FR2931557A1 - METHOD FOR DETERMINING THE HEMOGLOBIN RATE, DIGITIZING AND DIFFERENTIATING WHITE GLOBES AND ADAPTED MEDIA - Google Patents
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Abstract
L'invention concerne un procédé de détermination, dans un échantillon sanguin, du taux d'hémoglobine, de numération et de différenciation des globules blancs, comprenant les étapes suivantes : On met l'échantillon sanguin dans un milieu isotonique ou hyperosmolaire, à un pH n'excédant pas 10, en l'absence d'ions cyanure et comprenant au moins un sel d'ammonium quaternaire et un agent bactériostatique, On détecte le complexe formé entre l'hémoglobine et les groupes d'ammonium quaternaire, par spectrophotométrie, et On dénombre les globules; blancs et on les différencie en au moins trois sous-populations. L'invention concerne aussi un milieu pour mettre en oeuvre le procédé.The invention relates to a method for determining, in a blood sample, the hemoglobin count, count and differentiation of white blood cells, comprising the following steps: The blood sample is placed in an isotonic or hyperosmolar medium, at a pH value not exceeding 10, in the absence of cyanide ions and comprising at least one quaternary ammonium salt and a bacteriostatic agent, the complex formed between hemoglobin and the quaternary ammonium groups is detected by spectrophotometry, and We count the globules; and differentiate into at least three subpopulations. The invention also relates to a medium for implementing the method.
Description
L'invention concerne un procédé et un milieu de réaction pour, à la fois, déterminer sans produit toxique tel que le cyanure le taux d'hémoglobine, dénombrer et différencier les globules blancs (GB) sur une même dilution d'un échantillon sanguin. Les méthodes traditionnelles de mesure de l'hémoglobine reposaient sur la détection en spectrophotométrie à 540 nm, d'un complexe chromogène formé entre des ions cyanures et l'hémoglobine sous une forme oxydée, la méthémoglobine. L'échantillon sanguin à analyser était exposé à un milieu de réaction aqueux contenant des sels de cyanure (cyanure de potassium) et des sels de ferricyanure (ferricyanure de potassium ou de sodium). En milieu aqueux, les globules rouges (GR) sont lysés, l'hémoglobine est oxydée en méthémoglobine par les ions ferricyanure et cyanures, lesquels possèdent une forte affinité vis-à-vis de l'hème ; ils forment un complexe cyanméthémoglobine, dont le maximum d'absorbance est à 540nm. La mesure de l'hémoglobine est faite par spectrophotométrie. Par la suite, pour accélérer la lyse des GR, un sel d'ammonium quaternaire a été ajouté en faible concentration au milieu réactionnel. On s'est cependant heurté à un problème d'agglutination des complexes formés entre les ions ferrocyanures et les groupes ammonium quaternaire ; ces agglutinats présentent une turbidimétrie qui gêne la mesure photométrique de l'hémoglobine. Pour cette raison, les sels de ferricyanure ont été abandonnés, alors que le sel de cyanure est conservé. The invention relates to a method and a reaction medium for simultaneously determining, without a toxic product such as cyanide, the hemoglobin level, counting and differentiating white blood cells (GB) on the same dilution of a blood sample. Traditional methods of measuring hemoglobin were based on spectrophotometric detection at 540 nm of a chromogenic complex formed between cyanide ions and hemoglobin in an oxidized form, methemoglobin. The blood sample to be analyzed was exposed to an aqueous reaction medium containing cyanide salts (potassium cyanide) and ferricyanide salts (potassium ferricyanide or sodium). In an aqueous medium, red blood cells (RBCs) are lysed, hemoglobin is oxidized to methemoglobin by ferricyanide and cyanide ions, which have a high affinity for heme; they form a cyanmethemoglobin complex, whose maximum absorbance is at 540 nm. The measurement of hemoglobin is made by spectrophotometry. Subsequently, to accelerate the lysis of the GR, a quaternary ammonium salt was added in low concentration to the reaction medium. However, there was a problem of agglutination of the complexes formed between the ferrocyanide ions and the quaternary ammonium groups; these agglutinates have a turbidimetry which hinders the photometric measurement of hemoglobin. For this reason, the ferricyanide salts have been abandoned, while the cyanide salt is retained.
Des automates ont été développés pour analyser rapidement l'hémoglobine, le nombre de GR et de GB dans les échantillons sanguins. Les milieux de réaction ont dû aussi évoluer parallèlement ; pour compter les GR et les GB, on est passé d'un diluant aqueux à un diluant isotonique ou faiblement hyperosmolaire. Dans ces conditions, il a été nécessaire d'augmenter la concentration en ammonium quaternaire pour lyser les GR. Ces techniques présentent l'inconvénient majeur d'impliquer des ions cyanure, toxiques. Des méthodes ne nécessitant plus d'ions cyanure ont été mises au point. Automata have been developed to quickly analyze hemoglobin, the number of RBCs and GBs in blood samples. The reaction media also had to evolve in parallel; to count the GRs and GBs, we went from an aqueous diluent to an isotonic diluent or weakly hyperosmolar diluent. Under these conditions, it was necessary to increase the quaternary ammonium concentration to lyse the RBCs. These techniques have the major disadvantage of involving cyanide ions, toxic. Methods no longer requiring cyanide ions have been developed.
I. Oshiro et al. Clin. Biochem. 15(1) 83-88 (1982), proposent un procédé de détermination du taux d'hémoglobine dans un échantillon sanguin, mettant en jeu du lauryl sulfate de sodium (SLS), en l'absence de tout ion cyanure. Le SLS mis au contact de l'échantillon provoque l'hémolyse des GR, entraîne la conversion de l'hémoglobine en méthémoglobine par oxydation de l'atome de fer. Le complexe stable formé est détecté en spectrophotométrie d'absorption. Le SLS, même aux concentrations les plus faibles indiquées, provoque une lyse de l'ensemble des cellules, y compris des GB qui sont réduits à l'état de noyaux. Cette méthode utilise une forte dilution qui ne permet pas le comptage des GB avec une imprécision acceptable pour un temps de comptage limité. En outre le dénombrement différentiel n'est pas accessible. I. Oshiro et al. Clin. Biochem. 15 (1) 83-88 (1982), propose a method for determining the level of hemoglobin in a blood sample involving sodium lauryl sulfate (SLS) in the absence of any cyanide ion. The SLS brought into contact with the sample causes hemolysis of the RBCs, leads to the conversion of hemoglobin to methemoglobin by oxidation of the iron atom. The stable complex formed is detected in absorption spectrophotometry. SLS, even at the lowest concentrations indicated, causes lysis of all cells, including GBs which are reduced to nuclei. This method uses a high dilution which does not allow the counting of GB with an acceptable inaccuracy for a limited counting time. In addition, the differential count is not accessible.
Le document US5468640A décrit un procédé rapide de détermination du taux d'hémoglobine, dans un échantillon sanguin, selon lequel on met ledit échantillon au contact d'un milieu de réaction, à un pH de 11,3-13,7, comprenant un tensioactif ionique, également exempt de tout ion cyanure. Soit le tensioactif est aussi une base forte, comme l'hydroxyde de stéaryltrialkylammonium, et il confère le pH requis au milieu, soit il n'est pas une base forte, par exemple le bromure de cétyltriméthylammonium (CTAB), et une base forte doit être ajoutée, par exemple un hydroxyde de métal alcalin. Après hémolyse des GR par le tensioactif, l'action de ce dernier et de celle de la base forte entraînent la dénaturation de l'hémoglobine, l'exposition des hèmes de l'hémoglobine à l'oxygène ,de l'air provoquant l'oxydation de l'atome de fer. Le complexe formé entre les hèmes ferriques et les ions hydroxyde est détecté en spectrophotométrie d'absorption. Comme le procédé précédemment décrit, cette méthode ne permet pas de déterminer la différenciation des GB, car les conditions drastiques provoquent inévitablement leur lyse à l'état de noyaux. Le document US6740527A divulgue un procédé de détermination du taux d'hémoglobine d'un échantillon sanguin, toujours dépourvu d'ion cyanure, qui permet en outre de donner une numération des GB. L'échantillon est d'abord dilué, puis mis en contact avec un milieu de réaction qui comprend un agent de lyse consistant en 0,1-20% en poids d'au moins un sel d'ammonium quaternaire et 0,1-15% en poids d'un sel d'hydroxylamine. Cette méthode permet de mesurer le taux d'hémoglobine et de dénombrer les GB, mais il ne permet pas de différencier ces derniers. Déterminer le taux d'hémoglobine, le nombre de GB et la différenciation des GB avec un seul agent de lyse sur un analyseur automatique d'hématologie permet de réduire le nombre de réactifs utilisés et de simplifier l'organisation fluidique de l'analyseur. Ce sont des facteurs de robustesse du système et de réduction des coûts de fabrication et de fonctionnement. L'invention apporte un procédé simple permettant, dans le même échantillon sanguin, à la fois de déterminer le taux d'hémoglobine, et de dénombrer et différencier les GB. Ce procédé met en jeu les techniques de lecture et de mesure classiquement employées dans le domaine de la formulation sanguine et n'implique aucune entité chimique toxique, comme les ions cyanures par exemple. US5468640A discloses a rapid method for determining the level of hemoglobin in a blood sample, wherein said sample is contacted with a reaction medium at a pH of 11.3-13.7 comprising a surfactant ionic, also free of any cyanide ion. Either the surfactant is also a strong base, such as stearyltrialkylammonium hydroxide, and it imparts the required pH to the medium, or it is not a strong base, for example cetyltrimethylammonium bromide (CTAB), and a strong base must to be added, for example an alkali metal hydroxide. After hemolysis of the RBCs by the surfactant, the action of the latter and that of the strong base cause the denaturation of hemoglobin, the exposure of heme hemoglobin to oxygen, the air causing the oxidation of the iron atom. The complex formed between ferric heme and hydroxide ion is detected in absorption spectrophotometry. Like the previously described method, this method does not make it possible to determine the differentiation of the GBs, because the drastic conditions inevitably cause their lysis in the state of nuclei. US6740527A discloses a method for determining the hemoglobin level of a blood sample, still devoid of cyanide ion, which further allows to give a count of GB. The sample is first diluted and then contacted with a reaction medium which comprises a lysing agent consisting of 0.1-20% by weight of at least one quaternary ammonium salt and 0.1-15% by weight. % by weight of a hydroxylamine salt. This method makes it possible to measure the hemoglobin level and to count the GB, but it does not make it possible to differentiate them. Determining the hemoglobin level, the number of GB and the differentiation of GB with a single lysing agent on an automatic hematology analyzer makes it possible to reduce the number of reagents used and to simplify the fluid organization of the analyzer. These are factors of robustness of the system and reduction of manufacturing and operating costs. The invention provides a simple method for determining, in the same blood sample, both hemoglobin levels and for counting and differentiating GB. This method involves the reading and measurement techniques conventionally used in the field of blood formulation and does not involve any toxic chemical entity, such as cyanide ions for example.
Le procédé de l'invention comprend les étapes suivantes : On met l'échantillon sanguin au contact d'un milieu isotonique ou hyperosmolaire, à un pH n'excédant pas 10, dépourvu d'ions cyanure, et comprenant au moins un sel d'ammonium quaternaire et au moins un agent bactériostatique. The method of the invention comprises the following steps: The blood sample is brought into contact with an isotonic or hyperosmolar medium, at a pH not exceeding 10, free of cyanide ions, and comprising at least one salt of quaternary ammonium and at least one bacteriostatic agent.
On détecte le complexe formé entre l'hémoglobine et les groupes d'ammonium quaternaire, par spectrophotométrie, et On dénombre les GB et on les différencie en au moins trois sous populations. Pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention, le ou les sels 20 d'ammonium quaternaire répondent avantageusement aux caractéristiques suivantes, considérées seules ou en combinaison : Le ou les sels d'ammonium quaternaire sont choisis parmi les composés de formule (I) NR1 R2R3R4* X dans laquelle R1 représente une chaîne hydrocarbonée ayant de 1 à 18 atomes 25 de carbone, R2, R3 et R4 représente chacun, indépendamment, un groupe alkyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone, et X représente un halogène ou un groupe choisi parmi OH, CH3SO4 et PO4. 30 R1 peut représenter une chaîne hydrocarbonée ayant de 10 à 18 atomes de carbone et alors le ou lesdits sels sont de préférence choisis parmi les sels de dodécyltriméthylammonium, de myristyltriméthyl ammonium, de palmityltriméthyl ammonium et de stéaryltriméthylammonium. R1 peut aussi représenter une chaîne hydrocarbonée ayant de 1 à 35 6 atomes de carbone, et le ou lesdits sels sont de préférence choisis parmi les sels de tétraéthyl ammonium. The complex formed between hemoglobin and quaternary ammonium groups is detected spectrophotometrically and GB is counted and differentiated into at least three subpopulations. In carrying out the process of the invention, the quaternary ammonium salt or salts advantageously have the following characteristics, taken alone or in combination: The quaternary ammonium salt (s) are chosen from compounds of formula (I) NR1 R2R3R4 * X wherein R1 represents a hydrocarbon chain having from 1 to 18 carbon atoms, R2, R3 and R4 each independently represents an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and X represents a halogen or a group selected from OH, CH3SO4 and PO4. R 1 can represent a hydrocarbon chain having from 10 to 18 carbon atoms and then the said salt or salts are preferably chosen from the salts of dodecyltrimethylammonium, myristyltrimethylammonium, palmityltrimethylammonium and stearyltrimethylammonium. R 1 can also represent a hydrocarbon chain having from 1 to 6 carbon atoms, and said salt or salts are preferably chosen from tetraethyl ammonium salts.
Bien entendu, selon l'invention, ledit milieu peut comprendre plusieurs sels d'ammonium quaternaire, en particulier plusieurs sels de formule (I), et par exemple un ou des sels de formule (I) où R1 est une chaîne en C10-C18 et/ou un ou des sels de formule (I) où R1 est une chaîne en C1-C6. Of course, according to the invention, said medium may comprise several quaternary ammonium salts, in particular several salts of formula (I), and for example one or more salts of formula (I) in which R1 is a C10-C18 chain. and / or one or more salts of formula (I) in which R1 is a C1-C6 chain.
Des sels particulièrement adaptés sont choisis parmi le bromure de myristyltriméthyl ammonium, le chlorure de dodécyltriméthyl ammonium et l'hydroxyde de tétraéthylammonium, employés seuls ou en mélange. Par rapport au poids du milieu, la proportion du ou des sels d'ammonium quaternaire varie de 2 à 4% en poids. Particularly suitable salts are chosen from myristyltrimethylammonium bromide, dodecyltrimethylammonium chloride and tetraethylammonium hydroxide, used alone or as a mixture. With respect to the weight of the medium, the proportion of the quaternary ammonium salt or salts varies from 2 to 4% by weight.
Comme dit précédemment, le milieu comprend un ou des agents bactériostatiques de préférence choisis parmi le diméthylurée et le 2-pyridinethiol-1-oxyde de sodium. Le milieu peut en outre contenir d'autres ingrédients : un agent stabilisateur, par exemple l'acide éthylène diamine tétra acétique (EDTA), au moins un tensioactif non ionique, tel que le Triton . Le taux d'hémoglobine peut être mesuré par les techniques classiques de spectrophotométrie. Le dénombrement des GB est effectué par une méthode elle aussi classique basée par exemple sur le principe d'impédance qui, selon le procédé de l'invention, permet aussi de différencier les GB en au moins les trois sous-populations suivantes : les lymphocytes, les cellules monocytaires (autres que les lymphocytes) et les granulocytes. Selon une variante du procédé de l'invention, le milieu contient au moins un sel d'ammonium quaternaire de formule (I) dans laquelle R1 représente une chaîne hydrocarbonée de 12 atomes de carbone et un autre sel d'ammonium quaternaire de formule (I) dans laquelle R1 représente une chaîne hydrocarbonée de 14 atomes de carbone. Dans ces conditions, et associées à une méthode biparamétrique d'impédance et de mesure laser aux grands angles, elle aussi classique, on peut différencier au moins les quatre sous-populations suivantes : les lymphocytes, les monocytes, les granulocytes éosinophiles et les granulocytes neutrophiles. Le milieu peut aussi comprendre jusqu'à trois sels d'ammonium quaternaire, voire plus. Selon une mise en oeuvre préférée du procédé, l'échantillon sanguin est dilué en milieu légèrement hyperosmolaire et tamponné à pH neutre. Un pH supérieur à 10 provoque une lyse partielle des GB empêchant leur comptage différentiel. L'invention concerne aussi un milieu pour la détermination du taux d'hémoglobine et pour le dénombrement et la différentiation des globules blancs, ledit milieu étant exempt d'ions cyanure, et comprenant au moins un sel d'ammonium quaternaire. Celui-ci est avantageusement choisi parmi les composés de formule I, NR1 R2R3R4+ X- dans laquelle R1 représente une chaîne hydrocarbonée ayant de 1 à 18 atomes de carbone R2, R3 et R4 représente chacun, indépendamment, un groupe alkyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone, et X représente un halogène ou un groupe choisi parmi OH, CH3SO4 et PO4, et un agent bactériostatique. As stated above, the medium comprises one or more bacteriostatic agents preferably chosen from dimethylurea and 2-pyridinethiol-1-sodium oxide. The medium may also contain other ingredients: a stabilizing agent, for example ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA), at least one nonionic surfactant, such as Triton. The hemoglobin level can be measured by standard spectrophotometric techniques. The enumeration of GB is carried out by a conventional method also based for example on the principle of impedance which, according to the method of the invention, also makes it possible to differentiate GB in at least the following three sub-populations: lymphocytes, monocytic cells (other than lymphocytes) and granulocytes. According to a variant of the process of the invention, the medium contains at least one quaternary ammonium salt of formula (I) in which R 1 represents a hydrocarbon chain of 12 carbon atoms and another quaternary ammonium salt of formula (I ) in which R 1 represents a hydrocarbon chain of 14 carbon atoms. Under these conditions, and associated with a biparametric method of impedance and laser measurement at large angles, also conventional, we can differentiate at least the following four sub-populations: lymphocytes, monocytes, eosinophilic granulocytes and neutrophilic granulocytes . The medium may also comprise up to three quaternary ammonium salts, or even more. According to a preferred implementation of the method, the blood sample is diluted in slightly hyperosmolar medium and buffered at neutral pH. A pH greater than 10 causes partial lysis of GBs preventing their differential counting. The invention also relates to a medium for the determination of hemoglobin level and for enumeration and differentiation of white blood cells, said medium being free of cyanide ions, and comprising at least one quaternary ammonium salt. This is advantageously chosen from the compounds of formula I, NR1 R2R3R4 + X- in which R1 represents a hydrocarbon chain having from 1 to 18 carbon atoms R2, R3 and R4 each independently represent an alkyl group having from 1 to 6 carbon atoms, and X represents a halogen or a group selected from OH, CH3SO4 and PO4, and a bacteriostatic agent.
Ce milieu est avantageusement celui décrit précédemment et en présente les mêmes caractéristiques, considérées seules ou en combinaison. Un milieu préféré comprend les sels d'ammonium quaternaire suivants : le bromure de myristyltriméthyl ammonium, le chlorure de dodécyltriméthyl ammonium, l'hydroxyde de tétraéthylammonium. This medium is advantageously that described above and has the same characteristics, considered alone or in combination. A preferred medium comprises the following quaternary ammonium salts: myristyltrimethylammonium bromide, dodecyltrimethylammonium chloride, tetraethylammonium hydroxide.
Avantageusement, la proportion du bromure de myristyltriméthyl ammonium varie de 20-40 g/L, celle du chlorure de dodécyltriméthyl ammonium de 1-10 g/L et celle de l'hydroxyde de tétraéthylammonium de 1-5 g/L. Il peut en outre comprendre au moins un agent bactériostatique de préférence choisi parmi le diméthylurée et le 2-pyridinethiol-1-oxyde de sodium. Advantageously, the proportion of myristyltrimethylammonium bromide ranges from 20-40 g / l, that of dodecyltrimethylammonium chloride of 1-10 g / l and that of tetraethylammonium hydroxide from 1-5 g / l. It may further comprise at least one bacteriostatic agent preferably chosen from dimethylurea and 2-pyridinethiol-1-sodium oxide.
La proportion de diméthylurée y varie de 1-10 g/L et celle du le 2-pyridinethiol- 1-oxyde de sodium de 1-10 g/L. II peut encore comprendre un agent stabilisateur, tel que l'acide éthylène diamine tétra acétique (EDTA), dont la proportion varie de préférence de 1-10 g/L. The proportion of dimethylurea varies from 1-10 g / l and that of 2-pyridinethiol-1-sodium oxide from 1-10 g / l. It may also comprise a stabilizing agent, such as ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA), the proportion of which preferably varies from 1-10 g / l.
Comme dit précédemment, ce milieu est avantageusement isotonique ou hyperosmolaire, de préférence légèrement hyperosmolaire. Les objets de l'invention sont exposés plus en détails et illustrés dans les exemples ci-après.35 Exemple 1 : formulation d'un milieu selon l'invention Le milieu approprié comprend un diluant et un agent de lyse et de réaction, comme suit : En tant que diluant, une solution aqueuse composée de : un tampon organique phosphate, par exemple hydrogénophosphate de sodium ou phosphate disodique anhydre un stabilisateur des membranes, par exemple chlorure ou sulfate de sodium des agents bactériostatiques, par exemple diméthylurée et 2-pyridinethiol-1-oxyde de sodium un agent stabilisant par exemple EDTA disodique (EDTA.Na2) et en tant qu'agent de lyse, une solution aqueuse composée de : un mélange de bromure de myristyltriméthyl ammonium, chlorure de dodécyltriméthyl ammonium et hydroxyde de tétraéthylammonium, Triton , en tant que tensioactif non ionique, chlorure de sodium en tant que stabilisateur des membranes, identique ou différent de celui du diluant, et l'eau désionisée. Le diluant a une osmolarité comprise entre 320-360 mOsm/Kg à pH neutre et l'agent de lyse a un pH de 10,5 +1- 0.4. Le milieu réactionnel obtenu a un pH proche de 8. As said above, this medium is advantageously isotonic or hyperosmolar, preferably slightly hyperosmolar. The objects of the invention are described in more detail and illustrated in the examples below. EXAMPLE 1 Formulation of a Medium According to the Invention The appropriate medium comprises a diluent and a lysing and reaction agent, as follows As the diluent, an aqueous solution composed of: an organic phosphate buffer, for example sodium hydrogen phosphate or disodium phosphate anhydrous membrane stabilizer, for example sodium chloride or sodium sulfate bacteriostatic agents, for example dimethylurea and 2-pyridinethiol- 1-sodium oxide a stabilizing agent, for example disodium EDTA (EDTA.Na 2) and as lysing agent, an aqueous solution composed of: a mixture of myristyltrimethylammonium bromide, dodecyltrimethylammonium chloride and tetraethylammonium hydroxide, Triton , as a nonionic surfactant, sodium chloride as a membrane stabilizer, the same or different from that of the diluent, and the deionized water ised. The diluent has an osmolarity of 320-360 mOsm / Kg at neutral pH and the lysing agent has a pH of 10.5 ± 0.4. The reaction medium obtained has a pH close to 8.
Exemple 2 : mise en oeuvre du procédé sur un analyseur dit 3 populations Préparation de l'échantilllon sanguin : Environ 16 pl de sang sont prélevés du tube où l'échantillon a été recueilli. L'aiguille est rincée intérieurement et extérieurement avec du diluant, au-dessus de la cuvette de rinçage. Ensuite, 3,5 ml du diluant décrit à l'exemple 1 sont ajoutés pour obtenir une première dilution (1/219). Une seconde dilution est faite avec 31,2pl de cette première dilution et 4ml du diluant (1/128). Les dilutions sont transférées par vide vers les chambres de comptage. Pendant la dilution des GR, 0,41 ml d'agent de lyse est ajouté à la première dilution dans la chambre de comptage des GB. La dilution finale est d'environ 1/244 pour les GB et de 1/28200 pour les GR/Plaquettes. Une fois les transferts effectués, les cuvettes de dilution sont remplies de diluant pour les rincer. Example 2: Implementation of the method on a 3-population analyzer Preparation of the blood sample: About 16 μl of blood are taken from the tube where the sample was collected. The needle is rinsed internally and externally with thinner, above the rinsing bowl. Then 3.5 ml of the diluent described in Example 1 is added to obtain a first dilution (1/219). A second dilution is made with 31.2 μl of this first dilution and 4 ml of the diluent (1/128). The dilutions are transferred by vacuum to the counting chambers. During the dilution of the RBCs, 0.41 ml of lysing agent is added at the first dilution in the GB counting chamber. The final dilution is about 1/244 for GB and 1/28200 for GR / Platelets. Once the transfers are made, the dilution cuvettes are filled with diluent to rinse them.
Comptages : Une séquence de comptage est effectuée comme suit : 18Opl de la première dilution sont mesurés volumétriquement pour dénombrer les GB alors que 100pI environ de la seconde dilution sont mesurés pour les GR/Plaquettes. Le volume de la dilution des GB est contrôlé par deux barrières optiques dans un tube volumétrique. Pendant le comptage volumétrique, les données sont réparties dans 4 tables de 2 secondes chacune pour une utilisation statistique. Counting: A counting sequence is performed as follows: 18Op1 of the first dilution is measured volumetrically to count the GB while about 100pI of the second dilution is measured for RBCs / Platelets. The dilution volume of the GB is controlled by two optical barriers in a volumetric tube. During the volumetric count, the data is divided into 4 tables of 2 seconds each for statistical use.
Le comptage GR/Plaquettes débute avec le comptage des GB et s'arrête exactement après 8 secondes. Différenciation en trois populations de GB : Les différentes sous-populations de GB sont différenciées sur des critères de taille en contrôlant les conditions de lyse (diluant, agent de lyse, temps d'action). Quand ces conditions sont réunies, la réaction chimique qui s'effectue permet de distinguer trois populations de GB : les lymphocytes, les granulocytes et les cellules de taille moyenne (basophiles + monocytes + une partie des éosinophiles + de jeunes granulocytes). Après le processus de lyse, les lymphocytes sont les plus petites cellules avec leur petit noyau et corrèlent avec les cellules comprises entre 25 et 90 5 fL (paramétrable) sur l'histogramme de distribution des GB (en mode humain) non représenté. Les cellules moyennes se trouvent dans la région située entre les lymphocytes et les granulocytes. GR / Platelet counting starts with GB counting and stops exactly after 8 seconds. Differentiation into three populations of GB: The different subpopulations of GB are differentiated on size criteria by controlling the lysis conditions (diluent, lysing agent, time of action). When these conditions are met, the chemical reaction that takes place makes it possible to distinguish three populations of GB: lymphocytes, granulocytes and medium-sized cells (basophils + monocytes + a part of eosinophils + young granulocytes). After the lysis process, the lymphocytes are the smallest cells with their small nucleus and correlate with the cells between 25 and 90 μL (parameterizable) on the histogram of distribution of GB (in human mode) not shown. The average cells are in the region between lymphocytes and granulocytes.
Après action de la lyse, elles sont corrélées avec les cellules entre 90 5 et 140 5 fL (modifiable) sur l'histogramme de distribution des GB, non représenté. Certains éosinophiles peuvent cependant dépasser 220 fL. Les granulocytes neutrophiles, après action de la lyse, sont les plus grosses cellules avec leurs noyaux polysegmentés retenant une partie du cytoplasme. Les neutrophiles sont corrélés avec les cellules entre 140 10 et 449 fL sur l'histogramme de distribution des GB, non représenté. Hémoglobine La source lumineuse, une diode électroluminescente (LED) verte (555 nm), permet de calculer l'absorbance qui est proportionnelle à la concentration en hémoglobine de l'échantillon. Le trajet optique est déterminé par deux conduits optiques dans la chambre des GB. La référence Hb est mémorisée pendant la mise en route ou quand la chambre est remplie de diluant. After lysis action, they are correlated with cells between 90 and 140 fL (modifiable) on the GB distribution histogram, not shown. Some eosinophils may, however, exceed 220 fL. Neutrophilic granulocytes, after the action of lysis, are the largest cells with their polysegmented nuclei retaining part of the cytoplasm. Neutrophils are correlated with cells between 140 and 449 fL on the GB distribution histogram, not shown. Hemoglobin The light source, a green light emitting diode (LED) (555 nm), calculates the absorbance that is proportional to the hemoglobin concentration of the sample. The optical path is determined by two optical paths in the GB chamber. The reference Hb is stored during start-up or when the chamber is filled with thinner.
Exemple 3 : Mise en oeuvre du procédé sur un analyseur au moins 4 populations Préparation de l'échantilllon sanguin : 150pL de sang sont prélevés du tube où le sang a été recueilli au préalable. La colonne de sang est aspirée par l'analyseur à travers une vanne céramique où 25 1 pL sont échantillonnés pour former une première dilution au 1/72 environ avec 1800pL de diluant faiblement hypertonique à pH neutre. Une seconde dilution est faite en cascade avec 25 1 pL et environ 2mL de diluant afin de mesure au 1/6000 GR et Plaquettes. 475pL de la prédilution sont repris avec 210pL d'agent de lyse et 1440pL du diluant environ pour obtenir une dilution finale au 1/251. Example 3: Implementation of the method on an analyzer at least 4 populations Preparation of the blood sample: 150 μL of blood are taken from the tube where the blood was collected beforehand. The blood column is aspirated by the analyzer through a ceramic valve where 25 μL are sampled to form a first dilution at about 1:72 with 1800 μL of low pH neutral hypertensive diluent. A second dilution is made in cascade with 1 μL and about 2 mL of diluent for measurement at 1/6000 GR and platelets. 475 μl of the predilution are taken up with 210 μl of lysing agent and 1440 μl of the diluent approximately to obtain a final dilution at 1/251.
Mesures : L'hémoglobine est mesurée à 560nm directement dans la cuve de préparation des GB au bout de 15 secondes. Cette dilution GB/Hb au 1/251 est ensuite transférée dans un cytomètre où 267pL sont injectés au travers d'un micro orifice de 75pm et d'un faisceau laser focalisé à proximité, dans une architecture à double flux hydrodynamique. Ce double dispositif de mesure d'impédance électrique et de mesure laser aux grands angles permet de dénombrer les GB et de déterminer au moins 4 sous populations leucocytaires : lymphocytes, monocytes, granulocytes érythrocytaires, granulocytes neutrophiles, mais également la mise en évidence du plasmodium vivax, le signalement d'agglutinats plaquettaires ou de GR nucléés. 67 pL de la dilution au 1/6000 sont à leur tour transférés et injectés au travers d'un micro orifice de 75pm dans une architecture à double flux hydrodynamique pour le comptage des GR et des plaquettes.30 Measurements: Hemoglobin is measured at 560nm directly in the GB preparation tank after 15 seconds. This 1/251 GB / Hb dilution is then transferred to a cytometer where 267 μL are injected through a 75 μm micro-orifice and a nearby focused laser beam in a hydrodynamic double-flow architecture. This double device for measuring electrical impedance and laser measurement at large angles makes it possible to count GB and to determine at least 4 sub-leukocyte populations: lymphocytes, monocytes, erythrocyte granulocytes, neutrophil granulocytes, but also the detection of plasmodium vivax. , reported platelet agglutinates or GR nucleated. 67 μl of the 1/6000 dilution are in turn transferred and injected through a 75 μm micro-orifice into a hydrodynamic double-flow architecture for the counting of GRs and platelets.
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