FR2828104A1

FR2828104A1 - Utilisation d'inhibiteurs du facteur de croissance epidermique liant l'heparine ou d'inhibiteurs de ses recepteurs pour la preparation de medicaments utiles pour traiter le myelome

Info

Publication number: FR2828104A1
Application number: FR0110354A
Authority: FR
Inventors: Bernard Klein; Vos John De; Yue Dan Wang
Original assignee: CELLGEN SARL; Centre Hospitalier Universitaire de Montpellier CHUM
Current assignee: CELLGEN SARL; Centre Hospitalier Universitaire de Montpellier CHUM
Priority date: 2001-08-01
Filing date: 2001-08-01
Publication date: 2003-02-07
Anticipated expiration: 2021-08-01
Also published as: CA2459071A1; WO2003013485A1; US20040254144A1; EP1411907A1; FR2828104B1; JP2005504038A

Abstract

La présente invention a pour objet l'utilisation d'au moins un inhibiteur du facteur de croissance épidermique (EGF) liant l'héparine (HB) ou d'au moins un inhibiteur des récepteurs de HB-EGF, ou récepteurs ErbB, ou d'au moins un inhibiteur des voies de transduction associées pour la préparation de médicaments utiles pour induire l'apoptose et/ ou inhiber la prolifération des cellules tumorales plasmocytaires IL-6 dépendantes.

Description

La présente invention est relative au traitement du myélome multiple. Elle concerne plus particulièrement l'utilisation d'au moins un inhibiteur du facteur de croissance épidermique (EGF) liant l'héparine (HB) ou d'au moins un inhibiteur des récepteurs de HB-EGF, ou récepteurs ErbB ou d'au moins un inhibiteur des voies de transduction associées pour la préparation de médicaments utiles pour induire l'apoptose et/ou inhiber la prolifération des cellules tumorales plasmocytaires IL-6 dépendantes.

La présente invention concerne également l'utilisation d'au moins un inhibiteur du facteur de croissance épidermique liant l'héparine HB-EGF ou d'au moins inhibiteur des récepteurs de HB-EGF, ou récepteurs ErbB ou d'au moins un inhibiteur des voies de transduction associées en combinaison avec au moins un inhibiteur de IL-6 ou au moins un inhibiteur du récepteur de IL-6 ou au moins un inhibiteur des voies de transduction associées pour la préparation de médicaments utiles pour induire l'apoptose et/ou inhiber la prolifération des cellules tumorales plasmocytaires IL-6 dépendantes.

L'interleukine 6 (IL-6) et les autres cytokines de la famille IL-6 sont des facteurs de croissance importants des cellules malignes plasmocytaires impliqués dans le myélome multiple (1, 2).

On sait également que IL-6 est principalement produit par les cellules de l'environnement de la moelle osseuse (2, 3) et que la production de IL-6 par ces cellules est induite après interaction avec les cellules de myélome (4,5).

On a maintenant trouvé que le gène codant pour le facteur de croissance épidermique liant l'héparine (HB-EGF) est surexprimé dans les cellules de myélome et que la prolifération de lignées cellulaires de myélome induites par IL-6 est liée à la présence d'une boucle autocrine CD9/HBEGF/ErbB1.

HB-EGF est un facteur produit soit sous forme soluble, soit sous forme de protéine transmembranaire (6, 7). la forme membranaire est le récepteur

de la toxine de la diphtérie. De plus, HB-EGF est un ligand des récepteurs du facteur de croissance épidermique (ErbB1 et ErbB4) (6, 7). Il est produit par diverses cellules tumorales et agit en tant que facteur de croissance tumoral autocrine (6, 7).

Les inhibiteurs du facteur HB-EGF qui conviennent aux fins de l'invention sont toutes les substances capables d'inhiber la prolifération ou d'induire l'apoptose des cellules plasmocytaires tumorales par exemple dans les conditions définies dans les exemples illustratifs ci-après.

A titre d'exemples de substances capables d'inhiber le facteur HB-EGF, on peut citer notamment les héparines, en particulier l'héparine de bas poids moléculaire, la toxine diphtérique et les anticorps anti-HB-EGF, en particulier les anticorps monoclonaux anti-HB-EGF, tels que ceux décrits dans les exemples illustratifs ci-après.

Les inhibiteurs du récepteur de HB-EGF qui conviennent aux fins de l'invention sont toutes les substances capables d'inhiber la prolifération ou d'induire d'apoptose des cellules plasmocytaires tumorales par exemple dans les conditions définies dans les exemples ci-après.

Des exemples d'inhibiteurs des récepteurs ErbB appropriés sont notamment les anticorps monoclonaux anti-ErbB 1, tels que par exemple l'anticorps monoclonal LA-1, commercialisé par UBI (Lake Placid NY USA).

Les inhibiteurs de IL-6 qui peuvent être utilisés aux fins de l'invention sont par exemple les corticoïdes, l'IL-6 mutée ou d'autres inhibiteurs de l'IL-6 et les anticorps monoclonaux anti-IL-6, tels que notamment ceux dirigés contre la chaîne gp 80 ou la chaîne gp 130, par exemple les anticorps monoclonaux B-E8, produits par la société Diaclone (Besançon) et les inhibiteurs du récepteur de IL-6 tels que l'anticorps monoclonal B-R3, anticorps anti-transducteur de IL-6 gp 130, propriété de l'INSERM et Diaclone, produit par Diaclone.

Une dose efficace de chacun des inhibiteurs mis en oeuvre selon l'invention doit être utilisée selon des doses pharmacologiquement équivalentes, déduites des données expérimentales.

La dose efficace dépend, bien entendu, de l'état d'évolution du myélome, de l'âge, du profil biologique, de l'état clinique du patient et d'autres paramètres pharmacologiques dépendants du patient ou de son état clinique, tels que par exemple la production quotidienne d'IL-6 calculée selon la méthode décrite par Lu et al. (13), le profil de prolifération, le taux de CRP/IL-6, l'isotype de la protéine monoclonale, les facteurs pronostiques du myélome, les fonctions vitales notamment la clearance à la créatinine, les fonctions hépatiques,...).

La dose efficace peut être déterminée selon la méthode décrite par Lu et al (13).

En général, la dose d'inhibiteur de HB-EGF ou du récepteur de HB-EGF peut être comprise entre 10 et 1000 gg/mL de plasma.

La dose d'inhibiteur de IL-6 ou d'inhibiteur du récepteur de IL-6 peut être comprise entre 10 et 1000 ug/mL de plasma.

Selon un autre aspect, la présente invention a pour objet une composition pharmaceutique à action anti-myélome (action inhibitrice de la prolifération du myélome) contenant, en tant que principe actif, une quantité efficace d'au moins un inhibiteur de HB-EGF ou d'au moins un inhibiteur des récepteurs de HB-EGF, en combinaison avec un excipient pharmaceutique acceptable.

Selon une variante préférée, la composition pharmaceutique selon l'invention contient, en tant que principe actif, une quantité efficace d'au moins un inhibiteur de HB-EGF ou au moins un inhibiteur des récepteurs ErbB de HB-EGF, en particulier du récepteur ErbB1 ou du récepteur ErbB4, ou au moins un inhibiteur des voies de transduction en association avec une quantité efficace d'au moins un inhibiteur de IL-6 ou d'au moins un inhibiteur du récepteur de IL-6, ou d'un inhibiteur des voies de transduction induites par l'IL-6, lesdits inhibiteurs étant conditionnés

ensemble ou séparément avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

On peut utiliser un véhicule pharmaceutiquement acceptable classique quelconque, tel que par exemple une solution contenant un stabilisateur d'anticorps monoclonal ou de l'albumine humaine, de préférence, on utilise un véhicule pharmaceutiquement acceptable approprié pour une administration parentérale.

L'invention a également pour objet un procédé de traitement du myélome qui consiste à administrer aux patients ayant un myélome une quantité efficace d'au moins un inhibiteur de HB-EGF ou d'au moins un inhibiteur du récepteur de HB-EGF ou d'au moins un inhibiteur des voies de transduction associées éventuellement en combinaison avec une quantité efficace d'au moins un inhibiteur de IL-6 ou d'au moins un récepteur de IL-6 ou d'au moins un inhibiteur des voies de transduction associées, l'administration desdits inhibiteurs étant concomitante ou séquentielle, déterminée selon les données déduites de paramètres pharmacologiques ou de données cliniques.

La présente invention va être maintenant décrite plus en détail par les tests qui ont été réalisés et qui mettent en évidence que, dans le cas du myélome, on peut inhiber la prolifération des cellules plasmocytaires malignes ou provoquer l'apoptose de ces cellules.

Dans les tests reportés ci-après, on a utilisé les lignées cellulaires de myélome humaines (HMCL) XG-1, XG-6, XG-13 et XG-14 obtenues dans l'Unité de Thérapie Cellulaire du CHU de Montpellier et l'unité INSERM U475 à Montpellier et qui ont été décrites dans la littérature (8, 9, 10).

On sait que la croissance de ces quatre lignées cellulaires de myélome, XG-1, XG-6, XG-13 et XG-14, est strictement dépendante de l'addition d'IL-6 exogène. Lors du retrait de IL-6, ces cellules subissent une apoptose progressive en 3 à 4 jours. Les HMCL ont été maintenues dans du milieu de culture sans sérum X-VIVO 20 (Biowittaker, Maryland, US) et 5 ng/ml de IL-6.

Dans ces tests, on a utilisé : - les EGF et EGF recombinants commercialisés par R & D System (Minneapolis, MN, USA), - la toxine diphtérique mutée commercialisée par Sigma (St. Louis,
MO, USA), - l'anticorps neutralisant dirigé contre HB-EGF commercialisé par
R & D System, - l'anticorps monoclonal (mAb) LA-1 neutralisant dirigé contre le récepteur ErbB1 produit par UBI (Lake Placid, NY USA) et commercialisé par EUROMEDEX (Souffelweyersheim, France), - les immunoglobulines de chèvre purifiées commercialisées par
TEBU (Le Perray en Yvelines, France).

- l'anticorps monoclonal anti-transducteur de IL-6 gp 130 B-R3 neutralisant décrit par Wijdenes et al. (11).

Les méthodes mises en oeuvre dans ces tests vont maintenant être décrites en détail Expression de gènes signal intercellulaires dans des cellules de myélome L'expression de 268 gènes codant des protéines signal intercellulaires a été évaluée sur des lignées cellulaires de myélome (HMCL) et des lignées cellulaires Iymphoblastoïdes (LCL) infectées avec le virus de Epstein-Barr (LCL) avec les membranes à ADN ATLAS selon la technique de ClonTech (Bâle, Suisse).

L'ARN poly (A+) a été extrait de chaque cellule et utilisé pour synthétiser de l'ADNc marqué par un élément radioactif (32p).

Les ADNc radiomarqués ont ensuite été hybridés à deux puces d'ADN identiques selon la technique préconisée par Clontech et la radioactivité a été analysée par Phospho Imager (Amersham, Saclay, France).

Analyse par cytométrie de flux L'expression de ErbB1 a été évaluée en incubant 5x105 cellules de myélome avec 0,5 g d'anticorps monoclonal de souris anti-récepteur de EGF (anti-EGF-R) humain (LA1) ou un anticorps monoclonal de souris ne reconnaissant pas les antigènes humains (Immunotech, Marseille, France) dans du tampon phosphate (PBS) contenant 30% de sérum AB à 40C pendant 30 minutes. Ensuite, les cellules ont été lavées et incubées avec un anticorps monoclonal de chèvre anti-souris conjugué avec du polyéthylèneglycol (PE) (Immunotech, Marseille, France) dans du PBS contenant 30% de sérum AB à 40C pendant 30 minutes.

Le HB-EGF membranaire a été détecté en marquant 5x105 cellules de myélome avec 0,5 gg d'anticorps de chèvre anti HB-EGF humain ou 1% de sérum de chèvre dans du PBS contenant 100 00 g/ml d'immunoglobulines (Ig) à 4 C pendant 30 minutes. Les cellules ont été lavées et incubées avec des immunoglobulines de porc anti-chèvre conjuguées au FITC, dans du PBS contenant 100 u, g/mi à 4 C pendant 30 minutes. Le pourcentage de cellules marquées et l'intensité moyenne de fluorescence (IMF) ont été déterminés par le cytomètre de flux de type FACScan (Becton Dickinson, USA), ou autres.

Tests de prolifération des cellules Les cellules ont été cultivées pendant 5 jours dans des microplaques de titrage à fond plat et à 96 puits à raison de 104 cellules/puits dans du milieu de culture sans sérum X-VIVO 20. Différentes concentrations de cytokines ou de facteurs de croissance ou d'inhibiteurs de cytokines/facteurs de croissance ont été ajoutées au début de la culture dans 6 puits de culture par groupe. A la fin de la culture, les cellules ont été marquées avec de la thymidine tritiée (Amersham, Orsay, France) pendant 12 heures, récoltées et comptées selon le mode opératoire décrit par De Vos et al (12).

Croissance à lonq terme de cellules de myélome Pour examiner les effets de EGF ou IL-6 sur la croissance à long terme des cellules de myélome, les cellules ont été lavées une fois avec du milieu de culture, incubées pendant 5 h à 37 C dans du milieu de culture X-VIVO 20 et lavées de nouveau deux fois.

Elles ont été ensuite cultivées à la concentration cellulaire de 105 cellules/ml avec HB-EGF (50ug/ml) ou IL-6 (500 pg/ml) avec ou sans 10 g/ml d'anticorps monoclonal anti-gp130 neutralisant, BR-3 (INSERM/Diaclone) ou avec ou sans 10 Ilg/ml d'anticorps monoclonal anti-ErbB1 neutralisant (LA-1).

Détection des cellules apoptotiques Les cellules de myélome ont été cultivées pendant 3 à 4 jours dans des microplaques à fond plat à raison de 3 x 105 cellules par puits dans du milieu de culture X-VIVO 20 avec différentes quantités d'IL-6/facteur de croissance HB-EGF ou d'inhibiteurs d'IL-6/facteur de croissance HB-EGF.

A la fin de la culture, les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS et mises en suspension dans une solution d'annexine-V-FITC (dilution 1/50 dans du tampon HEPES : 10mM HEPES/NaOH, pH 7,4, 140 mM NaCl et 5 mMCaCl2).

Elles ont été incubées pendant 20 minutes à température ambiante et lavées deux fois avec le tampon HEPES. La fluorescence a été analysée par un cytomètre à flux FACSan.

On a produit de l'ADNc avec 2 ; j. g tota) d'ARN en utilisant la transcriptase reverse Superscript Il (Life Technologies) et l'oligo d (T) 12-1R (Amersham Pharmacia Biotech) à titre d'amorce. Chaque portion de 25 l de PCR contenait 1 l de lADNc premier brin, 1 p. M de chaque amorce (sens et antisens), 0,2 mM de chaque dNTP, 1,5 mM de MgCis, 1 x tampon pour polymérase, 2 U de Taq polymérase (Life Technologies) et 1 Ci de aP-

dCTP (Amersham Pharmacia Biotech). On a utilisé les amorces suivantes : - Tyro3 5'-CAC TGA GCT GGC TGA CTA AGC CCC (sens) et - 5'-AAT GCA TGC ACT TAA GCA GCA GGG (antisens) ; - HB-EGF 5'-TGG TGC TGA AGC TCT TTC TGG (sens) et - 5'-GTG GGA ATT AGT CAT GCC CAA (antisens) ;

- FRZB 5'-AAG TCT GGC AGG AAC TCG AA (sens) et - 5'-ACT TCC TGG TGC TTG ATT GC (antisens) ; - p2-microgtobutine (p2-M) 5'-CCA GCA GAG AAT GGA AAG TC (sens) et 5'-GAT GCT GCT TAC ATG TCT CG (antisens).

Les tailles des produits de la PCR étaient pour Tyro3 344 pdb, HB-EGF

605 pdb, FRZB (Frizzled-related receptor B) 599 pdb, ss2-M 269 pdb. Le profil d'amplification était de 1 minute à 94 C, 45 secondes à 59 C (Tyro3) ou à 62 C (HB-EGF) ou à 60 C (FRZB ou ss2-M), 1 minute à 72 C, opérations suivies par une extension finale de 10 minutes à 72 C. Le nombre de cycles était de 26 pour Tyro3, de 32 pour HB-EGF et de 25 pour FRZB ou 82-M On a effectué une électrophorèse des produits réactionnels sur du gel de polyacrylamide à 4%, on les a séchés et on les a exposés à des films rayon X.

Exemple 1 : action critique de HB-EGF autocrine sur la survie et la prolifération des cellules de myélome HB-EGF est un gène dont l'expression peut être liée à la pathobiologie du myélome multiple (MM). En utilisant les puces ADN, on a trouvé que le gène HB-EGF était surexprimé de façon marquée dans 3 lignées de myélome (HMCL : XG-1, XG-7 et XG-14) et dans aucune des 4 LCL. On a recherché l'expression du gène HB-EGF par RT-PCR dans les lignées cellulaires et dans des cellules primaires. On a détecté l'ARNm de HBEGF dans 3/6 HMCLs, mais dans aucune des 4 LCL, ce qui confirme les résultats obtenus avec les puces ADN. De façon intéressante, tandis que l'ARNm de HB-EGF n'a pas pu être amplifié par RT-PCR dans des

cellules plasmatiques malignes purifiées à partir de 4 des 4 cas de PCL, on a trouvé une forte expression dans des cellules médullaires purifiées à partir de 2 patients atteints de MM. Dans des cellules plasmatiques normales, on a noté une expression faible dans 1 des 4 échantillons. Le gène ErbB1, à la différence du gène ErbB4, a été hautement exprimé dans les cellules de MM, ainsi que dans les LCL, ce qui suggère que HBEGF peut être un facteur de croissance autocrine des cellules tumorales, en se fixant à son récepteur Erb-B1. On a donc recherché si le blocage de l'activité de HB-EGF pouvait moduler la prolifération de la lignée des cellules de MM XG-1 qui a hautement exprimée le gène HB-EGF. Comme souligné sur la Figure 1 A, l'addition d'un anticorps de neutralisation à HBEGF a bloqué la prolifération de XG-1 d'une façon dose-dépendante. Avec 50 . g/rnt d'anticorps anti-HB-EGF, l'inhibition est montée jusqu'à 80%. Cet effet inhibiteur a été inversé par addition d'une quantité en excès de HB-EGF recombinant, ce qui démontre la spécificité des effets de blocage de l'anticorps (Figure 1 B). Au contraire, l'anticorps anti-HBEGF n'a pas eu d'effet sur la prolifération de EBV-1 LCL (Figure 1C).

Ces observations montrent clairement que HB-EGF est un nouveau facteur de croissance impliqué dans la survie de IL-6 et la prolifération des cellules de myélome XG-1.

Le HB-EGF membranaire a aussi été mis en évidence sur les cellules de myélome en incubant ces cellules incubées avec des anticorps de chèvre anti-HB-EGF ou du sérum de chèvre témoin puis avec un anticorps de porc anti-tg de chèvre conjugué à FITC. La fluorescence a été analysée avec un cytofluoromètre FACScan. Les résultats sont ceux d'une expérience représentative de deux expériences.

Les résultats obtenus sont reportés sur la figure 2 sur laquelle on a porté en abscisses l'intensité de fluorescence et en ordonnées le nombre de cellules comptées.

Ces résultats montrent que le HB-EGF membranaire est présent à la surface des cellules. Le marquage était plus intense avec les cellules XG-

1 et XG-14, qui ont présenté une plus forte expression du gène de HBEGF déterminée par la technique des puces ADN cytokine/récepteur ou par RT-PCR, ainsi que le montrent les données du tableau 1 ci-après : TABLEAU 1 : Expression de gènes déterminée par des membranes à
ADN ATLAS (Les valeurs en dessous de 20 sont considérées comme non significatives)

<tb>
<tb> XG-1XG-14XG-6XG-13
<tb> HB-EGF <SEP> 2890 <SEP> 1020 <SEP> 263 <SEP> 166
<tb> EGF <SEP> 6 <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 54
<tb> ErbBl <SEP> 5549 <SEP> 3635 <SEP> 559 <SEP> 783
<tb> ErbB2 <SEP> 71 <SEP> 75 <SEP> 60 <SEP> 42
<tb> ErbB3 <SEP> 35 <SEP> 52 <SEP> 124 <SEP> 101
<tb> ErbB4 <SEP> 17 <SEP> 9 <SEP> 180 <SEP> 25
<tb>
Exemple 2 : Inhibition par la toxine diphtérique mutée de la prolifération des cellules de myélome induite par IL-6 Des cellules de myélome (104 cellules/puits) ont été cultivées pendant 5 jours dans du milieu de culture sans sérum X-VIVO 20 avec 500 pg/ml de IL-6 et une concentration progressive de toxine diphtérique mutée (mDT). Dans un groupe de culture, 1 urg/ml de HB-EGF recombinant a été ajouté au début de la culture en même temps que 100 u. g/m ! de mDT et 500 pg/ml de IL-6. Les résultats sont les moyennes + ET de l'incorporation de thymidine tritiée déterminée sur des puits de culture en sextuple. Les résultats qui sont reportés sur la figure 3 sont ceux d'une expérience représentative de 3 à 4 expériences, selon les lignées cellulaires.

* indique une différence statistique de la valeur moyenne par rapport à celle du groupe de cellules cultivées sans mDT ou HB-EGF (P < 0,05, testé avec un test T de Student). ** indique une différence statistique de la valeur moyenne par rapport à celle du groupe de cellules cultivées avec

100 u. g/ml de mDT.

La figure 3 montre que ce HB-EGF autocrine est critique pour promouvoir la croissance de 2/4 HMCLs dépendantes de IL-6, les HMCL XG-1 et XG-14. En réalité, la toxine diphtérique mutée (mDT), qui est un inhibiteur spécifique de HB-EGF a fait décroître la prolifération des HMCL induite par IL-6. L'effet inhibiteur de mDT était compensé par l'addition d'un excès de HB-EGF recombinant, ce qui indique qu'il n'était pas dû à une toxicité non spécifique de la DT mutée (figure 3).

Exemple 3 : Un antagoniste de HB-EGF n'inhibe pas la prolifération de cellules de myélome cultivées avec de hautes concentrations de IL-6 Des cellules de myélome (104 cellules/puits) ont été cultivées pendant 5 jours dans du milieu de culture sans sérum X-VIVO 20 (A) avec 500 pg/ml ou 5 ng/ml de IL-6 et une concentration progressive de toxine diphtérique mutée (mDT), (B) avec des concentrations progressives de IL-6. Les résultats reportés sur la figure 4 sont des moyennes + ET de l'incorporation de thymidine tritiée déterminée sur des puits de culture en sextuple. Les résultats sont ceux d'une expérience représentative de deux expériences.

L'inhibition par mDT ou par des anticorps anti-HB-EGF de la prolifération de cellules de myélome dépendante de IL-6 a été observée de manière reproductible quand des cellules de myélome ont été stimulées avec une concentration de IL-6 de 100-500 pg/mi (figure 4a). Avec une plus grande concentration de IL-6 (5 ng/ml), aucune inhibition statistiquement significative n'a pu être observée (figure 4a). Il est à noter qu'une grande prolifération des 4 HMCL était déjà atteinte avec 100-500 pg/ml de IL-6 et n'a pas pu être augmentée par addition de 10-30 fois plus de IL-6 (figure 4b).

Exemple 4 : Induction de l'apoptose de cellules de myélome par un antagoniste de HB-EGF Des cellules de myélome ont été cultivées pendant 3 jours avec 500 pg/ml de IL-6 avec ou sans 100 u. g/mt de toxine diphtérique mutée. Dans un groupe, 1 ng/ml de HB-EGF a été ajouté au début de la culture en même

temps que 500 pg/ml de IL-6 et 100 I1g/ml de toxine diphtérique mutée. L'apoptose a été évaluée par marquage à l'annexine V et analyse par cytofluorimétrie. Les nombres dans les panneaux indiquent le pourcentage de cellules positives pour l'annexine V en apoptose. Les résultats reportés sur la Figure 5 sont ceux de l'expérience représentative de deux expériences.

Au moyen d'un marquage avec l'annexine V, mDT s'est révélée induire une apoptose dans les 2 HMCLs XG-1 et XG-14 (figure 5), avec une majorité de cellules de myélome (87 % et 62 %) en apoptose avec 100 u. g/ml de mDT. L'apoptose induite par mDT était compensée par addition d'une grande quantité de HB-EGF recombinant capable de contrebalancer la mDT (figure 5).

Exemple 5 : Expression de ErbB1 sur des cellules de myélome Des cellules de myélome ont été marquées avec un anticorps monoclonal dirigé contre ErbB1 ou un anticorps monoclonal murin témoin ne reconnaissant aucun antigène humain. Puis, les cellules ont été marquées avec un anticorps de chèvre anti-Ig murine conjugué à PE. La fluorescence a été analysée avec un cytofluorimètre FACSscan. Les résultats reportés sur la figure 6 sont ceux d'une expérience représentative de trois expériences. Les cellules de myélome XG-1 et XG-14 exprimaient la plus grande densité de ErbB1.

Ces résultats sont en accord avec ceux du Tableau 1, montrant que les cellules de myélome expriment largement le gène de ErbB1 et plus faiblement et de manière non reproductible les autres récepteurs de la famille EGF-R.

Exemple 6 : Inhibition par les anticorps monoclonaux anti-ErbB1 de la prolifération des cellules de myélome induite par IL-6 Des cellules de myélome (104 cellules/puits) ont été cultivées pendant 5 jours dans du milieu de culture sans sérum X-VIVO 20 avec 500 pg/ml de IL-6 et une concentration progressive d'un anticorps monoclonal anti-

ErbB1 (0-10 t-tg/ml). Dans un groupe de culture, 1 g/mt de HB-EGF recombinant a été ajouté au début de la culture en même temps que 10 jlglml d'anticorps monoclonal anti-ErbB1 et 500 pg/ml de IL-6. Les résultats sont des moyennes 1 ET de l'incorporation de thymidine tritiée déterminée sur des puits de culture en sextuple. Les résultats représentés sur la figure 7 sont ceux d'une expérience représentative de deux à trois expériences, selon les lignées cellulaires. * indique une différence statistique de la moyenne par rapport à celle du groupe de cellules cultivées sans mAb anti-ErbB1 ou HB-EGF (p < 0,05, testé avec un test T de Student). ** indique une différence statistique de la moyenne par rapport à celle du groupe de cellules cultivées avec 10 ug/ml de mAb antiErbB1.

Les résultats de la figure 7 montrent que la prolifération des cellules XG-1 et XG-14 était fortement inhibée par l'anticorps anti-ErbB1 à une concentration (10 Ilg/ml). L'effet inhibiteur de l'anticorps monoclonal antiErbB1 était compensé par addition d'une grande quantité de HB-EGF recombinant. Il est à noter que les lignées cellulaires de myélome n'expriment pas le gène de EGF (tableau 1). La forte inhibition de la prolifération des cellules XG-1 et XG-14 par l'anticorps monoclonal antiErbB1 est en accord avec leur haute expression du gène de HB-EGF, une inhibition marquée par des antagonistes de HB-EGF et une expression de ErbB1 détectable par FACS. Globalement, ces données montrent que la survie et la prolifération, induites par IL-6, des lignées cellulaires de myélome XG-1 et XG-14 dépend d'une boucle autocrine HB-EGF/ErbB1.

Exemple 7 : Inhibition par les anticorps monoclonaux anti-IL-6 ou anti ErbB1 de la prolifération des cellules de myélome induite par IL-6 Des cellules de myélome XG-1 ont été cultivées en présence de 100 pg/ml d'interleukine-6 (IL-6) dans du milieu X-VIV020 pendant 96 heures.

Au jour 0, différentes concentrations d'un anticorps monoclonal anti-IL-6 (B-E8) et/ou d'un anticorps monoclonal anti-ErbBI (LA-1) ont été ajoutées.

Les résultats de la figure 8 montrent que l'anticorps monoclonal antiErbB1 potentialise l'effet inhibiteur de l'anticorps monoclonal anti-IL-6 sur la prolifération dépendante d'IL-6 des cellules.

Exemple 8 : Expression de la tétraspanine CD9 par les lignées de myélome Des cellules de myélome ont été cultivées pendant 2 jours dans du milieu de culture X-VIVO 20 avec 0,2ng/mL ou 2ng/mL d'IL-6, et l'expression de CD9 a été évaluée par marquage avec un anticorps monoclonal anti-CD9 conjugué à la phycoérythrine. Le pourcentage de cellules marquées et l'intensité moyenne de fluorescence (IMF) ont été déterminés au moyen d'un cytofluorimètre FASCscan. Les résultats sont ceux d'une expérience parmi deux expériences représentatives.

La IMF obtenue avec l'anticorps témoin d'isotype correspondant a été fixée entre 3 et 5. Les résultats du tableau 2 (ci-après) montrent que les lignées XG-1 et XG-14 expriment fortement la tetraspanine CD9. Cette expression n'est pas régulée par l'IL-6. Les lignées XG-1 et XG-13 l'expriment très faiblement. La tetraspanine CD9 étant un récepteur de HB-EGF, capable d'augmenter très fortement son activité biologique, ces données renforcent l'importance d'une boucle autocrine CD9/HB- EGFlErb-B1 dans le contrôle de la prolifération des lignées XG-1 et XG-14 médiée par l'IL-6.

TABLEAU 2 : Expression de CD9 sur les cellules myélomateuses

<tb>
<tb> XG-1 <SEP> XG-14 <SEP> XG-6 <SEP> XG-13
<tb> IL-6 <SEP> Cellules <SEP> IMF <SEP> Cellules <SEP> IMF <SEP> Cellules <SEP> IMF <SEP> Cellules <SEP> IMF <SEP> 1
<tb> 1 <SEP> viables <SEP> viables <SEP> viables <SEP> viables
<tb> marqués <SEP> marqués <SEP> (%) <SEP> marqués <SEP> (% <SEP> marqués <SEP> (%
<tb> (%)))
<tb> 2 <SEP> ng/ml <SEP> 100 <SEP> 418 <SEP> 100 <SEP> 108 <SEP> 35 <SEP> 17 <SEP> 37 <SEP> 18
<tb> 0. <SEP> 2 <SEP> ng/ml <SEP> 100 <SEP> 393 <SEP> 100 <SEP> 91 <SEP> 30 <SEP> 19 <SEP> 39 <SEP> 17
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Exemple 9 : Inhibition de la prolifération des cellules de myélome par un anticorps monoclonal anti-CD9 Pour examiner si CD9 est critique pour promouvoir la survie des cellules de myélome à médiation par IL-6, on a utilisé un mAb dirigé contre CD9.

Des cellules de myélome (104 cellules/puits) ont été cultivées pendant 5 jours dans du milieu de culture sans sérum X-VIVO 20 avec 500 pg/ml de IL-6 et 50 u.ig/ml du mAb anti-CD9 SYB-1. Dans un groupe de culture, 1 jjg/ml de HB-EGF recombinant a été ajouté au début de la culture en même temps que 10 u. g/m) de mAb anti-CD9 SYB-1 et 500 pg/ml de IL-6.

Les résultats sont des moyennes + ET de l'incorporation de thymidine tritiée déterminée sur des puits de culture en sextuple. Les résultats sont ceux d'une expérience représentative de deux expériences. * indique une différence statistique de la moyenne par rapport à celle du groupe de cellules cultivées sans mAb anti-CD9 ou HB-EGF (P < 0,05, testé avec un test T de Student).

Comme le montre la figure 9, l'anticorps monoclonal anti-CD9 SYB-1 a pu bloquer la prolifération des cellules de myélome XG-1. Cette inhibition a été compensée par l'addition d'une grande quantité de HB-EGF recombinant qui peut entrer en compétition avec l'anticorps monoclonal anti-CD9 pour la liaison à CD9.

Exemple 10 : Effets synergiques de IL-6 et HB-EGF pour déclencher la survie et la prolifération des cellules de myélome Des cellules de myélome XG-1 ou XG-14 ont été cultivées à raison de 105 cellules/ml dans du milieu de culture sans sérum X-VIVO 20 avec lOg/m) d'un anticorps monoclonal murin ne reconnaissant aucun antigène humain et sans cytokine, ou avec 500 pg/ml de IL-6 ou 100 ng/ml de HB-EGF recombinant. Dans certains groupes de culture, 10 u. g/ml d'anticorps monoclonal anti-transducteur de IL-6 gp130 B-R3 neutralisant ou d'anticorps monoclonal anti-ErbB1 LA-1 neutralisant ont été ajoutés. Tous les 3 à 4 jours, la viabilité des cellules et le nombre de cellules ont été testés, et les cellules ont été cultivées de nouveau à

raison de 105 cellules/ml avec du milieu de culture frais contenant pour chaque groupe les concentrations initiales de cytokine et/ou d'inhibiteur de cytokine. Les résultats sont les nombres de cellules cumulés produits dans la culture d'une expérience représentative de trois expériences.

Comme le montre la figure 10, en l'absence de IL-6, les deux lignées cellulaires de myélome XG-1 et XG-14 ne se sont pas développées et sont mortes progressivement en 4 à 5 jours. L'addition de IL-6 a induit une croissance vigoureuse. La croissance induite par IL-6 a été totalement abolie par le mAb anti-gp 130 neutralisant. Elle a été également totalement abolie par l'anticorps monoclonal anti-ErbB1 neutralisant en accord avec les données ci-dessus. HB-EGF recombinant a favorisé la survie des cellules de myélome XG-1 et XG-14 et une croissance qui était plus faible que celle induite par IL-6. La faible croissance des cellules de myélome à médiation par HB-EGF recombinant a été inhibée par l'anticorps monoclonal anti-ErbB1. Elle a également été totalement inhibée par l'anticorps monoclonal anti-gp130 neutralisant. Cette expression autocrine du gène de IL-6 a été détectée aussi avec les puces ADN ATLAS dans des cellules XG-1 et dans les autres lignées cellulaires de myélome (voir tableau 1) et confirmé par RT-PCR (Figure 11).

Prises en combinaison, ces données indiquent que la faible croissance des cellules de myélome avec HB-EGF-recombinant est liée à cette faible production autocrine de IL-6 par les cellules de myélome. On en déduit qu'il existe une coopération des voies de transduction induites par le transducteur de IL-6 gp130 et ErbB1 pour déclencher une survie et une prolifération optimales des cellules de myélome.

Références
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Measurement of whole body interleukin-6 (IL-6) production : prediction of the efficacy of anti-IL-6 treatments. Blood 1995,86 : 3123-3131)

Claims

Revendications 1. Utilisation d'au moins un inhibiteur du facteur de croissance épidermique (EGF) liant l'héparine (HB) ou d'au moins un inhibiteur des récepteurs de HB-EGF, ou récepteurs ErbB, ou d'au moins un inhibiteur des voies de transduction associées pour la préparation de médicaments utiles pour induire l'apoptose et/ou inhiber la prolifération des cellules tumorales plasmocytaires IL-6 dépendantes.
2. Utilisation d'au moins un inhibiteur du facteur de croissance épidermique liant l'héparine HB-EGF ou d'au moins un inhibiteur des récepteurs de HB-EGF, ou récepteurs ErbB, ou d'au moins un inhibiteur des voies de transduction associées en combinaison avec au moins un inhibiteur de IL-6 ou au moins un inhibiteur des récepteurs de IL-6, ou au moins un inhibiteur des voies de transduction associées, pour la préparation de médicaments utiles pour induire l'apoptose et/ou inhiber la prolifération des cellules tumorales plasmocytaires

IL-6 dépendantes.
3. Utilisation selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que l'inhibiteur du facteur de croissance épidermique liant l'héparine HB-EGF est choisi parmi les héparines, en particulier l'héparine de bas poids moléculaire, la toxine diphtérique, les anticorps anti-HB-EGF.
4. Utilisation selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que les inhibiteurs du récepteur du facteur de croissance épidermique liant l'héparine HB-EGF sont choisis parmi les anticorps monoclonaux anti-ErbB ou autre récepteurs de HB-

EGF ou les inhibiteurs des voies de transduction associées.
5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que l'inhibiteur de IL-6 est choisi parmi les

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corticoïdes, les inhibiteurs de la production d'IL-6, les anticorps monoclonaux anti IL-6, l'interleukine-6 mutée antagoniste.
6. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que l'inhibiteur du récepteur de IL-6 est dirigé contre la chaîne gp80 ou gp130 ou sont des inhibiteurs des voies de transduction associées.
7. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend, à titre de principe actif, au moins un inhibiteur du facteur de croissance épidermique liant l'héparine HB-EGF ou au moins un inhibiteur des récepteurs ErbB ou au moins un inhibiteur des voies de transduction associées en combinaison avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
8. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un inhibiteur du facteur de croissance épidermique liant l'héparine HB-EGF ou au moins un inhibiteur de ses récepteurs ou au moins un inhibiteur des voies de transduction associées en association avec au moins un inhibiteur de IL-6 ou au moins un inhibiteur du récepteur de IL-6 ou au moins un inhibiteur de ses récepteurs ou au moins un inhibiteur des voies de transduction associées, lesdits inhibiteurs étant conditionnés ensemble ou séparément en combinaison avec un véhicule pharmaceutique acceptable.