FR2918754A1 - Enzyme linked immunosorbant assay type biological test realizing method, involves diluting reagent in blue color dye, diluting another reagent in red color dye, and forming violet color dye by mixing two color dyes - Google Patents
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Abstract
Description
PROCEDE POUR LA REALISATION DE TESTS BIOLOGIQUES PAR IMMUNODOSAGE ETPROCESS FOR CARRYING OUT BIOLOGICAL TESTS BY IMMUNODOSING AND
TROUSSE TECHNIQUE POUR SA MISE EN îUVRE La présente invention trouve son application dans le domaine de la biotechnologie, en particulier les immunodosages. TECHNICAL KIT FOR ITS IMPLEMENTATION The present invention finds application in the field of biotechnology, in particular immunoassays.
Plus particulièrement, elle concerne un procédé pour la réalisation de tests biologiques, consistant à déposer dans un flacon de réaction ou puits une solution d'un premier réactif selon un volume prédéterminé, puis une solution d'un second réactif selon un volume également prédéterminé. More particularly, it relates to a method for carrying out biological tests, comprising depositing in a reaction flask or well a solution of a first reagent according to a predetermined volume, then a solution of a second reagent according to a predetermined volume.
A titre d'exemple non limitatif, les immunodosages connus de type ELISA (Enzyme Linked Immunosorbant Assay) s'effectuent de la manière suivante. By way of nonlimiting example, the known immunoassays of the ELISA type (Enzyme Linked Immunosorbant Assay) are carried out as follows.
Au fond d'un puits, on dispose un premier anticorps (macromolécules ou protéines) fixé au fond du puits par électrostat-_sme. At the bottom of a well, there is a first antibody (macromolecules or proteins) attached to the bottom of the well by electrostat-_sme.
Ensuite, on procède à la saturation de la surface par dépôt d'une protéine inerte de type serum albumine. Then, the surface is saturated by depositing an inert serum albumin protein.
Puis on procède au dépôt d'un échantillon biologique, contenant par exemple un virus, sur l'anticorps. Then we proceed to deposit a biological sample, for example containing a virus, on the antibody.
Enfin, on dépose un second anticorps, toujours spécifique du virus recherché, sur lequel est fixée une enzyme, le virus étant ainsi pris en sandwich entre les premier et second anticorps. Finally, a second antibody is deposited, always specific for the desired virus, to which an enzyme is attached, the virus thus being sandwiched between the first and second antibodies.
De cette manière est mise en évidence la première fixation du virus avec le second anticorps, et c'est en mesurant la réaction de l'enzyme que l'on met en évidence une coloration visuelle, s'il y a virus, et pouvant être quantifiée. In this way, the first fixation of the virus with the second antibody is demonstrated, and it is by measuring the reaction of the enzyme that a visual coloration is detected, if there is a virus, and which can be quantified.
Ce test bien connu présente certains inconvénients. En effet, l'échantillon biologique est déposé sur le premier anticorps en très petit volume, de l'ordre de quelques microlitres, dans une microplaque contenant un nombre important de puits. This well-known test has certain disadvantages. Indeed, the biological sample is deposited on the first antibody in very small volume, of the order of a few microliters, in a microplate containing a large number of wells.
L'opérateur doit donc pipeter des solutions en très faibles volumes et les transférer dans les puits d'une plaque de microtitration constituée de 96 ou 384 puits par exemple. Les difficultés essentielles sont la précision du pipetage et la distribution dans les micro-puits, sans erreur volumétrique. The operator must therefore pipette solutions in very low volumes and transfer them into the wells of a microtiter plate consisting of 96 or 384 wells for example. The main difficulties are the precision of the pipetting and the distribution in the microwells, without volumetric error.
Les solutions biologiques sont généralement incolores et il est par conséquent difficile pour l'opérateur de contrôler si la solution a été déposée au bon volume et dans le bon puits. The biological solutions are generally colorless and it is therefore difficult for the operator to control whether the solution has been deposited at the right volume and in the well.
Dans un certain nombre cas, dont le test ELISA , le protocole indique l'ajout de deux solutions dans le même puits, comme évoqué précédemment. L'opérateur n'a donc pas de moyens pour lui permettre de vérifier que ces réactifs ont été distribués dans le bon puits, et qu'il n'en a pas déposé deux fois dans le même, ou encore qu'il n'en a pas déposé du tout. Par exemple, si l'on dépose dans un premier temps 20 p1 d'une solution d'un réactif, puis 100 pl d'une seconde solution d'un second réac:tif, il n'est pas possible de mettre en évidence d'éventuelles erreurs de pipetage, cela n'étant visible ni à l' oeil ni à l'aide d'un appareil. In a number of cases, including the ELISA test, the protocol indicates the addition of two solutions in the same well, as mentioned previously. The operator therefore has no means to allow him to verify that these reagents were distributed in the right well, and that he has not deposited two times in the same, or that he has not deposited at all. For example, if 20 μl of a solution of a reagent and then 100 μl of a second solution of a second reactant are first deposited, it is not possible to demonstrate possible pipetting errors, this not being visible to the eye or using a device.
Dans le cadre du test ELISA , ce problème ne concerne bien entendu que le dépôt de l'échantillon biologique et le dépôt du second anticorps, le premier anticorps étant préalablement fixé au fond du puits. In the context of the ELISA test, this problem naturally concerns only the deposition of the biological sample and the deposition of the second antibody, the first antibody being previously fixed at the bottom of the well.
La présente invention a pour but de résoudre le problème exposé ci-dessus, et concerne à cet effet, d'une manière générale, un procédé pour la réalisation de test biologiques, notamment par immunodosage, consistant à déposer dans un flacon de réaction ou puits, une solution d'un premier réactif selon un volume prédéterminé, puis une solution d'un second réactif selon un volume prédéterminé, caractérisé en ce que : - le premier réactif est dilué dans un colorant de couleur choisie de manière à visualiser sa présence dans le puits, le second réactif est dilué dans un colorant de couleur choisie, mais différente du précédent, de manière à visualiser sa présence dans le puits par mélange des couleurs, donnant naissance à une troisième couleur. The aim of the present invention is to solve the problem set out above, and for this purpose generally relates to a method for carrying out biological tests, in particular by immunoassay, consisting in depositing in a reaction flask or well. , a solution of a first reagent according to a predetermined volume, then a solution of a second reagent according to a predetermined volume, characterized in that: the first reagent is diluted in a color dye chosen so as to visualize its presence in the well, the second reagent is diluted in a dye of a chosen color, but different from the previous one, so as to visualize its presence in the well by mixing the colors, giving rise to a third color.
L'invention concerne également les caractéristiques qui ressortiront au cours de la description qui va suivre, et qui devront être considérées isolément ou selon toutes leurs combinaisons techniques possibles. The invention also relates to the features which will emerge during the following description, which should be considered in isolation or in all their possible technical combinations.
Cette description donnée à titre d'exemple non limitatif, fera mieux comprendre comment l'invention peut être réalisée en référence au dessin annexé sur lequel: La figure unique représente, schématiquement et à titre d'exemple, le fonctionnement d'un test ELISA selon le procédé de l'invention. This description given by way of non-limiting example, will better understand how the invention can be made with reference to the accompanying drawing in which: The single figure shows, schematically and by way of example, the operation of an ELISA test according to the process of the invention.
Le procédé selon l'invention consiste donc dans son principe à colorer de deux couleurs distinctes les solutions utilisées dans le test, de telle manière que, d'une part, le dépôt d'un petit volume de quelques microlitres soit aisément repérable par l'expérimentateur, et que d'autre part, le mélange des deux solutions colorées produise un changement de couleur résultant, couleur qui pourra être caractéristique de la bonne distribution des réactifs. The method according to the invention therefore consists in principle of coloring the solutions used in the test in two distinct colors, so that, on the one hand, the deposition of a small volume of a few microliters is easily identifiable by the Experimenter, and that on the other hand, the mixture of the two colored solutions produces a resulting color change, which color may be characteristic of the good distribution of reagents.
Comme le montre bien la figure, - le premier réactif est dilué dans un colorant de couleur choisie X de manière à visualiser sa présence dans le puits 1, - le second réactif est dilué dans un colorant de couleur choisie Y, mais différente du précédent, de manière à visualiser sa présence dans le puits 1 par mélange des couleurs X et Y, donnant naissance à une troisième couleur z.. As the figure clearly shows, the first reagent is diluted in a selected colorant X in order to visualize its presence in well 1, the second reagent is diluted in a chosen colorant Y, but different from the previous one, in order to visualize its presence in the well 1 by mixing the X and Y colors, giving rise to a third color z.
Concernant plus particulièrement le test biologique du type ELISA , celui-ci consiste à déposer, sur un premier anticorps fixé dans un flacon de réaction ou puits, un échantillon biologique contenant le virus, puis à déposer un second anticorps spécifique du même virus recherché sur lequel est fixée une enzyme. With particular reference to the ELISA-type biological test, it consists in depositing, on a first antibody fixed in a reaction flask or well, a biological sample containing the virus, then depositing a second antibody specific for the same desired virus on which an enzyme is fixed.
Dans ce cas, le procédé selon l'invention est remarquable par les étapes suivantes : l'échantillon biologique est dilué dans un colorant de couleur choisie X, le second anticorps est dilué dans un colorant de couleur choisie Y, mais différente du précédent, on dépose dans le puits, sur le premier anticorps, l'échantillon biologique de couleur choisie X, selon un volume prédéterminé, - on effectue un contrôle visuel ou spectrophotométrique du dépôt réel de l'échantillon biologique dans l'ensemble des puits 1 du fait de leur coloration 25 volumétrique X, - on dépose dans le puits, sur l'échantillon biologique de couleur X, le second anticorps de couleur choisie Y, selon un volume prédéterminé, 30 - on effectue un contrôle visuel ou spectrophotométrique du dépôt réel du second anticorps sur l'échantillon biologique dans 20 les puits, du fait du changement de coloration de l'ensemble par mélange de l'échantillon biologique de couleur X avec le second anticorps de couleur Y, donnant une nouvelle couleur Z. In this case, the process according to the invention is remarkable by the following steps: the biological sample is diluted in a selected colorant X, the second antibody is diluted in a chosen colorant Y, but different from the previous one, depositing in the well, on the first antibody, the selected color biological sample X, according to a predetermined volume, - a visual or spectrophotometric check is made of the actual deposit of the biological sample in all the wells 1 due to their X-volumetric coloring is deposited in the well, on the X-colored biological sample, the second selected color antibody Y, according to a predetermined volume, a visual or spectrophotometric control of the actual deposit of the second antibody is carried out. on the biological sample in the wells, because of the change in coloration of the whole by mixing the biological sample of color X with the second antic Orps of color Y, giving a new color Z.
L'invention concerne également les kits ou trousses d'analyse biologique, plus particulièrement les immunoessais de type ELISA mis en oeuvre dans les laboratoires de recherche, ou laboratoires cliniques. Les échantillons biologiques sont souvent disponibles en faible quantité notamment lorsque plusieurs analyses différentes sont requises pour un même échantillon. Afin de les réaliser sur les échantillons dans de meilleures conditions de spécificité, il est souvent nécessaire de diluer ces échantillons. De plus, ces méthodes d'analyses étant très sensibles, il ne faut utiliser que de très faibles quantités d'échantillons pour réaliser les tests. The invention also relates to kits or kits for biological analysis, more particularly ELISA type immunoassays used in research laboratories, or clinical laboratories. Biological samples are often available in small quantities, especially when several different analyzes are required for the same sample. In order to perform them on samples under better specificity conditions, it is often necessary to dilute these samples. In addition, since these analytical methods are very sensitive, only very small quantities of samples should be used to perform the tests.
L'invention vise à utiliser une solution colorée pour diluer l'échantillon à analyser et le rendre visible même en très faible volume (quelques microlitres). L'utilisation de solutions en très faibles volumes, distribuées manuellement dans une plaque de microtitration est donc contrôlable visuellement et très simplement. The aim of the invention is to use a colored solution to dilute the sample to be analyzed and make it visible even in very small volumes (a few microliters). The use of solutions in very low volumes, manually distributed in a microtiter plate is therefore controllable visually and very simply.
Dans une trousse de dosage des immunoglobulines humaines, les échantillons contenant sont dilués au 1/100ème dans la solution de dilution, de couleur bleu. 20 p1 de la dilution sont déposés dans un puits de plaque de microtitration. 100 pl de la solution colorée en rouge (contenant les réactifs de détection des IgG (immunoglobulines) humaines), sont ensuite additionnés aux 20 pl de solution bleue, formant une coloration violette de la solution dans le micro-puits. La nuance de violet peut éventuellement être contrôlée en plaçant la microplaque dans un lecteur de microplaque à 492 et 620 nm (nanomètres). A défaut on pourra remarquer visuellement une erreur de volume de solution X comme une erreur sur la solution Y par une différence significative de la couleur Z violette attendue. In a human immunoglobulin assay kit, the containing samples are diluted 1/100 in the dilution solution, blue in color. 20 μl of the dilution are deposited in a microtiter plate well. 100 μl of the red stained solution (containing the IgG (immunoglobulin) detection reagents) are then added to the 20 μl of blue solution, forming a purple coloration of the solution in the microwell. The violet shade can optionally be controlled by placing the microplate in a microplate reader at 492 and 620 nm (nanometers). Otherwise, a solution volume error X can be visually noticed as an error on the Y solution by a significant difference in the expected violet Z color.
A l'issue de la phase d'incubation, les micro-puits sont vidés et lavés éliminant toute coloration. La réaction d'immuno-essai peut se dérouler classiquement comme tout ELISA, à savoir la révélation de l'activité enzymatique, proportionnelle à la quantité d'IgG (immunoglobulines) présentes dans l'échantillon à analyser. At the end of the incubation phase, the microwells are emptied and washed, eliminating any coloration. The immunoassay reaction can proceed conventionally as any ELISA, namely the revelation of the enzymatic activity, proportional to the amount of IgG (immunoglobulins) present in the sample to be analyzed.
Selon les avantages procurés par l'invention, la coloration de la solution X de dilution de l'échantillon en bleu, permet d'une part de rendre visible le dépôt d'un très faible volume de celui-ci dans le puits de microtitration, ce qui est impossible à contrôler sans cette coloration. According to the advantages provided by the invention, the coloration of the sample dilution solution X in blue makes it possible on the one hand to make visible the deposition of a very small volume of it in the microtiter well, which is impossible to control without this coloring.
La coloration en rouge de la solution Y contenant le réactif dit conjugué enzymatique permet après mélange d'obtenir une coloration Z violette très nette et prouve que les réactifs ont bien été déposés, qui plus est au bon volume. The red coloring of the solution Y containing the so-called enzymatic conjugate reagent makes it possible, after mixing, to obtain a very sharp purple Z-coloration and proves that the reagents have been deposited, which moreover is at the right volume.
A titre d'exemple, nous allons décrire un test où l'expérimentateur doit déposer 20 p1 de la solution X (bleue) et 100 pl de la solution Y (rouge). As an example, we will describe a test where the experimenter must deposit 20 μl of solution X (blue) and 100 μl of solution Y (red).
Si dépôt correct de 1 x 20 pl de la solution X (bleue) dans le puits 1, et 1 x 100 p1 de la solution Y (rouge) : le mélange sera de couleur violet prononcé. Si dépôt de 2 x 20 pl de la solution X (bleue) dans le puits, et 1 x 100 pl de la solution Y (rouge) . la couleur du mélange sera bleue, visible à l'oeil, donc erreur visible directement. Si oubli de dépôt de la solution X (bleue) couleur rouge, donc erreur visible directement. Si dépôt de lx 20 pl de la solution X (bleue), et dépôt de 2 x 100 pl de solution Y (rouge) . mélange d'une couleur violet pâle, donc erreur visible directement.. If correct deposit of 1 x 20 μl of solution X (blue) in well 1, and 1 x 100 μl of solution Y (red): the mixture will be of pronounced purple color. If 2 x 20 μl of solution X (blue) is deposited in the well, and 1 x 100 μl of solution Y (red). the color of the mixture will be blue, visible to the eye, therefore visible error directly. If you forget to deposit solution X (blue) red color, so visible error directly. If 1 x 20 μl of solution X (blue), and 2 x 100 μl of solution Y (red). mix of a pale purple color, so visible error directly ..
Selon l'avantage procuré par l'invention, sans coloration des solutions en présence, les erreurs précitées seraient quasiment indétectables. According to the advantage provided by the invention, without staining of the solutions present, the aforementioned errors would be virtually undetectable.
A noter également que lorsque l'on réalise de nombreux essais simultanément, plusieurs microplaques de 96 puits, après dépôt des échantillons, les plaques peuvent être contrôlées par lecture dans un lecteur de microplaques par spectrophotométrie permettant de plus la détection d'erreurs de pipetage volumétrique. It should also be noted that when carrying out numerous tests simultaneously, several microplates of 96 wells, after deposit of the samples, the plates can be controlled by reading in a microplate reader by spectrophotometry allowing further detection of volumetric pipetting errors. .
L'invention concerne également une trousse pour la mise en oeuvre du procédé qui vient d'être décrit, contenant : - - - - La des puits de microplaques revêtus d'anticorps anti-immunoglobulines humaines, prêts à l'emploi, la solution de diluant pour les échantillons (colorée en bleu), une solution rouge contenant le conjugué enzymatique à mélanger avec l'échantillon dilué, pour former une coloration violet, une gamme de contrôles pour permettre de faire le dosage, une solution de révélation ou substrat, une solution d'arrêt. trcusse permet de réaliser le test dans son 15 intégralité.. The invention also relates to a kit for carrying out the method which has just been described, containing: - - - - - The microplate wells coated with anti-human immunoglobulin antibodies, ready to use, the solution of diluent for the samples (stained blue), a red solution containing the enzyme conjugate to be mixed with the diluted sample, to form a violet stain, a range of controls to make the assay, a revealing solution or substrate, a stop solution. trcusse makes it possible to carry out the test in its entirety.
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- 2007-07-13 FR FR0705099A patent/FR2918754B1/en active Active
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