FR2892820A1 - Demonstrating anti-antigen/antibody blood comprises e.g. contacting antibody viscous solution with antigen bound magnetic particles, incubating to form complex, applying magnetic field and taking reading of obtained image - Google Patents

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Abstract

Demonstrating a specific antibody/antigen complex formation comprises: filling a viscous substance into a reactor to partly coat the inclined wall of the reactor; contacting the obtained viscous solution having the antibody with the magnetic particles carrying the antigen; incubating the reactor until complex formation; applying a magnetic field to the reactor and agitating the reactor so that the magnetic particles are led towards the bottom and/or the inclined wall of the reactor; and taking a reading of the obtained image at the bottom and/or at the coated inclined wall of the reactor. Demonstration process of a specific antibody/antigen complex formed by the reaction of an antibody present in a solution and an antigen bound to magnetic particles in a reactor having open top and closed bottom, where a portion heading towards the bottom decreases to form an inclined wall, which is partly coated with an anti-immunoglobulin or other compounds capable of binding with the antibody of the complex comprises: filling a viscous substance or a homogeneous gel in to the reactor to partly coat the inclined wall; contacting the obtained viscous solution or suspension containing the antibody with the magnetic particles carrying or likely to carry the antigen; incubating the reactor until the complex formation; applying a magnetic field to the reactor and agitating the reactor, in such manner that the magnetic particles are led towards the bottom and/or the inclined wall of reactor; and taking reading of the obtained image at the bottom of the reactor and/or at the coated inclined wall by eyes and/or any other reading system, where the images demonstrates presence or absence of the specific antibody/antigen complex. Independent claims are included for: (1) a demonstration device of the complex comprises a reactor or a set of reactors opened towards the top and closed bottom and of which the section decreases in the neighboring zone of the bottom to form an inclined wall extending towards the bottom, where each reactor is filled partly by a viscous substance or a gel, a magnet or a set of magnets located externally under the reactor and coupled with the rotating agitating system of the reactors, optionally, an incubator to regulate the temperature of reactor, and optionally, a reader to evaluate the presence and the localization of magnetic erythrocytes at the end of the reaction of each reactor; and (2) a kit for the demonstration of the specific complex comprising a reacting agent comprising a suspension of coated magnetic particles or to be coated with the antigen, the reactor or the set of reactors, a container containing the viscous solution or the gel, or optionally each reactor is filled partly by the viscous substance or of the gel, and optionally, the magnet or the set of magnets.

Description

La présente invention concerne un procédé magnétique d'immunodiagnostic The present invention relates to a magnetic immunodiagnostic method

pour la mise en évidence de complexe anticorps/antigène. for the detection of antibody / antigen complex. Un tel procédé a pour application la recherche et/ou l'identification d'anticorps ou d'antigène, de préférence d'anticorps anti-antigène ou d'antigène de groupe sanguin, ce procédé mettant en oeuvre une suspension de particules magnétiques revêtues d'antigène pouvant être porté par des cellules telles que des érythrocytes. Such a method has application to mark and / or identification of antibodies or antigen, preferably anti-blood group antigen or antigen antibody, this method using a suspension of magnetic particles coated with antigen may be increased by cells such as erythrocytes. L'invention comprend également un dispositif et un kit permettant de réaliser un tel procédé. The invention also includes a device and a kit for carrying out such a method. La transfusion sanguine consiste de nos jours à administrer par voie intraveineuse des préparations de concentré de globules rouges (concentrés globulaires) 10 obtenues à partir de sang de donneurs. Blood transfusion is nowadays administering intravenous preparations of red blood cell concentrate (concentrated red blood cells) obtained from 10 blood donors. Lors d'une transfusion sanguine, le risque premier est lié à la possibilité de réunir dans l'organisme du receveur (la personne transfusée) un anticorps et son antigène érythrocytaire. During a blood transfusion, the first risk relates to the possibility of convening in the body of the recipient (the person transfused) an antibody and its erythrocyte antigen. On trouve en effet à la surface des érythrocytes, appelés encore globules rouges ou hématies, des antigènes membranaires érythrocytaires, notamment 15 des antigènes de groupe (ou système) sanguin, capables d'être reconnus par le système immunitaire et de déclencher une réponse immune. erythrocytes found in effect at the surface, still called RBCs or erythrocytes, erythrocyte membrane antigens, including 15 of the group antigens (or system) blood, capable of being recognized by the immune system and trigger an immune response. Les globules rouges du donneur sont dits compatibles avec le sang du receveur si le receveur ne présente pas d'anticorps circulants dirigés contre un antigène érythrocytaire du donneur. Red blood cells from the donor are said to be compatible with the blood of the recipient if the recipient does not have circulating antibodies directed against an erythrocyte antigen of the donor. 20 Parmi l'ensemble des variants antigéniques d'un antigène membranaire érythrocytaire constituant les groupes sanguins, plus de vingt systèmes antigéniques érythrocytaires chez l'Homme ont été à ce jour identifiés : système ABO avec les antigènes A ou B, système Rhésus avec l'antigène D, E ou e et C ou c, système Kell avec l'antigène K ou k, Duffy (Fya, Fyb), Kidd (Jka, Jkb) ou encore d'autres systèmes 25 moins fréquemment recherchés en pratique existant aussi tels que MNS, Lewis, etc.. Les individus présentant une même association d'antigènes érythrocytaires appartiennent à un même groupe sanguin érythrocytaire. 20 Of all the antigenic variants of erythrocyte membrane antigen constituting the blood groups, more than twenty erythrocyte antigen systems in humans have been identified to date: ABO system with the antigens A or B, Rhesus system with the antigen D, e or e and C or c, Kell system with the antigen or K k, Duffy (Fya, Fyb), Kidd (Jka, Jkb) or other systems 25 less frequently sought in existing practice also such as MNS, Lewis, etc .. individuals with the same association of erythrocyte antigens belong to the same erythrocyte blood group. Les groupes sanguins sont d'autant plus complexes et nombreux que l'on utilise plusieurs systèmes antigéniques. Blood groups are even more complex and numerous that one uses more antigenic systems. En dehors de situation pathologique, dans le cas par exemple de maladie auto- 30 immune, le sérum d'un individu peut contenir deux types d'anticorps dirigés contre des antigènes érythrocytaires : - (i) les anticorps dits réguliers et dirigés contre les antigènes du système ABO (par exemple anticorps anti-A chez l'individu de groupe B). Outside pathological situation in the case for example of 30 self immune disease, the serum of an individual may contain two types of antibodies directed against blood group antigens: - (i) regular said antibodies directed against antigens ABO (e.g. anti-A antibodies in the group of individual B). Il s'agit d'immunoglobulines de type IgM qui sont capables d'agglutiner les globules rouges in vitro. These IgM type of immunoglobulin which are capable of agglutinating red blood cells in vitro. Ce phénomène est mis à profit pour déterminer le groupe ABO d'un individu par les épreuves de Beth-Vincent et Simonin, l'épreuve de Beth-Vincent permettant de déterminer les antigènes portés par les globules rouges de l'individu (phénotype antigénique) et l'épreuve de Simonin permettant de réaliser l'étude complémentaire, c'est-à-dire de déterminer les anticorps anti-A et/ou anti-B circulants présents dans le sérum de l'individu. This phenomenon is utilized to determine the ABO group of an individual by test Beth Vincent and Simonin, Beth Vincent test for determining the antigens carried by the red blood cells of the individual (antigenic phenotype) and Simonin test for performing the supplementary study, that is to say to determine the anti-A antibody and / or anti-B circulating in the serum of the individual. Dans l'épreuve de Beth-Vincent, les globules rouges de l'individu sont mis en présence de sérums tests, ou anticorps tests, possédant chacun un type d'anticorps précis, dirigé contre un antigène du système ABO. In the test of Beth Vincent, red blood cells of the individual are placed in the presence of test sera, or antibody tests, each with a specific type of antibody directed against an antigen of ABO system. Il s'agit donc d'un test d'agglutination des globules rouges avec des sérums tests. It is therefore an agglutination of red blood cells with test sera. Dans l'épreuve de Simonin, appelée encore contre-épreuve, le sérum de l'individu, contenant ses anticorps circulants, est mis en présence de globules rouges tests, ou érythrocytes tests, appartenant chacun à un groupe antigénique précis du système ABO. In the Simonin test, also called against-test, serum of the individual, containing its circulating antibodies is brought into red blood tests, or erythrocyte tests, each belonging to a specific antigen group of the ABO system. Il s'agit donc d'un test d'agglutination du sérum avec des globules rouges tests : - (ii) les anticorps dits irréguliers (ou immuns) dont la présence dans le sérum ou plasma est facultative et qui sont dirigés contre des antigènes des systèmes non ABO. It is therefore a serum agglutination test with test red blood cells: - (ii) said irregular antibodies (or immune) whose presence in serum or plasma is optional and which are directed against antigens of the systems not ABO. Il s'agit le plus souvent d'IgG, apparaissant à l'occasion d'une stimulation antigénique par des globules rouges étrangers, par exemple suite à une immunisation contre un ou plusieurs antigènes lors d'une transfusion sanguine ou encore lors d'une grossesse par réaction immunitaire maternelle dirigée contre les antigènes érythrocytaires foetaux n'appartenant pas au groupe sanguin maternel, notamment lors de l'accouchement. This is usually IgG, appearing on the occasion of antigenic stimulation by foreign red cells, for example following an immunization against one or more antigens in a blood transfusion or during a pregnancy maternal immune reaction directed against the erythrocytic fetal antigens not belonging to the maternal blood, particularly during delivery.

La recherche de ces anticorps dits irréguliers est appelée Recherche d'Agglutinine Irrégulière (RAI). The search for these so-called irregular antibodies is called the Irregular Agglutinin Research (IAR). Ce test est utilisé pour détecter la présence ou non dans le sang d'un individu d'IgG dirigées contre divers antigènes érythrocytaires. This test is used to detect the presence or not in the blood of an individual IgG directed against different blood group antigens. Pour cela, on cherche à mettre en évidence la fixation de ces IgG sur des globules rouges tests dont les antigènes sont connus. For this, we seek to highlight the setting of these IgG red blood tests whose antigens are known. On procède en parallèle sur de nombreux types de globules rouges, la comparaison des résultats permettant d'identifier l'IgG ou les IgG présentes. in parallel is carried out on many types of red blood cells, comparing the results to identify the IgG or the IgG present.

Le risque est plus important pour les antigènes les plus immunogènes comme le rhésus D mais aussi les autres rhésus (E>c>e>C), le Kell (K), le Duffy (Fy a, Fy b), le Kidd (Jka, Jk b), etc.. En pratique, on ne peut tenir compte de tous ces antigènes pour réaliser une transfusion faute de quoi on ne disposerait jamais du bon groupe sanguin au bon moment, d'autant moins que certaines associations antigéniques sont très rares. The risk is greater for the most immunogenic antigens such as Rhesus D but also other rhesus (E> c> e> C), Kell (K), Duffy (Fy a, Fy b), Kidd (Jka , Jk b), etc .. in practice, we can not consider all of these antigens to make a mistake transfusion what you never would have the right blood group at the right time, especially as some antigenic associations are very rare . La transfusion standard ne tient compte que du groupe dans le système ABO plus le Rhésus D (Rh+ ou Rh-). Standard transfusions only considers the group in the ABO system plus Rhesus D (Rh + or Rh). Dans les situations à risque d'apparition d'une agglutinine irrégulière, on tient compte d'un certain nombre d'autres systèmes, notamment les Rhésus C et E et le Kell, voire encore d'autres systèmes. In situations at risk of developing an irregular agglutinin, considering a number of other systems, including Rhesus C and E and Kell, or even other systems. Il s'agira alors pour ces situations à risques de respecter la compatibilité du groupe sanguin du donneur avec celui du sang du receveur en tenant compte de la présence ou du risque d'apparition de ces agglutinines irrégulières. It will then be for these risk situations to respect the compatibility of the donor's blood with the blood of the recipient, taking into account the presence or risk of occurrence of these irregular antibodies. Ainsi, chez un patient receveur porteur d'anticorps irréguliers anti- érythrocytaires ou dans une situation à risque comme notamment chez les patients polytransfusés ne possédant pas d'anticorps irréguliers anti-érythrocytaires et chez la femme enceinte, il est indispensable de sélectionner les unités de concentrés érythrocytaires qui vont lui être transfusées de telle sorte que les globules rouges du donneur devront être dépourvus des antigènes contre lesquels les anticorps du receveur sont dirigés ou susceptibles d'apparaître. Thus, in an irregular antibody carrying anti erythrocyte recipient patient or in a risky situation as especially in multi-transfused patients that have no red cell irregular antibodies and in pregnant women, it is essential to select units erythrocyte concentrates which are to be transfused to him such as red blood cells from the donor will be devoid of the antigens against which the recipient of the antibodies are directed or may appear. Cette épreuve de compatibilité est obligatoire chez ces patients et de manière préventive chez tous les receveurs avant l'administration des concentrés érythrocytaires en effectuant une épreuve de compatibilité directe avec les hématies du donneur en présence du sérum ou plasma du receveur. This compatibility test is mandatory in these patients preventively in all recipients before the administration of red blood cells by performing a direct-matched with the donor red cells in the presence of serum or plasma of the recipient. Aucune réaction d'agglutination et/ou de lyse dans les techniques utilisées pour la RAI ne doit être observée. No agglutination reaction and / or lysis in the techniques used for RAI must be observed. En pratique clinique transfusionnelle, le phénotypage érythrocytaire, qui correspond à la recherche et à l'identification des antigènes de groupe sanguin à la surface des hématies (à l'exception du système particulier ABO où l'on recherche en outre la présence des anticorps réguliers correspondants), concerne aussi bien le receveur que le donneur. Transfusion clinical practice, erythrocyte phenotyping, which is the research and identification of blood group antigens on the surface of red blood cells (except where particular ABO also one for the presence of antibodies regular correspondents), concerns both the recipient and the donor.

A l'échelon du receveur et du donneur, trois niveaux de phénotype érythrocytaire existent afin de mettre à disposition du receveur des concentrés érythrocytaires compatibles en fonction des situations à risque : - la détermination du phénotype groupage ABO (ou groupage ABO) et Rhésus standard (présence ou absence de l'antigène D) ; At the level of the recipient and the donor, three levels of erythrocyte phenotype exist in order to provide the recipient of compatible red blood cells based on risk situations: - determining the ABO grouping phenotype (or ABO) and standard rhesus ( presence or absence of the D antigen); - la détermination du phénotype Rhésus Kell (présence ou absence des antigènes C, E, e, e et K) ; - determining the Kell phenotype Rhesus (presence or absence of antigens C, E, E, E and K); et - la détermination du phénotype étendu (ou élargi) (présence ou absence des antigènes du système Duffy, Fy a et Fy b, du Système Kidd, Jk a et Jk b, et du système MNSs (antigènes S et s), d'autres antigènes pouvant être en outre recherchés selon la nature du risque et/ou de l'anticorps irrégulier mis en évidence dans le sérum du receveur. Les techniques habituellement utilisées, mises en oeuvre pour rechercher et identifier la présence ou l'absence d'antigène de groupe sanguin à la surface d'érythrocyte de donneur et/ou de receveur, ou visant à rechercher et identifier la présence ou l'absence d'anticorps anti-antigène de groupe sanguin, régulier (pour le groupage ABO) ou irrégulier dans le cadre de la RAI dans le sérum ou plasma de donneur et/ou de receveur, sont bien connues de l'homme de l'art et ne seront ici pas décrites. Pour le phénotypage, elles consistent en général à rechercher à l'aide de sérums-tests contenant les anticorps appropriés l and - determining the extended phenotype (or enlarged) (presence or absence of the Duffy antigen, Fy a and Fy b, Kidd system, Jk a, and Jk b, and MNSs system (S antigens and s) of other antigens may be further sought by the nature of the risk and / or irregular antibodies highlighted in the recipient's serum. the commonly used techniques, implemented to search for and identify the presence or absence of antigen of blood to the donor erythrocyte surface and / or recipient, or to search for and identify the presence or absence of anti-antigen antibodies blood type, regular (for ABO grouping) or in irregular part of the RAI in serum or plasma donor and / or recipient, are well known to those skilled in the art and will not described here. for phenotyping, they generally consist of search using serum tests containing the appropriate antibodies a présence ou l'absence de l'antigène recherché. a presence or absence of the antigen sought. De préférence, ces anticorps contenus dans ces sérums tests sont de nature agglutinante (IgM ou IgA), ce qui permet d'obtenir une agglutination totale ou partielle des érythrocytes à phénotyper lorsque ces derniers portent l'antigène correspondant à l'anticorps présent dans le sérum test. Preferably, these antibodies contained in these test sera are agglutinating nature (IgM or IgA), which allows to obtain a total or partial agglutination of erythrocytes phenotype when they carry the antigen corresponding to the antibody present in the serum test. Néanmoins, il est possible d'utiliser des anticorps tests non agglutinants (de type IgG), l'agglutination étant provoquée au moyen d'une anti-immunoglobuline et visible notamment après une étape de centrifugation et remise en suspension du culot obtenu (technique dite de Coombs indirect). Nevertheless, it is possible to use non-agglutinating test antibodies (IgG), the agglutination being caused by an anti-immunoglobulin and visible in particular after a centrifugation step and resuspension of the resulting pellet (known technique indirect Coombs). Il est également possible d'utiliser des anticorps tests non agglutinants où la présence de ces anticorps tests fixés sur le globule rouge est visualisée au moyen d'une anti-immunoglobuline fixée sur une phase solide (technique dite d'immuno-adhérence). It is also possible to use non-agglutinating antibody tests where the presence of these antibody tests attached to the red blood cell is visualized using an anti-immunoglobulin attached to a solid phase (so-called technique of immuno-adhesion). La lecture du résultat pourra être réalisée à l'oeil ou au moyen de lecteur approprié. Reading the result can be achieved by eye or by means of appropriate drive.

Pour la recherche et l'identification dans l'échantillon de sérum ou plasma du patient à tester d'anticorps anti-antigènes de groupe sanguin, réguliers pour le groupage ABO ou irréguliers dans le cadre de la RAI, on met en général en présence du sérum ou du plasma du patient avec des érythrocytes-tests (appelés encore hématies-, ou globules rouges-tests, d'antigénicité connue dans un certain nombre de systèmes de groupes sanguins (ABO, Rhésus, Kell, Duffy, Kidd, MNSs, ...). Pour la RAI, pour laquelle les anticorps susceptibles d'être présents sont plutôt de type non agglutinant, les techniques utilisées sont de type Coombs indirect par agglutination au moyen d'une antiimmunoglobuline ou par immunoadhérence sur une phase solide revêtue d'une anti- immunoglobuline. Pour la RAI, on utilise dans une première étape un panel de globules rouges dit de dépistage (deux ou trois globules rouges de groupe différent choisis de façon à comporter le maximum d'antigènes) To search and identification in the serum sample or patient plasma to be tested for anti-blood group antigens of antibody, for the regular or irregular ABO grouping as part of the RAI, it is generally brought into the serum or plasma patient with erythrocyte-test (called yet hématies-, or red blood cell tests, known antigenicity in a number of blood group systems (ABO, Rh, Kell, Duffy, Kidd, MNSs,. ...) for RAI, for which antibodies may be present are rather of non-caking type, the techniques used are indirect Coombs type by agglutination using an anti-immunoglobulin or by panning on a solid phase coated with an anti-immunoglobulin. for the RAI is used in a first step a sample of red blood cells said screening (two or three different red blood cell group selected so as to have the maximum antigens) permettant de détecter (mais pas d'identifier) la présence ou l'absence d'anticorps irréguliers. for detecting (but not identified) the presence or absence of irregular antibodies. Lorsque le dépistage est positif, on réalise alors l'identification de la spécificité du ou des anticorps irréguliers présents au moyen d'au moins un panel de globules rouges dit d'identification comportant en général 10 globules rouges différents phénotypés dans la grande majorité des systèmes de groupes sanguins connus. When screening is positive, then performs identification of the specificity of the irregular antibodies present by means of at least a panel of red cells having said identification generally 10 different phenotyped red blood cells in the vast majority of systems known blood groups. Il existe un grande nombre de variantes des techniques utilisées pour le phénotypage ou la RAI dans le domaine de la transfusion sanguine, ces techniques pouvant être manuelles, sur plaque d'opaline, en tube ou en cupule de microplaque, ou complètement automatisées à l'aide de robot distributeur d'échantillon et de réactif, agitateur, incubateur et lecteur automatique dont les programmes sont adaptés aux techniques mises en oeuvre. There are a large number of variants of the techniques used for phenotyping or RAI in the field of blood transfusion, these techniques can be manual, plate opaline, tube or microtiter well, or completely automated in using sample distributor robot and reagent, stirrer, incubator and automatic reader of programs is adapted to the technical implementations. Parmi les techniques utilisées, on peut citer les techniques pour lesquelles la présence d'anticorps anti-antigène de groupe sanguin ou d'antigène de groupe sanguin est basée sur la mise en évidence d'une agglutination de globules rouges après centrifugation mettant en oeuvre une mini colonne de filtration transparente (gel type sephadex ou microbilles) dont l'évasement à l'extrémité supérieure sert de chambre d'incubation et dont le seuil de coupure choisi pour la colonne empêche les hématies agglutinées après centrifugation de traverser la colonne (voir notamment le document brevet EP 0 194 212 ou brevet EP 0 755 719). Among the techniques used include techniques for which the presence of blood group antigen or anti-blood group antigen antibodies is based on the detection of agglutination of red blood cells after centrifugation implementing a mini transparent filtration column (sephadex gel type or microbeads), the flare at the upper end serves as an incubation chamber and the cutoff chosen for the column prevents the RBCs agglutinated after centrifugation through the column (see in particular patent EP 0194212 or EP 0755719).

On peut également citer les techniques pour lesquelles le phénotypage ou la RAI est basée sur la mise en évidence de globules rouges sensibilisés avec un anticorps après centrifugation puis immunoadhérence mettant en oeuvre une barrière de séparation constituée d'un gel ou d'un liquide dont la densité est choisie de telle manière que seuls les globules rouges peuvent traverser cette barrière lors d'une centrifugation, le container à réaction étant revêtu dans sa partie inférieure d'une anti-immunoglobuline afin de piéger les globules rouges sensibilisés et donner une image caractéristique. We may also mention the techniques for which phenotyping or RAI is based on the detection of red blood cells sensitized with an antibody after centrifugation then panning implementing a separation barrier comprises a gel or a liquid whose density is selected such that only the red blood cells can pass through the barrier during centrifugation, the reaction container being coated in its lower part with an anti-immunoglobulin in order to trap red blood cells sensitized and give a characteristic image. Parmi ces techniques, on peut citer le document brevet EP 0 058 780 qui décrit un procédé de phénotypage sanguin dans lequel le mélange réactionnel est centrifugé au travers d'un coussin de densité supérieure (de type solution d'albumine bovine ou de polyvinyl pyrrolidone), ce qui présente l'avantage de supprimer l'étape de lavage des hématies sensibilisées. Among these techniques, there may be mentioned patent EP 0058780 which discloses a blood phenotyping method wherein the reaction mixture is centrifuged through a density greater cushion (type solution of bovine albumin or polyvinyl pyrrolidone) this has the advantage of removing the washing step of sensitized red blood cells. On peut également citer le document brevet WO 98/02752 qui décrit un procédé général pour déterminer la présence d'un antigène sanguin présent sur des érythrocytes ou d'un anticorps fixant un tel antigène. One can also cite the document WO 98/02752 patent that describes a general method for determining the presence of a blood antigen present on erythrocytes or an antibody binding such antigen. Dans ce procédé, les érythrocytes sensibilisés ou non, sont séparés des anticorps non fixés par centrifugation grâce à un milieu de séparation dont la densité est supérieure à celle du liquide contenant les anticorps, mais inférieure à celle des érythrocytes, les érythrocytes sensibilisés étant séparés des érythrocytes non sensibilisés sur la paroi inférieure du container à réaction sur lequel est immobilisée une antiimmunoglobuline, les érythrocytes non sensibilisés étant rassemblés dans le fond du container, l'analyse de l'image finale obtenue étant spécifique de la présence ou non de l'analyte recherché. In this method, erythrocytes sensitized or not, are separated from unbound by centrifugation antibody through a separation medium having a density higher than the liquid containing the antibodies but lower than that of erythrocytes, sensitized erythrocytes are separated from erythrocytes unsensitized on the bottom wall of the reaction container on which is immobilized an anti-immunoglobulin, non-sensitized erythrocytes are collected in the bottom of the container, analyzing the final image obtained being specific for the presence or absence of the analyte research. Parmi les variantes des techniques utilisées pour le phénotypage ou la RAI, on peut également citer celles qui ont été développées de manière générale pour la recherche dans un échantillon d'un analyte capable de se fixer sur une cellule en utilisant des particules magnétiques, ceci notamment afin de supprimer la centrifugation, opération nécessaire notamment dans les techniques basées sur l'agglutination comme la technique à l'antiglobuline (Coombs indirect par agglutination ou par immunoadhérence sur phase solide) pour la RAI ou encore pour le phénotypage, ou encore, comme pour la RAI, lorsqu'il est nécessaire de laver les globules rouges sensibilisés afin d'éliminer les anticorps non spécifiques capables de reconnaître l'anti-immunoglobuline utilisée à l'étape suivante. Among the variants of the techniques used for phenotyping or RAI, we can also mention those that were generally developed for research in a sample of an analyte capable of binding to a cell using magnetic particles, this particular to remove the centrifugation necessary operation including techniques based on agglutination such as technical antiglobulin (indirect Coombs by agglutination or by panning on solid phase) for RAI or for phenotyping, or, as RAI, when it is necessary to wash the red cells sensitized to remove non-specific antibodies capable of recognizing the anti-immunoglobulin used in the next step.

En effet, l'étape de centrifugation est toujours difficile à mettre en oeuvre dans les procédés que l'on souhaite entièrement automatiser, notamment due au coût et à l'encombrement des centrifugeuses, leur manipulation, etc.. Les particules magnétiques sont depuis longtemps utilisées pour la détection de 5 complexes de type ligand-récepteur ou anticorps-antigène, on peut citer par exemple les procédés tels que ceux décrits dans les documents brevets suivants : - le document WO 92/17781 qui décrit une méthode de détermination de la présence d'un ligand dans un échantillon dans laquelle on incube des particules de latex magnétiques, pouvant être de couleurs différentes, revêtues d'une substance, telle un anticorps, capable de 10 se fixer avec ce ligand, puis on applique un champ magnétique au milieu d'incubation et enfin on observe la présence ou l'absence d'agglutination ; Indeed, the centrifugation step is always difficult to implement in processes that you want fully automate, particularly due to the cost and clutter of centrifuges, handling, etc .. The magnetic particles are long used for the detection of five receptor-ligand complexes or antibody-antigen type include for example methods such as those described in the following patent documents: - WO 92/17781 which describes a method of determining the presence a ligand in a sample wherein incubated magnetic latex particles, which may be of different colors, coated with a substance such as an antibody, capable of 10 bind with said ligand, and then applying a magnetic field to the medium incubation and finally observed the presence or absence of agglutination; ou encore - le document EP 0 426 170 qui décrit une méthode de détermination de la présence d'un ligand dans un échantillon, méthode dans laquelle on incube des particules de gélatine magnétiques sensibilisées avec des antigènes ou des anticorps capables de se fixer avec ce 15 ligand, puis on applique un champ magnétique au milieu d'incubation et enfin on observe la présence ou l'absence d'agglutination, ladite méthode étant caractérisée en ce qu'on observe l'état de glissement de ces particules après inclinaison du container, notamment une cupule de microplaque à fond en V. De telles particules magnétiques ont déjà été utilisées en immunohématologie pour 20 le phénotypage et/ou la RAI. or - EP 0426170 which describes a method for determining the presence of a ligand in a sample, in which method incubated magnetic gelatin particles sensitized with antigens or antibodies capable of binding with the 15 ligand, and then applying a magnetic field to the incubation medium and finally observing the presence or absence of agglutination, said method being characterized in that observes the slip state of these particles after inclination of the container, including a bottom microtiter well in V. such magnetic particles have been used in immunohematology for 20 phenotyping and / or RAI. Parmi les documents décrivant de telles applications, on peut citer notamment : - le document EP 0 351 857 qui décrit un procédé de dosage immunologique utilisant des marqueurs magnétisés tels que des anticorps ou des antigènes fixés sur des billes de latex magnétiques. Among the documents describing such applications, there may be mentioned in particular: - EP 0351857 describes an immunoassay method using magnetized markers such as antibodies or antigens attached to magnetic latex beads. Ces marqueurs sont capables de se lier à une substance que l'on 25 souhaite déterminer dans une étape d'immunoréaction, et l'on rassemble ensuite les particules magnétiques à marqueur sur une région prédétel,ninée de la surface d'une paroi dans un récipient de mesure à l'aide d'un aimant positionné sous cette cupule et sous l'action d'un champ magnétique, ce procédé pouvant comprendre une substance qui peut se lier spécifiquement à la substance à déterminer immobilisée sur une région prédéterminée 30 de la surface de la paroi du récipient de mesure. These markers are capable of binding to a substance which is 25 to be determined in an immunoreaction step, and then collects the magnetic particles on a marker prédétel region ninée of the surface of a wall in a measuring container by means of a magnet positioned under the cup under the action of a magnetic field, which method can comprise a substance which can specifically bind to the substance to be determined immobilized on a predetermined region 30 of the surface of the wall of the measuring vessel. Il est décrit notamment une technique RAI par immunoadhérence dans laquelle des érythrocytes préalablement fixés au fond d'une cupule de microplaque sont ensuite sensibilisés avec le sérum du receveur, puis lavés (par aspiration et injection du liquide de lavage), puis dans laquelle cupule on ajoute les billes de latex magnétiques revêtues d'une anti-immunoglobuline avant d'appliquer un champ magnétique ; Described including technical RAI by panning in which erythrocytes previously attached to the bottom of a microtiter well are then sensitized with the recipient's serum and then washed (by aspiration and injection of the washing liquid) and in which cup adds the magnetic latex beads coated with an anti-immunoglobulin before applying a magnetic field; - le document EP 0 528 708 qui décrit un procédé de détection par immunoadhérence d'une substance biologique susceptible d'être présente dans un échantillon. - EP 0528708 describes a method for detecting by immunoadherence a biological substance which may be present in a sample. Dans ce procédé, les érythrocytes à phénotyper ou servant de panel de dépistage et/ou d'identification sont fixés préalablement sur le fond d'une microplaque. In this method, the erythrocyte phenotyping or for screening panel and / or identification are predetermined on the bottom of a microplate. Après sensibilisation des érythrocytes ainsi fixés avec le sérum test (pour le phénotypage) ou le sérum du receveur à tester (pour la RAI), les cupules sont lavées et on ajoute ensuite lo des billes de latex magnétiques revêtues d'anti-immunoglobuline. After sensitization of erythrocytes thus fixed with the test serum (for phenotyping) or the recipient's serum to be tested (for RAI), the wells are washed and then added lo the magnetic latex beads coated with anti-immunoglobulin. Dans ce procédé, on applique notamment deux types de champ magnétique successifs (de type vertical et circulaire) afin de déplacer les particules magnétiques non liées spécifiquement avec la substance à rechercher ; In this process, is applied in particular two types of successive magnetic field (vertical and circular type) to move unbound magnetic particles specifically with the substance to be searched; et - le document brevet EP 0 230 768 qui décrit un procédé de co-agrégation de 15 particules magnétiques capable de se lier à une substance contenue dans un échantillon au moyen de composés polycationiques ou polyanioniques en présence d'un champ magnétique. and - the document EP 0230768 which describes a method of co-aggregation of magnetic particles 15 capable of binding to a substance contained in a sample by means of polycationic or polyanionic compounds in the presence of a magnetic field. Ce document décrit en particulier la séparation du plasma d'un échantillon de sang total contenant des globules rouges dans lequel procédé, on ajoute séquentiellement dans un container placé sur un aimant l'échantillon de sang total et un ferrofluide 20 (FeC12/FeC13) revêtu d'albumine bovine sérique succinylée, les agrégats de particules d'érythrocytes ainsi obtenus étant entraînés vers l'aimant permettant ainsi de récupérer le plasma clarifié par décantation. This document describes in particular the separation of a whole blood sample containing red blood cells plasma in which method sequentially added to a container placed on a whole blood sample magnet and a ferrofluid 20 (FeC12 / FeC13) coated of succinylated bovine serum albumin, red blood cells of aggregates of particles thus obtained being driven towards the magnet and for recovering the clarified plasma by decantation. Dans ce document, il est également décrit un procédé permettant de quantifier la présence d'un anticorps anti-RH (anti-D) dans un échantillon de plasma préparé selon le procédé précédent lequel est incubé en présence d'une suspension 25 de globules rouges RH+ fluorescents et auquel mélange on ajoute ensuite et séquentiellement le ferrofluide succinylé et du polybrène, les globules rouges étant lavés plusieurs fois par application d'un champ magnétique et décantation avant l'ajout d'une anti-immunoglobuline. In this document it is also described a method for quantifying the presence of anti-Rh antibodies (anti-D) in a plasma sample prepared by the above process which is incubated in the presence of a suspension of red blood cells 25 RH + fluorescent and which mixture is then added sequentially and the succinylated ferrofluid and polybrene, red blood cells are washed several times by applying a magnetic field and decanting prior to the addition of an anti-immunoglobulin. La quantification de l'anticorps anti-RH dans l'échantillon de plasma est évaluée par comparaison à des témoins en analysant les fluctuations de quantité 30 de fluorescence observée dans un volume donné. Quantitation of anti-Rh antibodies in the plasma sample is evaluated by comparison with control by analyzing the amount of fluctuations of fluorescence observed 30 in a given volume.

Ainsi, il reste de pouvoir disposer d'un procédé rapide et simple de mise en évidence de la présence d'un anticorps dirigé spécifiquement contre un antigène donné dans un mélange réactionnel complexe contenant notamment des anticorps dirigés contre d'autres antigènes, dans lequel procédé, il n'y ait ni étape de lavage et ni étape de centrifugation. Thus, there remains to have available a rapid and simple method for demonstrating the presence of an antibody specifically directed against a given antigen in a complex reaction mixture containing in particular antibodies directed against other antigens, in which method there is no washing step and no centrifugation step. Un tel procédé sans étape de centrifugation et sans étape de lavage, notamment pour la RAI, aurait comme avantage de pouvoir être mis en oeuvre sur un support pratique et disponible tel qu'une microplaque, et être entièrement automatisé. Such a method without centrifugation step without washing step, especially for RAI would have the advantage of being implemented on a practical and available support such as a microplate, and be fully automated. Ceci est justement l'objet de la présente invention. This is precisely the object of the present invention. Dans un réacteur de type cupule de microplaque à fond rond présentant une paroi inclinée revêtue d'une anti-immunoglobuline capable de se lier spécifiquement à un anticorps, les inventeurs ont mis au point un procédé simple et efficace de mise en évidence de complexe spécifique formé entre un anticorps et un antigène dans un mélange réactionnel complexe pouvant contenir des anticorps libres, notamment dirigés contre d'autres antigènes, ceci sans étape de lavage et sans étape de centrifugation. In a cup-type reactor microplate round bottom having an inclined wall coated with an anti-immunoglobulin capable of specifically binding to an antibody, the inventors have developed a simple and effective method of highlighting specific complex formed between an antibody and an antigen in a complex reaction mixture can contain free antibody, particularly against other antigens, without previous washing step without centrifugation step. Ce procédé met en oeuvre une suspension de particules magnétiques revêtues d'antigène pouvant être porté par une cellule, ce procédé pouvant être largement automatisé et appliqué en particulier à la RAI, et, le cas échéant, au phénotypage de globules rouges. This method implements a suspension of antigen-coated magnetic particles that can be carried by a cell, this process can be largely automated and applied in particular to the RAI and, if appropriate, phenotyping red blood cells. Dans ce procédé la présence du complexe anticorps/antigène est déterminé en fin de réaction par visualisation de la présence du complexe formé sur la paroi inclinée du réacteur par immunoadhérence. In this method the presence of the antibody / antigen complex is determined by the end of reaction by visualization of the presence of the complex formed on the inclined wall of the reactor by panning. Les inventeurs ont mis en évidence de manière surprenante qu'il était possible après incubation d'un mélange réactionnel entre une solution d'anticorps et une suspension de particules magnétiques revêtues d'antigènes, notamment d'érythocytes, ledit mélange réactionnel étant formé dans une cupule au-dessus d'une solution visqueuse ou d'un gel de densité supérieure à la solution d'anticorps, de faire migrer ladite suspension de particules magnétiques au travers de cette solution visqueuse ou de ce gel séparateur vers la paroi inclinée revêtue d'anti-immunoglobuline et/ou le fond de la cupule en utilisant l'action d'un champ magnétique obtenu au moyen d'un aimant situé sous la cupule et de pouvoir visualiser la présence de complexe spécifique formé par immunoadhérence, ceci sans faire migrer les anticorps libres susceptibles de saturer l' anti-immunoglobuline. The inventors have surprisingly demonstrated that it was possible after incubating a reaction mixture between an antibody solution and a suspension of magnetic particles coated with antigens, especially of erythrocytes, said reaction mixture being formed in a cup on top of a viscous solution or a higher density gel to the antibody solution, to migrate said suspension of magnetic particles through the viscous solution or gel of this separator to the inclined wall coated with anti-immunoglobulin and / or the bottom of the cup by using the action of a magnetic field obtained by means of a magnet located in the cup and able to visualize the presence of specific complex formed by panning, without prior migrate free antibodies that could saturate the anti-immunoglobulin.

Les inventeurs ont mis en évidence de manière encore plus surprenante qu'il était possible d'améliorer très avantageusement ce procédé par une action combinée et simultanée du champ magnétique et d'une agitation rotative de la cupule qui non seulement permet de faciliter grandement la migration des particules, notamment revêtues d'érythrocytes, au travers de la solution visqueuse ou de gel, mais également de favoriser la probabilité de rencontre entre les antigènes portés par les particules magnétiques et l'anti-immunoglobuline fixée sur la paroi inclinée et le fond de la cupule. The inventors have demonstrated even more surprisingly it was possible to improve very advantageously by this method a combined and simultaneous action of the magnetic field and a rotary shaking of the cup which not only greatly facilitate migration particles, including coated erythrocytes through the viscous solution or gel, but also to promote the probability of encounter between the antigens carried by the magnetic particles and the anti-immunoglobulin attached onto the inclined wall and the bottom of the cup. Si il a été montré qu'il était possible d'utiliser des solutions visqueuses, ou des gels, de densité supérieure à celle du liquide contenant les anticorps, mais inférieure à celle des érythrocytes, pour séparer par centrifugation des érythrocytes (sensibilisés ou non) des anticorps libres non fixés à ces érythrocytes, ceci pour éviter l'étape de lavage dans les techniques d'immunoadhérence (voir les documents brevets EP 0 058 780 et WO 98/02752 cités précédemment), les inventeurs ont mis en évidence qu'il était également possible d'éliminer également cette étape de centrifugation en utilisant ces substances visqueuses ou gels avec des particules magnétiques porteuses d'antigène, notamment des érythrocytes, au moyen d'un champ magnétique provoqué par un aimant permanent situé à l'extérieur et sous la cupule, en particulier en combinant ce champ magnétique avec une étape d'agitation rotative du réacteur. If it has been shown that it is possible to use viscous solutions, or gels, of greater than that of the liquid density containing the antibodies but lower than that of erythrocytes, for centrifugally separating erythrocytes (sensitized or not) free antibodies not fixed to the erythrocytes, to avoid the washing step in the techniques of panning (see patent EP 0,058,780 and WO 98/02752 mentioned above), the inventors have shown that was also possible to also eliminate this centrifugation step using this viscous substances or gels with magnetic particles carrying antigen, in particular erythrocytes, by means of a magnetic field created by a permanent magnet located outside and under the cup, in particular by combining this magnetic field with a rotary stirring reactor stage.

Ainsi, sous un premier aspect, la présente invention a pour objet un procédé de mise en évidence d'un complexe spécifique formé par réaction entre un anticorps présent dans une solution et un antigène lié à une particule magnétique, la réaction s'effectuant dans un réacteur ouvert vers le haut et à fond fermé et dont la section diminue au moins dans la zone voisine du fond pour former une paroi inclinée s'étendant jusque dans le fond, ladite paroi inclinée étant au moins en partie revêtue d'une anti-immunoglobuline ou de tout autre composé capable de se lier à l'anticorps dudit complexe formé, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) préalablement à la réaction : - le remplissage préalable du réacteur avec une substance visqueuse ou un gel 30 homogène de manière à recouvrir au moins en partie la paroi inclinée du réacteur, b) la mise en contact au-dessus de la solution visqueuse contenue dans le réacteur de la solution contenant o Thus, in a first aspect, the present invention relates to a method of highlighting a specific complex formed by reaction between an antibody present in a solution and an antigen bound to a magnetic particle, the reaction taking place in a open reactor upwards and closed at the base and whose cross-section decreases at least in the region near the bottom to form an inclined wall extending into the base, said angled wall being at least partly coated with an anti-immunoglobulin or any other compound capable of binding to the antibody of said complex formed, characterized in that it comprises the following steps: a) prior to the reaction: - the pre-filling of the reactor with a viscous substance or a homogeneous gel 30 so as to cover at least part of the inclined wall of the reactor, b) contacting over the viscous solution in the reactor the solution containing o u susceptible de contenir ledit anticorps avec la suspension de particules magnétiques portant ou susceptible de porter ledit antigène ; u capable of containing said antibody with the suspension of magnetic particles carrying or likely to said antigen; c) l'incubation du réacteur, de préférence pendant un temps et une température appropriés à la formation du complexe, de préférence pendant au moins 5 mn ; c) incubating the reactor, preferably for a time and temperature appropriate to the formation of the complex, preferably for at least 5 min; d) l'application d'un champ magnétique audit réacteur et l'agitation du réacteur, de telle manière que les particules magnétiques soient entraînées vers le fond et/ou la paroi inclinée du réacteur revêtue d'une anti-immunoglobuline ou de tout autre composé capable de se lier à l'anticorps, en particulier de telle manière que la plus grande partie Io des particules magnétiques se retrouvent localisées au fond du réacteur et/ou fixées spécifiquement à la paroi inclinée par ladite anti-immunoglobuline ou ledit autre composé capable de se lier à l'anticorps ; d) applying a magnetic field to said reactor and agitation of the reactor, so that the magnetic particles are entrained towards the bottom and / or the inclined wall of the reactor coated with an anti-immunoglobulin, or any other compound capable of binding to the antibody, in particular such that the greater part Io magnetic particles are found located in the reactor bottom and / or specifically bound to the inclined wall by said anti-immunoglobulin or said other compound capable to bind to the antibody; et e) la lecture à l'oeil et/ou par tout autre système de lecture approprié, de l'image obtenue au fond du réacteur et/ou sur la paroi inclinée du réacteur revêtue de ladite anti15 immunoglobuline, cette image obtenue permettant de mettre en évidence la présence ou non de la formation d'un complexe spécifique anticorps/anti-antigène. and e) reading by eye and / or by any other appropriate playback system, the image obtained at the reactor bottom and / or on the inclined wall of the reactor coated with said anti15 immunoglobulin, this image obtained for carrying detect the presence or absence of the formation of a specific antibody / anti-antibody complex. Par complexe spécifique formé par réaction entre un anticorps présent dans une solution et un antigène lié à une particule magnétique, on entend désigner dans la présente description le complexe formé entre un anticorps capable de reconnaître 20 spécifiquement un antigène et cet antigène, ce complexe étant formé ici sur la particule magnétique sur laquelle est fixé l'antigène. By specific complex formed by reaction between an antibody present in a solution and an antigen bound to a magnetic particle is meant in the present description the complex formed between an antibody capable of recognizing 20 specifically an antigen and said antigen, the complex is formed here on the magnetic particle to which is fixed the antigen. Par complexe spécifique, il est également inclus ici le complexe formé entre un anticorps capable de reconnaître spécifiquement un antigène porté par une cellule, notamment un érythrocyte et cet antigène, ce complexe étant formé également ici sur la 25 particule magnétique sur laquelle est fixée la cellule porteuse de l'antigène. By specific complex, it is also included here the complex formed between an antibody capable of specifically recognizing an antigen carried by a cell, especially an erythrocyte and this antigen, which complex is also formed here on 25 magnetic particle to which is attached the cell carrier antigen. De manière générale, l'anticorps di complexe spécifique anticorps/antigène peut être de nature IgG, IgM, IgA ou IgE ou de tout autre classe d'anticorps. Generally, the antibody specific complex di antibody / antigen may be nature IgG, IgM, IgA or IgE or any other class of antibodies. Par anti-immunoglobuline capable de se lier à l'anticorps dudit complexe formé, on entend désigner ici par anti-immunoglobuline, les anti-immunoglobulines, 30 polyclonales ou monoclonales, capables de reconnaître et de fixer tout anticorps, notamment humain, qu'il soit de type IgG, IgM, IgA ou IgE (anti-immunoglobuline totale), ou certaines classes particulières d'anticorps, notamment anti-IgG spécifique. For anti-immunoglobulin capable of binding to the antibody of said formed complex is meant here by anti-immunoglobulin, anti-immunoglobulin 30 polyclonal or monoclonal, capable of recognizing and binding any antibody, including human, he either IgG, IgM, IgA or IgE (total anti-immunoglobulin) or particular classes of antibodies, including specific anti-IgG.

De telles anti-immunoglobulines, notamment humaines, sont bien connues de l'homme de l'art et disponibles chez de nombreux fournisseurs, et ne seront pas développées ici, notamment leurs procédés de production. Such anti-immunoglobulin, including human, are well known to the skilled person and available from many suppliers, and will not be developed here, including their production processes. Par tout autre composé capable de se lier à l'anticorps dudit complexe formé, on entend particulièrement les composés de type protéine A ou protéine G bien connue de l'homme de l'art pour reconnaître et fixer spécifiquement les anticorps. By any other compound capable of binding to the antibody of said complex formed, it is particularly meant the protein compounds A or protein G well known to those skilled in the art for recognizing and specifically binding antibodies.

Par la plus grande partie des particules magnétiques, on entend désigner ici au moins 60 % de la quantité de particules magnétiques présentes dans le mélange réactionnel, de préférence au moins 70 %, 80 %, 85 %, 90 % et 95 %. For the majority of magnetic particles, herein is meant at least 60% of the amount of magnetic particles present in the reaction mixture, preferably at least 70%, 80%, 85%, 90% and 95%. De préférence encore au moins 98 %. More preferably at least 98%. De manière particulière lorsqueles antigènes sont portés par des cellules, notamment des érythrocytes, par la plus grande partie des particules magnétiques, on entendra désigner la plus grande partie des particules magnétiques ou la plus grande partie des cellules, la plus grande partie des cellules signifiant au moins 60 % de la quantité de cellules magnétisées présentes dans le mélange réactionnel, de préférence au moins 70 %, 80 %, 85 %, 90 % et 95 %. Special way lorsqueles antigens are carried by cells, in particular erythrocytes, for most magnetic particles is intended to denote the largest part of the magnetic particles or the majority of cells, most of the signifier cells least 60% of the quantity of magnetized cells present in the reaction mixture, preferably at least 70%, 80%, 85%, 90% and 95%. De préférence encore au moins 98 %. More preferably at least 98%. Dans ce cas particulier où les antigènes sont portés par des cellules, notamment des érythrocytes, l'étape d) d'application d'un champ magnétique audit réacteur et d'agitation du réacteur devra être comprise comme de telle manière que lesparticules magnétiques ou les cellules magnétisées soient entraînées vers le fond et/ou la paroi inclinée du réacteur revêtue d'une anti-immunoglobuline ou de tout autre composé capable de se lier à l'anticorps, en particulier de telle manière que la plus grande partie des particules magnétiques ou des cellules magnétisées se retrouvent localisées au fond du réacteur et/ou fixées spécifiquement à la paroi inclinée par ladite antiimmunoglobuline ou ledit autre composé capable de se lier à l'anticorps. In this particular case the antigens are carried by cells, in particular erythrocytes, step d) applying a magnetic field to said reactor and agitation of the reactor will be understood as such that the magnetic or lesparticules magnetized cells are driven toward the bottom and / or the inclined wall of the reactor coated with an anti-immunoglobulin or any other compound capable of binding to the antibody, in particular such that the greater part of the magnetic particles or magnetized cells are found located in the reactor bottom and / or specifically bound to the inclined wall by said anti-immunoglobulin or said other compound capable of binding to the antibody.

Dans un mode de réalisation préféré, la présente invention comprend un procédé selon l'invention, caractérisé en ce que le mélange réactionnel obtenu après incubation du mélange entre la solution contenant ou susceptible de contenir ledit anticorps et la suspension de particules magnétiques portant ou susceptible de porter ledit antigène, contient des anticorps libres, en particulier non dirigés contre les antigènes portés par les particules magnétiques, ces anticorps libres étant capables de se fixer à l'antiimmunoglobuline ou au composé utilisé capable de se lier à l'anticorps. In a preferred embodiment, the present invention comprises a method according to the invention, characterized in that the reaction mixture obtained after incubation of the mixture between the solution containing or suspected of containing said antibody and the suspension of magnetic particles carrying or capable of carrying said antigen, contains free antibody, particularly not directed against the antigens carried by the magnetic particles, these free antibodies being capable of binding to the anti-immunoglobulin used or the compound capable of binding to the antibody. Par anticorps libres, on entend désigner ici les anticorps non complexés à un antigène porté par les particules magnétiques. By free antibodies is meant here uncomplexed antibody to an antigen carried by the magnetic particles.

Dans un mode de réalisation également préféré, la présente invention comprend un procédé selon l'invention, caractérisé en ce que ledit anticorps contenu ou susceptible d'être contenu dans la solution et dont on cherche à mettre en évidence la formation d'un complexe spécifique avec un antigène porté par les particules magnétiques, est un anticorps de type IgG, ou, si cet anticorps est un anticorps anti- antigène de groupe sanguin, est un anticorps non agglutinant les érythrocytes portant l'antigène correspondant. In an equally preferred embodiment, the present invention includes a method according to the invention, characterized in that said content or antibody capable of being contained in the solution and which it is desired to demonstrate the formation of a specific complex with an antigen carried by the magnetic particles is an IgG type antibody, or, if this antibody is an antibody to blood group antigen, an antibody is non-agglutinating erythrocytes carrying the corresponding antigen. De préférence encore, lorsque cet anticorps est de type IgG, on préférera comme anti-immunoglobuline, une anti-IgG, notamment humaine (dirigée contre des anticorps d'origine humaine). More preferably, when this antibody is of the IgG type, it is preferable as an anti-immunoglobulin, anti-IgG, in particular human (directed against antibodies of human origin).

Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, la présente invention comprend un procédé selon l'invention, caractérisé en ce qu'à l'étape d), l'agitation du réacteur est effectuée en présence du champ magnétique. In a particularly preferred embodiment, the present invention includes a method according to the invention, characterized in that in step d), the stirring of the reactor is effected in the presence of the magnetic field. A l'étape d), l'étape d'application du champ magnétique et l'étape d'agitation du réacteur peuvent être réalisées en commençant par l'une ou par l'autre, mais de telle sorte qu'au moins pendant un temps donné, l'application du champ magnétique et l'agitation soient simultanées. In step d), the step of applying the magnetic field and the reactor agitation step may be performed beginning with the one or the other, but such that at least a given time, the application of the magnetic field and stirring are simultaneous. Bien entendu, sont également compris dans le procédé selon l'invention, le cas où une application du champ magnétique est effectuée avant l'agitation du réacteur à l'étape d) du procédé, cette application du champ magnétique seule (sans agitation) ne devant pas excéder une durée d'au plus 2 mn, de préférence d'au plus 1 mn 30 s, 1 mn ou 30 s. Of course, are also included in the method according to the invention, the case where a magnetic field application is performed prior to agitation of the reactor in step d) of the method, this application of the magnetic field alone (without agitation) did to exceed a period of at most 2 minutes, preferably at most 1 min 30 s, 1 min or 30 s. Il en est de même si l'agitation était effectuée avant l'application du champ magnétique, cette période d'agitation seule ne devant pas excéder une durée d'au plus 2 mn, de préférence d'au plus 1 mn 30 s, 1 mn ou 30 s. It is the same if the agitation was performed prior to applying the magnetic field, this single agitation period not to exceed a period of at most 2 minutes, preferably at most 1 min 30 s, 1 min or 30 s. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, la présente invention 30 comprend un procédé selon l'invention, caractérisé en ce qu'à l'étape d), l'application du champ magnétique est effectuée simultanément avec l'agitation du réacteur. In a particularly preferred embodiment, the present invention 30 comprises a process according to the invention, characterized in that in step d), the magnetic field application is performed simultaneously with the stirring of the reactor.

Par simultanément, on entend désigner un laps de temps ne devant pas excéder plus de 20 s où seule une agitation ou une application du champ magnétique est réalisée. By simultaneously is meant a period of time not to exceed more than 20 seconds when only agitation or application of the magnetic field is carried out. Sous cet aspect, la présente invention comprend un procédé selon l'invention, caractérisé en ce qu'à l'étape d), l'application du champ magnétique et l'agitation sont réalisées simultanément pendant une durée comprise entre 2,5 mn et 10 mn. In this aspect, the present invention comprises a method according to the invention, characterized in that in step d), applying the magnetic field and stirring are carried out simultaneously for a period between 2.5 minutes and 10 min. Dans un mode de réalisation préféré, la présente invention comprend un procédé selon l'invention, caractérisé en ce qu'à l'étape d), l'application du champ magnétique et l'agitation sont réalisées simultanément pendant une durée comprise entre 4 mn et 7 mn, de manière encore plus préférée entre 5 mn et 6 mn. In a preferred embodiment, the present invention comprises a method according to the invention, characterized in that in step d), applying the magnetic field and stirring are carried out simultaneously for a period of between 4 minutes and 7 min, even more preferably between 5 min and 6 min.

La présente invention comprend un procédé selon l'invention, caractérisé en ce qu'à l'étape d), l'application du champ magnétique est réalisée au moyen d'un aimant situé à l'extérieur sous le réacteur de telle manière que les particules magnétiques soient entraînées vers le fond du réacteur, de préférence selon l'axe longitudinal du réacteur. The present invention includes a method according to the invention, characterized in that in step d), the magnetic field application is performed by means of a magnet located outside the reactor in such a way that magnetic particles are entrained towards the reactor bottom, preferably along the longitudinal axis of the reactor. Dans un mode de réalisation préféré du procédé de l'invention, à l'étape d), ledit aimant est un aimant permanent de magnitude comprise entre 8 000 et 16 000 gauss, de préférence entre 10 000 et 14 000 gauss, de manière plus préférée entre 11 500 et 12 500 gauss, une magnitude de 12 000 gauss étant encore plus préférée. In a preferred embodiment of the inventive method, in step d), said magnet is a permanent magnet of magnitude between 8000 and 16,000 gauss, preferably between 10 000 and 14 000 gauss, more preferably between 11,500 and 12,500 gauss, a magnitude of 12,000 gauss being even more preferred. Dans un mode de réalisation préféré, la présente invention comprend un procédé selon l'invention, caractérisé en ce qu'à l'étape d), l'agitation est réalisée au moyen 20 d'un agitateur rotatif. In a preferred embodiment, the present invention comprises a method according to the invention, characterized in that in step d), the stirring is performed by means 20 of a rotary shaker. Par agitateur rotatif, on entend citer ici particulièrement une plateforme rotative dont le réacteur, ou l'ensemble des réacteurs lorsqu'il s'agit notamment d'une microplaque de 96 cupules, est solidaire (voir figures lA et 1B). Rotary agitator means include here especially a rotating platform of which the reactor or all reactors in the case in particular of a microplate of 96 wells, is secured (see Figures lA and 1B). Dans un mode particulier d'agitation, la présente invention comprend un procédé 25 selon l'invention, caractérisé en ce qu'à l'étape d), l'agitation est une agitation rotative ayant une orbitale comprise en proportion entre 1,0 mm et 2,5 mm de diamètre, de préférence entre 1,25 mm et 2,25 mm, entre 1,5 mm et 2 mm de diamètre, 2 mm étant le diamètre de l'orbitale préférée, lorsque le réacteur à comme diamètre 7 mm pour sa plus grande section. In a particular mode of stirring, the present invention comprises a method 25 according to the invention, characterized in that in step d), the stirring is a rotary stirring having an orbiting understood proportion between 1.0 mm and 2.5 mm in diameter, preferably between 1.25 mm and 2.25 mm, between 1.5 mm and 2 mm in diameter, 2 mm being the preferred diameter of the orbital, such as when the reactor diameter 7 mm for the largest section. 30 Par proportion, on comprendra ici que par exemple lorsque le diamètre de la plus grande section du réacteur est le double ou la moitié de 7 mm, le diamètre correspondant de l'orbitale de rotation mentionné sera respectivement doublé ou divisé par 2. Par orbitale pour une agitation de type rotative, on entend désigner le diamètre du cercle décrit par le point le plus bas du réacteur lors de l'agitation (point le plus bas 5 de l'axe centrale longitudinal du réacteur). 30 By proportion, here will be understood that for example, when the diameter of the largest section of the reactor is the double or half of 7 mm, the corresponding diameter mentioned rotation of the orbital will be respectively doubled or divided by 2. Orbital for a rotary type of stirring is meant the diameter of the circle described by the lowest point of the reactor during stirring (the lowest point 5 of the longitudinal central axis of the reactor). Dans un mode de réalisation préféré, la présente invention comprend un procédé selon l'invention, caractérisé en ce qu'à l'étape d), l'agitation est effectuée à une vitesse comprise entre 250 et 750 trs/mn, de préférence entre 400 et 600 trs/mn. In a preferred embodiment, the present invention comprises a method according to the invention, characterized in that in step d), the stirring is carried out at a speed between 250 and 750 rev / min, preferably between 400 and 600 rev / min. Dans un mode de réalisation particulier, l'aimant situé sous chacun des réacteurs 10 est solidaire de la plateforme d'agitation (voir également figures lA et 1B) . In a particular embodiment, the magnet beneath each of the reactors 10 is secured to the stirring platform (see also Figures lA and 1B). Dans ce dernier cas, l'axe central longitudinal de l'aimant situé sous le réacteur suit l'orbitale suivi par l'axe central longitudinal du réacteur pendant l'agitation. In the latter case, the longitudinal central axis of the magnet beneath the reactor follows the orbital followed by the longitudinal central axis of the reactor during stirring. Dans un mode de réalisation particulier, l'aimant situé sous chacun des réacteurs est désolidarisé de la plateforme d'agitation. In a particular embodiment, the magnet beneath each reactor is separated from the agitating platform. Dans ce dernier cas, l'axe central 15 longitudinal de l'aimant situé sous le réacteur ne bouge pas et ne suit pas l'orbitale suivi par l'axe central longitudinal du réacteur pendant l'agitation. In the latter case, the central longitudinal axis 15 of the magnet located in the reactor does not move and does not follow the orbit followed by the longitudinal central axis of the reactor during stirring. La présente invention comprend un procédé selon l'invention, caractérisé en ce qu'à l'étape c), la durée d'incubation est comprise entre 10 mn et 30 mn, de préférence entre 15 mn et 25 mn. The present invention includes a method according to the invention, characterized in that in step c), the incubation time is between 10 min and 30 min, preferably between 15 minutes and 25 minutes. 20 Dans un mode de réalisation préféré, la présente invention comprend un procédé selon l'invention, caractérisé en ce qu'à l'étape c), l'incubation est réalisée à une température comprise entre 10 C et 40 C, de préférence entre 25 C et 40 C, entre 30 C et 40 C, de préférence à environ 37 C (37 C 1 C). 20 In a preferred embodiment, the present invention comprises a method according to the invention, characterized in that in step c), the incubation is conducted at a temperature between 10 C and 40 C, preferably between 25 C and 40 C, 30 C and 40 C, preferably at about 37 C (37 C 1 C). Dans un mode de réalisation préféré, la présente invention comprend un procédé 25 selon l'invention, caractérisé en ce qu'à l'étape b), l'incubation est réalisée à une température comprise entre 30 C et 40 C, de préférence à 37 C. Les techniques immunodiagnostiques, de capture ou de tri cellulaire mettant en oeuvre des particules magnétiques ont fait l'objet de nombreuses publications et sont bien connues de l'homme de l'art. In a preferred embodiment, the present invention includes a method 25 according to the invention, characterized in that in step b), the incubation is conducted at a temperature between 30 C and 40 C, preferably at 37 C. immunodiagnostic techniques, capture or cell sorting utilizing magnetic particles have been the subject of numerous publications and are well known to the skilled artisan. 30 Parmi ces techniques, on peut citer celles faisant appel à une fontionnalisation de la particule magnétique permettant d'obtenir une fonction réactive en surface capable de réagir dans des conditions et avec des réactifs appropriés avec l'antigène que l'on souhaite greffer de manière covalente sur la particule, notamment une fonction acide, amine, époxy ou aldhéhyde pour ne citer que les plus courants. 30 Such techniques include those using a fontionnalisation of the magnetic particle to obtain a surface reactive functional group capable of reacting under conditions and with appropriate reagents with the antigen that is to be grafted so covalently on the particle, in particular an acid, amine, epoxy or aldehyde to mention only the most common. On peut également citer celles faisant appel à une adsorption passive de l'antigène que l'on souhaite fixer sur la particule, notamment par un traitement adéquate permettant d'obtenir des billes chargées positivement ou négativement en fonction des antigènes et des conditions dans lesquelles on souhaite réaliser cette absorption passive. May also be mentioned those involving passive adsorption of the antigen that is to be set on the particle, in particular by an adequate treatment to obtain beads positively or negatively charged depending on antigens and conditions under which wants to achieve this passive absorption. Parmi les fournisseurs, dont les microbilles (ou particules) magnétiques peuvent être utilisées dans le cadre de la présente invention, on peut citer en particulier la société Ademtech (33600 Pessac, France) qui propose des particules magnétiques d'environ 100 à 500 nm de diamètre pouvant être fonctionnalisées par une acide ou une amine ainsi que les protocoles et réactifs permettant d'effectuer le greffage souhaité avec ces fonctions. Among suppliers, the microbeads (or particles) Magnetic can be used in the context of the present invention include in particular the Ademtech company (33600 Pessac, France) which offers magnetic particles of about 100 to 500 nm diameter that can be functionalized with an acid or amine as well as the protocols and reagents for performing the desired grafting with these functions. Cette société fournie également ces mêmes particules non fonctionnalisées, de type hydrophobe de diamètre d'environ 300 nm 30 nm, particules utilisées notamment dans les exemples ci-après. This company also provided the same unfunctionalized particles, hydrophobic diameter of about 300 nm 30 nm, in particular particles used in the examples below. Ces particules magnétiques sont constituées à plus de 50 % d'un noyau de composé ferromagnétique (type oxyde de fer), ce noyau étant enrobé de polystyrène. These magnetic particles are more than 50% of a ferromagnetic compound core (iron oxide type), this core being coated polystyrene. On peut également citer la société Bioclone Inc. (San Diego, CA, USA) qui propose tout un catalogue de billes magnétiques fonctionnalisées pouvant être utilisées. Also exemplary society Bioclone Inc. (San Diego, CA, USA) offering a whole catalog of functionalized magnetic beads that can be used. On peut citer encore la société Dynal Biotech GmbH (Hamburg, Germany) avec sa gamme très variée de DynabeadsTM proposant notamment des microbilles magnétiques activées à la streptavidine, au tosyl ou activées par une fonction acide carboxylique. We may also mention the company Dynal Biotech GmbH (Hamburg, Germany) with its varied range of DynabeadsTM particular offering magnetic microbeads activated streptavidin, the tosyl or activated by a carboxylic acid. On peut également citer la société Merck Chimie SAS (94126 Fontenay-sous-Bois, France) qui avec sa gamme de microbilles magnétiques EstaporTM propose différentes tailles de particules (de 300 nm à 2 m) à base de polystyrène ou de divinylbenzène pouvant comprendre jusqu'à plus de 50 % de ferrite et pouvant être fonctionnalisées ou non, par exemple avec une fonction acide ou amine. Also exemplary Merck Chimie SAS (94126 Fontenay-sous-Bois, France), with its range of magnetic microbeads EstaporTM offers different particle sizes (from 300 nm to 2 m) based on polystyrene or divinylbenzene may include up 'more than 50% ferrite, which can be functionalized or not, for example with an acid or amine function. Ces particules sont préparées par un procédé mettant en oeuvre une polymérisation du styrène en présence du composé ferromagnétique. These particles are prepared by a process using a polymerization of styrene in the presence of the ferromagnetic compound. On peut enfin citer les particules magnétiques décrites dans le document brevet européen EP 0 038 730 de Rhône Poulenc qui décrit des latex de polymères magnétiques, dans le document brevet européen EP 0 125 995, dans les demandes de brevets européens EP 0 105 714, EP 0 190 006, EP 0 238 353 et EP 0 249 357 de Serono Diagnostics, ou encore dans les documents brevets français FR 2 262 805 et FR 2 454 098 de Corning Glass Works. the magnetic particles can finally mention described in European patent EP 0038730 of Rhone Poulenc which describes magnetic polymer latex in the document EP 0125995, in European patent applications EP 0105714, EP 0190006, EP 0238353 and EP 0249357 Serono Diagnostics, or in french patent documents FR 2,262,805 and FR 2,454,098 of Corning Glass Works.

Par particules magnétiques au sens de la présente invention, on entend également ici les solutions aqueuses de ferrofluide obtenues à partir d'un mélange polyoxoanions de Fe(III) et d'au moins un métal M(II) de degré II d'oxydation, tel que Fe(II)), ferrofluide tel qu'obtenu notamment par les procédés décrits aux exemples 1 à 8 de la demande de brevet français publiée sous le No. FR 2 461 521. De préférence la solution de ferrofluide qui pourra être utilisée dans les procédés de l'invention résultera d'une dilution de la solution de ferrofluide, obtenu par les procédés de préparation de ferrofluide décrits aux exemples 1 à 8 de la demande de brevet français publiée sous le No. 2 461 521, en milieu aqueux et de préférence en absence de tensio-actif (ou détergent) pour éviter notamment la lyse des érythrocytes lorsque ces derniers seront mis en contact avec cette solution de ferrofluide pour être magnétisés, ceci dans le procédé particulièrement pré Magnetic particle within the meaning of the present invention is also meant here aqueous solutions of ferrofluid obtained from polyoxoanions a mixture of Fe (III) and at least one metal M (II) oxidation state II, such as Fe (II)), ferrofluid as obtained in particular by the methods described in examples 1 to 8 of the French patent application published under No. FR 2 461 521. preferably the ferrofluid solution which can be used in the methods of the invention will result in a dilution of the ferrofluid solution obtained by the ferrofluid preparation processes described in examples 1 to 8 of the French patent application published under No. 2 461 521, in aqueous medium and preferably in the absence of surfactant (or detergent) in particular to avoid the lysis of erythrocytes when they are brought into contact with this ferrofluid solution to be magnetized, this particularly in the pre process féré de l'invention mettant en oeuvre des antigènes portés par des érythrocytes. ferred to the invention implementing the antigens carried by the erythrocytes. Dans un mode de réalisation préféré, ladite solution de ferrofluide sera caractérisée en ce qu'elle est préparée à partir d'un mélange polyoxoanions de Fe(III) et d'au moins un métal M(II) de degré II d'oxydation de préférence choisi parmi les métaux de la première série des métaux de transition tels que Fe(II), Co(II), Mn(II), Cu(II) ou Ni(II). In a preferred embodiment, said ferrofluid solution is characterized in that it is prepared from a polyoxoanions mixture of Fe (III) and at least one metal M (II) oxidation state II preferably selected from metals of the first series transition metals such as Fe (II), Co (II), Mn (II), Cu (II) or Ni (II). La solution de ferrofluide pourra notamment être préparée à partir d'un mélange 20 de polyoxoanions de Fe(III) et d'au moins un métal M(II) associé à un cation tel que H+, CH3+, N(CH3)4+, N(C2H5)4+ ou tout autre cation capable de conférer au polyoxoanion une plus grande solubilité dans l'eau que les cations Na, K+ et NH4, ces cations pourront être notamment apportés par les acides appropriés, tels que HCI, CH3COOH, ou encore par l'hydroxyde de tétraméthyl- ou tétraéthyl-ammonium. The ferrofluid solution may in particular be prepared from a mixture of 20 polyoxoanions Fe (III) and at least one metal M (II) associated with a cation such as H +, CH 3 +, N (CH3) 4+, N (C2H5) 4+ or any other cation capable of imparting the polyoxoanion greater solubility in water than the cations Na, K and NH4 +, these cations can be made by including appropriate acids, such as HCl, CH3COOH, or still by tetramethylammonium hydroxide or tetraethylammonium. 25 De préférence, les sources de métaux de départ choisis pour Fe(III) et M(II) pour préparer le ferrofluide seront des sels choisis parmi : - pour Fe(III), ceux listés dans de la demande de brevet français publiée sous le No. 2 461 521, page 4, lignes 1 et 2, notamment le chlorure ferrique, et - pour M(II), ceux listés dans de la demande de brevet français publiée sous le 30 No. 2 461 521, page 4, lignes 3 à 6, notamment le chlorure ferreux. 25 Preferably, the starting metal sources selected for Fe (III) and M (II) to prepare the ferrofluid will be salts selected from: - for Fe (III), those listed in the French patent application published under No. 2,461,521, page 4, lines 1 and 2, including ferric chloride, and - M (II), those listed in the French patent application published under No. 30 2,461,521, page 4, lines 3 to 6, in particular ferrous chloride. De préférence, lasolution de ferrofluide est préparée à partir d'un mélange entre Fe(III) et le métal M(II) caractérisé en ce que le rapport molaire initial de degré II est de 2 1 ; Preferably lasolution ferrofluid is prepared from a mixture of Fe (III) and the metal M (II) characterized in that the degree of initial molar ratio II is 2 1; de manière plus préférée de 2 0, 5 ; more preferably from 2 0, 5; 2 0,25 ou encore 2 0,1, un rapport molaire initial de 2 entre Fe(III) et le métal M(II) de degré II étant le plus préféré. 2 0.25 0.1 or 2, an initial molar ratio of 2 between Fe (III) and the metal M (II) level II being most preferred. De préférence encore, au mélange initial de sel de Fe(III) et du métal M(II) de degré II sera ajoutée une base forte appropriée telle que l'hydroxyde de sodium, l'hydroxyde de tétraméthyl- ou tétraéthyl-ammonium. More preferably, the initial mixture of Fe salt (III) and of the metal M (II) level II will be added a suitable strong base such as sodium hydroxide, tetramethylammonium hydroxide or tetraethylammonium. De préférence encore, la solution aqueuse de ferrofluide est préalablement diluée dans un tampon ou une solution physiologique. More preferably, the ferrofluid aqueous solution is previously diluted in a buffer or a physiological solution. Dans certaines applications, notamment lorsqu'il s'agira d'améliorer la sensibilité ou la vitesse de réaction (sans toutefois augmenter la non spécificité du test), on pourra utiliser un tampon dit de basse force ionique (BFI), appelée encore tampon LISS ( LISS pour Low Ionie Strength Solution ). In some applications, especially when it comes to improving the sensitivity or response speed (without increasing the non-specificity of the test), we can use a low ionic strength buffer says (BFI), also called LISS buffer (LISS for Low Ionia Strength Solution). Dans un mode de réalisation préféré, ladite solution de ferrofluide est diluée de 0,25 à 10 % (v/v) dans ledit tampon ou ladite solution physiologique, de préférence entre 0,25 et 5 %, entre 0, 25 et 2,5 %, entre 0,25 et 1 %, entre 0,25 et 0,75 %. In a preferred embodiment, said ferrofluid solution is diluted from 0.25 to 10% (v / v) in said buffer or said physiological solution, preferably between 0.25 and 5%, between 0, 25 and 2, 5%, between 0.25 and 1%, between 0.25 and 0.75%.

Dans un mode de réalisation préféré, la présente invention comprend un procédé selon l'invention, caractérisé en ce que les particules magnétiques ont un diamètre compris entre 100 nm et 1,5 m, de préférence entre 150 nm et 1,2 m, un diamètre compris entre 200 nm et 1 m ou entre 200 nm et 800 nm étant le plus préféré. In a preferred embodiment, the present invention comprises a method according to the invention, characterized in that the magnetic particles have a diameter between 100 nm and 1.5 m, preferably between 150 nm and 1.2 m, a diameter of between 200 nm and 1 m or between 200 nm and 800 nm being most preferred. Dans un mode de réalisation préféré, la présente invention comprend un procédé selon l'invention, caractérisé en ce que les particules magnétiques contiennent au moins 35 %, de préférence au moins 50 % en poids de composés ferromagnétiques (ferrite ou oxyde de fer par exemple), de préférence au moins 70 %, de préférence lesdits composés ferromagnétiques sont des oxydes de fer. In a preferred embodiment, the present invention comprises a method according to the invention, characterized in that the magnetic particles contain at least 35%, preferably at least 50% by weight of ferromagnetic compounds (ferrite or iron oxide e.g. ), preferably at least 70%, preferably said compounds are ferromagnetic iron oxides. De préférence encore, lorsque l'antigène du complexe spécifique est porté par une cellule, notamment un érythrocyte, les particules magnétiques sont de type hydrophobe et lavées préalablement en présence de surfactant, de préférence d'un détergent de type non-ionique. More preferably, when antigen specific complex is carried by a cell, especially an erythrocyte, the magnetic particles are hydrophobic and washed beforehand in the presence of surfactant, preferably a non-ionic detergent. Dans un mode de réalisation préféré, la présente invention comprend un procédé selon l'invention, caractérisé en ce qu'à l'étape a), le remplissage préalable du réacteur avec une substance visqueuse ou un gel homogène est réalisé avec une substance visqueuse ou un gel dont la densité est telle qu'elle empêche la migration des anticorps n'ayant pas formé de complexe avec les antigènes liés aux particules magnétiques vers la paroi inclinée et le fond du réacteur revêtue d'anti-immunoglobuline ou du composé capable de reconnaître l'anticorps lors de l'étape d). In a preferred embodiment, the present invention comprises a method according to the invention, characterized in that in step a), the pre-filling of the reactor with a viscous substance or a homogeneous gel is produced with a viscous substance or a gel having a density such that it prevents migration of the antibody have not formed a complex with the antigen bound to magnetic particles to the inclined wall and the bottom of the reactor coated with anti-immunoglobulin or compound capable of recognizing the antibody in step d). Dans un mode de réalisation préféré, la présente invention comprend un procédé selon l'invention, caractérisé en ce qu'à l'étape a), la solution visqueuse ou le gel est de densité supérieure à 1. De préférence, la solution visqueuse est une solution à base de sérum albumine, en particulier bovine, à base de polyvinyl pyrrolidone (PVP-40 ou PVP-60) ou encore de gélatine. In a preferred embodiment, the present invention comprises a method according to the invention, characterized in that in step a), the viscous solution or gel is a density greater than 1. Preferably, the viscous solution is a serum albumin-based solution, in particular bovine, based on polyvinyl pyrrolidone (PVP-40 or PVP-60) or gelatin. De préférence ces solutions . Preferably these solutions. L'homme de l'art saura adapter le protocole exemplifié ci-après dans les exemples pour une solution homogène de gel SephadexTM G-100 superfine aux autres types de gel ou de solution visqueuse, ceci suivant la nature des antigènes (portés ou non par des cellules), la taille et la composition des particules magnétiques en ferrite, ceci pour obtenir la migration complète des particules au travers de ces solutions visqueuses ou gels, notamment en faisant varier la densité finale de la solution visqueuse ou de gel, le temps de migration (agitation), la vitesse d'agitation et le cas échéant l'orbitale de rotation de l'agitation rotative. Those skilled in the art will adapt the protocol exemplified hereinafter in the examples for a homogeneous gel solution SephadexTM G-100 superfine to other types of gel or viscous solution, this depending on the nature of the antigens (or not worn by cells), the size and composition of the magnetic particles of ferrite, this to get the full migration of the particles through these viscous solutions or gels, in particular by varying the final density of the viscous solution or gel, the time to migration (agitation), the stirring rate and, if appropriate orbital of the rotary stirring rotation. Par exemple, en ce qui concerne les solutions visqueuses à base d'albumine ou de PVP, des concentrations d'environ 30 % 10 % pourront être utilisées. For example, as regards the viscous solutions based on albumin or PVP, concentrations of about 30% 10% may be used. Dans un mode de réalisation préféré, la présente invention comprend un procédé selon l'invention, caractérisé en ce qu'à l'étape a), le gel est un gel de dextran ou d'agarose (Type SepharoseTM (Pharmacia, Suède), notamment le SepharoseTM 4B ou 6B. Dans un mode de réalisation également préféré, lorsque ladite solution est de type gel, ce gel est préparé en présence de sérum albumine bovine afin d'augmenter la densité de la solution de gel, de préférence à des concentrations finales dans la solution de gel comprises entre 5 % et 15 % en p/v, de préférence à 10 % 2,5 %. Dans un mode de réalisation préféré, la présente invention comprend un procédé selon l'invention, caractérisé en ce qu'à l'étape a), la solution visqueuse est du SephadexTM, (Société Pharmacia, Suède, ou Sigma-Aldrich), de préférence du G-10TM, du G-25TM du G-50TM du G-75TM du G-100TM du G-150TM ou du G-200TM dont le diamètre des billes de dextran peut varier entre 20 nm et 300 In a preferred embodiment, the present invention comprises a method according to the invention, characterized in that in step a), the gel is a dextran gel or agarose (Type Sepharose (Pharmacia, Sweden) including Sepharose 4B or 6B. in an equally preferred embodiment, when said solution is gel-like, the gel is prepared in the presence of bovine serum albumin in order to increase the density of the gel solution, preferably at concentrations finals in the gel solution between 5% and 15% w / v, preferably 2.5% to 10%. in a preferred embodiment, the present invention comprises a method according to the invention, characterized in that in step a), the viscous solution is SephadexTM (Pharmacia, Sweden or Sigma-Aldrich), preferably the G-10TM, G-25TM 50TM G-G-G-75TM 100TM G-150TM or G-200TM the diameter of dextran beads can vary between 20 nm and 300 nm. nm. De manière plus préférée le SephadexTM est le G-100TM superfine. More preferably the SephadexTM is G-100TM superfine.

De préférence encore, la concentration en gel, notamment en SephadexTM ou SepharoseTM est comprise entre 1,5 % et 6 %, de préférence entre 2 % et 5 %, entre 2,5 % et 4 %. More preferably, the gel concentration, especially in SephadexTM or Sepharose is between 1.5% and 6%, preferably between 2% and 5%, between 2.5% and 4%. La concentration de 3 % 0,5 % en p/v étant la plus préférée, notamment pour le SephadexTM, en particulier pour le G-100TM superfine. The concentration of 3% 0.5% w / v being most preferred, particularly for SephadexTM, especially for the G-100TM superfine.

Dans un mode de réalisation préféré, la présente invention comprend un procédé selon l'invention, caractérisé en ce qu'à l'étape b), la solution contenant ou susceptible de contenir ledit anticorps est déposée sur la solution visqueuse avant le dépôt de la suspension de particules magnétiques portant ou susceptible de porter ledit antigène. In a preferred embodiment, the present invention comprises a method according to the invention, characterized in that in step b) the solution containing or suspected of containing said antibody is deposited on the viscous solution before depositing the suspension of magnetic particles carrying or capable of carrying said antigen. Dans un mode de réalisation préféré, la présente invention comprend un procédé selon l'invention, caractérisé en ce qu'avant l'étape b), la solution visqueuse est recouverte d'une solution aqueuse destinée à diluer le mélange réactionnel déposé à l'étape b), de préférence lorsque la solution d'anticorps est du serum ou plasma humain non dilué. In a preferred embodiment, the present invention comprises a method according to the invention, characterized in that before step b), the viscous solution is covered with an aqueous solution for diluting the reaction mixture introduced in the step b), preferably when the antibody solution is serum or undiluted human plasma. De préférence, ladite solution aqueuse destinée à diluer la solution ou l'échantillon d'anticorps représente un volume de 1 à 10 fois le volume de la solution d'anticorps, de préférence encore de 2 à 7 fois, de 3 à 6 fois ou de 4 à 5, 5 fois. Preferably, said aqueous solution to dilute the solution or the antibody sample represents a volume of 1 to 10 times the volume of the antibody solution, more preferably from 2 to 7 times, 3 to 6 times or of 4 and 5, 5 times. De 4 à 5 fois étant la gamme la plus préférée, notamment dans un réacteur de type cupule de microplaque 96 puits. 4 to 5 times being the preferred range, in particular in a cup-type reactor of 96-well microplate. La solution de dilution peut être ainsi une solution physiologique, pouvant également contenir de la BSA (voir ci-après pour les concentrations de BSA préférées). The diluting solution may thus be a physiological solution, possibly also containing BSA (see below for concentrations of preferred BSA).

Dans un mode de réalisation préféré, la présente invention comprend un procédé selon l'invention, caractérisé en ce qu'avant l'étape b), la solution visqueuse est recouverte d'une solution aqueuse destinée à diluer et à favoriser la formation du complexe anticorps/antigène à l'étape b) (voir figures 2A et 2B). In a preferred embodiment, the present invention comprises a method according to the invention, characterized in that before step b), the viscous solution is covered with an aqueous solution for diluting and promote complex formation antibody / antigen in step b) (see figures 2A and 2B). Dans ce cas, lorsqu'il s'agit de mettre en évidence un complexe spécifique formé par un anticorps/antigène de groupe sanguin, notamment dans le cadre d'une RAI ou d'un phénotypage de globule rouge, cette solution de dilution favorisant la réaction est réalisée à base d'un tampon basse force ionique (BFI), ce tampon étant bien connu de l'homme de l'art en immunohématologie, ce tampon BFI pouvant être le cas échéant réalisé en présence d'une concentration finale en sérum albumine bovine (BSA) comprise entre 1, 5 % et 6 % (p/v), de préférence entre 2 % et 5 %, la valeur 3 % 1 % étant préférée. In this case, when it comes to identify a specific formed by an antibody / blood group antigen complex, especially in the context of a RAI or phenotyping red blood cell, this diluting solution promoting reaction is carried out based on a low ionic strength buffer (BFI), this buffer being well known to those skilled in the art in immunohematology, the BFI buffer can be optionally performed in the presence of a final concentration in serum bovine albumin (BSA) between 1, 5% and 6% (w / v), preferably between 2% and 5%, the value 3% 1% being preferred.

Dans certaines applications, notamment lorsqu'il s'agira d'améliorer la sensibilité ou la vitesse de réaction (sans toutefois augmenter la non spécificité du test), on pourra utiliser un tampon dit de basse force ionique (BFI), appelé encore tampon LISS ( LISS pour Low Ionic Strength Solution ). In some applications, especially when it comes to improving the sensitivity or response speed (without increasing the non-specificity of the test), we can use a low ionic strength buffer says (BFI), also called LISS buffer (LISS for Low Ionic Strength Solution).

Par tampon ou solution physiologique, l'homme de l'art comprendra qu'il s'agit ci-avant de tampon habituellement utilisé dans le domaine de la biologie cellulaire, notamment en immunohématologie afin d'éviter la lyse des globules rouges, notamment pour l'application RAI ou phénotypage. By buffer or physiological solution, those skilled in the art will understand that it is above of buffer usually used in the field of cell biology, especially in immunohematology to avoid lysis of red blood cells, in particular for RAI or phenotyping application. De tels tampons ou solutions seront par exemple des tampons à pH physiologique, compris entre 6,8 et 7,5, avec une molarité des constituants du tampon ajustée de telle sorte que la solution finale obtenue s'apparente pour la pression osmotique à la molarité d'une solution de type NaCl à 9 pour mille (proche de 0,15 M de NaCl). Such buffers or solutions are, for example, physiological buffers at pH of between 6.8 and 7.5, adjusted with a molarity of buffer components so that the final solution is similar to the osmotic pressure molarity a NaCl-type solution at 9 per thousand (near 0.15 M NaCl). On peut notamment citer mais sans s'y limiter le tampon phosphate type PBS à pH 7,0 û 7,4 bien connu de l'homme de l'art. These include but not limited to PBS type phosphate buffer at pH 7.0 7.4 û well known to the skilled artisan. La composition des tampons BFI ou LISS ne sera pas ici développée, ces tampons étant bien connus en immunohématologie pour favoriser les réactions d'agglutination. The composition of the BFI or LISS buffers will not be developed here, these buffers are well known in immunohematology to promote agglutination reactions. Ces tampons sont notamment disponibles auprès des fournisseurs de réactifs pour l'immunohématologie (on pourra citer pour exemple, mais sans s'y limiter le tampon LISS de composition suivante : 16 g/1 de glycine, 0,03 M de NaCl et 0,015 M phosphate à pH 6,7). These buffers include reactants available from suppliers to Immunohaematology (there may be mentioned for example, but not limited to the LISS buffer of following composition: 16 g / 1 glycine, 0.03 M NaCl and 0.015 M phosphate at pH 6.7).

Dans un mode de réalisation préféré, la présente invention comprend un procédé selon l'invention, caractérisé en ce que le réacteur est une cupule de microplaque à fond rond (ou encore appelé à fond en U ou hémisphérique), ou encore ou à fond V. Les réacteurs de type cupule de microplaque présensibilisés (revêtues) sur le fond et sur en partie la paroi inclinée de la cupule avec l'anti-immunoglobuline humaine ou tout autre composé capable de reconnaître un anticorps peuvent être réalisées aisément selon les techniques bien connues de l'homme de l'art (voir notamment les exemples ci-après). In a preferred embodiment, the present invention comprises a method according to the invention, characterized in that the reactor is a microtiter well round bottom (or called U-bottom or hemispherical) or bottom or V . the cup-type reactors microplate presensitized (coated) on the bottom and partly on the inclined wall of the cup with the anti-human immunoglobulin or any other compound capable of recognizing an antibody can be performed easily according to well known techniques the skill in the art (see in particular the examples below). Dans un mode de réalisation préféré, la présente invention comprend un procédé selon l'invention, caractérisé en ce que la solution d'anticorps est un échantillon de plasma ou de sérum humain dans lequel on cherche à mettre en évidence la présence d'un anticorps dirigé spécifiquement contre un antigène lié à la particule magnétique, de préférence un anticorps n'agglutinant les particules magnétiques, en particulier de type IgG, et en ce que l'anti-immunoglobuline est une anti-immunoglobuline humaine, notamment une anti-IgG humaine. In a preferred embodiment, the present invention comprises a method according to the invention, characterized in that the antibody solution is a sample of plasma or human serum in which it is desired to highlight the presence of an antibody specifically directed against an antigen bound to the magnetic particle, preferably an antibody agglutinating the magnetic particles, in particular of the IgG type, and in that the anti-immunoglobulin is a human immunoglobulin, particularly anti-human IgG . Dans un mode de réalisation préféré, la présente invention comprend un procédé selon l'invention, caractérisé en ce qu'à l'étape e), la collecte au point le plus bas du réacteur de l'ensemble des particules magnétiques est significative de l'absence de formation de complexe spécifique anticorps/antigène ou en ce que la présence d'au moins une fraction visible de particules magnétiques sur la paroi inclinée du réacteur revêtue d'anti-immunoglobuline est significative de la formation dudit complexe. In a preferred embodiment, the present invention comprises a method according to the invention, characterized in that in step e), collecting at the lowest point in the reactor of all the magnetic particles is indicative of the absence of specific complex formation antibody / antigen or in the presence of at least one visible fraction of magnetic particles on the inclined wall of the reactor coated with anti-immunoglobulin is indicative of the formation of said complex. De préférence, les particules magnétiques peuvent être colorées pour une meilleur visualisation de ces particules. Preferably, the magnetic particles can be colored for better visualization of these particles. Dans un mode de réalisation préféré, la présente invention comprend un procédé selon l'invention, pour la mise en évidence d'un complexe spécifique formé par réaction entre un anticorps présent dans une solution et un antigène porté par une cellule ou par un virus, elle- ou lui-même lié à une ou plusieurs particules magnétiques (incluant ici les solutions de type ferrofluide comme ci-avant mentionnées) suivant la taille de la cellule ou du virus et celle de la particule. In a preferred embodiment, the present invention includes a method according to the invention for the detection of a specific complex formed by reaction between an antibody present in a solution and an antigen carried by a cell or a virus, itself or itself bound to one or more magnetic particles (including here the type of ferrofluid solutions as mentioned above) according to the size of the cell or virus and that of the particle. De préférence, la cellule est choisie parmi les cellules eucaryotes, mammifère ou levure, ou de bactérie. Preferably, the cell is chosen from eukaryotic cells, mammalian or yeast, or bacterium. De préférence encore, la cellule est une cellule de mammifère, notamment 20 humaine, de préférence un globule blanc, de type lymphocyte ou macrophage, ou encore une plaquette ou encore un érythrocyte (ou globule rouge). More preferably, the cell is a mammalian cell, in particular 20 human, preferably a white blood cell, macrophage or lymphocyte type, or a wafer or an erythrocyte (or red blood cell). Sous un aspect particulier l'antigène porté par la cellule n'est pas un antigène naturellement présent à la surface externe de la cellule, cet antigène ayant dans ce cas était préalablement fixé par liaison covalente, ionique ou adsorbé à la surface de la 25 cellule. In a particular aspect the antigen carried by the cell is not a naturally occurring antigen to the outer surface of the cell, said antigen having in this case was previously fixed by covalent, ionic or adsorbed to the surface of the cell 25 . Dans un mode de réalisation préféré, la présente invention comprend un procédé selon l'invention, pour la mise en évidence d'un complexe spécifique formé par réaction entre un anticorps anti-antigène de groupe sanguin présent dans une solution et un antigène de groupe sanguin, caractérisé en ce que la cellule est un érythrocyte, et de 30 préférence en ce que ledit antigène est un antigène naturel porté par l'érythrocyte. In a preferred embodiment, the present invention comprises a method according to the invention for the detection of a specific complex formatting formed by reaction between an anti-antigen antibody of blood group present in a solution and a blood group antigen characterized in that the cell is an erythrocyte and 30 preferably in that said antigen is a natural antigen carried by the erythrocyte. Dans la présente description les termes érythrocyte, globule rouge et hématie seront employés indifféremment pour désigner la même cellule sanguine. In this specification the terms erythrocyte, red blood cell and red blood cell will be used interchangeably to mean the same blood cell.

Dans un mode de réalisation préféré, la présente invention comprend un procédé selon l'invention, pour la recherche et d'agglutinines irrégulières (RAI) ou la recherche d'anticorps érythrocytaires dans un échantillon de sérum ou plasma, de préférence d'anticorps non agglutinants, ou encore pour le phénotypage de globule rouge, caractérisé en ce qu'il comprend une étape dans laquelle les érythrocytes portant les antigènes sont préalablement liés par liaisons ioniques ou par adsorption à des particules magnétiques ou en suspension dans une solution de ferrofluide, de préférence les particules magnétiques sont non fonctionnalisées et lavées en présence de surfactant, notamment non ioniques, ces particules magnétiques pouvant être après ce lavage en détergent mises en contact avec une solution d'albumine (comprise entre 0,05 % et 5 %, de préférence entre 0, 1 % et 1 %) pour faciliter l'adsorption des érythrocytes. In a preferred embodiment, the present invention comprises a method according to the invention, for the research and irregular antibodies (RAI) or mark of red cell antibodies in a serum sample or plasma, preferably non-antibody tackifiers, or for phenotyping red blood cell, characterized in that it comprises a step in which the erythrocytes carrying the antigen is previously bound by ionic bonding or by adsorption to magnetic particles or suspended in a ferrofluid solution, preferably the magnetic particles are non-functionalized and washed in the presence of surfactant, in particular nonionic, these magnetic particles can be after this washing detergent contacted with an albumin solution (between 0.05% and 5%, preferably 0, 1% and 1%) to facilitate the adsorption of the erythrocytes. Dans ce cas, l'albumine est elle-même liée par liaison ionique ou adsorbée à la surface de la particule magnétique si le traitement de cette particule ou sa fonctionnalisation, notamment sa charge surfacique résultante, autorise cette liaison ionique ou cette adsorption ; In this case, albumin is itself bound by ionic bond or adsorbed at the surface of the magnetic particle if the treatment of this particle or its functionalization, including its resulting surface charge, allows this ionic bond or the adsorption; ou encore par couplage covalent de l'albumine sur des fonctions de la particule magnétique, notamment carboxyliques ou aldéhydiques greffées à la surface de ces particules autorisant notamment la possibilité de formation de liaison covalente avec les fonctionsamines, notamment avec des résidus lysines de l'albumine (BSA). or alternatively by covalent coupling of albumin on functions of the magnetic particle, in particular carboxylic or aldehyde grafted onto the surface of these particles in particular allowing the possibility of covalent bond formation with fonctionsamines, particularly with lysine residues of albumin (BSA).

Dans un mode de réalisation préféré, la présente invention comprend un procédé selon l'invention, pour le phénotypage de globules rouges, caractérisé en ce que la solution d'anticorps à l'étape b) est une solution de sérum test contenant un anticorps anti-antigène de groupe sanguin connu, de préférence de nature IgG, le réacteur étant alors revêtu d'une anti-immunoglobuline dirigée contre l'espèce dont est issu l'anticorps anti-antigène de groupe sanguin utilisé (animale ou humaine) ou de tout autre composé capable de reconnaître l'anticorps spécifique contenu dans ce sérun test (notamment une protéine A ou G). In a preferred embodiment, the present invention comprises a method according to the invention for phenotyping red blood cells, characterized in that the antibody solution in step b) is a test serum solution containing anti blood group-antigen of known, preferably of IgG type, the reactor then being coated with an anti-immunoglobulin directed against the species from which the blood group anti-antigen antibody used (animal or human) or any further compound capable of recognizing the specific content in this SERUN test antibody (including a protein a or G). Dans un mode de réalisation préféré, la présente invention comprend un procédé selon l'invention, caractérisé en ce qu'avant ou après leur fixation sur des particules magnétiques ou leur mise en suspension dans la solution de ferrofluide, de préférence avant, les érythrocytes peuvent être soumis à l'action d'une protéase, de préférence la broméline ou la papaïne, ceci afin de favoriser la formation du complexe spécifique, ces techniques étant bien connues de l'homme de l'art pour le phénotypage de groupe sanguin. In a preferred embodiment, the present invention comprises a method according to the invention, characterized in that before or after their attachment to magnetic particles or suspended in the ferrofluid solution, preferably before, the erythrocytes can be subject to the action of a protease, preferably bromelain or papain, in order to promote the formation of specific complex, these techniques are well known to the skilled person for phenotyping blood group. Dans un mode de réalisation préféré, la présente invention comprend un procédé selon l'invention, caractérisé en ce que la concentration d'érythrocytes dans la suspension finale d'érythrocytes liés aux particules magnétiques ou dans la solution de ferrofluide, avant d'être ajoutée à la solution d'anticorps dans le réacteur, est comprise entre 0,1 % à et 5 % en volume, de préférence entre 0,5 % et 2,5 % et entre 0,75 % et 2 %, la valeur 1 % 0, 25 % étant la plus préférée. In a preferred embodiment, the present invention comprises a method according to the invention, characterized in that the concentration of red cells in the final suspension of erythrocytes bound to the magnetic particles in the ferrofluid or solution before being added to the antibody solution in the reactor is between 0.1% to 5% by volume, preferably between 0.5% and 2.5% and between 0.75% and 2%, the value 1% 0, 25% being most preferred.

Dans un procédé de l'invention particulièrement préféré pour la RAI et ou le phénotypage réalisé dans une cupule de microplaque, ce procédé comprend les étapes suivantes : a) préalablement à la réaction : - le remplissage préalable d'une cupule fond rond avec 50 l 10 gl d'une solution homogène d'un gel de SephadexTM G-100 superfine à environ 3 % 0,5 % dans un tampon de type LISS en présence de BSA à 10 % 2,5 % de manière à recouvrir au moins en partie la paroi inclinée du réacteur ; In a method of the invention particularly preferred for RAI and phenotyping or carried out in a microtiter well, this method comprises the following steps: a) prior to the reaction: - the pre-filling a round bottom cup with 50 l 10 gl of a solution of a homogeneous gel SephadexTM G-100 superfine to about 3% 0.5% in LISS buffer type in the presence of 10% BSA 2.5% so as to cover at least partially the inclined wall of the reactor; et, le cas échéant, - l'ajout de 60 gl 15 gl d'un tampon LISS à 3 % 1 % de BSA, de préférence à pH compris entre 6,5- et 7,5 ; and, where appropriate, - the addition of 60 gl 15 gl of a LISS buffer at 3% 1% BSA, preferably at a pH between 7,5 and 6,5-; - de disposer d'érythrocytes magnétisés à l'aide d'une solution de ferrofluide ou particules magnétiques, de préférence quand il s'agit de particules magnétiques de taille comprise entre 200 nm et 1000 nm ou entre 200 nm et 800 nm, de préférence ces particules sont non fonctionnalisées, de préférence contiennent au moins 40 % de ferrite (d'oxyde de fer), de préférence encore étant recouvertes de BSA et/ou ayant été préalablement traitées afin que ces particules puissent se fixer par liaison ionique ou par adsorption sur les érythrocytes portant l'antigène pouvant former le complexe spécifique avec ledit anticorps, notamment par lavage en présence de détergent non ionique ; - obtain erythrocytes magnetized with the aid of a ferrofluid solution or magnetic particles, preferably when it comes to the magnetic particles of size between 200 nm and 1000 nm or between 200 nm and 800 nm, preferably these particles are non-functionalized, preferably contain at least 40% ferrite (iron oxide), more preferably being coated with BSA and / or having previously been treated so that these particles can be determined by ionic bonding or by adsorption on erythrocytes carrying the antigen capable of forming the specific complex with said antibodies, in particular by washing in the presence of nonionic detergent; b) la mise en contact au-dessus de la solution de gel homogène, ou, le cas échéant, au-30 dessus du tampon LISS à 3 % 1 % de BSA, contenue dans la cupule : - de la solution contenant ou susceptible de contenir ledit anticorps avec 25 pl 7,5 l de la suspension d'érythrocytes revêtus de particules magnétiques portant ou susceptibles de porter ledit antigène, les érythrocytes étant à une concentration dans la suspension comprise entre 0,75 % et 1, 25 % en v/v, avec - 12 gl 8 gl d'échantillon contenant les anticorps (sérum ou plasma dans le cas de la RAI, ou sérum test dans le cas d'un phénotypage) ; b) contacting over the homogeneous gel solution, or, where appropriate, at-30 above LISS buffer at 3% 1% BSA, contained in the well: - the solution containing or capable of containing said antibody with 25 pl 7.5 l of the suspension of erythrocytes coated magnetic particles carrying or capable of carrying said antigen, the erythrocytes are in a concentration in the suspension of between 0.75% and 1 25% by v / v, with - 12 8 gl gl sample containing the antibody (serum or plasma in the case of the RAI, or serum test in the case of a phenotyping); c) l'incubation du réacteur pendant 20 mn 5 mn à 37 C 1 C ; c) incubating the reactor for 20 minutes 5 minutes at 37 C 1 C; d) simultanément, l'application d'un champ magnétique audit réacteur et l'agitation du réacteur, pendant une durée de 5 mn 30 s 1 mn ; d) simultaneously applying a magnetic field to said reaction vessel and stirring the reactor for a period of 5 min 30 s 1 min; et e) la lecture à l'oeil et/ou par tout autre système de lecture approprié, de l'image obtenue au fond du réacteur et/ou sur la paroi inclinée du réacteur revêtue de ladite antiimmunoglobuline, cette image obtenue permettant de mettre en évidence la présence ou non de la formation d'un complexe spécifique anticorps/anti-antigène, l'interprétation pouvant être réalisée à l'aide de la figure 3 et de la figure 4 caractéristique respectivement d'une image négative (pas de formation de complexe spécifique et d'une image positive (présence de complexe). 15 Sous un autre aspect, la présente invention a pour objet un dispositif pour la mise en évidence d'un complexe spécifique formé par réaction entre un anticorps présent dans une solution et un antigène lié à une particule magnétique, de préférence pour la mise en évidence d'un complexe spécifique formé par réaction entre un anticorps anti- 20 antigène de groupe sanguin présent dans une solution et un an and e) reading by eye and / or by any other appropriate playback system, the image obtained at the reactor bottom and / or on the inclined wall of the reactor coated with said anti-immunoglobulin, the image obtained for carrying clearly the presence or absence of the formation of a specific antibody / anti-antigen, the interpretation may be carried out using the Figure 3 and Figure 4 respectively characteristic of a negative image (no formation of specific and a positive image complex (presence of complex). 15 in another aspect, the present invention relates to a device for the detection of a specific complex formed by reaction between an antibody present in a solution and antigen bound to a magnetic particle, preferably for the detection of a specific complex formed by reaction between an antibody 20 anti-blood group antigen present in a solution and a year tigène de groupe sanguin porté par un érythrocyte lié lui-même à une ou plusieurs particules magnétiques, notamment pour la RAI, la recherche d'anticorps érythrocytaire, ou encore pour le phénotypage de groupe sanguin, caractérisé en ce qu'il comprend : a) - un réacteur ou un ensemble de réacteurs ouvert vers le haut et à fond fermé et dont 25 la section diminue au moins dans la zone voisine du fond pour former une paroi inclinée s'étendant jusque dans le fond, ladite paroi inclinée étant au moins en partie revêtue d'une anti-immunoglobuline ou d'un composé capable de se lier à l'anticorps dudit complexe formé, - chacun des réacteurs pouvant être rempli en partie d'une substance visqueuse ou 30 d'un gel ; tigène blood group carried by an erythrocyte bound itself to one or more magnetic particles, in particular for RAI, the search for erythrocyte antibody, or for phenotyping blood group, characterized in that it comprises: a) - a reactor or an open reactor assembly upwardly and closed bottom 25 and whose cross-section decreases at least in the region near the bottom to form an inclined wall extending into the bottom, said inclined wall being at least part coated with an anti-immunoglobulin or a compound capable of binding to the antibody of said complex formed, - each of the reactors can be partially filled with a viscous substance or a gel 30; b) au moins un aimant ou un ensemble d'aimants pouvant être disposé à l'extérieur sous le ou les réacteurs et un système d'agitation rotatif dudit ou desdits réacteurs, ce système d'agitation étant de préférence solidarisé avec l'aimant ou la plate-forme supportant les aimants afin de déplacer les aimants de la même manière que lesdits réacteurs pendant la phase d'agitation ; b) at least one magnet or set of magnets can be arranged outside in the reactor or reactors and a rotary stirring system said one or more reactors, stirring system preferably being integral with the magnet or the platform supporting the magnets to move the magnets in the same way that said reactors during the stirring phase; c) le cas échéant, un incubateur capable de réguler la température d'incubation des réacteurs ; c) optionally, an incubator capable of regulating the reactor temperature incubation; et d) le cas échéant, un lecteur capable d'évaluer la présence et la localisation des érythrocytes magnétisés à la fin de la réaction sur chacun des réacteurs, notamment sur la paroi inclinée et le fond du réacteur revêtu de l'anti-immunoglobuline ou du composé capable de se lier à l'anticorps du complexe spécifique éventuellement formé. and d) where appropriate, a reader able to assess the presence and location of erythrocytes magnetized at the end of the reaction on each of the reactors, in particular on the inclined wall and the bottom of the reactor coated with the anti-immunoglobulin or of the compound capable of binding to the antibodies specific complex possibly formed.

De préférence, le dispositif selon l'invention est caractérisé en ce que la substance visqueuse ou le gel a les caractéristiques telles que définies dans le procédé selon l'invention ci-avant avec les mêmes préférences. Preferably, the device according to the invention is characterized in that the viscous substance or gel has the characteristics as defined in the method according to the invention above with the same preferences. Il en est de même pour les particules magnétiques ou la suspension de cellules magnétisées, les caractéristiques de l'aimant et de l'agitateur rotatif.. It is the same for the magnetic particles or suspension of magnetized cells, the characteristics of the magnet and the rotator ..

De préférence encore, le dispositif selon l'invention est caractérisé en ce que ledit réacteur est une cupule de microplaque, de préférence à fond rond (hémisphérique) ou à fond en V, une microplaque comprenant 96 cupules étant encore plus préférée. More preferably, the device according to the invention is characterized in that said reactor is a microtiter well, preferably round bottom (hemispherical) or V-bottomed microplate comprising wells 96 being even more preferred. De préférence, l'aimant est sous la forme d'une pile, comme montré au schéma des figures 1A et 1B, de préférence une plate-forme comprenant 96 aimants en forme de pile, disposés chacun sous une cupule. Preferably, the magnet is in the form of a stack, as shown in Figures 1A and 1B outline, preferably a platform 96 comprising magnets shaped stack, each disposed in a cup.

Sous encore un autre aspect, l'invention concerne un kit pour la mise en évidence d'un complexe spécifique formé par réaction entre un anticorps présent dans une solution et un antigène lié à une particule magnétique, caractérisé en ce qu'il comprend : a) un réactif comprenant une suspension de particules magnétiques revêtues au moins d'un antigène ; In yet another aspect, the invention relates to a kit for the detection of a specific complex formed by reaction between an antibody present in a solution and an antigen bound to a magnetic particle, characterized in that it comprises: a ) a reagent comprising a suspension of magnetic particles coated with at least one antigen; et b) - un réacteur ou un ensemble de réacteurs ouvert vers le haut et à fond fermé et dont la section diminue au moins dans la zone voisine du fond pour former une paroi inclinée s'étendant jusque dans le fond, ladite paroi inclinée étant au moins en partie revêtue d'une anti- immunoglobuline capable de se lier à l'anticorps dudit complexe formé, - un container contenant une solution visqueuse ou un gel, ou le cas échéant, chacun des réacteurs étant rempli en partie de ladite substance visqueuse ou dudit gel ; and b) - a reactor or an open reactor assembly upwards and closed at the base and whose cross-section decreases at least in the region near the bottom to form an inclined wall extending into the base, said angled wall being at least partly coated with an anti-immunoglobulin capable of binding to the antibody of said formed complex, - a container containing a viscous solution or a gel, or where appropriate, each of the reactors being filled portion of said viscous substance or said gel; et, c) le cas échéant, au moins un aimant ou un ensemble d'aimants pouvant être disposé à l'extérieur sous le ou les réacteurs, ledit aimant étant de préférence solidaire d'un agitateur rotatif, de préférence l'orbitale de l'agitateur étant de 2 mm 1 mm pour un diamètre de réacteur dans sa plus grande section de 7 mm (ou en proportion équivalente). and, c) optionally, at least one magnet or set of magnets can be arranged outside in the reactor or reactors, said magnet being preferably integral with a rotary stirrer, preferably orbital of agitator being 2 mm 1 mm for a reactor of diameter at its widest section of 7 mm (or equivalent amount). De préférence, l'invention concerne un kit selon l'invention, pour la RAI, caractérisé en ce que ledit réactif contient une suspension d'érythrocytes tests de phénotype comm magnétisés à l'aide de particules magnétiques ou d'une solution de ferrofluide. Preferably, the invention relates to a kit according to the invention for RAI, characterized in that said reagent contains an erythrocyte suspension comm phenotype tests magnetized using magnetic particles or ferrofluid solution. De préférence, l'invention concerne un kit selon l'invention, pour le phénotypage de groupe sanguin caractérisé en ce que ledit réactif contient un sérum test contenant un anticorps anti-antigène de groupe sanguin, de préférence de type IgG, et, en outre un réactif contenant une suspension de particules magnétiques ou solution de ferrofluide pouvant se lier à une suspension d'érythrocytes que l'on cherche à phénotyper. Preferably, the invention relates to a kit according to the invention for phenotyping blood group characterized in that said reagent contains a test serum containing anti-blood group antigen antibodies, preferably IgG, and furthermore a reagent containing a suspension of magnetic particles or ferrofluid solution capable of binding to an erythrocyte suspension which seeks to phenotype. De préférence également, l'invention concerne un kit selon l'invention, caractérisé en ce que la substance visqueuse ou le gel, et le cas échéant les particules magnétiques ou la suspension de cellules magnétisées, le cas échéant les caractéristiques de l'aimant et de l'agitateur rotatif, a ou ont les caractéristiques telles que définies pour le procédé selon l'invention avec également les préférences définies pour ces solutions visqueuses ou de gel ou autres composés et éléments. Also preferably, the invention relates to a kit according to the invention, characterized in that the viscous substance or gel, and optionally the magnetic particles or suspension of magnetized cells, where appropriate, the characteristics of the magnet and of the rotary agitator, has or have the features as defined for the method according to the invention also with the preferences for these viscous solutions or gel or other compounds and elements. De préférence encore, l'invention concerne un kit selon l'invention, caractérisé en ce que ledit réacteur est une cupule de microplaque, de préférence à fond rond (hémisphérique) ou à fond en V, une microplaque comprenant 96 cupules étant encore plus préférée. More preferably, the invention relates to a kit according to the invention, characterized in that said reactor is a microtiter well, preferably round bottom (hemispherical) or V-bottomed microplate comprising wells 96 being even more preferred . Les figures dont les légendes sont ci-après, ainsi que les exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée.30 Légendes des figures Figures lA et 1B : Schéma vue de dessus (figure 1A) et vue de côté (figure 1B) de la plate-forme d'agitation ( teleshakeTM ) comprenant une plaque de fer doux sous la microplaque sur laquelle plaque de fer doux est fixé magnétiquement chacun des aimants en forme de pile sous chaque cupule de la microplaque. FIGS whose legends are below, and the examples which follow are intended to illustrate the invention without limiting the portée.30 Figure legends Figures lA and 1B: Schematic top view (Figure 1A) and for side (1B) of the platform agitation (teleshakeTM) comprising a soft iron plate in the microplate on which soft iron plate is fixed magnetically each of the magnets in a stack in each well of the microplate. (1) Gabarit en plastique permettant d'obtenir le bon espacement des aimants ; (1) Plastic template to obtain the proper spacing of the magnets; (2) Eléments permettant de caler la plaque d'aimants sur le teleshake ; (2) Elements to wedge the plate of magnets on the Teleshake; (3) Taquet du Teleshake permettant de caler les microplaques ; (3) Latch Teleshake to stall the microplates; (4) Aimant piles ; (4) Magnet batteries; (5) Microplaque ; (5) Microtiter; (6) Gabarit plastique ; (6) plastic template; (7) Plaque de fer doux sur laquelle les aimants sont fixés magnétiquement ; (7) plate of soft iron on which the magnets are magnetically attached; (8) Plaque de carton isolant le teleshake du champ magnétique des aimants piles ; (8) isolating the cardboard sheet Teleshake the magnetic field of magnets batteries; (9) Plateau rotatif du teleshake. (9) rotatably Plateau Teleshake.

Figures 2A et 2B : Schémas d'une cupule réacteur à fond rond (ou en U) après revêtement avec de l'anti-immunoglobuline sur sa paroi inclinée (en partie) et au fond de la cupule avant l'ajout de la solution de gel (tampon 1) et des différents solutions et réactifs. Figures 2A and 2B: Drawings of a cup round bottom reactor (or U) after coating with anti-immunoglobulin on its inclined wall (part) and the bottom of the well before adding the solution of gel (buffer 1) and the different solutions and reagents.

Figure 3 : Photographie montrant une image d'une réaction négative d'immunoadhérence avec des antigènes portés par des érythrocytes (pas de formation de complexe 20 spécifique). Figure 3: A photograph showing an image of an immunoadhesion negative reaction with antigens carried by the erythrocytes (no specific complex formation 20).

Figure 4 : Photographie montrant une image d'une réaction positive d'immunoadhérence avec des antigènes portés par des érythrocytes (formation de complexe spécifique adhérent à la paroi inclinée revêtue d'anti-immunoglobuline). Figure 4: A photograph showing an image of an immunoadhesion positive reaction with antigens carried by the erythrocytes (specific complex formation adherent to the inclined wall coated with anti-immunoglobulin). Figure 5 : Titrage de l'anti-D du CNRGS, dilution en polycontrol : douteux à 1 croix sur l'hématie homozygote à 2,5 ng/ml. Figure 5: Titration of anti-D CNRGS, dilution Polycontrol: Impaired 1 cross on the red cell homozygous 2.5 ng / ml.

Figure 6 : Titrage de l'anti-D du CNRGS, dilution en plasma AB : 1 croix sur l'hématie 30 homozygote à 2,5 ng/ml. Figure 6: Titration of anti-D CNRGS, plasma dilution AB: 1 cross on the red cell 30 homozygous 2.5 ng / ml.

Figure 7 : Titrage de l'anti- D et de l'anti- Fya du Contrôle Qualité en sérum AB. Figure 7: Titration of anti-D and anti-Fya Quality Control serum AB. * *

Figure 8 : Répétabilité et Reproductibilité 35 8 échantillons négatifs et 4 échantillons positifs (anti-D) ont été passés 3 fois sur une même plaque. Figure 8: Repeatability and Reproducibility 35 8 negative samples and four positive samples (anti-D) were passed three times on the same plate.

Figure 9 : Répétabilité et Reproductibilité 8 échantillons négatifs et 4 échantillons positifs (anti-D) ont été passés sur une autre 40 plaque. Figure 9: Repeatability and Reproducibility 8 negative samples and four positive samples (anti-D) were run on another plate 40. EXEMPLE 1 : Revêtement de la paroi inclinée et du fond de la cupule avec une anti- immunoglobuline La nature chimique et physico-chimique du plastique de la cupule utilisée 45 permet de recouvrir celui-ci d'une couche d'anti- immunoglobuline humaine (de type AHG monoclonale ou polyclonale) capable de se lier spécifiquement avec lesanticorps 25 des complexes spécifiques éventuellement formés, lorsque l'anticorps dudit complexe est d'origine humaine. EXAMPLE 1: Coating of the inclined wall and the bottom of the well with an anti-immunoglobulin The chemical and physicochemical nature of the plastic used the cup 45 permits the cover thereof of an anti-human immunoglobulin layer ( type AHG monoclonal or polyclonal) capable of specifically binding with specific lesanticorps 25 possibly formed complex, when the antibody of said complex is of human origin. On peut noter en outre que cette composition d'AGH peut comprendre des anticorps dirigés contre des déterminants de protéines sériques de type complément. It may be noted further that this composition AGH may include antibodies directed against different determinants complement type of serum proteins.

Les surfaces de la paroi interne du récipient qui ne sont pas revêtues d'AGH, peuvent être saturées à l'aide des agents saturants classiquement utilisés dans des techniques de type phase solide ou ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay). The surfaces of the inner wall of the vessel that are not coated with AGH, may be saturated using the saturating agents conventionally used in solid phase type techniques or ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay). Par exemple, la solution d'AGH à une concentration comprise entre 1 et 10 g/ml, peut être préparée en tampon carbonate 0,2 M pH 9,6. For example, the solution of AGH at a concentration between 1 and 10 g / ml, can be prepared in carbonate buffer 0.2 M pH 9.6.

Cette solution est répartie sous un volume de 75 l dans chaque cupule d'une micro-plaque à fond rond de type Maxisorp U8 NUNC, puis les plaques sont incubées une nuit à 4 C. Les cupules sont ensuite lavées à l'aide d'une solution tampon phosphate (PBS 2,5 mM pH 7,4) afin d'éliminer toutes les protéines non adsorbées directement au plastique. This solution is distributed in a volume of 75 l in each well of a microplate round-bottom type U8 Maxisorp NUNC, then the plates are incubated overnight at 4 C. The wells are then washed with the aid of a phosphate buffer solution (PBS 2.5 mM pH 7.4) to remove any non-adsorbed directly to the plastic proteins. Les cupules 1 sont ensuite traitées à l'aide d'une solution d'albumine à 30 g/1 en tampon PBS à raison de 100 pl par cupule. The cups 1 are then treated with an albumin solution to 30 g / 1 in PBS buffer at a rate of 100 pl per well. Après une incubation de 2 heures à température ambiante, les cupules sont à nouveau lavées en tampon phosphate. After incubation for 2 hours at room temperature, the wells are again washed in phosphate buffer.

EXEMPLE 2 : Préparation d'une suspension d'érythrocytes magnétisés à l'aide de particules magnétiques ou d'une solution de ferrofluide A) A l'aide de particules magnétiques On a utilisé dans cet exemple des particules paramagnétiques qui présentent une très grande homogénéité de taille (environ 300 nm de diamètre), une forte charge en matériau ferromagnétique (supérieure à 50 % en masse, environ 75 % en masse) et un état de surface plutôt hydrophobe (non fonctionnalisé). EXAMPLE 2 Preparation of an erythrocyte suspension magnetized using magnetic particles or ferrofluid solution A) using magnetic particles were used in this example paramagnetic particles which have a very high homogeneity size (about 300 nm in diameter), a high load of ferromagnetic material (greater than 50% by weight, about 75% by weight) and a surface state rather hydrophobic (non-functionalized). Ces particules peuvent être utilisées directement pour la magnétisation desérythrocytes, ou de préférence après un lavage préalable en détergent non ionique. These particles can be used directly for desérythrocytes magnetization, or preferably after prior washing in non-ionic detergent.

Ces particules peuvent être également utilisées après une étape de traitement avec le sérum albumine bovine (BSA) pour fixer l'érythrocyte de sorte à créer de multiples liaisons de faibles intensités entre la surface de l'érythrocyte et les particules. These particles may also be used after a step of treatment with bovine serum albumin (BSA) for securing the erythrocyte so as to create multiple bonds low intensities between the surface of the erythrocyte and the particles.

A cet effet, la fixation se déroule en deux étapes, la première consiste en l'activation des particules à l'aide de la BSA et la deuxième est la mise en présence de ces particules magnétiques recouvertes de BSA avec une suspension d'érythrocytes traités ou non par des enzymes protéolytiques. For this purpose, the fixing takes place in two stages, the first is the activation of the particles with BSA and the second is placed in the presence of these magnetic particles coated with BSA treated with a suspension of erythrocytes or not by proteolytic enzymes.

Les érythrocytes ainsi obtenues sont attirées par un champ magnétique et peuvent ainsi être utilisées dans le procédé de l'invention. The erythrocytes thus obtained are attracted by a magnetic field and thus can be used in the process of the invention. a) Première étape : activation des particules ferromagnétiques à la BSA Des particules de type Ademtech hydrophobe non fonctionnalisées de taille d'environ 300 nm, sont préalablement lavées et stockées en détergent non ionique. a) First step: activation of the ferromagnetic particles to the BSA hydrophobic Ademtech like particles unfunctionalized size of about 300 nm, are previously washed and stored in non-ionic detergent.

Le cas échéant, ces particules sont mises en présence d'une solution d'albumine bovine à 0,1 % (poids/volume) en tampon PBS pH 7,2. Where appropriate, these particles are brought into contact with a solution of bovine albumin in 0.1% (w / v) in PBS pH 7.2 buffer. Après une incubation de trente minutes à température ambiante et sous agitation non magnétique, les particules en suspension sont attirées par un aimant et le surnageant dépourvu de particules est éliminé. After incubation for thirty minutes at room temperature and non-magnetic stirring, the suspended particles are attracted by a magnet and the supernatant free from particles is removed. Le culot de particules ainsi recouvert de BSA peut être utilisé directement au cours de la phase de magnétisation des érythrocytes. The pellet of particles thus coated BSA can be used directly in the erythrocytes magnetization phase.

b) Deuxième étape :Magnétisation des érythrocytes Est ajoutée, au culot de particules ferromagnétiques obtenu à l'étape précédente, la suspension globulaire mise en tampon LISS à la concentration adéquate (possibilité d'effectuer la magnétisation des érythrocytes avec des suspensions cellulaires comprises entre 0,6 à 10 % en v/v et, le cas échéant, préalablement lavées trois fois avec de l'eau physiologique par exemple). b) Second step: Magnetization of the erythrocytes is added to the pellet of ferromagnetic particles obtained in the preceding step, the cell suspension in LISS buffer setting to the appropriate concentration (for automated magnetization erythrocytes with cell suspensions between 0 6 to 10% v / v and, where appropriate, previously washed three times with physiological saline, for example). Après avoir parfaitement homogénéisé, la suspension est incubée trente minutes à température ambiante sous agitation douce et homogène. After perfectly homogenized, the suspension is incubated for thirty minutes at room temperature with gentle agitation and homogeneous. Les érythrocytes sont ensuite lavés avec un tampon PBS pH 7,4 (deux lavages par centrifugation, trois minutes à 500 g). The erythrocytes are then washed with PBS buffer pH 7.4 (two washes by centrifugation, three minutes at 500 g). Le culot d'érythrocytes magnétisés peut être ensuite repris à la concentration de mise en oeuvre de l'analyse à l'aide d'un tampon type LISS (ou BFI). The magnetized erythrocyte pellet may then be resumed at a concentration of implementation of the analysis using a type LISS buffer (or BFI). Dans un exemple particulier, le rapport entre la quantité de particules mises en oeuvre et la quantité d'érythrocytes est compris entre 10 et 30 de sorte à obtenir une magnétisation efficace sans risquer de dégrader les antigènes de groupe sanguin présents à la surface de l'érythrocyte. In a particular example, the ratio between the amount of particles used and the amount of erythrocytes is between 10 and 30 so as to obtain an effective magnetization without the risk of degrading blood group antigens present on the surface of the erythrocyte.

Les érythrocytes ainsi obtenus peuvent soit être utilisés directement en tant que réactif (pour la RAI par exemple) ou en tant qu'analyte (pour le phénotypage). The erythrocytes thus obtained can either be used directly as a reagent (for RAI for example) or as an analyte (for phenotyping). A ce stade, ils peuvent également subir un traitement par des enzymes protéolytiques telles que la broméline ou la papaïne si nécessaire pour effectuer l'analyse demandée. At this stage, they may also undergo treatment with proteolytic enzymes such as bromelain and papain as necessary to perform the requested analysis.

B) A l'aide d'une solution de ferrofluide 1) Fabrication du ferrofluide prépurifié Matériel et méthode Matériel particulier et produits - 1 filtre Stericup GS 200 ml 0,22 m (Réf.: 107943) - 1 aimant solution de NH4OH à 28-30 % (ACROS, Réf.: 205840025 lot n A 017559001) - solution de HNO3 à 60 % (NORMAPUR, Réf. : UN 2031 lot n N182) FeC12, 4H2O (SIGMA, Réf. : 22,029-9 lot n S18641-463) - FeCl3, 6H2O (SIGMA, Réf. : F-2877, lot n 033K0108) 15 Fabrication du Ferrofuide : Préparation : 1/ Peser 13,51 g de FeC13 et dissoudre dans 20 ml d'eau déminéralisée et filtrée par agitation magnétique. B) Using a ferrofluid solution 1) Manufacture of the ferrofluid prepurified Materials and methods Equipment and particular products - 1 Stericup GS filter 200 ml 0.22 m (Ref .: 107943) - 1 magnet NH4OH 28 -30% (Acros, Ref .: 205 840 025 017 559 001 lot A) - 60% HNO 3 solution (NORMAPUR, Ref: 2031 lot N182.) FeC12, 4H2O (SIGMA, Ref: 22.029-9 lot S18641-. 463) - FeCl3, 6H2O (SIGMA, Ref: F-2877, lot 033K0108) 15 Manufacturing Ferrofuide Preparation 1 / Weigh 13.51 g of FeC13 and dissolve in 20 ml of deionized and filtered water by magnetic stirring. . Transférer la solution dans une éprouvette de 50 ml, rincer et compléter à 50 ml avec de l'eau déminéralisée filtrée (solution à 1 M). Transfer the solution into a test tube of 50 ml, rinse and complete to 50 ml with filtered demineralized water (1M solution). 20 2/ Peser 19,88 g de FeC12 et dissoudre dans 20 ml d'eau déminéralisée et filtrée par agitation magnétique. 20 2 / Weigh 19.88 g of FeC12 and dissolve in 20 ml of deionized water and filtered by magnetic stirring. Transférer la solution dans une éprouvette de 50 ml, rincer et compléter à 50 ml avec de l'eau déminéralisée filtrée (solution à 2 M). Transfer the solution into a test tube of 50 ml, rinse and complete to 50 ml with filtered demineralized water (solution 2M). 3/ Filtrer chaque solution sur filtre seringue 0,22 m. 3 / Filter each solution on 0.22 m syringe filter. 4/ Mettre 30 ml d'une solution d'ammoniac (NH4OH) à 28 % dans une éprouvette 25 de 250 ml et ajouter qsp 120 ml d'eau déminéralisée et filtrée (solution à 2 M). 4 / Put 30 ml of an ammonia solution (NH4OH) at 28% in a test tube 25 and add 250 ml qs to 120 ml of deionized and filtered water (2 M solution). 5/ Peser le ballon en verre de 1 1 du Rotavapor à vide. 5 / Weigh the glass flask 1 1 Rotavapor vacuum. Incubation : 6/ Mettre 10 ml de la solution de FeC12 (2 M) et 40 ml de la solution de FeCl3 (1 M) dans le ballon 1 L pour Rotavapor, homogénéiser la solution en agitant le ballon à 30 la main. Incubation: 6 / Put 10 ml of the FeC12 solution (2 M) and 40 ml of FeCl3 solution (1 M) in 1 L flask for Rotavapor, homogenize the solution by shaking the flask at 30 hand. 7/ Ajouter 200 ml d'eau déminéralisée filtrée, homogénéiser la solution en agitant le ballon à la main. 7 / Add 200 ml of filtered demineralized water, homogenize the solution by agitating the flask by hand. 8/ Placer le ballon de façon inclinée sur un appareil de type Rotavapor. 8 / Place the flask in an inclined manner on a Rotavapor type apparatus. 9/ Faire tourner le ballon à vitesse maximum pour bien homogénéiser la solution. 9 / Rotate the maximum speed ball to homogenize the solution. 10/ Ajouter 120 ml de la solution d'ammoniac 2 M. 11/ Laisser tourner le ballon pendant 15 minutes. 10 / Add 120 ml of the ammonia solution 2 M 11 / Allow the flask for 15 minutes. 12/ Mettre 105 ml d'acide nitrique (HNO3) à 60 % dans une fiole de 1 1 et ajouter qsp 1 1 d'eau déminéralisée filtrée (solution à 1 M). 12 / Put 105 ml of nitric acid (HNO3) at 60% in a flask and add 1 1 1 1 qs filtered deionized water (1M solution). 13/ Après les 15 minutes de rotation, placer le ballon sur l'aimant pendant 4 minutes. 13 / After 15 minutes of rotation, place the ball on the magnet for 4 minutes. 14/ Aspirer la totalité du surnageant. 14 / Aspirate all the supernatant. 15/ Resuspendre le culot. 15 / Resuspend pellet. 1 er lavage : 16/ Placer le ballon sur le Rotavapor et le faire tourner à vitesse maximum. 1 wash: 16 / Place the flask on the Rotavapor and rotate at maximum speed. 17/ Ajouter 200 ml de la solution d'HNO3 à 1 M. 18/ Laisser tourner le ballon pendant 10 minutes. 17 / Add 200 ml of the HNO3 solution 1 M 18 / Allow the flask for 10 minutes. 19/ Resuspendre le culot. 19 / Resuspend pellet. 20/ Répéter l'opération jusqu'à dissolution complète du culot. 20 / Repeat until complete dissolution of the pellet. 21/ Placer le ballon sur pour faire décanter la suspension de fer. 21 / Place the flask on to decant the iron suspension. 22/ Aspirer le surnageant. 22 / Aspirate supernatant. 23/ Resuspendre le culot. 23 / Resuspend pellet. Les étapes 16 à 23 peuvent être répétées si nécessaire. The steps 16 to 23 can be repeated if necessary. Dilution finale : 26/ Peser le ballon. Final dilution: 26 / Weigh the ball. 27/ En déduire la masse du culot obtenu et calculer le rendement de la réaction : (Masse culot obtenu / Masse de fer initiale) x 100 Masse de fer initiale = 14,77 g 55 % < rendement 28/ Ajouter 200 ml d'eau filtrée dans le ballon. 27 / deduce the mass of the pellet obtained and calculate the reaction yield (pellet weight obtained / initial iron mass) x 100 weight of original iron = 14.77 g 55% <yield 28 / Add 200 ml of water filtered into the flask. 29/ Placer le ballon sur le Rotavapor. 29 / Place the flask on the Rotavapor. 30/ Resuspendre le culot. 30 / Resuspend pellet. 31/ Filtrer la solution sur un filtre Stericup à 0,22 m. 31 / Filter the solution through a 0.22 m filter Stericup.

Préparation de la solution mère de ferrofluide : Diluer le ferrofluide ainsi obtenu dans un tampon LISS ou une solution physiologique à la concentration voulue dans un flacon. Preparation of stock solution of ferrofluid: Dilute the ferrofluid thus obtained in LISS buffer or saline to the desired concentration in a vial. Conservation du ferrofluide et/ou de la solution diluée à 4 C. 2) Magnétisation des Erythrocytes a) possibilité 1 : - mise en contact des érythrocytes avec la solution de ferrofluide diluée entre 0,3 et 0,5 % (v/v) dans du LISS ou dans un tampon physiologique afin d'obtenir la concentration désirée en érythrocytes de la suspension finale, de préférence entre 0, 5 % et 3 % en érythrocyte. Conservation of the ferrofluid and / or the diluted solution at 4 C. 2) Magnetization of erythrocytes) option 1: - contacting the erythrocytes with the diluted ferrofluid solution between 0.3 and 0.5% (v / v) in LISS or in a physiological buffer to obtain the desired concentration in erythrocytes of the final suspension, preferably between 0, 5% and 3% by erythrocyte. b) possibilité 2 : - amener la solution de ferrofluide à une DO à 450 nm équivalente à 0,9 dans du LISS, - ajouter 10 l de culot globulaire à 80 % d'hématocrite pour 240 pl solution de ferrofluide. b) Possibility 2: - bringing the ferrofluid solution to an OD at 450 nm equal to 0.9 in LISS, - add 10 l of RBCs at 80% hematocrit to 240 pl ferrofluid solution.

EXEMPLE 3 : Exemple de protocole et matériels et méthodes pour la RAI A) Protocole 1. Prendre une microplaque 96 puits revêtue avec AGH. Example 3: Example protocol and materials and methods for RAI A) Protocol 1. Take a 96-well microplate coated with AGH. 2. Déposer 50 pl de Tampon 1 (solution de gel) dans autant de cupules que nécessitera le test RAI. 2. Dispense 50 ul of Buffer 1 (gel solution) in as many wells that require the RAI test. 3. Déposer 60 l de solution LISS à 3 % en BSA chaque cupule utilisée. 3. Add 60 l of LISS solution of 3% BSA in each well used. 4. Déposer 12 l d'échantillon (sérum ou plasma) à analyser. 4. Add 12 l of sample (serum or plasma) to be analyzed. 5. Déposer 25 pl d'hématies magnétisées de panel RAI (hématie 1 dans le puits 1, hématie 2 dans le puits 2 et hématie 3 dans le puits 3). 5. Add 25 ul of panel magnetized RAI erythrocytes (red cell 1 into the well 1, 2 red cell into the well 2 and red cell 3 into the well 3). 6. Incuber la microplaque 20 min à 37 C. 7. Sortir la microplaque de l'incubateur. 6. Incubate the microplate for 20 min at 37 C. 7. Remove the plate from the incubator. 8. Mettre la plaque sur le teleshakeTM (agitateur de microplaque commercialisé par H+P LAB., Allemagne) adapté pour ce protocole (voir figures lA et 1B). 8. Place the plate on the teleshakeTM (MTP shaker marketed by H + P LAB., Germany) suitable for this protocol (see Figures lA and 1B). 9. Agiter 5 min 30 sec. 9. Shake 5 min 30 sec. à 500 tours/min10. 500 rev / min10. Interpréter Plaque coatée (revêtue d'AGH) avant et après dépôt (voir figures 2A et 2B). Interpret plate coated plate (coated with AGH) before and after deposition (see Figures 2A and 2B).

B) Interprétation (vue de dessus) (voir figures 3 et 4) 1. Un culot central, régulier et lisse sera interprété comme négatif (voir figure 3). B) Interpretation (top view) (see Figures 3 and 4) 1. A central pellet, regular and smooth will be interpreted as negative (see Figure 3). 2. Toute ouverture du culot central sera considérée comme positif. 2. Each opening of the central base will be considered positive. 3. Un tapis de cellule sur l'ensemble de la surface du puits sera un positif fort (voir figure 4). 3. A cell mat on the entire surface of the well will be a strong positive (see Figure 4). C) Composition des éléments nécessaires à la réaction 1. Tampon 1 1.1. C) Composition of the elements needed for reaction 1. Buffer 1 1.1. Ramener la BSA 30 % à une concentration de 10 % dans du tampon LISS. Bring the BSA 30% at a concentration of 10% in LISS buffer. 1.2. 1.2. Peser le SephadexTM G-100 superfine (600 mg pour 20 ml de tampon 1) (Réf. 10 17.0061.01 - Amersham Bioscience). Weigh the SephadexTM G-100 superfine (600 mg per 20 ml of buffer 1) (Ref 10 17.0061.01 -. Amersham Bioscience). 1.3. 1.3. Dissoudre le SephadexTM dans la BSA ramenée précédemment à 10 % dans le LISS. Dissolve SephadexTM in BSA reduced to 10% earlier in LISS. 1.4. 1.4. Laisser le tampon 1 une nuit à 4 C avant utilisation. Allow the buffer 1 night at 4 C before use. 2. Solution LISS à 3 % en BSA (voir composition d'une solution type LISS dans 15 la description) ou utiliser une solution LISS du commerce. 2. LISS solution in 3% BSA (see composition of an LISS solution in 15 type description) or using a LISS solution of commerce. 3. Tampon LISS (voir composition dans la description). 3. LISS buffer (composition see in the description). 4. Hématies magnétisées de panel RAI (voir Exemple 2). 4. Erythrocytes magnetized RAI panel (see Example 2). 5. Microplaque révêtue d'anti immunoglobuline. 5. Microplate coated with anti immunoglobulin. Microplaque NUNC maxisorp de 96 puits coatée avec une antiglobuline 20 Humaine monoclonale anti-IgG entre 1 et 5 g /ml (voir exemple précédent pour les conditions de coating). Microplate NUNC maxisorp 96-well plate coated with anti-IgG antiglobulin 20 Human monoclonal between 1 and 5 g / ml (see preceding example for the conditions of coating).

EXEMPLE 4 : Résultats A) Etude de receveurs 25 Le protocole a été testé sur 308 échantillons de receveurs. Example 4 Results) Study recipients 25 The protocol was tested on 308 samples of recipients. Panel d'hématies magnétisées 15 jours avant le début des analyses Tableau 2 : Comparaison avec une technique standard Diamed par gel centrifugation RAI PROCEDE DE L'INVENTION TOTAL Positifs Douteux Négatifs DIAMED Positifs 4 0 0 4 Négatifs 3 2 299 304 TOTAL 7 2 299 308 Seuls 5 échantillons sont discordants sur 308, soit un taux de concordance avec 10 Diamed de 98,4 %. Panel of magnetized erythrocytes 15 days before the start of the analyzes Table 2: Comparison with standard Diamed gel centrifugation technique RAI PROCESS OF INVENTION TOTAL Doubtful Positive Negative Positive DIAMED 4 0 0 4 3 Negatives 2,299,304 TOTAL 7 2,299,308 only five samples are discordant of 308, a concordance rate with 10 Diamed 98.4%. Tous les échantillons positifs sont vus par le procédé de l'invention. All positive samples are seen by the process of the invention. Sensibilité 100 % (n=4) Sensitivity 100% (n = 4)

Parmi les 304 négatifs, on peut noter 5 discordants soit 98,3 % de corrélation 15 Taux de faux positifs réels : 1 % Taux de douteux : 0,6 % Spécificité (n = 304) : 98,3 % Among the negative 304, it may be noted 5 discordant 98.3% correlation 15 real false positive rate: 1% doubtful Rate: 0.6% Specificity (n = 304): 98.3%

B) Etude de panels de positifs 20 1) Premier panel testé : 22 sérums positifs : - 7 sérums avec leurs dilutions : deux échantillons de sérum présentant un anticorps anti-D, deux échantillons avec un anticorps anti-Fya, un avec un anticorps anti-Kell, un avec un anti-E et un avec un anti-S. B) Study of positive January 20 panels) First test panel: 22 positive sera: - 7 sera with dilutions thereof: two serum samples with anti-D antibodies, both samples with anti-Fya antibody, with anti -Kell, one with an anti-E and one with an anti-S. Résultats : aucun échantillon raté. Results: no missed sample. 25 2) Deuxième panel (Life Therapeutics) - 32 sérums Nbre d'échant Anticorps 1 CDE Nbre d'échant.Anticorps Nbre d'échant Anticorps 2 Jkb 3 Lub C 3 Fyb 2 E 3 30 D slide 5 Jka 1 Jsa 1 e 2 Kpb 2 Lua 1 Fya 4 S 2 Panel testé avec le protocole de l'invention (décrit dans les exemples) Résultats : aucun sérum positif raté. 25 2) The second panel (Life Therapeutics) - No. of samples 32 sera Antibody 1 CDE échant.Anticorps No. No. of samples Antibody 2 Jkb 3 Lub C 3 Fyb 2 E 3 30 D slide 5 Jka Jsa 1 1 e 2 kbp Lua 2 1 4 S 2 Fya Panel tested with the protocol of the invention (described in the examples) Results: no missed positive serum. Seulement 2 échantillons n'ont pas montré une concordance parfaite sur les 3 hématies testées en screening : 2 hématies faussement positives. Only 2 samples showed no perfect agreement on the 3 red cells tested screening: 2 false-positive red blood cells. 3) Test de receveurs du Centre Hospitalier Régional & Universitaire de Lille (CHR&U de Lille, France) 4 échantillons receveurs du CHR&U de Lille ont été détectés positifs par notre méthode et confirmés en méthode de référence DIAMED. 3) recipients Testing Center Hospitalier Régional Universitaire de Lille & (CHR & U Lille, France) 4 receivers samples CHR & U Lille were detected positive by our method and reference method confirmed DIAMED. 4) Limite de détection Protocole de l'invention Afin de tester la limite de détection de la méthode décrite nous avons utilisé l'anti-D à 20 ng/ml du CNRGS (centre National de Référence des Groupes Sanguins) ainsi qu'un anticorps anti-Fya du contrôle Qualité, tous deux dilués dans du polycontrol. 4) Limit of detection protocol of the invention To test the detection limit of the described method we used anti-D to 20 ng / ml of CNRGS (National Center of Blood Groups of Reference) and an antibody anti-Fya quality control, both diluted in Polycontrol. -Anti-D CNRGS Dilution en polycontrol : douteux à 1 croix sur l'hématie homozygote à 2,5 ng/ml. -Anti-D CNRGS Dilution Polycontrol: Impaired 1 cross on the red cell homozygous 2.5 ng / ml. Voir Figure 5 Dilution en plasma AB : 1 croix sur l'hématie homozygote à 2,5 ng/ml. See Figure 5 plasma dilution AB: 1 cross on the red cell homozygous 2.5 ng / ml.

Voir Figure 6 - Titrage de l'anti- D et de l'anti- Fya du contrôle qualité en sérum AB Voir Figure 7 5) Répétabilité et Reproductibilité Protocole de l'invention Afin de tester le protocole 8 échantillons négatifs et 4 échantillons positifs (anti-D) ont été passés sur 2 plaques différentes et 3 fois sur une même plaque. See Figure 6 - Titration of anti-D and anti-Fya serum quality control AB See Figure 7. 5) Repeatability and Reproducibility Protocol of the invention To test the protocol 8 negative samples and 4 positive samples ( anti-D) were run on two different plates and three times on the same plate. - 3 fois sur la même plaque (test intra-plaque) (voir figure 8) - sur une autres plaque (test inter-plaque à comparer avec la figure 8) (voir figure 9). - 3 times on the same plate (test intra-plate) (see Figure 8) - a further plate (inter-plate test in comparison with FIG 8) (see Figure 9).

Les résultats observés montrent une excellente reproductibilité et répétabilité du procédé de l'invention. The observed results show excellent reproducibility and repeatability of the process of the invention.

Claims (35)

    REVENDICATIONS
  1. 1. Procédé de mise en évidence d'un complexe spécifique formé par réaction entre un anticorps présent dans une solution et un antigène lié à une particule magnétique, la réaction s'effectuant dans un réacteur ouvert vers le haut et à fond fermé et dont la section diminue au moins dans la zone voisine du fond pour former une paroi inclinée s'étendant jusque dans le fond, ladite paroi inclinée étant au moins en partie revêtu d'une anti-immunoglobuline ou de tout autre composé capable de se lier à l'anticorps dudit complexe formé, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) préalablement à la réaction : - le remplissage préalable du réacteur avec une substance visqueuse ou un gel homogène de manière à recouvrir au moins en partie la paroi inclinée du réacteur, b) la mise en contact au-dessus de la solution visqueuse contenue dans le réacteur de la solution contenant ou susceptible de contenir ledit anticorps avec la suspension de particul 1. A method of highlighting a specific complex formed by reaction between an antibody present in a solution and an antigen bound to a magnetic particle, the reaction taking place in an open reactor upwards and closed bottom and whose section decreases at least in the region near the bottom to form an inclined wall extending into the base, said angled wall being at least partly coated with an anti-immunoglobulin or any other compound capable of binding to the said antibody complex formed, characterized in that it comprises the following steps: a) prior to the reaction: - the pre-filling of the reactor with a viscous substance or a homogeneous gel so as to cover at least part of the inclined wall of the reactor b) contacting over the viscous solution in the reactor the solution containing or suspected of containing said antibody with the suspension of particul es magnétiques portant ou susceptible de porter ledit antigène ; magnetic bearing are or likely to said antigen; c) l'incubation du réacteur pendant un temps donné nécessaire à la formation du complexe ; c) incubating the reactor during a given time required for the formation of the complex; d) l'application d'un champ magnétique audit réacteur et l'agitation du réacteur, de telle 20 manière que les particules magnétiques soient entraînées vers le fond et/ou la paroi inclinée du réacteur; d) applying a magnetic field to said reactor and agitation of the reactor, in such a 20 way that the magnetic particles are entrained towards the bottom and / or the inclined wall of the reactor; et e) la lecture à l'oeil et/ou par tout autre système de lecture appropriée, de l'image obtenue au fond du réacteur et/ou sur la paroi inclinée du réacteur revêtue de ladite antiimmunoglobuline ou de tout autre composé capable de se lier à l'anticorps, cette image 25 obtenue permettant de mettre en évidence la présence ou non de la formation d'un complexe spécifique anticorps/anti-antigène. and e) reading by eye and / or by any other appropriate playback system, the image obtained at the bottom of the reactor and / or on the inclined wall of the reactor coated with said anti-immunoglobulin or any other compound capable of binding to the antibody, this 25 obtained image to highlight the presence or absence of the formation of a specific antibody / anti-antibody complex.
  2. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le mélange réactionnel obtenu par mélange entre la solution contenant ou susceptible de contenir ledit anticorps et la suspension de particules magnétiques portant ou susceptible de 30 porter ledit antigène, contient un ou plusieurs anticorps non dirigés contre les antigènes portés par les particules magnétiques et capables de se fixer à l'anti-immunoglobuline ou à tout autre composé capable de se lier à l'anticorps. 2. Method according to claim 1, characterized in that the reaction mixture obtained by mixing between the solution containing or suspected of containing said antibody and the suspension of magnetic particles carrying or capable of carrying said 30 antigen contains one or more non antibodies against antigens carried by the magnetic particles and capable of binding to anti-immunoglobulin, or any other compound capable of binding to the antibody.
  3. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'à l'étape d), l'application d'un champ magnétique audit réacteur et l'agitation du réacteur sont réalisées simultanément. 3. The method of claim 1 or 2, characterized in that in step d), applying a magnetic field to said reactor and agitation of the reactor are carried out simultaneously.
  4. 4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'à l'étape d), l'application du champ magnétique et l'agitation sont réalisées simultanément pendant une durée comprise entre 2,5 mn et 10 mn. 4. A method according to one of claims 1 to 3, characterized in that in step d), applying the magnetic field and stirring are carried out simultaneously for a time between 2.5 min and 10 min .
  5. 5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'à l'étape d), l'application du champ magnétique et l'agitation sont réalisées simultanément pendant une durée comprise entre 5 mn et 6 mn. 5. A method according to claim 4, characterized in that in step d), applying the magnetic field and stirring are carried out simultaneously for a period between 5 min and 6 min.
  6. 6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'à l'étape d), l'application du champ magnétique est réalisée au moyen d'un aimant situé à l'extérieur sous le réacteur de telle manière que les particules magnétiques soient entraînées au fond du réacteur. 6. A method according to one of claims 1 to 5, characterized in that in step d), the magnetic field application is performed by means of a magnet located outside the reactor in such a way that the magnetic particles are entrained in the reactor bottom.
  7. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'à l'étape d) ledit aimant est un aimant permanent de magnitude comprise entre 10 000 et 14 000 gauss. 7. A method according to claim 6, characterized in that in step d) said magnet is a permanent magnet of magnitude between 10 000 and 14 000 gauss.
  8. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'à l'étape d), l'agitation est réalisée au moyen d'un agitateur rotatif. 8. A method according to one of claims 1 to 7, characterized in that in step d), the stirring is performed by means of a rotary shaker.
  9. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'à l'étape d), l'agitation est effectuée à une vitesse comprise entre 250 et 750 trs/mn. 9. The method of claim 8, characterized in that in step d), the stirring is carried out at a speed between 250 and 750 rev / min.
  10. 10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'à l'étape c), la durée d'incubation est comprise entre 10 mn et 30 mn. 10. A method according to one of claims 1 to 9, characterized in that in step c), the incubation time is between 10 minutes and 30 minutes.
  11. 11. Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'à l'étape c), l'incubation est réalisée à une température comprise entre 20 C et 40 C. 11. A method according to one of claims 1 to 10, characterized in that in step c), the incubation is conducted at a temperature between 20 C and 40 C.
  12. 12. Procédé selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce qu'à l'étape b), l'incubation est réalisée à une température de 37 C 1 C. 12. A method according to one of claims 1 to 11, characterized in that in step b), the incubation is conducted at a temperature of 37 C 1 C.
  13. 13. Procédé selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que les particules magnétiques ont un diamètre compris entre 100 nm et 1,5 m. 13. A method according to one of claims 1 to 12, characterized in that the magnetic particles have a diameter between 100 nm and 1.5 m.
  14. 14. Procédé selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que les particules magnétiques contiennent au moins 40 % en poids au moins de composés ferromagnétiques. 14. A method according to one of claims 1 to 13, characterized in that the magnetic particles contain at least 40% by weight at least of ferromagnetic compounds.
  15. 15. Procédé selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisé en ce qu'à l'étape a), le remplissage préalable du réacteur avec une substance visqueuse ou un gel homogène est réalisé avec une substance visqueuse ou un gel dont la densité est telle qu'elle empêche la migration des anticorps n'ayant pas formé de complexe avec les antigènes liés aux particules magnétiques vers la paroi revêtue d'anti-immunoglobuline ou de tout autre composé capable de se lier à l'anticorps lors de l'étape d). 15. A method according to one of claims 1 to 14, characterized in that in step a), the pre-filling of the reactor with a viscous substance or a homogeneous gel is produced with a viscous substance or a gel whose density is such that it prevents migration of the antibody have not formed a complex with the antigen bound to magnetic particles to the wall coated with anti-immunoglobulin or any other compound capable of binding to the antibody during the step d).
  16. 16. Procédé selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisé en ce qu'à l'étape a), la solution visqueuse ou le gel est de densité supérieure à 1. 16. A method according to one of claims 1 to 15, characterized in that in step a), the viscous solution or the gel is greater than one density.
  17. 17. Procédé selon l'une des revendications 1 à 16, caractérisé en ce qu'à l'étape a), le gel est un gel de dextran ou d'agarose. 17. A method according to one of claims 1 to 16, characterized in that in step a), the gel is a gel of agarose or dextran.
  18. 18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'à l'étape a), la solution visqueuse est du SephadexTM, de préférence du G-10OTM superfine. 18. The method of claim 17, characterized in that in step a), the viscous solution is SephadexTM, preferably G-10OTM superfine.
  19. 19. Procédé selon l'une des revendications 1 à 18, caractérisé en ce qu'à l'étape b), la solution contenant ou susceptible de contenir ledit anticorps est déposée sur la solution visqueuse avant le dépôt de la suspension de particules magnétiques portant ou susceptible de porter ledit antigène. 19. A method according to one of claims 1 to 18, characterized in that in step b) the solution containing or suspected of containing said antibody is deposited on the viscous solution before deposition of the suspension of magnetic particles carrying or likely to said antigen.
  20. 20. Procédé selon l'une des revendications 1 à 19, caractérisé en ce qu'avant l'étape b), la solution visqueuse est recouverte d'une solution aqueuse destinée à diluer le mélange réactionnel déposé à l'étape b). 20. A method according to one of claims 1 to 19, characterized in that before step b), the viscous solution is covered with an aqueous solution for diluting the reaction mixture deposited in step b).
  21. 21. Procédé selon l'une des revendications 1 à 20, caractérisé en ce qu'avant l'étape b), la solution visqueuse est recouverte d'une solution aqueuse destinée à diluer et à favoriser la formation du complexe anticorps/antigène à l'étape b). 21. A method according to one of claims 1 to 20, characterized in that before step b), the viscous solution is covered with an aqueous solution for diluting and promote the formation of antibody / antigen complex to the step b).
  22. 22. Procédé selon l'une des revendications 1 à 21, caractérisé en ce que le réacteur est une cupule de microplaque à fond rond ou à fond V. 22. A method according to one of claims 1 to 21, characterized in that the reactor is a microtiter well round bottom or bottom V.
  23. 23. Procédé selon la revendication 22, caractérisé en ce qu'à l'étape d), l'agitation est une agitation rotative ayant une orbitale comprise entre 1,0 mm et 2,5 mm de diamètre. 23. The method of claim 22, characterized in that in step d), the stirring is a rotary stirring having an orbiting between 1.0 mm and 2.5 mm in diameter.
  24. 24. Procédé selon la revendication 23, caractérisé en ce que la solution d'anticorps est un échantillon de plasma ou de sérum humain dans lequel on cherche à mettre en évidence la présence d'un anticorps dirigé spécifiquement contre un antigène lié à la particule magnétique et en ce que l'anti-immunoglobuline est une anti- immunoglobuline humaine. 24. The method of claim 23, characterized in that the antibody solution is a sample of plasma or human serum in which it is desired to highlight the presence of an antibody specifically directed against an antigen bound to the magnetic particle and in that the anti-immunoglobulin is an anti-human immunoglobulin.
  25. 25. Procédé selon l'une des revendications 1 à 24, caractérisé en ce qu'à l'étape e), la collecte au point le plus bas du réacteur de l'ensemble des particules magnétiques est significative de l'absence de formation de complexe spécifique anticorps/antigène ou en ce que la présence d'au moins une fraction visible de particules magnétiques sur la paroi inclinée du réacteur revêtue d'anti-immunoglobuline est significative de la formation dudit complexe. 25. A method according to one of claims 1 to 24, characterized in that in step e), collecting at the lowest point in the reactor of all the magnetic particles is indicative of the absence of formation of specific antibody / antigen complex or that the presence of at least one visible fraction of magnetic particles on the inclined wall of the reactor coated with anti-immunoglobulin is indicative of the formation of said complex.
  26. 26. Procédé selon l'une des revendications 1 à 25, pour la mise en évidence d'un complexe spécifique formé par réaction entre un anticorps présent dans une solution et un antigène porté par une cellule elle-même liée à une ou plusieurs particules magnétiques. 26. A method according to one of claims 1 to 25 for the detection of a specific complex formed by reaction between an antibody present in a solution and an antigen carried by a cell itself linked to one or more magnetic particles .
  27. 27. Procédé selon la revendication 26, pour la mise en évidence d'un complexe spécifique formé par réaction entre un anticorps anti-antigène de groupe sanguin présent dans une solution et un antigène de groupe sanguin, caractérisé en ce que la cellule est un érythrocyte. 27. The method of claim 26, for the detection of a specific complex formatting formed by reaction between an anti-antigen antibody of blood group present in a solution and a blood group antigen, characterized in that the cell is an erythrocyte .
  28. 28 Procédé selon la revendication 27, pour la recherche et d'agglutinines irrégulières (RAI) dans un échantillon de sérum ou plasma, caractérisé en ce qu'il comprend une étape dans laquelle la suspension d'érythrocytes portant les antigènes sont liés par adsorption à des particules magnétiques préalablement mises en contact avec une solution d'albumine. 28 A method according to claim 27 for the research and irregular antibodies (RAI) in a serum or plasma sample, characterized in that it comprises a step wherein the suspension of erythrocytes carrying the antigen are bound by adsorption to magnetic particles beforehand contacted with a solution of albumin.
  29. 29. Procédé selon la revendication 27, pour le phénotypage de globules rouges, caractérisé en ce que la solution d'anticorps à l'étape b) est une solution de sérum test contenant un anticorps anti-antigène de groupe sanguin connu. 29. The method of claim 27 for phenotyping red blood cells, characterized in that the antibody solution in step b) is a test serum solution containing anti-antigen antibody of known blood group.
  30. 30. Procédé selon la revendication 29, caractérisé en ce qu'avant la fixation des particules magnétiques, les érythrocytes sont préalablement soumis à l'action d'une protéase. 30. A method according to claim 29, characterized in that before the attachment of the magnetic particles, the erythrocytes are subjected beforehand to the action of a protease.
  31. 31. Procédé selon l'une des revendications 27 à 30, caractérisé en ce que la concentration d'érythrocytes dans la suspension d'érythrocytes liés aux particules magnétiques est comprise entre 0,1 % à et 5 %. 31. A method according to one of claims 27 to 30, characterized in that the concentration of erythrocytes in the suspension of erythrocytes bound to the magnetic particles is from 0.1% to 5%.
  32. 32. Dispositif pour la mise en évidence d'un complexe spécifique formé par réaction entre un anticorps présent dans une solution et un antigène lié à une particule magnétique, ou pour la mise en évidence d'un complexe spécifique formé par réaction entre un anticorps anti-antigène de groupe sanguin présent dans une solution et un antigène de groupe sanguin porté par un érythrocyte lié à une ou plusieurs particules magnétiques, ou pour la RAI ou pour le phénotypage de groupe sanguin, caractérisé en ce qu'il comprend : a) - un réacteur ou un ensemble de réacteurs ouvert vers le haut et à fond fermé et dont la section diminue au moins dans la zone voisine du fond pour former une paroi inclinée s'étendant jusque dans le fond, ladite paroi inclinée étant au moins en partie revêtue d'une anti-immunoglobuline ou de tout autre composé capable de se lier à l'anticorps dudit complexe formé, - chacun des réacteurs pouvant être rempli en partie d'une substance 32. Apparatus for detection of a specific complex formed by reaction between an antibody present in a solution and an antigen bound to a magnetic particle, or for the demonstration of a specific complex formed by reaction between an antibody -antigen blood group present in a solution and a blood group antigen carried by an erythrocyte bound to one or more magnetic particles, or the RAI or for phenotyping blood group, characterized in that it comprises: a) - a reactor or an open reactor assembly upwards and closed at the base and whose cross-section decreases at least in the region near the bottom to form an inclined wall extending into the base, said angled wall being at least partly coated an anti-immunoglobulin or any other compound capable of binding to the antibody of said complex formed, - each reactor can be filled in part of a substance visqueuse ou d'un gel ; viscous or gel; b) au moins un aimant ou un ensemble d'aimants pouvant être disposé à l'extérieur sous le ou les réacteurs couplé(s) à un système d'agitation rotatif dudit ou desdits réacteurs ; b) at least one magnet or set of magnets can be disposed outside the under or coupled reactor (s) to a rotary stirring system said one or more reactors; c) le cas échéant, un incubateur capable de réguler la température d'incubation des réacteurs ; c) optionally, an incubator capable of regulating the reactor temperature incubation; et d) le cas échéant, un lecteur capable d'évaluer la présence et la localisation des 15 érythrocytes magnétiques à la fin de la réaction de chacun des réacteurs. and d) where appropriate, a reader able to assess the presence and location of the 15 magnetic erythrocytes at the end of the reaction of each of the reactors.
  33. 33. Kit pour la mise en évidence d'un complexe spécifique formé par réaction entre un anticorps présent dans une solution et un antigène lié à une particule magnétique, caractérisé en ce qu'il comprend : a) un réactif comprenant une suspension de particules magnétiques revêtues au moins 20 d'un antigène ; 33. Kit for the detection of a specific complex formed by reaction between an antibody present in a solution and an antigen bound to a magnetic particle, characterized in that it comprises: a) a reagent comprising a suspension of magnetic particles coated at least 20 antigen; et b) - un réacteur ou un ensemble de réacteurs ouvert vers le haut et à fond fermé et dont la section diminue au moins dans la zone voisine du fond pour former une paroi inclinée s'étendant jusque dans le fond, ladite paroi inclinée étant au moins en partie revêtue d'une anti-immunoglobuline ou de tout autre composé capable de se lier à l'anticorps 25 dudit complexe formé, - un container contenant une solution visqueuse ou un gel, ou le cas échéant, chacun des réacteurs étant rempli en partie de ladite substance visqueuse ou dudit gel ; and b) - a reactor or an open reactor assembly upwards and closed at the base and whose cross-section decreases at least in the region near the bottom to form an inclined wall extending into the base, said angled wall being at least partly coated with an anti-immunoglobulin or any other compound capable of binding to the antibody 25 of the complex formed, - a container containing a viscous solution or a gel, or where appropriate, each of the reactors being filled in portion of said viscous substance or said gel; et, c) le cas échéant, au moins un aimant ou un ensemble d'aimants pouvant être disposé à l'extérieur sous le ou les réacteurs couplé(s) à un agitateur rotatif 30 and, c) optionally, at least one magnet or set of magnets can be disposed outside the under or coupled reactor (s) to a rotatable agitator 30
  34. 34. Kit selon la revendication 33, pour la RAI, caractérisé en ce que ledit réactif contient une suspension d'érythrocytes tests de phénotype connu. 34. The kit of claim 33, for RAI, characterized in that said reagent contains a suspension of erythrocytes known phenotype tests.
  35. 35. Kit selon la revendication 33, pour le phénotypage de groupe sanguin caractérisé en ce que ledit réactif contient un sérum test contenant un anticorps antiantigène de groupe sanguin, de préférence de type IgG, et, en outre, un réactif contenant une suspension de particules magnétiques pouvant se lier à une suspension d'érythrocytes que l'on cherche à phénotyper. 35. The kit of claim 33, for phenotyping blood group characterized in that said reagent contains a test serum containing antibodies antiantigène blood group, preferably of the IgG type, and, in addition, a reagent containing a suspension of particles magnetic capable of binding to an erythrocyte suspension which seeks to phenotype.
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