FR2944104A1 - Method for detection of non-toxic indocyanine green fluorescent marker in e.g. solid medium of biological cancer tissues of patient in neurology field, involves detecting time-resolved fluorescence signal of fluorescent marker - Google Patents

Method for detection of non-toxic indocyanine green fluorescent marker in e.g. solid medium of biological cancer tissues of patient in neurology field, involves detecting time-resolved fluorescence signal of fluorescent marker Download PDF

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Abstract

The method involves introducing a fluorescent marker in a diffusion medium (20). Excitations of the medium are realized using primary impulsions of a primary excitation beam at a primary wavelength and secondary impulsions of a secondary excitation beam shifted spectrally and temporally from the primary excitation beam, where secondary wavelength of the secondary beam is different from the primary wavelength of the primary beam. A time-resolved fluorescence signal of the marker is detected. An independent claim is also included for a tomography device for detection of a fluorescent marker in a diffusion medium.

Description

1 EXTINCTION DE L'AUTOFLUORESCENCE DES TISSUS BIOLOGIQUES EN TOMOGRAPHIE RESOLUE EN TEMPS 1 AUTOFLUORESCENCE EXTINCTION OF BIOLOGICAL TISSUE TOMOGRAPHY RESOLVED TIME

DESCRIPTION DOMAINE TECHNIQUE ET ART ANTÉRIEUR L'invention concerne le domaine de l'imagerie optique appliquée au domaine médical et notamment de l'imagerie de fluorescence in vivo et ex-vivo. TECHNICAL FIELD AND PRIOR ART The invention relates to the field of optical imaging applied to the medical field including fluorescence imaging in vivo and ex vivo.

Elle concerne principalement le domaine technique de l'imagerie optique diffuse, et de son application à l'imagerie optique diffuse de fluorescence ou à la détermination de propriétés optiques de milieux diffusants. It mainly concerns the technical area of ​​diffuse optical imaging and its application to diffuse optical imaging of fluorescence or determining optical properties of scattering media. Elle peut notamment être appliquée à des échantillons de tissus biologiques ou à des parties du corps animal ou humain dont les dimensions sont compatibles avec les profondeurs de pénétration des rayonnements optiques utilisés. It may in particular be applied to samples from biological tissues or parts of the animal or human body, whose dimensions are compatible with the penetration depths of the optical radiation used. Ces techniques permettent de mettre en oeuvre des systèmes de diagnostic non invasifs grâce à l'utilisation de rayonnements non-ionisants, faciles d'utilisation et peu coûteux. These techniques allow to implement noninvasive diagnostic systems through the use of non-ionizing radiation, easy to use and inexpensive. Pratiquement, un marqueur fluorescent ou fluorophore (substance chimique d'une molécule capable d'émettre de la lumière de fluorescence après excitation) est injecté au sujet et se fixent sur certaines molécules spécifiques, par exemple des tumeurs cancéreuses. Practically, a fluorescent or fluorophore label (chemical substance of a molecule capable of emitting fluorescence upon excitation light) is injected into the subject and bind to specific molecules, e.g., cancerous tumors. La zone d'intérêt est éclairée à la longueur d'onde d'excitation optimale du fluorophore et le signal fluorescent est détecté. The area of ​​interest is illuminated at the optimum excitation wavelength of the fluorophore and the fluorescent signal is detected. L'imagerie 2 optique de diffusion û sans injection de marqueur fluorescent û est déjà utilisée en milieu clinique, notamment dans les domaines de la mammographie et de la neurologie. 2 imaging optical distribution without fluorescent marker û û injection is already being used in clinical settings, particularly in the areas of mammography and neurology. L'imagerie optique de fluorescence (avec injection de fluorophore spécifique) est quant à elle limitée à ce jour à des applications petit animal en raison du manque de marqueurs adaptés et injectables à l'humain, et du problème d'autofluorescence des tissus qui se pose pour la détection en profondeur. The fluorescence optical imaging (with injection of specific fluorophore) is itself limited to date in small animal applications due to lack of suitable injectable markers to human, and the problem of autofluorescence of tissues that poses for the depth detection.

En effet, pour appliquer cette méthode au diagnostic, par exemple de cancers, chez l'être humain, le signal spécifique à détecter est situé plus profondément sous la peau que chez le petit animal. In order to apply this method to diagnosis, for example, cancers, in humans, the specific signal to be detected is located deeper under the skin than in small animals. Mais ce signal faiblit avec la profondeur, principalement à cause de l'absorption et de la diffusion des tissus, et se confronte à un signal parasite qui perturbe la détection. But that signal weakens with depth, mainly because of the absorption and distribution of tissues and confronts an interference signal which disturbs the detection. Ce signal parasite est appelé auto-fluorescence et désigne la fluorescence de tissus auxquels aucune substance chimique ou fluorophore spécifique n'a été injecté : il s'agit de la fluorescence naturelle du tissu, due principalement à la présence de molécules appelées fluorophores endogènes (collagène, élastine, NADH, flavines, porphyrines), qui ont elles aussi, le potentiel d'émettre de la lumière lorsqu'elles sont stimulées. This interference signal is called autofluorescence and fluorescence means the tissue to which no chemical or specific fluorophore was injected: it is the natural fluorescence of the fabric, mainly due to the presence of endogenous molecules called fluorophores (collagen , elastin, NADH, flavins, porphyrins), which have also the potential to emit light when stimulated. L'imagerie de fluorescence in vivo est donc souvent limitée par le problème de l'autofluorescence des tissus biologiques. The in vivo fluorescence imaging is often limited by the autofluorescence of the problem of biological tissues.

Par conséquent, l'amélioration de contraste que l'on peut obtenir en marquant les cellules à l'aide 3 de fluorophores, dépend fortement du rapport entre la fluorescence des marqueurs et la fluorescence endogène, ou autofluorescence. Therefore, the contrast enhancement that can be obtained by labeling the cells with three fluorophores, strongly depends on the ratio between the fluorescence of the markers and the endogenous fluorescence, or autofluorescence. Pour augmenter ce contraste, on cherche à diminuer le bruit (constitué principalement par l'autofluorescence) par rapport au signal (la fluorescence du marqueur). To increase the contrast, one seeks to decrease the noise (mainly constituted of the autofluorescence) from the signal (fluorescence label). Pour détecter une inclusion fluorescente à une profondeur de quelques centimètres dans les tissus biologiques, on peut utiliser un dispositif tel que celui de la figure 1, qui permet de suivre la fluorescence temporellement après chaque impulsion d'excitation (c'est la tomographie résolue en temps). For detecting a fluorescent inclusion at a depth of a few centimeters in biological tissues, can be used a device like that of Figure 1, that monitors the fluorescence temporally after each excitation pulse (the resolved tomography time). Un laser 8 d'excitation Saphir-titane délivre un train d'impulsion à une fréquence de 80 Mhz (durée entre les impulsions : 12.5 ns) avec une puissance moyenne de quelques centaine de milliwatts. A laser 8 Sapphire titanium excitation delivers a pulse train at a frequency of 80 MHz (period between pulses: 12.5 ns) with an average power of a few hundred milliwatts. Ce laser est accordable en longueur d'onde de par exemple entre 700 nm à 950 nm pour exciter différents types de fluorophores. This laser is tunable in wavelength, for example between 700 nm to 950 nm to excite different types of fluorophores. De préférence, l'excitation se fait dans les longueurs d'onde du rouge ou du proche infra-rouge. Preferably, the excitation is in the wavelength of red or near infrared. Ce type d'imagerie de fluorescence est appelée imagerie de fluorescence résolue en temps. This type of imaging is called fluorescence resolved fluorescence imaging time. La fréquence des impulsions varie typiquement que quelques centaines de kHz à quelques centaines de MHz. The pulse frequency is typically from a few hundred kHz to several hundred MHz. Les sources utilisées peuvent être des diodes laser pulsées picosecondes, ou des lasers femtosecondes. The sources may be laser diodes pulsed picosecond, or femtosecond lasers. La durée de chaque impulsion lumineuse étant généralement inférieure à 1ns, on parlera alors de sources lumineuses pulsées subnanosecondes. The duration of each light pulse is typically less than 1ns, then we speak of pulsed light sources subnanosecond. 4 Le laser est injecté dans une fibre optique 10 d'excitation qui va permettre de sonder l'échantillon 20. La fluorescence émise par l'inclusion fluorescente présente dans l'échantillon est collectée par une deuxième fibre optique 12 - de détection - et le signal de fluorescence filtré (la référence 16 désigne un filtre) est mesuré à l'aide d'un tube photomultiplicateur 4 raccordé à une carte 13 de comptage de photons (TCSPC) synchronisée avec une partie prélevée du laser d'excitation via une photodiode 9. Ce montage permet de mesurer le signal de fluorescence et de le suivre spatialement (temporellement). 4 laser is injected into an optical fiber 10 that allows excitation of the sample probe 20. The fluorescence emitted by this fluorescent inclusion in the sample is collected by a second optical fiber 12 - detection - and filtered fluorescence signal (reference 16 designates a filter) is measured using a photomultiplier tube 4 connected to a card 13 for photon counting (TCSPC) synchronized with a removed part of the excitation laser through a photodiode 9 . This assembly allows to measure the fluorescence signal and to follow the spatially (temporally). Un exemple de mesure réalisée avec ce type de dispositif est donné en figure 2. La courbe I, représente le signal de fluorescence mesuré en présence d'une inclusion fluorescente (alexa750) placée à lcm de profondeur par rapport aux fibres d'excitation et d'émission, dans un milieu simulant le tissu biologique (mêmes propriétés optiques d'absorption et de diffusion) qui est l'intralipide. An example of measurement carried out with this type of device is given in Figure 2. The curve I represents the fluorescence signal measured in the presence of a fluorescent baseline (alexa750) placed lcm deep with respect to the excitation fibers and issue, in simulated biological tissue (same optical properties of absorption and scattering), which is intralipid. La courbe II représente le même signal enregistré sans l'inclusion fluorescente. Curve II represents the same signal recorded without fluorescent inclusion. Ce signal représente la fluorescence endogène émise par le milieu environnant (l'intralipide), il s'agit de l'autofluorescence. This signal represents the endogenous fluorescence emitted by the surrounding environment (intralipid), it is the autofluorescence. Celle-ci est présente dans la courbe I et masque le signal que l'on souhaite mesurer et qui provient de l'inclusion fluorescente. It is present in the curve I and the mask signal that is to be measured and which comes from the fluorescent inclusion. Pour retrouver ce signal (courbe III), il faut faire la soustraction des deux signaux (courbes I et II). To locate the signal (curve III), it is necessary to subtract the two signals (curves I and II).

Dans le cas où on souhaite appliquer cette technique à l'imagerie de tissus cancéreux in vivo, la soustraction des deux signaux devient impossible, car, une fois le fluorophore injecté au patient, il est 5 impossible de l'enlever pour enregistrer l'autofluorescence, dont l'intensité est variable selon l'endroit où on se trouve dans le tissu. If you want to apply this technique in vivo imaging of cancer tissue, the subtraction of the two signals becomes impossible, because once the fluorophore injected into the patient, it is impossible to remove 5 to record autofluorescence whose intensity is variable depending on where it is in the tissue. En outre, plus la profondeur augmente, plus le signal d'excitation diminue, par diffusion optique dans les tissus. In addition, the greater the depth increases, the excitation signal decreases, by optical scattering in the tissue. Ceci va diminuer fortement l'excitation de l'inclusion fluorescente par rapport à l'excitation du tissu biologique qui se trouve devant. This will greatly reduce the excitation of fluorescent inclusion compared to the excitement of the biological tissue in front. Par conséquent, la fluorescence endogène excitée dans des zones se trouvant proche de la fibre d'excitation va émettre un signal d'autofluorescence beaucoup plus fort que le signal de fluorescence émis par l'inclusion fluorescente placée à quelques centimètres de profondeur qui, elle, reçoit un faible signal d'excitation à cause de la diffusion optique de celui-ci dans les tissus. Therefore, the endogenous fluorescence excited in areas located close to the excitation fiber will emit autofluorescence signal much stronger than the fluorescence signal emitted by the fluorescent inclusion placed a few centimeters deep, which in turn receives a low excitation due to the optical diffusion thereof in tissues signal. Pour diminuer l'effet de l'autofluorescence dans les tissus biologiques, d'autres techniques basées sur des analyses assez complexes sont proposées dans différentes publications. To reduce the effect of autofluorescence in biological tissues, other techniques based on rather complex analyzes are available in various publications.

L'article de Steinkamp, JA et al., "Dual- laser, differential fluorescence correction method for reducing cellular background autofluorescence". The article Steinkamp, ​​JA et al., "Dual-laser, differential fluorescence method for correcting Reducing cellular autofluorescence background." Cytometry, 1986. 7(6): p. Cytometry, 1986, 7 (6): p. 566-574, décrit une méthode pour diminuer l'autofluorescence dans les cellules marquées par des anticorps fluorescents. 566-574, describes a method for reducing autofluorescence in the cells labeled with fluorescent antibody. Cette technique est basée sur l'utilisation de deux lasers, 6 le premier excitant le fluorophore et l'autofluorescence, et le deuxième laser, décalé spectralement par rapport au premier, excitant uniquement l'autofluorescence. This technique is based on the use of two lasers, the first 6 exciting the fluorophore and the autofluorescence, and the second laser, spectrally shifted with respect to the first exciting only the autofluorescence. Une soustraction de ces deux signaux permet d'obtenir le signal de fluorescence, en supposant que l'autofluorescence soit comparable spectralement et quantitativement dans les deux cas. A subtraction of these two signals yields the fluorescent signal, assuming that the autofluorescence comparable spectrally and quantitatively in both cases. L'excitation a lieu dans le bleu (400 nm) et les mesures se font dans un cadre de détection de la fluorescence à l'échelle de la cellule (pas de mesure en profondeur). The excitation takes place in the blue (400 nm) and measurements are made in a fluorescence detection frame in the scale of the cell (no depth measurement). Une autre technique est décrite dans l'article de Lakowicz, JR, et al., "Background suppression in frequency-domain fluorometry". Another technique is described in the article by Lakowicz, JR, et al., "Background suppression in frequency-domain Fluorometry".

Analytical biochemistry, 2000. 277(1): p. Analytical Biochemistry, 2000. 277 (1): p. 74û85 et dans l'article de Herman, P, et al, "Real-time background suppression during frequency domain lifetime measurements". 74û85 and in the article by Herman P, et al, "Real-time background suppression During lifetime frequency domain measurements". Analytical biochemistry, 2002. 309(1) . Analytical Biochemistry, 2002. 309 (1). p. p. 19û26. 19û26. Elle est basée sur l'utilisation d'un fluorophore (MLC : metal ligand complex) d'une très longue durée de vie (entre 20ns et 10ps) dans un milieu dont la durée de vie de l'autofluorescence est courte par rapport au fluorophore (propylene glycol, plasma humain). It is based on the use of a fluorophore (MLC: metal ligand complex) of a very long life (between 20 ns and 10 ps) in a medium whose life autofluorescence is short relative to the fluorophore (propylene glycol, human plasma). La fluorescence, ainsi décalée temporellement, peut être détectée avec un photomultiplicateur déclenché après l'émission de l'autofluorescence (gating). Fluorescence and temporally offset, can be detected with a photomultiplier triggered after the emission of autofluorescence (gating). Le fluorophore est mélangé avec le milieu, et l'excitation se fait dans le bleu (400 nm) qui est une région de forte absorption des tissus (tandis que l'eau n'absorbe pas beaucoup à 400nm). The fluorophore is admixed with the medium, and the excitation is in the blue (400 nm) which is a strong absorption of the tissue region (while water does not absorb very much 400 nm). Dans ce document, il 7 n'y a pas de mesure en profondeur, et en outre le fluorophore étudié n'est pas injectable à l'homme. In it, there 7 is no depth measurement, and further studied the fluorophore is not injectable man. Une autre technique est décrite dans l'article de Levenson, RM et al., "Spectral imaging and microscopy". Another technique is described in the article by Levenson, RM et al., "Spectral imaging and microscopy." American Laboratory, 2000. 32(22) . American Laboratory, 2000. 32 (22). p. p. 26-32 et dans celui de Mansfield, JR, et al., "Autofluorescence removal, multiplexing, and automated analysis methods for in-vivo fluorescence imaging". 26-32 and that of Mansfield, JR, et al., "Autofluorescence removal, multiplexing, and automated analysis methods for in vivo fluorescence imaging". Journal of biomedical optics, 2005. 10(4): p. Journal of Biomedical Optics, 2005. 10 (4): p. 1-7. 1-7. Ces auteurs sont les seuls qui traitent le problème de l'autofluorescence en infrarouge (pour l'imagerie en profondeur). These writers are the only ones who treat the problem of infrared autofluorescence (for imaging deep). Cette technique assez complexe est basée sur l'excitation et la détection multispectrale: un spectre est réalisé en chaque pixel de l'image. This rather complex technique is based on the excitation and the multispectral detection: a spectrum is formed in each pixel of the image. Les images obtenues en trois dimensions (x, y, longueur d'onde) sont ensuite analysées minutieusement à l'aide d'algorithmes mathématiques pour corriger la contribution de l'autofluorescence. The obtained images in three dimensions (x, y, wavelength) are then analyzed thoroughly using mathematical algorithms to correct the contribution of autofluorescence. Cette technique a été industrialisée dans un appareil maestro pour l'imagerie du petit animal. This technique was industrialized in a Maestro device for small animal imaging. Les fluorophores utilisés sont de type Qdot (non injectable à l'homme) dont la durée de vie est très grande (dizaine de ns). The fluorophores used are Qdot type (not injectable human) whose life is very large (tens of ns). Enfin, l'article de Gao, M., et al., "Effects of background fluorescence in fluorescence molecular tomography". Finally, Article Gao, M., et al., "Effects of background fluorescence in fluorescence molecular tomography". Applied optics, 2005. 44(26) . Applied Optics, 2005. 44 (26). p. p. 5468-5474, propose une étude sur des fantômes optiques (intralipide) en implantant des inclusions (billes en plastique remplies d'une solution fluorescente Cy5). 5468-5474, proposes a study on optical ghosts (Intralipid) by implanting inclusions (plastic beads filled with fluorescent solution Cy5). Des algorithmes mathématiques sont employés pour la reconstruction des images des billes 8 fluorescentes. Mathematical algorithms are used for image reconstruction 8 fluorescent beads. La profondeur des inclusions est d'environ 1 cm au maximum. The depth of the inclusions of about 1 cm maximum. D'une manière générale, il se pose donc le problème de trouver un nouveau procédé, permettant de réduire, dans un signal d'imagerie de fluorescence résolue en temps, la contribution de l'autofluorescence par rapport à celle des sources de fluorescence associées à des marqueurs. In general, it is therefore the problem of finding a new method for reducing, in a fluorescence imaging signal time-resolved, the contribution of autofluorescence compared to fluorescent sources associated with markers. Un tel procédé est de préférence apte à être mis en oeuvre pour des signaux résultant d'une excitation en profondeur. Such a process is preferably adapted to be implemented for signals resulting from excitation at depth. En outre, un tel procédé est de préférence aisé à mettre en oeuvre, sans analyse ou traitement complexe du signal temporel. In addition, such a method is preferably easy to implement, without complex processing or analysis of the time signal.

Il se pose également le problème de trouver un nouveau dispositif, permettant de mettre en oeuvre un tel procédé. It is also the problem of finding a new device for implementing such a method. EXPOSÉ DE L'INVENTION L'invention concerne d'abord un procédé de localisation d'au moins un marqueur fluorescent dans un milieu diffusant ou environnant le marqueur, dans lequel : a) on introduit au moins un marqueur fluorescent dans ce milieu, b) on dirige vers ce milieu, contenant au moins un marqueur fluorescent, une pluralité de premières impulsions d'un premier faisceau d'excitation à au moins une première longueur d'onde et une pluralité de deuxièmes impulsions d'un deuxième faisceau d'excitation à au moins une deuxième longueur 9 d'onde, différente d'au moins une longueur d'onde du premier faisceau, c) on détecte au moins un signal de fluorescence, résolu en temps, du marqueur fluorescent. DESCRIPTION OF THE INVENTION The invention relates to a first method for locating at least one fluorescent marker in a scattering or medium surrounding the marker, wherein: a) introducing at least one fluorescent marker in this medium b) is directed to this medium containing at least one fluorescent marker, a plurality of first pulses of a first excitation beam to at least a first wavelength and a plurality of second pulses of a second excitation beam at least a second length 9 wavelength, different from at least one of the first beam wavelength, c) detecting at least one fluorescence signal, time-resolved, the fluorescent label.

Le milieu diffusant contient des substances ou molécules endogènes, qui donnent lieu à l'émission d'un signal de fluorescence, dit autofluorescence. The scattering medium contains endogenous substances or molecules, which give rise to the emission of a fluorescence signal, said autofluorescence. Les premières impulsions permettent de réaliser au moins une excitation de l'autofluorescence, tandis que les deuxièmes impulsions permettent de réaliser au moins une excitation de la fluorescence du marqueur fluorescent. The first pulses used to perform at least one excitation of the autofluorescence, while the second pulses are used to produce at least one excitation of the fluorescence of the fluorescent marker. Les premières et les deuxièmes impulsions sont temporellement alternées, une deuxième impulsion étant séparée d'une première impulsion précédente d'une durée inférieure ou égale à la durée de déclin de l'autofluorescence du milieu diffusant. The first and second pulses are temporally alternately, a second pulse being separated from a first preceding pulse of a duration less than or equal to the decay time of the autofluorescence of the scattering medium. Le décalage temporel est par exemple inférieur à 2 ns ou à 1 ns ou à 500 ps ou à 100 ps, mais est supérieur à 0 (>0). The time shift is for example less than 2 ns or 1 ns or 500 ps or 100 ps, ​​but is greater than 0 (> 0).

L'invention permet de diminuer fortement la contribution de l'autofluorescence dans un signal de fluorescence résolu en temps, et ce de manière optique, à l'aide d'une double excitation, dont l'une est décalée spectralement et temporellement par rapport à l'autre. The invention allows to greatly reduce the contribution of autofluorescence in a fluorescence signal resolved in time, and optically, using a double excitation, one of which is shifted spectrally and temporally with respect to the other. Chaque deuxième impulsion vient après une durée inférieure à la durée de vie de l'autofluorescence, le milieu diffusant étant alors quasiment aveugle à la deuxième longueur d'onde, et va exciter le fluorophore pour produire un signal dans une région spectrale de détection correspondant aux moyens 10 de détection. Each second pulse comes after a time shorter than the lifetime of autofluorescence, the diffusing medium being then almost blind to the second wavelength, and will excite the fluorophore to produce a signal in a spectral region corresponding to the detection means 10 for detecting. On ne réalise pas une excitation multiphotonique du milieu diffusant c'est-à-dire une première excitation, avec la première impulsion, relayée ensuite par une deuxième excitation à partir de l'état excité atteint lors de la première excitation ; We do not realize a multiphoton excitation of the scattering medium that is to say a first excitation, with the first pulse, then relayed by a second excitation from the excited state reached at the first excitation; donc chaque deuxième impulsion va exciter le marqueur et pratiquement pas le milieu diffusant du fait de l'aveuglement précédemment décrit. therefore each second pulse will excite the marker and virtually no scattering medium due to blindness previously described. Les premier et deuxième faisceaux d'excitation sont décalés spectralement, par exemple d'une valeur au moins égale à 50 nm. The first and second excitation beams are shifted spectrally, e.g., a value at least equal to 50 nm. Chaque premier faisceau d'excitation peut avoir une longueur d'onde inférieure à la longueur d'onde de chaque deuxième faisceau d'excitation. Each first excitation beam may have a wavelength less than the wavelength of each second excitation beam. On peut ainsi réaliser une excitation adaptée de l'autofluorescence lorsque celle-ci est située dans une gamme spectrale plus faible que la fluorescence du fluorophore ou du marqueur fluorescent exogène ou injecté. One can thus achieve an appropriate excitation of the autofluorescence when the latter is located in a lower spectral range that the fluorescence of the fluorophore or exogenous or injected fluorescent label.

De préférence on réalise, à chaque impulsion du premier faisceau laser, une saturation d'un état excité de molécules du milieu diffusant. Is preferably carried out at each pulse of the first laser beam, a saturation of an excited state of molecules of the scattering medium. Les premières impulsions et les deuxièmes impulsions peuvent avantageusement être envoyées vers le milieu diffusant par une même fibre optique. The first pulses and the second pulses may advantageously be sent to the scattering medium by a single optical fiber. Ainsi un même volume du milieu examiné subit chacun des deux rayonnements. And the same volume of test medium undergoes each of the two radiation. L'invention permet de réaliser un examen en profondeur, dans le milieu examiné ou diffusant. The invention allows for a thorough review in the examined medium or broadcast. Par 30 exemple, au moins un marqueur fluorescent est situé à 11 une distance d'une interface entre le milieu diffusant et le milieu extérieur comprise entre 3 cm et 5 cm. For 30 example, at least one fluorescent marker is located 11 away from an interface between the scattering medium and the external medium of between 3 cm and 5 cm. Avantageusement, le milieu diffusant est visqueux ou solide. Advantageously, the scattering medium is viscous or solid.

On peut réaliser en outre un filtrage d'au moins une partie du signal d'autofluorescence qui provient du milieu diffusant. It may further perform a filtering at least a portion of the autofluorescence signal from the scattering medium. Un procédé selon l'invention peut comporter en outre une étape de réalisation d'une image représentant la localisation ou la position d'au moins un marqueur fluorescent dans le milieu diffusant. A method according to the invention may further comprise a step of producing an image representing the location or position of at least one fluorescent marker in the scattering medium. L'invention concerne également un dispositif de tomographie de fluorescence résolue en temps d'un milieu diffusant, comportant : a) des moyens formant source de rayonnement pour former des premières impulsions de rayonnement, à au moins une première longueur d'onde, b) des moyens formant source de rayonnement pour former des deuxièmes impulsions de rayonnement à au moins une deuxième longueur d'onde, différente d'au moins une longueur d'onde du premier faisceau, les premières et deuxièmes impulsions étant temporellement alternées, c) des moyens pour amener les premières et 25 deuxièmes impulsions de rayonnement dans un milieu diffusant, d) des moyens pour détecter au moins un signal de fluorescence, résolu en temps, provenant du milieu étudié. The invention also relates to a fluorescence tomography device of a time-resolved scattering medium, comprising: a) source means of radiation to form first radiation pulses, at least a first wavelength, b) source means of radiation to form second radiation pulses to at least a second wavelength, different from at least one of the first beam wavelength, the first and second pulses being temporally alternating, c) means to bring the first and 25 second pulses of radiation in a scattering medium, d) means for detecting at least one fluorescence signal, time-resolved, from the analysis medium. 30 Dans un tel dispositif, les premier et deuxième faisceaux d'excitations peuvent 12 préférentiellement être décalés spectralement de telle sorte que l'excitation du fluorophore par les premières impulsions soit négligeable. 30 In such a device, the first and second excitation beams 12 can preferably be shifted spectrally such that the excitation of the fluorophore by the first pulses is negligible. Le décalage pourra être d'au moins 50 nm. The offset may be at least 50 nm. Chaque premier faisceau d'excitation peut avoir une longueur d'onde inférieure à la longueur d'onde de chaque deuxième faisceau d'excitation. Each first excitation beam may have a wavelength less than the wavelength of each second excitation beam. Un dispositif selon l'invention peut en outre comporter : - des moyens de filtrage d'un signal de fluorescence, - et/ou des moyens pour réaliser une image à partir de signaux de fluorescence, résolus en temps. A device according to the invention may further comprise: - filtering means of a fluorescence signal, - and / or means for producing an image from fluorescence signals resolved in time. BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS 15 - La figure 1 représente un dispositif pour mettre en oeuvre un procédé selon l'art antérieur, - la figure 2 est un exemple de mesure réalisée selon l'art antérieur, - la figure 3 représente un dispositif pour 20 mettre en oeuvre l'invention, - la figure 4 représente dans le temps, des impulsions du premier laser et du deuxième laser, - la figure 5 représente le décalage spectral entre l'autofluorescence et la fluorescence 25 des fluorophores, - la figure 6 représente une courbe de saturation. BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS 15 - Figure 1 shows a device for carrying out a method according to the prior art, - Figure 2 is an example of measurement performed according to the prior art, - Fig 3 shows a device 20 for putting implement the invention, - Figure 4 shows in time, pulses of the first laser and the second laser, - Figure 5 represents the spectral difference between the autofluorescence and fluorescence 25 fluorophores, - Figure 6 shows a saturation curve. 10 13 EXPOSÉ DÉTAILLÉ DE MODES DE RÉALISATION PARTICULIERS Un exemple de dispositif pouvant être mis en oeuvre dans le cadre de l'invention est représenté en figure 3. October 13 DESCRIPTION OF SPECIFIC EMBODIMENTS DETAILED An example device that can be implemented in the context of the invention is shown in Figure 3.

Ce dispositif comporte une première source 8 de rayonnement en impulsions et une deuxième source 80 de rayonnement en impulsions. This device comprises a first source 8 of radiation in pulses and a second source 80 of radiation pulses. Chacune de ces sources est de préférence une source laser émettant dans l'infra rouge. Each source is preferably a laser source emitting in the infrared. Du point de vue temporel, la largeur de chaque impulsion (de l'une ou l'autre source) compatible avec l'invention ne doit pas dépasser quelques centaines de femtoseconde (elle est donc inférieure à 10-13s ou à 10-12s) , afin que tous les photons émis par la deuxième source déclenchent simultanément l'excitation du milieu autofluorescent et ceci avant le déclin de la fluorescence du milieu environnant (l'autofluorescence), qui est compris entre quelques centaines de picosencondes et quelques nanosecondes. From the temporal perspective, the width of each pulse (from any source) compatible with the invention should not exceed a few hundred femtosecond (it is less than 10-13s or 10-12s) so that all the photons emitted by the second source simultaneously trigger the excitation of the autofluorescent medium and this before the decline of fluorescence of the surrounding medium (autofluorescence), which is between a few hundred and a few nanoseconds picosencondes. Ceci permet de rendre le milieu environnant majoritairement aveugle à la deuxième impulsion : lorsque celle-ci arrive, une molécule de ce milieu est encore dans l'état électronique excité et il lui impossible de réabsorber un autre photon. This will make the majority of blind surrounding environment to the second pulse: when this happens, a molecule of this medium is still in the excited electronic state and unable to reabsorb another photon. La lumière émise par la première source 8, est envoyée par une fibre 10 vers la cellule 20 qui contient le milieu à analyser. The light emitted by the first source 8, is sent through a fiber 10 to the cell 20 which contains the medium to be analyzed. La lumière émise par la deuxième source 80, rejoint également la fibre 10 et est aussi envoyée vers la cellule 20. Il peut y avoir deux fibres différentes, une pour chaque laser, mais à condition que le point d'excitation soit le même pour les deux faisceaux, ou 14 que les deux faisceaux convergent sensiblement sur une même zone, car ce point ou cette zone va émettre de l'autofluorescence et sera aveugle à la deuxième impulsion. The light emitted by the second source 80, also joined the fiber 10 and is also sent to the cell 20. There may be two different fibers, one for each laser, provided that the excitation point is the same for two beams, or 14 that the two beams converge substantially on a same area, since this point or zone will emit autofluorescence and will be blind to the second pulse.

Les deux sources sont synchronisées par des moyens 17 de synchronisation. The two sources are synchronized by means 17 for synchronization. Les impulsions de la deuxième source sont décalées spectralement par rapport aux impulsions de la première source. The pulses of the second source are spectrally shifted with respect to the pulses from the first source. Par exemple la première source émet à une longueur d'onde d'environ 700 nm (longueur d'onde adaptée notamment au cas de l'excitation de l'intralipide comme source d'autofluorescence, dont le temps de déclin est d'environ 500 ps), tandis que le spectre de la deuxième source est centré à une longueur d'onde d'environ 750 nm. For example, the first source emits at a wavelength of about 700 nm (wavelength adapted in particular to the case of excitation of Intralipid as a source of autofluorescence, whose decay time is approximately 500 ps), while the spectrum of the second source is centered at a wavelength of about 750 nm. Les impulsions de la deuxième source sont décalées temporellement par rapport aux impulsions de la première source par des moyens 81 formant ligne à retard. The pulses of the second source are temporally offset with respect to pulses of the first source through means forming a delay line 81.

On donne plus loin des explications plus détaillées concernant ces deux types de décalage entre les deux sources 8 et 80. On injecte donc dans le milieu 20 les faisceaux de la première source et de la deuxième source, qui fonctionnent toutes deux en impulsions et de manière synchronisée. It further provides more detailed explanations of these two types of offset between the two sources 8 and 80. So is injected into the middle 20 the beams of the first source and second source, which operate both pulse and so synchronized. Les puissances des deux sources sont déterminées de façon à ce que la première source produise un aveuglement significatif du milieu diffusant, et que la seconde source permette l'obtention d'un signal de fluorescence exploitable. The powers of the two sources are determined so that the first source produces a significant blinding of the scattering medium, and the second source allows obtaining a workable fluorescence signal. 15 Les deux sources peuvent éventuellement avoir la même puissance, si cela permet de satisfaire à cette condition. 15 The two sources may possibly have the same power, if it can satisfy this requirement. La référence 21 désigne des moyens de focalisation des faisceaux. The reference 21 designates means for focusing the beams. Une fibre 12 permet de collecter le rayonnement de fluorescence issu du milieu 20. Les deux fibres 10, 12 peuvent être déplacées l'une par rapport à l'autre. A fiber 12 is used to collect the fluorescence radiation from the medium 20. The two fibers 10, 12 may be displaced relative to each other. Ceci présente un intérêt lorsque la technique de reconstruction de l'image met en oeuvre les algorithmes de localisation 3D, par exemple selon l'enseignement des documents US20080067420, EP1762982, ou US20070049807. This is relevant when image reconstruction technique uses algorithms of 3D localization, such as teaching materials US20080067420, EP1762982 or US20070049807. Elles sont par exemple montées sur des moyens de déplacement en translation verticaux et horizontaux (suivant les axes X, Y et Z de la figure 3). They are for example mounted on said vertical and horizontal displacement in translation (along the axes X, Y and Z of Figure 3). Pour cela on peut mettre en oeuvre une ou des platines montées en translation pour déplacer les extrémités des fibres optiques. For this we can implement one or more plates mounted in translation to move the ends of the optical fibers. Dans tous les cas la translation peut être pilotée par ordinateur. In all cases the translation can be controlled by computer. La source 8 d'impulsions de rayonnement peut également être utilisée comme moyen de déclenchement de la carte TCSPC 13 : un miroir semiréfléchissant 17 et un détecteur 9 permettent de prélever une partie du signal du laser 8 et de l'utiliser comme déclencheur des moyens 13. Un filtre interférentiel 16 et/ou un filtre coloré absorbant les faibles longueurs d'onde peuvent être placés devant le détecteur 4 pour sélectionner la lumière de fluorescence d'un fluorophore disposé dans le milieu 20 et optimiser l'élimination de la lumière 16 d'excitation. The source 8 of radiation pulses can also be used as a card of the trigger means TCSPC 13: a semi-reflecting mirror 17 and a detector 9 are used to remove a portion of the laser signal 8 and used as a trigger means 13 . an interference filter 16 and / or a low wavelength-absorbing color filter may be placed before the detector 4 to select the fluorescent light of a fluorophore disposed in the medium 20 and optimize the elimination of light 16 d 'excitation. Un filtre peut aussi permettre d'éliminer tout ou partie de l'autofluorescence résiduelle au moment de l'excitation du fluorophore Des moyens électroniques 24 tels qu'un ordinateur ou un micro ordinateur ou un calculateur sont programmés pour mémoriser et traiter les signaux du détecteur 4. Ces moyens comportent une unité centrale 26 programmée pour traiter des données temporelles de fluorescence obtenues par un procédé selon l'invention. A filter may also allow to eliminate all or part of the residual autofluorescence at the time of excitation of the fluorophore Electronic means 24 such as a computer or a microcomputer or a computer are programmed to store and process the detector signals 4. These means comprise a central processing unit 26 programmed to process the fluorescence time data obtained by a process according to the invention. Un signal de fluorescence résolu en temps, détecté lors de la mise en oeuvre d'un procédé et d'un dispositif selon l'invention, sera sensiblement similaire à celui de la courbe I de la figure 2. En particulier ces moyens 24 permettent de mettre en oeuvre un procédé de reconstitution à partir des données temporelles, par exemple tel que décrit dans le document EP 1884765 ou US 2008067420 ou EP1762982, ou US20070049807. A fluorescence signal resolved in time, detected in the implementation of a method and a device according to the invention will be substantially similar to the curve I of Figure 2. In particular, these means 24 are used to implement a recovery process from the time data, for example as described in EP 1884765 or US 2008067420 or EP1762982, or US20070049807. Une image représentant le positionnement du ou des fluorophores dans le milieu 20 examiné peut ensuite être visualisée sur des moyens de visualisation 27. Les moyens 24 permettent éventuellement de commander ou de contrôler d'autres parties du dispositif expérimental, par exemple la position des fibres 10, 12. D'autres éléments peuvent être utilisés pour la détection : un photomultiplicateur, ou une photodiode à avalanche, ou une caméra rapide, ou un ensemble Caméra et HRI -High Rate Imager-. An image representing the position of the or fluorophores in the examined medium 20 may then be displayed on display means 27. The means 24 may be used to control or to control other parts of the experimental device, for example the position of the fibers 10 12. other elements may be used for detection: a photomultiplier or an avalanche photodiode, or a fast camera, or a set camera and HRI -High Rate Imager-. Tous ces systèmes peuvent être utilisés pour la détection, en les plaçant après les moyens de filtrage 16. 17 Le milieu étudié 20 est un milieu diffusant, par exemple un tissu biologique. All these systems can be used for detection, placing them after the filtering means 17 16. The medium studied 20 is a scattering medium such as a biological tissue. Dans ce type de milieu, un rayonnement incident peut pénétrer avec une profondeur de pénétration pouvant atteindre quelques cm, par exemple 3 cm ou 5 cm. In this type of medium, incident radiation can penetrate with a penetration depth up to a few cm, for example 3 cm or 5 cm. Les valeurs exactes dépendent de la puissance de la source utilisée et des propriétés optiques du milieu, notamment du coefficient d'absorption et du coefficient de diffusion réduit. The exact values ​​depend on the power of the source used and the optical properties of the medium, in particular the absorption coefficient and the reduced scattering coefficient.

On ainsi pu atteindre une profondeur de 3.5 cm dans de la viande ex-vivo et 3 cm dans un milieu biomimétique à la prostate humaine. a depth of 3.5 cm is able to achieve in the ex vivo meat and 3 cm in a biomimetic environment in the human prostate. Autrement dit, des fluorophores situés à une distance comprise entre 0 cm (donc situés très proches de la surface définie comme l'interface entre le milieu 20 et le milieu extérieur) et 3 cm ou 5 cm à distance de cette surface vont pouvoir être détectés. In other words, fluorophores located at a distance of between 0 cm (thus located very near the surface defined as the interface between the medium 20 and the external medium) and 3 cm or 5 cm distance from this surface will be detected . Les moyens de détection 4 détectent donc un rayonnement qui provient de la zone du milieu diffusant excitée par les faisceaux des sources 8, 80. Ce rayonnement traverse le milieu diffusant en direction de la frontière entre le milieu diffusant et le milieu extérieur, puis atteint les moyens 4 de détection. The detection means 4 therefore detect radiation which comes from the region of the diffusing medium excited by the beams of the sources 8, 80. This radiation passes through the scattering medium in the direction of the border between the scattering medium and the external medium, and reaches the means 4 detection. Le milieu étudié peut être un milieu vivant. The medium studied may be a living environment. Il peut s'agir par exemple d'une zone du corps humain ou animal. It can be such an area of ​​the human or animal body. En effet, le dispositif décrit ici est tout à fait applicable à l'imagerie in-vivo ou ex-vivo. Indeed, the device described here is quite applicable to imaging in vivo or ex vivo. Pour une application in vivo on peut injecter à l'homme ou à l'animal un ou des marqueurs fluorescents non-toxiques, exemple ICG (vert d'indocyanine) ou d'autres types de marqueurs 18 fluorescents connus de l'homme du métier, par exemple du document PCT/FR2007/000269. For application in vivo can be injected in man or animal or a non-toxic fluorescent labels, such as ICG (indocyanine green) or other types of markers 18 fluorescent known to those skilled in the art example of PCT / FR2007 / 000269. L'enveloppe corporelle de l'homme ou de l'animal peut constituer alors l'interface du milieu diffusant avec le milieu extérieur ; The body shell of the man or the animal can then form the interface of the scattering medium with the external environment; dans ce cas on injecte la lumière dans le milieu à travers l'épiderme (cas de l'étude de la fluorescence du sein ou des testicules) ou, lors d'une endoscopie, à travers la paroi du canal utilisé (par exemple : paroi rectale dans le cas d'une endoscopie rectale). in this case the light is injected into the medium through the skin (as in the study of the fluorescence of the breast or testicles) or during an endoscopy, through the wall of the channel used (eg wall rectally in the case of rectal endoscopy). On peut aussi utiliser une sonde échographique par contact direct. One can also use an ultrasound probe by direct contact. Comme déjà expliqué, il y a également excitation d'autres éléments du milieu, créant une fluorescence parasite, ou une autofluorescence. As already explained, there are also driving other elements of the environment, creating a parasitic fluorescence, or autofluorescence.

De préférence le milieu 20 est visqueux ou fluide. Preferably the medium 20 is viscous or fluid. On donne plus loin, avec la figure 6, un exemple avec une solution eau et intralipide 1%, qui a la même viscosité que l'eau. further given, with reference to FIG 6, an example with a solution of water and 1% Intralipid, which has the same viscosity as water. L'efficacité de la technique est d'autant plus grande que l'on atteint le régime de saturation (décrit plus loin) qui permet l'aveuglement des molécules ; The effectiveness of the technique is all the greater as we reach the saturation conditions (described below) for the blindness of molecules; ce régime est atteint plus aisément dans le cas du solide. this diet is more easily achieved in the case of the solid. Dans ce régime, les molécules du milieu environnent sont aveuglées, à l'état excité. In this scheme, the molecules of the surrounding medium are blinded in its excited state.

Du point de vue temporel, les impulsions d'excitation des deux sources sont distribuées comme représenté schématiquement en figure 4.Les impulsions de la première source sont désignées par I1r celles de la deuxième source 80 par I2. The temporal point of view, the excitation pulses of the two sources are distributed as shown schematically in Figure 4.The pulses from the first source are designated by I1r those of the second source 80 by I2. Chaque impulsion I2 est séparée de l'impulsion I1 précédente par une durée At, fixe, mais réglable à l'aide des moyens 81. De 19 préférence, chaque impulsion du deuxième laser est décalée temporellement de l'impulsion précédente du premier laser d'une durée At (K0), inférieure à la durée caractéristique du déclin de l'autofluorescence ; Each I2 pulse is separated from the previous pulse I1 At a fixed duration but adjustable with the means 19, 81. Preferably, each pulse of the second laser is temporally offset from the previous pulse of the first laser of at a time (K0), less than the characteristic time of the decline of autofluorescence; par exemple, dans le cas de l'intralipide, dont la durée de vie est d'environ 500 ps, la valeur de At sera comprise entre 0 et 500 ps (0<At<500ps)(de préférence quelques ps ou quelques dizaines de ps, par exemple entre 1 ps et 20 ps ou 50 ps ou 100 ps). for example, in the case of Intralipid, whose lifespan is about 500 ps, ​​the value of At is between 0 and 500 ps (0 <At <500ps) (preferably a few ps or tens of ps, for example between 1 ps and 20 ps or 50 ps or 100 ps).

Ce décalage temporel At dépend notamment de la nature du milieu ou des tissus traversés, et en particulier de la durée de déclin de l'autofluorescence. At this time lag depends particularly on the nature of the medium or tissues crossed, and in particular the decay time of autofluorescence. Par exemple cette durée est d'environ 1 ns, dans de la viande (ex vivo). For example, this time is approximately 1 ns in meat (ex vivo).

Pratiquement, le décalage temporel est déterminé, selon les cas de figures, notamment en fonction de la puissance des sources et des propriétés d'autofluorescence du milieu. Practically, the time offset is determined according to the scenarios, in particular according to the power sources and autofluorescence of the medium properties. D'une façon générale, on cherche à ce que la seconde impulsion soit activée lorsque les molécules des tissus sont toujours aveuglées par le premier faisceau, mais aussi à ce que le signal d'auto fluorescence soit suffisamment faible pour qu'il ne soit pas pris en compte par le détecteur de fluorescence (et ce malgré le filtrage). In general, it is desired that the second pulse is activated when the molecules of tissue are still blinded by the first beam, but also that the auto fluorescence signal is low enough that it is not taken into account by the fluorescence detector (despite the filtering).

On cherche à ce que la première impulsion n'excite pas le fluorophore. We seek that the first pulse does not excite the fluorophore. La largeur de bande d'excitation d'un fluorophore étant relativement large, il est préférable, du point de vue spectral, que la première source soit spectralement décalée par rapport à la source d'excitation du fluorophore. Bandwidth excitation of a fluorophore is relatively wide, it is preferable, from the spectral point of view, that the first source is spectrally shifted with respect to the fluorophore excitation source. Le décalage spectral entre les deux faisceaux est par exemple de 50 20 nm ou plus (la valeur de 50 nm est une valeur moyenne de la largeur spectrale de la fluorescence) dans la limite de possibilité de filtrage. The wavelength shift between the two beams is for example of 50 20 nm or more (the value of 50 nm is a mean value of the spectral width of the fluorescence) in the filter can limit. Plus précisément, la longueur d'onde du deuxième faisceau laser est de préférence supérieure à celle du premier faisceau laser, afin de pouvoir filtrer (avec un filtre passe-haut) la fluorescence de l'inclusion, comme expliqué ci-dessous en liaison avec la figure 5. Specifically, the wavelength of the second laser beam is preferably greater than that of the first laser beam, to filter (with a high-pass filter) the fluorescence of the inclusion, as explained below in connection with Figure 5.

Mais l'inverse est également possible : on peut utiliser une longueur d'onde du deuxième faisceau laser inférieure à celle du premier faisceau laser. But the reverse is also possible: one may use a wavelength of the second laser beam smaller than the first laser beam. Le filtrage (pour séparer la fluorescence que l'on cherche à observer de l'autofluorescence et de la lumière du premier faisceau laser) est alors réalisé : à l'aide d'un filtre passe-bande commercial (généralement de largeur spectrale de l'ordre de quelques dizaines de nm, par exemple comprise entre 10 nm et 50 nm). Filtering (to separate the fluorescence that is sought to observe the autofluorescence light and the first laser beam) is then performed: Using a commercial band-pass filter (typically spectral width of order of a few tens of nm, for example between 10 nm and 50 nm). En figure 5 on a représenté un exemple de spectre d'autofluorescence (cas de l'intralipide, courbe A) et le spectre de la fluorescence du fluorophore (courbe F). In Figure 5 there is shown an example of autofluorescence spectrum (the case of Intralipid, curve A) and the fluorescence spectrum of the fluorophore (curve F). Ce schéma permet d'illustrer le décalage spectral qui permet de dissocier la fluorescence de l'autofluorescence. This diagram illustrates the spectral shift that allows to separate the fluorescence autofluorescence. La ligne T en trait interrompu représente la transmission spectrale du filtre utilisé pour la détection. The line T in phantom represents the spectral transmission of the filter used for detection. On a donc intérêt à réaliser ici une excitation avec le premier laser 8 (impulsions I1 de la figure 4, déjà commentée ci dessus) à longueur d'onde plus courte que l'excitation réalisée avec le deuxième laser 80 (impulsions I2 de la figure 4). It is therefore advantageous to realize here excitation with the first laser 8 (I1 pulses of Figure 4, already discussed above) to length of shorter wavelength than the excitation performed with the second laser 80 (I2 pulses of Figure 4). Le laser 8 21 permet d'exciter l'autofluorescence, et le laser 80 la fluorescence. The laser 8 21 enables to excite autofluorescence, and the laser 80 fluorescence. Lorsque l'excitation à l'aide du laser 80 est réalisée, les molécules autofluorescentes sont déjà saturées par le laser 8, et elles ne peuvent plus réabsorber l'énergie du laser 80 car ce dernier intervient avant le déclin de l'autofluorescence. When the excitation with the laser 80 is performed, the auto-fluorescent molecules are already saturated by the laser 8, and they can no longer reabsorb the laser energy 80 because it occurs before the decline of autofluorescence. Dans les conditions de décalage spectral, et temporel indiquées ci-dessus, chaque molécule qui peut donner lieu à une émission d'autofluorescence et qui a absorbé un photon du premier faisceau laser est excitée à un certain niveau, qui présente une certaine durée de vie 'auto (environ 500 ps dans le cas de l'intralipide). Under the conditions of spectral shift, and time indicated above, each molecule that can result in autofluorescence emission and which has absorbed a photon of the first laser beam is energized to a certain level, which has a certain service life self (about 500 ps in the case of intralipid). Si le deuxième faisceau laser arrive dans le milieu suffisamment tôt, au moins avant ' to, elle est encore dans son état excité et n'a pas encore donné lieu à une émission d'autofluorescence. If the second laser beam arrives in the middle early, at least before 'to, it is still in its excited state and has not resulted in an autofluorescence emission. Elle n'est donc pas disponible pour être excitée par un photon du deuxième faisceau laser lorsque ce dernier arrive. It is therefore not available to be excited by a photon of the second laser beam when it arrives.

Autrement dit, les molécules déjà excitées ne pourront être actives sous l'influence de photons du deuxième faisceau laser (dans l'exemple déjà choisi : à 750 nm) qu'après la fin du processus d'autofluorescence, c'est-à-dire après le début de la deuxième impulsion laser. In other words, the molecules already energized can not be active under the influence of photons of the second laser beam (in the example already selected: 750 nm) after the end of autofluorescence process, that is, ie after the beginning of the second laser pulse. Par contre, les photons du deuxième laser vont pouvoir être absorbés par les molécules de marqueur fluorescent et donner lieu à une émission de fluorescence (décalée spectralement et temporellement) que l'on souhaite observer et ces photons ne seront pas (ou peu) absorbés par les molécules qui contribuent 22 usuellement à l'autofluorescence. Against by the photons of the second laser will be absorbed by the fluorescent marker molecules and give rise to a fluorescence emission (shifted spectrally and temporally) that one wishes to observe and these photons will not (or little) absorbed by molecules that contribute usually 22 to autofluorescence. Le milieu environnant devient ainsi aveugle à la longueur d'onde d'excitation du fluorophore. The surrounding environment becomes blind to the fluorophore excitation wavelength. Il y a néanmoins une émission d'autofluorescence, car les molécules excitées par le premier faisceau finissent par donner lieu à une telle émission. Nevertheless, there autofluorescence emission because the molecules excited by the first beam end up giving rise to such issuance. Mais cette autofluorescence résiduelle peut être filtrée spectralement. But this residual autofluorescence can be filtered spectrally. Dans le cas de l'intralipide, l'autofluorescence résiduelle est située aux environs de 630 nm et est filtrée spectralement par exemple par filtre de type Chroma Z66OLP. In the case of Intralipid, residual autofluorescence is located at approximately 630 nm and is spectrally filtered for example by type Chroma Z66OLP filter. Ainsi, seule la fluorescence du fluorophore est détectable, l'autofluorescence ayant alors été considérablement réduite. Thus, only the fluorescence of the fluorophore is detectable, then the autofluorescence having been significantly reduced.

Si la densité d'énergie incidente et la durée d'irradiation du premier laser, éventuellement la fréquence des impulsions, sont suffisantes, il peut même se produire un phénomène qui est la saturation de l'état excité concerné des molécules du milieu environnant. If the incident energy density and duration of irradiation of the first laser, possibly the frequency of the pulses are sufficient, there may even occur a phenomenon which is the saturation of the excited molecules concerned surrounding environment state. Ce processus n'est pas en lui-même nécessairement destructif pour ces molécules, mais les effets de photoblanchiment et de photo-dégradation sont d'autant plus importants que l'intensité incidente est élevée (ce qui est voulu dans cette technique). This process is not in itself necessarily destructive of these molecules, but the effects of photobleaching and photo-degradation are even more important than the incident intensity is high (what is wanted in this technique). Les tissus, qui sont des tissus vivants, peuvent alors être endommagés, mais l'endommagement reste plus faible que dans le cas d'une biopsie, où il y a prélèvement de quelques centimètres de tissus. The fabrics, which are living tissue can then be damaged, but the damage remains lower than in the case of a biopsy, where there sampling a few centimeters of tissue. Un exemple de ce phénomène de saturation est traduit par la courbe de la figure 6, mesurée dans l'intralipide. An example of this saturation phenomenon is reflected in the curve of Figure 6, measured in intralipid. La valeur du seuil de puissance moyenne 23 avant saturation est d'environ 100 mW (flux de photons incident de 1020 photons/cm2/s).5 The value of the average power threshold 23 before saturation is about 100 mW (incident photon flux of 1020 photons / cm2 / s) .5

Claims (16)

  1. REVENDICATIONS1. REVENDICATIONS1. Procédé de détection d'au moins un marqueur fluorescent dans un milieu diffusant (20), dans lequel : a) on introduit au moins un marqueur fluorescent dans ce milieu diffusant, b) on réalise des excitations du milieu, à l'aide d'une pluralité de premières impulsions d'un premier faisceau d'excitation à au moins une première longueur d'onde et d'une pluralité de deuxièmes impulsions d'un deuxième faisceau d'excitation à au moins une deuxième longueur d'onde, différente d'au moins une longueur d'onde du premier faisceau, les premières et deuxièmes impulsions étant alternées, une deuxième impulsion étant séparée d'une première impulsion précédente d'une durée inférieure ou égale à la durée de déclin de l'autofluorescence du milieu diffusant, c) on détecte au moins un signal de fluorescence, résolu en temps, du marqueur fluorescent. A method of detecting at least one fluorescent marker in a scattering medium (20), wherein: a) introducing at least one fluorescent marker in this scattering medium, b) carrying out the excitations of the medium, with the aid of a plurality of first pulses of a first excitation beam to at least a first wavelength and a plurality of second pulses of a second excitation beam to at least a second wavelength, different from at least one beam of the first wavelength, the first and second pulses being alternated, a second pulse being separated from a first preceding pulse of a duration less than or equal to the decay time of the autofluorescence of the scattering medium c) detecting at least one fluorescence signal, time-resolved, the fluorescent label.
  2. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel les premier et deuxième faisceaux d'excitation sont décalés spectralement. 2. The method of claim 1, wherein the first and second excitation beams are shifted spectrally.
  3. 3. Procédé selon la revendication 1, dans lequel les premier et deuxième faisceaux d'excitation sont décalés spectralement d'une valeur au moins égale à 50 nm. 3. The method of claim 1, wherein the first and second excitation beams are spectrally offset by an amount at least equal to 50 nm.
  4. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, dans lequel chaque premier faisceau d'excitation a une longueur d'onde inférieure à la longueur d'onde de chaque deuxième faisceau d'excitation. 4. A method according to one of claims 1 to 3, wherein each first excitation beam has a wavelength less than the wavelength of each second excitation beam.
  5. 5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, dans lequel on réalise, à chaque impulsion du premier faisceau laser, une saturation d'un état excité de molécules du milieu diffusant. 5. A method according to one of claims 1 to 4, wherein is carried out at each pulse of the first laser beam, a saturation of an excited state of molecules of the scattering medium.
  6. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, dans lequel les premières impulsions et les deuxièmes impulsions sont envoyées vers le milieu diffusant par une même fibre optique (10). 6. A method according to one of claims 1 to 5, wherein the first pulses and the second pulses are supplied to the scattering medium by a single optical fiber (10). 15 15
  7. 7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, dans lequel au moins un marqueur fluorescent est situé à une distance d'une interface entre le milieu diffusant (20) et le milieu extérieur comprise entre 3 20 cm et 5 cm. 7. A method according to one of claims 1 to 6, wherein at least one fluorescent label is located at a distance of an interface between the scattering medium (20) and the external medium 20 between 3 cm and 5 cm.
  8. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, dans lequel le milieu diffusant est visqueux ou solide. 8. A method according to one of claims 1 to 7, wherein the scattering medium is viscous or solid.
  9. 9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, dans lequel on réalise en outre un filtrage d'au moins une partie du signal d'autofluorescence qui provient du milieu diffusant (20). 9. A method according to one of claims 1 to 8, wherein the filtering further there is provided a least a portion of the autofluorescence signal from said scattering medium (20). 10 25 30 26 October 25 30 26
  10. 10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, dans lequel on réalise en outre une image représentant la position d'au moins un marqueur fluorescent dans le milieu diffusant (20). 10. A method according to one of claims 1 to 9, wherein further is made an image representing the position of at least one fluorescent marker in the scattering medium (20).
  11. 11. Dispositif de tomographie de fluorescence résolue en temps d'un milieu diffusant (20), comportant : a) des moyens (8) formant source de rayonnement pour former des premières impulsions de rayonnement, à au moins une première longueur d'onde, b) des moyens (80) formant source de rayonnement pour former des deuxièmes impulsions de rayonnement à au moins une deuxième longueur d'onde, différente d'au moins une longueur d'onde du premier faisceau, les premières et deuxièmes impulsions étant alternées, c) des moyens (10) pour amener les premières et deuxièmes impulsions de rayonnement dans 20 un milieu diffusant (20), d) des moyens (4) pour détecter au moins un signal de fluorescence, résolu en temps, provenant du milieu étudié. 11. A tomography time-resolved fluorescence of a scattering medium (20), comprising: a) means (8) forming radiation source to form first radiation pulses, at least a first wavelength, b) means (80) forming a radiation source to form second radiation pulses to at least a second wavelength, different from at least one of the first beam wavelength, the first and second pulses being alternated, c) means (10) for causing the first and second radiation pulses in 20 a scattering medium (20), d) means (4) for detecting at least one fluorescence signal, time-resolved, from the analysis medium. 25 25
  12. 12. Dispositif selon la revendication 11, dans lequel les premier et deuxième faisceaux d'excitations sont décalés spectralement. 12. Device according to claim 11, wherein the first and second beams of excitations are shifted spectrally.
  13. 13. Dispositif selon la revendication 12, 30 dans lequel les premier et deuxième faisceaux d'excitations sont décalés spectralement d'au moins 50 nm. 13. Device according to claim 12, 30 wherein the first and second beams of excitations are shifted spectrally by at least 50 nm. 10 10
  14. 14. Dispositif selon l'une des revendications 11 à 13, dans lequel chaque premier faisceau d'excitation a une longueur d'onde inférieure à la longueur d'onde de chaque deuxième faisceau d'excitation. 14. Device according to one of claims 11 to 13, wherein each first excitation beam has a wavelength less than the wavelength of each second excitation beam.
  15. 15. Dispositif selon l'une des revendications 11 à 14, comportant en outre des moyens (16) de filtrage d'un signal de fluorescence. 15. Device according to one of claims 11 to 14, further comprising means (16) for filtering of a fluorescence signal.
  16. 16. Dispositif selon l'une des revendications 11 à 15, comportant des moyens (24, 26, 27) pour réaliser une image à partir de signaux de fluorescence, résolus en temps. 16. Device according to one of claims 11 to 15, comprising means (24, 26, 27) for making an image from fluorescence signals resolved in time. 15 15
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