La présente invention est dans le domaine du soin des cheveux et notamment dans celui du soin des cheveux âgés.

Il est connu que l'âge entraîne un vieillissement du cheveu et que les désordres qui en résultent peuvent être accélérés ou induits par certains facteurs extérieurs (tels que les expositions UV, les températures intenses, les agressions chimiques...).

Le follicule pileux est formé de compartiments parfaitement individualisés, les uns d'origine dermique (gaine conjonctive et papille dermique), les autres de nature épithéliale (gaine épithéliale externe, gaine interne, tige pilaire et glande sébacée). La gaine conjonctive, synthétisées par des fibroblastes, est surtout une matrice extracellulaire formée de collagènes de type 1 et III, ainsi que de protéoglycannes. Traversée, dans le tiers inférieur, par un réseau de capillaires sanguins, elle se prolonge à la base du follicule, par la papille dermique, véritable agrégat de matrice extracellulaire.

La matrice extracellulaire du derme, comme celle de tous les tissus conjonctifs de l'organisme, est composée de protéines appartenant à plusieurs grandes familles: les collagènes, les glycoprotéines matricielles autres que les collagènes (fibronectine, laminine), l'élastine et les protéoglycannes. On trouve également dans la matrice extracellulaire du derme, comme celle de tous les tissus conjonctifs de l'organisme, des glycosaminoglycannes sous forme libre (c'est à dire non liés à une protéine).

Il est maintenant bien établi que des interactions spécifiques existent entre ces différentes classes de protéines pour donner naissance à un tissu fonctionnel.

Les protéoglycannes sont des macromolécules complexes constituées d'un tronc protéique central ramifié, ou réseau de protéines, auquel sont attachés de très nombreuses chaînes latérales polyosidiques appelées glycosaminoglycannes.

Dans la suite de la présente demande, on désignera les protéoglycannes par l'abréviation PGs et les glycosaminoglycannes par l'abréviation GAGs.

Les GAGs ont longtemps été désignés sous le terme de mucopolysaccharides acides en raison de leur forte capacité de rétention d'eau, de leur nature glucidique et de leur caractère acide provenant de leurs multiples charges négatives.

Les PGs et les GAGs sont synthétisés par différentes cellules au niveau du derme et de l'épiderme: fibroblastes, kératinocytes et mélanocytes. 40 Les fibroblastes synthétisent majoritairement des collagènes, des glycoprotéines matricielles autres que les collagènes (fibronectine, laminine), des protéoglycannes et de l'élastine. Les kératinocytes synthétisent majoritairement des GAGs sulfatés et de l'acide hyaluronique alors que les mélanocytes ne produisent apparemment pas d'acide hyaluronique.

Lorsqu'ils sont associés à une protéine, les GAGs sont liés par des structures d'ancrage aux différentes chaînes polypeptidiques, nommées protéine « core » ou protéine porteuse, et forment ainsi des molécules de PGs. Les GAGs peuvent également exister dans la matrice extracellulaire sous forme libre c'est à dire non liée à une protéine matricielle : c'est notamment le cas de l'acide hyaluronique.

15 De façon générale, les rôles biologiques des PGs sont très diversifiés, allant d'une fonction passive de support mécanique (par exemple serglycines) ou d'un rôle de barrière ionique de filtration moléculaire (par exemple perlecanne et bamacanne de la membrane basale glomérulaire), à des effets plus spécifiques dans l'adhésion, l'étalement, la prolifération, la différenciation cellulaire ou la 20 morphogenèse, ou, à des effets très spécifiques d'interactions PG-protéine, tels que la fonction de récepteur du bétaglycanne ou l'interaction de la décorine avec le collagène.

Les PGs constituent 0,5 à 2 % du poids sec du derme, le collagène en 25 représentant à lui seul jusqu'à 80 %.

La concentration et la distribution dans la peau humaine des GAGs et des PGs varient avec l'âge.

30 Parallèlement aux mécanismes contribuant à l'élaboration de ces matrices extracellulaires spécialisées, il existe des processus de remodelage continuel dont la régulation dépend de la balance entre synthèse et dégradation des éléments protéiques de la matrice.

35 Plusieurs familles de protéases matricielles sont maintenant décrites ainsi que les facteurs intervenant dans leur activation-inactivation.

Parmi les éléments dégradés au cours du vieillissement chronobiologique, les PGs et les GAGs sont également altérés. En effet, au cours du vieillissement, les 40 fibroblastes et les kératinocytes produisent de moins en moins de PGs et de GAGs et leur synthèse est imparfaite. Il en résulte une désorganisation importante : le dépôt des GAGs sur le squelette protéique formant le PG est10 anormal, ce qui a pour conséquence, une moins grande avidité pour l'eau de ces PGs et donc une diminution de l'hydratation et de la tonicité des tissus.

La possession de cheveux sains, vigoureux et nombreux tout au long de la vie est une ambition de la plupart des hommes et des femmes. De nombreux produits pour cheveux incluant des compositions toniques capillaires, sont utilisés pour lutter contre le vieillissement du cheveu. Cependant, aucun produit topique, ni composition pour la voie orale à ce jour ne permet de lutter contre toutes les altérations liées aux cheveux âgés.

Par l'intermédiaire de nombreux tests cliniques réalisés ces dernières années, la Demanderesse a pu ainsi déterminer les symptômes liés aux cheveux âgés. Parmi ces symptômes, peut être cité le changement d'aspect de la fibre rendant le cheveu terne et sans éclat.

De manière inattendue, les inventeurs ont constaté que la diminution des GAGs dans le derme était directement liée à l'apparition des cheveux ternes et/ou sans éclat et que les extraits de grenade pouvaient s'avérer efficaces pour stimuler la néosynthèse des GAGs par les fibroblastes et/ou les kératinocytes et ainsi lutter contre les altérations retrouvées dans le cheveu vieilli et notamment contre l'apparition des cheveux ternes ou des cheveux sans éclat.

La grenade ou pomme-grenade (pomegranate en anglais) est le fruit du grenadier (Punica granatum), arbuste de la famille des Lythracées.

Ce fruit cultivé depuis plusieurs milliers d'années a de nombreux mérites qui sont, pour certains, connus depuis très longtemps. Ses effets bénéfiques vis-à-vis de l'hypertension ont été décrits ainsi que ses effets préventifs des cancers de la prostate et du sein ou retardant la détérioration des cartilages dont est responsable l'ostéoarthrite.

Le brevet US 6,800,292 concerne l'utilisation d'un agent dermatologique pouvant contenir un extrait de grenade, pour traiter des désordres dermatologiques parmi lesquels sont cités les cheveux cassants, les dommages dus au climat et l'amincissement du cheveu.

WO 99/16415 décrit que l'acide ellagique, l'un des antioxydants présents dans la grenade peut être utilisé pour améliorer l'état de la chevelure.

Cependant, aucun de ces documents ne suggère un éventuel effet de cet extrait vis-à-vis spécifiquement des désordres esthétiques liés aux cheveux âgés que sont les cheveux ternes et/ou les cheveux sans éclat.

L'invention a ainsi pour objet l'utilisation d'une quantité efficace d'au moins un extrait de grenade pour prévenir et/ou traiter l'apparition des cheveux ternes et/ou des cheveux sans éclat due au vieillissement chronologique d'un sujet.

Les cheveux ternes et/ou sans éclat sont des cheveux dont la brillance est diminuée voir inexistante. Cette brillance, qui correspond à la réflexion de la lumière sur la matière kératinique, peut être évaluée par simple examen visuel de la chevelure ou au moyen de techniques plus complexes en utilisant par exemple un microscope électronique pour évaluer la capacité d'un cheveu à réfléchir cette lumière.

Par «quantité efficace», on entend au sens de la présente invention une quantité suffisante pour obtenir l'effet attendu.

Par « extrait de grenade », on entend aussi bien les extraits de fruit, les extraits de graine de Punica granatum et leurs mélanges en toutes proportions. Avantageusement, on utilise un extrait de fruit - ou extrait de grenade - cet extrait pouvant provenir de toutes les parties de la grenade. L'extrait de grenade préférentiel selon la présente invention sera un extrait de fruit entier ou encore plus préférentiellement un jus de fruit entier (souvent appelé « extrait de jus de fruit de grenade » par les fournisseurs).

L'extrait de grenadier peut-être obtenu à partir de toute partie du grenadier et en 25 particulier à partir du fruit incluant la graine.

Par extrait, on entend aussi bien un mélange brut de parties du végétal grossièrement réduites en morceaux et du solvant d'extraction que des fractions ou préparations plus ou moins élaborées des principes actifs solubilisés lors de 30 l'extraction. On peut utiliser un extrait total, c'est-à-dire un extrait comprenant l'ensemble des fractions présentes dans les parties de Punica granatum, éventuellement dépourvue des parties cellulosiques (ligneuses). Selon un autre mode de mise en oeuvre de l'invention, on utilisera au moins un extrait enrichi en certaines fractions. 35 L'extrait peut être obtenu par toute méthode de préparation d'un extrait végétal connue de l'homme du métier. En particulier, l'extrait peut être obtenu par la macération de la partie du végétal dans l'eau, ou dans un solvant composé d'un mélange d'eau et d'un solvant organique par exemple eau-alcool, ou encore eau- 40 acétone, ou encore eau-propylène glycol, ou encore eau-butylene glycol. Le rapport plante/solvant peut varier par exemple et sans limitation de 1/4 à 1/20.

Avantageusement, la préparation de l'extrait débute par le broyage des parties du végétal suivi d'une macération dans le solvant d'extraction pendant plusieurs heures. L'extraction peut être réalisée sous agitation pour en améliorer la performance. L'extraction peut être réalisée à température ambiante ou en augmentant la température par exemple à 50°C ou encore à 60°C. Une fois l'extraction réalisée, la solution est filtrée.

La solution ainsi obtenue peut être concentrée par tout procédé connu de l'homme de l'art. De même la solution obtenue peut être lyophilisée par toute 10 méthode classique de lyophilisation, on obtient ainsi une poudre.

L'extraction à partir du fruit de grenadier incluant la graine peut aboutir, selon un procédé particulier de réalisation, à la préparation d'une huile essentielle. L'extrait sous forme de solution concentrée, de même que l'extrait sous forme de poudre, 15 de même que l'extrait sous forme d'huile essentielle peut être repris dans un milieu approprié pour la consommation par voie orale pour l'homme.

Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, l'extrait est choisi parmi les extraits aqueux et les extraits alcooliques ou hydro-alcooliques de Punica 20 granatum.

L'extrait peut être introduit sous la forme d'une poudre lyophilisée, d'un liquide ou d'une huile et/ou le cas échéant sous une forme concentrée.

25 De tels extraits sont par exemple commercialisés par la société DRACO Natural Products sous les noms commerciaux «Pomegranate Seed Oil » ou « Pomegranate Powdered Extract , 40% » ou par la société Naturex sous le nom « Extrait de jus de fruit de grenade » ou « Pomegranate extract 40% », ou par la société MMP Inc. sous le nom commercial « Pomegranate Juice extract E40 » ou 30 par la société Blue California sous le nom commercial « Pomegranate Extract 70% », ou encore par la société Guillin Layn Natural Ingredients sous le nom commercial « Pomegranate Seed P.E » ou enregistrés par exemple avec le numéro CAS 84961-57-9.

35 Il est entendu que le choix des extraits de grenade est effectué en tenant compte de la finalité de la composition les comportant, c'est-à-dire destinée à une application topique ou à une administration transcutanée ou à une administration orale.

40 Par le terme « prévenir », on entend « diminuer le risque de développer ».

Par le terme « traiter », sauf indication contraire, on entend toute action visant à améliorer le confort, le bien-être d'un individu, ce terme couvre donc aussi bien atténuer, soulager que curer.

Les compositions selon l'invention pourront être administrées par voie topique ou par voie orale, par voie sous cutanée, par voie intradermique ou par voie parentérale. La voie d'administration préférentielle sera la voie orale. Les compositions selon l'invention peuvent se présenter sous toutes les formes galéniques normalement utilisées selon la voie d'utilisation.

La quantité efficace de l'extrait de grenade sera préférentiellement mise en oeuvre à une teneur pouvant varier de 0,0001 à 1000/0 en poids, notamment de 0,001 à 200/0 en poids ou 0,01 à 150/0 en poids, plus particulièrement de 0,1 à 100/0 en poids, et encore plus préférentiellement de 0,5 à 50/0 en poids par rapport au poids total de la composition en contenant.

La teneur en extrait de grenade utilisée pour la voie topique sera préférentiellement de 0,0001 à 300/0, plus préférentiellement de 0,01 à 150/0 en poids, et encore plus préférentiellement de 0,1 à 100/0 en poids ou encore de 0,5 à 50/0 en poids par rapport au poids total de la composition en contenant.

La teneur en extrait de grenade utilisée pour la voie orale sera préférentiellement comprise entre 5 et 1000/0 en poids. En administration orale, la composition pourra donc être constituée, dans un mode de réalisation particulier de l'invention, uniquement d'extrait de grenade. Toutefois, cette teneur en extrait de grenade sera comprise plus préférentiellement entre 5 et 800/0 en poids et encore plus préférentiellement entre 5 et 700/0 en poids ou encore entre 5 et 200/0 en poids par rapport au poids total de la composition en contenant.

Un « support physiologiquement acceptable » est selon l'invention un support cosmétiquement ou pharmaceutiquement acceptable compatible avec la peau, les muqueuses et/ou les cheveux.

Par « support cosmétiquement acceptable », on entend un support sans aspect désagréable, et qui ne génère pas de picotement, de tiraillement ou de rougeur inacceptable pour l'utilisateur. Pour l'ingestion, de nombreuses formes de réalisation de compositions orales et notamment de compléments alimentaires sont possibles. Leur formulation est réalisée par les procédés usuels pour produire des dragées, gélules, gels, émulsions, comprimés, capsules ou solutions.

En particulier, le(s) actif(s) selon l'invention peuvent être incorporés dans toutes autres formes de compléments alimentaires ou d'aliments enrichis, par exemple des barres alimentaires, ou des poudres compactées ou non. Les poudres peuvent être diluées à l'eau, dans du soda, des produits laitiers ou dérivés du soja, ou être incorporées dans des barres alimentaires.

Conviennent notamment comme supports alimentaires ou pharmaceutiques, le lait, le yaourt, le fromage, les laits fermentés, les produits fermentés à base de lait, des glaces, des produits à base de céréales fermentées, des poudres à base de lait, des formules pour enfants et nourrissons, des aliments pour animaux en particulier domestiques, des comprimés ou tablettes, des suspensions de bactéries liquides, des suppléments oraux sous forme sèche et les suppléments oraux sous forme liquide.

En particulier, la composition selon l'invention peut être une composition alimentaire pour la consommation humaine. Il peut s'agir en particulier d'aliments complets nutritionnels, de boissons, d'eaux minérales, de soupes, de suppléments diététiques et d'aliments de remplacement, de barres nutritionnelles, de confiserie, de produits à base de lait ou à base de lait fermenté, de yaourts, de poudres à base de lait, de produits de nutrition entérale, de compositions pour enfants et/ou nourrissons, de produits à base de céréales ou de produits à base de céréales fermentées, de glaces, de chocolat, de café, de produits « culinaires » tels que de la mayonnaise, de la purée de tomate ou des assaisonnements pour salades. La composition selon l'invention peut également être destinée aux animaux.

Les actifs selon l'invention peuvent être formulés avec les excipients et composants usuels pour de telles compositions orales ou compléments alimentaires, à savoir notamment composants gras et/ou aqueux, agents humectants, épaississants, conservateurs, agents de texture, de saveur et/ou d'enrobage, antioxydants, conservateurs et colorants usuels dans le domaine de l'alimentaire.

Les agents de formulation et excipients pour composition orale, et notamment pour compléments alimentaires sont connus dans ce domaine et ne font pas ici l'objet d'une description détaillée.

En ce qui concerne ces compositions destinées à être appliquées par voie topique et notamment sur la peau et/ou le cuir chevelu, il peut s'agir de solutions aqueuses, hydroalcooliques ou huileuses, de dispersions du type des solutions ou dispersions du type lotion ou sérum, d'émulsions de consistance liquide ou semiliquide du type lait, de suspensions ou émulsions, du type crème, de gel aqueux ou anhydre, de microémulsions, de microcapsules, de microparticules, ou de dispersions vésiculaires de type ionique et/ou non ionique.

Les compositions cosmétiques, plus particulièrement concernées par une application topique, peuvent se présenter notamment sous forme de solutions aqueuses, hydroalcooliques ou huileuses, de dispersions du type des solutions ou dispersions du type lotion ou sérum, d'émulsions de consistance liquide ou semiliquide du type lait, obtenues par dispersion d'une phase grasse dans une phase aqueuse (HIE) ou inversement (E/H), ou de suspensions ou émulsions de consistance molle, semi-solide ou solide du type crème, de gel aqueux ou anhydre, ou encore de microémulsions, de microcapsules, de microparticules, ou de dispersions vésiculaires de type ionique et/ou non ionique. Ces compositions sont préparées selon les méthodes usuelles.

Elles peuvent être également utilisées pour les cheveux sous forme de solutions aqueuses, alcooliques ou hydroalcooliques, ou sous forme de crèmes, de gels, d'émulsions, de mousses ou encore sous forme de compositions pour aérosol contenant également un agent propulseur sous pression. Elles seront préférentiellement une lotion ou un shampoing.

Lorsque la composition de l'invention est une émulsion, la proportion de la phase grasse peut aller de 5 à 80 % en poids, et de préférence de 5 à 50 % en poids par rapport au poids total de la composition. Les huiles, les émulsionnants et les coémulsionnants utilisés dans la composition sous forme d'émulsion sont choisis parmi ceux classiquement utilisés dans le domaine cosmétique et/ou dermatologique. L'émulsionnant et le coémulsionnant peuvent être présents, dans la composition, en une proportion allant de 0,3 à 30 % en poids, et de préférence de 0,5 à 20 % en poids par rapport au poids total de la composition.

Lorsque la composition de l'invention est une solution ou un gel huileux, la phase grasse peut représenter plus de 90 % du poids total de la composition.

De façon connue, la composition cosmétique de l'invention peut contenir également des adjuvants habituels dans le domaine cosmétique pharmaceutique et/ou dermatologique, tels que les gélifiants hydrophiles ou lipophiles, les actifs hydrophiles ou lipophiles, les conservateurs, les antioxydants, les solvants, les parfums, les charges, les filtres, les bactéricides, les absorbeurs d'odeur et les matières colorantes. Les quantités de ces différents adjuvants sont celles classiquement utilisées dans le domaine considéré, et par exemple de 0,01 à 20 % du poids total de la composition. Ces adjuvants, selon leur nature, peuvent être introduits dans la phase grasse et/ou dans la phase aqueuse.

Comme matières grasses utilisables dans l'invention, on peut citer les huiles minérales comme par exemple le polyisobutène hydrogéné et l'huile de vaseline, les huiles végétales comme par exemple une fraction liquide du beurre de karité, huile de tournesol et d'amandes d'abricot, les huiles animales comme par exemple le perhydrosqualène, les huiles de synthèse notamment l'huile de Purcellin, le myristate d'isopropyle et le palmitate d'éthyl hexyle, et les huiles fluorées comme par exemple les perfluoropolyéthers. On peut aussi utiliser des alcools gras, des acides gras comme par exemple l'acide stéarique et comme par exemple des cires notamment de paraffine, carnauba et la cire d'abeilles. On peut aussi utiliser des composés siliconés comme les huiles siliconées et par exemple les cyclométhicone et diméthicone, les cires, les résines et les gommes siliconées. Ces composés peuvent être fonctionnalisés ou non.

Comme émulsionnants utilisables dans l'invention, on peut citer par exemple le stéarate de glycérol, le polysorbate 60, le mélange alcool cétylstéarylique/alcool cétylstéarylique oxyéthyléné à 33 moles d'oxyde d'éthylène vendu sous la dénomination Sinnowax A00 par la société HENKEL, le mélange de PEG-61PEG-32/Glycol Stéarate vendu sous la dénomination de Tefose® 63 par société GATTEFOSSE, le PPG-3 myristyl éther, les émulsionnants siliconés tels que le cétyldiméthicone copolyol et le mono- ou tristéarate de sorbitane, le stéarate de PEG-40, le monostéarate de sorbitane oxyéthyléné (200E).

Comme solvants utilisables dans l'invention, on peut citer les alcools inférieurs, notamment l'éthanol et l'isopropanol, le propylène glycol.

Comme gélifiants hydrophiles, on peut citer les polymères carboxyliques tel que le carbomer, les copolymères acryliques tels que les copolymères d'acrylates/alkylacrylates, les polyacrylamides et notamment le mélange de polyacrylamide, C13-14-Isoparaffine et Laureth-7 vendu sous le nom de Sepigel 305° par la société SEPPIC, les polysaccharides comme les dérivés cellulosiques tels que les hydroxyalkylcelluloses et en particulier les hydroxypropylcellulose et hydroxyéthylcellulose, les gommes naturelles telles que les guar, caroube et xanthane et les argiles.

Comme gélifiants lipophiles, on peut citer les argiles modifiées comme les bentones, les sels métalliques d'acides gras comme les stéarates d'aluminium et la silice hydrophobe, ou encore l'éthylcellulose et le polyéthylène.

Bien entendu, les compositions topiques, ou associations selon l'invention 40 peuvent en outre contenir plusieurs autres actifs.

A titre d'actifs utilisables, on peut citer, les vitamines B3, B5, B6, B8, C, D ou PP, la niacine, le rétinol (vitamine A) et ses dérivés et le tocophérol (vitamine E) et ses dérivés.

En particulier, on peut utiliser un complexe anti-oxydant comprenant au moins un des composés suivants : les vitamines C et E.

Selon un autre de ses aspects, l'invention a pour objet un procédé cosmétique pour prévenir et/ou traiter l'apparition des cheveux ternes et/ou des cheveux sans éclat due au vieillissement chronobiologique d'un sujet, comprenant au moins une étape d'application topique sur les cheveux et/ou le cuir chevelu dudit sujet d'une quantité efficace d'au moins un extrait de grenade ou d'une composition en contenant.

Préférentiellement, ledit extrait ou ladite composition sera laissé en contact avec les cheveux et/ou le cuir chevelu, qui seront ensuite, optionnellement rincés.

Le procédé de traitement cosmétique de l'invention peut être mis en oeuvre notamment en appliquant les compositions cosmétiques et/ou dermatologiques ou associations telles que définies ci-dessus, selon la technique d'utilisation habituelle de ces compositions. Par exemple : applications de crèmes, de gels, de sérums, de lotions sur les cheveux secs, application d'une lotion pour cheveux sur cheveux mouillés, de shampooings.

Selon un autre de ses aspects, l'invention a pour objet un procédé cosmétique pour prévenir et/ou traiter l'apparition des cheveux ternes et/ou des cheveux sans éclat due au vieillissement chronobiologique d'un sujet, comprenant au moins une étape d'administration orale d'une quantité efficace d'au moins un extrait de grenade ou d'une composition en contenant.

Le procédé cosmétique selon l'invention peut être mis en oeuvre par administration orale ou application topique, journalière par exemple, de l'extrait ou de l'association selon l'invention qui peuvent être par exemple formulés sous forme de gels, lotions, émulsions. Dans le cas d'une administration orale, les doses journalières d'extrait de grenade sont comprises préférentiellement entre 0,5 et 2500 mg/jour, plus précisément entre 5 et 500 mg/jour.

L'un ou l'autre de ces procédés cosmétiques peut comprendre une application ou une administration unique. Selon un mode de réalisation particulier, l'application ou l'administration est répétée par exemple 2 à 3 fois quotidiennement sur une journée ou plus et généralement sur une durée prolongée d'au moins 4 semaines, voire 4 à 15 semaines, avec le cas échéant une ou plusieurs périodes d'interruption.

Dans la description et dans les exemples suivants, sauf indication contraire, les pourcentages sont des pourcentages en poids et les plages de valeurs libellées sous la forme "entre ... et ..." incluent les bornes inférieure et supérieure précisées. Les ingrédients sont mélangés, avant leur mise en forme, dans l'ordre et dans des conditions facilement déterminées par l'homme de l'art.

Les exemples ci-après sont présentés à titre illustratif et non limitatif du domaine de l'invention.

Exemple 1 : démonstration de l'effet revendiqué 1. Matériel et méthode

1.1. Modèle biologique

- Tissus : Néosynthèse des GAGs totaux : 36 épidermes de 13 jours EpiskinTM (J13).

- Conditions de culture : 37°C, 5% CO2.

- Milieu de culture : Milieu de différenciation lot n°09-DIFF-010 (Néosynthèse des 25 GAGs totaux).

1.2. Composés testés et références Extrait testé Aspect/Stock Solution Dilution Concentrations age stock testées E1 (Draco) - Poudre 10 mg/mi Milieu de 0.001 mg/mi Extrait de jus - Stockage à en DMSO différencia de fruit entier +4°C à l'abri tion ou de la lumière PBS E2 (Naturex, - Poudre 100 mg/mi Milieu de 0.005 mg/ml Avignon, Stockage à en DMSO différencia France) _ +4°C à l'abri tion ou Extrait de jus de la lumière PBS de fruit entier .3. Test préliminaire de cytotoxicité

- Plaques : 96 puits - Cellules/puits : 10000 NHEK en milieu Keratinocyte-SFM - Gamme de concentrations testées : cf. Tableau 1 - Nombre de réplicats : 6 - Contact cellules/composé : 48 heures - Paramètres d'évaluation : réduction du MTT et observations morphologiques au microscope (objectif x10) La transformation du sel de tétrazolium incolore (MTT : 3-(4,5-diméthyl thiazol-2-yl)-2,5 diphényl-tetrazolium bromide) en cristaux bleus de formazan, solubles dans le DMSO, est proportionnelle à l'activité de la succinate déshydrogénase (une enzyme mitochondriale). En conséquence, la transformation du MTT en cristaux de formazan par la succinate déshydrogénase est proportionnelle au nombre de cellules vivantes.

Les cellules ont été incubées en présence de MTT puis ont été dissociées et les 20 cristaux de formazan ont été solubilisés. La densité optique (DO) à 540 nm, représentative du nombre de cellules vivantes, a été mesurée sur un lecteur de plaques (SoftMax, Molecular Devices).

1.4. Synthèse des glycosaminoglycanes sur EpiskinTM - Culture et traitement

A réception, les épidermes reconstruits EpiskinTM ont été placés en plaques 24 puits contenant 2 ml de milieu de différenciation et cultivés pendant 24 heures. 30 Après incubation, les épidermes ont été placés en plaques 12 puits en milieu de différenciation contenant ou non (témoin) les composés à testés ou la référence et incubés pendant 72 heures. Un contrôle DMSO à 0.50/0 a été réalisé en parallèle. Pour la mesure de la néosynthèse des GAGs, la [3H]-glucosamine pour la néosynthèse des GAGs totaux) a été ajouté pendant les 24 dernières heures 35 d'incubation. Toutes les conditions ont été réalisées en n=3 pour la néosynthèse des GAGs (totaux) et en n=1 pour le contrôle histologique.

- Mesure de l'incorporation de radioactivité dans les GAGs

40 A la fin du traitement, les glycosaminoglycanes ont été extraits séparément des milieux de culture et des épidermes à l'aide de tampon chaotropique (Tris/HCI 50 mM, guanidine 4 M, EDTA 5 mM, pH 8.0) puis purifiés par chromatographie 12 25 d'échange d'ions (adsorption des molécules anioniques sur billes de Q-Sepharose et désorption des molécules peu et moyennement anioniques avec une solution d'urée 6 M + NaCl 0.2 M). La radioactivité incorporée dans les molécules restées sur le support (GAGs, majoritairement) a été mesurée par scintillation liquide. Les résultats ont été exprimés en pourcentage de variation de la synthèse des GAGs totaux par rapport au témoin. 1.5. Traitement des données Les données brutes ont été transférées et traitées sous le logiciel Microsoft Excel®. Les comparaisons intergroupes ont été réalisées à l'aide du test T de Student. Formules utilisées dans ce rapport : Le pourcentage de stimulation est calculé suivant la formule suivante : Valeur Stimulation (%) = X 100 - 100 Moyenne du témoin L'erreur standard de la moyenne (esm) représente l'écart de la moyenne de l'échantillon par rapport à la moyenne de la vraie population. L'esm est calculé en divisant le Sd par la racine carrée de la taille de l'échantillon. 25 Le pourcentage de viabilité est obtenu selon la formule suivante = (DO composé DO témoin) x 100- 2. Résultats 30 2.1 Test préliminaire de cytotoxicité Les résultats des tests de viabilité au MTT et l'observation des tapis cellulaires ont conduit à sélectionner les concentrations à tester dans la suite de l'étude. Aucune toxicité sur les cellules n'a été décelée aux concentrations testées (voir Figure 1). 2.2. Effets des composés sur la synthèse des GAGs épidermiques - Synthèse des GAGs totaux sur EpiskinTM 15 20 35 L'incorporation de [3H]-glucosamine a été mesurée dans les GAGs présents dans les milieux de culture (Figure 1). Au niveau basal, l'incorporation de [3H]-glucosamine dans les GAGs libérés dans le milieu de culture était quasiment négligeable par rapport à celle mesurée dans les épidermes (40/0 du total). Le contrôle DMSO, testé à 0.50/0, a eu tendance à stimuler l'incorporation de [3H]-glucosamine dans les GAGs de la fraction intra-épidermique (200/0 du stimulation) alors qu'aucun effet n'a été observé au niveau des GAGs libérés dans le milieu de culture. 10 L'extrait correspondant au jus de fruit entier de grenade E1, testé à 0.001 mg/mi, a significativement stimulé l'incorporation de [3H]-glucosamine dans les GAGs libérés dans le milieu de culture (990/0 de stimulation).

15 L'extrait correspondant au jus de fruit entier E2, testé à 0.005 mg/mi, a significativement stimulé l'incorporation de [3H]-glucosamine dans les GAGs libérés dans le milieu de culture (2080/0 de stimulation).

3. Conclusion L'extrait E1, testé à 0.001 mg/mi, a stimulé la néosynthèse des GAGs totaux libérés dans les milieux de cultures (facteur 2 environ).

L'extrait E2, testé à 0.005 mg/mi, a stimulé la néosynthèse des GAGs totaux 25 libérés dans les milieux de culture.

Par leur capacité à stimuler la synthèse des glycosaminoglycannes, ces extraits ont comme propriété de renforcer les protéoglycannes au niveau de la gaine conjonctive du cheveu et donc de corriger les effets des altérations de la matrice 30 des cheveux vieillis. Exemple 2: Exemples de compositions 1. Composition de lotion pour les cheveux grenade (% en poids) Extrait de grenade : jus de fruit entier de 5,00 Vitamine E 0,05 Isopropanol 40,00 Conservateur 0,35 Eau qsp 100,00 20 35 40 2. Composition de lait pour le soin du cheveu

Extrait de grenade : jus de fruit entier de grenade Vitamine E Isopropanol Stéarate de glycérol Alcool cétylstéarylique/alcool cétylstéarylique oxyéthyléné à 33 moles OE (Sinnowax AO vendu par la société Henkel) Alcool cétylique Diméthicone (DC 200 Fluid vendu par la société Dow Corning) Huile de vaseline Myristate d'isopropyle (Estol IPM 1514 vendu par Unichema) Glycérine Conservateur Eau qsp

3. Composition de gel pour le soin des cheveux

Extrait de grenade : jus de fruit entier de grenade 20 Vitamine E Vitamine C Isopropanol Conservateur Eau qsp 25 4. Composition de lotion pour le soin des cheveux

Extrait de grenade : jus de fruit entier de grenade Vitamine E 30 Isopropanol Conservateur Eau qsp(% en poids) 5,00 0,05 40,00 0,30 100,00 (% en poids) 5,00 0,05 40,00 1,00

3,00 1,00 1,00 6,00 3,00 20,00 0,30 100,00

(% en poids) 5,00 0,05 2,50 40,00 0,30 100,00