FR2924614A1 - Utilisation cosmetique de proteines de type calgranuline a. - Google Patents

Abstract

La présente invention a pour objet l'utilisation, notamment cosmétique et/ou thérapeutique, de la calgranuline A, de polypeptides dérivés de cette protéine ou d'analogues de ceux-ci, d'une séquence nucléique codant pour un tel polypeptide ou d'un agent modulateur de l'activité ou de l'expression d'un tel polypeptide, notamment pour stimuler la différenciation épithéliale terminale.L'invention concerne également l'utilisation de la calgranuline A, de polypeptides dérivés de cette protéine ou d'analogues de ceux-ci, ou d'une séquence nucléique codant pour un tel polypeptide à titre de marqueur pour l'évaluation d'un état d'un épithélium.

Description

La présente invention a pour objet l'utilisation, notamment cosmétique et/ou thérapeutique, de la calgranuline A, de polypeptides dérivés de cette protéine, par exemple issus de sa protéolyse, ou d'analogues de ceux-ci, d'une séquence nucléique codant pour un tel polypeptide ou d'un agent modulateur de l'activité ou de l'expression d'un tel polypeptide, notamment pour stimuler la différenciation épithéliale terminale. L'invention concerne également l'utilisation de la calgranuline A, de polypeptides dérivés de cette protéine ou d'analogues de ceux-ci, ou d'une séquence nucléique codant pour un tel polypeptide à titre de marqueur pour l'évaluation d'un état d'un épithélium, et notamment de l'épiderme.

Les épithéliums sont des tissus dont les cellules sont jointives et solidaires les unes des autres et reposent sur une membrane basale. Ils forment un revêtement soit externe, par exemple en surface de la peau, ou l'épiderme, soit interne, en surface d'une muqueuse. Ils peuvent également former des glandes. Plus précisément, ces épithéliums sont des structures dont l'homéostasie résulte de la mise en oeuvre d'un ensemble, finement régulé, de signaux intracellulaires et extracellulaires agissant à toutes les étapes de la prolifération, de la migration, de la différenciation cellulaire, ainsi que de la synthèse des différents composants de la matrice extracellulaire. Ces signaux peuvent, notamment, résulter de l'action de facteurs produits par des kératinocytes.

Le maintien des bonnes fonctions physiologiques d'un épithélium implique notamment la différenciation épithéliale terminale et/ou la synthèse de protéoglycannes. En ce qui concerne plus particulièrement l'épiderme, il s'agit d'un épithélium, conventionnellement divisé en une couche basale de kératinocytes contenant, notamment, des cellules souches cutanées et constituant la couche germinative de l'épiderme, une couche dite épineuse constituée de plusieurs couches de cellules polyhédriques disposées sur la couche basale, une couche dite granuleuse comprenant une à trois couches dites de cellules aplaties contenant des inclusions cytoplasmiques distinctes, les grains de kératohyaline, et enfin, un ensemble de couches supérieures, appelé couche cornée (ou stratum corneum) constituée de kératinocytes au stade terminal de leur différenciation appelés cornéocytes. Le stratum corneum, la partie la plus externe de la peau qui assure la fonction barrière entre l'organisme et l'environnement, et la tige pilaire, partie émergente du follicule pileux qui constitue la chevelure, représentent tous deux l'aboutissement du processus de différenciation des kératinocytes. La différenciation épidermique suit un processus de maturation dans lequel des kératinocytes de la couche basale se différencient et migrent pour aboutir à la formation des cornéocytes, cellules mortes totalement kératinisées. Cette différenciation est la résultante de phénomènes parfaitement coordonnés qui vont conduire au maintien d'une épaisseur constante et assurer ainsi l'homéostasie de l'épiderme. De nombreux troubles ou pathologies cutanées peuvent résulter d'un dysfonctionnement de l'homéostasie de l'épiderme, et notamment de la différenciation 10 épithéliale terminale des kératinocytes. Ainsi, les principales modifications concernant l'épiderme sont une diminution de la différenciation des kératinocytes entraînant un déficit de la matrice protéique de la cellule cornée, une augmentation des métalloprotéinases, protéases dégradant la matrice extracellulaire et qui participent au vieillissement cutané, ainsi qu'à une diminution de la 15 synthèse des différents glycosaminoglycannes. Par exemple, dans le cas de la peau âgée, ce dysfonctionnement se manifeste généralement par l'apparition de rides (micro-relief et rides profondes), une perte de l'élasticité, par un toucher rugueux et par une sécheresse. Sur le plan histologique, un aplatissement de la jonction dermo-épidermique et une diminution d'épaisseur du derme et 20 de l'épiderme sont observés. Le contenu en collagène et en glycosaminoglycannes diminue. La fonction barrière de la peau est altérée. L'ensemble de ces phénomènes est accru par l'exposition solaire chronique. De même, ce dysfonctionnement peut être exacerbé chez les femmes lors de la ménopause. 25 On sait déjà qu'au cours des différentes étapes de différenciation des kératinocytes interviennent plusieurs familles de protéines ayant chacune une fonction spécifique. Parmi elles, les protéases jouent un rôle primordial dans la desquamation, c'est-à-dire dans l'élimination des cornéocytes à la surface de l'épiderme, et les transglutaminases participent à la réticulation des protéines qui vont former l'enveloppe 30 cornée de la peau et de la tige pilaire. La présente invention résulte particulièrement de la caractérisation par les inventeurs de l'expression de la protéine calgranuline A, encore dénommée MRP8, dans le stratum corneum de l'épiderme humain, en particulier dans un épiderme humain sec et âgé. La protéine calgranuline A appartient à la famille des protéines de liaison au calcium S100, et est également dénommée S 100A8. C'est une protéine dont la forme précurseur comprend 93 résidus d'acide aminés SEQ ID NO 2 dont le poids moléculaire apparent est de 8 kDa. Sa structure comprend notamment deux sites de fixation du calcium de type domaine EF-hand . Elle existe sous forme dimérique, ainsi que sous forme multimérique avec la protéine MRP14 (ou calgranuline B). La calgranuline A est fortement exprimée dans les granulocytes, ainsi que dans certains épithéliums stratifiés, tels que la langue, l'oesophage et les cellules buccales. Par ailleurs, une surexpression de la calgranuline A est associée au psoriasis. A la connaissance des inventeurs, la calgranuline A n'avait pas jusqu'ici été identifiée comme étant une protéine dont l'expression était diminuée dans le stratum corneum humain âgé et sec.

Au contraire, dans leur analyse de biopsies de peau prélevées respectivement chez un individu jeune et chez un individu âgé, Gromov et al. concluaient que l'expression de la calgranuline A ne variait pas au cours du vieillissement cutané (Mol. Cell Proteomics, 2003 Feb. ; 2(2) :70-84). En effet, contre toute attente, la calgranuline A s'avère être également un marqueur potentiel de l'état physiologique de la peau, notamment en terme de vieillissement. Ainsi, comme il ressort des essais figurant ci-après, les inventeurs ont constaté de manière inattendue, d'une part une expression de cette protéine au niveau du stratum corneum non pathologique, et d'autre part une diminution significative de son expression au cours du vieillissement de l'épiderme.

En conséquence, selon un de ses premiers aspects, la présente invention a pour objet une utilisation cosmétique ou encore non thérapeutique, d'une quantité efficace d'au moins un polypeptide dérivé de la calgranuline A et, notamment, de séquence d'acides aminés codée par une séquence d'acides nucléiques représentée en tout ou partie par une séquence représentée par SEQ ID NO 1, un analogue de celle-ci ou un fragment de celle- ci, d'au moins une séquence nucléique codant pour un tel polypeptide ou d'au moins un agent modulateur de l'activité ou de l'expression d'un tel polypeptide à titre d'agent utile pour stimuler une différenciation épithéliale terminale, et notamment de type épidermique.

Selon un autre de ses aspects, la présente invention a également pour objet une utilisation d'une quantité efficace d'au moins un polypeptide dérivé de la calgranuline A et, notamment, de séquence d'acides aminés codée par une séquence d'acides nucléiques représentée en tout ou partie par une séquence représentée par SEQ ID NO 1, un analogue de celle-ci ou un fragment de celle-ci, d'au moins une séquence nucléique codant pour un tel polypeptide ou d'au moins un agent modulateur de l'activité ou de l'expression d'un tel polypeptide pour la préparation d'une composition, notamment thérapeutique, destinée à stimuler une différenciation épithéliale, et en particulier épidermique. En particulier, les compositions considérées selon l'invention peuvent être 10 destinées à stimuler la différenciation terminale des kératinocytes. Au sens de la présente invention, on entend désigner par l'expression quantité efficace la quantité minimale nécessaire à l'observation de l'effet attendu, à savoir un effet cosmétique ou un effet thérapeutique, étant entendu que les quantités efficaces nécessaires à l'obtention d'un effet cosmétique ou d'un effet thérapeutique 15 peuvent être, le cas échéant, identiques ou différentes. Au sens de l'invention, on entend désigner par utilisation cosmétique une utilisation destinée, principalement, à procurer un effet esthétique et/ou du confort. Au sens de l'invention, on entend désigner par composition thérapeutique une composition destinée à procurer un effet prophylactique ou curatif au regard de 20 troubles épithéliaux, et notamment épidermiques, reconnus comme traduisant un état pathologique. Par prophylactique ou préventif au sens de l'invention, on entend la diminution du risque de survenue d'un phénomène, par exemple une pathologie. Une composition conforme à l'invention peut, en particulier, être destinée à 25 prévenir et/ou traiter un amincissement d'un épiderme et/ou une perte de fermeté, d'élasticité, de densité et/ou de tonicité d'un épiderme et/ou la formation de rides et de ridules. Par signes de vieillissement cutané, on entend toutes les modifications de l'aspect extérieur de la peau dues au vieillissement qu'il soit chronologique et/ou photo- 30 induit, comme par exemple les rides et ridules, la peau flétrie, le manque d'élasticité et/ou de tonus de la peau, l'amincissement du derme et/ou la dégradation des fibres de collagène ce qui entraîne l'apparence de peau molle et ridée.

Selon un autre mode de réalisation, une composition conforme à l'invention peut, notamment, être destinée à prévenir et/ou à traiter des signes cutanés de sécheresse, en particulier à prévenir et/ou à traiter une déshydratation d'un épithélium, notamment d'un épiderme.

Une composition conforme à l'invention peut, en particulier, être destinée à prévenir et/ou traiter les effets du vieillissement chronologique d'un épithélium, notamment d'un épiderme ou des lèvres ou du cuir chevelu. Selon un autre aspect, la présente invention concerne également l'utilisation d'au moins un polypeptide conforme à l'invention à titre d'outil de criblage de composés biologiques ou chimiques susceptibles de moduler, et en particulier d'activer, l'expression et/ou l'activité biologique dudit polypeptide. En particulier, elle concerne un procédé de criblage d'actifs anti-âge comprenant au moins les étapes consistant à : a) mettre en contact, au moins un type cellulaire apte à exprimer un polypeptide conforme à l'invention, c'est-à-dire la calgranuline A ou l'un de ses dérivés avec au moins un composé chimique ou biologique à tester, dans des conditions propices à une manifestation de l'expression dudit polypeptide, et b) déterminer une teneur dudit polypeptide. Selon encore un autre de ses aspects, la présente invention concerne également l'utilisation d'au moins un polypeptide conforme à l'invention, ou d'au moins une séquence d'acides nucléiques codant pour ledit polypeptide, à titre d'outil de caractérisation in vitro ou ex vivo d'un état d'un épithélium, et notamment d'un épiderme. Plus précisément, la présente invention concerne, selon un autre de ses aspects, un procédé, notamment cosmétique, non invasif, pour caractériser l'état de surface d'un épithélium, notamment d'un épiderme, comprenant au moins la caractérisation qualitative ou quantitative de l'expression et/ou de l'activité biologique d'un polypeptide conforme à l'invention c'est-à- dire la calgranuline A, de l'un de ses dérivés ou fragments. Selon une variante de réalisation, la donnée ou valeur obtenue peut être appréciée comparativement à une donnée ou valeur de référence, obtenue par exemple à partir d'au moins un épithélium, notamment un épiderme, distinct de celui faisant l'objet de la caractérisation, et dont l'état est connu.

La présente invention vise encore selon un autre de ses aspects un procédé, notamment cosmétique, non invasif, pour caractériser l'efficacité d'un traitement cosmétique ou thérapeutique visant à suppléer aux signes de vieillissement cutané, comprenant au moins la caractérisation qualitative ou quantitative de l'expression et/ou de l'activité biologique d'un polypeptide conforme à l'invention, c'est-à-dire de la calgranuline A, de l'un de ses dérivés ou fragments. Selon une variante de réalisation, la donnée obtenue à l'issue de la caractérisation peut être également examinée comparativement à une valeur ou donnée de référence. Cette valeur ou donnée de référence peut être une donnée obtenue à partir de l'épithélium, notamment de l'épiderme, à soumettre au traitement, antérieurement à l'administration dudit traitement ou dans un délai chronologique plus court au regard de la date de début de traitement. Comme il ressort de la description qui suit, les procédés selon l'invention sont particulièrement avantageux dans la mesure où leur mise en oeuvre ne requiert pas d'opération invasive. Les procédés de l'invention peuvent être effectués in vitro, ex vivo ou in vivo. En effet, la localisation par les inventeurs du nouveau biomarqueur du vieillissement qu'est la calgranuline A, dans le stratum corneum non pathologique rend possible une caractérisation quantitative ou qualitative de l'expression de cette protéine par simple prélèvement topique. La méthode de prélèvement peut par exemple être une technique de type stripping consistant à appliquer sur l'épithélium considéré, tel qu'un épiderme, une portion de ruban adhésif. En décollant ce ruban adhésif, une fraction de l'épithélium, par exemple une fraction épidermique, est prélevée. Celle-ci, après extraction de ses protéines, est ensuite analysée par des méthodes conventionnelles, telles que le dosage immuno-enzymatique ou plus particulièrement une analyse Western-Blot.

DEFINITION POLYPEPTIDE Selon un mode de réalisation, un polypeptide convenant à l'invention peut avoir une séquence d'acides aminés représentée en tout ou partie par une séquence 30 représentée par SEQ ID NO 2, ou un analogue de celle-ci, ou un fragment de celle-ci.

Au sens de la présente invention, on entend désigner de manière générale, sauf indication contraire, par la calgranuline A la séquence (SEQ ID NO 2) de la protéine ayant ou non subi des modifications post-traductionnelles. Il est par ailleurs connu que la séquence primaire d'un polypeptide, c'est-à-dire l'enchaînement des acides aminés, détermine des sites spécifiquement reconnus par des enzymes de type protéase, telles que la trypsine qui, une fois la reconnaissance de ces sites effective, vont induire le clivage du polypeptide par protéolyse. Cette protéolyse résulte en la génération de divers peptides, ou fragments de protéolyse, de la calgranuline A. Les inventeurs ont détecté la présence de tels peptides dans le stratum corneum. En conséquence, l'invention s'étend également aux fragments de protéolyse de la calgranuline A. Ainsi, selon un mode de réalisation particulier, un polypeptide convenant à l'invention peut avoir une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 8 et SEQ ID NO 9, et leurs mélanges. Par analogue d'un polypeptide , on entend désigner tout polypeptide présentant une homologie de séquence, en particulier vis-à-vis d'une des séquences caractéristiques dudit polypeptide, ainsi qu'une activité biologique de même nature.

Cet analogue peut être un agent peptidomimétique. L'homologie peut être d'au moins 85 %, par exemple d'au moins 90 %, et par exemple d'au moins 95 %. L'homologie peut être déterminée par comparaison visuelle ou au moyen de tout outil informatique généralement utilisé dans le domaine, tel que les programmes BLAST disponibles ys!2yystnd)iIi et utilisés avec les paramètres configurés par défaut. L'homologie de séquence peut résulter de modifications issues de mutation ou de variation dans les séquences des peptides selon l'invention provenant, soit de la délétion ou de l'insertion d'un ou plusieurs acides aminés, soit de la substitution d'un ou plusieurs acides aminés dans les séquences caractéristiques d'un polypeptide selon l'invention. Au sens de l'invention, on entend désigner par fragment de polypeptide toute portion d'un polypeptide conforme à l'invention comprenant au moins 4, au moins 6, en particulier au moins 8, et plus particulièrement au moins 12 acides aminés consécutifs dudit polypeptide, et une activité biologique sensiblement similaire. Par séquence caractéristique du polypeptide , on entend viser notamment au regard de la calgranuline A, la séquence représentée par SEQ ID NO 2.

De manière générale, les analogues polypeptidiques peuvent comprendre des substitutions conservatrices par rapport à la séquence d'acides aminés du polypeptide naturel. Plusieurs de ces modifications peuvent être combinées. A titre d'exemple de mutations que l'on peut considérer dans la présente invention, il peut être mentionné, de manière non exhaustive, le remplacement d'un ou plusieurs résidus d'acides aminés par des résidus d'acides aminés ayant un indice hydropathique similaire sans pour autant affecter de manière sensible les propriétés biologiques du polypeptide, et notamment son activité biologique telle que son activité de stimulation de la prolifération et/ou de la migration et/ou de la différenciation terminale des kératinocytes au niveau d'un épithélium, et en particulier de l'épiderme. L'indice hydropathique est un indice attribué aux acides aminés en fonction de leur hydrophobicité et de leur charge (Kyte et al. (1982), J. Mol. Biol., 157 : 105). Un polypeptide ou analogue également visé par la présente invention peut être un polypeptide ayant subi une ou plusieurs modification(s) post-traductionnelle(s).

Par modification(s) post-traductionnelle(s) , on entend englober l'ensemble des modifications qu'un peptide ou une protéine est susceptible de subir à l'issue de sa synthèse dans une cellule, telles que par exemple une ou des phosphorylation(s), une ou des thiolation(s), une ou des acétylation(s), une ou des glycosylation(s), une ou des lipidation(s), telles qu'une farnésylation ou une palmitoylation, ou encore un réarrangement structural induisant la formation de complexes multimériques, soit de nature homomérique, soit de nature hétéromérique en liaison avec MRP14 par exemple. Selon un mode de réalisation, un polypeptide convenant à la mise en oeuvre de l'invention peut être sous forme multimérique. La calgranuline A peut également être sous une forme associée au calcium ou autres ions divalents équivalents, ou encore sous une forme associée à l'acide arachidonique. Enfin, la calgranuline A peut subir un clivage protéolytique résultant en divers fragments de la protéine.

L'analogue présente, par ailleurs, sensiblement la même activité biologique que le polypeptide naturel. Selon un mode de réalisation, un polypeptide convenant à la mise en oeuvre de l'invention peut également être un polypeptide naturel ou synthétique, le cas échéant susceptible d'être obtenu après lyse enzymatique ou chimique de la calgranuline A, ou par synthèse chimique ou biologique, ou par extraction à partir d'un tissu biologique, comme par exemple la peau, exprimant naturellement le polypeptide, ou après transfection de celui-ci, ainsi que les différentes formes post-traductionnelles de celui-ci, ou encore tout polypeptide naturel ou synthétique dont la séquence comprend totalement ou partiellement (en tout ou partie) une séquence d'acides aminés précitée, par exemple les variants et les analogues. L'homme de l'art peut obtenir un polypeptide conforme à l'invention au moyen de procédés à base d'ADN recombinant, comme par exemple, ceux décrits dans le manuel Molecular Cloning û A Laboratory Manual (2ème édition), Sambrook et al., 1989, Vol. I-III, Coldspring Harbor Laboratory, Coldspring Harbor Press, NY, (Sambrook). Selon un autre mode de réalisation, un polypeptide convenant à la mise en oeuvre de l'invention peut également être un polypeptide tel que défini précédemment dans lequel un résidu au moins a été remplacé par un résidu d'acide aminé d'indice hydropathique similaire, comme défini précédemment. Selon un autre mode de réalisation, un polypeptide convenant à la mise en oeuvre de l'invention peut également être un polypeptide tel que défini précédemment, fusionné avec un autre polypeptide, un agent de ciblage hydrophile ou hydrophobe, un précurseur de bio-conversion, un agent de marquage luminescent, radioactif ou colorimétrique. De manière non limitative, on peut citer comme exemple de composés susceptibles d'être couplés avec un polypeptide conforme à l'invention des protéines fluorescentes comme la Green Fluorescent Protein , des composés chimiques fluorescents, tels que la rhodamine, la fluorescéine, ou le Texas Red , des composés phosphorescents, des éléments radioactifs, tels que 3H, 14C 35S 1211 ou 125I, ou des agents de marquage colorimétrique, comme les substrats chromogènes sensibles à l'action de la galactosidase, de la peroxydase, de la chloramphénicol acétyltransférase, de la luciférase ou de la phosphatase alcaline. Selon la nature des composés susceptibles d'être couplés avec un polypeptide conforme à l'invention, le couplage peut être opéré par des procédés chimiques, notamment au moyen de fonctions chimiques réactives ou par des procédés de biologie moléculaire connus de l'homme de l'art.

DEFINITION SEQUENCES ACIDES NUCLEIQUES Selon un mode de réalisation, la présente invention concerne également des séquences d'acides nucléiques codant pour un polypeptide de l'invention et leur mise en 10 oeuvre dans les différentes utilisations et procédés conformes à l'invention. Ainsi, la présente invention se rapporte également à l'utilisation de séquences d'acides nucléiques, notamment d'acides désoxyribonucléiques, ou d'acides ribonucléiques codant pour un polypeptide conforme à l'invention, notamment les séquences correspondant au moins à une séquence d'acides nucléiques représentée par 15 SEQ ID NO 1, des analogues de celle-ci ou un fragment de celle-ci pour la préparation d'une composition conforme à l'invention. Au sens de la présente invention, on entend désigner par fragment de séquence d'acides nucléiques , une séquence d'acides nucléiques codant pour tout ou partie d'un polypeptide conforme à l'invention, ou un analogue de celui-ci, et en 20 particulier une séquence d'acides nucléiques représentée par SEQ ID NO 1 ou un analogue de celle-ci. Par analogue d'une séquence d'acides nucléiques , on entend désigner toute séquence d'acides nucléiques, éventuellement résultant de la dégénérescence du code des acides nucléiques, et codant pour un polypeptide de séquence identique ou analogue à 25 celle du polypeptide codée par ladite séquence d'acides nucléiques. Les séquences d'acides nucléiques peuvent être issues de toutes origines possibles, à savoir soit animale, en particulier de mammifères et encore plus particulièrement humaine, soit végétale, soit de micro-organismes (virus, phages, bactéries entre autres) ou encore de champignons, sans préjuger du fait qu'elles soient présentes de 30 manière naturelle ou non dans ledit organisme d'origine. En l'occurrence, l'invention se rapporte également à l'utilisation de fragments d'acides nucléiques isolés et purifiés codant pour les polypeptides considérés selon l'invention. Une séquence d'acides nucléiques conforme à l'invention peut comprendre une séquence sens, anti-sens ou interférentielle correspondant à une séquence codant pour un polypeptide conforme à l'invention.

Ainsi, la présente invention se rapporte également à l'utilisation de séquences d'acides nucléiques, notamment d'acides désoxyribonucléiques ou d'acides ribonucléiques codant pour un polypeptide conforme à l'invention. Les séquences d'acides nucléiques selon l'invention peuvent notamment être utilisées pour préparer les séquences d'acides ribonucléiques correspondantes, sens ou anti-sens. L'invention a également pour objet l'utilisation de tout polynucléotide, de séquence d'acides ribonucléiques ou désoxyribonucléiques, comprenant une séquence sens ou anti-sens, notamment Small interferent RNA (SiRNA), correspondant au moins à la séquence d'acides nucléiques SEQ ID NO 1 ou un analogue de celle-ci.

AGENT MODULATEUR Selon un autre mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation d'un agent modulateur de l'expression et/ou de l'activité d'un polypeptide conforme à l'invention.

En particulier, l'invention concerne l'utilisation d'un agent modulateur activateur de l'activité d'un polypeptide de l'invention. A titre d'exemples d'événements cellulaires régulés de façon positive par la Calgranuline A, on peut citer, notamment, l'activation de la voie de signalisation dépendante du récepteur Toll-like 4 (TLR4), ou encore le transport de l'acide arachidonique. Au sens de l'invention, on entend par moduler , au regard d'un effet donné, l'action de stimuler ou d'inhiber cet effet. Au sens de la présente invention, on entend par l'expression agent modulateur ou composé chimique ou biologique apte à moduler l'activité biologique et/ou l'expression tout composé apte à agir, directement ou indirectement, sur au moins un polypeptide conforme à l'invention, ou une séquence d'acides nucléiques codant pour celui-ci, ou sur un élément d'une voie de signalisation infra ou extra-cellulaire, ou d'une 11 voie métabolique, impliquant ledit polypeptide, ou sur un élément impliqué dans la régulation de la transcription et/ou de la traduction d'une séquence d'acides nucléiques codant pour ledit polypeptide. Par activité biologique , on entend désigner, notamment au regard de la calgranuline A, l'activité biologique de la protéine représentée par la séquence SEQ ID NO 2, de la forme mature ainsi que de la protéine ayant ou non subi des modifications. Cet agent modulateur peut être un agent activateur ou inhibiteur de l'expression d'un polypeptide de l'invention.

A titre illustratif, des agents activateurs de l'expression d'un polypeptide conforme à l'invention peuvent être des agents affectant de façon transitoire la fonction barrière de l'épiderme, tels que les dérivés du propylène glycol, ou provoquant un effet occlusif, tels que la vaseline, ou encore des composés aptes à augmenter le calcium intracellulaire, tels que la thapsigargine.

A titre illustratif et non limitatif des agents inhibiteurs de l'expression d'un polypeptide conforme à l'invention peuvent être cités, notamment, les flavonoïdes d'écorce de pin, le sulfo-N-succinimidyloléate, les sels Zn2+ et Cu2+, des rétinoïdes synthétiques tels que le tazarotène, les dérivés substitués benzimidazoles, ainsi que les dérivés aminométhylamides.

Plus particulièrement, l'agent modulateur peut être un activateur de l'expression des polypeptides selon l'invention. La présente invention se rapporte en outre à un procédé de criblage de composés biologiques ou chimiques ou de facteurs physico-chimiques susceptibles de moduler une activité biologique d'un polypeptide selon l'invention comprenant au moins les étapes consistant à : a) mettre en contact, avec au moins un composé chimique ou biologique à tester, au moins un polypeptide conforme à l'invention et/ou soumettre ledit polypeptide audit facteur physico-chimique, dans des conditions propices à la manifestation de ladite activité biologique dudit polypeptide, et b) déterminer ladite activité biologique dudit polypeptide. Dans un tel procédé, l'activité biologique du polypeptide, en particulier son activité de différenciation épithéliale, et notamment de différenciation épidermique terminale, notamment au regard des kératinocytes, peut être déterminée par toute méthode connue de l'homme de l'art. Par exemple et de manière non limitative, on peut mentionner des méthodes de culture cellulaire suivie d'une caractérisation de marqueurs de différenciation, tels que par exemple la kératine 10 et la filaggrine, ou de marqueurs de prolifération, tels que par exemple KI 67 et PCNA. Selon un mode de réalisation, l'activité biologique du polypeptide peut être comparée à une valeur de référence. Une valeur de référence peut être obtenue en mesurant l'activité biologique du 10 polypeptide en l'absence de tout composé biologique ou chimique ou facteur physico-chimique à tester. Dans l'hypothèse où cette mesure de valeur de référence est effectuée préalablement à la mise en oeuvre du composé biologique ou chimique ou du facteur physico-chimique à tester, la méthode selon l'invention peut permettre en outre, le cas 15 échéant, d'apprécier l'efficacité potentielle dudit composé. Cette activité biologique peut ne pas être affectée par la présence dudit composé ou, en revanche, être inhibée ou stimulée. Dans l'hypothèse où un effet activateur est constaté, le composé testé est susceptible d'être utilisé, par exemple, à titre d'actif anti-âge. 20 Un procédé conforme à l'invention peut être effectué sur un échantillon cellulaire isolé obtenu, soit d'une biopsie cutanée, soit à partir de cellules en culture. Avantageusement, à titre d'échantillon cellulaire convenant à l'invention, on peut mentionner un échantillon de kératinocytes. Avantageusement, un polypeptide mis en oeuvre dans un procédé selon la 25 présente invention peut être la calgranuline A.

La présente invention concerne également un procédé de criblage de composés biologiques ou chimiques, susceptibles de moduler l'expression d'un polypeptide conforme à l'invention comprenant au moins les étapes consistant à : 30 a) mettre en contact au moins un type cellulaire apte à exprimer une séquence d'acides nucléiques codant pour ledit polypeptide conforme à l'invention avec au moins un composé chimique ou biologique à tester, dans des conditions propices à la manifestation de l'expression de ladite séquence, et b) déterminer l'expression de ladite séquence d'acides nucléiques. L'expression d'une séquence d'acide nucléique peut être déterminée, par 5 exemple, au moyen de sondes oligonucléotidiques, par tout protocole connu de l'homme de l'art. A titre d'exemple de méthodes de détection de séquence d'acides nucléiques, il peut être fait mention de la réaction de polymérisation en chaîne (PCR), de la réaction de polymérisation en chaîne transcriptase inverse (RT-PCR ou Q-PCR), du Northern-blot, de 10 la méthode ribonuclease protection assay , des méthodes avec des puces à ADN, des méthodes avec des puces transcriptomiques, des méthodes avec des puces à oligonucléotides, des méthodes d'hybridation in situ. A titre d'exemple d'agents convenant à la détection d'une séquence d'acides nucléiques, et en particulier d'ARNm, il peut être fait mention de sondes d'acides 15 nucléiques marquées pouvant s'hybrider à ladite séquence. Une telle sonde d'acide nucléique peut être aisément obtenue par toute méthode connue de l'homme de l'art. Ainsi, les séquences d'acides nucléiques conformes à l'invention peuvent être utilisées pour réaliser des amorces oligonucléotidiques sens et/ou anti-sens, qui 20 s'hybrident dans des conditions de forte stringence à la séquence SEQ ID NO 1 ou un analogue de celle-ci. L'expression d'une séquence d'acide nucléique conforme à l'invention peut être comparée à une valeur de référence obtenue, par exemple, en effectuant un procédé conforme à l'invention en l'absence de composé à tester. 25 L'expression d'une séquence d'acide nucléique peut également être déterminée, de manière indirecte, par la détermination de l'expression du polypeptide codé par ladite séquence, au moyen de toute technique connue dans le domaine, telle que le Western-Blot, l'ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay), la méthode de Bradford ou de Lowry, ou comme indiqué ci-après. 30 La présente invention se rapporte également à un procédé de criblage de composés biologiques ou chimiques, voire d'actifs anti-âge, susceptibles de moduler l'expression d'un polypeptide conforme à l'invention, comprenant au moins les étapes consistant à : a) mettre en contact au moins un type cellulaire apte à exprimer un polypeptide conforme à l'invention avec au moins un composé chimique ou biologique à 5 tester, dans des conditions propices à la manifestation de l'expression dudit polypeptide. b) déterminer une teneur du polypeptide, et c) comparer ladite teneur déterminée à l'étape b) à une teneur dudit polypeptide déterminée en l'absence de composé chimique ou biologique à tester. La comparaison effectuée à l'étape c) peut permettre de déduire une 10 information quant à la propriété dudit composé testé à moduler l'expression d'un polypeptide conforme à l'invention. Un procédé conforme à l'invention peut être effectué sur un échantillon cellulaire isolé. La détermination d'une teneur d'un polypeptide conforme à l'invention peut 15 être effectuée au moyen de toute méthode connue de l'homme de l'art. A titre de méthodes de détection d'un polypeptide, il peut être fait mention du Western-blot, du Slot-blot, du Dot-blot, des méthodes ELISA de type singleplex ou multiplex, des méthodes de protéomique ou de glycomique, de coloration de polypeptides dans un gel de polyacrylamide par un colorant à base d'Argent, par le bleu de Coomassie 20 ou par le SYPRO, de l'immunofluorescence, de l'absorption UV, de méthodes immunohistochimiques en microscopie classique, électronique ou confocale, de FRET (fluorescence resonance energy transfer/transfert d'énergie par résonance de fluorescence), des méthodes de TR-FRET (time resolved FRET/FRET en résolution de temps), des méthodes de FLIM (fluorescence lifetime imaging microscopy/imagerie par microscopie 25 en temps de fluorescence), des méthodes de FSPIM (fluorescence spectral imaging microscopy/imagerie par microscopie en spectre de fluorescence), des méthodes de FRAP (fluorescence recovery alter photobleaching/recouvrement de fluorescence après photoblanchiment), des méthodes par gène rapporteur, des méthodes d'AFM (atomic force microscopy/microscopie par force atomique), des méthodes de résonance plasmonique de 30 surface, des méthodes de microcalorimétrie, des méthodes de cytométrie en flux, des méthodes de biosenseurs, des méthodes de radioimmuno-essais (RIA), des méthodes de focalisation isoélectrique, et des tests enzymatiques, des méthodes mettant en oeuvre des puces à peptides, des puces à sucre, des puces d'anticorps, des méthodes de spectrométrie de masse, des méthodes de spectrométrie de type SELDI-TOF (Ciphergen). Les procédés conformes à l'invention peuvent être effectués sur un échantillon, par exemple isolé, d'épithélium, notamment d'épiderme, obtenu à partir d'une biopsie cutanée ou d'un modèle cellulaire épithélial, par exemple épidermique ou plus avantageusement d'un prélèvement de surface non invasif, notamment par adhésif ( tape stripping ) de stratum corneum ou par simple lavage. Un prélèvement d'un échantillon d'épiderme peut se faire par toute méthode connue de l'homme de l'art.

Ces méthodes peuvent être effectuées par des techniques dites de stripping . Ces strippings sont des surfaces collantes appliquées à la surface de l'épiderme comme le Blenderm de 3M, le D'squam (adhésif commercial de CuDERM), la colle cyanoacrylate ou la méthode du stripping vernis. Grâce à ces strippings , les cornéocytes adhérents et le contenu de leurs espaces intercellulaires peuvent être prélevés et soumis par la suite à une extraction permettant d'avoir accès au contenu protéique. Le prélèvement d'un échantillon convenant au procédé peut aussi être effectué de façon plus directe par lavages de la surface cutanée, au moyen par exemple d'accessoires de type turbine à ailette, de type cellule à spirale (tel que décrit dans le brevet FR 2 667 778) associée à un circuit fluidique, ou simplement par ajout/prélèvement d'une goutte de tampon à la surface de la peau. A titre indicatif, on peut mentionner d'autres méthodes de prélèvement adaptées à la mise en oeuvre de l'invention, telles que des méthodes par grattage de la partie supérieure du stratum corneum au moyen d'un système bilames. Cette technique permet de recueillir des squames qui peuvent ensuite être directement analysées par différentes techniques pour déterminer les taux en minéraux, aminoacides ou lipides. Il est entendu que l'ensemble des compositions cosmétiques ou thérapeutiques considérées selon l'invention, mettent en oeuvre un milieu physiologiquement acceptable. Au sens de la présente invention, on entend désigner par milieu physiologiquement acceptable , un milieu convenant à l'application d'une composition sur un épithélium ou une matière kératinique, telle que la peau, le cuir chevelu, les lèvres, les muqueuses et les fibres kératiniques comme les cheveux, les ongles et les poils, ou le cas échéant par voie orale ou parentérale.

Au sens de la présente invention, on entend désigner par thérapeutique une composition pouvant être mise en oeuvre dans le cadre d'un traitement prophylactique et/ou curatif, ou d'une méthode d'évaluation d'un état d'un épithélium, et notamment de l'épiderme.

Selon un autre mode de réalisation, une composition cosmétique ou thérapeutique conforme à l'invention peut comprendre, en outre, au moins un agent actif cosmétique et/ou thérapeutique. Comme exemples d'agents actifs utilisables dans le cadre de la présente invention, il peut être fait mention d'huiles cosmétiques, telles que les huiles de silicone, les huiles végétales de type triglycérides, les huiles hydrocarbonées, telles que l'huile de Parleam et les esters d'acides gras et d'alcool gras. Il peut également être possible d'utiliser d'autres agents actifs permettant d'améliorer l'état de la peau, tels que des agents actifs hydratants ou humidifiants ou des agents actifs permettant d'améliorer la barrière lipidique naturelle, tels que des céramides, des sulfates de cholestérol et/ou des acides gras, et leurs mélanges. Il peut également être possible d'utiliser des enzymes ayant une activité sur la peau, telles que des protéases, des lipases, des glucosidases, des amidases, des cérébrosidases et/ou des mélanases, et leurs mélanges. Comme autres exemples d'agents actifs convenant à la mise en oeuvre de la présente invention, figurent des actifs analgésiques, des actifs anti-levures, des actifs antibactériens, des actifs anti-parasitaires, des actifs anti-fongiques, des actifs anti-viraux, des actifs anti-inflammatoires stéroïdiens, des actifs anesthésiques, des actifs anti-prurigineux, des actifs kératolytiques, des actifs anti-radicaux libres, des actifs anti-séborrhéiques, des actifs anti-pelliculaires, des actifs anti-acnéiques, des actifs visant à prévenir le vieillissement de la peau et/ou à améliorer son état, des actifs anti-dermatites, des actifs anti-irritants, des actifs immunomodulateurs, des actifs pour le traitement de la peau sèche, des actifs anti-transpirants, des actifs anti-psoriatiques, des actifs protecteurs contre les UV, des actifs anti-histaminiques, des actifs cicatrisants, des actifs auto-bronzants, des antioxydants tels que le thé vert ou des fractions actives de celui-ci, la glycérine, la laponite, la caféine, des huiles essentielles aromatiques, des colorants, des actifs dépigmentants, des liporégulateurs, des actifs adoucissants, rafraîchissants, déodorants, insensibilisants, blanchissants, nourrissants, des actifs diminuant la différenciation et/ou la prolifération et/ou la pigmentation cutanée, et leurs mélanges. D'une manière générale, toute composition de l'invention peut être appliquée sur la peau (sur toute zone cutanée du corps) ou sur les muqueuses (buccale, jugale, gingivale, génitale, conjonctivale, ...). De façon connue, une composition cosmétique peut contenir également des adjuvants habituels dans le domaine cosmétique, tels que des gélifiants hydrophiles ou lipophiles, des additifs hydrophiles ou lipophiles, des conservateurs, des antioxydants, des solvants, des parfums, des charges, des filtres, des absorbeurs d'odeurs et des matières colorantes. Les quantités des différents constituants des compositions selon l'invention sont celles classiquement utilisées dans les domaines considérés. La quantité de composé chimique ou biologique ou de polypeptide, de séquence d'acides nucléiques ou d'agent modulateur conforme à l'invention contenue dans une composition selon l'invention, encore dite quantité efficace est, bien entendu, fonction de la nature du composé et de l'effet recherché et peut donc varier dans une large mesure. Pour donner un ordre de grandeur, une composition peut contenir un agent modulateur conforme à l'invention ou un polypeptide en une quantité représentant de 0,00001 % à 50 % du poids total de la composition, en particulier en une quantité représentant de 0,001 % à 10 % du poids total de la composition, et plus particulièrement en une quantité représentant de 0,1 % à 1 % du poids total de la composition. Une composition selon l'invention peut être plus particulièrement dédiée à la réduction et/ou au traitement d'affections susceptibles de détériorer l'état d'un épithélium, et notamment d'un épiderme. Un état d'un épithélium visé par la présente invention peut être un état lié à un dysfonctionnement de la différenciation épithéliale terminale, en particulier épidermique, notamment des kératinocytes. Un tel état peut être d'origine chronologique (i.e. lié au temps écoulé comme 30 le vieillissement cutané) et/ou indicatif d'un trouble cutané, lié par exemple au photovieillissement.

Ainsi, une composition conforme à l'invention, notamment cosmétique, peut, en particulier, être destinée à prévenir et/ou traiter un amincissement d'un épiderme et/ou une perte de fermeté, d'élasticité, de densité et/ou de tonicité d'un épiderme et/ou la formation de rides et ridules.

Selon un autre mode de réalisation, une composition conforme à l'invention, en particulier cosmétique, peut, notamment, être destinée à prévenir et/ou à traiter des signes cutanés de sécheresse, en particulier à prévenir et/ou à traiter une déshydratation d'un épiderme. Une composition de l'invention peut également être destinée à prévenir et/ou à 10 traiter des désordres de la fonction barrière d'un épithélium, notamment d'un épiderme.

Selon un autre mode de réalisation, une composition conforme à l'invention, notamment cosmétique, peut être destinée à prévenir et/ou à traiter des signes de vieillissement épidermique. 15 Une composition conforme à la présente invention, notamment thérapeutique, peut être plus particulièrement destinée au traitement d'un trouble cutané tel qu'un trouble de l'hydratation de la peau, tel que la xérose, une parakératose, une hyperkératose, une ichtyose, un psoriasis, une dermatite atopique, un eczéma, une rosacée, un lichen, un prurit, une pathologie cutanée ayant une composante inflammatoire ou résultant d'une 20 altération de la réponse immunitaire, une desquamation, un dérèglement de la mélanogénèse ou de la sébogenèse, une alopécie, l'hirsutisme, un trouble de la cicatrisation, ou un trouble cutané impliquant des phénomènes de sécrétion et de processus d'invasion cellulaire, notamment dans le cadre de néoplasies malignes ou bénignes. Selon un autre aspect, la présente invention concerne également l'utilisation 25 d'au moins un polypeptide conforme à l'invention ou d'au moins une séquence d'acides nucléiques codant pour ledit polypeptide, à titre d'outil de caractérisation in vitro ou ex vivo d'un état d'un épithélium, et notamment d'un épiderme. A titre d'exemple, il est possible de caractériser selon l'invention un état d'un épithélium choisi parmi la desquamation, l'ichtyose, l'hyperkératose, la sécheresse d'un 30 épiderme, le vieillissement chronologique et le photovieillissement. Ainsi, comme précisé précédemment, la présente invention concerne selon un autre de ses aspects des procédés non invasifs pour caractériser l'état de surface d'un épiderme non pathologique ou encore l'efficacité d'un traitement cosmétique ou thérapeutique visant à caractériser qualitativement ou quantitativement l'expression de la calgranuline A, de l'un de ses dérivés ou fragments. Ces procédés sont particulièrement avantageux dans la mesure où leur mise en oeuvre ne nécessite pas de recourir obligatoirement à une technique opératoire pour procéder à une telle caractérisation. Un extrait de l'épiderme peut ainsi être obtenu par simple stripping et directement analysé par une technique d'analyse conventionnelle, notamment telle que décrite précédemment. Selon un mode de réalisation, un procédé de caractérisation d'un état d'un épithélium, par exemple un épiderme, comprend au moins les étapes consistant à : a) déterminer, dans un échantillon dudit épithélium, une teneur d'un polypeptide conforme à l'invention, ou d'une séquence d'acides nucléiques codant pour ledit polypeptide, et b) comparer ladite teneur déterminée à l'étape a) à une valeur de référence. 15 Avantageusement, un procédé de l'invention est non invasif. Un procédé de l'invention est avantageusement effectué sur un échantillon isolé. Selon un mode de réalisation, un procédé selon l'invention peut être effectué sur un échantillon d'épithélium, et notamment d'épiderme, prélevé chez un individu. 20 Un procédé selon l'invention peut également être effectué sur un échantillon d'épithélium, et notamment d'épiderme, prélevé à partir d'un modèle cellulaire épithélial, et notamment épidermique, ou d'une peau isolée reconstruite afin d'en qualifier l'état. Le prélèvement d'un échantillon d'épithélium peut se faire par toute méthode connue de l'homme de l'art. 25 Un procédé selon l'invention peut être effectué in vivo, in vitro ou ex vivo. Une valeur de référence peut être, par exemple, une teneur en polypeptide ou en séquence d'acides nucléiques déterminée sur un échantillon d'épiderme prélevé sur un épithélium, et notamment une peau normale, c'est-à-dire satisfaisante sur le plan physiologique, à l'image par exemple d'une peau jeune. 30 La mesure d'une valeur de référence peut être effectuée parallèlement ou séquentiellement à la détermination de ladite teneur d'un polypeptide ou d'une séquence d'acides nucléiques.

Une comparaison d'une teneur déterminée avec une valeur de référence peut permettre d'évaluer une déviation par rapport à cette valeur. L'analyse de l'intensité et/ou de la nature de cette déviation (négative ou positive) peut être informative de l'état de l'épiderme.

La caractérisation d'un état d'un épiderme peut être indicatif d'un éventuel trouble cutané qui peut être corrigé par l'utilisation de composés susceptibles de moduler l'expression d'un polypeptide de l'invention. Selon un mode de réalisation, un procédé selon l'invention peut être mis en oeuvre dans un procédé de diagnostic in vivo, in vitro ou ex vivo d'un trouble présumé d'un 10 épithélium, et notamment de l'épiderme, chez un individu. Par exemple, un état d'un épithélium à évaluer peut être choisi parmi la desquamation, l'ichtyose, l'hyperkératose, la sécheresse d'un épiderme, le vieillissement ou le photovieillissement. Un polypeptide convenant à la mise en oeuvre d'un procédé selon l'invention 15 peut être avantageusement la calgranuline A. La détermination d'une teneur en polypeptide conforme à l'invention ou en acides nucléiques conformes à l'invention dans un échantillon d'épiderme peut être effectuée par tout protocole connu de l'homme de l'art. A titre de méthodes de détection d'un polypeptide, il peut être fait mention de 20 celles citées précédemment. Ainsi, il peut être envisagé de détecter la présence d'un polypeptide conforme à l'invention au moyen d'un anticorps, le cas échéant sous une forme marquée. Un anticorps susceptible d'être utilisé à titre d'outil d'évaluation d'un état d'un épiderme peut être obtenu par tout procédé connu de l'homme de l'art, tel que décrit dans 25 Antibodies: A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990). De façon avantageuse, les anticorps utilisés peuvent être des anticorps recombinants, tels que ceux développés par la société Antibodies-by-design. Une séquence d'acide nucléique convenant à la mise en oeuvre d'un procédé selon l'invention peut être avantageusement une séquence d'acides nucléiques codant pour 30 la calgranuline A, par exemple de type ARNm. A titre d'exemple de méthodes de détection d'acides nucléiques conformes à l'invention, il peut être fait mention des méthodes citées précédemment.

La présente invention concerne également un procédé, non thérapeutique, pour mettre en évidence un effet d'un traitement susceptible de faire régresser un trouble d'un épithélium, notamment un trouble cutané ou du cuir chevelu, chez un individu, comprenant au moins les étapes consistant à : a) effectuer, avant le traitement, au moins une première détermination, dans un premier échantillon d'un épithélium prélevé chez ledit individu, d'une activité biologique et/ou de l'expression d'un polypeptide conforme à l'invention, ou de l'expression d'une séquence d'acides nucléiques codant pour ledit polypeptide, b) effectuer, après le traitement, au moins une seconde détermination, dans un second échantillon d'un épithélium prélevé chez ledit individu, de ladite activité biologique et/ou de ladite expression dudit polypeptide ou de ladite expression de ladite séquence d'acides nucléiques déterminées à l'étape a), et c) comparer les première et deuxième déterminations, notamment afin d'en déduire une information relative à un effet au moins du traitement.

Un tel traitement peut en particulier être un traitement cosmétique. En particulier, le traitement dont l'effet est à évaluer peut être un traitement destiné à soulager ou réduire un trouble cutané ou du cuir chevelu lié à un dysfonctionnement de la prolifération et/ou de la différenciation des kératinocytes. L'activité biologique et l'expression d'un polypeptide peuvent être déterminées comme indiqué précédemment. Selon un autre aspect, la présente invention se rapporte à un procédé de traitement cosmétique d'un trouble cutané comprenant au moins une étape consistant à appliquer sur une partie au moins de la peau, des muqueuses et/ou des fibres kératiniques, au moins une composition cosmétique conforme à l'invention.

Selon un autre aspect, la présente invention concerne l'utilisation d'une quantité efficace d'au moins un polypeptide conforme à l'invention ou d'au moins un agent modulateur de l'expression dudit polypeptide pour la préparation et/ou l'amélioration d'un modèle cellulaire pluristratifié, notamment de type épidermique ou muqueux, et en particulier un modèle de peau reconstruite.

Au sens de l'invention, on entend désigner par modèle de peau reconstruite , un modèle dans lequel sont associés différents types cellulaires, tels que notamment les constituants naturels de la peau, à l'image par exemple des kératinocytes, des fibroblastes, des cellules de Langerhans et des mélanocytes. Les cellules de type fibroblastes peuvent être irradiées ou non. De tels modèles et leur préparation sont connus de l'homme de l'art.

Au sens de la présente invention, un doit se comprendre, sauf indication contraire, au sens de au moins un . Les exemples figurant ci-après sont présentés à titre illustratif et non limitatif de l'invention.

EXEMPLE I Analyse d'échantillons prélevés par stripping vernis sur différentes zones cutanées d'un individu Les analyses sont réalisées à partir de strippings vernis effectués sur les jambes.

Les sujets se prêtant à l'étude sont regroupés en 4 groupes. Le groupe AS correspond au groupe 1 : ménopausées sèches n=15. Le groupe AN correspond au groupe 2 : ménopausées normales n=13. Le groupe JS correspond au groupe 3 : jeunes sèches n=16. Le groupe JN correspond au groupe 4 : jeunes normales n=14. 1 : Préparation de poudres acétoniques Deux strippings vernis (B. Mehul et al., J Biol Chem 2000, Apr 28; 275(17): 12841-7) de 10 cm sont disposés dans 20 ml d'acétone. Les cornéocytes se décollent. Le mélange est filtré sur membrane de nylon de 40 m. Trois rinçages successifs sont effectués avec le même volume d'acétone. La suspension est finalement filtrée sur pompe à vide. On obtient des poudres acétoniques de stratum corneum sous forme sèche. 2 : Extraction des échantillons On procède à une extraction en conditions dénaturantes. Pour ce faire, un préùlavage est réalisé avec un volume (100 l) de tampon PBS (Phosphate Buffer Saline) +0,1 % Triton X100 qui est ajouté par mg de poudres acétoniques. Le mélange est broyé au potter et centrifugé. Le culot de cornéocytes est recueilli. Il est extrait avec un même volume (100 l/mg) de tampon Laemmli 0,0625 mM tris pH 6,8, 200 mM DTT, 2 % SDS, 10 % glycérol. Le mélange est porté à ébullition pendant 10 minutes, puis il est broyé et centrifugé 10 minutes à 10000 g. Le surnageant est recueilli. Un dosage de protéines est réalisé selon la technique de Bradford avec le réactif Bradford (Bio-Rad Protein assay) Les échantillons sont ajustés à 1 mg/ml.

3 : Analyses des protéines par Western-blot Les protéines sont séparées par électrophorèse SDS-PAGE. Après transfert semi-sec sur membrane de PVDF (Immobilon-P Milipore) selon un protocole standard, les protéines sont incubées avec l'anticorps primaire anti-calgranuline A (Santa-Cruz 8112 (c19)) toute une nuit à 4 °C. Puis la seconde incubation a lieu avec l'anticorps secondaire (anti-goat IgG-HRP conjugate, Biorad) dirigé contre l'anticorps primaire 1 heure à température ambiante. La présence de la calgranuline A sur la membrane est révélée par immunodétection à l'aide du kit ECL plus (Amersham). La membrane est ensuite colorée à l'Amidoblack pour détecter les protéines totales présentes sur ladite membrane. L'image est acquise au FluorSmax (Biorad) et les bandes quantifiées à l'aide du logiciel Quantityone (Biorad).

4 : Résultats Les résultats sont exprimés en delta cnt*mm2 de la protéine d'intérêt / delta cnt*mm2 des protéines totales.

Méthodologie : - analyse de variance à 2 facteurs Age et Type de peau prenant en compte l'interaction de ces deux facteurs + analyse de variance à 1 facteur (groupe) et test de comparaisons multiples de Tukey. Les conditions de normalité et d'homoscédasticité n'étant pas vérifiées, l'analyse a été réalisée après transformation logarithmique. L'analyse statistique a été effectuée avec les logiciels SAS version 8.2 et SPSS version 12.

Tous les tests ont été réalisés au seuil bilatéral de 5 %.

Le tableau ci-après reprend les résultats moyennés ainsi que leurs écart-types à la moyenne (sem). Calgranuline A (25-30 kDa) Calgranuline A (8 kDa) groupe Moyenne Sem Moyenne Sem AS 1893 465 69 43 AN 7180 2825 481 344 JS 7740 2534 158 94 JN 11408 3101 297 136 On note une diminution significative de l'expression de la calgranuline A détectée par Western-blot au cours du vieillissement cutané (p=0.003). Cette diminution est particulièrement accentuée pour les peaux âgées sèches.

Claims (17)

REVENDICATIONS

1. Utilisation cosmétique d'une quantité efficace d'au moins un polypeptide de séquence d'acides aminés codée par une séquence d'acides nucléiques représentée en tout ou partie par une séquence représentée par SEQ ID NO 1, un analogue de celle-ci, ou un fragment de celle-ci, d'au moins une séquence nucléique codant pour un tel polypeptide ou d'au moins un agent modulateur de l'activité ou de l'expression d'un tel polypeptide à titre d'agent utile pour stimuler une différenciation épithéliale terminale.

2. Utilisation d'une quantité efficace d'au moins un polypeptide de séquence d'acides aminés codée par une séquence d'acides nucléiques représentée en tout ou partie par une séquence représentée par SEQ ID NO 1, un analogue de celle-ci, ou un fragment de celle-ci, d'au moins une séquence nucléique codant pour un tel polypeptide ou d'au moins un agent modulateur de l'activité ou de l'expression d'un tel polypeptide pour la préparation d'une composition thérapeutique destinée à stimuler une différenciation épithéliale terminale.

3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle ledit polypeptide a une séquence d'acides aminés représentée en tout ou partie par une séquence représentée par SEQ ID NO 2, un analogue de celle-ci, ou un fragment de celle-ci.

4. Utilisation selon la revendication 3, dans laquelle ledit polypeptide est 20 sous une forme multimérique.

5. Utilisation selon la revendication 3, dans laquelle ledit polypeptide a une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 8 et SEQ ID NO 9.

6. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans 25 laquelle l'agent modulateur est un activateur de l'expression dudit polypeptide.

7. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle ledit agent utile ou ladite composition est destiné(e) à prévenir et/ou traiter un amincissement d'un épiderme et/ou une perte de fermeté, d'élasticité, de densité et/ou de tonicité d'un épiderme et/ou la formation de rides et ridules. 30

8. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans laquelle ledit agent utile ou ladite composition est destiné(e) à prévenir et/ou à traiter des signescutanés de sécheresse, en particulier à prévenir et/ou à traiter une déshydratation d'un épiderme.

9. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 dans laquelle ledit agent utile ou ladite composition est destiné(e) à prévenir et/ou à traiter des désordres 5 de la fonction barrière d'un épiderme.

10. Utilisation d'au moins un polypeptide tel que défini selon la revendication 3, 4 ou 5, à titre d'outil de criblage de composés biologiques ou chimiques susceptibles de moduler l'expression et/ou l'activité biologique dudit polypeptide.

11. Utilisation d'au moins un polypeptide tel que défini selon la revendication 10 3, 4 ou 5, ou d'au moins une séquence d'acides nucléiques codant pour ledit polypeptide à titre d'outil de caractérisation in vitro ou ex vivo d'un état d'un épithélium.

12. Utilisation selon la revendication précédente, dans laquelle l'état de l'épithélium est choisi parmi la desquamation, l'ichtyose, l'hyperkératose, la sécheresse d'un épiderme, le vieillissement chronologique et le photovieillissement. 15

13. Procédé de caractérisation d'un état d'un épithélium comprenant au moins les étapes consistant à : a) déterminer dans un échantillon dudit épithélium, une teneur d'un polypeptide tel que défini selon la revendication 3, 4 ou 5 ou d'une séquence d'acides nucléiques codant pour ledit polypeptide, et 20 b) comparer ladite teneur déterminée à l'étape a) à une valeur de référence.

14. Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce qu'il est non invasif.

15. Procédé de criblage d'actifs anti-âge comprenant au moins les étapes consistant à : 25 a) mettre en contact au moins un type cellulaire apte à exprimer un polypeptide tel que défini en revendication 3, 4 ou 5 avec au moins un composé chimique ou biologique à tester, dans des conditions propices à une manifestation de l'expression dudit polypeptide, b) déterminer une teneur dudit polypeptide. 30

16. Procédé cosmétique pour caractériser l'efficacité d'un traitement cosmétique ou thérapeutique visant à suppléer aux signes de vieillissement cutané,comprenant au moins la caractérisation qualitative ou quantitative de l'expression et/ou de l'activité biologique d'un polypeptide tel que défini en revendication 3, 4 ou 5.

17. Utilisation d'une quantité efficace d'au moins un polypeptide tel que défini en revendication 3, 4 ou 5, ou d'au moins un agent modulateur de l'expression dudit polypeptide pour la préparation et/ou l'amélioration d'un modèle cellulaire pluristratifié, en particulier un modèle de peau reconstruite.