HU0100526A2 - The anti-HPV antigens, their uses and processes for their preparation - Google Patents

The anti-HPV antigens, their uses and processes for their preparation Download PDF

Info

Publication number
HU0100526A2
HU0100526A2 HU0100526A HU0100526A HU0100526A2 HU 0100526 A2 HU0100526 A2 HU 0100526A2 HU 0100526 A HU0100526 A HU 0100526A HU 0100526 A HU0100526 A HU 0100526A HU 0100526 A2 HU0100526 A2 HU 0100526A2
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
leu
asp
protein
hpv
glu
Prior art date
Application number
HU0100526A
Other languages
Hungarian (hu)
Inventor
Wilfried L.J. Dalemans
Catherine Marie Ghislaine Gerard
Original Assignee
Smithkline Beecham Biologicals S.A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to GBGB9727262.9A priority Critical patent/GB9727262D0/en
Application filed by Smithkline Beecham Biologicals S.A. filed Critical Smithkline Beecham Biologicals S.A.
Priority to PCT/EP1998/008563 priority patent/WO1999033868A2/en
Publication of HU0100526A2 publication Critical patent/HU0100526A2/en

Links

Classifications

    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL, OR TOILET PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12Viral antigens
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL, OR TOILET PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02Bacterial antigens
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL, OR TOILET PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02Bacterial antigens
    • A61K39/09Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
    • A61K39/092Streptococcus
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL, OR TOILET PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL, OR TOILET PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511Organic adjuvants
    • A61K2039/55561CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL, OR TOILET PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/58Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
    • A61K2039/585Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation wherein the target is cancer
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL, OR TOILET PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031Proteins
    • A61K2039/6068Other bacterial proteins, e.g. OMP
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL, OR TOILET PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2319/00Fusion polypeptide
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA Viruses
    • C12N2710/00011MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA Viruses dsDNA Viruses
    • C12N2710/20011Papillomaviridae
    • C12N2710/20022New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA Viruses
    • C12N2710/00011MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA Viruses dsDNA Viruses
    • C12N2710/20011Papillomaviridae
    • C12N2710/20034Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02ATECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection
    • Y02A50/30Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
    • Y02A50/38Medical treatment of vector-borne diseases characterised by the agent
    • Y02A50/408Medical treatment of vector-borne diseases characterised by the agent the vector-borne disease being caused by a protozoa
    • Y02A50/411Medical treatment of vector-borne diseases characterised by the agent the vector-borne disease being caused by a protozoa of the genus Plasmodium, i.e. Malaria
    • Y02A50/412Medical treatment of vector-borne diseases characterised by the agent the vector-borne disease being caused by a protozoa of the genus Plasmodium, i.e. Malaria the medicinal preparation containing antigens or antibodies, e.g. vaccines, antisera

Abstract

A találmány tárgya készítmény, amely HPV-ből származó, működőképesenegy immunológiai fúziós partnerhez kapcsolt E6- és/vagy E7-fehérjétvagy E6/E7 fúziós fehérjét, valamint egy CpG-tartalmú oligonukleotidottartalmaz. The invention composition is derived from HPV, operably linked to an immunological fusion partner E6 and / or E7 protein oligonukleotidottartalmaz or E6 / E7 fusion protein as well as a CpG-containing. A találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerintikészítmény gyógyászati alkalmazásai és eljárások előállítására. The invention also relates to the preparation of the present invention szerintikészítmény therapeutic uses and processes. Atalálmány szerinti készítmény alkalmazható páciensben HPV- antigénelleni immunválasz indukálására, továbbá HPV-indukált tumorokmegelőzésére és kezelésére. composition can be used in a patient invention tend HPV antigénelleni inducing an immune response, and treatment of HPV-induced and tumorokmegelőzésére. Ó HE

Description

PÉLDÁNY COPIES

HPV-antigén elleni készítmények, alkalmazásaik és eljárások előállításukra The anti-HPV antigens, their uses and processes for their preparation

KIVONAT EXTRACT

A találmány tárgya készítmény/ amely HPV-ből származó, működőképesen egy immunológiai fúziós partnerhez kapcsolt E6- és/vagy E7-fehérjét vagy E6/E7 fúziós fehérjét, valamint egy CpG-tartalmú oligonukleotidot tartalmaz. The present invention is operably linked to an immunological fusion partner E6 and / or E7 proteins of E6 / E7 fusion protein as well as a CpG-containing oligonucleotide comprises or derived from compositions / which HPV. A találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti készítmény gyógyászati alkalmazásai és eljárások előállítására. The invention further relates to applications of the preparation of pharmaceutical compositions and methods of the invention.

A találmány szerinti készítmény alkalmazható páciensben HPV-antigén elleni immunválaszt indukálására, továbbá HPV-indukált tumorok megelőzésére és kezelésére. immune response to an HPV antigen formulation of the present invention can be used to induce in a patient, to prevent or treat HPV-induced tumors.

Aktaszámunk: 92395-3072A/SG Docket: 92395-3072A / SG

KÖZZÉTÉTELI DISCLOSURE
Képviselő: Representative: PÉLDÁNY -- COPIES - 4T- 4T-
Danubia Danubia
Szabadalmi és patent and Védjegy Iroda Kft. Ltd. Trademark Office.
B udapes B udapest t t

HPV-antigén elleni készítmények, alkalmazásaik és eljárások előállításukra The anti-HPV antigens, their uses and processes for their preparation

A találmány tárgyát oltóanyag-készítmények képezik, amelyek egy HPV-törzsből származó, működőképesen egy immunológiai fúziós partnerhez kapcsolt E6 és/vagy E7 vagy E6/E7 fúziós fehérjét, valamint egy CpG-tartalmú oligonukleotidot tartalmaznak és amelyek a humán papillómavírus által indukált tumorok vagy léziók kezelésére vagy megelőzésére alkalmazhatók. The present invention provides vaccine compositions which operably an associated immunological fusion partner E6 and / or E7, or E6 / E7 fusion protein as well as a CpG-containing oligonucleotides comprise from an HPV strain and which are induced by human papillomavirus tumors or lesions useful in the treatment or prevention. A találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti készítmény gyógyászati alkalmazásai és eljárások előállítására. The invention further relates to applications of the preparation of pharmaceutical compositions and methods of the invention.

A találmány tárgyát konkrétan olyan oltóanyagkészítmények képezik, amelyekben a fúziós fehérjékben az egyik partner egy olyan fehérje, vagy egy olyan fehérjerészlet, amely T-helper epitópokat (például a B-típusú Haemophilus influenzae-ból származó protein-D) tartalmaz, a másik partner pedig egy humán papillómavírus antigén (például a rákot okozó HPV-16 vagy a HPV-18 törzsből származó E6- vagy E7-fehérje), és amely oltóanyagkészítmények a huAktaszámunk: 92395-3072A/SG mán papillómavírus által indukált tumorok kezelésére vagy megelőzésére alkalmazhatók, és amelyek adjuvánsként CpGtartalmú oligonukleotidot tartalmaznak. The application particularly relates to a vaccine composition thereof, wherein the fusion protein to a partner is a protein or a protein portion comprising a T-helper epitopes (such as protein D from type B H. influenzae), and the other partner a human papillomavirus antigens (e.g., cancer-causing HPV-16 or the E6 or E7 protein from HPV strain 18), and that the vaccine compositions huAktaszámunk: 92395-3072A / SG Mán useful in the treatment or prevention of papillomavirus-induced tumors, and which CpGtartalmú include oligonucleotide adjuvant.

A papillómavírusok kisméretű csupasz DNS-vírusok (7,9 kilobázis, kettőszálú) és nagyon faj specifikusak. The Papillomaviruses are small naked DNA viruses (7.9 kilobases, double stranded) and highly species specific. Eddig már több mint 70 humán papillómavírus (HPV) genotípust írtak le. So far, they have been described for more than 70 human papillomavirus (HPV) genotypes. A papillómavírusokat eredetük (azaz humán, szarvasmarha, stb.) és az ugyanazon fajból származó más papillómavírusokkal való genetikai rokonságuk alapján osztályozzuk. Papilloma viruses are classified according to their origin (i.e., human, bovine, etc.), And their genetic relatedness with other papilloma viruses from the same species. A HPV-k általában a bőrre vagy nyálkahártyafelületekre specifikusak, és nagy általánosságban veszélyességük alapján soroljuk be őket a kevéssé vagy a nagyon veszélyes kategóriába . they are classified as a low to a very dangerous category is usually applied to the skin or nyálkahártyafelületekre specific and more generally on the basis of their hazardous HPVs.

A kevéssé veszélyes HPV-k jóindulatú léziókat (szemölcs vagy papillóma) okoznak, amelyek több hónapon vagy éven át megmaradhatnak. A little dangerous HPVs cause benign lesions (warts or papilloma), which may persist for several months or years. A nagyon veszélyes HPV-k preneoplasztikus léziókat és rákot okoznak. A very dangerous pre-neoplastic lesions caused by HPV and cancer. Egy HPV-vírus és emberi rák közötti legerősebb pozitív összefüggés a HPV16 és HPV-18 és a nyaki karcinóma között figyelhető meg. strongest positive association between an HPV virus and human cancer is observed between HPV 16 and HPV-18 and cervical carcinoma. Több mint tíz egyéb HPV-típus is megtalálható nyaki karcinómákban, így például a HPV-31 és a HPV-32, bár kevésbé gyakoriak. More than ten other HPV types in cervical carcinomas can also be found, such as HPV-31 and HPV-32, although less frequent.

Fiatal, szexuálisan aktív nőkben a genitális HPVfertőzés gyakori, és legtöbben vagy megszabadulnak a fertőzéstől, vagy ha léziók keletkeznek, azok visszafejlődnek. Young sexually active women with genital HPVfertőzés common and most or freed from the infection, or if lesions occur, they regress. A fertőzötteknek csak egy kisebb csoportjánál alakulnak ki olyan léziók, amelyek nagyfokú intraepiteliális neopláziává alakulnak át, és csak egy nagyon kis hányaduknál fejlődik ki ezekből ráterjedő karcinóma. The infected develop only in a minority of any lesions that are converted to a high degree intraepithelial neopláziává, and develops only a very small proportion of them from these invasive carcinoma.

A HPV-fertőzéshez vezető molekuláris eseményeket részletesen még nem ismerjük. HPV infection leading molecular events is not yet fully known. A virális ciklus jobb megismerését az akadályozza, hogy nem áll rendelkezésre olyan megfelelő in vitro rendszer, amellyel a humán papillómavirust szaporítani lehetne. A better understanding of the viral cycle obstacle to an appropriate in vitro system is not available, which would help to propagate the human papilloma virus.

Bakteriális klónozó rendszerek, illetve újabban PCRamplifikáció segítségével már sok különböző HPV-típust izoláltak és jellemeztek. using bacterial cloning systems, and more recently PCRamplifikáció been isolated from many different types of HPV and characterized. A HPV-genomok molekuláris felépítését a már jól jellemzett 1. típusú szarvasmarha papillómavírus (BPV1) genomjával való összehasonlítás alapján határozták meg. molecular structure of the HPV genomes is determined by comparison with papillomavirus (BPV1) genome has been well characterized in the type 1 bovine.

Habár léteznek kisebb eltérések, az eddig megismert HPV-genomok mindegyikében megtalálható legalább hét korai gén (E1-E7) és két késői gén (LI és L2) . Although there are small differences, the currently known HPV genomes can be found in each of at least seven early gene (E1 to E7), and two late genes (LI and L2). Megfigyelhető ezenkívül egy 5' szabályozó régió, amely a HPV-genom transzkripciós eseményeit irányító szabályozó szekvenciákat tartalmaz. It can be observed in addition to a 5 'regulatory region which contains regulatory sequences direct the transcriptional events of the HPV genome.

Az El-gén a vírus replikációjában, az E2-gén pedig a transzkripció irányításában vesz részt, és a vírus integrációjakor általában mindkettő tönkremegy. The El gene replication of the virus, the E2 gene is involved in the management of transcription, and virus usually towards integrating both destroyed. Az E6- és az E7gének a vírus transzformációjában vesznek részt, továbbá az E5-gén szerepe is ehhez a folyamathoz kapcsolódik. The E6 and E7gének participate in the transformation of the virus and the role of the E5 gene is also linked to this process.

A nyaki karcinómát okozó HPV-kben, például a HPV-16ban és a HPV-18-ban az onkogén folyamat a vírus-DNS integrálódása után indul be. HPV causes cervical carcinoma engines, such as HPV-18 and HPV-16ban in the oncogenic process starts after integration of viral DNA. Az integráció nyomán az LI és L2 kapszidfehérjéket kódoló gének inaktiválódnak, továbbá el4 • · • ·····«·· • · · · ... Following the integration of the LI and L2 capsid proteins are inactivated genes encoding and EL4 • • · ····· "·· • · · · ...

• · ··· · ·· ♦·? • · · · · · · ·· ♦?

···· ·· ·· · _ tűnik az E2 represszor funkciója, amelynek eredményeként megszűnik az E6/E7 nyitott leolvasási keret szabályozása és ettől kezdve az E6 és E7 korai gének folyamatosan túlexpresszálódnak. · ···· ·· ·· _ appears E2 repressor function, which results in the regulation of E6 / E7 open reading frame is terminated and since then constantly overexpressed E6 and E7 early genes. Ez végső soron a normális sejtdifferenciálódás fokozatos eltűnéséhez és a karcinóma kialakulásához vezet. This ultimately leads to the gradual disappearance of the normal cellular differentiation and the development of cancer. Az E6 és az E7 úgy teszi tönkre a normális sejtciklust, hogy inaktiválják a p53 és a pRB (retinoblasztóma géntermék) tumorrepresszor fehérjéket. The E6 and E7 destroy the normal cell cycle to inactivate p53 and pRB (retinoblastoma gene product) tumorrepresszor proteins.

A nyaki karcinóma nőkben elég gyakori, és egy rák előtti („precancerous) köztes fázison keresztül ráterjedő karcinómává alakul, amely gyakran halálos kimenetelű. The cervical carcinoma in women develop invasive carcinoma through quite common and prior to a cancer ( "precancerous) intermediate phase, which is often fatal. A betegség köztes fázisát nyaki intraepiteliális neopláziának nevezik, és súlyossága szerint I.-III. intermediate stages of cervical intraepithelial neoplasia termed the disease, and according to the severity of I-III. kategóriákba sorolják (CIN I. -III.) . into categories (CIN I-III.).

A női anogenitális traktus HPV-fertőzése klinikailag lapos nyaki kondilómák formájában manifesztálódik, amelyet a legfőképpen a nyaki pikkelyes epitélium felszíni és a köztes sejtjeit érintő kiolocitózis fémjelez. The female anogenital tract HPV infections clinically manifests as cervical flat condylomas, which is mainly the cervical squamous epithelium superficial and intermediate cells of the touch kiolocitózis hallmarked.

A sokmagvú, és a perinukleáris térben egy világos udvart tartalmazó koilociták a vírus citopatikus hatásának következményei. The polynuclear, and the courtyard with a clear perinuclear space koilociták consequences cytopathic effect of the virus. Az epitélium az abnormális keratinizáció nyomán megvastagszik, és ez az oka a léziók szemölcsszerű megj elenésének. The epithelium thickens the wake of abnormal keratinization, and this is why the wart-like lesions elenésének comment.

A HPV-16-ra vagy a HPV-18-ra pozitív lapos kondilómák jelenléte nagy kockázati faktort jelent a ráterjedő nyaki karcinóma prekurzor lézióinak tekintett nyaki intraepiteliális neoplázia (CIN) és a karcinóma in situ (CIS) kialakulása szempontjából. The presence of a positive HPV-16 or HPV-18 flat condylomas a major risk factor in invasive cervical carcinoma precursor lesions of cervical intraepithelial neoplasia considered (CIN) and carcinoma in situ (CIS) in terms of formation.

• · • ·

Az onkogén HPV-fertőzés három egymás után fázisban történik: The oncogenic HPV infection occurs after three different phases:

(1) látens fertőzés, (2) intranukleáris vírusreplikáció, amelynek során komplett virionok keletkeznek, ami megfelel a koilociták megjelenésének. (1) a latent infection, (2) intranuclear viral replication, are produced in which the complete virions, which corresponds to koilociták appearance. A HPV ebben a fázisban minden fehérjéjét termeli, így az E2, E5, E6, E7, Ll és L2 fehérjéket is. HPV in this phase is produced by all proteins, such as E2, E5, E6, E7, LI and L2 proteins.

(3) a vírus beépül a sejtek genomjába, ami beindítja a malignus transzformációt, a CIN II., valamint a CIN III./CIS állapotoknak felel meg és a koilociták progresszív eltűnése jellemzi. (3) the virus integrates into the genome of the cells, which triggers the malignant transformation, CIN II., And corresponds to CIN III./CIS condition and characteristics of the progressive disappearance koilociták. Ebben a fázisban az E2 expressziója csökken, az E6-é és az E7-é pedig fokozódik. In this phase, the reduced expression of E2, E6 and E7 é's is enhanced. A CIN II./III. CIN II./III. és a CIN III./nyaki karcinóma állapotok között a bazális sejtekben episzómális vírus-DNS-ből csak az E6 és az E7 integrálódik (tumoros sejtek). CIN and carcinoma III./nyaki between states only the E6 and E7 integrated episomal in the basal cells viral DNA (tumor cells). A nyaki karcinómák 85%-a pikkelysejt-karcinóma, és leginkább a HPV-16 szerotípushoz kapcsolódik. The cervical carcinomas is linked to 85% of squamous cell carcinoma, and most of HPV 16 serotype. Az esetek 10%-a adenokarcinóma, 5%-a pedig adenopikkelysejt-karcinóma. 10% of cases are adenocarcinomas, and carcinomas adenopikkelysejt 5%. Ez utóbbi karcinómák legfőképpen a HPV-18 szerotípussal állnak összefüggésben. The latter is especially cancers are associated with HPV-18 serotypes. Léteznek azonban más onkogén HPV-típusok is. However, there are other oncogenic HPV types.

A WO 96/19496 sz. WO 96/19496 c. nemzetközi szabadalmi bejelentés humán papillómavírus E6- és E7-fehérjéket ismertet, konkrétabban E6/E7 fúziós fehérjéket, amelyekben mind az E6-, mind pedig az E7-fehérje deléciókat tartalmaz. International Patent Application, human papillomavirus E6 and E7 proteins are described, more specifically E6 / E7 fusion proteins wherein both the E6 and E7 protein and deletions. A szerzők szerint e deléciós fúziós fehérjék immunogének. According to the authors of this deletion fusion proteins are immunogenic.

A nem metilált CpG-dinukleotidot tartalmazó immunmódosító oligonukleotidok (CpG) jól ismertek (WO 96/02555, EP 468520). immunomodulatory oligonucleotides containing unmethylated CpG dinucleotides (CpG) are known (WO 96/02555, EP 468520). A CpG a DNS-ben lévő citozin-guanozin dinukleotid6 • · · motívumok rövidítése. The CpG in DNA cytosine-guanosine dinukleotid6 • · · stands motives. A múltban megfigyelték, hogy a BCG egy DNS-frakciója tumorellenes hatású. In the past, been observed that the DNA fraction of BCG an antitumor effect. Más vizsgálatokban kimutatták, hogy a BCG-gén szekvenciája alapján előállított szintetikus oligonukleotidok képesek immunstimuláló hatást kiváltani (in vitro és in vivő is). Our studies show that synthetic oligonucleotides designed on the basis of BCG gene sequences capable of inducing immunostimulatory effects (both in vitro and in vivo). A szerzők megállapították, hogy ez az aktivitás bizonyos palindróm szekvenciákhoz, többek között a centrális CG-motívumhoz köthető. The authors concluded that this activity is certain palindromic sequences, inter alia, to the central CG motif. A CGmotívum központi szerepét az immunrendszer stimulálásában később ismerték fel [Krieg, Natúré 374, 5469 (1995)]. The central role of CGmotívum recognized by the immune system after stimulation [Krieg, Nature 374, 5469 (1995)]. A részletes vizsgálatok megmutatták, hogy a CG-motívumok DNSszekvenciája bakteriális DNS-ben gyakori, gerincesekben azonban ritkán fordul elő. Detailed analysis has shown that often, however, rare in vertebrate CG DNA sequence motifs in bacterial DNA.

Jelenleg az az elterjedt nézet, hogy ez az evolúciós különbség teszi lehetővé a gerincesek immunrendszere számára, hogy felismerje a bakteriális DNS-t (amely a fertőzések során kerül be a szervezetbe), és ez vezet az immunrendszer stimulációjához. At present, the commonly held view is that this evolutionary difference allows the vertebrate immune system to recognize bacterial DNA (which enters the body during infection), leading to stimulation of the immune system. Krieg szerint az immunstimuláló szekvencia a következőképpen definiálható: Krieg according to the immunostimulatory sequence is defined as follows:

Purin-purin-CG-pirimidin-pirimidin, és a CG-motívum nem metilált. Purine-purine-CG-pyrimidine-pyrimidine, and the CG motif is not methylated. A hat nukleotid bizonyos kombinációinál egy palindróm szekvencia is megjelenik. certain combinations of the six nucleotides a palindromic sequence is displayed. Egy oligonukleotidban számos ilyen motívum előfordulhat egyetlen motívum ismétlődése vagy különböző motívumok kombinációja formájában. A number of such oligonucleotide may form a single pattern repeat of pattern or a combination of different motifs. Egy vagy több, ilyen immunstimuláló szekvenciát tartalmazó oligonukleotid jelenléte több különböző immunsejtcsoportot is aktivál, így például a (γ-interferont termelő és citolitikus aktivitású) killersejteket és a makrofágokat [Wooldridge és mtsai., 89/8, (1977)]. The presence of an oligonucleotide containing one or more of these immunostimulatory sequence activate various immune cell group, such as (γ-interferon production and cytolytic activity) and macrophages Killer [Wooldridge et al., 89/8 (1977)]. Habár más, a fenti konszenzus szekvenciával nem rendelkező, nem metilált CpG-t tartalmazó szekvenciákról is kimutatták már, hogy immunmódosító hatásuk van. Although it has been demonstrated in other, also sequences containing unmethylated CpG sequence in the above non-consensus that have immunomodulatory activity.

A találmány tárgyát olyan készítmények képezik, amelyek működőképesen egy T-sejt epitópokat tartalmazó immunológiai fúziós partnerhez kapcsolt E6 és/vagy E7 vagy E6/E7 fúziós fehérjét, valamint adjuvánsként egy immunmódosító CpG-tartalmú oligonukleotidot tartalmaznak. The present invention relates to compositions comprising as operably linked to an immunological fusion partner E6 and / or E7, or E6 / E7 fusion protein comprising a T-cell epitopes and comprising an immunomodulatory CpG-containing oligonucleotide as an adjuvant.

A találmány egy előnyös megvalósítási módjában az immunológiai fúziós partner a B-típusú Haemophilus influenzáé protein-D-je. In a preferred embodiment, the immunological fusion partner is the type B H. influenzae protein D is longer. A protein-D származék előnyösen a fehérje körülbelül első egyharmadát tartalmazza, konkrétan körülbelül az első 100-110 N-terminális aminosavat. The protein D derivative comprises approximately the first third of the preferably protein, specifically approximately the first N-terminal 100-110 amino acids. A protein-D lehet lipidált (lipo-protein-D). The protein D may be lipidated (Lipo Protein D). További immunológiai fúziós partnerek még az influenzáé virus NS1 nem szerkezeti fehérjéje (hemagglutinin). Additional immunological fusion partners have influenzae virus NS1 protein of non-structural (hemagglutinin). Általában a fehérje N-terminális 81 aminosavát alkalmazzuk, bár más fragmensek is megfelelőek, ha tartalmaznak T-helper epitópokat. In general, the protein N-terminal 81 amino acids are used, although different fragments are also suitable if they contain T helper epitopes.

A találmány egy másik megvalósítási módjában az immunológiai fúziós partner a LYTA nevű fehérje, amelynek előnyösen a C-terminális részét használjuk. In another embodiment the immunological fusion partner is the protein called LYTA, which is preferably used in the C-terminal portion. A Lyta Streptococcus pneumoniae-ből származik, amely egy N-acetilL-alanin-amidázt, LYTA-amidázt {a lytA-gén terméke [Gene 43, 265-272 (1986))]}, egy autolizint szintetizál, amely specifikusan bontja a peptidoglikán gerinc egyes kötéseit. Lyta is derived from the Streptococcus pneumoniae that is an N-acetyl-L-alanine amidase, amidase LYTA {product of the lytA gene [Gene, 43, 265-272 (1986))]} an autolysin that specifically degrades the peptidoglycan spinal certain bonds. A LYTA-fehérje C-teminális doménje a felelős a kolin és egyes kolinanalógok, pl. LYTA protein C in terminal domain is responsible for the choline and to some choline analogues such. DEAE iránti affinitásért. DEAE affinity to. A fehérje ezen tulajdonsága alapján dolgozták ki az E. coli C-LYTA expressziós plazmidot, amellyel fúziós fehérjék expresszálhatók. The developed protein of E. coli C-LYTA expression plasmid based on these properties, which fusion proteins can be expressed. Az aminoterminálison C-LYTA fragmenst tartalmazó hibrid fehérjék tisztítása jól ismert [Biotechnology 10, 795-798 (1992)]. Purification of hybrid proteins are well known [Biotechnology 10: 795-798 (1992)] containing the C-LYTA fragment at the amino terminus. A találmány egyik előnyös megvalósítási módjában a Lyta-molekula C-terminális végén, a 178. aminosavtól kezdődően található ismétlődő szakaszt alkalmazzuk. In a preferred embodiment, the repeating section in the beginning is used Lyta molecule C-terminal end of the amino acid 178.

Különösen előnyös az a forma, amikor a 188-305. Particularly preferred is the form in which the 188-305. aminosavakat magában foglaló szakaszt alkalmazzuk. amino acids including a portion thereof.

A találmány tárgyát tehát annak egy előnyös megvalósítási módjában olyan készítmények képezik, amelyek egy immunstimuláló CpG-oligonukleotidot és egy fúziós fehérjét tartalmaznak, amelyben a fúziós fehérje a következő: protein-D—HPV-16 E6, protein-D-HPV-16 E7, protein-D-HPV-18 E7, protein-D—HPV-18 E6 vagy protein-D—HPV-16 és HPV-18 Εβ E7. The invention provides in a preferred embodiment provides compositions comprising an immunostimulatory CpG oligonucleotide and a fusion protein wherein the fusion protein is as follows: Protein D-HPV 16 E6, protein D-HPV 16 E7, protein D-HPV 18 E7 protein D-HPV 18 E6 or protein D-HPV-16 and HPV-18 E7 Εβ. A protein-D rész előnyösen a protein-D első egyharmada. The protein D part preferably in the first third of protein D. Nyilvánvaló, hogy más HPV-altípusokból származó E6- és E7fehérje is alkalmazható. Obviously, from the E6 and E7fehérje also applicable to other HPV subtypes.

A találmányban alkalmazott fehérjéket előnyösen E. colí-ban expresszáltatjuk. Proteins used in this invention preferably are expressed in E. coli. A találmány egy előnyös megvalósítási módjában a fehérjéket 5-9 tagú, előnyösen hat hisztidinből álló hisztidinfárokkal expresszáltatjuk. In a preferred embodiment the proteins are expressed in a 5-9 membered ring, preferably a six-histidine hisztidinfárokkal. Ez a tisztítás során jelent előnyt. This is an advantage during cleaning.

A találmány egy előnyös megvalósítási módjában az E7fehérje az rb-kötőhelyben (retinoblasztóma géntermék kötőhely) egy vagy több mutációt hordoz, így nem rendelkezik semmilyen transzformáló aktivitással. In a preferred embodiment, bearing one or more mutations in the E7fehérje RB binding site (retinoblastoma gene product binding site) so that it has no transforming activity. A HPV-16 E7 előnyös mutációi például a Cys 24 glicinnel, vagy a glutaminsav 26 glutaminnal való helyettesítése. The HPV-16 E7 preferred mutations as glycine Cys24, or substitution of Glutamic acid 26 with Glutamine. A találmány egy előnyös t *ν· · <· · • · » · • · · · · In a preferred t * ν · <· · · • »• · · · · ·

V*·· ·· • · · • · · · ·.<* _« Λ» · * megvalósítási módjában az E7-fehérje minkét mutációt hordozza . V * ·· ·· • • · · · · · ·. <_ * «Λ» * · embodiment carries mutations in both the E7 protein.

A HPV-18 E7 előnyös mutációi például a Cys 2 7 glicinnel, és/vagy a glutaminsav 2 g glutaminnal való helyettesítése. The HPV-18 E7 preferred mutations of example 2 Cys 7 with glycine, and / or substitution of the glutamic acid with glutamine, 2 g. Itt is előnyös, ha mind a két mutáció jelen van. Here it is preferred that both mutations are present.

A transzformáló képesség megszüntetése érdekében az E6 p53-régiójába is bevihetők egyszeres vagy kétszeres mutációk. To eliminate the transforming ability of the p53 region of E6 can be incorporated in a single or double mutations.

A találmány egy másik megvalósítási módjában a találmány tárgyát egy immunológiai fúziós partnerrel működőképesen összekapcsolt HPV E6/E7 fúziós fehérje és egy CpG immunmódosító oligonukleotid képezi. In another embodiment, the invention relates to an immunological fusion partner operably linked HPV E6 / E7 fusion protein and a CpG immunomodulatory oligonucleotide forms.

A találmány szerinti oltóanyag preferenciálisan THl immunválaszt indukál. The vaccine of the present invention preferentially induce a Thl immune response.

Két fő helper T-sejttípust ismerünk, ezek a THl és a TH2, amelyek az általuk szekretált citokinek szempontjából különböznek. There are two main types of helper T cells, these THI and TH2, which differ from the point of view of the secreted cytokines. Úgy tekinthető, hogy a citokinek adják két különböző típusú immunválasz hajtóerejét. It is considered that given two different types of immune response to the driving force of cytokines. A THl-típusú immunválasz sejtközvetített effektormechanizmusokat tartalmaz, így például a T-limfociták általi INF-γ és IL-2 citokinek termelését. Thl-type immune response comprises cell-mediated effector mechanisms such as the T lymphocytes by IFN-γ and IL-2 cytokines. Az INF-γ azután más sejteket aktiválhat és azokban további fontos citokinek és mediátorok termelését indukálhatja [az INF-y-aktivált NK-sejtek IL12-t termelnek, az ILl2-aktivált NK sejtek limfokin-aktivált killersejtekké (LAK) alakulnak át, az INF-y-aktivált makrofágok gyulladásközvetítőket, pl. INF-γ then may activate other cells, and those may induce production of other important cytokines and mediators [INF-y-activated NK cells IL12 is produced, the ILl2-activated NK cells are transformed into lymphokine-activated killersejtekké (LAK), INF y-activated macrophages in inflammatory mediators, e. TNFa-t, ILl-et, IL6-ot termelnek és nitrogénoxidot bocsátanak ki, az IL2 az antigénspecifikus, haplotípus-korlátozott citotoxikus T-limfociták (CTL) dif10 • · « *« «·«* · · • ·»· · ferenciálódását segíti]. TNFa, or was, IL-6 is produced and nitrogen oxides they emit, the IL-2 antigen specific, haplotype restricted cytotoxic T lymphocytes (CTL) dif10 • · «*« «·« * · • · »· · ferenciálódását It helps]. Az antitestek szintjén egérben a Thl-típusú immunválasz során IgG2-izotípusú antitestek is keletkeznek (Balb/c-egerekben IgG2a, C57BL/6-egerekben IgG2b). The antibody levels in mice during the Thl-type immune response IgG2 isotype antibodies are also produced (Balb / c mice IgG2a, C57BL / 6 mice IgG2b).

A Th2-típusú immunválasz az antigén elleni humorális immunválaszt jelenti, amelynek során olyan citokinek termelődnek, mint az IL4, az IL5, az IL6 és az IL10, továbbá sokféle immunglobulin-izotípus termelődik, egérben például IgGl, IgA és IgM. Th2-type immune response is a humoral immune response to the antigen in which the produced cytokines such as IL4, the IL5, IL6 and IL10, and a wide variety of immunoglobulin isotypes produced in mouse such as IgG, IgA, and IgM.

Emberben a Thl- és a Th2-immunválasz nem választható el ilyen élesen. In humans, the Thl and Th2 immune response can not be separated from these sharply. Adott egyén támogathat pl. An individual support may e. olyan immunválaszt, amely elsődlegesen Thl típusú, vagy olyat, amely elsődlegesen Th2 típusú. an immune response that is primarily a Thl-type, or one that is primarily Th2. Gyakran célszerű azonban a citokincsaládokat az egér CD4+ T-sejtklónokra a Mosmann és Often, however, the appropriate cytokines in murine CD4 + T cell clones by Mosmann and the

Coffman [Mosmann, TR és Coffman, RL, ΊΉ1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties, Annual Review of Immunology 7, 145-173 (1989)] által leírtak alapján taglalni . Coffman [Mosmann, TR and Coffman, RL, ΊΉ1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties Annual Review of Immunology, 7, 145-173 (1989)] as described by left open.

Emberben a THl-típusú válasznál az INFg és az IL2 citokinek is megjelennek, és végső soron az egérre jellemző CTL és az IgG2-izotípus megjelenése megfelel az IgGl-típusú antitesteknek. In humans, the Thl-type appear to CHOOSE INFg and IL-2 cytokines, and ultimately characterized mouse CTL and the appearance of the IgG2 isotype IgGl type antibodies.

Az 1. típusú fenotípus nagyon fontos a vírusos és intracelluláris bakteriális fertőzések elleni védelemben, továbbá a rák kezelésében is. Type 1 phenotype is important in protection against intracellular viral and bacterial infections, and even cancer treatment.

A találmányban alkalmazható fehérjék rekombináns eljárásokkal történő előállítására egy olyan expressziós stra11 *»«· «··· tégia alkalmazható, amelyben az E7-fehérjét, E6-fehérjét vagy E6/E7 fúziós fehérjét a B-típusú Haemophilus influenzáé protein-D-jének N-terminális harmadához fuzionálhatjuk, amely egy helper T-sejt epitópokat tartalmazó immunológiai fúziós partner. methods for the recombinant production of proteins for use herein is an expression stra11 * »« · «··· tégia used, wherein the E7 protein E6 protein E6 / E7 fusion protein or the type B H. influenzae protein D of N fused-terminal third of which is a helper immunological fusion partner having T cell epitopes. A fúziós fehérje karboxiterminálisához ezután egy polihisztidin-farkat kapcsolunk, amely leegyszerűsíti a fehérje tisztítását. The fusion protein is then coupled with a carboxy polyhistidine tail, which simplifies purification of the protein. Az így kapott fehérjét E. coli-ban túlexpresszáltatva kapjuk az oldhatatlan terméket. The protein obtained in E.coli túlexpresszáltatva obtain the insoluble product.

A találmány szerinti fehérjéket tioredoxinnal (TIT) is koexpresszáltathatjuk, in trans. The proteins of the invention koexpresszáltathatjuk thioredoxin (KIC) is in trans. A tioredoxinos koexpresszió során azért előnyösebb az in trans helyzet, mint az in cis, mert az antigén így tioredoxinmentes marad és nincs szükség proteáz alkalmazására. The coexpression thioredoxin in trans is preferably the case, as in cis, for the antigen and does not need thus remains tioredoxinmentes protease application. A tioredoxinos koexpresszió megkönnyíti a találmány szerinti fehérjék oldhatóvá tételét. Coexpression of thioredoxin facilitates Solubilization of the proteins of the invention. Az eljárás további előnye, hogy hatással van a kitermelésre, a tisztított fehérje oldhatóságára és minőségére is. A further advantage is that the impact of the extraction, the purified protein solubility and quality as well.

A replikálható expressziós vektorokat a találmány szerint állíthatjuk elő, úgy hogy a gazdasejttel kompatibilis vektort elhasítva egy ép replikont tartalmazó lineáris DNSszegmenst kapunk, majd a lineáris szegmenst ligációs körülmények között egy vagy több DNS-molekulával kombináljuk, amely a lineáris szegmenssel együtt a kívánt terméket kódolja, azaz például a találmány szerinti fehérjét kódoló DNS-polimert, vagy annak származékát. The replicable expression vectors may be prepared according to the invention, so that compatible with the host vector cleaved linear DNA segment having an intact replicon is obtained, and the linear segments are combined ligation conditions with one or more DNA molecules encoding the desired product together with said linear segment, e.g., encoding a protein of the invention, the DNA polymer or a derivative thereof.

A DNS-polimert a vektor összeállítása során vagy azelőtt is előállíthatjuk. The DNA polymer may be prepared in the preparation of the vector, or before.

w «'Ο ·»·· ·· » ♦ * * * • W v·· . w '' · Ο »·· ··» ♦ • * * * W v ··.

*·<*- · v · · ' ' βτ »♦- */ *** · * <* - · · · v '' βτ »♦ - * / ***

A vektor kiválasztásakor részben a gazdasejt tulajdonságait kell figyelembe venni, amely lehet prokarióta vagy eukarióta, előnyösen E. coli. The vector selecting section properties of the host cell to be considered, which may be prokaryotic or eukaryotic, preferably E. coli. Megfelelő vektorok például a plazmidok, a bakteriofágok, a kozmidok és a rekombináns vírusok. Suitable vectors include plasmids, bacteriophages, cosmids and recombinant viruses.

A replikálható expressziós vektor előállítása történhet hagyományos módon, amelynek során megfelelő restrikciós enzimeket, majd DNS-polimerizációt és ligálást alkalmazunk. Preparation of the replicable expression vector according to conventional methods, using appropriate restriction enzymes and DNA polymerization and ligation in which. A megfelelő eljárásokat Id. például Maniatis és mtsai. Suitable procedures, e. For example, Maniatis et al. publikációjában (ld. fent). publications (see Fig. above).

A rekombináns gazdasejt előállítása a találmány szerint a következőképpen történik. Preparation of recombinant host cells according to the invention is as follows. A gazdasejtet transzformációs körülmények között a találmány szerinti replikálható expressziós vektorral transzformáljuk. The host cell under transforming conditions replicable expression vector of the present invention is transformed. Megfelelő transzformációs körülményeket jelentenek a hagyományos eljárásokban alkalmazottak, ld. Suitable transforming conditions are conventional methods of employees, supra. például Maniatis és mtsai. e.g., Maniatis et al. publikációjában (ld. fent), vagy a DNS-klónozás c. publication (see Fig. above), or the c DNA cloning. munkában [DNA Cloning, II. work [DNA Cloning, II. kötet, szerk. Volume, ed. DM Glover, IRL Press Ltd. DM Glover, IRL Press Ltd.

(1985)]. (1985)].

A transzformáló körülmények megválasztását a gazdasejt határozza meg. The choice of transforming conditions is determined by the host cells. Egy bakteriális gazdát, például E. coli-t először CaCl 2 -dal [Cohen és mtsai., Proc. A bacterial host such as E. coli is first CaCl2 azide [Cohen et al., Proc. Natl. Natl. Acad. Acad. Sci. Sci.

69, 2110 (1973)], vagy RbCl-t, MnCl 2 -t, kálium-acetátot és glicerint tartalmazó oldattal kezeljük, majd 3-[Nmorfolino]-propán-szulfonsavat, RbCl-t és glicerint alkalmazunk. Was treated with 69: 2110 (1973)], or with rbcL-t, -t MnCl2, potassium acetate and glycerol solution and then with 3- [Nmorpholino] -propane-sulphonic acid, rbcL, and glycerol is used. Emlőssejt-tenyészeteket úgy transzformálhatunk, hogy kalciummal koprecipitáljuk a vektor-DNS-t a sejtekre. Mammalian cell cultures can be transformed by that vector-coprecipitated DNA with calcium to cells. A találmány kiterjed továbbá egy, a találmány szerinti ···· ···· • · The invention also relates to a according to the invention ···· ···· • ·

replikálható expressziós vektorral transzformált gazdasejtre is. replicable expression vector is transformed host.

A transzformált sejtek tenyésztése olyan körülmények között történik, amely lehetővé teszi a DNS-polimer expresszióját. culturing the transformed cells under conditions allowing expression of the DNA polymer. E célra hagyományos eljárások alkalmazhatók, ld. For this purpose, conventional methods may be used, see Fig. például Maniatis és mtsai. e.g., Maniatis et al. publikációjában és a DNSklónozás c. publication and DNSklónozás c. munkában (ld. fent). work (see Fig. above). A sejtet tehát előnyösen ellátjuk tápanyagokkal és 50°C alatti hőmérsékleten szaporítjuk. The cell is provided with nutrients and is therefore preferably grown at a temperature below 50 ° C.

A termék kinyerésére a gazdasejt típusának megfelelő hagyományos eljárások alkalmazhatók. The recovery of product suitable for the host cells using conventional techniques. Ha tehát a gazda bakteriális sejt, például E. coli, akkor a lizálás történhet fizikai, kémiai vagy enzimatikus úton, majd a fehérjeterméket az így kapott lizátumból izoláljuk. Thus, if the host is a bacterial cell such as E. coli, the lysis take place physically, chemically or enzymatically and the protein product isolated from the lysate thus obtained. Ha a gazda emlőssejt, a terméket általánosságban a tápközegből vagy sejtmentes kivonatból izolálhatjuk. When the host is mammalian, the product may be isolated from the medium or the cell-free extract in general. A hagyományos fehérjeizolációs eljárások közé tartozik a szelektív kicsapás, az adszorpciós kromatografia és a monoklonális antitestaffinitásoszlopos affinitáskromatográfia. Conventional protein isolation techniques include selective precipitation, adsorption chromatography, and affinity monoclonal antitestaffinitásoszlopos.

Ha a találmány szerinti fehérjéket hisztidinfárokkal (His-toldalék) expresszáltatjuk, akkor a fehérje egyszerűen tisztítható affinitáskromatográfiával, amelyhez egy fémionaffinitáskromatográfiás oszlopot (IMAC) alkalmazunk. When the proteins of the invention expressed hisztidinfárokkal (His tag), the protein may be readily purified by affinity chromatography with an fémionaffinitáskromatográfiás column (IMAC) is used.

Az IMAC-oszlop előtt vagy után egy második kromatográfiás lépés, például Q-sepharose is alkalmazható annak érdekében, hogy nagy tisztaságú fehérjepreparátumot állítsunk elő. before or after the IMAC column to a second chromatographic step, such as Q-sepharose also produce a useful, in order to highly purified protein preparation. Ha az immunológiai fúziós partner C-LYTA, akkor a termék tisztítása történhet a C-LYTA kolin- és/vagy DEAE-kötő ···· ···· ·· tulajdonságát. If the immunological fusion partner C-Lyta, then cleaning the product may be the C-LYTA for choline and / or DEAE-binding ···· ···· ·· property. A C-LYTÁ-t és his-toldalékot is tartalmazó termékek könnyen és hatékonyan tisztíthatok egy kétlépéses, differenciális affinitáskromatográfiát is magában foglaló eljárás segítségével. Products containing the C-LYTA and his-tag can be purified easily and efficiently by using a two-step differential affinity procedure involving. Az első lépésben a His-toldalék IMACoszlopok iránti affinitását, a második lépésben pedig a LYTA C-terminális doménjének kolin vagy DEAE iránti affinitását használjuk ki. In the first step, the His tag affinity IMACoszlopok, is used choline or DEAE affinity of the C-terminal domain of the LYTA the second step out.

Az előnyös oltóanyagkészítmények minimálisan proteinD—HPV-16 E6-ot vagy annak egy származékát, valamint protein-D—HPV-16 E7-et tartalmaznak. The vaccine compositions preferably contain a minimum protein of HPV-16 E6 or a derivative thereof, and protein-HPV 16 E7. Az E6 és az E7 egyetlen molekula alakjában is alkalmazható, előnyösen protein-D—E6/E7 fúzió formájában. The E6 and E7 may also be used as a single molecule, preferably in the form of a Protein D-E6 / E7 fusion. Az oltóanyagok ezenkívül tartalmazhatják még a HPV-18 E6- vagy E7-fehérjéjét, vagy mindkettőt, előnyösen egy protein-D—E6 vagy egy protein-D—E7 fúziós fehérje, vagy egy protein-D—E6/E7 fúziós fehérje formájában. Vaccines also may further comprise the HPV-18 E6 or E7 proteins, or both, preferably in the form of a Protein D-E6 or Protein D-E7 fusion protein or Protein D E6 / E7 fusion protein. A találmány szerinti oltóanyagok más, a HPV-16-ból vagy a HPV-18-ból származó HPV-antigéneket is tartalmazhatnak. Vaccines of the invention may contain other HPV antigens from HPV 16, or from HPV-18 from it. Az oltóanyag konkrétan tartalmazhatja az Ll- vagy az L2antigén monomereket. The vaccine specifically contain the LI or L2antigén monomers. Az L1-, L2-antigének együtt, vírusszerű részecskék formájában is alkalmazhatók, vagy az Llfehérje önmagában is alkalmazható vírusszerű részecske vagy kapszomer szerkezet formájában. The L1, L2 antigens together, can be used in the form of virus-like particles can be used alone or Llfehérje virus-like particle or capsomere structure form. A fenti antigének, vírusszerű részecskék és kapszomerek önmagukban ismertek. Such antigens, virus like particles and capsomers are per se known. Ld. például WO 94/00152, WO 94/20137, WO 94/05792 és WO 93/02184. See., E.g., WO 94/00152, WO 94/20137, WO 94/05792 and WO 93/02184. További korai fehérjék, például az E2, vagy előnyösen az E5 is alkalmazható. Additional early proteins are used, for example E2 or preferably E5 well. A találmány szerinti oltóanyagok ezenkívül más HPV-törzsekből, előnyösen a HPV-615 • · ···· · · · · ból, a HPV-ll-ből, a HPV-31-ből, vagy a HPV-32-ből származó antigéneket is tartalmazhatnak. The vaccines of the invention also other HPV strains, preferably the HPV 615 • ···· · · · · · antigens derived from the HPV-ll out, from HPV-31 or HPV-32 agents.

Az oltóanyagok előállítását a Pharmaceutical Biotechnology Oltóanyagok tervezése - az alegység és az adjuváns eljárás (Vaccine Design - the subunit and adjuvant approach) című 6. kötete [szerk. 6. Volume taken - (the subunit and adjuvant approach Vaccine Design) [ed - in Pharmaceutical Biotechnology design Vaccines The preparation of vaccines, the subunit and adjuvant method. Powell és Newman, Plenurn Press (1995)] ismerteti. Powell and Newman, Plenurn Press, (1995)] disclosed. A liposzómás bekapszulázást például Fullerton ismerteti (4,235,877 számú egyesült államokbeli szabadalom). Liposomal encapsulation example describes Fullerton (U.S. No. 4,235,877 patent).

Az előnyös oligonukleotid-szekvenciák előnyösen egy vagy több CpG-motívumot tartalmaznak, amelyek hat vagy több nukleotid távolságra helyezkednek el egymástól. Preferred oligonucleotide sequences preferably contain one or more CpG motifs spaced apart by six or more nucleotides. A találmány szerinti oligonukleotidok általában dezoxinukleotidok. The oligonucleotides of the invention are generally deoxynucleotides. A találmány egyik előnyös megvalósítási módjában az oligonukleotidban lévő nukleotidok közötti kötések foszforoditioátkötések vagy még előnyösebben foszforotioátkötések. foszforoditioátkötések or more preferably a phosphorothioate linkages between nucleotides in the oligonucleotide is a preferred embodiment of the invention. habár a foszfodiészterkötés vagy egyéb nukleotidok közötti kötések is megfelelőek a találmány céljára, ezen belül olyan oligonukleotidok is, amelyekben többféle kötés is található. although phosphodiester linkages between nucleotides, or other appropriate for use herein, also including oligonucleotides having a plurality of bonding area.

Az előnyös oligonukleotidok szekvenciája a következő: a szekvenciák előnyösen minden esetben a nukleotidok közötti kötés helyén foszforotioát-módosított kötést tartalmaznak. Preferred oligonucleotides have the following sequences: The sequences preferably contain all phosphorothioate modified linkages case the bond between the nucleotides is appropriate.

1. First oligó: oligo: TCC TCC ATG ATG ACG ACG TTC TTC CTG CTG ACG ACG TT TT
2. Second oligó: oligo: TCT TCT CCC CCC AGC AGC GTG GTG CGC CGC CAT CAT
3. Third oligó: oligo: ACC ACC GAT DAM GAC GAC GTC GTC GCC GCC GGT GGT GAC GGC ACC ACG GAC GGC ACC ACG

• · • ·

A találmányban alkalmazott CpG-oligonukleotidok bármilyen, a technikában ismert eljárás (pl. EP 468 520) segítségével megszintetizálhatók. using CpG oligonucleotides utilized in this invention by any method known in the art (eg. EP 468 520) can be synthesized. Az oligonukleotidokat célszerűen automatikus szintetizátorban állítjuk elő. The oligonucleotides are conveniently prepared using an automatic synthesizer. A foszforotioát-oligonukleotidok vagy a foszforoditioátok előállítására szolgáló eljárásokat az 5,663,153 és az 5,278,302 számú egyesült államokbeli szabadalmak, valamint a WO 95/26204 ismerteti. Processes for the phosphorothioate oligonucleotides or phosphorodithioate are described in the preparation of 5,663,153 and 5,278,302 U.S. Patents, as well as in WO 95/26204.

A találmányt az alábbiakban példákon keresztül részletesebben is ismertetjük. The invention is described in more detail by means of examples below.

I. példa Example I

Protein-Dl/3—E7—His (HPV-16)_fúziós_fehérjét expresszáló E. coli törzs előállítása Preparation of Protein-Dl / 3-E7-His (HPV 16) _fúziós_fehérjét E. coli strain expressing

1. Az expressziós plazmid előállítása 1. Preparation of expression plasmid

a) A pMG MCS prot Dl/3 (=pRIT14589) plazmid a pMG81 (ld. WO 97/01640 számon megjelentetett 951 3261.9 számú egyesült királyságbeli szabadalom) származéka, amelyben az Influenza-NSl kódoló régiójának 4-81. a) Plasmid pMG MCS prot Dl / 3 (= pRIT14589) published the pMG81 (see Fig. WO 97/01640 under No. 951 3261.9 UK patent) derivative thereof, wherein the influenza NSl coding region of 4-81. kodonjait a Haemophilus influenzáé 772. törzse, 2. biotípusának [H. codons Haemophilus influenzae strain 772, biotype 2 [H. Janson és mtsai., Infection and Immunity Jan., 119-125 (1991)] érett protein-D-jének Ser20-»Thrl27 részletével helyettesítettünk. replaced »Thrl27 portion of Janson et al., Infection and Immunity, Jan. (1991)] from 119 to 125 of mature protein D of Ser20-. A Prot-Dl/3 szekvenciája után egy többszörös klónozóhely (11 aminosav) , majd a C-terminális Histoldalékot (6 His) kódoló régió található. After Prot-Dl / 3 sequence of a multiple cloning site (11 residues) and a coding region for the C-terminal Histoldalékot (6 His) found. A plazmidot a protein-Dl/3—E7—His fúziós fehérje expresszáltatására alkalmaztuk . This plasmid is used in the protein-Dl / 3-E7-His fusion protein expression.

• ·· · · · · · • ·· · · · · ·

b) A HPV-genomból származó HPV-16 E6- és E7szekvenciákat [ld. b) HPV-16 E6 and HPV genome originating E7szekvenciákat [ld. Dorf és mtsai., Virology 145, 181-185 (1985)] a HPV-16 pBR322-be klónozott teljes genomjából [forrás: Deutsches Krebsforschungzentrum (DKFZ), Referenzzentrum für humán pathogen Papillomaviruses - D 69120 - Heidelberg] amplifikáitűk, majd pUC19-be szubklónoztuk, és így kaptuk a TCA301-et (=pRIT14462). Dorf et al, Virology 145, 181-185 (1985)] cloned HPV 16 full length genome pBR322 [source: obtained from Deutsches Krebsforschungszentrum (DKFZ), Referenzzentrum fur human pathogen Papillomaviruses - D 69120 - Heidelberg] was amplified and pUC19. subcloned into, to provide compound was TCA301 (= pRIT14462).

A protein-Dl/3—E7—His fúziós fehérjét expresszáló TCA308 (=pRIT14501) plazmid előállítása Protein-Dl / 3-E7-His fusion protein expressing TCA308 (= pRIT14501) Plasmid

Az E7-fehérje l->98 aminosavainak megfelelő nukleotidszekvenciát a pRIT14462-ből amplifikáltuk. corresponding to the E7 protein l-> 98 amino acids of the nucleotide sequence amplified from pRIT14462 out. A polimerázláncreakció során az E7-szekvencia 5'- és 3'-végein Ncol és Spel hasítóhelyeket hoztunk létre, amelynek segítségével be tudtuk illeszteni a pMGMCS Prot Dl/3 plazmid azonos helyeire, és így kaptuk a TCA308 plazmidot (=pRIT14501). During the polymerase chain E7 sequence 5 'and 3' ends we were generated NcoI and SpeI recognition sites, whereby we were able to paste the pMGMCS Prot Dl / 3 of the same sites of plasmid to give plasmid TCA308 (= pRIT14501). Ezt követően megszekvenáltuk az inszertet és így ellenőriztük, hogy a polimeráz-láncreakció során nem jött létre módosítás. Subsequently, the insert was sequenced, and thus verify that no modification had been generated during the polymerase chain reaction. A protein-Dl/3—E7—His (HPV-16) fúziós fehérje szekvenciáját az 1. azonosítószámú szekvenciánál, a kódoló szekvenciát pedig a 2. azonosítószámú szekvenciánál tüntettük fel. Protein-Dl / 3-E7-His (HPV-16) fusion protein sequence is shown in sequence ID No. 2 ID No. 1 sequence, the coding sequence.

2. Az AR58 törzs transzformálása 2. The AR58 strain Transformation

A pRIT14501 plazmidot E. coli AR58 törzsbe [Mott és mtsai., Proc. The plasmid pRIT14501 E. coli strain AR58 [Mott et al., Proc. Natl. Natl. Acad. Acad. Sci. 82, 88 (1985)] vittük be, amely az λ-pL promóter egy hőérzékeny represszorát tartalmazó hibás λ-lizogén. Sci., 82, 88 (1985)] was introduced to the λ pL promoter defective λ lysogen containing a thermosensitive repressor.

• · • ··«····· ·· • · · · · · ·· ··· · ·· ··· • · ·· ·· ·· · · • · • ·· "····· ·· • · · · · · · · · · ·· ·· ·· ·· ·· · · · • · · ·

3. A baktériumtörzs szaporítása és indukálása - A Prot-Dl/3—E7—His expresszáltatása 3. Strain propagation and induction - of Prot-Dl / 3-E7-His Expression

A pRIT14501 plazmiddal transzformált AR58-sejteket 50 gg/ml kanamicint tartalmazó 100 ml LB-tápközegben, 30°C-on szaporítottuk. transformed with plasmid pRIT14501 were grown AR58 100 ml LB medium containing 50 gg / ml of kanamycin at 30 ° C. A növekedés logaritmikus szakaszában a hőmérsékletet a λ-represszor inaktiválása és a protein-Dl/3— E7—His fehérje szintézisének beindítása érdekében 39°C-ra emeltük majd a baktériumokat 4 óra után lecentrifugáltuk és logarithmic phase of growth, the temperature was raised to 39 ° C and the bacteria are centrifuged after 4 hours and for the λ repressor and start deactivating the protein-Dl / 3-E7-His protein synthesis

-20°C-ra tettük. At -20 ° C.

II. II. példa example

Protein-Dl/3—E6—his / HPV-16 fúziós fehérjét expresszáló E. coli törzs előállítása Preparation of Protein-Dl / 3-E6-his / HPV-16 fusion protein in E. coli strain expressing

1. Az expressziós plazmid előállítása 1. Preparation of expression plasmid

a) A pMG MCS prot Dl/3 (=pRIT14589) plazmid a pMG81 (ld. WO 97/01640 számon megjelentetett 951 3261.9 számú egyesült királyságbeli szabadalom) származéka, amelyben az Jníluenza-NSl kódoló régiójának 4-81. a) Plasmid pMG MCS prot Dl / 3 (= pRIT14589) published the pMG81 (see Fig. WO 97/01640 under No. 951 3261.9 UK patent) derivative thereof, wherein the Jníluenza-NSl coding region of 4-81. kodonjait a Haemophilus influenzáé 772. törzse, 2. biotípusának [H. codons Haemophilus influenzae strain 772, biotype 2 [H. Janson és mtsai., Infection and Immunity Jan., 119-125 (1991)] érett protein-D-jének Ser20-»Thrl27 részletével helyettesítettünk. replaced »Thrl27 portion of Janson et al., Infection and Immunity, Jan. (1991)] from 119 to 125 of mature protein D of Ser20-. A Prot-Dl/3 szekvenciája után egy többszörös klónozóhely (11 aminosav), majd a C-terminális Histoldalékot (6 His) kódoló régió található. After Prot-Dl / 3 sequence of a multiple cloning site (11 residues) and a coding region for the C-terminal Histoldalékot (6 His) found. A plazmidot a protein-Dl/3—E6—his fúziós fehérje expresszáltatására alkalmaztuk. This plasmid is used in the protein-Dl / 3-E6-his fusion protein expression.

• · • ·

b) A HPV-genomból származó HPV-16 E6- és E7-szekvenciákat [ld. b) from the HPV-16 genome, the HPV E6 and E7 sequences [see Fig. Dorf és mtsai., Virology 145, 181-185 (1985)] a HPV-16 pBR322-be klónozott teljes genomjából [forrás: Deutsches Krebsforschungzentrum (DKFZ), Referenzzentrum für humán pathogen Papillomaviruses - D 69120 - Heidelberg] amplifikáltuk, majd pUC19-be szubklónoztuk, és így kaptuk a Dorf et al [source Virology 145: 181-185 (1985)] cloned HPV 16 full length genome pBR322. Obtained from Deutsches Krebsforschungszentrum (DKFZ), Referenzzentrum fur human pathogen Papillomaviruses - D 69120 - Heidelberg] amplified and pUC19 We subcloned in to give the

TCA301-et (=pRIT14462). It was TCA301 (= pRIT14462).

A protein-Dl/3—E6—His/HPV-16 fúziós fehérjét expresszáló TCA307 (=pRIT14497) plazmid előállítása Protein-Dl / 3-E6-His / HPV-16 fusion protein expressing TCA307 (= pRIT14497) Plasmid

Az E6-fehérje 1—>151 aminosavainak megfelelő nukleotidszekvenciát a pRIT14462-ből amplifikáltuk. The E6 protein corresponding 1-> 151 amino acids of the nucleotide sequence amplified from pRIT14462 out. A polimeráz-láncreakció során az E6-szekvencia 5'- és 3'végein Ncol és Spel hasítóhelyeket hoztunk létre, amelynek segítségével be tudtuk illeszteni a pMGMCS Prot Dl/3 plazmid azonos helyeire, és így kaptuk a TCA307 plazmidot (=pRIT14497). During the polymerase chain reaction, the sequence 5 'and E6 3'végein created Ncol and Spel recognition sites, whereby we were able to paste the pMGMCS Prot Dl / 3 of the same sites of plasmid to give the plasmid TCA307 (= pRIT14497). Ezt követően megszekvenáltuk az inszertet és így ellenőriztük, hogy a polimeráz-láncreakció során nem jött létre módosítás. Subsequently, the insert was sequenced, and thus verify that no modification had been generated during the polymerase chain reaction. A protein-Dl/3—E6—His fúziós fehérje szekvenciáját a 3. azonosítószámú szekvenciánál, a kódoló szekvenciát pedig a 4. azonosítószámú szekvenciánál tüntettük fel. Protein-Dl / 3-E6-His fusion protein sequence is shown in SEQ ID NO: 4, Seq ID No. 3 sequence of the coding sequence.

2. Az AR58 törzs transzformálása 2. The AR58 strain Transformation

A pRIT14501 plazmidot E. coli AR58 törzsbe [Mott és mtsai., Proc. The plasmid pRIT14501 E. coli strain AR58 [Mott et al., Proc. Natl. Natl. Acad. Acad. Scí. Sci. 82, 88 (1985)] vittük be, amely az λ-pL promoter egy hőérzékeny represszorát tartalmazó hibás λ-lizogén. 82, 88 (1985)] was introduced to the λ pL promoter defective λ lysogen containing a thermosensitive repressor.

• · • «·*····· · · • · · · · ·· ··· · ·· ·*· • · ·· ·· ·· · _· • ··· ·· ·· · · • · • «* ····· · · · • · · · · · · · · ·· ·· * · · • · · ·· ·· ·· ·· ·· _ · • · · · · ·

3. A baktériumtörzs szaporítása és indukálása - A Prot-Dl/3—E6—His expresszáltatása 3. Strain propagation and induction - of Prot-Dl / 3-E6-His Expression

A pRIT14501 plazmiddal transzformált AR58-sejteket 50 gg/ml kanamicint tartalmazó 100 ml LB-tápközegben, 30°C-on szaporítottuk. transformed with plasmid pRIT14501 were grown AR58 100 ml LB medium containing 50 gg / ml of kanamycin at 30 ° C. A növekedés logaritmikus szakaszában a hőmérsékletet a λ-represszor inaktiválása és a protein-Dl/3— E6—his fehérje szintézisének beindítása érdekében 39°C-ra emeltük majd a baktériumokat 4 óra után lecentrifugáltuk és logarithmic phase of growth, the temperature was raised to 39 ° C and the bacteria are centrifuged after 4 hours and for the λ repressor and start deactivating the protein-Dl / 3-E6-his protein synthesis

-20°C-ra tettük. At -20 ° C.

4. A protein-Dl/3—E6—his (HPV-16) fúziós fehérje jellemzése 4. Characterization of protein-Dl / 3-E6-his (HPV-16) fusion protein

A kivonatok elkészítése Preparation of extracts

A lefagyasztott sejteket felolvasztottuk, 10 ml PBSpufferben felszuszpendáltuk, majd SLM Aminco Francia típusú, nyomás alkalmazásán alapuló sejtsajtolóban 20.000 psi nyomáson (három lépésban) összetörtük. The frozen cells were thawed, resuspended in 10 ml PBSpufferben and crushing at 20.000 psi (three) SLM Aminco French type sejtsajtolóban based on the application of pressure. A kivonatot 4°C-on, 30 percig, 16.000 g-vel centrifugáltuk. The extract was centrifuged at 4 ° C for 30 minutes and 16,000 x g.

A Coomassie-festett SDS-poliakrilamid-gelek és a Western-blottok elemzése The Coomassie-stained SDS-polyacrylamide gels and Western blots analysis

A fenti kivonatok centrifugálása után mintákat vettünk a felülúszóból és a pelletből, majd SDS-poliakrilamidgélelektroforézissel és Western-blottolással megvizsgáltuk őket. After centrifugation of extracts described above, aliquots of supernatant and pellet were analyzed by SDS-poliakrilamidgélelektroforézissel and Western blotting.

A Coomassie-val festett gelekben a pelletfrakciónál a legerőteljesebb sáv körülbelül 32 kDa-nál jelent meg, amelyet a Western-blottokon nyúl poliklonális anti-protein-Dvel és a hozzáférhető hisztidinfarkat detektáló borjú vékonybél alkalikus foszfatázhoz kapcsolt Ni-NTA konjugátum • · · (Qiagen kát. sz. 34510) segítségével azonosítottuk. The Coomassie stained gels in the pellet strongest band of about 32 kDa to that in Western blots by rabbit polyclonal anti-protein Dvel and connected to the available hisztidinfarkat detecting calf intestinal alkaline phosphatase by Ni-NTA conjugate • · (Qiagen using no. 34510) Cat. identified. Az expresszié szintje a teljes fehérje körülbelül 5%-ának felelt meg. The level of expression represents about 5% of the total protein.

5. Koexpresszió tioredoxinnal 5. coexpression thioredoxin

A prot-Dl/3—E7—His (HPV-18) expresszáltatásával (IX. példa) analóg módon E. coli AR58 törzset a tioredoxint és a protein-Dl/3—E7—His (HPV-16) konstrukciót kódoló plazmiddal transzformáltuk. Proton Dl / 3-E7-His (HPV-18) expression (example IX.) Analogously E.coli AR58 strain with a plasmid encoding thioredoxin and protein-Dl / 3-E7-His (HPV 16) construct was transformed .

III. III. példa example

Protein-Dl/3—E6E7—his / HPV-16 fúziós fehérjét expresszáló E. coli törzs előállítása Preparation of Protein-Dl / 3-E6E7-his / HPV-16 fusion protein in E. coli strain expressing

1. Az expressziós plazmid előállítása 1. Preparation of expression plasmid

a) A pMG MCS prot Dl/3 (=pRIT14589) plazmid a pMG81 (ld. fent) származéka, amelyben az Tn_fluenza-NSl kódoló régiójának 4-81. a) Plasmid pMG MCS prot Dl / 3 (= pRIT14589) of pMG81 (see Fig. above) from which the coding region of the NS-Tn_fluenza 4-81. kodonjait a Haemophilus influenzáé 772. törzse, 2. biotípusának [H. codons Haemophilus influenzae strain 772, biotype 2 [H. Janson és mtsai., Infection and Immunity Jan., 119-125 (1991)] érett protein-D-jének Janson et al., Infection and Immunity, Jan., 119-125 (1991)] of mature protein D of

Ser20-»Thrl27 részletével helyettesítettünk. replaced Ser20- »Thrl27 portion thereof. A Prot-Dl/3 szekvenciája után egy többszörös klónozóhely (11 aminosav), majd a C-terminális His-toldalékot (6 His) kódoló régió található. After Prot-Dl / 3 sequence of a multiple cloning site (11 residues) and a coding region for the C-terminal histidine tail (6 His) found. A plazmidot a protein-Dl/3—E6E7—his fúziós fehérje expresszáltatására alkalmaztuk. This plasmid is used in the protein-Dl / 3-E6E7-his fusion protein expression.

b) A HPV-genomból származó HPV-16 E6- és E7szekvenclákat [ld. b) HPV-16 E6 and HPV genome originating E7szekvenclákat [ld. Dorf és mtsai., Virology 145, 181-185 (1985)] a HPV-16 pBR322-be klónozott teljes genomjából [forrás: Deutsches Krebsforschungzentrum (DKFZ), Referenzzentrum fúr humán pathogen Papillomaviruses - D 69120 22 • »* · · * · Dorf et al, Virology 145, 181-185 (1985)] cloned HPV 16 full length genome pBR322 [source:. Obtained from Deutsches Krebsforschungszentrum (DKFZ), Referenzzentrum fur human pathogen Papillomaviruses - D 69120 22 • »* * · · ·

Heidelberg] amplifikáltuk, majd pUC19-be szubklónoztuk, és így kaptuk a TCA301-et (=pRIT14462). Heidelberg] were amplified and subcloned into pUC19 to give the dispenser-TCA301 (= pRIT14462).

c) A TCA301-ben (pRIT14462) lévő E6-ot és az E7-et kódoló szekvenciákat egy szintetikus oligonukleotidadaptorral módosítottuk (amelyet az AflIII és az Nsil helyek közé illesztettünk be) , amellyel az E6- és az E7-gén között egy 5 nukleotidos deléciót hoztunk létre, hogy eltávolítsuk az E6 stopkodonját és így az E6 és az E7 kódoló szekvenciáit egymáshoz fuzionáltassuk. c) encoding in TCA301 in (pRIT14462) E6 and E7 sequences were modified with a synthetic oligonukleotidadaptorral (which was inserted into the Afl III and Nsi I sites), whereby between the E6 and E7 gene 5 nt deletion has been created to remove the stop codon of E6 and thus the coding sequences of the E6 and E7 fusing together. így kaptuk a TCA309 (pRIT14556) plazmidot. give plasmid TCA309 (pRIT14556).

A protein-Dl/3—E6E7—His/HPV-16 fúziós fehérjét expresszáló TCA311 (=pRIT14512) plazmid előállítása Protein-Dl / 3-E6E7-His / HPV-16 fusion protein expressing TCA311 (= pRIT14512) Plasmid

Az E6E7 fúziós fehérje 1—»249 aminosavainak megfelelő nukleotidszekvenciát a pRIT14556-ból amplifikáltuk. 1-> 249 amino acids of a nucleotide sequence corresponding to the E6E7 fusion protein was amplified from pRIT14556 from. A polimeráz-láncreakció során az E6E7 fúziós szekvencia 5'és 3'-végein Ncol és Spel hasítóhelyeket hoztunk létre, amelynek segítségével be tudtuk illeszteni a pMGMCS Prot Dl/3 plazmid azonos helyeire, és így kaptuk a TCA311 plazmidot (=pRIT14512). During the polymerase chain reaction, the E6E7 fused sequences 5'és 3 'ends were generated NcoI and SpeI recognition sites, whereby we were able to paste the pMGMCS Prot Dl / 3 of the same sites of plasmid to give the plasmid TCA311 (= pRIT14512). Ezt követően megszekvenáltuk az inszertet és így ellenőriztük, hogy a polimeráz-láncreakció során nem jött létre módosítás. Subsequently, the insert was sequenced, and thus verify that no modification had been generated during the polymerase chain reaction. A protein-Dl/3—E6/E7—His fúziós fehérje szekvenciáját az 5. azonosítószámú szekvenciánál, a kódoló szekvenciát pedig a 6. azonosítószámú szekvenciánál tüntettük fel. Protein-Dl / 3-E6 / E7-His fusion protein sequence is shown in SEQ ID NO 6, SEQ ID NO: 5 sequence, the coding sequence.

• 9 · · • 9 · ·

2. Az AR58 törzs transzformálása 2. The AR58 strain Transformation

A pRIT14501 plazmidot E. coli AR.58 törzsbe [Mott és mtsai., Proc. The E. coli plasmid pRIT14501 AR.58 strain [Mott et al., Proc. Natl. Natl. Acad. Acad. Sci. 82, 88 (1985)] vittük be, amely az λ-pL promóter egy hőérzékeny represszorát tartalmazó hibás λ-lizogén. Sci., 82, 88 (1985)] was introduced to the λ pL promoter defective λ lysogen containing a thermosensitive repressor.

3. A baktériumtörzs szaporítása és indukálása - A Prot-D 1 /3—E 6E 7—His expresszál tatása 3. Strain Induction and Propagation - the Prot-D 1/3-E 7-His 6E expressed Tatas

A pRIT14512 plazmáddal transzformált AR58-sejteket 50 pg/ml kanamicint tartalmazó 100 ml LB-tápközegben, 30°C-on szaporítottuk. AR58 transformed cells were grown in 100 ml LB medium containing 50 ug / ml kanamycin at 30 ° C. The plazmáddal pRIT14512. A növekedés logaritmikus szakaszában a hőmérsékletet a λ-represszor inaktiválása és a protein-Dl/3— E6E7—his fehérje szintézisének beindítása érdekében 39°C-ra emeltük majd a baktériumokat 4 óra után lecentrifugáltuk és logarithmic phase of growth, the temperature was raised to 39 ° C and the bacteria are centrifuged after 4 hours and for the λ repressor and start deactivating the protein-Dl / 3-E6E7-his protein synthesis

-20°C-ra tettük. At -20 ° C.

4. A protein-Dl/3—E6E7—his (HPV-16) fúziós fehérje jellemzése 4. Characterization of protein-Dl / 3-E6E7-his (HPV-16) fusion protein

A lefagyasztott sejteket felolvasztottuk, 10 ml PBSpufferben felszuszpendáltuk, majd SLM Aminco Francia típusú, nyomás alkalmazásán alapuló sejtsajtolóban 20.000 psi nyomáson (három lépésban) összetörtük. The frozen cells were thawed, resuspended in 10 ml PBSpufferben and crushing at 20.000 psi (three) SLM Aminco French type sejtsajtolóban based on the application of pressure. A kivonatot 4°C-on, 30 percig, 16.000 g-vel centrifugáltuk. The extract was centrifuged at 4 ° C for 30 minutes and 16,000 x g.

A fenti kivonatok centrifugálása után mintákat vettünk a felülúszóból és a pelletből, majd SDS-poliakrilamidgélelektroforézissel és Western-blottolással megvizsgáltuk őket. After centrifugation of extracts described above, aliquots of supernatant and pellet were analyzed by SDS-poliakrilamidgélelektroforézissel and Western blotting.

A Coomassie-val festett gelekben a pelletfrakciónál a legerőteljesebb sáv körülbelül 48 kDa-nál jelent meg, amelyet a Western-blottokon nyúl poliklonális anti-protein-D• · »♦· · ♦ · « • · · · · · · ·« ··· a *♦ ··· ···· · · ·· · .· • · 4 · ·* ·* vei és a hozzáférhető hisztidinfarkat detektáló borjú vékonybél alkalikus foszfatázhoz kapcsolt Ni-NTA konjugátum (Qiagen kát. sz. 34510) segítségével azonosítottuk. The Coomassie stained gels in the pellet strongest band of about 48 kDa by Western blots by rabbit polyclonal anti-protein D • · »♦ · ♦ ·« • · · · · · · · «· ·· the * ♦ ···· ··· ·· · · ·. · • 4 · · · · * * spiked with the available hisztidinfarkat coupled to calf intestinal alkaline phosphatase detection by Ni-NTA conjugate (Qiagen no. cat. 34510) It was identified. Az expresszió szintje a teljes fehérje körülbelül 1%-ának felelt meg. The level of expression represents about 1% of the total protein.

IV. ARC. példa example

Analóg módon a Lipo-Dl/3 és az HPV-16-ból származó E6E7 fúziójából származó fehérjét tioredoxin jelenlétében E. coli-ban expresszáltattuk. Analogously, from Lipo-protein Dl / 3-E6E7 from HPV 16 from fusion of E. coli thioredoxin is expressed in the presence of. A pre-fehérje (388 aminosav) Nterminálisa MDP-aminosavakat tartalmaz, amelyet a lipoprotein-D (Haemophilus influenzáé) szignálpeptidjének 16 aminosava követ, amely in vivő lehasad és így jön létre az érett fehérje (370 aminosav). The pre-protein (388 aa) contains MDP N-terminal amino acids followed by 16 amino acids of signal peptide of lipoprotein D (Haemophilus influenzae), which is cleaved in vivo in order to form the mature protein (370 amino acids). A lipoprotein (1-127. aminosav) részt az E6-ból és az E7-ből álló fúziós fehérje követi, a fehérje C-terminálisán pedig egy TSGHHHHHH szekvencia található. Lipoprotein (1-127. Amino acids) is followed by a fusion protein of E6 and E7 from out of, the C-terminus of the protein and a sequence located TSGHHHHHH.

V. példa EXAMPLE V

A ProtDl/3—E7mutált(cys24-»gly,glu26->gln)/HPV-16 fúziós fehérjét expresszáló E. coli B1002 törzs előállítása The ProtDl / 3-E7mutált (cys24- »gly, glu26-> gln) A solution / HPV-16 fusion protein was expressed in E. coli strain B1002

1. Az expressziós plazmid előállítása 1. Preparation of expression plasmid

Kiindulási anyagok starting materials

a) pRIT14501 (=TCA308) plazmid, amely a ProtDl/3—E7— a) pRIT14501 (= TCA308) plasmid that of ProtDl / 3-E7

His-t kódolja His encodes

b) LITMUS28 plazmid (New England Biolabs kát. sz. 30628), egy pUC-ből származó klónozó vektor • · • ·« *»♦ * · * -* » ♦» · * b) plasmid LITMUS28 (New England Biolabs Cat no 30628), a cloning vector derived from pUC • • · · «*» * · * ♦ -.. * »♦» · *

c) A pMG MCS prot Dl/3 (=pRIT14589) plazmid a pMG81 (ld. fent) származéka, amelyben az Influenza-NSl kódoló régiójának 4-81. c) Plasmid pMG MCS prot Dl / 3 (= pRIT14589) of pMG81 (see Fig. above) derivative thereof, wherein the influenza NSl coding region of 4-81. kodonjait a Haemophilus influenzáé 772. törzse, 2. biotípusának [H. codons Haemophilus influenzae strain 772, biotype 2 [H. Janson és mtsai., Infection and Immunity Jan., 119-125 (1991)] érett protein-D-jének Ser20-»Thrl27 részletével helyettesítettünk. replaced »Thrl27 portion of Janson et al., Infection and Immunity, Jan. (1991)] from 119 to 125 of mature protein D of Ser20-. A Prot-Dl/3 szekvenciája után egy többszörös klónozóhely (11 aminosav), majd a C-terminális His-toldalékot (6 His) kódoló régió található . After Prot-Dl / 3 sequence of a multiple cloning site (11 residues) and a coding region for the C-terminal histidine tail (6 His) found.

A His-farokkal ellátott protein-Dl/3— E7mutált(cys24—>gly,glu26—>gln) fúziós fehérjét expresszáló pRIT14733 (=TCA347) plazmid előállítása The His-tail with protein-Dl / 3- E7mutált (cys24-> gly, glu26-> gln) fusion protein expressing pRIT14733 (= TCA347) Plasmid

A pRITl4501 (=TCA308) Ncol-Xbal fragmensét, amely a HPV-16-ból származó E7-gén kódoló szekvenciáját és a Hisfarkat hordozza, mutagenezisre alkalmazható Litmus 28 köztes vektorba szubklónoztuk, így kaptuk a pRIT14909-et (=TCA337) . The pRITl4501 (= TCA308) NcoI-XbaI fragment carrying the sequence coding Hisfarkat and the E7 gene from HPV 16 from, subcloned into an intermediate vector Litmus 28 useful for mutagenesis to give the pRIT14909 was (= TCA337). A két mutáció - cys24—»gly [Edmonds és Vousden, J. Virology 63, 2650 (1989] és glu26-»gln [Phelps és mtsai., J. Virology 66, 2418-27 (1992)] - bevitelével csökkenteni kívántuk a retinoblasztóma-gén antionkogén termékéhez (pRB) való kötődést. Az E7-génbe a Quick Change Site Directed Mutagenesis kit (Stratagene kát. sz. 200518) segítségével vittük be a mutációkat, és így kaptuk a pRIT14681-et (=TCA343). A mutációk jelenlétét és a komplett E7-gén integritását szekvenálással ellenőriztük, majd a mutált E7-gént a pRIT14589 (=pMG MCS ProtDl/3) vektorba illesztettük, és így kaptuk a pRIT14733 (=TCA347) plazmidot. The two mutations - cys24- »gly [Edmonds and Vousden, J. Virology 63: 2650 (1989] and glu26-» gln [Phelps et al, J. Virology 66, 2418-27 (1992).] - intended to reduce the introduction of the retinoblastoma gene binding product (pRB). Quick Change Site Directed Mutagenesis kit (Stratagene no. cat. 200518) using transferred mutations on anti-oncogenic E7 gene to give the pRIT14681 was (= TCA343). mutations the presence and integrity of the complete E7 gene was confirmed by sequencing, and the mutated E7 gene in pRIT14589 (= pMG MCS ProtDl / 3) inserted into the vector to give plasmid pRIT14733 (= TCA347).

• * ** a » « · · · · * ♦·»» • * ** to the »« · · · · · * ♦ »»

A protein-Dl/3—E7mutált (cys24—»gly, glu26—>gln)—His fúziós fehérje szekvenciáját a 7. és 8. azonosítószámú szekvencia mutatja. Protein-Dl / 3-E7mutált (cys24- »gly, glu26-> gln) -His fusion protein sequence shown in SEQ ID NO: 7 and 8.

2. A ProtDl/3—E7mutált(cys24—>gly,glu26—>gln)—His/HPV16-ot expresszáló B1002 törzs előállítása 2. ProtDl / 3-E7mutált (cys24-> gly, glu26-> gln) -His / HPV16 Preparation of strain B1002 expressing

A pRIT14733 plazmidot E. coli AR58 törzsbe [Mott és mtsai., Proc. Plasmid pRIT14733 E. coli strain AR58 [Mott et al., Proc. Natl. Natl. Acad. Acad. Sci. 82, 88 (1985)] vittük be, amely az λ-pL promóter egy hőérzékeny represszorát tartalmazó hibás λ-lizogén, és a kanamicinrezisztens transzformánsok szelektálásával kaptuk a B1002 törzset. Sci., 82, 88 (1985)] was introduced, which was obtained from the B1002 strain λ pL promoter defective λ lysogen containing a thermosensitive repressor, and kanamycin-resistant transformants by selection.

3. A B1002 baktériumtörzs szaporítása és indukálása A ProtDl/3—E7mutált (cys24—»gly, glu26—>gln)—His (HFV-16) expresszáltatása 3. The bacterial strain B1002 propagation and induction of ProtDl / 3-E7mutált (cys24- »gly, glu26-> gln) -His (HFV-16) Expression of

A pRIT14733 plazmiddal transzformált AR58-sejteket (B1002 törzs) 50 pg/ml kanamicint tartalmazó 100 ml LBtápközegben, 30°C-on szaporítottuk. AR58 transformed cells (B1002 strain) were grown in 100 ml LBtápközegben containing 50 ug / ml kanamycin at 30 ° C. The plasmid pRIT14733. A növekedés logaritmikus szakaszában a hőmérsékletet a λ-represszor inaktiválása és a protein-Dl/3—E7mutált—His /HPV-16 fehérje szintézisének beindítása érdekében 39°C-ra emeltük majd a baktériumokat 4 óra után lecentrifugáltuk és -20°C-ra tettük. logarithmic phase of the growth temperature was 39 ° C and then raised to the bacteria were spun down and after 4 hours at -20 ° C for the λ repressor inactivate starting protein Dl / 3-E7mutált-His / HPV 16 protein synthesis above.

4. A ProtDl/3—E7mut (cys24->gly,glu26—>gln) —His (HPV16) fúziós fehérje jellemzése 4. ProtDl / 3-E7mut (cys24-> gly, glu26-> gln) -His characterization (HPV16) fusion protein

A lefagyasztott sejteket felolvasztottuk, 10 ml PBSpufferben felszuszpendáltuk, majd SLM Aminco Francia típusú, nyomás alkalmazásán alapuló sejtsajtolóban 20.000 psi nyomáson (három lépésban) összetörtük. The frozen cells were thawed, resuspended in 10 ml PBSpufferben and crushing at 20.000 psi (three) SLM Aminco French type sejtsajtolóban based on the application of pressure. A kivonatot 4°C-on, 30 percig, 16.000 g-vel centrifugáltuk. The extract was centrifuged at 4 ° C for 30 minutes and 16,000 x g.

A fenti kivonatok centrifugálása után mintákat vettünk a felülúszóból és a pelletből, majd SDS-poliakrilamidgélelektroforézissel és Western-blottolással megvizsgáltuk őket. After centrifugation of extracts described above, aliquots of supernatant and pellet were analyzed by SDS-poliakrilamidgélelektroforézissel and Western blotting.

A Coomassie-val festett gelekben a pelletfrakciónál a legerőteljesebb sáv körülbelül 33 kDa-nál jelent meg, amelyet a Western-blottokon nyúl poliklonális 22 J 70 antiprotein-D-vel, monoklonális anti-E7/HPV-l6-tal (Zymed) és a hozzáférhető hisztidinfarkat detektáló borjú vékonybél alkalikus foszfatázhoz kapcsolt Ni-NTA konjugátum (Qiagen kát. sz. 34510) segítségével azonosítottuk. The Coomassie stained gels in the pellet strongest band of about 33 kDa by Western blots by rabbit polyclonal 22 J 70 anti-protein D, with a monoclonal anti E7 / HPV L6 (Zymed) and available hisztidinfarkat coupled to calf intestinal alkaline phosphatase detection by Ni-NTA conjugate (Qiagen cat. no. 34510) was identified. Az expresszió szintje a teljes fehérje körülbelül 3-5%-ának felelt meg. The expression level of about 3-5% of the total protein corresponded cent.

A B1002-sejteket a táplevestől centrifugálással választottuk el, majd a koncentrált B1002-sejteket -65°C-on tároltuk. B1002 The cells were separated by centrifugation of táplevestől then concentrated B1002 cells were stored at -65 ° C.

VI. VI. példa example

A clyta—E6—his (HPV-16) fúziós fehérjét expresszáló E. Expression of clyta-E6-his (HPV-16) fusion protein expressing E.

coli törzs előállítása Preparation coli

1. Az expressziós plazmid előállítása 1. Preparation of expression plasmid

a) A ProtDl/3—E6—His /HPV-16 fúziós fehérjét kódoló pRIT14497 (=TCA307) plazmid a) pRIT14497 encoding ProtDl / 3-E6-His / HPV-16 fusion protein (= TCA307) plasmid

b) A pRIT14661 (=DVA2) a Streptococcus pneumoniae LytA b) the pRIT14661 (= DVA2) LytA from Streptococcus pneumoniae

177 C-terminális kodonját kódoló szekvenciát tartalmazó köztes vektor. 177 intermediate vector containing the coding sequence for the C-terminal codon. A Lyta a Streptococcus pneumoniae-ből származik és egy N-acetil-L-alanin-amidázt, LYTA-amidázt (a lytA-gén terméke [Gene 43, 265-272 (1986))]}, egy autolizint szintetizál, amely specifikusan bontja a *ί»· peptidoglikán gerinc egyes kötéseit. LYTA is derived from Streptococcus pneumoniae, and an N-acetyl-L-alanine amidase, amidase LYTA (product of lytA gene [Gene, 43, 265-272 (1986))]} an autolysin that specifically degrades * the ί »· peptidoglycan backbone certain bonds. A LYTA-fehérje Cteminális doménje a felelős a kolin és egyes kolinanalógok, pl. The domain of the LYTA protein is responsible for the Cteminális choline and choline analogues individual, for example. DEAE iránti affinitásért. DEAE affinity to.

lb A clyta—E6—His (HPV-16) fúziós fehérjét kódoló PRIT14634 (=TCA332) plazmid előállítása lb PRIT14634 (= TCA332) Preparation of a plasmid encoding the clyta-E6-his (HPV-16) fusion protein

a) Az első lépésben megtisztítottuk a pRIT14497 plazmid nagy NcoI-AflIII restrikciós fragmensét és a pRIT14661 plazmid kis Af lIII-AflIII restrikciós fragmensét. a) The first step was purified AflIII large NcoI restriction fragment of plasmid pRIT14661 and the small Af LIII-AflIII restriction fragment of plasmid pRIT14497.

b) A második lépésben hozzákapcsoltuk a clyta szekvenciát az E6—His zekvenciához (az Ncol és az AflIII egymással kompatibilis hasítóhelyek), így kaptuk a pRIT14634 (=TCA332) plazmidot, amely a pL-promóter irányítása alatt a clyta—E6—His fúziós fehérjét kódolja. b) The second step was coupled to the clyta sequences of E6-His zekvenciához (NcoI and AflIII are compatible restriction sites) to give plasmid pRIT14634 (= TCA332), that is under the control of the pL promoter of clyta-E6-His fusion protein encodes.

A clyta—E6—His fúziós fehérje szekvenciáját a 9. azonosítószámú szekvenciánál, a kódoló szekvenciát pedig a 10. Expression of clyta-E6-His fusion protein sequence of Seq ID No. 9, and 10 of the coding sequence.

azonosítószámú szekvenciánál tüntettük fel. shown in SEQ ID NO.

Az AR58 törzs transzformálása The AR58 strain Transformation

A pRITl4634 plazmidot E. coli AR58 törzsbe [Mott és mtsai., Proc. The E.coli AR58 strain Plasmid pRITl4634 [Mott et al., Proc. Natl. Natl. Acad. Acad. Sci. 82, 88 (1985)] vittük be, amely az λ-pL promoter egy hőérzékeny represszorát tartalmazó hibás λ-lizogén. Sci., 82, 88 (1985)] was introduced to the λ pL promoter defective λ lysogen containing a thermosensitive repressor.

A baktériumtörzs szaporítása és indukálása - A clyta— E6—His expresszáltatása Strain Induction and Propagation - the clyta- E6-His Expression

A pRIT14634 plazmiddal transzformált AR58-sejteket 50 gg/ml kanamicint tartalmazó 100 ml LB-tápközegben, 30°C-on szaporítottuk. AR58 transformed cells were grown in 100 ml LB medium containing 50 gg / ml of kanamycin at 30 ° C. The plasmid pRIT14634. A növekedés logaritmikus szakaszában a hőmérsékletet a λ-represszor inaktiválása és a clyta—E6—his fehérje szintézisének beindítása érdekében 39°C-ra emeltük logarithmic phase of growth, the temperature was raised to 39 ° C to inactivate the λ repressor start of clyta-E6-his protein synthesis

• ·· • · · majd a baktériumokat 4 óra után lecentrifugáltuk és -20°Cra tettük. • • · ·· and the bacteria were spun down and after 4 hours at -20 ° C.

4. A clyta—E6—his fúziós fehérje jellemzése 4. Characterization of fusion clyta-E6-his protein

A lefagyasztott sejteket felolvasztottuk, 10 ml PBSpufferben felszuszpendáltuk, majd SLM Aminco Francia típusú, nyomás alkalmazásán alapuló sejtsajtolóban 20.000 psi nyomáson (három lépésban) összetörtük. The frozen cells were thawed, resuspended in 10 ml PBSpufferben and crushing at 20.000 psi (three) SLM Aminco French type sejtsajtolóban based on the application of pressure. A kivonatot 4°C-on, 30 percig, 16.000 g-vel centrifugáltuk. The extract was centrifuged at 4 ° C for 30 minutes and 16,000 x g. A fenti kivonatok centrifugálása után mintákat vettünk a felülúszóból és a pelletből, majd SDS-poliakrilamid-gélelektroforézissel és Western-blottolással megvizsgáltuk őket. After centrifugation of extracts described above, aliquots of supernatant and pellet were analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and Western blotting.

A Coomassie-val festett gelekben a pelletfrakciónál a legerőteljesebb sáv körülbelül 33 kDa-nál jelent meg, amelyet a Western-blottokon nyúl poliklonális anti-clyta-val és a hozzáférhető hisztidinfarkat detektáló borjú vékonybél alkalikus foszfatázhoz kapcsolt Ni-NTA konjugátum (Qiagen kát. sz. 34510) segítségével azonosítottuk. The Coomassie stained gels in the pellet strongest band of about 33 kDa by Western blots by rabbit polyclonal anti-clyta with and accessible hisztidinfarkat detecting calf intestinal alkaline phosphatase linked Ni-NTA conjugate (Qiagen Cat. . 34510) was identified. Az expresszié szintje a teljes fehérje körülbelül 3%-ának felelt meg. The level of expression represents about 3% of the total protein.

VII. VII. példa example

A clyta—E7—his (HPV-16) fúziós fehérjét expresszáló E. Expression of clyta-E7-his (HPV-16) fusion protein expressing E.

coli törzs előállítása Preparation coli

1. Az expressziós plazmid előállítása 1. Preparation of expression plasmid

la Kiindulási anyagok la Starting Materials

a) A ProtDl/3—E7-His /HPV-16 fúziós fehérjét kódoló pRIT14501 (=TCA308) plazmid a) pRIT14501 encoding ProtDl / 3-E7-His / HPV-16 fusion protein (= TCA308) plasmid

b) A Streptococcus pneumoniae LytA 177 C-terminális kodonját kódoló szekvenciát tartalmazó pRIT14661 (=DVA2) köztes vektor b) pRIT14661 containing the coding LytA of Streptococcus pneumoniae 177 C-terminal codons of the sequence (= DVA2) intermediate vector

1. b A clyta—E7—His (HPV-16) fúziós fehérjét kódoló pRIT14626 (=TCA330) plazmid előállítása 1b pRIT14626 (= TCA330) Preparation of a plasmid encoding the clyta-E7-His (HPV-16) fusion protein

a) Az első lépésben megtisztítottuk a pRIT14501 plazmid nagy NcoI-AflIII restrikciós fragmensét és a pRIT14661 plazmid kis AflIII-AfIlii restrikciós fragmensét. a) The first step was purified AflIII large NcoI restriction fragment of plasmid pRIT14661 and the small-AfIlii Afl III restriction fragment of plasmid pRIT14501.

b) A második lépésben hozzákapcsoltuk a clyta szekvenciát az E7—His szekvenciához (az Ncol és az AflIII egymással kompatibilis hasítóhelyek), így kaptuk a pRIT14626 (=TCA330) plazmidot, amely a pL-promóter irányítása alatt a clyta—E7—His fúziós fehérjét kódolja. b) The second step was coupled to the clyta sequences to the E7-His sequences (NcoI and AflIII are compatible restriction sites) to give plasmid pRIT14626 (= TCA330), that is under the control of the pL promoter of clyta-E7-His fusion protein encodes.

A clyta—E7—His fúziós fehérje szekvenciáját a 11. azonosítószámú szekvenciánál, a kódoló szekvenciát pedig a 12. azonosítószámú szekvenciánál tüntettük fel. Expression of clyta-E7-His fusion protein sequence is shown in SEQ ID NO 12 of the sequence ID No. 11 sequence, the coding sequence.

2. Az AR58 törzs transzformálása 2. The AR58 strain Transformation

A pRIT14626 plazmidot E. coli AR58 törzsbe [Mott és mtsai., Proc. Plasmid pRIT14626 E. coli strain AR58 [Mott et al., Proc. Natl. Natl. Acad. Acad. Sci. 82, 88 (1985)] vittük be, amely az λ-pL promoter egy hőérzékeny represszorát tartalmazó hibás λ-lizogén. Sci., 82, 88 (1985)] was introduced to the λ pL promoter defective λ lysogen containing a thermosensitive repressor.

3. A baktériumtörzs szaporítása és indukálása - A clyta—E7—His expresszáltatása 3. Strain Induction and Propagation - Expression of clyta-E7-His Expression

A pRIT14626 plazmiddal transzformált AR58-sejteket 50 pg/ml kanamicint tartalmazó 100 ml LB-tápközegben, 30°C-on szaporítottuk. AR58 transformed cells were grown in 100 ml LB medium containing 50 ug / ml kanamycin at 30 ° C. The plasmid pRIT14626. A növekedés logaritmikus szakaszában a hőmérsékletet a λ-represszor inaktiválása és a clyta—E7—his fehérje szintézisének beindítása érdekében 39°C-ra emeltük • ·· · • · · majd a baktériumokat 4 óra után lecentrifugáltuk és -20°Cra tettük. logarithmic phase of the growth temperature for the λ repressor inactivate the starting clyta-E7-his protein synthesis was raised to 39 ° C • • ·· · · · and the bacteria were spun down and after 4 hours at -20 ° C.

4. A clyta—E7—his fúziós fehérje jellemzése 4. Characterization of fusion clyta-E7-his protein

A lefagyasztott sejteket felolvasztottuk, 10 ml PBSpufferben felszuszpendáltuk, majd SLM Aminco Francia típusú, nyomás alkalmazásán alapuló sejtsajtolóban 20.000 psi nyomáson (három lépésban) összetörtük. The frozen cells were thawed, resuspended in 10 ml PBSpufferben and crushing at 20.000 psi (three) SLM Aminco French type sejtsajtolóban based on the application of pressure. A kivonatot 4°C-on, 30 percig, 16.000 g-vel centrifugáltuk. The extract was centrifuged at 4 ° C for 30 minutes and 16,000 x g. A fenti kivonatok centrifugálása után mintákat vettünk a felülúszóból és a pelletből, majd SDS-poliakrilamid-gélelektroforézissel és Western-blottolással megvizsgáltuk őket. After centrifugation of extracts described above, aliquots of supernatant and pellet were analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and Western blotting.

A Coomassie-val festett gelekben a pelletfrakciónál a legerőteljesebb sáv körülbelül 35 kDa-nál jelent meg, amelyet a Western-blottokon nyúl poliklonális anti-clyta-val és a hozzáférhető hisztidinfarkat detektáló borjú vékonybél alkalikus foszfatázhoz kapcsolt Ni-NTA konjugátum (Qiagen kát. sz. 34510) segítségével azonosítottuk. The Coomassie stained gels in the pellet strongest band of about 35 kDa by Western blots by rabbit polyclonal anti-clyta with and accessible hisztidinfarkat detecting calf intestinal alkaline phosphatase linked Ni-NTA conjugate (Qiagen Cat. . 34510) was identified. Az expresszió szintje a teljes fehérje körülbelül 5%-ának felelt meg. The level of expression represents about 5% of the total protein.

VIII. VIII. példa example

A clyta—E6E7—his (HPV-16) fúziós fehérjét expresszáló Expression of clyta-E6E7-his (HPV-16) fusion protein-expressing

E. coli törzs előállítása Preparation of E. coli

1. Az expressziós plazmid előállítása 1. Preparation of expression plasmid

la Kiindulási anyagok la Starting Materials

a) A ProtDl/3—E6E7—His /HPV-16 fúziós fehérjét kódoló pRIT14512 (=TCA311) plazmid ···· ·*·· a) encoding ProtDl / 3-E6E7-His / HPV-16 fusion protein pRIT14512 (= TCA311) ···· plasmid * · ··

b) A Streptococcus pneumoniae LytA 177 C-terminális kodonját kódoló szekvenciát tartalmazó pRIT14661 (=DVA2) köztes vektor b) pRIT14661 containing the coding LytA of Streptococcus pneumoniae 177 C-terminal codons of the sequence (= DVA2) intermediate vector

1. b A clyta—E6E 7—His (HFV-16) fúziós fehérjét kódoló pRIT14629 (=TCA331) plazmid előállítása 1b pRIT14629 (= TCA331) Preparation of a plasmid encoding the E6E clyta-7-His (HFV-16) fusion protein

a) Az első lépésben megtisztítottuk a pRIT14512 plazmid nagy NcoI-AflIII restrikciós fragmensét és a pRIT14661 plazmid kis AflIII-AflIII restrikciós fragmensét. a) The first step was purified AflIII large NcoI restriction fragment of plasmid pRIT14661 and the small AflIII-AflIII restriction fragment of plasmid pRIT14512.

b) A második lépésben hozzákapcsoltuk a clyta szekvenciát az E6E7—His szekvenciához (az Ncol és az AflIII egymással kompatibilis hasítóhelyek), így kaptuk a pRIT14629 (=TCA331) plazmidot, amely a pL-promóter irányítása alatt a clyta—E6E7—His fúziós fehérjét kódolja. b) The second step was coupled to the clyta sequences of E6E7-His sequences (NcoI and AflIII are compatible restriction sites) to give plasmid pRIT14629 (= TCA331), that is under the control of the pL promoter of clyta-E6E7-His fusion protein encodes.

A clyta—E6E7—His fúziós fehérje szekvenciáját a 13. azonosítószámú szekvenciánál, a kódoló szekvenciát pedig a 14. azonosítószámú szekvenciánál tüntettük fel. Expression of clyta-E6E7-His fusion protein sequence is shown in SEQ ID NO 14 to SEQ ID No 13 sequence, the coding sequence.

2. Az AR58 törzs transzformálása 2. The AR58 strain Transformation

A pRIT14629 plazmidot E. coli AR58 törzsbe [Mott és mtsai., Proc. Plasmid pRIT14629 E. coli strain AR58 [Mott et al., Proc. Natl. Natl. Acad. Acad. Sci. 82, 88 (1985)] vittük be, amely az λ-pL promoter egy hőérzékeny represszorát tartalmazó hibás λ-lizogén. Sci., 82, 88 (1985)] was introduced to the λ pL promoter defective λ lysogen containing a thermosensitive repressor.

3. A baktériumtörzs szaporítása és indukálása - A clyta—E6E7—His expresszáltatása 3. Strain Induction and Propagation - Expression of clyta-E6E7-His Expression

A pRITl4629 plazmiddal transzformált AR58-sejteket 50 gg/ml kanamicint tartalmazó 100 ml LB-tápközegben, 30°C-on szaporítottuk. AR58 transformed cells were grown in 100 ml LB medium containing 50 gg / ml of kanamycin at 30 ° C. The plasmid pRITl4629. A növekedés logaritmikus szakaszában a hőmérsékletet a λ-represszor inaktiválása és a clyta—E6E7—his fehérje szintézisének beindítása érdekében 39°C-ra emeltük majd a baktériumokat 4 óra után lecentrifugáltuk és -20°Cra tettük. logarithmic phase of growth, the temperature was raised to 39 ° C and the bacteria were spun down and after 4 hours at -20 ° C in order to inactivate the λ repressor start of clyta-E6E7-his protein synthesis.

4. A clyta—E6E 7—his fúziós fehérje jellemzése 4. Characterization E6E clyta-7-his fusion protein

A lefagyasztott sejteket felolvasztottuk, 10 ml PBSpufferben felszuszpendáltuk, majd SLM Aminco Francia típusú, nyomás alkalmazásán alapuló sejtsajtolóban 20.000 psi nyomáson (három lépésban) Összetörtük. The frozen cells were thawed, resuspended in 10 ml PBSpufferben, press SLM Aminco French type based on the use sejtsajtolóban pressure crushed at 20.000 psi (three). A kivonatot 4°C-on, 30 percig, 16.000 g-vel centrifugáltuk. The extract was centrifuged at 4 ° C for 30 minutes and 16,000 x g.

A fenti kivonatok centrifugálása után mintákat vettünk a felülúszóból és a pelletből, majd SDS-poliakrilamidgélelektroforézissel és Western-blottolással megvizsgáltuk őket. After centrifugation of extracts described above, aliquots of supernatant and pellet were analyzed by SDS-poliakrilamidgélelektroforézissel and Western blotting.

A Coomassie-val festett gelekben a pelletfrakciónál a legerőteljesebb sáv körülbelül 48 kDa-nál jelent meg, amelyet a Western-blottokon nyúl poliklonális anti-clyta-val és a hozzáférhető hisztidinfárkát detektáló borjú vékonybél alkalikus foszfatázhoz kapcsolt Ni-NTA konjugátum (Qiagen kát. sz. 34510) segítségével azonosítottuk. The Coomassie stained gels in the pellet strongest band of about 48 kDa by Western blots by rabbit polyclonal anti-clyta with and accessible hisztidinfárkát detecting calf intestinal alkaline phosphatase linked Ni-NTA conjugate (Qiagen Cat. . 34510) was identified. Az expresszió szintje a teljes fehérje körülbelül 1%-ának felelt meg. The level of expression represents about 1% of the total protein.

IX. IX. példa example

Prot-Dl/3—E7—his (HPV-18) (E. coli B1011) Prot-Dl / 3-E7-his (HPV 18) (E. coli B1011)

A_Protein-Dl/3—E7—his_HPV_koexpresszál tatása tioredoxinnal (E. coli B1012) in trans A_Protein-Dl / 3-E7 his_HPV_koexpresszál Tatas thioredoxin (E. coli B1012) in trans

1. Az expressziós plazmid előállítása • · · · 1. Preparation of expression plasmid • · · ·

la A Protein-Dl/3—E7—His /HPV-18 fúziós fehérjét expresszáló TCA316 (=pRIT14532) plazmid előállítása la Protein-Dl / 3-E7-His / HPV-18 fusion protein expressing TCA316 (= pRIT14532) Plasmid

Kiindulási anyagok starting materials

a) A pMG MCS prot Dl/3 (-pRIT14589) plazmid a pMG81 (ld. WO 97/01640 számon megjelentetett 951 3261.9 számú egyesült királyságbeli szabadalom) származéka, amelyben az Influenza-NSl kódoló régiójának 4-81. a) pMG MCS prot Dl / 3 (-pRIT14589) Plasmid pMG81 (see Fig. WO 97/01640, published under No. 951 3261.9 UK patent) derivative thereof, wherein the influenza NSl coding region of 4-81. kodonjait a Haemophilus influenzáé 772. törzse, 2. biotípusának [H. codons Haemophilus influenzae strain 772, biotype 2 [H. Janson és mtsai., Infection and Immunity Jan., 119-125 (1991)] érett protein-D-jének Ser20—>Thrl27 részletével helyettesítettünk. replaced> Thrl27 portion of Janson et al., Infection and Immunity, Jan. (1991)] from 119 to 125 of mature protein D of Ser20-. A Prot-Dl/3 szekvenciája után egy többszörös klónozóhely (11 aminosav), majd a C-terminális Histoldalékot (6 His) kódoló régió található. After Prot-Dl / 3 sequence of a multiple cloning site (11 residues) and a coding region for the C-terminal Histoldalékot (6 His) found. A plazmidot a protein-Dl/3—E7—his fúziós fehérje expresszáltatására alkalmaztuk. This plasmid is used in the protein-Dl / 3-E7-his fusion protein expression.

b) A HPV-genomból származó HPV-18 E6- és E7szekvenciákat [Colé és mtsai., J. Mól. b) HPV-18 E6 from HPV genome and E7szekvenciákat [Cole et al., J. Mol. Bioi. Biol. 193, 599-608 (1987)] a HPV-18 pBR322-be klónozott teljes genomjából [forrás: Deutsches Krebsforschungzentrum (DKFZ), Referenzzentrum für humán pathogen Papillomaviruses - D 69120 - Heidelberg] amplifikáltuk, majd pUC19-be szubklónoztuk, és így kaptuk a TCA302-t (=pRIT14467). 193, 599-608 (1987)] full length genome cloned in pBR322 HPV 18 [source: obtained from Deutsches Krebsforschungszentrum (DKFZ), Referenzzentrum fur human pathogen Papillomaviruses - D 69120 - Heidelberg] were amplified and subcloned into pUC19 to give the t-TCA302 (= pRIT14467).

A TCA316 (=pRIT14532) plazmid előállítása The TCA316 (= pRIT14532) Plasmid

Az E7-fehérje 1—>105 aminosavainak megfelelő nukleotidszekvenciát a pRIT14467-ből amplifikáltuk. E7 protein as 1-> 105 amino acids of the nucleotide sequence amplified from pRIT14467 out. A polimeráz-láncreakció során az E7-szekvencia 5'- és 3'végein Ncol és Spel hasítóhelyeket hoztunk létre, amelynek segítségével be tudtuk illeszteni a pMGMCS Prot Dl/3 During the polymerase chain reaction, the E7 sequence 5 'and 3'végein created Ncol and Spel recognition sites, whereby we were able to paste the pMGMCS Prot Dl / 3

• · · • · · · plazmid azonos helyeire, és így kaptuk a TCA316 plazmidot (=pRIT14532). • • · · · · · the same sites of plasmid to give plasmid TCA316 (= pRIT14532). Ezt követően megszekvenáltuk az inszertet és az E7-génben találtunk egy módosítást az E7/HPV-18prototípushoz képest (128. nukieotid G—>A), amelynek eredményeként egy glicint glutaminsav helyettesített (az E7 43. aminosava, a fúziós fehérje 156. pozíciója). Subsequently, the insert was sequenced and the E7 gene was found a change as compared with E7 / HPV 18prototípushoz (nucleotide 128 G-> A), which results in a glutamic acid substituted glycine (amino acid residue 43 of the E7, position 156 in fusion protein) . A proteinDl/3—E7—His /HPV-18 fúziós fehérje szekvenciáját a 15. azonosítószámú szekvenciánál, a kódoló szekvenciát pedig a 16. The proteinDl / 3-E7-His / HPV-18 fusion protein of the sequence in SEQ ID NO 15, and 16 of the coding sequence.

azonosítószámú szekvenciánál tüntettük fel. shown in SEQ ID NO.

lb A tioredoxint expresszáló TCA313 (=pRIT14523) plazmid előállítása The thioredoxin-expressing lb TCA313 (= pRIT14523) Plasmid

Kiindulási anyagok starting materials

a) A pBBRlMCS4 plazmid (Antoine, R. és C. Locht, Mól. a) Plasmid pBBRlMCS4 (Antoine R. and C. Locht, Mol.

Microbiol. Microbiol. 6, 1785-1799 (1992); 6, 1785-1799 (1992); ME Kovach és mtsai., ME Kovach et al.,

Biotechnology 16(5), 800-802], amely kompatibilis a ColEl vagy P15a replikációs origókat tartalmazó plazmidokkal Biotechnology 16 (5), 800-802], which is compatible with plasmids containing ColEl or p15A replicons

b) A pMG42 plazmid (ld. WO 93/04175), amely a lambdafág pL-promóterének szekvenciáját tartalmazza b) Plasmid pMG42 (see Fig. WO 93/04175) containing the pL promoter sequence of the phage lambda

c) A pTRX plazmid (Invitrogen, Thiofusion kit, K35001), amely a tioredoxin kódoló szekvenciáját és egy AspA transzkripciós terminátor szekvenciáját hordozza c) The pTRX plasmid (Invitrogen, kit Thiofusion, K35001), which carries the coding sequence and a transcription terminator sequence of the thioredoxin ASPA

A TCA313 (=pRIT14523) plazmid előállítása The TCA313 (= pRIT14523) Plasmid

Megtisztítottuk, majd a pBBRlMCS4 plazmidvektor EcoRIés HindlII-helyeire ligáltuk a pMG42 EcoRI-Ndel fragmensét, amely a pL-promótert hordozza. Purified, and then the plasmid pBBRlMCS4 EcoRIés HindIII sites of pMG42 was ligated to the EcoRI-NdeI fragment carrying the pL promoter. és a pTRX Ndel-HindlII fragmensét, amely a tioredoxin kódoló szekvenciáját és az AspA-terminátort hordozza, így kaptuk a TCA313 (=pRIT14523) plazmidot. pTRX and the NdeI-HindIII fragment carrying the coding sequence and the aspA terminator thioredoxin, give plasmid TCA313 (= pRIT14523).

• · · • ·« · »*>· » · · . • • · · · «·» *> · »· ·.

A tioredoxin kódoló szekvenciáját a 17. azonosítószámú szekvenciánál tüntettük fel. The coding sequence for thioredoxin is depicted in SEQ ID NO: 17 sequence.

2. Az AR58 törzs transzformálása 2. The AR58 strain Transformation

2. a A ProtDl/3—E7—His/HFV-18-at expresszáló B1011 törzs előállítására 2. The ProtDl / 3-E7-His / HFV-18 expressing the B1011 strain of

A pRIT14532 plazmidot E. coli AR58 törzsbe [Mott és mtsai., Proc. Plasmid pRIT14532 E. coli strain AR58 [Mott et al., Proc. Natl. Natl. Acad. Acad. Sci. 82, 88 (1985)] vittük be, amely az λ-pL promóter egy hőérzékeny represszorát tartalmazó hibás λ-lizogén, majd szelektáltuk a kanamicinrezisztens transzformánsokat. Sci., 82, 88 (1985)] was introduced to the λ pL promoter defective λ lysogen containing a thermosensitive repressor, and the kanamycin-resistant transformants were selected.

2. b A ProtDl/3—E7—His/HPV-18-at és tioredoxint expresszáló B1012 törzs előállítására 2. b The ProtDl / 3-E7-His / HPV-18 and thioredoxin expressing the B1012 strain of

A pRIT14532 és a pRIT14523 plazmidot E. coli AR58 törzsbe [Mott és mtsai., Proc. The pRIT14532 and pRIT14523 Plasmid E. coli strain AR58 [Mott et al., Proc. Natl. Natl. Acad. Acad. Sci. 82, 88 (1985)] vittük be, amely az λ-pL promóter egy hőérzékeny represszorát tartalmazó hibás λ-lizogén, majd szelektáltuk a kanamicinrezisztens transzformánsokat. Sci., 82, 88 (1985)] was introduced to the λ pL promoter defective λ lysogen containing a thermosensitive repressor, and the kanamycin-resistant transformants were selected.

3. A B1011 és a B1012 baktériumtörzsek szaporítása és indukálása - A Prot-Dl/3—E7—His/HPV-18 expresszáltatása tioredoxin nélkül és tioredoxinnal in trans 3. The B1011 and B1012 propagation and induction of bacterial strain - without Prot-Dl / 3-E7-His / HPV 18 Expression of thioredoxin and thioredoxin in trans

A pRIT14532 plazmáddal transzformált AR58-sejteket (B1011 törzs) 50 gg/ml kanamicint tartalmazó, a pRIT14532 plazmáddal és a pRIT14523 plazmáddal transzformált AR58sejteket (B1012 törzs) pedig 50 gg/ml kanamicint és 100 pg/ml ampicillint 100 ml LB-tápközegben, 30°C-on szaporítottuk. The pRIT14532 plazmáddal transformed AR58sejteket (strain B1011) transformed AR58sejteket containing 50 gg / ml kanamycin, the pRIT14532 plazmáddal and pRIT14523 plazmáddal (strain B1012) and 50 gg / ml of kanamycin and 100 pg / ml ampicillin in 100 ml of LB medium, 30 grown ° C. A növekedés logaritmikus szakaszában a hőmérsékletet a λ-represszor inaktiválása és a protein-Dl/3—E7— his/HPV-18 fehérje és a tioredoxin szintézisének beindítása • ·· » ·*· The logarithmic growth phase, the temperature starting the λ repressor inactivation and protein-Dl / 3 E7-his / HPV-18 and thioredoxin protein synthesis ·· • »* · ·

V-18 fehérje és a tioredoxin szintézisének beindítása érdekében 39°C-ra emeltük majd és 4 óráig inkubáltuk. to V-18 protein and thioredoxin starting the synthesis of 39 ° C and then raised to and incubated for 4 hours.

A protein-Dl/3—E7—his (HPV-18) fúziós fehérje jellemzése Characterization of protein-Dl / 3-E7-his (HPV-18) fusion protein

A kivonatok elkészítése Preparation of extracts

A lefagyasztott sejteket felolvasztottuk, 10 ml PBSpufferben felszuszpendáltuk, majd SLM Aminco Francia típusú, nyomás alkalmazásán alapuló sejtsajtolóban 20.000 psi nyomáson (három lépésban) összetörtük. The frozen cells were thawed, resuspended in 10 ml PBSpufferben and crushing at 20.000 psi (three) SLM Aminco French type sejtsajtolóban based on the application of pressure. A kivonatot 4°C-on, 30 percig, 16.000 g-vel centrifugáltuk. The extract was centrifuged at 4 ° C for 30 minutes and 16,000 x g.

A Coomassie-festett SDS-poliakrilamid-gelek és a Western-blottok elemzése The Coomassie-stained SDS-polyacrylamide gels and Western blots analysis

A fenti kivonatok centrifugálása után mintákat vettünk a felülúszóból és a pelletből, majd SDS-poliakrilamidgélelektroforézissel és Western-blottolással megvizsgáltuk őket. After centrifugation of extracts described above, aliquots of supernatant and pellet were analyzed by SDS-poliakrilamidgélelektroforézissel and Western blotting.

A Coomassie-val festett gelekben, a B1011 törzsnél a protDl/3—E7—His fúziós fehérjét (körülbelül 31 kDa) a pelletfrakcióban találtuk, a B1012 törzsnél pedig részben a felülúszóban (30%), majd a sávot Western-blottokon nyúl poliklonális anti-protein-D-vel és a hozzáférhető hisztidinfarkat detektáló borjú vékonybél alkalikus foszfatázhoz kapcsolt Ni-NTA konjugátum (Qiagen kát. sz. 34510) segítségével azonosítottuk. The Coomassie-stained gels, the B1011 strain of protDl / 3-E7-His fusion protein (about 31 kDa) was found to pelletfrakcióban, the B1012 strain and partially in the supernatant (30%), and the band in Western blots by rabbit polyclonal anti related protein of Example D-channels and the available hisztidinfarkat detecting calf intestinal alkaline phosphatase conjugate Ni-NTA (Qiagen cat. no. 34510) was identified. A Coomassie-val festett SDS-poliakrilamid-gelek alapján az expresszió szintje a teljes fehérje körülbelül 1-3%-ának felelt meg. Based on SDS-polyacrylamide gels by Coomassie stained expression level of about 1-3% of the total protein in the peak response.

·* ·Λ ·····♦·· ft * · Λ · ·· ····· ♦ ft

X. példa Example X

A ProtDl/3—E7mutált(Gys27—>gly,glu29—>gln)/HPV-18 fúziós fehérjét expresszáló E. coli B1098 törzs előállítása The ProtDl / 3-E7mutált (Gys27-> gly, glu29-> gln) A solution / HPV-18 fusion protein was expressed in E. coli strain B1098

1. Az expressziós plazmid előállítása Kiindulási anyagok 1. Preparation of expression plasmid Starting Materials

a) pRIT14532 (=TCA316) plazmid, amely a ProtDl/3—E7— a) pRIT14532 (= TCA316) plasmid that of ProtDl / 3-E7

His-t kódolja His encodes

b) LITMUS28 plazmid (New England Biolabs kát. sz. 30628), egy pUC-ből származó klónozó vektor b) plasmid LITMUS28 (New England Biolabs, cat. no. 30628), a cloning vector derived from pUC

c) A pMG MCS prot Dl/3 (=pRIT14589) plazmid a pMG81 (ld. fent) származéka, amelyben az Influenza-NSl kódoló régiójának 4-81. c) Plasmid pMG MCS prot Dl / 3 (= pRIT14589) of pMG81 (refer. to above) derivative thereof, wherein the influenza NSl coding region of 4-81. kodonjait a Haemophilus influenzáé 772. törzse, 2. biotípusának [H. codons Haemophilus influenzae strain 772, biotype 2 [H. Janson és mtsai., Infection and Immunity Jan., 119-125 (1991)] érett protein-D-jének Janson et al., Infection and Immunity, Jan., 119-125 (1991)] of mature protein D of

Ser20—»Thrl27 részletével helyettesítettünk. replaced Ser20- »Thrl27 portion thereof. A Prot-Dl/3 szekvenciája után egy többszörös klónozóhely (11 aminosav), majd a C-terminális His-toldalékot (6 His) kódoló régió található . After Prot-Dl / 3 sequence of a multiple cloning site (11 residues) and a coding region for the C-terminal histidine tail (6 His) found.

A His-farokkal ellátott protein-Dl/3— with a His-tail protein-Dl / 3-

E7mutált (cys27—»gly ,glu29—»gln) fúziós fehérjét expresszáló pRIT14831 (=TCA355) plazmid előállítása E7mutált (cys27- »gly, glu29-» gln) fusion protein expressing pRIT14831 (= TCA355) Plasmid

A pRIT14532 (=TCA316) Ncol-Xbal fragmensét, amely a The pRIT14532 (= TCA316) NcoI-XbaI fragment of the

HPV-18-ból származó E7-gén kódoló szekvenciáját és a Hisfarkat hordozza, mutagenezisre alkalmazható Litmus 28 köztes vektorba szubklónoztuk, így kaptuk a pRITl4910-et (=TCA348). E7 gene derived from HPV 18 and carries the sequence encoding Hisfarkat, subcloned into Litmus 28 useful for mutagenesis as an intermediate vector to give the pRITl4910 was (= TCA348). Az E7/HPV-16 mutagenezisének analógiájára a két mutáció - cys27—»gly és glu29->gln - bevitelével csökkente• * f 4 ni kívántuk a retinoblasztorna-gén antionkogén termékéhez (pRB) való kötődést. E7 / HPV 16 mutagenesis analogy with the two mutations - cys27- »gly glu29-> gln - introducing wanted reduces • 4 * f ni binding to an anti-oncogene product (pRB) retinoblasztorna the gene.

Az E7-génbe a Quick Change Site Directed Mutagenesis kit (Stratagene kát. sz. 200518) segítségével vittük be a mutációkat. The E7 gene of the Quick Change Site Directed Mutagenesis kit (no. Stratagene cat. 200 518) was introduced mutations. Mivel a pRIT14532 szekvenálása azt mutatta, hogy az E7 43. pozíciójában a HPV-18 prototípus szekvenciájában lévő glicin helyett egy glutaminsav van, elvégeztünk egy második mutagenizálási lépést is, amelynek során a 43. pozícióba glicint vittünk be. As the sequencing of pRIT14532 showed that there is a glutamic acid rather than glycine in the prototype sequence of HPV 18 E7, position 43, we performed mutagenesis of a second step in which the glycine was introduced into position 43. A mutációk jelenlétét és a komplett E7-gén integritását szekvenálással ellenőriztük, majd a mutált E7-gént a pRIT14589 (=pMG MCS ProtDl/3) vektorba illesztettük, és így kaptuk a pRIT14831 (=TCA355) plazmidot. The presence and integrity of the complete E7 gene mutations was verified by sequencing, and the mutated E7 gene in pRIT14589 (= pMG MCS ProtDl / 3) inserted into the vector to give plasmid pRIT14831 (= TCA355).

A protein-Dl/3—E7mutált (cys27—>gly, glu29—»gln) — His/HPV-18 fúziós fehérje szekvenciáját a 18. és 19. azonosítószámú szekvencia mutatja. Protein-Dl / 3-E7mutált (cys27-> gly, glu29- »gln) - His / HPV-18 fusion protein sequence shown in SEQ ID NO: 18 and 19.

2. A ProtDl/3—E7mutált (cys27—»gly,glu29—>gln)-His/HFV18-at expresszáló B1098 törzs előállítása 2. ProtDl / 3-E7mutált (cys27- »gly, glu29-> gln) -His / HFV18 strain B1098 expressing preparation:

A pRIT14831 plazmidot E. coli AR58 törzsbe [Mott és mtsai., Proc. The plasmid pRIT14831 E. coli strain AR58 [Mott et al., Proc. Natl. Natl. Acad. Acad. Sci. 82, 88 (1985)] vittük be, amely az λ-pL promoter egy hőérzékeny represszorát tartalmazó hibás λ-lizogén, és a kanamicinrezisztens transzformánsok szelektálásával kaptuk a B1098 törzset. Sci., 82, 88 (1985)] was introduced, which was obtained from the B1098 strain λ pL promoter defective λ lysogen containing a thermosensitive repressor, and kanamycin-resistant transformants by selection.

3. A B1098 baktériumtörzs szaporítása és indukálása A ProtDl/3—E7mutált (cys27—>gly ,glu29-»gln) —His (HPV-18) expresszáltatása 3. The bacterial strain B1098 induction and propagation of ProtDl / 3-E7mutált (cys27-> gly glu29- »gln) -His (HPV-18) Expression of

A pRIT14831 plazmiddal transzformált AR58-sejteket (B1098 törzs) 50 pg/ml kanamicint tartalmazó 100 ml LB»» » · The AR58 transformed with plasmid pRIT14831 cells (strain B1098) 50 ug / ml kanamycin, containing 100 ml of LB »» »·

- 40 tápközegben, 30°C-on szaporítottuk. - 40 medium, grown at 30 ° C. A növekedés logaritmikus szakaszában a hőmérsékletet a λ-represszor inaktiválása és a protein-Dl/3—E7mutált—His /HPV-18 fehérje szintézisének beindítása érdekében 39°C-ra emeltük majd a baktériumokat 4 óra után lecentrifugáltuk és -20°C-ra tettük. logarithmic phase of the growth temperature was 39 ° C and then raised to the bacteria were spun down and after 4 hours at -20 ° C for the λ repressor inactivate starting protein Dl / 3-E7mutált-His / HPV 18 protein synthesis above.

4. A ProtDl/3—E7mut(cys27—»gly,glu2 9—»gln)—His (HPV18) fúziós fehérje jellemzése 4. ProtDl / 3-E7mut (cys27- »gly, glu2 9-» gln) -His (HPV18) fusion protein Characterization

A lefagyasztott sejteket felolvasztottuk, 10 ml PBSpufferben felszuszpendáltuk, majd SLM Aminco Francia típusú, nyomás alkalmazásán alapuló sejtsajtolóban 20.000 psi nyomáson (három lépésban) összetörtük. The frozen cells were thawed, resuspended in 10 ml PBSpufferben and crushing at 20.000 psi (three) SLM Aminco French type sejtsajtolóban based on the application of pressure. A kivonatot 4°C-on, 30 percig, 16.000 g-vel centrifugáltuk. The extract was centrifuged at 4 ° C for 30 minutes and 16,000 x g.

A Coomassie-festett SDS-poliakrilamid-gelek és a Western-blottok elemzése The Coomassie-stained SDS-polyacrylamide gels and Western blots analysis

A fenti kivonatok centrifugálása után mintákat vettünk a felülúszóból és a pelletből, majd SDS-poliakrilamidgélelektroforézissel és Western-blottolással megvizsgáltuk őket. After centrifugation of extracts described above, aliquots of supernatant and pellet were analyzed by SDS-poliakrilamidgélelektroforézissel and Western blotting. A Coomassie-val festett gelekben a pelletfrakciónál a legerőteljesebb sáv körülbelül 31 kDa-nál jelent meg, amelyet a Western-blottokon nyúl poliklonális 22 J 70 antiprotein-D-vel és a hozzáférhető hisztidinfarkat detektáló monoklonális Penta-His (Qiagen kát. sz. 34660) segítségével azonosítottuk. The Coomassie stained gels in the pellet strongest band of about 31 kDa by Western blots by rabbit polyclonal 22 J 70 anti-protein-D and available hisztidinfarkat detecting monoclonal Penta-His (Qiagen cat. No. 34660 ) was identified. Az expresszió szintje a teljes fehérje körülbelül 3-5%-ának felelt meg. The expression level of about 3-5% of the total protein corresponded cent.

XI. XI. példa example

Protein-Dl/3—E6—His (HPV-18)_fúziós_fehérjét expresszáló E, coli törzs előállítása Protein-Dl / 3-E6-his (HPV 18) Preparation _fúziós_fehérjét expressing E. coli strain

1. Az expressziós plazmid előállítása 1. Preparation of expression plasmid

a) A pMG MCS prot Dl/3 (=pRIT14589) plazmid a pMG81 (ld. fent) származéka, amelyben az Influenza-NSl kódoló régiójának 4-81. a) Plasmid pMG MCS prot Dl / 3 (= pRIT14589) of pMG81 (see Fig. above) derivative thereof, wherein the influenza NSl coding region of 4-81. kodonjait a Haemophilus influenzáé 772. törzse, 2. biotípusának [H. codons Haemophilus influenzae strain 772, biotype 2 [H. Janson és mtsai., Infection and Immunity Jan., 119-125 (1991)] érett protein-D-jének Janson et al., Infection and Immunity, Jan., 119-125 (1991)] of mature protein D of

Ser20—>Thrl27 részletével helyettesítettünk. replaced Ser20-> Thrl27 portion thereof. A Prot-Dl/3 szekvenciája után egy többszörös klónozóhely (11 aminosav), majd a C-terminális His-toldalékot (6 His) kódoló régió található. After Prot-Dl / 3 sequence of a multiple cloning site (11 residues) and a coding region for the C-terminal histidine tail (6 His) found. A plazmidot a protein-Dl/3—E6—his fúziós fehérje expresszáltatására alkalmaztuk. This plasmid is used in the protein-Dl / 3-E6-his fusion protein expression.

A HPV-genomból származó HPV-18 E6- és E7-szekvenciákat [Colé és mtsai., J. Mól·. HPV-18 E6 and E7 sequences from the HPV genome [Cole et al., J. Mol ·. Bioi. Biol. 193, 599-608 (1987)] a HPV18 pBR322-be klónozott teljes genomjából [forrás: Deutsches Krebsforschungzentrum (DKFZ), Referenzzentrum für humán pathogen Papillomaviruses - D 69120 - Heidelberg] amplifikáltuk, majd pUCl9-be szubklónoztuk, és így kaptuk a TCA302-t (=pRIT14467). 193, 599-608 (1987)] cloned HPV 18 full length genome pBR322 [source: obtained from Deutsches Krebsforschungszentrum (DKFZ), Referenzzentrum fur human pathogen Papillomaviruses - D 69120 - Heidelberg] were amplified and subcloned into pUCl9 afford the TCA302 -t (= pRIT14467).

A protein-Dl/3—E6—His /HPV-18 fúziós fehérjét expresszáló TCA314 (=pRIT14526) plazmid előállítása Protein-Dl / 3-E6-His / HPV-18 fusion protein expressing TCA314 (= pRIT14526) Plasmid

Az E6-fehérje 1—>158 aminosavainak megfelelő nukleotidszekvenciát a pRIT14467-ből amplifikáltuk. E6 protein as 1-> 158 amino acids of the nucleotide sequence amplified from pRIT14467 out. A polimeráz-láncreakció során az E6-szekvencia 5'- és 3'végein Ncol és Spel hasítóhelyeket hoztunk létre, amelynek segítségével be tudtuk illeszteni a pMGMCS Prot Dl/3 • · · · During the polymerase chain reaction, the sequence 5 'and E6 3'végein created Ncol and Spel recognition sites, whereby we were able to paste the pMGMCS Prot Dl / 3 • · · ·

plazmid azonos helyeire, és így kaptuk a TCA314 plazmidot (=pRIT14526). the same sites of plasmid to give plasmid TCA314 (= pRIT14526). Ezt követően megszekvenáltuk az inszertet és így ellenőriztük, hogy a polimeráz-láncreakció során nem jött létre módosítás. Subsequently, the insert was sequenced, and thus verify that no modification had been generated during the polymerase chain reaction. A protein-Dl/3—E6—His fúziós fehérje szekvenciáját a 20. azonosítószámú szekvenciánál, a kódoló szekvenciát pedig a 21. azonosítószámú szekvenciánál tüntettük fel. Protein-Dl / 3-E6-His fusion protein sequence is shown in SEQ ID NO: 21 of the sequence in SEQ ID NO 20, the coding sequence.

Az AR58 törzs transzformálása The AR58 strain Transformation

A pRIT14526 plazmidot E. coli AR58 törzsbe [Mott és mtsai., Proc. The plasmid pRIT14526 E. coli strain AR58 [Mott et al., Proc. Natl. Natl. Acad. Acad. Sci. 82, 88 (1985)] vittük be, amely az λ-pL promóter egy hőérzékeny represszorát tartalmazó hibás λ-lizogén. Sci., 82, 88 (1985)] was introduced to the λ pL promoter defective λ lysogen containing a thermosensitive repressor.

3. A baktériumtörzs szaporítása és indukálása - A Prot-Dl/3—E6—His expresszáltatása 3. Strain propagation and induction - of Prot-Dl / 3-E6-His Expression

A pRIT14525 plazmiddal transzformált AR58-sejteket 50 pg/ml kanamicint tartalmazó 100 ml LB-tápközegben, 30°C-on szaporítottuk. AR58 transformed cells were grown in 100 ml LB medium containing 50 ug / ml kanamycin at 30 ° C. The plasmid pRIT14525. A növekedés logaritmikus szakaszában a hőmérsékletet a λ-represszor inaktiválása és a protein-Dl/3— E6—His fehérje szintézisének beindítása érdekében 39°C-ra emeltük majd a baktériumokat 4 óra után lecentrifugáltuk és -20°C-ra tettük. logarithmic phase of growth, the temperature was raised to 39 ° C and then bacteria are centrifuged after 4 hours and cooled at -20 ° for λ repressor inactivate the starting protein Dl / 3-E6-His protein synthesis.

4. A protein-Dl/3—E6—his fúziós fehérje jellemzése 4. Characterization of protein-Dl / 3-E6-his fusion protein

A lefagyasztott sejteket felolvasztottuk, 10 ml PBSpufferben felszuszpendáltuk, majd SLM Aminco Francia típusú, nyomás alkalmazásán alapuló sejtsajtolóban 20.000 psi nyomáson (három lépésban) összetörtük. The frozen cells were thawed, resuspended in 10 ml PBSpufferben and crushing at 20.000 psi (three) SLM Aminco French type sejtsajtolóban based on the application of pressure. A kivonatot 4°C-on, 30 percig, 16.000 g-vel centrifugáltuk. The extract was centrifuged at 4 ° C for 30 minutes and 16,000 x g. A fenti kivonatok centrifugálása után mintákat vettünk a felülúszóból és a • · · · · After centrifugation of extracts described above, aliquots of supernatant and • · · · ·

- 43 - ....... - 43 - .......

pelletből, majd SDS-poliakrilamid-gélelektroforézissel és Western-blottolással megvizsgáltuk őket. pellet, followed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and Western blotting was examined them.

A Coomassie-val festett gelekben a pelletfrakciónál a legerőteljesebb sáv körülbelül 32 kDa-nál jelent meg, amelyet a Western-blottokon nyúl poliklonális anti-protein-Dvel és a hozzáférhető hisztidinfarkat detektáló borjú vékonybél alkalikus foszfatázhoz kapcsolt Ni-NTA konjugátum (Qiagen kát. sz. 34510) segítségével azonosítottuk. The Coomassie stained gels in the pellet strongest band of about 32 kDa by Western blots with rabbit polyclonal anti-protein Dvel and available hisztidinfarkat detecting calf intestinal alkaline phosphatase by Ni-NTA conjugate (Qiagen Cat. . 34510) was identified. Az expresszió szintje a teljes fehérje körülbelül 3-5%-ának felelt meg. The expression level of about 3-5% of the total protein corresponded cent.

XII. XII. példa example

Protein-Dl/3—E6E7—his / HPV-18 fúziós fehérjét expresszáló E. coli törzs előállítása Preparation of Protein-Dl / 3-E6E7-his / HPV-18 fusion protein in E. coli strain expressing

1. Az expressziós plazmid előállítása 1. Preparation of expression plasmid

a) A pMG MCS prot Dl/3 (=pRIT14589) plazmid a pMG81 (ld. fent) származéka, amelyben az fnfluenza-NSl kódoló régiójának 4-81. a) pMG MCS prot Dl / 3 (= pRIT14589) Plasmid pMG81 (see Fig. above) from which the coding region of the NS-fnfluenza 4-81. kodonjait a Haemophilus influenzáé 772. törzse, 2. biotípusának [H. codons Haemophilus influenzae strain 772, biotype 2 [H. Janson és mtsai., Infection and Immunity Jan., 119-125 (1991)] érett protein-D-jének Janson et al., Infection and Immunity, Jan., 119-125 (1991)] of mature protein D of

Ser20—>Thrl27 részletével helyettesítettünk. replaced Ser20-> Thrl27 portion thereof. A Prot-Dl/3 szekvenciája után egy többszörös klónozóhely (11 aminosav), majd a C-terminális His-toldalékot (6 His) kódoló régió található. After Prot-Dl / 3 sequence of a multiple cloning site (11 residues) and a coding region for the C-terminal histidine tail (6 His) found. A plazmidot a protein-Dl/3—E6E7—his fúziós fehérje expresszáltatására alkalmaztuk. This plasmid is used in the protein-Dl / 3-E6E7-his fusion protein expression.

b) A HPV-genomból származó HPV-18 E6- és E7szekvenciákat [Colé és mtsai., J. Mól. b) HPV-18 E6 from HPV genome and E7szekvenciákat [Cole et al., J. Mol. Bioi. Biol. 193, 599-608 (1987)] a HPV-18 pBR322-be klónozott teljes genomjából ···· ···· * · · · · ···· ·· · ·'' • »·· .. ., [forrás: Deutsches Krebsforschungzentrum (DKFZ), 193, 599-608 (1987)] ···· ···· complete genome of HPV-18 are cloned into pBR322 * · · · · · · ·· ···· '' • ».. ··., [source: obtained from Deutsches Krebsforschungszentrum (DKFZ)

Referenzzentrum für humán pathogen Papillomaviruses - D Referenzzentrum fur human pathogen Papillomaviruses - D

69120 - Heidelberg] amplifikáltuk, majd pUC19-be szubklónoztuk, és így kaptuk a TCA302-t (=pRIT14467). 69120 - Heidelberg] were amplified and subcloned into pUC 19 to give the t-TCA302 (= pRIT14467).

c) A TCA302-ben (pRIT14467) lévő E6-ot és az E7-et kódoló szekvenciákat egy szintetikus oligonukleotidadaptorral módosítottuk (amelyet az Hgal és az Nsil helyek közé illesztettünk be), amellyel az E6- és az E7-gén között egy 11 nukleotidos deléciót hoztunk létre, hogy eltávolítsuk az E6 stopkodonját és így az E6 és az E7 kódoló szekvenciáit egymáshoz fuzionáltassuk. c) encoding in TCA302 in (pRIT14467) E6 and E7 sequences were modified with a synthetic oligonukleotidadaptorral (inserted to the Hga I and Nsi I sites), whereby between the E6 and E7 gene a 11 nt deletion has been created to remove the stop codon of E6 and thus the coding sequences of the E6 and E7 fusing together. így kaptuk a TCA320 (=pRITl4618) plazmidot. give plasmid TCA320 (= pRITl4618).

A protein-Dl/3—E6E7—His/HFV-18 fúziós fehérjét expresszáló TCA328 (=pRIT14567) plazmid előállítása Protein-Dl / 3-E6E7-His / HFV-18 fusion protein expressing TCA328 (= pRIT14567) Plasmid

Az E6E7 fúziós fehérje l->263 aminosavainak megfelelő nukleotidszekvenciát a pRIT14618-ból amplifikáltuk. corresponding to the E6E7 fusion protein l-> 263 amino acids of the nucleotide sequence amplified from pRIT14618 from. A polimeráz-láncreakció során az E6E7 fúziós szekvencia 5'és 3'-végein Ncol és Spel hasítóhelyeket hoztunk létre, amelynek segítségével be tudtuk illeszteni a pMGMCS Prot Dl/3 plazmid azonos helyeire, és így kaptuk a TCA328 plazmidot (=pRIT14567). During the polymerase chain reaction, the E6E7 fused sequences 5'és 3 'ends were generated NcoI and SpeI recognition sites, whereby we were able to paste the pMGMCS Prot Dl / 3 of the same sites of plasmid to give the plasmid TCA328 (= pRIT14567). Ezt követően megszekvenáltuk az inszertet és így ellenőriztük, hogy a polimeráz-láncreakció során nem jött létre módosítás. Subsequently, the insert was sequenced, and thus verify that no modification had been generated during the polymerase chain reaction. A protein-Dl/3—E6/E7—His fúziós fehérje szekvenciáját a 22. azonosítószámú szekvenciánál, a kódoló szekvenciát pedig a 23. azonosítószámú szekvenciánál tüntettük fel. Protein-Dl / 3-E6 / E7-His fusion protein sequence is shown in SEQ ID NO 23 to 22 of the sequence, the coding sequence.

···· ···· e · ···· ···· e ·

2. Az AR58 törzs transzformálása 2. The AR58 strain Transformation

A pRIT14567 plazmidot E. coli AR58 törzsbe [Mott és mtsai., Proc. The plasmid pRIT14567 E. coli strain AR58 [Mott et al., Proc. Natl. Natl. Acad. Acad. Sci. 82, 88 (1985)] vittük be, amely az λ-pL promóter egy hőérzékeny represszorát tartalmazó hibás λ-lizogén. Sci., 82, 88 (1985)] was introduced to the λ pL promoter defective λ lysogen containing a thermosensitive repressor.

3. A baktériumtörzs szaporítása és indukálása - A Prot-Dl/3—E6E7—His expresszáltatása 3. Strain propagation and induction - of Prot-Dl / 3-E6E7-His Expression

A pRIT14512 plazmiddal transzformált AR58-sejteket 50 pg/ml kanamicint tartalmazó 100 ml LB-tápközegben, 30°C-on szaporítottuk. AR58 transformed cells were grown in 100 ml LB medium containing 50 ug / ml kanamycin at 30 ° C. The plasmid pRIT14512. A növekedés logaritmikus szakaszában a hőmérsékletet a λ-represszor inaktiválása és a protein-Dl/3— E6E7—his fehérje szintézisének beindítása érdekében 39°C-ra emeltük majd a baktériumokat 4 óra után lecentrifugáltuk és -20°C-ra tettük. logarithmic phase of growth, the temperature was raised to 39 ° C and then bacteria are centrifuged after 4 hours and cooled at -20 ° for λ repressor inactivate the starting protein Dl / 3-E6E7-his protein synthesis.

4. A protein-Dl/3—E6E7—his fúziós fehérje jellemzése 4. Characterization of protein-Dl / 3-E6E7-his fusion protein

A lefagyasztott sejteket felolvasztottuk, 10 ml PBSpufferben felszuszpendáltuk, majd SLM Aminco Francia típusú, nyomás alkalmazásán alapuló sejtsajtolóban 20.000 psi nyomáson (három lépésban) összetörtük. The frozen cells were thawed, resuspended in 10 ml PBSpufferben and crushing at 20.000 psi (three) SLM Aminco French type sejtsajtolóban based on the application of pressure. A kivonatot 4°C-on, 30 percig, 16.000 g-vel centrifugáltuk. The extract was centrifuged at 4 ° C for 30 minutes and 16,000 x g.

A fenti kivonatok centrifugálása után mintákat vettünk a felülúszóból és a pelletből, majd SDS-poliakrilamidgélelektroforézissel és Western-blottolással megvizsgáltuk őket. After centrifugation of extracts described above, aliquots of supernatant and pellet were analyzed by SDS-poliakrilamidgélelektroforézissel and Western blotting.

A Coomassie-val festett gelekben a pelletfrakciónál a legerőteljesebb sáv körülbelül 48 kDa-nál jelent meg, amelyet a Western-blottokon nyúl poliklonális anti-protein-Dvel és a hozzáférhető hisztidinfarkat detektáló borjú vé46 konybél alkalikus foszfatázhoz kapcsolt Ni-NTA konjugátum (Qiagen kát. sz. 34510) segítségével azonosítottuk. The Coomassie stained gels in the pellet strongest band of about 48 kDa by Western blots by rabbit polyclonal anti-protein Dvel and connected to the available hisztidinfarkat detecting calf vé46 intestine alkaline phosphatase by Ni-NTA conjugate (Qiagen cat. no. 34510) was identified. Az expresszié szintje a teljes fehérje körülbelül 1%-ának felelt meg. The level of expression represents about 1% of the total protein.

XIII. XIII. példa example

A PD1/3-E7 fúziós fehérjét és különböző CpGoligonukleotidokat tartalmazó oltóanyag terápiás hatását TCl-ben (E7-expresszáló tumormodell) vizsgáltuk. The therapeutic effect of the vaccine containing the PD-1/3-E7 fusion protein and different TCL tested CpGoligonukleotidokat (E7 expressing tumor model).

1. Terápiás kísérletek: eljárás 1. Therapeutic experiments: Method

C57BL/6 immunkompetens egerek lágyékába szubkután injekcióban 10 6 TCl-sejtet (E7-expresszáló tumorsejtek) (200 μΐ) adtunk be. Subcutaneous injection of 10 6 TCl cells (E7 expressing tumor cells) (200 μΐ) was added into the flank of C57BL / 6 immunocompetent mice. Az egereket a tumorindukció után 7 és 14 nappal oltottuk be a talppárnába adott injekcióval (100 μΐ: 50 μΐ/talppárna), amely 5 μg ProtDl/3—E7(HPV-16)-t és különböző adjuvánsokat tartalmazott: Mice were injected Tumor Induction After 7 and 14 days into the foot pads given by injection (100 μΐ 50 μΐ / footpad) containing 5 ug ProtDl / 3 E7 (HPV-16) and various adjuvants -t:

A második immunizáció után 2 és 4 héttel csoportonként 5 egeret leöltünk, majd kivettük a lépet és a térdhajlati nyirokcsomót és ezekben vizsgáltuk az immunválaszt. After the second immunization, 2 and 4 weeks 5 mice per group were sacrificed and spleens were taken and the popliteal lymph nodes, and these were tested for an immune response.

1.2 Eredmények 1.2 Results

Csoportok Groups

1) 2) 3) 1) 2) 3) PB PB
ProtDl/3-E7(HPV-16) ProtDl / 3 E7 (HPV-16) 1826 1826 (WD1001): (WD1001): TCC TCC
ProtDl/3-E7(HPV-16) ProtDl / 3 E7 (HPV-16) + 1. oligó: + 1 oligo:
ATG ACG ATG ACG TTC CTG ACG TT TTC CTG ACG TT
4) 4) 1. oligó 1. oligo
5) 5) ProtDl/3-E7(HPV-16) ProtDl / 3 E7 (HPV-16) + 2. oligó/ + 2, oligo / 1758 1758 (WD1002): (WD1002): TCT TCT

CCC AGC GTG CGC CAT • · · CCC AGC GTG CGC CAT • · ·

6) 2. oligó 6) the second oligo

Tumornövekedés tumor Growth

A tumorok növekedését az egyes tumorok hetente kétszer történő mérésével követtük nyomon. The growth of tumors was monitored by measuring individual tumors twice a week.

1. ábra: ezen az ábrán (a mm 2 /csoportban kifejezett) átlagos tumornövekedést mutatjuk be (n=10), amelyet 4 héten át követtünk nyomon. Figure 1: this figure (expressed in mm 2 / group) are shown in mean tumor growth (n = 10) were followed for 4 weeks follow.

• A szubkután injekcióban beadott 10 6 TCl-sejt hatására minden állatban megjelent a tumor. Administered by subcutaneous injection causes • A 10 6 TCl cells in all animals appeared in the tumor.

• A vagy csak ProtDl/3E7-tel vagy csak adjuvánssal kezelt állatokban mindben megjelent a tumor. • or treated with the ProtDl / 3E7 or adjuvant alone animals tel-released every tumor.

• Ahogy az az 1. és 2. ábrán látható, azoknál az egereknél, amelyek antigént és CpG-oligonukleotidot is kaptak, az átlagos tumornövekedés igen kismértékű maradt, és a csoportok között is igen hasonlóan alakult, ami azt jelzi, hogy vagy lelassult a tumornövekedés, vagy hogy számos tumor teljes mértékben kilökődött. • As shown in Figures 1 and 2, those mice that received antigen and CpG oligonucleotide the mean tumor growth remained very low and formed a very similar between groups, suggesting that either has slowed down the tumor growth or that many tumors completely ejected.

Az utolsó oltás után 2 és 4 héttel az egyes tumorok vizsgálata azt mutatta, hogy az egyes csoportokban a teljes kilökődés az alábbiak szerint alakult: After the last vaccination 2 and 4 weeks examining individual tumors showed that the total rejection of each group was as follows:

28. nap (n=10) Day 28 (n = 10) 42. nap (n=5) 42 days (n = 5)
E7+1. E7 + 1st oligó (1826) oligo (1826) 40% 40% 40% 40%
1. oligó 1. oligo 0% 0% 0% 0%
E7+2. E7 + 2nd oligó (1758) oligo (1758) 70% 70% 40% 40%
2. oligó 2. oligo 0% 0% 0% 0%

A PD1/3-E7 + CpG-oligókkal beoltott egereknél a csoportonkénti átlagos tumornövekedés igen hasonló és az egyes tumorok növekedésének vizsgálata azt mutatta, hogy a CpGoligók hosszabb időtartamú teljes tumorkilökődést indukáltak. The PD1 / 3 E7 + CpG oligókkal vaccinated mice Examination of the mean tumor growth per group is similar and the individual tumor growth showed that the longer duration CpGoligók induced complete tumor rejection.

Következtetés Conclusion

Mindkét oligó (2. oligó > 1. oligó) teljes tumorvisszafejlődést okozott. Both oligo (oligo 2> oligo 1) resulted in complete tumor regression.

A limfoproliteratív választ a lép- és nyirokcsomósejtek 72 órás, PDl/3E7-tel, E7-fehérjével (Bollen) és PD-vel (teljes), vagy PDl/3-mal (latex-mikrogyöngyökhöz kötve vagy szabadon) (10, 1, 01 pg/ml) történő in vitro restimulálásával vizsgáltuk a II. The limfoproliteratív response of spleen and lymph node cells 72 hours, PDI / 3E7-tel, E7 protein (Bollen) and PD (whole), or PD / 3 (linked latex microbeads or free) (10, 1, in with 01 pg / ml) was tested in vitro restimulálásával II. után 2 és 4 héttel. After 2 to 4 weeks.

• A pozitív kontrollok (ConA-stimulálás) pozitívak voltak. • The positive control (Con A stimulation) were positive.

• Meglepő módon sem E7-specifikus, sem PD-specifikus limfoproliferatív választ nem kaptunk, ha a II. • Surprisingly, we have not received any specific E7 or PD-specific lymphoproliferative response if II. után 2 és 4 héttel lépsejtekkel indultunk (valószínűleg technikai problémák miatt: az adatok nincsenek feltüntetve) • Ezzel ellentétben a ProtDl/3-E7-et és az 1. és 2. CpGoligókat kapott egerek nyirokcsomósejtjei nagyon jó E7specifikus proliferatív választ adtak, bár PD (teljes) specifikus választ még a legnagyobb, 100 gg/ml-es koncentrációnál is alig lehetett megfigyelni, PD1/3specifikus választ pedig még akkor sem, ha latexmikrogyöngyökhöz voltak kötve. 2 and 4 weeks after starting spleen (probably because of technical problems: data not shown) • In contrast, mice that received the ProtDl / 3-E7 and CpGoligókat 1 and 2 were very good E7specifikus lymph node proliferative response, although the PD ( complete) specific response was observed barely even in the largest, 100 gg / ml concentration, PD1 / 3specifikus answer and even if they were connected latexmikrogyöngyökhöz.

A II. II. után 4 héttel hasonló eredményeket kaptunk. After four weeks were obtained similar results.

Szerológia serology

Anti-E7-antitest választ, a totál IgG-t (IgGtot) és az izotípusokat (IgGl, IgG2a, IgG2b) ELISÁ-val mértük, ahogy az az Anyagok és eljárások c. Anti-E7 antibody responses, the total IgG (IgGtot) and isotypes (IgGl, IgG2a, IgG2b) were measured by ELISA as in the Materials and Methods c. részben szerepel (fedő antigén: E7-fehérje). partially included (coating antigen E7 protein). A 3. és 4. ábra a különböző IgGizotípusok relatív százalékos arányát mutatja a II. Figures 3 and 4 show the relative percentage of the different IgGizotípusok II. után 2 és 4 héttel. After 2 to 4 weeks.

• Az oligók csak gyengén (2. oligó), vagy egyáltalán nem (1. oligó) hatnak a PD1/3-E7 adásakor megfigyelt gyenge antitestválaszra. • The oligos only weakly (oligo 2) or not at all (oligo 1) act as weak antibody response observed in the PD1 / 3 E7-administration.

• A túlsúlyban lévő E7-specifikus antitest-alosztály egyértelműen az IgG2b volt mindegyik vizsgált készítmény esetében (a teljes IgG 80-90%-a). • E7 specific antibody subclass was clearly dominant in the case of each test composition IgG2b (80-90% of total IgG).

A II. II. után 4 héttel hasonló eredményeket kaptunk. After four weeks were obtained similar results.

Az anti-E7 válaszok (post II., összegyűjtött szérum) izotípusprofilja, exp. The anti-E7 responses (post II. Pooled sera) izotípusprofilja exp. 97293 97 293

Csoport Group IgGl IgGl IgG2a IgG2a IgG2b IgG2b IgGtot IgGtot
1) PBS 1) PBS 0 0 0 0 0 0 0 0
2) ProtDl/3-E7(HPV-16) 2) ProtDl / 3 E7 (HPV-16) 1020 1020 0 0 4130 4130 4740 4740
3) ProtDl/3-E7(HPV-16) + 1. oligó 3) ProtDl / 3 E7 (HPV-16) 1 + oligo 170 170 400 400 3680 3680 4910 4910
4) 1. oligó 4) oligo 1 0 0 0 0 530 530 420 420
5) ProtDl/3-E7(HPV-16) + 2. oligó 5) ProtDl / 3 E7 (HPV-16) + oligo 2 0 0 590 590 7560 7560 13690 13690
6) 2. oligó 6) the second oligo 0 0 0 0 0 0 0 0
Csoport Group IgGl IgGl IgG2a IgG2a IgG 2 b IgG 2 b IgGtot IgGtot
1) PBS 1) PBS 0 0 0 0 0 0 0 0
2) ProtDl/3-E7(HPV-16) 2) ProtDl / 3 E7 (HPV-16) 240 240 0 0 1650 1650 1400 1400
3) ProtDl/3-E7(HPV-16) + 1. oligó 3) ProtDl / 3 E7 (HPV-16) 1 + oligo 0 0 0 0 1280 1280 1430 1430
4) 1. oligó 4) oligo 1 0 0 0 0 0 0 0 0
5) ProtDl/3-E7(HPV-16) + 2. oligó 5) ProtDl / 3 E7 (HPV-16) + oligo 2 0 0 560 560 3600 3600 5880 5880
6) 2. oligó 6) the second oligo 0 0 0 0 0 0 0 0

«·«· ·· · * · «· '·· · · · *

CTL-teszt CTL test

A CTL-választ az utolsó oltás után két héttel lehetett megfigyelni, amikor a sejteket besugárzott TC1 rn vitro restimuláltuk, és célsejtként TCl-et vagy E7-tel pulzált EL4-et alkalmaztunk, és az egereket PD1/3-E7 + 2. CpG-oligó > 1. CpG-oligó (25-40% specifikus lízis) készítménnyel immunizáltuk és nem csak az oligókkal. The CTL response to two days was observed after the final inoculation, when the cells were irradiated TC1 rn vitro restimulated and used TCl was or E7 pulsed EL4 dispenser as target cells, and the mice were PD1 / 3 E7 + the second CpG oligo> CpG oligo 1 (25-40% specific lysis) were immunized with a composition, not only the oligókkal.

• Lízist inkább a TCl-sejteken láttunk, mint az E7-tel pulzált EL4-sejteken, de ezt leginkább a PD1/3-E7 + CpGoligók (2>1) készítményekkel oltott egerekre volt jellemző. • lysis rather seen Tcl cells than the E7 pulsed EL4 cells, but most of the PD1 / 3 E7 + CpGoligók grafted (2> 1) preparations from mice occurred. Ebben a kísérletben más készítmények nem indukáltak CTL-t. In this experiment other formulations did not induce CTL.

• Az E7-tel pulzált EL4-sejtek („E7 pulsed EL4 cells) alkalmazásakor nem tapasztaltunk lízist, ha az egereket csak a fehérjével vagy csak az adjuvánssal kezeltük. • lysis was not observed when using the E7 pulsed EL4 cells ( "E7 pulsed EL4 cells), when mice were treated only with the protein or the adjuvant alone.

1.3 Anyagok és eljárások 1.3 Materials and Methods

Anyag Material Márka Brand Sorozatszám serial Koncentráció (mg/ml) Concentration (mg / ml) Puffer Buffer
ProtDl/3-E7 ProtDl / 3-E7 957/015 957/015 0, 677 0 677 PBS 7,4 7.4 PBS
CpG-oligó 1826 CpG oligo 1826 EuroGentec Eurogentec WD1001 WD1001 5 5 H 2 O H 2 O
CpG-oligó CpG oligo EuroGentec Eurogentec WD1002 WD1002 5 5 h 2 o H2O

1.3.1 A készítmények előállítása 1.3.1 Preparation of the compositions

A készítményeket az oltások napján állítottuk elő. The compositions were prepared on the day of vaccination.

··«· ···· ·· '···· ·

Oligótartalmú készítmények Oligótartalmú preparations

Az egyéb adjuváns nélküli, csak oligót tartalmazó készítményeket úgy állítottuk elő, hogy a PBS 7,4-ben hígított ProtDl/3-E7-hez hozzáadtuk a CpG-t. The other compositions containing only oligo without adjuvant were prepared in PBS to 7.4 was added to the CpG diluted ProtDl / 3-E7-offer.

Az antigén nélküli adjuváns kontrollokat úgy állítottuk elő, hogy a fehérjét PBS-sel helyettesítettük. The adjuvants controls without antigen were prepared by replacing the protein in PBS.

1.3.2 Egerek és sejtvonalak 1.3.2 Mice and cell lines

Egerek: ezekben a kísérletekben C27J1/6 (Iffa Credo) egereket használtunk. Mice: used C27J1 / 6 (Iffa Credo) mice in these experiments.

Sejtvonalak: A TC1- (forrás: John Hopkins Egyetem) vagy EL4-sejteket 10% FCS-t és egyéb adalékokat [2 mM Lglutamin. Cell lines: Tc1 (source: Johns Hopkins University), or EL4 cells were 10% FCS and other additives [2 mM Lglutamin. 1% antibiotikum (10.000 E/ml penicillin, 10.000 pg/ml sztreptomicin), 1% nem esszenciális aminosav lOOx, 1% nátrium-piruvát (Gibco), 5xl0* 5 M 2-merkaptoetanol] tartalmazó RPMI-1640 (Bio Whittaker) tápközegben szaporítottuk. 1% antibiotic (10,000 units / ml penicillin, 10,000 pg / ml streptomycin), 1% non-essential amino Loox, 1% sodium pyruvate (Gibco), 5xl0 * 5 M 2-mercaptoethanol], RPMI-1640 (Bio Whittaker) supplemented We are grown. A injekciók beadása előtt a TCl-sejteket tripszinnel kezeltük, majd szérummentes tápközeggel mostuk. Prior to receiving the injection TCl cells were trypsinized and washed in serum free medium.

1.3.3 Tumornövekedés 1.3.3 Tumor Growth

Az állatokat a 0. napon tumorsejtekkel oltottuk be, majd a 7. napon véletlenszerűen csoportokba soroltuk őket. The animals inoculated with tumor cells on day 0 and on day 7 were divided into groups randomly. Ezt követően folyamatosan vizsgáltuk az egyes tumorok növekedését [a két fő átmérőt (A és B) körző segítségével hetente kétszer megmértük, így kaptuk az A x B értéket, amely a tumorfelület mérőszáma, majd csoportonként 5 értéket átlagoltunk, és ezt tüntettük fel a 6 hetes időszakot bemutató grafikonon]. Subsequently continuously we studied the growth of certain tumors [two main diameters (A and B) were measured twice weekly using calipers, to afford the value x B, wherein the tumor surface metrics and was averaged from five values ​​per group, and as indicated by the 6-week presentation stay graph].

*»· ···· ··· · • ·»· *· * "···· · · · · · • ·» · · *

1.3.4 CMI-leolvasás 1.3.4 CMI readings

In vitro limfoproliferáció In vitro lymphoproliferation

A limfoproliferációt egyedi lépsejt és nyirokcsomósejt mintákon végeztük el. The spleen and lymph node cells specific lymphoproliferation was performed on the samples. 200.000 lépsejtet vagy térdhaj lati nyirokcsomósejtet három párhuzamosban, 96-lyukú mikrolemezen, 1% normál egérszérumot és egyéb adalékokat tartalmazó RPMI-tápközegre szélesztettünk. 200000 spleen cells or popliteal lymph node cells were plated in triplicate, in 96 well microplate, in RPMI medium containing 1% normal mouse serum and other additives. 72 órás in vitro restimuláció után, amelyhez különböző mennyiségű PD1/3-E7et (1, 0,1, 0,01 pg/ml) vagy E7-et (10-1-0,1 gg/ml) alkalmaztunk, a tenyészet felülúszójából kivettünk 100 μΐ-t és 1 μϋί 3H-timidint (Amersham, 5 Ci/mmol) tartalmazó friss tápközeggel helyettesítettük. After 72 h in vitro restimulation, to which different amounts of PD1 / 3-E7et (1, 0.1, 0.01 pg / ml) or E7et (10-1-0,1 gg / ml) was used, the culture supernatant 100 is removed and replaced with 1 μΐ μϋί fresh medium containing 3H-thymidine (Amersham, 5 Ci / mmol). 16 óra elteltével a sejteket szűrőlemezeken learattuk, majd a beépült radioaktivitást βszámlálóban mértük. After 16 hours the cells were harvested filter plates and the incorporated radioactivity was measured βszámlálóban. Az eredményeket cpm-ben (három párhuzamos átlagában), vagy stimulációs indexben (a tenyészet átlag cpm-je antigénnel / a tenyészet átlag cpm-je antigén nélkül) fejeztük ki. The results are expressed in cpm (the average of three) or stimulation index (mean cpm in cultures with antigen / mean cpm in cultures without antigen).

1.3.5 CTL-teszt x 10 s lépsejtet 7 napon át, ConA (2%) (ld. fent) jelenlétében vagy anélkül 2 x 10 6 besugárzott (18.000 r) TCl-sejttel (E7-expresszáló tumorsejt) együtt tenyésztettünk. 1.3.5 CTL test x 10 spleen cells and Con A (2%) (see Fig. Above) in the presence or absence of 2 x 10 6 irradiated were cocultured for 7 days (18,000 r) TCL cells (E7 expressing tumor cells).

A citotoxicitás vizsgálatához alkalmazott célsejtek vagy Cr51-tel (DuPont NEN, 37 MBq/ml) töltött (1 óra, 37°C) TCl-sejtek vagy E7-tel pulzált [1 óra, 37°C a sejtek Cr51töltése során, 10 pg/ml E7-peptid (49-57) (QCB) EL4sejtekkel összehasonlítva] EL4-sejtek voltak, az NK-függő lízist K562-sejteken vizsgáltuk. target cells or Cr51-tel for testing cytotoxicity (DuPont NEN 37MBq / ml) loaded (1 hour, 37 ° C) TCl cells or E7 pulsed [1 hour at 37 ° C the cells during Cr51töltése, 10 pg / ml E7 peptide] were compared (49-57) (QCB) EL4sejtekkel EL4 cells NK dependent lysis was tested K562 cells. Egy 96-lyukú mikrolemez • »· fr (V-aljú, Nunc 2-45128) minden lyukába 2000 sejtet tettünk úgy, hogy a legmagasabb effektor/célsejt-arány 100/1 volt. A 96-well microplate • »fr · (V-bottomed Nunc 2-45128) were 2000 cells in each well so that the highest effector / target cell ratio was 100/1. A spontán és a maximális Cr51-felszabadulás kontrolikísérleteit hat párhuzamosban végeztük tápközegben vagy 1,5% tritonban tartott célsejteken. Spontaneous and maximum release Cr51 kontrolikísérleteit six replicates were performed with target cells or a medium of 1.5% Triton. A lemezeket óvatosan lecentrifugáltuk majd 4 órán, 7% C02~ben át 37°C-on inkubáltuk. The plates were then centrifuged gently for 4 h, incubated in 7% C02 ~ 37 ° C. A felülúszók 50-50 μΙ-ét egy 96-lyukú mikrolemez (Lumaplate, Packard) lyukaiba pipettáztuk, hagytuk beszáradni egy éjszakán át, majd Top Count típusú számlálóban visszamértük. The supernatants 50-50 μΙ in pipetted into a 96-well microplate (Lumaplate, Packard) to wells, allowed to dry overnight, then visszamértük type Top Count counter. Az eredményeket a specifikus lízis százalékában fejeztük ki, amelyet a következő képletből számoltunk: (kísérleti felszabadulás - spontán felszabadulás / (maximális felszabadulás - spontán felszabadulás) x 100. Results are expressed as percent specific lysis which is calculated from the following formula: (experimental release - spontaneous release / (maximal release - spontaneous release) x 100th

Szerológia serology

Az anti-E7-antitest koncentrációjának mérésére ELISÁ-t alkalmaztunk, amelynek során a fedő antigén az E7 volt. The anti-E7 antibody ELISA was used to measure the concentration of coating antigen was E7 in which. Az antigén- és antitestoldatokat lyukaként 50 μΐ mennyiségben alkalmaztuk. 50 μΐ was used in an amount of antigen and antibody solutions as a hole. Az antigén végkoncentrációja 3 gg/ml (karbonát-puff erben, pH 9,5) volt, és éjszakán át 4°C-on kötöttük ki egy 96-lyukú mikrotitráló lemez (Maxisorb Immuno-plate, Nunc, Dánia) lyukaiba. The final concentration of the antigen 3 gg / ml (carbonate buffer, pH 9.5) at 4 ° C was bound to wells of a 96-well microtiter plates (Maxisorb Immuno-plate, Nunc, Denmark) overnight. A lemezeket ezután 1 órán át 37°C-on inkubáltuk 1% szarvasmarha szérumalbumint és 0,1% Tween-20at tartalmazó PBS-sel (telítő puffer). The plates were then 1 hour at 37 ° C were incubated with 1% bovine serum albumin and PBS containing 0.1% Tween-20at (loading buffer). Az E7-tel fedett lemezek lyukaiba ezután a szérum telítő pufferben elkészített kétszeres hígításait (1/100-as hígítástól kezdve) adtuk, majd 1,5 órán át 37°C~on inkubáltuk. wells of the plates were then covered E7 tel (from 1/100 as dilution) was added to duplicate dilutions of serum prepared in loading buffer, then incubated for 1.5 hours at 37 ~ C. A lemezeket PBS/0,1% Tween-20-szal 3-szor mostuk, majd telítő pufferben 1/5000re hígított biotinnal konjugált anti-egér IgGl-et, IgG2a-t, * ►· Plates were washed 3 times with PBS / 0.1% Tween-20 and then diluted with a loading buffer 1 / 5000a with biotin-conjugated anti-mouse IgGI, IgG2a, * ► ·

- 54 IgG2b-t vagy IgGtot-t (Amersham, Egyesült Királyság) adtunk hozzá és 1,5 órán át 37°C-on inkubáltuk. - 54 IgGtot or IgG2b (Amersham, UK) was added and incubated for 1.5 hours at 37 ° C. A mosási lépést követően telitő pufferben 1/5000-re hígított sztreptavidinbiotinilált peroxidáz komplexet (Amersham, Egyesült Királyság) adtunk hozzá és 30 percig 37°C-on inkubáltuk. After the washing step was diluted / 5,000 to 1 saturation buffer sztreptavidinbiotinilált peroxydase complex (Amersham, UK) was added and incubated 30 min at 37 ° C. A lemezeket a fentiek szerint mostuk, majd 10 percig TMB-vel (tetrametil-benzidin) inkubáltuk. Plates were washed as above and incubated for 10 min with TMB (tetramethylbenzidine). A reakciót 4N H 2 SO 4 -gyel állítottuk le és a lemezeket 450 nm-nél olvastuk le. The reaction was stopped with 4N H 2 SO 4 and with an the plates read at 450 nm. A középponti hígításokat a SoftMax Pro szoftver segítségével (négyparaméteres egyenlet alkalmazásával)számitottuk ki. The midpoint dilutions calculated according to the SoftMax Pro software (using a four parameters equation).

XIV. XIV. példa example

A második kísérletben a találmány szerinti oltóanyagot a gerinc jelentősége szempontjából vizsgáltuk. In the second experiment, the vaccine of the invention was tested in the backbone of relevance.

1. Terápiás kísérletek: eljárás • C57BL/6 immunkompetens egerek lágyékába szubkután injekcióban 10 6 TCl-sejtet (E7-expresszáló tumorsejtek) (200 μΐ) adtunk be. 1. Therapeutic experiments: • The method of C57BL / 6 immunocompetent mice injected subcutaneously into the flank 10 6 TCl cells (E7 expressing tumor cells) (200 μΐ) was administered.

• 2 oltás, a tumorindukció után 7 és 14 nappal, a talppárnába adott injekcióval (100 pl: 50 pl/talppárna) , 5 pg • two vaccinations, 7 and 14 days after the Tumor Induction, the foot pads given by injection (100 l: 50 l / foot pad), 5 pg

ProtDl/3—E7(HPV16) , +/- CpG-oligó; ProtDl / 3 E7 (HPV 16), +/- CpG oligo; 1. oligó (WD1001), foszforotioát-módosított formában vagy ugyanaz az oligó (WD1006), de foszfodiészterkötéssel. Oligo 1 (WD1001), phosphorothioate-modified form or the same oligo (WD1006) but foszfodiészterkötéssel.

• 5 állat/csoport • 5 animals / group

A tumornövekedést az egyes tumorok hetente kétszer történő mérésével követtük nyomon. Tumor growth was monitored by measuring individual tumors twice a week. Az 5. ábrán az 5 állatból álló csoportok átlagos tumornövekedése látható, és azt ♦♦ Figure 5 shows the average tumor growth in groups of 5 animals can be seen, and it ♦♦

V* mutatja, hogy a foszforotioát-módosított oligonukleotidok hatásosan idézik elő a tumorok visszafejlődését. V * shows that the phosphorothioate modified oligonucleotides are effective to cause tumor regression.

Következtetések: conclusions:

• A 10 s TCl-tumorsejttel kezelt állatok mindegyikében növekedő tumor alakult ki. • In each of the 10 animals and treated TCl tumor cells growing tumor formed.

• A 7 nappal egymás után, PD1/3-E7(HPV16) fehérjével kétszer leoltott állatok mindegyikében tumor alakult ki. • 7 days in a row, PD1 / 3 E7 (HPV 16) protein in each of the two inoculated animals developed tumors.

• A vizsgált koncentrációkban a PDl/3-E7-fehérjével és WD1006 oligóval kezelt állatok mindegyikében kialakult tumor. • The concentrations tested formed in each of the animals treated with PD / 3 E7 protein and oligo WD1006 tumor.

• Az E7-fehérjét és CpG 1001-t 10-200 pg közötti mennyiségben kapó állatokban a tumorok részben vagy teljesen (20-40%) visszafejlődtek. • animal of E7 protein and CpG 1001 is receiving an amount of from 10 to 200 pg of tumors (20-40%) regressed partially or completely.

Az első koncentráció, amelynél a tumorok visszafejlődésével járó terápiás hatás még nem teljes mértékben jelentkezett E7 + 1 μg CpG-oligó 1001. The first concentration at which the therapeutic effect is associated with tumor regression is not fully occurred 1 ug E7 + CpG oligo 1,001th

XV. XV. példa example

A harmadik kísérletsorozatban a találmány szerinti oltóanyagokat E7-fehérjét expresszáló transzgénikus egerekben vizsgáltuk. The third set of experiments, the vaccines of the present invention expressing E7 protein was tested in transgenic mice.

• A transzgénikus egértörzset M. Parmentier és C. Ledent állította elő az IRIBHN-nél (ULB) [Hivatkozás: PNAS (USA) 87, 6176-6180 (1990)]. • the transgenic mouse strain M. Parmentier and C. LEDENE prepare the IRIBHN than (ULB) [Reference: PNAS (USA) 87 (1990) 6176-6180].

• Mivel a transzgénikus egerek születésüktől fogva együtt élnek az E7(HPV-16) génnel, úgymond toleránsak e génnel szemben, azaz a HPV-16-ból származó E7 ebben az esetben saját antigén-nek tekintendő. • Because the transgenic mice from birth live with the E7 (HPV-16) gene, so to speak, against those from E7 tolerant gene, ie, from HPV-16 in this case considered as a self-antigen has.

• · • · ···· ···· ·· • · · • ♦ · · · · • · · · · • A transzgén expresszióját a tiroglobulin-promóter irányítja. • ···· ···· ·· · · • • • ♦ · · · · · · · · · · • • The expression of the transgene controlled by the thyroglobulin promoter. Mivel a tiroglobulin csak a pajzsmirigyben expresszálódik konstitutív módon, az E7 is a pajzsmirigyben expresszálódik. As expressed constitutively, the E7 is expressed only in the thyroid thyroglobulin in the thyroid gland.

• Az expresszió eredményeként a pajzsmirigysejtek proliferálódnak, és az egerekben strúma és gócok fejlődnek ki, amelyek 0,5-1 év után ráterjedő rákká alakulnak át. • As a result of the expression in thyroid cells proliferate, and the mice develop goiter and nodules, which are transformed into cancer after invasive 0.5-1 years.

A kísérlet eredményei (Id. 6. ábra) azt mutatják, hogy a találmány szerinti CpG-oligonukleotiddal és antigénnel történő terápiás oltás hatására csökken a tumornövekedés, sőt a tumor teljes mértékben visszafejlődhet. The results of the experiment (see Fig. 6) show that the effect of a therapeutic vaccination with CpG oligonucleotide and antigen according to the invention reduces tumor growth or even regress the tumor entirely.

Anyagok és eljárások • C57BL/6-Transgenic hím vagy nőstény egerek lágyékába szubkután injekcióban 10 e TCl-sejtet (E7-expresszáló tumorsejtek) (200 μΐ) adtunk be. Materials and Methods flank of mice by subcutaneous injection of 10 e TCl cells (E7 expressing tumor cells) (200 μΐ) was administered • C57BL / 6 Transgenic males or females.

• 2 oltás, a tumorindukció után 7 és 14 nappal, a talppárnába adott injekcióval (100 μΐ: 50 μΐ/talppárna) , 5 μg • two vaccinations, 7 and 14 days after the Tumor Induction, the foot pads given by injection (100 μΐ 50 μΐ / foot pad), 5 ug

ProtDl/3—E7(HPV16), CpG-oligonukleotid: TCT CCC AGC GTG CGC CAT és két kontroll adjuváns jelenlétében. ProtDl / 3 E7 (HPV 16), CpG oligonucleotide TCT CCC AGC GTG CGC CAT and two control the presence of adjuvant.

• 10 állat/csoport • 10 animals / group

A második immunizálás után 2 és 4 héttel az állatokat leöltük, és kivettük a lépet valamint a térdhaj lati nyirokcsomót . 2 and 4 weeks after the second immunization, the animals were sacrificed and spleens were taken and the popliteal lymph node.

Következtetés Conclusion

A találmány szerinti oltóanyagok hatásosan idézik el a HPV-indukált tumorok visszafejlődését. The vaccines of the invention effective to induce the regression of HPV-induced tumors.

···· ···· · · ···· ···· · ·

- 57 SZEKVENCIALISTA az ί. - 57 of the sequence listing ί. azonosítószámú szekvencia adatai: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI: SEQ ID NO: Details: SEQUENCE CHARACTERISTICS:

HOSSZA: 220 aminosav LENGTH: 220 amino acids

TÍPUSA: aminosav TYPE: amino acid

HÁNY SZÁLÚ: egy HOW MANY FIBERS: A

TOPOLÓGIÁJA: lineáris TOPOLOGY: linear

Fehérje: D 1/3 E7 his Protein D 1/3 E7 His

AZ 1. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: DESCRIPTION OF SEQ ID No. 1:
Mer Mer Asp asp Pro Pro Ser Ser Ser Ser His His Ser Ser Ser Ser Asn Asn Met Met Alá below Asn Asn Thr Thr Gin Gin Met Met Lys Lys
1 1 5 5 10 10 15 15
Ser Ser Asp asp Lys Lys Ile Ile Ile Ile Ile Ile Alá below His His Arg Arg Gly Gly Alá below Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr Leu Leu Pro Pro
20 20 25 25 30 30
Glu Glu His His Thr Thr Leu Leu Glu Glu Ser Ser Lys Lys Alá below Leu Leu Alá below Phe Phe Alá below Gin Gin Gin Gin Alá below Asp asp
35 35 40 40 45 45
Tyr Tyr Leu Leu Glu Glu Gin Gin Asp asp Leu Leu Alá below Met Met Thr Thr Lys Lys Asp asp Gly Gly Arg Arg Leu Leu Val With Val With
50 50 55 55 60 60
Ile Ile His His Asp asp His His Phe Phe Leu Leu Asp asp Gly Gly Leu Leu Thr Thr Asp asp Val With Alá below Lys Lys Lys Lys Phe Phe
65 65 70 70 75 75 80 80
Pro Pro His His Arg Arg His His Arg Arg Lys Lys Asp asp Gly Gly Arg Arg Tyr Tyr Tyr Tyr Val With Ile Ile Asp asp Phe Phe Thr Thr
85 85 90 90 95 95
Leu Leu Lys Lys Glu Glu Ile Ile Gin Gin Ser Ser Leu Leu Glu Glu Met Met Thr Thr Glu Glu Asn Asn Phe Phe Glu Glu Thr Thr Met Met
100 100 105 105 110 110
Alá below Met Met His His Gly Gly Asp asp Thr Thr Pro Pro Thr Thr Leu Leu His His Glu Glu Tyr Tyr Met Met Leu Leu Asp asp Leu Leu
115 115 120 120 125 125
Gin Gin Pro Pro Glu Glu Thr Thr Thr Thr Asp asp Leu Leu Tyr Tyr Cys Cys Tyr Tyr Glu Glu Gin Gin Leu Leu Asn Asn Asp asp Ser Ser
130 130 135 135 140 140
Ser Ser Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp asp Glu Glu Ile Ile Asp asp Gly Gly Pro Pro Alá below Gly Gly Gin Gin Alá below Glu Glu Pro Pro
145 145 150 150 155 155 160 160
Asp asp Arg Arg Alá below His His Tyr Tyr Asn Asn Ile Ile Val With Thr Thr Phe Phe Cys Cys Cys Cys Lys Lys cys cys Asp asp Ser Ser
165 165 170 170 175 175
Thr Thr Leu Leu Arg Arg Leu Leu Cys Cys Val With Gin Gin Ser Ser Thr Thr His His Val With Asp asp Ile Ile Arg Arg Thr Thr Leu Leu
1B0 1B0 185 185 190 190
Glu Glu Asp asp Leu Leu Leu Leu Met Met Gly Gly Thr Thr Leu Leu Gly Gly Ile Ile Val With Cys Cys Pro Pro Ile Ile Cys Cys Ser Ser
195 195 200 200 205 205
Gin Gin Lys Lys Pro Pro Thr Thr Ser Ser Gly Gly His His His His His His His His His His Kis small
210 210 215 215 220 220

• · • ·

A 2. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI: 2. The SEQ ID NO DATA: SEQUENCE CHARACTERISTICS:

HOSSZA: 663 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris Fehérje: D 1/3 E7 his LENGTH: 663 base pairs TYPE: nucleic acid NUMBER OF FIBERS: single TOPOLOGY: linear Protein D 1/3 E7 His

A 2. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: The SEQ ID NO: 2 DESCRIPTION:

ATGGATCCAA ATGGATCCAA

ATTATTGCTC ATTATTGCTC

120 120

CTTGCGTTTG CTTGCGTTTG

180 180

CGTTTAGTGG CGTTTAGTGG

240 240

CCACATCGTC CCACATCGTC

300 300

CAAAGTTTAG CAAAGTTTAG

360 360

TTGCATGAAT TTGCATGAAT

420 420

TTAAATGACA TTAAATGACA

480 480

GACAGAGCCC GACAGAGCCC

540 540

TGCGTACAAA TGCGTACAAA

600 600

GGAATTGTGT GGAATTGTGT

660 660

TAA TAA

663 663

GCAGCCATTC GCAGCCATTC

ACCGTGGTGC ACCGTGGTGC

CACAACAGGC CACAACAGGC

TTATTCACGA TTATTCACGA

ATCGTAAAGA ATCGTAAAGA

AAATGACAGA AAATGACAGA

ATATGTTAGA. ATATGTTAGA.

GCTCAGAGGA GCTCAGAGGA

ATTACAATAT ATTACAATAT

GCACACACGT GCACACACGT

GCCXCATCTG GCCXCATCTG

ATCAAATATG ATCAAATATG

TAGCGGTTAT TAGCGGTTAT

TGATTATTTA TGATTATTTA

TCACTTTTTA TCACTTTTTA

TGGCCGTTAC TGGCCGTTAC

AAACTTTGAA AAACTTTGAA

TTTGCAACCK TTTGCAACCK

GGAGGATGAA GGAGGATGAA

TGTAACCTTT TGTAACCTTT

AGACATTCGT AGACATTCGT

TTCTCAGAAA TTCTCAGAAA

GCGAATACCC GCGAATACCC

TTACCAGAGC TTACCAGAGC

GAGCAAGATT GAGCAAGATT

GATGGCTTGA GATGGCTTGA

TATGTCATCG TATGTCATCG

ACCATGGCCA ACCATGGCCA

GAGACAACTG GAGACAACTG

ATAGATGGTC ATAGATGGTC

TGTTGCAAGT TGTTGCAAGT

ACTTTGGAAG ACTTTGGAAG

CCAACTAGTG CCAACTAGTG

AAATGAAATC AAATGAAATC

ATACGTTAGA ATACGTTAGA

TAGCAATGAC TAGCAATGAC

CTGATGTTGC CTGATGTTGC

ACTTTACCTT ACTTTACCTT

TGCATGGAGA TGCATGGAGA

ATCTCTACTG ATCTCTACTG

CAGCTGGACA CAGCTGGACA

GTGACTCTAC GTGACTCTAC

ACCTGTTAAT ACCTGTTAAT

GCCACCATCA GCCACCATCA

AGACAAAATC AGACAAAATC

ATCTAAAGCA ATCTAAAGCA

TAAGGATGGT TAAGGATGGT

GAAAAAATTC GAAAAAATTC

AAAAGAAATT AAAAGAAATT

TACACCTACA TACACCTACA

TTATGAGCAA TTATGAGCAA

AGCAGAACCG AGCAGAACCG

GGGCACACTA GGGCACACTA

CCATCACCAT CCATCACCAT

A 3. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: The third SEQ ID NO DATA:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI: SEQUENCE CHARACTERISTICS:

HOSSZA: 822 bázispár LENGTH: 822 base pairs

TÍPUSA: nukleinsav TYPE: nucleic

HÁNY SZÁLÚ: egy HOW MANY FIBERS: A

TOPOLÓGIÁJA: lineáris TOPOLOGY: linear

Fehérje: D 1/3 E6 His/HPV 16 Protein D 1/3 E6 His / HPV 16

A 3. AZONOSÍTÓSZÁMÚ ID No. 3

A'rüGATCCAA gcagccattc 60 A'rüGATCCAA gcagccattc 60

ATTATTGCTC ACCGTGGTGC 120 ATTATTGCTC ACCGTGGTGC 120

CTTGCGTTTG CACAACAGGC 1B0 CTTGCGTTTG CACAACAGGC 1B0

CGTTTAGTGG TTATTCACGA 240 CGTTTAGTGG TTATTCACGA 240

CCACATCGTC ATCGTAAAGA 300 CCACATCGTC ATCGTAAAGA 300

CAAAGTTTAG AAATGACAGA 360 CAAAGTTTAG AAATGACAGA 360

CGACCCAGAA AGTTACCACA 420 CGACCCAGAA AGTTACCACA 420

TTAGAATGTG TGTACTGCAA 480 TTAGAATGTG TGTACTGCAA 480

CGGGATTTAT GCATAGTATA 540 CGGGATTTAT GCATAGTATA 540

AAGTTTTATT CTAAAATTAG 600 AAGTTTTATT CTAAAATTAG 600

TTAGAACAGC AATACAACAA 660 TTAGAACAGC AATACAACAA 660

AAGCCACTGT GTCCTGAAGA 720 AAGCCACTGT GTCCTGAAGA 720

ATAAGGGGTC GGTGGACCGG 7B0 ATAAGGGGTC GGTGGACCGG 7B0

GAKACCCAGC TGACTAGTGG 822 GAKACCCAGC TGACTAGTGG 822

SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQUENCE DESCRIPTION:

ATCAAATATG GCGAATACCC ATCAAATATG GCGAATACCC

TAGCGGTTAT TTACCAGAGC TAGCGGTTAT TTACCAGAGC

TGATTATTTA GAGCAAGATT TGATTATTTA GAGCAAGATT

TCACTTTTTA GATGGCTTGA TCACTTTTTA GATGGCTTGA

TGGCCGTTAC TATGTCATCG TGGCCGTTAC TATGTCATCG

AAACTTTGAA ACCATGGCCA AAACTTTGAA ACCATGGCCA

GTTATGCACA GAGCTGCAAA GTTATGCACA GAGCTGCAAA

GCAACAGTTA CTGCGACGTG GCAACAGTTA CTGCGACGTG

TAGAGATGGG AATCCATATG TAGAGATGGG AATCCATATG

TGAGTATAGA CATTATTGTT TGAGTATAGA CATTATTGTT

ACCGTTGTGT GATTTGTTAA ACCGTTGTGT GATTTGTTAA

AAAGCAAAGA CATCTGGACA AAAGCAAAGA CATCTGGACA

TCGATGTATG TCTTGTTGCA TCGATGTATG TCTTGTTGCA

CCACCATCAC CATCACCATT CCACCATCAC CATCACCATT

AAATGAAATC AGACAAAATC ATACGTTAGA ATCTAAAGCA TAGCAATGAC TAAGGATGGT CTGATGTTGC GAAAAAATTC ACTTTACCTT AAAAGAAATT TGTTTCAGGA CCCACAGGAG CAACTATACA TGATATAATA AGGTATATGA CTTTGCTTTT CTGTATGTGA TAAATGTTTA ATAGTTTGTA TGGAACAACA TTAGGTGTAT TAACTGTCAA AAAAGCAAAG ATTCCATAAT GATCATCAAG AACACGTAGA AA AAATGAAATC AGACAAAATC ATACGTTAGA ATCTAAAGCA TAGCAATGAC TAAGGATGGT CTGATGTTGC GAAAAAATTC ACTTTACCTT AAAAGAAATT TGTTTCAGGA CCCACAGGAG CAACTATACA TGATATAATA AGGTATATGA CTTTGCTTTT CTGTATGTGA TAAATGTTTA ATAGTTTGTA TGGAACAACA TTAGGTGTAT TAACTGTCAA AAAAGCAAAG ATTCCATAAT GATCATCAAG AACACGTAGA AA

A 4. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI: 4 SEQ ID NO DATA: SEQUENCE CHARACTERISTICS:

HOSSZA: 274 bázispár LENGTH: 274 base pairs

TÍPUSA: aminosav TYPE: amino acid

HÁNY SZÁLÚ: egy HOW MANY FIBERS: A

TOPOLÓGIÁJA: lineáris TOPOLOGY: linear

Fehérje: D 1/3 E7 His/HPV 16 Protein D 1/3 E7 His / HPV 16

A 4. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: The SEQ ID NO: 4 DESCRIPTION:

Met Asp 1 Ser Asp Met Asp Ser Asp 1 Pro Lys Pro Lys Ser Ile 20 Ile 20 Ser Ser 5 He 5 He Ser His Ser Ser Asn Met Alá Asn Thr Gin 10 His Ser Ser Asn Met Asn Thr Gln 10 Falling Met 15 Leu 15 Met Leu Lys Pro Lys Pro
Ile Alá Ile Falling His His Arg Gly 25 Gly Arg 25 Alá Ser under Ser Gly Gly Tyr 30 Tyr 30
Glu His His Glu Thr Thr Leu Leu Glu Glu Ser Lys Ser Lys Alá below Leu Alá Falling Leu Phe Alá Phe Falling Gin Gin Gin Gin Alá below Asp asp
35 35 40 40 45 45
Tyr Leu Tyr Leu Glu Glu Gin Gin Asp asp Leu Alá Falling Leu Met Met Thr Lys Lys Thr Asp Gly Arg Asp Gly Arg Leu Leu Val With Val With
50 50 55 55 50 50
Ile His His Ile Asp asp His His Phe Phe Leu Asp Leu Asp Gly Gly Leu Thr Leu Thr Asp Val Val Asp Alá below Lys Lys Lys Lys Phe Phe
65 65 70 70 75 75 80 80
Pro His His pro Arg Arg His His Arg Arg Lys Asp Lys Asp Gly Gly Arg Tyr Arg Tyr Tyr Val Val-Tyr Ile Ile Asp asp Phe Phe Thr Thr
85 85 90 90 95 95

Leu Leu Lys Lys Glu Glu Ile 100 Ile 100 Gin Gin
Alá below Met Met Phe Phe Gin Gin Asp asp
Cys Cys Thr Thr 115 Glu Glu 115 Leu Leu Gin Gin
Tyr Tyr 130 Cys Cys 130 Lys Lys Gin Gin Gin Gin
145 Arg Arg 145 Asp asp Leu Leu Cys Cys Ile Ile
Asp asp Lys Lys Cys Cys Leu Leu 165 Lys Lys 165

Ser Ser Leu Glu Leu Glu Met Thr Glu 105 Met Thr Glu 105 Asn Asn Phe Phe Glu Thr 110 Glu Thr 110 Met Met
Pro Pro Gin Gin Glu Glu Arg Arg Pro Pro Arg Arg Lys Lys Leu Leu Pro Pro Gin Gin Leu Leu
120 120 125 125
Thr Thr Thr Thr Ile Ile Kis small Asp asp Ile Ile Ile Ile Leu Leu Glu Glu Cys Cys Val With
135 135 140 140
Leu Leu Leu Leu Arg Arg Arg Arg Glu Glu Val With Tyr Tyr Asp asp Phe Phe Alá below Phe Phe
150 150 155 155 160 160
Val With Tyr Tyr Arg Arg Asp asp Gly Gly Asn Asn Pro Pro Tyr Tyr Alá below Val With Cys Cys
170 170 175 175
Phe Phe Tyr Tyr Ser Ser Lys Lys Ile Ile Ser Ser Glu Glu Tyr Tyr Arg Arg His His Tyr Tyr

• · » · · · * • · ··· · ·· ··· ···· · · · · · » fr\ · ··· *· ·* · • · »· · · · · · · · * ·· • · · · · · · · · ····" fr \ * · · · · · · · *

180 180 135 135 190 190
Cys Cys Tyr Tyr Ser Ser Leu Leu Tyr Tyr Gly Gly Thr Thr Thr Thr Leu Leu Glu Glu Gin Gin Gin Gin Tyr Tyr Asn Asn Lys Lys Pro Pro
195 195 200 200 205 205
Leu Leu Cys Cys Asp asp Leu Leu Leu Leu Ile Ile Arg Arg Cys Cys Ile Ile Asn Asn Cys Cys Gin Gin Lys Lys Pro Pro Leu Leu Cys Cys
210 210 215 215 220 220
Pro Pro Glu Glu Glu Glu Lys Lys Gin Gin Arg Arg His His Leu Leu Asp asp Lys Lys Lys Lys Gin Gin Arg Arg Phe Phe His His Asn Asn
225 225 230 230 235 235 240 240
Ile Ile Arg Arg Gly Gly Arg Arg Trp Trp Thr Thr Gly Gly Arg Arg Cys Cys Met Met Ser Ser Cys Cys Cys Cys Arg Arg Ser Ser Ser Ser
245 245 250 250 255 255
Arg Arg Thr Thr Arg Arg Arg Arg Glu Glu Thr Thr Gin Gin Leu Leu Thr Thr Ser Ser Gly Gly His His His His His His His His His His
260 260 265 265 270 270

His His

AZ 5. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI: 5 of SEQ ID NO DATA: SEQUENCE CHARACTERISTICS:

HOSSZA: 1116 bázispár LENGTH: 1116 base pairs

TÍPUSA: nukleinsav TYPE: nucleic

HÁNY SZÁLÚ: egy HOW MANY FIBERS: A

TOPOLÓGIÁJA: lineáris TOPOLOGY: linear

Fehérje: D 1/3 E6/E7/ HPV16 Protein D 1/3 E6 / E7 / HPV16

AZ 5. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 5. DESCRIPTION OF SEQ ID NO:

ATGGATCCAA 60 ATTATTGCTC 120 ATGGATCCAA 60 ATTATTGCTC 120 GCAGCCATTC GCAGCCATTC ATCAAATATG ATCAAATATG GCGAATACCC GCGAATACCC AAATGAAATC AAATGAAATC AGACAAAATC AGACAAAATC
ACCGTGGTGC ACCGTGGTGC TAGCGGTTAT TAGCGGTTAT TTACCAGAGC TTACCAGAGC ATACGTTAGA ATACGTTAGA ATCTAAAGCA ATCTAAAGCA
CTTGCGTTTG 180 CTTGCGTTTG 180 CACAACAGGC CACAACAGGC TGATTATTTA TGATTATTTA GAGCAAGATT GAGCAAGATT TAGCAATGAC TAGCAATGAC TAAGGATGGT TAAGGATGGT
CGTTTAGTGG 240 CGTTTAGTGG 240 TTATTCACGA TTATTCACGA TCACTTTTTA TCACTTTTTA GATGGCTTGA GATGGCTTGA CTGATGTTGC CTGATGTTGC GAAAAAATTC GAAAAAATTC
CCACATCGTC 300 CCACATCGTC 300 ATCGTAAAGA ATCGTAAAGA TGGCCGTTAC TGGCCGTTAC TATGTCATCG TATGTCATCG ACTTTACCTT ACTTTACCTT AAAAGAAATT AAAAGAAATT
CAAAGTTTAG 360 CAAAGTTTAG 360 AAATGACAGA AAATGACAGA AAACTTTGAA AAACTTTGAA ACCATGGCCA ACCATGGCCA TGTTTCAGGA TGTTTCAGGA CCCACAGGAG CCCACAGGAG
CGACCCAGAA 420 CGACCCAGAA 420 AGTTACCACA AGTTACCACA GTTATGCACA GTTATGCACA GAGCTGCAAA GAGCTGCAAA CAACTATACA CAACTATACA TGATATAATA TGATATAATA
TTAGAATGTG 480 TTAGAATGTG 480 TGTACTGCAA TGTACTGCAA GCAACAGTTA GCAACAGTTA CTGCGACGTG CTGCGACGTG AGGTATATGA AGGTATATGA CTTTGCTTTT CTTTGCTTTT
CGGGATTTAT 540 CGGGATTTAT 540 GCATAGTATA GCATAGTATA TAGAGATGGG TAGAGATGGG AATCCATATG AATCCATATG CTGTATGTGA CTGTATGTGA TAAATGTTTA TAAATGTTTA
AAGTTTTATT 600 AAGTTTTATT 600 CTAAAATTAG CTAAAATTAG TGAGTATAGA TGAGTATAGA CATTATTGTT CATTATTGTT ATAGTTTGTA ATAGTTTGTA TGGAACAACA TGGAACAACA
TTAGAACAGC 660 TTAGAACAGC 660 AATACAACAA AATACAACAA ACCGTTGTGT ACCGTTGTGT GATTTGTTAA GATTTGTTAA TTAGGTGTAT TTAGGTGTAT TAACTGTCAA TAACTGTCAA
AAGCCACTGT 720 AAGCCACTGT 720 GTCCTGAAGA GTCCTGAAGA AAAGCAAAGA AAAGCAAAGA CATCTGGACA CATCTGGACA AAAAGCAAAG AAAAGCAAAG ATTCCATAAT ATTCCATAAT
ATAAGGGGTC 780 ATAAGGGGTC 780 GGTGGACCGG GGTGGACCGG TCGATGTATG TCGATGTATG TCTTGTTGCA TCTTGTTGCA GATCATCAAG GATCATCAAG AACACGTAGA AACACGTAGA
GAAACCCAGC 840 GAAACCCAGC 840 TGATGCATGG TGATGCATGG AGATACACCT AGATACACCT ACATTGCATG ACATTGCATG AATATATGTT AATATATGTT AGATTTGCAA AGATTTGCAA
CCAGAGACAA 900 CCAGAGACAA 900 CTGATCTCTA CTGATCTCTA CTGTTATGAG CTGTTATGAG CAATTAAATG CAATTAAATG ACAGCTCAGA ACAGCTCAGA GGAGGAGGAT GGAGGAGGAT
GAAATAGATG 960 GAAATAGATG 960 GTCCAGCTGG GTCCAGCTGG ACAAGCAGAA ACAAGCAGAA CCGGACAGAG CCGGACAGAG CCCATTACAA CCCATTACAA TATTGTAACC TATTGTAACC
TTTTGTTGCA 1020 TTTTGTTGCA 1020 AGTGTGACTC AGTGTGACTC TACGCTTCGG TACGCTTCGG TTGTGCGTAC TTGTGCGTAC AAAGCACACA AAAGCACACA CGTAGACATT CGTAGACATT
CGTACTTTGG 1080 AAACCAACTA 1116 CGTACTTTGG 1080 AAACCAACTA 1116 AAGACCTGTT GTGGCCACCA AAGACCTGTT GTGGCCACCA AATGGGCACA TCACCATCAC AATGGGCACA TCACCATCAC CTAGGAATTG CATTAA CTAGGAATTG CATTAA TGTGCCCCAT TGTGCCCCAT CTGTTCTCAG CTGTTCTCAG

A 6. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI: The SEQ ID NO: 6 DATA: SEQUENCE CHARACTERISTICS:

HOSSZA: 372 aminosav LENGTH: 372 amino acids

TÍPUSA: aminosav TYPE: amino acid

HÁNY SZÁLÚ: egy HOW MANY FIBERS: A

TOPOLÓGIÁJA: lineáris TOPOLOGY: linear

Fehérje: D 1/3 E6/E7 HPV16 Protein D 1/3 E6 / E7 HPV16

A 6. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: The SEQ ID NO: 6 DESCRIPTION:

Met 1 Met 1 Asp asp Pro Pro Ser Ser Ser 5 Ser 5 His His Ser Ser Ser Ser
Ser Ser Asp asp Lys Lys Ile 20 Ile 20 Iie Ile Ile Ile Alá below His His
Glu Glu His His Thr 35 Thr 35 Leu Leu Glu Glu Ser Ser Lys Lys Alá 40 below 40
Tyr Tyr Leu 50 Leu 50 Glu Glu Gin Gin Asp asp Leu Leu Alá 55 below 55 Met Met
Ile 65 Ile 65 His His Asp asp His His Phe Phe Leu 70 Leu 70 Asp asp Gly Gly
Pro Pro His His Arg Arg His His Arg 85 Arg 85 Lys Lys Asp asp Gly Gly
Leu Leu Lys Lys Glu Glu Ile 100 Ile 100 Gin Gin Ser Ser Leu Leu Glu Glu
Alá below Met Met Phe 115 Phe 115 Gin Gin Asp asp Pro Pro Gin Gin Glu 120 Glu 120
Cys Cys Thr 130 Thr 130 Glu Glu Leu Leu Gin Gin Thr Thr Thr 135 Thr 135 Ile Ile
Tyr 145 Tyr 145 Cys Cys Lys Lys Gin Gin Gin Gin Leu 150 Leu 150 Leu Leu Arg Arg
Arg Arg Asp asp Leu Leu Cys Cys Ile 165 Ile 165 Val With Tyr Tyr Arg Arg
Asp asp Lys Lys Cys Cys Leu 180 Leu 180 Lys Lys Phe Phe Tyr Tyr Ser Ser
Cys Cys Tyr Tyr Ser 195 Ser 195 Leu Leu Tyr Tyr Gly Gly Thr Thr Thr 200 Thr 200
Leu Leu Cys 210 Cys 210 Asp asp Leu Leu Leu Leu Ile Ile Arg 215 Arg 215 Cys Cys
Pro 225 Pro 225 Glu Glu Glu Glu Lys Lys Gin Gin Arg 230 Arg 230 His His Leu Leu
Ile Ile Arg Arg Gly Gly Arg Arg Trp 245 Trp 245 Thr Thr Gly Gly Arg Arg
Arg Arg Thr Thr Arg Arg Arg 260 Arg 260 Glu Glu Thr Thr Gin Gin Leu Leu
Hl5 Hl5 Glu Glu Tyr 275 Tyr 275 Met Met Leu Leu Asp asp Leu Leu Gin 280 280 Gin
Tyr Tyr Glu 290 Glu 290 Gin Gin Leu Leu Asn Asn Asp asp Ser 295 Ser 295 Ser Ser
Pro 305 Pro 305 Alá below Gly Gly Gin Gin Alá below Glu 310 Glu 310 Pro Pro Asp asp
Phe Phe Cys Cys Cys Cys Lys Lys cys 325 cys 325 Asp asp Ser Ser Thr Thr
His His Val With Asp asp Ile 340 Ile 340 Arg Arg Thr Thr Leu Leu Glu Glu
Ile His His Ile Val His 370 Val His 370 Cys 355 His Cys 355 His Pro Pro Ile Ile Cys Cys Ser Ser Gin 360 360 Gin

Asn Asn Met 10 Met 10 Alá below Asn Asn Thr Thr Gin Gin Met 15 Met 15 Lys Lys
Arg 25 Arg 25 Gly Gly Alá below Ser Ser Gly Gly Tyr 30 Tyr 30 Leu Leu Pro Pro
Leu Leu Alá below Phe Phe Alá below Gin 45 Gin 45 Gin Gin Alá below Asp asp
Thr Thr Lys Lys Asp asp Gly 60 Gly 60 Arg Arg Leu Leu Val With Val With
Leu Leu Thr Thr Asp 75 asp 75 Val With Alá below Lys Lys Lys Lys Phe 80 Phe 80
Arg Arg Tyr 90 Tyr 90 Tyr Tyr Val With Ile Ile Asp asp Phe 95 Phe 95 Thr Thr
Met 105 Met 105 Thr Thr Glu Glu Asn Asn Phe Phe Glu 110 Glu 110 Thr Thr Met Met
Arg Arg Pro Pro Arg Arg Lys Lys Leu 125 Leu 125 Pro Pro Gin Gin Leu Leu
Kis small Asp asp Ile Ile Ile 140 Ile 140 Leu Leu Glu Glu Cys Cys Val With
Arg Arg Glu Glu Val 155 with 155 Tyr Tyr Asp asp Phe Phe Alá below Phe 160 Phe 160
Asp asp Gly 170 Gly 170 Asn Asn Pro Pro Tyr Tyr Alá below Val 175 with 175 Cys Cys
Lys 185 Lys 185 Ile Ile Ser Ser Glu Glu Tyr Tyr Arg 190 Arg 190 His His Tyr Tyr
Leu Leu Glu Glu Gin Gin Gin Gin Tyr 205 Tyr 205 Asn Asn Lys Lys Pro Pro
Ile Ile Asn Asn Cys Cys Gin 220 220 Gin Lys Lys Pro Pro Leu Leu Cys Cys
Asp asp Lys Lys Lys 235 Lys 235 Gin Gin Arg Arg Phe Phe Kis small Asn 240 Asn 240
Cys Cys Met 250 Met 250 Ser Ser Cys Cys Cys Cys Arg Arg Ser 255 Ser 255 Ser Ser
Met 265 Met 265 His His Gly Gly Asp asp Thr Thr Pro 270 Pro 270 Thr Thr Leu Leu
Pro Pro Glu Glu Thr Thr Thr Thr Asp 28S Asp 28S Leu Leu Tyr Tyr cys cys
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp 300 Asp 300 Glu Glu Ile Ile Asp asp Gly Gly
Arg Arg Alá below Kis 315 small 315 Tyr Tyr Asn Asn Ile Ile Val With Thr 320 Thr 320
Leu Leu Arg 330 Arg 330 Leu Leu Cys Cys Val With Gin Gin Ser 335 Ser 335 Thr Thr
Asp 345 Asp 345 Leu Leu Leu Leu Met Met Gly Gly Thr 350 Thr 350 Leu Leu Gly Gly
Lys Lys Pro Pro Thr Thr Ser Ser Gly Gly His His Kis small His His

365 • · • · · 365 • • · · ·

- 62 A 7. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI: - 62 of SEQ ID NO: 7 INFORMATION: SEQUENCE CHARACTERISTICS:

HOSSZA: 663 bázispár LENGTH: 663 base pairs

TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris TYPE: nucleic acid NUMBER OF FIBERS: single TOPOLOGY: linear

Fehérje: D 1/3 E7 mutált HPV 16 A 7. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: Protein D 1/3 E7 mutated HPV 16 7 SEQ ID NO DESCRIPTION:

ATGGATCCAA GCAGCCATTC ATCAAATATG GCGAATACCC AAATGAAATC AGACAAAATC 60 ATGGATCCAA GCAGCCATTC ATCAAATATG GCGAATACCC AAATGAAATC AGACAAAATC 60

ATTATTGCTC ACCGTGGTGC TAGCGGTTAT TTACCAGAGC ATACGTTAGA ATCTAAAGCA 120 ATTATTGCTC ACCGTGGTGC TAGCGGTTAT TTACCAGAGC ATACGTTAGA ATCTAAAGCA 120

CTTGCGTTTG CACAACAGGC TGATTATTTA GAGCAAGATT TAGCAATGAC TAAGGATGGT 180 CTTGCGTTTG CACAACAGGC TGATTATTTA GAGCAAGATT TAGCAATGAC TAAGGATGGT 180

CGTTTAGTGG TTATTCACGA TCACTTTTTA GATGGCTTGA CTGATGTTGC GAAAAAATTC 240 CGTTTAGTGG TTATTCACGA TCACTTTTTA GATGGCTTGA CTGATGTTGC GAAAAAATTC 240

CCACATCGTC ATCGTAAAGA TGGCCGTTAC TATGTCATCG ACTTTACCTT AAAAGAAATT 300 CCACATCGTC ATCGTAAAGA TGGCCGTTAC TATGTCATCG ACTTTACCTT AAAAGAAATT 300

CAAAGTTTAG AAATGACAGA aaactttgaa accatggcca tgcatggaga tacacctaca 360 CAAAGTTTAG AAATGACAGA aaactttgaa accatggcca tgcatggaga tacacctaca 360

TTGCATGAAT ATATGTTAGA TTTGCAACCA GAGACAACTG ATCTCTACGG TTATCAGCAA 420 TTGCATGAAT ATATGTTAGA TTTGCAACCA GAGACAACTG ATCTCTACGG TTATCAGCAA 420

TTAAATGACA GCTCAGAGGA GGAGGATGAA ATAGATGGTC CAGCTGGACA AGCAGAACCG 480 TTAAATGACA GCTCAGAGGA GGAGGATGAA ATAGATGGTC CAGCTGGACA AGCAGAACCG 480

GACAGAGCCC ATTACAATAT TGTAACCTTT TGTTGCAAGT GTGACTCTAC GCTTCGGTTG 540 GACAGAGCCC ATTACAATAT TGTAACCTTT TGTTGCAAGT GTGACTCTAC GCTTCGGTTG 540

TGCGTACAAA GCACACACGT AGACATTCGT ACTTTGGAAG ACCTGTTAAT GGGCACACTA 600 TGCGTACAAA GCACACACGT AGACATTCGT ACTTTGGAAG ACCTGTTAAT GGGCACACTA 600

GGAATTGTGT GCCCCATCTG TTCTCAGAAA CCAACTAGTG GCCACCATCA CCATCACCAT 660 GGAATTGTGT GCCCCATCTG TTCTCAGAAA CCAACTAGTG GCCACCATCA CCATCACCAT 660

TAA TAA

663 663

A 8. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: 8, SEQ ID NO DATA:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI: SEQUENCE CHARACTERISTICS:

HOSSZA: 220 aminosav LENGTH: 220 amino acids

TÍPUSA: aminosav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris TYPE: amino acid NUMBER OF FIBERS: single TOPOLOGY: linear

Fehérje: D 1/3 E7 mutált HPV 16 • · · Protein D 1/3 E7 HPV-16 mutated • · ·

- 63 A 8. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: - 63 8. DESCRIPTION OF SEQ ID NO:

Met Met Asp asp Pro Pro Ser Ser Ser Ser His His Ser Ser Ser Ser Asn Asn Met Met Aia Aia Asn Asn Thr Thr Gin Gin Met Met Lys Lys
- 1 - 1 5 5 10 10 15 15
Ser Ser Asp asp Lys Lys Ile Ile Ile Ile Ile Ile Alá below His His Arg Arg Gly Gly Alá below Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr Leu Leu Pro Pro
20 20 25 25 30 30
Glu Glu His His Thr Thr Leu Leu Glu Glu Ser Ser Lys Lys Alá below Leu Leu Alá below Phe Phe Aia Aia Gin Gin Gin Gin Alá below Asp asp
35 35 40 40 45 45
Tyr Tyr Leu Leu Glu Glu Gin Gin Asp asp Leu Leu Alá below Met Met Thr Thr Lys Lys Asp asp Gly Gly Arg Arg Leu Leu Val With Val With
50 50 55 55 60 60
Ile Ile His His Asp asp His His Phe Phe Leu Leu Asp asp Gly Gly Leu Leu Thr Thr Asp asp Val With Alá below Lys Lys Lys Lys Phe Phe
65 65 70 70 75 75 80 80
Pro Pro His His Arg Arg His His Arg Arg Lys Lys Asp asp Gly Gly Arg Arg Tyr Tyr Tyr Tyr Val With Ile Ile Asp asp Phe Phe Thr Thr
85 85 90 90 95 95
Leu Leu Lys Lys Glu Glu Ile Ile Gin Gin Ser Ser Leu Leu Glu Glu Met Met Thr Thr Glu Glu Asn Asn Phe Phe Glu Glu Thr Thr Met Met
100 100 105 105 110 110
Alá below Met Met Kis small Gly Asp Asp, Gly Thr Thr Pro Pro Thr Thr Leu Leu His His Glu Glu Tyr Tyr Met Met Leu Leu Asp asp Leu Leu
115 115 120 120 125 125
Gin Gin Pro Pro Glu Glu Thr Thr Thr Thr Asp asp Leu Leu Tyr Tyr Gly Gly Tyr Tyr Gin Gin Gin Gin Leu Leu Asn Asn Asp asp Ser Ser
130 130 135 135 140 140
Ser Ser Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp asp Glu Glu Ile Ile Asp asp Gly Gly Pro Pro Aia Aia Gly Gly Gin Gin Aia Aia Glu Glu Pro Pro
145 145 150 150 155 155 160 160
Asp asp Arg Arg Alá below His His Tyr Tyr Asn Asn Ile Ile Val With Thr Thr Phe Phe Cys Cys Cys Cys Lys Lys Cys Cys Asp asp Ser Ser
165 165 170 170 175 175
Thr Thr Leu Leu Arg Arg Leu Leu Cys Cys Val With Gin Gin Ser Ser Thr Thr His His Val With Asp asp Ile Ile Arg Arg Thr Thr Leu Leu
180 180 185 185 190 190
Glu Glu Asp asp Leu Leu Leu Leu Met Met Gly Gly Thr Thr Leu Leu Gly Gly Ile Ile Val With Cys Cys Pro Pro Ile Ile Cys Cys Ser Ser
195 195 200 200 205 205
Gin Gin Lys Lys Pro Pro Thr Thr Ser Ser Gly Gly His His His His His His His His His His His His

A 9. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI: 9. The SEQ ID NO DATA: SEQUENCE CHARACTERISTICS:

HOSSZA: 879 bázispár LENGTH: 879 base pairs

TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris TYPE: nucleic acid NUMBER OF FIBERS: single TOPOLOGY: linear

Fehérje: E6 His HPV 16 Protein: HPV16 E6 His

A 9. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: The SEQ ID NO: 9 DESCRIPTION:

ATGAAAGGGG GAATTGTACA TTCAGACGGC TCTTATCCAA AAGACAAGTT TGAGAAAATC 60 ATGAAAGGGG GAATTGTACA TTCAGACGGC TCTTATCCAA AAGACAAGTT TGAGAAAATC 60

AATGGCACTT GGTACTACTT TGACAGTTCA GGCTATATGC TTGCAGACCG CTGGAGGAAG 120 AATGGCACTT GGTACTACTT TGACAGTTCA GGCTATATGC TTGCAGACCG CTGGAGGAAG 120

CACACAGACG GCAACTGGTA CTGGTTCGAC AACTCAGGCG AAATGGCTAC AGGCTGGAAG 180 aaaatcgctg ataagtggta ctatttcaac gaagaaggtg ccatgaagac aggctgggtc 240 CACACAGACG GCAACTGGTA CTGGTTCGAC AACTCAGGCG AAATGGCTAC AGGCTGGAAG 180 aaaatcgctg ataagtggta ctatttcaac gaagaaggtg ccatgaagac aggctgggtc 240

AAGTACAAGG ACACTTGGTA CTACTTAGAC GCTAAAGAAG GCGCCATGGT ATCAAATGCC 300 AAGTACAAGG ACACTTGGTA CTACTTAGAC GCTAAAGAAG GCGCCATGGT ATCAAATGCC 300

TTTATCCAGT CAGCGGACGG AACAGGCTGG TACTACCTCA AACCAGACGG AACACTGGCK 360 TTTATCCAGT CAGCGGACGG AACAGGCTGG TACTACCTCA AACCAGACGG AACACTGGCK 360

GACAGGCCAG AATTGGCCAG CATGCTGGAC ATGGCCATGT TTCAGGACCC ACAGGAGCGA 420 GACAGGCCAG AATTGGCCAG CATGCTGGAC ATGGCCATGT TTCAGGACCC ACAGGAGCGA 420

CCCAGAAAGT TACCACAGTT ATGCACAGAG CTGCAAACAA CTATACATGA TATAATATTA 480 CCCAGAAAGT TACCACAGTT ATGCACAGAG CTGCAAACAA CTATACATGA TATAATATTA 480

GAATGTGTGT ACTGCAAGCA ACAGTTACTG CGACGTGAGG TATATGACTT TGCTTTTCGG 540 GAATGTGTGT ACTGCAAGCA ACAGTTACTG CGACGTGAGG TATATGACTT TGCTTTTCGG 540

GATTTATGCA TAGTATATAG AGATGGGAAT CCATATGCTG TATGTGATAA ATGTTTAAAG 600 • · · · • · • · · · · · ·· ··· · ·· ···· ·· ·· · ·'«···»» TATA GATTTATGCA TAG TAG AGATGGGAAT CCATATGCTG TATGTGATAA ATGTTTAAAG 600 • • · · · • · · · · · · · · · · ·· ·· ·· ·· ···· · ' «···» »

- 64 TTTTATTCTA AAATTAGTGA GTATAGACAT TATTGTTATA GTTTGTATGG AACAACATTA 660 - 64 TTTTATTCTA AAATTAGTGA GTATAGACAT TATTGTTATA GTTTGTATGG AACAACATTA 660

GAACAGCAAT ACAACAAACC GTTGTGTGAT TTGTTAATTA GGTGTATTAA CTGTCAAAAG 720 GAACAGCAAT ACAACAAACC GTTGTGTGAT TTGTTAATTA GGTGTATTAA CTGTCAAAAG 720

CCACTGTGTC CTGAAGAAAA GCAAAGACAT CTGGACAAAA AGCAAAGATT CCATAATATA 730 CCACTGTGTC CTGAAGAAAA GCAAAGACAT CTGGACAAAA AGCAAAGATT CCATAATATA 730

AGGGGTCGGT GGACCGGTCG ATGTATGTCT TGTTGCAGAT CATCAAGAAC ACGTAGAGAA 340 AGGGGTCGGT GGACCGGTCG ATGTATGTCT TGTTGCAGAT CATCAAGAAC ACGTAGAGAA 340

ACCCAGCTGA CTAGTGGCCA CCATCACCAT CACCATTAA 879 ACCCAGCTGA CTAGTGGCCA CCATCACCAT CACCATTAA 879

A 10. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: 10 SEQ ID NO DATA:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI: SEQUENCE CHARACTERISTICS:

HOSSZA: 293 aminosav LENGTH: 293 amino acids

TÍPUSA: aminosav TYPE: amino acid

HÁNY SZÁLÚ: egy HOW MANY FIBERS: A

TOPOLÓGIÁJA: lineáris TOPOLOGY: linear

Fehérje: E6 His HPV 16 Protein: HPV16 E6 His

A 10. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: The SEQ ID NO: 10 DESCRIPTION:

Met 1 Met 1 Lys Lys Gly Gly Gly Gly Ile Val 5 Ile Val 5 His His Ser Ser Asp asp Gly 10 Gly 10 Ser Ser Tyr Tyr Pro Pro Lys Lys Asp 15 asp 15 Lys Lys
Phe Phe Glu Glu Lys Lys Ile 20 Ile 20 Asn Gly Asn Gly Thr Thr Trp Trp Tyr 25 Tyr 25 Tyr Tyr Phe Phe Asp asp Ser Ser Ser 30 Ser 30 Gly Gly Tyr Tyr
Met Met Leu Leu Ala 35 Ala 35 Asp asp Arg Trp Arg-Trp Arg Arg Lys 40 Lys 40 His His Thr Thr Asp asp Gly Gly Asn 45 Asn 45 Trp Trp Tyr Tyr Trp Trp
Phe Phe Asp 50 asp 50 Asn Asn Ser Ser Gly Glu Gly Glu Met 55 Met 55 Ala Ala Thr Thr Gly Gly Trp Trp Lys 60 Lys 60 Lys Lys Ile Ile Ala Ala Asp asp
Lys 65 Lys 65 Trp Trp Tyr Tyr Tyr Tyr Phe Asn 70 Phe Asn 70 Glu Glu Glu Glu Gly Gly Ala Ala Met 75 Met 75 Lys Lys Thr Thr Gly Gly Trp Trp Val 80 Val 80
Lys Lys Tyr Tyr Lys Lys Asp asp Thr Trp B5 Trp Thr B5 Tyr Tyr Tyr Tyr Leu Leu Asp 90 asp 90 Ala Ala Lys Lys Glu Glu Gly Gly Ala 95 Ala 95 Met Met
Val With Ser Ser Asn Asn Ala 100 Ala 100 Phe Ile Phe Ile Gin Gin Ser Ser Ala 105 Ala 105 Asp asp Gly Gly Thr Thr Gly Gly Trp 110 Trp 110 Tyr Tyr Tyr Tyr
Leu Leu Lys Lys Pro 115 Pro 115 Asp asp Gly Thr Thr Gly Leu Leu Ala 120 Ala 120 Asp asp Arg Arg Pro Pro Glu Glu Leu 125 Leu 125 Ala Ala Ser Ser Met Met
Leu Leu Asp 130 Asp 130 Met Met Ala Ala Met Phe Met Phe Gin 135 135 Gin Asp asp Pro Pro Gin Gin Glu Glu Arg 140 Arg 140 Pro Pro Arg Arg Lys Lys Leu Leu
Pro 145 Pro 145 Gin Gin Leu Leu Cys Cys Thr Glu 150 Thr Glu 150 Leu Leu Gin Gin Thr Thr Thr Thr Ile 155 Ile 155 His His Asp asp Ile Ile Ile Ile Leu 160 Leu 160
Glu Glu Cys Cys Val With Tyr Tyr Cys Lys 165 Lys Cys 165 Gin Gin Gin Gin Leu Leu Leu 170 Leu 170 Arg Arg Arg Arg Glu Glu Val With Tyr 175 Tyr 175 Asp asp
Phe Phe Ala Ala Phe Phe Arg 18C Arg 18C Asp Leu Asp Leu Cys Cys Ile Ile Val 185 with 185 Tyr Tyr Arg Arg Asp asp Gly Gly Asn 190 Asn 190 Pro Pro Tyr Tyr
Ala Ala Val With Cys 195 Cys 195 Asp asp Lys Cys Lys Cys Leu Leu Lys 200 Lys 200 Phe Phe Tyr Tyr Ser Ser Lys Lys Ile 205 Ile 205 Ser Ser Glu Glu Tyr Tyr
Arg Arg His 210 His 210 Tyr Tyr Cys Cys Tyr Ser Tyr Ser Leu 215 Leu 215 Tyr Tyr Gly Gly Thr Thr Thr Thr Leu 220 Leu 220 Glu Glu Gin Gin Gin Gin Tyr Tyr
Asn 225 Asn 225 Lys Lys Pro Pro Leu Leu Cys Asp 230 Asp Cys 230 Leu Leu Leu Leu Ile Ile Arg Arg Cys 235 Cys 235 Ile Ile Asn Asn Cys Cys Gin Gin Lys 240 Lys 240
Pro Pro Leu Leu cys cys Pro Pro Glu Glu 245 Glu Glu 245 Lys Lys Gin Gin Arg Arg His 250 His 250 Leu Leu Asp asp Lys Lys Lys Lys Gin 255 255 Gin Arg Arg
Phe Phe His His Asn Asn Ile 260 Ile 260 Arg Gly Arg Gly Arg Arg Trp Trp Thr 265 Thr 265 Gly Gly Arg Arg Cys Cys Met Met Ser 270 Ser 270 Cys Cys Cys Cys
Arg His Arg His Ser His His ser Ser 275 His 275 His Ser Arg His Arg His Thr Arg Thr Arg Arg Arg Glu 280 Glu 280 Thr Thr Gin Gin Leu Leu Thr Thr Ser 285 Ser 285 Gly Gly His His His His

290 • « · · · * · » » 290 • "· · · · *» »

A 11. AZONOSITOSZAMU SZEKVENCIA ADATAI: The 11 AZONOSITOSZAMU sequence data:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI: SEQUENCE CHARACTERISTICS:

HOSSZA: 720 bázispár LENGTH: 720 base pairs

TÍPUSA: nukleinsav TYPE: nucleic

HÁNY SZÁLÚ: egy HOW MANY FIBERS: A

TOPOLÓGIÁJA: lineáris TOPOLOGY: linear

Fehérje: E7 HIS HPV 16 Protein: HPV 16 E7 HIS

A 11. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: The SEQ ID NO: 11 DESCRIPTION:

ATGAAAGGGG GAATTGTACA TTCAGACGGC 60 ATGAAAGGGG GAATTGTACA TTCAGACGGC 60

AATGGCACTT GGTACTACTT TGACAGTTCA 120 AATGGCACTT GGTACTACTT TGACAGTTCA 120

CACACAGACG GCAACTGGTA CTGGTTCGAC 180 CACACAGACG GCAACTGGTA CTGGTTCGAC 180

AAAATCGCTG ATAAGTGGTA CTATTTCAAC 240 AAAATCGCTG ATAAGTGGTA CTATTTCAAC 240

AAGTACAAGG ACACTTGGTA CTACTTAGAC 300 AAGTACAAGG ACACTTGGTA CTACTTAGAC 300

TTTATCCAGT CAGCGGACGG AACAGGCTGG 360 TTTATCCAGT CAGCGGACGG AACAGGCTGG 360

GACAGGCCAG AATTGGCCAG CATGCTGGAC 420 GACAGGCCAG AATTGGCCAG CATGCTGGAC 420

CATGAATATA TGTTAGATTT GCAACCAGAG 480 CATGAATATA TGTTAGATTT GCAACCAGAG 480

AATGACAGCT CAGAGGAGGA GGATGAAATA 540 AATGACAGCT CAGAGGAGGA GGATGAAATA 540

AGAGCCCATT ACAATATTGT AACCTTTTGT 600 AGAGCCCATT ACAATATTGT AACCTTTTGT 600

GTACAAAGCA CACACGTAGA CATTCGTACT 660 GTACAAAGCA CACACGTAGA CATTCGTACT 660

ATTGTGTGCC CCATCTGTTC TCAGAAACCA 720 ATTGTGTGCC CCATCTGTTC TCAGAAACCA 720

TCTTATCCAA AAGACAAGTT TGAGAAAATC TCTTATCCAA AAGACAAGTT TGAGAAAATC

GGCTATATGC TTGCAGACCG CTGGAGGAAG GGCTATATGC TTGCAGACCG CTGGAGGAAG

AACTCAGGCG AAATGGCTAC AGGCTGGAAG AACTCAGGCG AAATGGCTAC AGGCTGGAAG

GAAGAAGGTG CCATGAAGAC AGGCTGGGTC GAAGAAGGTG CCATGAAGAC AGGCTGGGTC

GCTAAAGAAG GCGCCATGGT ATCAAATGCC TACTACCTCA AACCAGACGG AACACTGGCA GCTAAAGAAG GCGCCATGGT ATCAAATGCC TACTACCTCA AACCAGACGG AACACTGGCA

ATGGCCATGC ATGGAGATAC ACCTACATTG ATGGCCATGC ATGGAGATAC ACCTACATTG

ACAACTGAIC TCTACTGTTA TGAGCAATTA ACAACTGAIC TCTACTGTTA TGAGCAATTA

GATGGTCCAG CTGGACAAGC AGAACCGGAC GATGGTCCAG CTGGACAAGC AGAACCGGAC

TGCAAGTGTG ACTCTACGCT TCGGTTGTGC TGCAAGTGTG ACTCTACGCT TCGGTTGTGC

TTGGAAGACC TGTTAATGGG CACACTAGGA TTGGAAGACC TGTTAATGGG CACACTAGGA

ACTAGTGGCC ACCATCACCA TCACCATTAA ACTAGTGGCC ACCATCACCA TCACCATTAA

A 12. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI: 12. The SEQ ID NO DATA: SEQUENCE CHARACTERISTICS:

HOSSZA: 240 aminosav LENGTH: 240 amino acids

TÍPUSA: aminosav TYPE: amino acid

HÁNY SZÁLÚ: egy HOW MANY FIBERS: A

TOPOLÓGIÁJA: lineáris TOPOLOGY: linear

Fehérje: E7 HIS HPV 16 eee · Protein: HPV 16 E7 HIS eee ·

- 66 A 12. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: - 66 12 DESCRIPTION OF SEQ ID NO:

Met 1 Met 1 Lys Lys Gly Gly Gly Gly Ile 5 Ile 5 Val With His His Ser Ser Asp asp Gly 10 Gly 10 Ser Ser Tyr Tyr Pro Pro Lys Lys Asp 15 asp 15 Lys Lys
Phe Phe Glu Glu Lys Lys Ile 20 Ile 20 Asn Asn Gly Gly Thr Thr Trp Trp Tyr 25 Tyr 25 Tyr Tyr Phe Phe Asp asp Ser Ser Ser 30 Ser 30 Gly Gly Tyr Tyr
Met Met Leu Leu Alá 35 below 35 Asp asp Arg Arg Trp Trp Arg Arg Lys 40 Lys 40 His His Thr Thr Asp asp Gly Gly Asn 45 Asn 45 Trp Trp Tyr Tyr Trp Trp
Phe Phe Asp 50 asp 50 Asn Asn Ser Ser Gly Gly Glu Glu Met 55 Met 55 Alá below Thr Thr Gly Gly Trp Trp Lys 60 Lys 60 Lys Lys Ile Ile Alá below Asp asp
Lys 65 Lys 65 Trp Trp Tyr Tyr Tyr Tyr Phe Phe Asn 70 Asn 70 Glu Glu Glu Glu Gly Gly Alá below Met 75 Met 75 Lys Lys Thr Thr Gly Gly Trp Trp Val 80 Val 80
Lys Lys Tyr Tyr Lys Lys Asp asp Thr 85 Thr 85 Trp Trp Tyr Tyr Tyr Tyr Leu Leu Asp 90 asp 90 Alá below Lys Lys Glu Glu Gly Gly Alá 95 below 95 Met Met
Val With Ser Ser Asn Asn Alá 100 below 100 Phe Phe Ile Ile Gin Gin Ser Ser Alá 105 below 105 Asp asp Gly Gly Thr Thr Gly Gly Trp 110 Trp 110 Tyr Tyr Tyr Tyr
Leu Leu Lys Lys Pro 115 Pro 115 Asp asp Gly Gly Thr Thr Leu Leu Alá 120 below 120 Asp asp Arg Arg Pro Pro Glu Glu Leu 125 Leu 125 Alá below Ser Ser Met Met
Leu Leu Asp 130 Asp 130 Met Met Alá below Met Met His His Gly 135 Gly 135 Asp asp Thr Thr Pro Pro Thr Thr Leu 140 Leu 140 His His Glu Glu Tyr Tyr Met Met
Leu 145 Leu 145 Asp asp Leu Leu Gin Gin Pro Pro Glu 150 Glu 150 Thr Thr Thr Thr Asp asp Leu Leu Tyr 155 Tyr 155 Cys Cys Tyr Tyr Glu Glu Gin Gin Leu 160 Leu 160
Asn Asn Asp asp Ser Ser Ser Ser Glu 165 Glu 165 Glu Glu Glu Glu Asp asp Glu Glu Ile 170 Ile 170 Asp asp Gly Gly Pro Pro Alá below Gly 175 Gly 175 Gin Gin
Alá below Glu Glu Pro Pro Asp 180 Asp 180 Arg Arg Alá below His His Tyr Tyr Asn 185 Asn 185 Ile Ile Val With Thr Thr Phe Phe Cys 190 Cys 190 Cys Cys Lys Lys
Cys Cys Asp asp Ser 195 Ser 195 Thr Thr Leu Leu Arg Arg Leu Leu Cys 200 Cys 200 Val With Gin Gin Ser Ser Thr Thr His 205 His 205 Val With Asp asp Ile Ile
Arg Arg Thr 210 Thr 210 Leu Leu Glu Glu Asp asp Leu Leu Leu 215 Leu 215 Met Met Gly Gly Thr Thr Leu Leu Gly 220 Gly 220 Ile Ile Val With Cys Cys Pro Pro
Ile 225 Ile 225 Cys Cys Ser Ser Gin Gin Lys Lys Pro 230 Pro 230 Thr Thr Ser Ser Gly Gly His His His 235 His 235 His His His His His His His His

A 13. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: 13. The SEQ ID NO DATA:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI: SEQUENCE CHARACTERISTICS:

HOSSZA: 1173 bázispár LENGTH: 1173 base pairs

TÍPUSA: nukleinsav TYPE: nucleic

HÁNY SZÁLÚ: egy HOW MANY FIBERS: A

TOPOLÓGIÁJA: lineáris TOPOLOGY: linear

Fehérje: E6E7 His HPV 16 Protein: HPV16 E6E7 His

A 13. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: 13. DESCRIPTION OF SEQ ID NO:

ATGAAAGGGG GAATTGTACA TTCAGACGGC TCTTATCCAA AAGACAAGTT TGAGAAAATC 60 ATGAAAGGGG GAATTGTACA TTCAGACGGC TCTTATCCAA AAGACAAGTT TGAGAAAATC 60

AATGGCACTT GGTACTACTT TGACAGTTCA GGCTATATGC TTGCAGACCG CTGGAGGAAG 120 AATGGCACTT GGTACTACTT TGACAGTTCA GGCTATATGC TTGCAGACCG CTGGAGGAAG 120

CACACAGACG GCAACTGGTA CTGGTTCGAC AACTCAGGCG AAATGGCTAC AGGCTGGAAG 1B0 CACACAGACG GCAACTGGTA CTGGTTCGAC AACTCAGGCG AAATGGCTAC AGGCTGGAAG 1B0

AAAATCGCTG ATAAGTGGTA CTATTTCAAC GAAGAAGGTG CCATGAAGAC AGGCTGGGTC 240 AAAATCGCTG ATAAGTGGTA CTATTTCAAC GAAGAAGGTG CCATGAAGAC AGGCTGGGTC 240

AAGTACAAGG ACACTTGGTA CTACTTAGAC GCTAAAGAAG GCGCCATGGT ATCAAATGCC 300 AAGTACAAGG ACACTTGGTA CTACTTAGAC GCTAAAGAAG GCGCCATGGT ATCAAATGCC 300

TTTATCCAGT CAGCGGACGG AACAGGCTGG TACTACCTCA AACCAGACGG AACACTGGCA 360 TTTATCCAGT CAGCGGACGG AACAGGCTGG TACTACCTCA AACCAGACGG AACACTGGCA 360

GACAGGCCAG AATTGGCCAG CATGCTGGAC ATGGCCATGT TTCAGGACCC ACAGGAGCGA 420 « ·······« · · ·· • · · · · · · * * «·· · ·· ··♦ ···· · · · » · · • «*» ·· ·· ·· GACAGGCCAG AATTGGCCAG CATGCTGGAC ATGGCCATGT TTCAGGACCC ACAGGAGCGA 420 «·······« ·· • · · · · · · · · * '· ·· ·· ·· ···· ♦ · · · »· · •" * »·· ·· ··

CCCAGAAAGT TACCACAGTT ATGCACAGAG CTGCAAACAA CTATACATGA TATAATATTA 480 CCCAGAAAGT TACCACAGTT ATGCACAGAG CTGCAAACAA CTATACATGA TATAATATTA 480

GAATGTGTGT ACTGCAAGCA ACAGTTACTG CGACGTGAGG TATATGACTT TGCTTTTCGG 540 GAATGTGTGT ACTGCAAGCA ACAGTTACTG CGACGTGAGG TATATGACTT TGCTTTTCGG 540

GATTTATGCA TAGTATATAG AGATGGGAAT CCATATGCTG TATGTGATAA ATGTTTAAAG 600 TATA GATTTATGCA TAG TAG AGATGGGAAT CCATATGCTG TATGTGATAA ATGTTTAAAG 600

TTTTATTCTA AAATTAGTGA GTATAGACAT TATTGTTATA GTTTGTATGG AACAACATTA 660 TTTTATTCTA AAATTAGTGA GTATAGACAT TATTGTTATA GTTTGTATGG AACAACATTA 660

GAACAGCAAT ACAACAAACC GTTGTGTGAT TTGTTAATTA GGTGTATTAA CTGTCAAAAG 720 GAACAGCAAT ACAACAAACC GTTGTGTGAT TTGTTAATTA GGTGTATTAA CTGTCAAAAG 720

CCACTGTGTC CTGAAGAAAA GCAAAGACAT CTGGACAAAA AGCAAAGATT CCATAATATA 780 CCACTGTGTC CTGAAGAAAA GCAAAGACAT CTGGACAAAA AGCAAAGATT CCATAATATA 780

AGGGGTCGGT GGACCGGTCG ATGTATGTCT TGTTGCAGAT CATCAAGAAC ACGTAGAGAA 840 AGGGGTCGGT GGACCGGTCG ATGTATGTCT TGTTGCAGAT CATCAAGAAC ACGTAGAGAA 840

ACCCAGCTGA TGCATGGAGA TACACCTACA TTGCATGAAT ATATGTTAGA TTTGCAACCA 900 ACCCAGCTGA TGCATGGAGA TACACCTACA TTGCATGAAT ATATGTTAGA TTTGCAACCA 900

GAGACAACTG ATCTCTACTG TTATGAGCAA TTAAATGACA GCTCAGAGGA GGAGGATGAA 960 GAGACAACTG ATCTCTACTG TTATGAGCAA TTAAATGACA GCTCAGAGGA GGAGGATGAA 960

ATAGATGGTC CAGCTGGACA AGCAGAACCG GACAGAGCCC A.TTACAATAT TGTAACCTTT 1020 ATAGATGGTC CAGCTGGACA AGCAGAACCG GACAGAGCCC A.TTACAATAT TGTAACCTTT 1020

TGTTGCAAGT GTGACTCTAC GCTTCGGTTG TGCGTACAAA GCACACACGT AGACATTCGT 1080 TGTTGCAAGT GTGACTCTAC GCTTCGGTTG TGCGTACAAA GCACACACGT AGACATTCGT 1080

ACTTTGGAAG ACCTGTTAAT GGGCACACTA GGAATTGTGT GCCCCATCTG TTCTCAGAAA 1140 ACTTTGGAAG ACCTGTTAAT GGGCACACTA GGAATTGTGT GCCCCATCTG TTCTCAGAAA 1140

CCAACTAGTG GCCACCATCA CCATCACCAT TAA 1173 CCAACTAGTG GCCACCATCA CCATCACCAT TAA 1173

A 14. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: 14. The SEQ ID NO DATA:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI: SEQUENCE CHARACTERISTICS:

HOSSZA: 391 aminosav LENGTH: 391 amino acids

TÍPUSA: aminosav TYPE: amino acid

HÁNY SZÁLÚ: egy HOW MANY FIBERS: A

TOPOLÓGIÁJA: lineáris TOPOLOGY: linear

Fehérje: E6E7 His HPV16 Protein: His HPV16 E6E7

A 14. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: The SEQ ID NO: 14 DESCRIPTION:

Met 1 Met 1 Lys Lys Gly Gly Gly Gly Ile 5 Ile 5 Val With His His Ser Ser Asp asp Gly 10 Gly 10 Ser Ser Tyr Tyr Pro Pro Lys Lys Asp 15 asp 15 Lys Lys
Phe Phe Glu Glu Lys Lys Ile 20 Ile 20 Asn Asn Gly Gly Thr Thr Trp Trp Tyr 25 Tyr 25 Tyr Tyr Phe Phe Asp asp Ser Ser Ser 30 Ser 30 Gly Gly Tyr Tyr
Met Met Leu Leu Alá 35 below 35 Asp asp Arg Arg Trp Trp Arg Arg Lys 40 Lys 40 His His Thr Thr Asp asp Gly Gly Asn 45 Asn 45 Trp Trp Tyr Tyr Trp Trp
Phe Phe Asp 50 asp 50 Asn Asn Ser Ser Gly Gly Glu Glu Met 55 Met 55 Alá below Thr Thr Gly Trp Gly Trp Lys 60 Lys 60 Lys Lys Ile Ile Alá below Asp asp
Lys 65 Lys 65 Trp Trp Tyr Tyr Tyr Tyr Phe Phe Asn 70 Asn 70 Glu Glu Glu Glu Gly Gly Alá below Met 75 Met 75 Lys Lys Thr Thr Gly Gly Trp Trp Val 80 Val 80
Lys Lys Tyr Tyr Lys Lys Asp asp Thr 85 Thr 85 Trp Trp Tyr Tyr Tyr Tyr Leu Leu Asp 90 asp 90 Alá below Lys Lys Glu Glu Gly Gly Alá 95 below 95 Met Met
Val With Ser Ser Asn Asn Alá 100 below 100 Phe Phe Ile Ile Gin Gin Ser Ser Alá 105 below 105 Asp asp Gly Gly Thr Thr Gly Trp 110 Gly Trp 110 Tyr Tyr Tyr Tyr
Leu Leu Lys Lys Pro 115 Pro 115 Asp asp Gly Gly Thr Thr Leu Leu Alá 120 below 120 Asp asp Arg Arg Pro Pro Glu Glu Leu 125 Leu 125 Alá below Ser Ser Met Met
Leu Leu Asp 130 Asp 130 Met Met Alá below Met Met Phe Phe Gin 135 135 Gin Asp asp Pro Pro Gin Gin Glu Glu Arg 140 Arg 140 Pro Pro Arg Arg Lys Lys Leu Leu
Pro 145 Pro 145 Gin Gin Leu Leu Cys Cys Thr Thr Glu 150 Glu 150 Leu Leu Gin Gin Thr Thr Thr Thr Ile 155 Ile 155 His His Asp asp Ile Ile Ile Ile Leu 160 Leu 160
Glu Glu Cys Cys Val With Tyr Tyr Cys 165 Cys 165 Lys Lys Gin Gin Gin Gin Leu Leu Leu 170 Leu 170 Arg Arg Arg Arg Glu Glu Val With Tyr 175 Tyr 175 Asp asp
Phe Phe Alá below Phe Phe Arg 180 Arg 180 Asp asp Leu Leu Cys Cys Ile Ile Val 185 with 185 Tyr Tyr Arg Arg Asp asp Gly Gly Asn 190 Asn 190 Pro Pro Tyr Tyr
Alá below Val With Cys 195 Cys 195 Asp asp Lys Lys Cys Cys Leu Leu Lys 200 Lys 200 Phe Phe Tyr Tyr Ser Ser Lys Lys Ile 205 Ile 205 Ser Ser Glu Glu Tyr Tyr
Arg Arg His 210 His 210 Tyr Tyr Cys Cys Tyr Tyr Ser Ser Leu 215 Leu 215 Tyr Tyr Gly Gly Thr Thr Thr Thr Leu 220 Leu 220 Glu Glu Gin Gin Gin Gin Tyr Tyr

Asn Asn Lys Lys Pro Pro Leu Leu Cys Cys Asp asp Leu Leu Leu Leu Ile Ile Arg Arg Cys Cys Ile Ile Asn Asn Cys Cys Gin Gin Lys Lys
225 225 230 230 235 235 240 240
Pro Pro Leu Leu Cys Cys Pro Pro Glu Glu Glu Glu Lys Lys Gin Gin Arg Arg His His Leu Leu Asp asp Lys Lys Lys Lys Gin Gin Arg Arg
245 245 250 250 255 255
Phe Phe His His Asn Asn Ile Ile Arg Arg Gly Gly Arg Arg Trp Trp Thr Thr Gly Gly Arg Arg Cys Cys Met Met Ser Ser Cys Cys Cys Cys
260 260 265 265 270 270
Arg Arg Ser Ser Ser Ser Arg Arg Thr Thr Arg Arg Arg Arg Glu Glu Thr Thr Gin Gin Leu Leu Met Met His His Gly Gly Asp asp Thr Thr
275 275 280 280 285 285
Pro Pro Thr Thr Leu Leu His His Glu Glu Tyr Tyr Hét Seven Leu Leu Asp asp Leu Leu Gin Gin Pro Pro Glu Glu Thr Thr Thr Thr Asp asp
290 290 295 295 300 300
Leu Leu Tyr Tyr Cys Cys Tyr Tyr Glu Glu Gin Gin Leu Leu Asn Asn Asp asp Ser Ser Ser Ser Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp asp Glu Glu
305 305 310 310 315 315 320 320
Ile Ile Asp asp Gly Gly Pro Pro Alá below Gly Gly Gin Gin Alá below Glu Glu Pro Pro Asp asp Arg Arg Alá below His His Tyr Tyr Asn Asn
325 325 330 330 335 335
Ile Ile Val With Thr Thr Phe Phe Cys Cys Cys Cys Lys Lys Cys Cys Asp asp Ser Ser Thr Thr Leu Leu Arg Arg Leu Leu Cys Cys Val With
340 340 345 345 350 350
Gin Gin Ser Ser Thr Thr His His Val With Asp asp Ile Ile Arg Arg Thr Thr Leu Leu Glu Glu Asp asp Leu Leu Leu Leu Met Met Gly Gly
355 355 360 360 365 365
Thr Thr Leu Leu Gly Gly Ile Ile Val With Cys Cys Pro Pro Ile Ile Cys Cys Ser Ser Gin Gin Lys Lys Pro Pro Thr Thr Ser Ser Gly Gly
370 370 375 375 380 380
His His His His His His His His His His His His
385 385 390 390

A 15. AZONOSITOSZAMU SZEKVENCIA ADATAI: The 15 AZONOSITOSZAMU sequence data:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI: SEQUENCE CHARACTERISTICS:

HOSSZA: 684 bázispár LENGTH: 684 base pairs

TÍPUSA: nukleinsav TYPE: nucleic

HÁNY SZÁLÚ: egy HOW MANY FIBERS: A

TOPOLÓGIÁJA: lineáris TOPOLOGY: linear

Fehérje: E 1/3 E7 his HPV 18 Protein: E 1/3 E7 his HPV 18

A 15. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: The SEQ ID NO: 15 DESCRIPTION:

GCGAATACCC AAATGAAATC AGACAAAATC GCGAATACCC AAATGAAATC AGACAAAATC

TTACCAGAGC ATACGTTAGA ATCTAAAGCA TTACCAGAGC ATACGTTAGA ATCTAAAGCA

GAGCAAGATT TAGCAATGAC TAAGGATGGT GAGCAAGATT TAGCAATGAC TAAGGATGGT

GATGGCTTGA CTGATGTTGC GAAAAAATTC GATGGCTTGA CTGATGTTGC GAAAAAATTC

TATGTCATCG ACTTTACCTT AAAAGAAATT TATGTCATCG ACTTTACCTT AAAAGAAATT

ACCATGGCCA TGCATGGACC TAAGGCAACA ► ► ACCATGGCCA TGCATGGACC TAAGGCAACA

CAAAATGAAA TTCCGGTTGA CCTTCTATGT CAAAATGAAA TTCCGGTTGA CCTTCTATGT

AACGATGAAA TAGATGAAGT TAATCATCAA AACGATGAAA TAGATGAAGT TAATCATCAA

CGTCACACAA TGTTGTGTAT GTGTTGTAAG CGTCACACAA TGTTGTGTAT GTGTTGTAAG

AGCTCAGCAG ACGACCTTCG AGCATTCCAG AGCTCAGCAG ACGACCTTCG AGCATTCCAG

TGTCCGTGGT GTGCATCCCA GCAGACTAGT TGTCCGTGGT GTGCATCCCA GCAGACTAGT

ATCAAKTATG ATCAAKTATG

TAGCGGTTAT TAGCGGTTAT

TGATTATTTA TGATTATTTA

TCACTTTTTA TCACTTTTTA

TGGCCGTTAC TGGCCGTTAC

AAACTTTGAA AAACTTTGAA

TTTAGAGCCC TTTAGAGCCC

AGAGGAAGAA AGAGGAAGAA

CGAACCACAA CGAACCACAA

AGTAGTAGAA AGTAGTAGAA

GTCCTTTGTG GTCCTTTGTG

TTAA TTAA

GCAGCCATTC GCAGCCATTC

ACCGTGGTGC ACCGTGGTGC

CACAACAGGC CACAACAGGC

TTATTCACGA TTATTCACGA

ATCGTAAAGA ATCGTAAAGA

AAATGACAGA AAATGACAGA

TTGTATTGCA TTGTATTGCA

TAAGCGACTC TAAGCGACTC

CCCGACGAGC CCCGACGAGC

GAATTGAGCT GAATTGAGCT

TGAACACCCT TGAACACCCT

ACCATCACCA ACCATCACCA

ATGGATCCAA ATGGATCCAA

ATTATTGCTC ATTATTGCTC

120 120

180 180

CGTTTAGTGG CGTTTAGTGG

240 240

CCACATCGTC CCACATCGTC

300 300

CAAAGTTTAG CAAAGTTTAG

360 360

TTGCAAGACA TTGCAAGACA

420 420

CACGAGCAAT CACGAGCAAT

480 480

CATTTACCAG CATTTACCAG

540 540

TGTGAAGCCA TGTGAAGCCA

600 600

CAGCTGTTTC CAGCTGTTTC

660 660

GGCCACCATC GGCCACCATC

684 • · · · • · · 684 • • · · · · ·

A 16. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI: 16. The SEQ ID NO DATA: SEQUENCE CHARACTERISTICS:

HOSSZA: 228 aminosav LENGTH: 228 amino acids

TÍPUSA: aminosav TYPE: amino acid

HÁNY SZÁLÚ: egy HOW MANY FIBERS: A

TOPOLÓGIÁJA: lineáris TOPOLOGY: linear

Fehérje: D 1/3 E7 his HPV 18 Protein D 1/3 E7 his HPV 18

A 16. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: The SEQ ID NO: 16 DESCRIPTION:

Met 1 Met 1 Asp asp Pro Pro Ser Ser Ser 5 Ser 5 Kis small Ser Ser Ser Ser Asn Asn Met 10 Met 10 Ala Ala Asn Asn Thr Thr Gin Gin Met 15 Met 15 Lys Lys
Ser Ser Asp asp Lys Lys Ile 20 Ile 20 Ile Ile Ile Ile Ala Ala His His Arg 25 Arg 25 Gly Gly Ala Ala Ser Ser Gly Gly Tyr 30 Tyr 30 Leu Leu Pro Pro
Glu Glu His His Thr 35 Thr 35 Leu Leu Glu Glu Ser Ser Lys Lys Ala 40 Ala 40 Leu Leu Ala Ala Phe Phe Ala Ala Gin 45 Gin 45 Gin Gin Ala Ala Asp asp
Tyr Tyr Leu 50 Leu 50 Glu Glu Gin Gin Asp asp Leu Leu Ala 55 Ala 55 Met Met Thr Thr Lys Lys Asp asp Gly 60 Gly 60 Arg Arg Leu Leu Val With Val With
Ile 65 Ile 65 His His Asp asp His His Phe Phe Leu 70 Leu 70 Asp asp Gly Gly Leu Leu Thr Thr Asp 75 asp 75 Val With Ala Ala Lys Lys Lys Lys Phe 80 Phe 80
Pro Pro His His Arg Arg His His Arg 85 Arg 85 Lys Lys Asp asp Gly Gly Arg Arg Tyr 90 Tyr 90 Tyr Tyr Val With Ile Ile Asp asp Phe 95 Phe 95 Thr Thr
Leu Leu Lys Lys Glu Glu Ile ICO Ile ICO Gin Gin Ser Ser Leu Leu Glu Glu Met 105 Met 105 Thr Thr Glu Glu Asn Asn Phe Phe Glu 110 Glu 110 Thr Thr Met Met
Ala Ala Met Met His 115 His 115 Gly Gly Pro Pro Lys Lys Ala Ala Thr 120 Thr 120 Leu Leu Gin Gin Asp asp Ile Ile Val 125 Val 125 Leu Leu His His Leu Leu
Glu Glu Pro 130 Pro 130 Gin. Gin. Asn Asn Glu Glu Ile Ile Pro 135 Pro 135 Val With Asp asp Leu Leu Leu Leu cys 140 cys 140 HÍ5 hi5 Glu Glu Gin Gin Leu Leu
Ser 145 Ser 145 Asp asp Ser Ser Glu Glu Glu Glu Glu 150 Glu 150 Asn Asn Asp asp Glu Glu Ile Ile Asp 155 Asp 155 Glu Glu Val With Asn Asn His His Gin 160 160 Gin
His His Leu Leu Pro Pro Ala Ala Arg 165 Arg 165 Arg Arg Ala Ala Glu Glu Pro Pro Gin 170 170 Gin Arg Arg His His Thr Thr Met Met Leu 175 Leu 175 Cys Cys
Met Met Cys Cys Cys Cys Lys 180 Lys 180 Cys Cys Glu Glu Ala Ala Arg Arg Ile 185 Ile 185 Glu Glu Leu Leu Val With Val With Glu 190 Glu 190 Ser Ser Ser Ser
Ala Ala Asp asp Asp 195 Asp 195 Leu Leu Arg Arg Ala Ala Phe Phe Gin 200 200 Gin Gin Gin Leu Leu Phe Phe Leu Leu Asn 205 Asn 205 Thr Thr Leu Leu Ser Ser
Phe His 225 Phe His 225 Val 210 His Val 210 His Cys His His Cys Pro Pro Trp Trp Cys Cys Ala 215 Ala 215 Ser Ser Gin Gin Gin Gin Thr Thr Ser 220 Ser 220 Gly Gly His His His His His His

A 17. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: 17. The SEQ ID NO DATA:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI: SEQUENCE CHARACTERISTICS:

HOSSZA: 110 aminosav LENGTH: 110 amino acids

TÍPUSA: aminosav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris TYPE: amino acid NUMBER OF FIBERS: single TOPOLOGY: linear

Tioredoxin • *·*····« ·« • · · · • ♦ ♦ ·· · ·· ··· · « · · · * • ·· · ·· ·* • thioredoxin * * ···· · "·« · • · · · ·· ·· • ♦ ♦ · · · · «· · · · ·· · ·· • * *

- 70 A 17. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: - 70 to 17 in SEQ ID NO DESCRIPTION:

Met Met Ser Ser ksp KSP Lys Lys Ile Ile Ile Ile His His Leu Leu Thr Thr Asp asp Asp asp Ser Ser Phe Phe Asp asp Thr Thr
1 1 5 5 10 10 15 15
Val With Leu Leu Lys Lys Alá below Asp asp Gly Gly Alá below Ile Ile Leu Leu Val With Asp asp Phe Phe Trp Trp Alá below Glu Glu
20 20 25 25 30 30
Cys Cys Gly Gly Pro Pro Cys Cys Lys Lys Met Met Ile Ile Alá below Pro Pro Ile Ile Leu Leu Asp asp Glu Glu Ile Ile Alá below
35 35 40 40 45 45 !►' ! ► '
Glu Glu Tyr Tyr Gin Gin Gly Gly Lys Lys Leu Leu Thr Thr Val With Alá below Lys Lys Leu Leu Asn Asn Ile Ile Asp asp Gin Gin
50 50 55 55 60 60
'ro 'ro Gly Gly Thr Thr Alá below Pro Pro Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Ile Ile Arg Arg Gly Gly Ile Ile Pro Pro Thr Thr Leu Leu
70 70 75 75
- - Lys Lys Asn Asn Gly Gly Glu Glu Val With Alá below Alá below Thr Thr Lys Lys Val With Gly Gly Alá below Leu Leu
B5 B5 90 90 95 95
r r Gin Gin Leu Leu Lys Lys Glu Glu Phe Phe Leu Leu Asp asp Alá below Asn Asn Leu Leu Alá below
100 100 105 105

Asp asp

Trp Trp

Asp asp

Asn Asn

Leu Leu

Ser Ser

A 18. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI: 18. The SEQ ID NO DATA: SEQUENCE CHARACTERISTICS:

HOSSZA: 684 bázispár LENGTH: 684 base pairs

TÍPUSA: nukleinsav TYPE: nucleic

HÁNY SZÁLÚ: egy HOW MANY FIBERS: A

TOPOLÓGIÁJA: lineáris TOPOLOGY: linear

Fehérje: D 1/3 E7 mutált HPV 18 Protein D 1/3 E7 mutated HPV 18

A 18. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: The SEQ ID NO: 18 DESCRIPTION:

ATGGATCCAA GCAGCCATTC ATCAAATATG GCGAATACCC AAATGAAATC AGACAAAAIC 60 ATGGATCCAA GCAGCCATTC ATCAAATATG GCGAATACCC AAATGAAATC AGACAAAAIC 60

ATTATTGCTC ACCGTGGTGC TAGCGGTTAT TTACCAGAGC ATACGTTAGA ATCTAAAGCA 120 ATTATTGCTC ACCGTGGTGC TAGCGGTTAT TTACCAGAGC ATACGTTAGA ATCTAAAGCA 120

CTTGCGTTTG CACAACAGGC TGATTATTTA GAGCAAGATT TAGCAATGAC TAAGGATGGT 180 CTTGCGTTTG CACAACAGGC TGATTATTTA GAGCAAGATT TAGCAATGAC TAAGGATGGT 180

CGTTTAGTGG TTATTCACGA TCACTTTTTA GATGGCTTGA CTGATGTTGC GAAAAAATTC 240 CGTTTAGTGG TTATTCACGA TCACTTTTTA GATGGCTTGA CTGATGTTGC GAAAAAATTC 240

CCACATCGTC ATCGTAAAGA TGGCCGTTAC TATGTCATCG ACTTTACCTT AAAAGAAATT 300 CCACATCGTC ATCGTAAAGA TGGCCGTTAC TATGTCATCG ACTTTACCTT AAAAGAAATT 300

CAAAGTTTAG AAATGACAGA AAACTTTGAA ACCATGGCCA TGCATGGACC TAAGGCAACA 360 CAAAGTTTAG AAATGACAGA AAACTTTGAA ACCATGGCCA TGCATGGACC TAAGGCAACA 360

TTGCAAGACA TTGTATTGCA TTTAGAGCCC CAAAATGAAA TTCCGGTTGA CCTTCTAGGT 420 TTGCAAGACA TTGTATTGCA TTTAGAGCCC CAAAATGAAA TTCCGGTTGA CCTTCTAGGT 420

CACCAGCAAT TAAGCGACTC AGAGGAAGAA AACGATGAAA TAGATGGAGT TAATCATCAA 480 CACCAGCAAT TAAGCGACTC AGAGGAAGAA AACGATGAAA TAGATGGAGT TAATCATCAA 480

CATTTACCAG CCCGACGAGC CGAACCACAA CGTCACACAA TGTTGTGTAT GTGTTGTAAG 540 CATTTACCAG CCCGACGAGC CGAACCACAA CGTCACACAA TGTTGTGTAT GTGTTGTAAG 540

TGTGAAGCCA GAATTGAGCT AGTAGTAGAA AGCTCAGCAG ACGACCTTCG AGCATTCCAG 600 TGTGAAGCCA GAATTGAGCT AGTAGTAGAA AGCTCAGCAG ACGACCTTCG AGCATTCCAG 600

CAGCTGTTTC TGAACACCCT GTCCTTTGTG TGTCCGTGGT GTGCATCCCA GCAGACTAGT 660 CAGCTGTTTC TGAACACCCT GTCCTTTGTG TGTCCGTGGT GTGCATCCCA GCAGACTAGT 660

GGCCACCATC ACCATCACCA TTAA 684 ·· · GGCCACCATC ACCATCACCA TTAA 684 ·· ·

A 19. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI: 19. The SEQ ID NO DATA: SEQUENCE CHARACTERISTICS:

HOSSZA: 228 aminosav LENGTH: 228 amino acids

TÍPUSA: aminosav TYPE: amino acid

HÁNY SZÁLÚ: egy HOW MANY FIBERS: A

TOPOLÓGIÁJA: lineáris TOPOLOGY: linear

Fehérje: D 1/3 E7 mutált HPV 18 Protein D 1/3 E7 mutated HPV 18

A 19. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: The SEQ ID NO: 19 DESCRIPTION:

Met 1 Met 1 Asp asp Pro Pro Ser Ser Ser 5 Ser 5 His His Ser Ser Ser Ser Asn Asn Met 10 Met 10 Alá below Asn Asn Thr Thr Gin Gin Met Lys 15 Met Lys 15
Ser Ser Asp asp Lys Lys Ile 20 Ile 20 Ile Ile Ile Ile Alá below His His Arg 25 Arg 25 Gly Gly Alá below Ser Ser Gly Gly Tyr 30 Tyr 30 Leu Pro Leu Pro
Glu Glu His His Thr 35 Thr 35 Leu Leu Glu Glu Ser Ser Lys Lys Alá 40 below 40 Leu Leu Alá below Phe Phe Alá below Gin 45 Gin 45 Gin Gin Alá Asp under the Asp
Tyr Tyr Leu 50 Leu 50 Glu Glu Gin Gin Asp asp Leu Leu Alá 55 below 55 Met Met Thr Thr Lys Lys Asp asp Gly Arg 60 Gly Arg 60 Leu Leu Val Val Val Val
Ile 65 Ile 65 His His Asp asp His His Phe Phe Leu 70 Leu 70 Asp asp Gly Gly Leu Leu Thr Thr Asp 75 asp 75 Val With Alá below Lys Lys Lys Phe 80 Lys Phe 80
Pro Pro His His Arg Arg His His Arg 85 Arg 85 Lys Lys Asp asp Gly Gly Arg Arg Tyr 90 Tyr 90 Tyr Tyr Val With Ile Ile Asp asp Phe Thr 95 Phe Thr 95
Leu Leu Lys Lys Glu Glu Ile 100 Ile 100 Gin Gin Ser Ser Leu Leu Glu Glu Met 105 Met 105 Thr Thr Glu Glu Asn Asn Phe Phe Glu 110 Glu 110 Thr Met Met-Thr
Alá below Met Met His 115 His 115 Gly Gly Pro Pro Lys Lys Alá below Thr 120 Thr 120 Leu Leu Gin Gin Asp asp Ile Ile Val 125 Val 125 Leu Leu His Leu His Leu
Glu Glu Pro 130 Pro 130 Glu Glu Asn Asn Glu Glu Ile Ile Pro 135 Pro 135 Val With Asp asp Leu Leu Leu Leu Gly 140 Gly 140 His His Gin Gin Gin Leu Gln Leu
Ser 145 Ser 145 Asp asp Ser Ser Glu Glu Glu Glu Glu 150 Glu 150 Asn Asn Asp asp Glu Glu Ile Ile Asp 155 Asp 155 Gly Gly Val With Asn Asn His Gin 160 His Gln 160
His His Leu Leu Pro Pro Alá below Arg 165 Arg 165 Arg Arg Alá below Glu Glu Pro Pro Gin 170 170 Gin Arg Arg His His Thr Thr Met Met Leu Cys 175 Leu Cys 175
Met Met Cys Cys Cys Cys Lys 130 Lys 130 Cys Cys Glu Glu Alá below Arg Arg Ile 185 Ile 185 Glu Glu Leu Leu Val With Val With Glu 190 Glu 190 . . Ser Ser Ser Ser
Alá below Asp asp Asp 195 Asp 195 Leu Leu Arg Arg Alá below Phe Phe Gin 200 200 Gin Gin Gin Leu Leu Phe Phe Leu Leu Asn 205 Asn 205 Thr Thr Leu Ser Ser Leu
Phe Phe Val 210 with 210 Cys Cys Pro Pro Trp Trp Cys Cys Alá 215 below 215 Ser Ser Gin Gin Gin Gin Thr Thr Ser 220 Ser 220 Gly Gly His His His His His His

His Kis His 225 • * · e · · • · · His small His 225 * • • · e · · · ·

V» ·> V »·>

A 20. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI: 20. The SEQ ID NO DATA: SEQUENCE CHARACTERISTICS:

HOSSZA: 837 bázispár LENGTH: 837 base pairs

TÍPUSA: nukleinsav TYPE: nucleic

HÁNY SZÁLÚ: egy HOW MANY FIBERS: A

TOPOLÓGIÁJA: lineáris TOPOLOGY: linear

Fehérje: D 1/3 E6 - His HPV.18 Protein D 1/3 E6 - His HPV.18

A 20. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: The SEQ ID NO: 20 DESCRIPTION:

ATGGATCCAA ATGGATCCAA

ATTATTGCTC ATTATTGCTC

120 120

CTTGCGTTTG CTTGCGTTTG

180 180

CGTTTAGTGG CGTTTAGTGG

240 240

CCACATCGTC CCACATCGTC

300 300

CAAAGTTTAG CAAAGTTTAG

360 360

CGACCCTACA CGACCCTACA

420 420

ATAACCTGTG ATAACCTGTG

480 480

AAAGATTTAT AAAGATTTAT

540 540

GATTTTTATT GATTTTTATT

600 600

TTGGAAAAAC TTGGAAAAAC

660 660

AAACCGTTGA AAACCGTTGA

720 720

ATAGCTGGGC ATAGCTGGGC

780 780

CTCCAACGAC CTCCAACGAC

B37 B37

GCAGCCATTC GCAGCCATTC

ACCGTGGTGC ACCGTGGTGC

CACAACAGGC CACAACAGGC

TTATTCACGA TTATTCACGA

ATCGTAAAGA ATCGTAAAGA

AAATGACAGA AAATGACAGA

AGCTACCTGA AGCTACCTGA

TATATTGCAA TATATTGCAA

TTGTGGTGTA TTGTGGTGTA

CTAGAATTAG CTAGAATTAG

TAACTAACAC TAACTAACAC

ATCCAGCAGA ATCCAGCAGA

ACTATAGAGG ACTATAGAGG

GCAGAGAAAC GCAGAGAAAC

ATCAAATATG GCGAATACCC ATCAAATATG GCGAATACCC

TAGCGGTTAT TTACCAGAGC TAGCGGTTAT TTACCAGAGC

TGATTATTTA GAGCAAGATT TGATTATTTA GAGCAAGATT

TCACTTTTTA GATGGCTTGA TCACTTTTTA GATGGCTTGA

TGGCCGTTAC TATGTCATCG TGGCCGTTAC TATGTCATCG

AAACTTTGAA ACCATGGCGC AAACTTTGAA ACCATGGCGC

TCTGTGCACG GAACTGAACA TCTGTGCACG GAACTGAACA

GACAGTATTG GAACTTACAG GACAGTATTG GAACTTACAG

TAGAGACAGT ATACCGCATG TAGAGACAGT ATACCGCATG

AGAATTAAGA CATTATTCAG AGAATTAAGA CATTATTCAG

TGGGTTATAC AATTTATTAA TGGGTTATAC AATTTATTAA

AAAACTTAGA CACCTTAATG AAAACTTAGA CACCTTAATG

CCAGTGCCAT TCGTGCTGCA CCAGTGCCAT TCGTGCTGCA

ACAAGTAACT AGTGGCCACC ACAAGTAACT AGTGGCCACC

AAATGAAATC AGACAAAATC ATACGTTAGA ATCTAAAGCA TAGCAAÍGAC TAAGGATGGT CTGATGTTGC GAAAAAATTC ACTTTACCTT AAAAGAAATT AAATGAAATC AGACAAAATC ATACGTTAGA ATCTAAAGCA TAGCAAÍGAC TAAGGATGGT CTGATGTTGC GAAAAAATTC ACTTTACCTT AAAAGAAATT

GCTTTGAGGA TCCAACACGG GCTTTGAGGA TCCAACACGG

CTTCACTGCA AGACATAGAA CTTCACTGCA AGACATAGAA

AGGTATTTGA ATTTGCATTT AGGTATTTGA ATTTGCATTT

CTGCATGCCA TAAATGTATA CTGCATGCCA TAAATGTATA

ACTCTGTGTA TGGAGACACA ACTCTGTGTA TGGAGACACA

TAAGGTGCCT GCGGTGCCAG TAAGGTGCCT GCGGTGCCAG

AAAAACGACG ATTTCACAAC AAAAACGACG ATTTCACAAC

ACCGAGCACG ACAGGAACGA ACCGAGCACG ACAGGAACGA

ATCACCATCA CCATTAA ATCACCATCA CCATTAA

A 21. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: 21. The SEQ ID NO DATA:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI: SEQUENCE CHARACTERISTICS:

HOSSZA: 279 aminosav LENGTH: 279 amino acids

TÍPUSA: aminosav TYPE: amino acid

HÁNY SZÁLÚ: egy HOW MANY FIBERS: A

TOPOLÓGIÁJA: lineáris TOPOLOGY: linear

Fehérje: D 1/3 E6 - His HPV 18 * *« « «· · 9 ·· « · • · ····· • « *· » * «·» ··»♦ · * · « · * Protein D 1/3 E6 - His HPV 18 * * «« «9 ·· ·« · · ····· • • «* ·" * "·" ·· "♦ * · ·« · *

Ρ ·«> ·· ·* «» Ρ · «> · * ··« »

- 73 A 21. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: - 73 DESCRIPTION 21, SEQ ID NO:

Met 1 Met 1 Asp asp Pro Pro Ser Ser Ser 5 Ser 5 His His Ser Ser Ser Ser Asn Asn Met 10 Met 10 Alá below Asn Asn Thr Thr Gin Gin Met 15 Met 15 Lys Lys
Ser Ser Asp asp Lys Lys ile 20 ile 20 He He Ile Ile Alá below His His Arg 25 Arg 25 Gly Gly Alá below Ser Ser Gly Gly Tyr 30 Tyr 30 Leu Leu Pro Pro
Glu Glu His His Thr 35 Thr 35 Leu Leu Glu Glu Ser Ser Lys Lys Alá 40 below 40 Leu Leu Alá below Phe Phe Alá below Gin 45 Gin 45 Gin Gin Alá below Asp asp
Tyr Tyr Leu 50 Leu 50 Glu Glu Gin Gin Asp asp Leu Leu Alá 55 below 55 Met Met Thr Thr Lys Lys Asp asp Gly 60 Gly 60 Arg Arg Leu Leu Val With Val With
Ile 65 Ile 65 His His Asp asp His His Phe Phe Leu 70 Leu 70 Asp asp Gly Gly Leu Leu Thr Thr Asp 75 asp 75 Val With Alá below Lys Lys Lys Lys Phe 80 Phe 80
Pro Pro His His Arg Arg His His Arg 85 Arg 85 Lys Lys Asp asp Gly Gly Arg Arg Tyr 90 Tyr 90 Tyr Tyr Val With Ile Ile Asp asp Phe 95 Phe 95 Thr Thr
Leu Leu Lys Lys Glu Glu Ile 100 Ile 100 Gin Gin Ser Ser Leu Leu Glu Glu Met 105 Met 105 Thr Thr Glu Glu Asn Asn Phe Phe Glu 110 Glu 110 Thr Thr Met Met
Alá below Arg Arg Phe 115 Phe 115 Glu Glu Asp asp Pro Pro Thr Thr Arg 120 Arg 120 Arg Arg Pro Pro Tyr Tyr Lys Lys Leu 125 Leu 125 Pro Pro Asp asp Leu Leu
Cys Cys Thr 130 Thr 130 Glu Glu Leu Leu Asn Asn Thr Thr Ser 135 Ser 135 Leu Leu Gin Gin Asp asp Ilé Ile Glu 140 Glu 140 Ile Ile Thr Thr Cys Cys Val With
Tyr 145 Tyr 145 Cys Cys Lys Lys Thr Thr Val With Leu 150 Leu 150 Glu Glu Leu Leu Thr Thr Glu Glu Val 155 with 155 Phe Phe Glu Glu Phe Phe Alá below Phe 160 Phe 160
Lys Lys Asp asp Leu Leu Phe Phe Val 165 with 165 Val With Tyr Tyr Arg Asp Arg Asp Ser 170 Ser 170 Ile Ile Pro Pro His His Alá below Alá 175 below 175 Cys Cys
His His Lys Lys Cys Cys Ile 180 Ile 180 Asp asp Phe Phe Tyr Tyr Ser Ser Arg 1B5 Arg 1B5 Ile Ile Arg Arg Glu Glu Leu Leu Arg 190 Arg 190 His His Tyr Tyr
Ser Ser Asp asp Ser 195 Ser 195 Val With Tyr Tyr Gly Gly Asp asp Thr 200 Thr 200 Leu Leu Glu Glu Lys Lys Leu Leu Thr 205 Thr 205 Asn Asn Thr Thr Gly Gly
Leu Leu Tyr 210 Tyr 210 Asn Asn Leu Leu Leu Leu Ile Ile Arg 215 Arg 215 Cys Cys Leu Leu Arg Arg Cys Cys Gin 220 220 Gin Lys Lys Pro Pro Leu Leu Asn Asn
Pro 225 Pro 225 Alá below Glu Glu Lys Lys Leu Leu Arg 230 Arg 230 His His Leu Leu Asn Asn Glu Glu Lys 235 Lys 235 Arg Arg Arg Arg Phe Phe His His Asn 240 Asn 240
Ile Ile Alá below Gly Gly His His Tyr 245 Tyr 245 Arg Arg Gly Gly Gin Gin Cys Cys His 250 His 250 Ser Ser Cys Cys Cys Cys Asn Asn Arg 255 Arg 255 Alá below
Arg His Arg His Gin His His Gin Glu His His Glu Arg 260 His Arg 260 His Leu His Leu His Gin His His Gin Arg Arg Arg Arg Arg 265 Arg 265 Glu Glu Thr Thr Gin Gin Val With Thr 270 Thr 270 Ser Ser Gly Gly

275 275

A 22. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI: 22. The SEQ ID NO DATA: SEQUENCE CHARACTERISTICS:

HOSSZA: 1152 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris LENGTH: 1152 base pairs TYPE: nucleic acid NUMBER OF FIBERS: single TOPOLOGY: linear

Fehérje: DI/3 E6 E7 His/ HPV 18 Protein: DI / 3 E6 E7 His / HPV 18

I* I *

9Í * «· »»· 9 »* 9 9 « t ····· • * »· * · · · * *·» ««.»« » * ♦ * » * a 22. azonosítószámú szekvencia leírása: 9i * «·» »· 9» 9 * 9 «t ····· • *» * · · · · · * »« «» «» * ♦ * »* 22 Description of the SEQ ID NO.:

ATGGATCCAA GCAGCCATTC ATCAAATATG 60 ATGGATCCAA GCAGCCATTC ATCAAATATG 60

ATTATTGCTC ACCGTGGTGC TAGCGGTTAT 120 ATTATTGCTC ACCGTGGTGC TAGCGGTTAT 120

CTTGCGTTTG CACAACAGGC TGATTATTTA 180 CTTGCGTTTG CACAACAGGC TGATTATTTA 180

CGTTTAGTGG TTATTCACGA TCACTTTTTA 240 CGTTTAGTGG TTATTCACGA TCACTTTTTA 240

CCACATCGTC ATCGTAAAGA TGGCCGTTAC 300 CCACATCGTC ATCGTAAAGA TGGCCGTTAC 300

CAAAGTTTAG AAATGACAGA AAACTTTGAA 360 CAAAGTTTAG AAATGACAGA AAACTTTGAA 360

CGACCCTACA AGCTACCTGA TCTGTGCACG 420 CGACCCTACA AGCTACCTGA TCTGTGCACG 420

ATAACCTGTG TATATTGCAA GACAGTATTG 480 ATAACCTGTG TATATTGCAA GACAGTATTG 480

AAAGATTTAT TTGTGGTGTA TAGAGACAGT 540 AAAGATTTAT TTGTGGTGTA TAGAGACAGT 540

GATTTTTATT CTAGAATTAG AGAATTAAGA 600 GATTTTTATT CTAGAATTAG AGAATTAAGA 600

TTGGAAAAAC TAACTAACAC TGGGTTATAC 660 TTGGAAAAAC TAACTAACAC TGGGTTATAC 660

AAACCGTTGA ATCCAGCAGA AAAACTTAGA 720 AAACCGTTGA ATCCAGCAGA AAAACTTAGA 720

ATAGCTGGGC ACTATAGAGG CCAGTGCCAT 780 ATAGCTGGGC ACTATAGAGG CCAGTGCCAT 780

CTCCAACGAC GCAGAGAAAC ACAAGTAATG 840 CTCCAACGAC GCAGAGAAAC ACAAGTAATG 840

GTATTGCATT TAGAGCCCCA AAATGAAATT 900 GTATTGCATT TAGAGCCCCA AAATGAAATT 900

AGCGACTCAG AGGAAGAAAA CGATGAAATA 960 AGCGACTCAG AGGAAGAAAA CGATGAAATA 960

CGACGAGCCG AACCACAACG TCACACAATG 1020 CGACGAGCCG AACCACAACG TCACACAATG 1020

ATTGAGCTAG TAGTAGAAAG CTCAGCAGAC 1080 aacaccctgt cctttgtgtg tccgtggtgt 1140 ATTGAGCTAG TAGTAGAAAG CTCAGCAGAC 1080 aacaccctgt cctttgtgtg tccgtggtgt 1140

CATCACCATT AA xl52 CATCACCATT AA xl52

GCGAATACCC AAATGAAATC AGACAAAATC GCGAATACCC AAATGAAATC AGACAAAATC

TTACCAGAGC ATACGTTAGA ATCTAAAGCA TTACCAGAGC ATACGTTAGA ATCTAAAGCA

GAGCAAGATT TAGCAATGAC TAAGGATGGT GAGCAAGATT TAGCAATGAC TAAGGATGGT

GATGGCTTGA CTGATGTTGC GAAAAAATTC GATGGCTTGA CTGATGTTGC GAAAAAATTC

TATGTCATCG ACTTTACCTT AAAAGAAATT TATGTCATCG ACTTTACCTT AAAAGAAATT

ACCATGGCGC GCTTTGAGGA TCCAACACGG ACCATGGCGC GCTTTGAGGA TCCAACACGG

GAACTGAACA CTTCACTGCA AGACATAGAA GAACTGAACA CTTCACTGCA AGACATAGAA

GAACTTACAG AGGTATTTGA ATTTGCATTT GAACTTACAG AGGTATTTGA ATTTGCATTT

ATACCGCATG CTGCATGCCA TAAATGTATA ATACCGCATG CTGCATGCCA TAAATGTATA

CATTATTCAG ACTCTGTGTA TGGAGACACA AATTTATTAA TAAGGTGCCT GCGGTGCCAG CACCTTAATG AAAAACGACG ATTTCACAAC CATTATTCAG ACTCTGTGTA TGGAGACACA AATTTATTAA TAAGGTGCCT GCGGTGCCAG CACCTTAATG AAAAACGACG ATTTCACAAC

TCGTGCTGCA ACCGAGCACG ACAGGAACGA TCGTGCTGCA ACCGAGCACG ACAGGAACGA

CATGGACCTA AGGCAACATT GCAAGACATT CATGGACCTA AGGCAACATT GCAAGACATT

CCGGTTGACC TTCTATGTCA CGAGCAATTA CCGGTTGACC TTCTATGTCA CGAGCAATTA

GATGGAGTTA ATCATCAACA TTTACCAGCC GATGGAGTTA ATCATCAACA TTTACCAGCC

TTGTGTATGT GTTGTAAGTG TGAAGCCAGA TTGTGTATGT GTTGTAAGTG TGAAGCCAGA

GACCTTCGAG CATTCCAGCA GCTGTTTCTG GACCTTCGAG CATTCCAGCA GCTGTTTCTG

GCATCCCAGC AGACTACTGG CCACCATCAC GCATCCCAGC AGACTACTGG CCACCATCAC

A 23. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI: 23 SEQ ID NO DATA: SEQUENCE CHARACTERISTICS:

HOSSZA: 384 aminosav LENGTH: 384 amino acids

TÍPUSA: aminosav TYPE: amino acid

HÁNY SZÁLÚ: egy HOW MANY FIBERS: A

TOPOLÓGIÁJA: lineáris TOPOLOGY: linear

Fehérje: Dl/3 E6 E7 His/ HPV 18 |*« * ·Τ«· Protein: Dl / 3 E6 E7 His / HPV 18 | * "* Τ ·« ·

Α 23. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA: Α 23, SEQ ID NO DESCRIPTION:

Met 1 Met 1 Asp asp Pro Pro Ser Ser Ser 5 Ser 5 His His Ser Ser Ser Ser Asn Asn Met 10 Met 10 Alá below Asn Asn Thr Thr Gin Gin Met 15 Met 15 Lys Lys
Ser Ser Asp asp Lys Lys Ile 20 Ile 20 Ile Ile Ile Ile Alá below His His Arg 25 Arg 25 Gly Gly Alá below Ser Ser Gly Tyr 30 Gly Tyr 30 Leu Leu Pro Pro
Glu Glu His His Thr 35 Thr 35 Leu Leu Glu Glu Ser Ser Lys Lys Alá 40 below 40 Leu Leu Alá below Phe Phe Alá below Gin 45 Gin 45 Gin Gin Alá below Asp asp
Tyr Tyr Leu 50 Leu 50 Glu Glu Gin Gin Asp asp Leu Leu Alá 55 below 55 Met Met Thr Thr Lys Lys Asp asp Gly 60 Gly 60 Arg Arg Leu Leu Val With Val With
Ile 65 Ile 65 His His Asp asp His His Phe Phe Leu 70 Leu 70 Asp asp Gly Gly Leu Leu Thr Thr Asp 75 asp 75 Val With Alá below Lys Lys Lys Lys Phe 80 Phe 80
Pro Pro His His Arg Arg His His Arg 85 Arg 85 Lys Lys Asp asp Gly Gly fug fug Tyr 90 Tyr 90 Tyr Tyr Val With Ile Ile Asp asp Phe 95 Phe 95 Thr Thr
Leu Leu Lys Lys Glu Glu Ile 100 Ile 100 Gin Gin Ser Ser Leu Leu Glu Glu Met 105 Met 105 Thr Thr Glu Glu Asn Asn Phe Phe Glu 110 Glu 110 Thr Thr Met Met
Alá below Arg Arg Phe 115 Phe 115 Glu Glu Asp asp Pro Pro Thr Thr Arg 120 Arg 120 Arg Arg Pro Pro Tyr Tyr Lys Lys Leu 125 Leu 125 Pro Pro Asp asp Leu Leu
Cys Cys Thr 130 Thr 130 Glu Glu Leu Leu Asn Asn Thr Thr Ser 135 Ser 135 Leu Leu Gin Gin Asp asp Ile Ile Glu 140 Glu 140 Ile Ile Thr Thr Cys Cys Val With
Tyr 145 Tyr 145 Cys Cys Lys Lys Thr Thr Val With Leu 150 Leu 150 Glu Glu Leu Leu Thr Thr Glu Glu Val 155 with 155 Phe Phe Glu Glu Phe Phe Alá below Phe 160 Phe 160
Lys Lys Asp asp Leu Leu Phe Phe Val 165 with 165 Val With Tyr Tyr Arg Arg Asp asp Ser 170 Ser 170 Ile Ile Pro Pro His His Alá below Alá 175 below 175 Cys Cys
Kis small Lys Lys Cys Cys Ile 1Θ0 Ile 1Θ0 Asp asp Phe Phe Tyr Tyr Ser Ser Arg 185 Arg 185 Ile Ile Arg Arg Glu Glu Leu Leu Arg 190 Arg 190 His His Tyr Tyr
Ser Ser Asp asp Ser 195 Ser 195 Val With Tyr Tyr Gly Gly Asp asp Thr 200 Thr 200 Leu Leu Glu Glu Lys Lys Leu Leu Thr 205 Thr 205 Asn Asn Thr Thr Gly Gly
Leu Leu Tyr 210 Tyr 210 Asn Asn Leu Leu Leu Leu Ile Ile Arg 215 Arg 215 Cys Cys Leu Leu Arg Arg Cys Cys Gin 220 220 Gin Lys Lys Pro Pro Leu Leu Asn Asn
Pro 225 Pro 225 Alá below Glu Glu Lys Lys Leu Leu Arg 230 Arg 230 His His Leu Leu Asn Asn Glu Glu Lys 235 Lys 235 Arg Arg Arg arg Phe Phe His His Asn 240 Asn 240
Ile Ile Alá below Gly Gly His His Tyr 245 Tyr 245 Arg Arg Gly Gly Gin Gin Cys Cys His 250 His 250 Ser Ser Cys Cys Cys Cys Asn Asn Arg 255 Arg 255 Alá below
Arg Arg Gin Gin Glu Glu Arg 260 Arg 260 Leu Leu Gin Gin Arg Arg Arg Arg Arg 265 Arg 265 Glu Glu Thr Thr Gin Gin Val With Met 270 Met 270 His His Gly Gly
Pro Pro Lys Lys Alá 275 below 275 Thr Thr Leu Leu Gin Gin Asp asp Ile 280 Ile 280 Val With Leu Leu His His Leu Leu Glu 285 Glu 285 Pro Pro Gin Gin Asn Asn
Glu Glu Ile 290 Ile 290 Pro Pro Val With Asp asp Leu Leu Leu 295 Leu 295 Cys Cys His His Glu Glu Gin Gin Leu 300 Leu 300 Ser Ser Asp asp Ser Ser Glu Glu

Glu Glu Glu Glu Asn Asn Asp asp Glu Glu Ile Ile Asp asp Gly Gly Val With Asn Asn His His Gin Gin His His Leu Leu Pro Pro Alá below
305 305 310 310 315 315 320 320
Arg Arg Arg Arg Alá below Glu Glu Pro Pro Gin Gin Arg Arg His His Thr Thr Met Met Leu Leu Cys Cys Met Met Cys Cys Cys Cys Lys Lys
325 325 330 330 335 335
Cys Cys Glu Glu Alá below Arg Arg Ile Ile Glu Glu Leu Leu Val With Val With Glu Glu Ser Ser Ser Ser Alá below Asp asp Asp asp Leu Leu
340 340 345 345 350 350
Arg Arg Alá below Phe Phe Gin Gin Gin Gin Leu Leu Phe Phe Leu Leu Asn Asn Thr Thr Leu Leu Ser Ser Phe Phe Val With Cys Cys Pro Pro
355 355 360 360 365 365
Trp Trp Cys Cys Alá below Ser Ser Gin Gin Gin Gin Thr Thr Ser Ser Gly Gly His His His His His His His His His His His His
370 370 375 375 380 380

·« »· t « · ·*· t · «» * T "· · · * t

, - 76 < , - 76 <

Claims (6)

SZABADALMI IGÉNYPONTOK
1. oligó: TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT oligo 1: TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT
1. Készítmény, amely HPV-ből származó, működőképesen egy immunológiai fúziós partnerhez kapcsolt E6- és/vagy E7fehérjét vagy E6/E7 fúziós fehérjét, valamint egy CpGtartalmú oligonukleotidot tartalmaz. 1. A composition which is operably linked to an immunological fusion partner E6 and / or E7fehérjét E6 / E7 fusion protein as well as an oligonucleotide or CpGtartalmú from HPV.
2/6 2/6
Napok száma *>*«· • w· Days *> * «w • · ·
PCT/EP98/08563 ·* PCT / EP98 / 08 563 · *
2. oligó: TCT CCC AGC GTG CGC CAT oligo 2: TCT CCC AGC GTG CGC CAT
2. Az 1. igénypont szerinti készítmény, amelyben a fúziós partner az alábbiak bármelyike: Haemophilus influenzae-ből származó protein-D vagy annak egy fragmense, Haemophilus influenzae-ből származó lipoprotein vagy annak egy fragmense, Influenzáé Virus-ból származó NS1 vagy annak egy fragmense, és Streptococcus pneumoniae-ből származó LYTA vagy annak egy fragmense. 2. The composition of claim 1, wherein the fusion partner is selected from from Haemophilus influenzae Protein D or a fragment thereof, lipoprotein, or a fragment of NS1 or from Influenzae Virus from originating influenzae Haemophilus a fragment and a fragment thereof or Lyta from Streptococcus pneumoniae.
3/6 ·»·* i · 3/6 »· i *
! !
io ra NN f (0 0 0 to f io NN (0 0 0
Izotípus profil 97293A Isotype profile 97293A
10)0)0) 10) 0) 0)
Egerek csoportja groups of mice
£ £ £ £ £ £ £ £ £ £ o He o He o He o He o He o He o He co co CO CO n · CN CN
• · · · « · « · · • « · · • · · · «·« · • · «· ·
476 476
PCT/EP98/08563 PCT / EP98 / 08 563
I I
I i I i
ί ί
π π ιΓΜ ιΓΜ ÍM im Τ- Τ- ! Ο Ο Ο Ο Ο : σ> : Σ> σ> σ> σ> σ>
ί ι ί ι
CD CD
L,Ω *CÖ χί 2 ιη L, Ω * CO 2 χί ιη
Egerek csoportja ο ο % Mice group ο ο%
£ ο £ ο ο ο •«S Ο • "S Ο sp ο* ο sp * ο ο \Ρ ο**· Ο \ Ρ ο · Ο ** £ ο £ ο ο ο SP ο SP ο νο ©* ο νο © ο * •>5 Ο •> 5 Ο σ> σ> C0 C0 r- r- ιη ιη V V Λ Λ OJ OJ Ί— Ί-
• · · · • ·· · ···· ·· ·· • · · · • · ·· ·· ·· ····
PCT/EP98/08563 PCT / EP98 / 08 563
3. oligó: ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG 3. oligo ACC GGT GAC GAT GAC GTC GCC GGC ACC ACG
12. Az 1-11 igénypontok bármelyike szerinti készítmény gyógyászati alkalmazásra. 12. A pharmaceutical composition for use according to any one of claims 1-11.
13. Az 1-11 igénypontok bármelyike szerinti készítmény alkalmazása páciensben HPV-antigén elleni immunválaszt indukálására szolgáló gyógyszer előállításában. 13. The medicament of claims 1-11 for the immune response to HPV antigens for inducing in a patient Use of a composition according to any one of products.
14. Az 1-11 igénypontok bármelyike szerinti készítmény alkalmazása páciensben HPV-indukált tumorok megelőzésére és kezelésére szolgáló gyógyszer előállításában. 14 1-11 a medicament for preventing and treating HPV induced tumors in a patient Use of a composition according to any one of products.
15. Eljárás a találmány szerinti készítmény előállítására azzal jellemezve, hogy működőképesen immunológiai fúziós partnerhez kapcsolt E6, E7 vagy E6/E7 fúziós fehérjéhez immunmódosító CpG-oligonukleotidot keverünk. 15. A process for preparing a composition according to the invention is characterized in that it is operably linked to an immunological fusion partner E6, E7 or E6 / E7 fusion protein mixed with an immunomodulatory CpG oligonucleotide.
A meghatalmazott: Authorized:
Danubia Danubia
Szabadalmi és Védjegy Iroda Kft. Ltd. Patent and Trademark Office.
Svingor Ádám Adam Svingor
V Λ • · ♦ · » · * • » »·* · »· *♦* »►»» ,_ΪΑ· * .< ♦ V Λ • · · »· * •» »· · *» * ♦ · * »►» », _ΪΑ · *. <
PCT/EP98/08563 j^ÖZZÉTÉTEí r í*-É £,0A Nγ ' 176* PCT / EP98 / 08563 ÖZZÉTÉTEí j ^ r t * e £, Nγ 0A '176 *
Napok száma Number of days
PCT/EP98/08563 ο PCT / EP98 / 08 563 ο
5Τ m 5Τ m
«*> «*>
ο ο
Λ Λ
Λ Λ
ΟΙ ΟΙ
Ο οι tn ο Ο Ο οι tn
( 2 iuiu) S9p9>)9A0UJ0lIini SOÖBUV tn • ** · · -• τ * * (2 iuiu) S9p9>) 9A0UJ0lIini SOÖBUV tn ** • · · - • τ *
V «·· · *« | V «·· · *" | · · » * · * *- · >« « '1 ' · "* * * · - ·>« « '1'
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti készítmény, amelyben az E6- vagy az E7-fehérje a HPV-16-ból vagy a HPV-18ból származik. 3. A composition according to claim 1 or 2 wherein the E6 or E7 protein is derived from HPV-16 or HPV-18ból.
4. Az 1., 2. vagy 3. igénypont szerinti készítmény, amelyben az E7-fehérje mutációt tartalmaz. 4. The composition of claim 1, 2 or 3 wherein the E7 protein contains a mutation.
5/6 5/6
Napok száma »··· ···· Number of days "··· ····
PCT/EP98/08563 PCT / EP98 / 08 563
6/6 6/6
5. Az 1., 2. vagy 3. igénypont szerinti készítmény, amelyben az E6-fehérje mutációt tartalmaz. 5. The composition of claim 1, 2 or 3, which contains the E6 protein is mutated.
6. Az 1-5. 6. 1-5. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, amely egy legalább 4 hisztidinből álló hisztidinfarkat is tartalmaz. A composition according to any preceding claim comprising a hisztidinfarkat of at least 4 histidine residues as well.
7. A találmány szerinti készítmény, amely egy további HPV-antigént tartalmaz. 7. The composition according to the invention comprising an additional HPV antigen.
8. A találmány szerinti készítmény, amelyben az immunmódosító CpG-oligonukleotid a következő hexamer motívumot tartalmazza:purin-purin-citozin-guanin-pirimidin-pirimidin. 8. The composition according to the invention, wherein the immunomodulatory CpG oligonucleotide comprises the hexamer motif: purine purine-cytosine-guanine-pyrimidine-pyrimidine.
I I
9. A találmány szerinti készítmény, amelyben az immunmódosító CpG-oligonukleotid kettő vagy több CpG-motívumot tartalmaz. 9. The composition according to the invention, wherein the immunomodulatory CpG oligonucleotide comprises two or more CpG motifs.
10. A találmány szerinti készítmény, amelyben az immunmódosító CpG-oligonukleotid foszforotioát nukleotidok közötti kötést tartalmaz. 10. The composition according to the invention, which comprises the immunomodulatory CpG oligonucleotide phosphorothioate linkages between nucleotides.
11. A találmány szerinti készítmény, amelyben az ímmunmódosító CpG-oligonukleotid az alábbiak bármelyike: 11. The composition according to the invention, the immune modifiers CpG oligonucleotide in which any one of the following:
6. ábra Figure 6
Ifi fO Youth fO
CM m CM m
o He
Napok száma Number of days
HU0100526A 1997-12-24 1998-12-18 The anti-HPV antigens, their uses and processes for their preparation HU0100526A2 (en)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB9727262.9A GB9727262D0 (en) 1997-12-24 1997-12-24 Vaccine
PCT/EP1998/008563 WO1999033868A2 (en) 1997-12-24 1998-12-18 Human papillomavirus vaccine

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HU0100526A2 true HU0100526A2 (en) 2001-06-28

Family

ID=10824179

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0103085A HU0103085A3 (en) 1997-12-24 1998-12-18 Formulations an processes for inducing an immune response to polysaccharide
HU0100526A HU0100526A2 (en) 1997-12-24 1998-12-18 The anti-HPV antigens, their uses and processes for their preparation

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0103085A HU0103085A3 (en) 1997-12-24 1998-12-18 Formulations an processes for inducing an immune response to polysaccharide

Country Status (21)

Country Link
EP (2) EP1040123A2 (en)
JP (2) JP2001527091A (en)
KR (1) KR20010033618A (en)
CN (2) CN1284885A (en)
AR (2) AR014182A1 (en)
AT (1) AT310535T (en)
AU (2) AU729336B2 (en)
BR (2) BR9814487A (en)
CA (2) CA2315276A1 (en)
CO (2) CO5070644A1 (en)
DE (1) DE69832521T2 (en)
ES (1) ES2251124T3 (en)
GB (1) GB9727262D0 (en)
HU (2) HU0103085A3 (en)
IL (2) IL136446D0 (en)
NO (2) NO20003302L (en)
NZ (2) NZ505107A (en)
PL (2) PL341698A1 (en)
TR (2) TR200001835T2 (en)
WO (2) WO1999033868A2 (en)
ZA (2) ZA9811849B (en)

Families Citing this family (111)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6207646B1 (en) 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
JP2005504513A (en) 2001-05-09 2005-02-17 コリクサ コーポレイション Compositions and methods for prostate cancer therapy and diagnosis
US6406705B1 (en) 1997-03-10 2002-06-18 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant
JP2004513615A (en) 2000-06-28 2004-05-13 コリクサ コーポレイション Compositions and methods for the treatment and diagnosis of lung cancer
US20020147143A1 (en) 1998-03-18 2002-10-10 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer
BR0009505A (en) 1999-04-02 2002-06-11 Corixa Corp Compounds and methods for therapy and diagnosis of lung cancer
US6908757B1 (en) 1998-03-26 2005-06-21 The Procter & Gamble Company Serine protease variants having amino acid deletions and substitutions
ES2374620T3 (en) 2000-06-20 2012-02-20 Corixa Corporation Mycobacterium tuberculosis MTB32A antigen with the active site inactivated and fusion proteins thereof.
WO1999061056A2 (en) 1998-05-22 1999-12-02 Loeb Health Research Institute At The Ottawa Hospital Methods and products for inducing mucosal immunity
AT346609T (en) 1998-05-29 2006-12-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Combined meningitis b / c vaccines
US20030235557A1 (en) 1998-09-30 2003-12-25 Corixa Corporation Compositions and methods for WT1 specific immunotherapy
PT1154790E (en) 1999-02-26 2005-03-31 Chiron Srl Reforco of the activity bactericide of antigen against neisseria with oligonucleotidos containing reasons cg
PT1162999E (en) * 1999-03-19 2007-02-28 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine against streptococcus pneumoniae
CN1227030C (en) 1999-04-19 2005-11-16 史密丝克莱恩比彻姆生物有限公司 Adjuvant composition comprising saponin and an immunostimulatory oligonucleotide
US6558670B1 (en) 1999-04-19 2003-05-06 Smithkline Beechman Biologicals S.A. Vaccine adjuvants
EP1171158A2 (en) * 1999-04-20 2002-01-16 SmithKline Beecham Biologicals s.a. Vaccine comprising rsv antigen and cpg oligonucleotide
ES2250151T3 (en) * 1999-06-29 2006-04-16 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Cpg use as a vaccine adjuvant against HIV.
SK782002A3 (en) * 1999-07-21 2003-08-05 Lexigen Pharm Corp FC fusion proteins for enhancing the immunogenicity of protein and peptide antigens
WO2001007484A2 (en) 1999-07-22 2001-02-01 The Procter & Gamble Company Protease conjugates having sterically protected clip sites
EP1210415A2 (en) 1999-07-22 2002-06-05 THE PROCTER &amp; GAMBLE COMPANY Subtilisin protease variants having amino acid substitutions in defined epitope regions
US6946128B1 (en) 1999-07-22 2005-09-20 The Procter & Gamble Company Protease conjugates having sterically protected epitope regions
BR0012693A (en) 1999-07-22 2002-04-09 Procter & Gamble Variant of subtilisin type protease; cleaning composition; composition and personal care
EP1204425B1 (en) 1999-08-19 2009-01-07 Dynavax Technologies Corporation Methods of modulating an immune response using immunostimulatory sequences and compositions for use therein
GB9925559D0 (en) * 1999-10-28 1999-12-29 Smithkline Beecham Biolog Novel method
US7223398B1 (en) 1999-11-15 2007-05-29 Dynavax Technologies Corporation Immunomodulatory compositions containing an immunostimulatory sequence linked to antigen and methods of use thereof
GB9928196D0 (en) 1999-11-29 2000-01-26 Chiron Spa Combinations of B, C and other antigens
AU5615601A (en) 2000-02-23 2001-09-03 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
US20040002068A1 (en) 2000-03-01 2004-01-01 Corixa Corporation Compositions and methods for the detection, diagnosis and therapy of hematological malignancies
US20010046967A1 (en) 2000-03-10 2001-11-29 Gary Van Nest Methods of preventing and treating respiratory viral infection using immunomodulatory polynucleotide
US7129222B2 (en) 2000-03-10 2006-10-31 Dynavax Technologies Corporation Immunomodulatory formulations and methods for use thereof
US20020098199A1 (en) 2000-03-10 2002-07-25 Gary Van Nest Methods of suppressing hepatitis virus infection using immunomodulatory polynucleotide sequences
US7157437B2 (en) 2000-03-10 2007-01-02 Dynavax Technologies Corporation Methods of ameliorating symptoms of herpes infection using immunomodulatory polynucleotide sequences
US20030129251A1 (en) 2000-03-10 2003-07-10 Gary Van Nest Biodegradable immunomodulatory formulations and methods for use thereof
AT389020T (en) 2000-04-21 2008-03-15 Corixa Corp Compounds and methods for treatment and diagnosis of Chlamydia infections
WO2001090129A2 (en) 2000-05-19 2001-11-29 Corixa Corporation Prophylactic and therapeutic treatment of infectious, autoimmune and allergic diseases with mono and disaccharide-base compounds
AUPQ761200A0 (en) * 2000-05-19 2000-06-15 Hunter Immunology Limited Compositions and methods for treatment of mucosal infections
EE200200709A (en) 2000-06-26 2004-08-16 Stressgen Biotechnologies Corporation The fusion protein-containing composition, and the fusion protein is a fusion polypeptide and the nucleic acid coding for
HU0402259A3 (en) 2001-09-20 2010-01-28 Glaxo Group Ltd Vaccines
JP4188687B2 (en) 2000-12-27 2008-11-26 ダイナバックス テクノロジーズ コーポレイション Immune modulation polynucleotides and methods of use thereof
ES2487645T3 (en) 2001-06-21 2014-08-22 Dynavax Technologies Corporation chimeric immunomodulatory compounds and methods of use thereof
AU2002326561B2 (en) 2001-08-07 2008-04-03 Dynavax Technologies Corporation Immunomodulatory compositions, formulations, and methods for use thereof
ES2405405T3 (en) 2001-12-17 2013-05-31 Corixa Corporation Compositions and methods for therapy and diagnosis of inflammatory bowel disease
JP2006504687A (en) 2002-09-13 2006-02-09 インターツェル・アクチェンゲゼルシャフトIntercell Ag Method of isolating the hepatitis C virus peptide
CA2388049A1 (en) 2002-05-30 2003-11-30 Immunotech S.A. Immunostimulatory oligonucleotides and uses thereof
WO2004011650A2 (en) 2002-07-24 2004-02-05 Intercell Ag Antigens encoded by alternative reading frame from pathogenic viruses
AT544466T (en) 2002-10-29 2012-02-15 Coley Pharm Group Inc Use of CpG oligonucleotides for treatment of hepatitis C virus infection
CA2502015A1 (en) 2002-12-11 2004-06-24 Coley Pharmaceutical Group, Inc. 5' cpg nucleic acids and methods of use
CN100546998C (en) 2002-12-23 2009-10-07 戴纳伐克斯技术股份有限公司 Immunostimulatory sequence oligonucleotides and methods of using the same
US8158768B2 (en) 2002-12-23 2012-04-17 Dynavax Technologies Corporation Immunostimulatory sequence oligonucleotides and methods of using the same
US7960522B2 (en) 2003-01-06 2011-06-14 Corixa Corporation Certain aminoalkyl glucosaminide phosphate compounds and their use
KR101110889B1 (en) 2003-01-06 2012-02-20 코릭사 코포레이션 Certain aminoalkyl glucosaminide phosphate compounds and their use
EP1608401A1 (en) * 2003-03-24 2005-12-28 Intercell AG Use of alum and a th1 immune response inducing adjuvant for enhancing immune respones
WO2004084938A1 (en) 2003-03-24 2004-10-07 Intercell Ag Improved vaccines
EP1625850B1 (en) * 2003-05-15 2012-02-29 Japan Science and Technology Agency Immunostimulating agents
US20090028874A1 (en) * 2003-12-24 2009-01-29 Leiden University Medical Center Synthetic Protein as Tumor-Specific Vaccine
US20080199493A1 (en) 2004-05-25 2008-08-21 Picker Louis J Siv and Hiv Vaccination Using Rhcmv- and Hcmv-Based Vaccine Vectors
WO2006042156A2 (en) 2004-10-08 2006-04-20 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA AS represneted by THE SECRETARY OF THE DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES, CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION Modulation of replicative fitness by using less frequently used synonymous codons
JP2008534594A (en) 2005-03-31 2008-08-28 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム Vaccine against Chlamydia infection
PT1877426E (en) 2005-04-29 2012-05-02 Glaxosmithkline Biolog Sa Method for preventing or treating m tuberculosis infection
US8137674B2 (en) * 2006-04-19 2012-03-20 Postech Foundation Compositions comprising HPV polypeptides and immunoenhancement peptides for the treatment and prevention of cervical cancer
CN101678091A (en) 2007-05-24 2010-03-24 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 Lyophilised antigen composition
EP2044198A4 (en) * 2006-07-27 2010-09-08 Ligocyte Pharmaceuticals Inc Chimeric influenza virus-like particles
WO2008094200A2 (en) * 2006-07-27 2008-08-07 Ligocy