FR2786784A1 - New DNA encoding heat-stable xylanase, useful e.g. in treating animal feed and in bread making, is derived from thermophilic fungus, particularly of the genus Thermoascus - Google Patents

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    • C12N9/248Xylanases
    • C12N9/2482Endo-1,4-beta-xylanase (3.2.1.8)

Abstract

A DNA fragment (I) isolated from a thermophilic fungus of the genus Thermoascus (or from the same family) and encoding a heat-stable xylanase (II), is new. A DNA fragment (I) isolated from a thermophilic fungus of the genus Thermoascus (or from the same family) and encoding a heat-stable xylanase (II), is new and comprises: (i) a 2966 bp sequence (1), reproduced, or fragments of it containing at least 300, especially 700, nucleotides (nt); (ii) the complement of (i); (iii) a sequence with at least 60, especially 75%, identity with (i) or (ii); or (iv) a sequence that encodes a xylanase with amino acid sequence identity at least 70, especially 85,% compared with an enzyme encoded by (i)-(iii). Independent claims are also included for the following: (1) a DNA construct comprising (I) plus elements that provide expression in a host cell; (2) (II) encoded by (I) or the construct of (a); (3) prokaryotic or eukaryotic host cells containing (I) or the construct of (a); (4) recombinant production of (II) by culturing cells of (c); and (5) (II) produced by method (d).

Description

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Figure img00010001

La présente invention a pour objet un fragment d'ADN de 771C!rmoGsclIs aurantiacus codant pour la synthèse d'une xylanase thermostable d'environ 33 kDa ou tout fragment d'ADN équivalent, une construction d'ADN comprenant ledit fragment et permettant son expression dans une cellule hôte. The present invention relates to a DNA fragment 771C! RmoGsclIs aurantiacus coding for the synthesis of a thermostable xylanase from about 33 kDa or any equivalent DNA fragment, a DNA construct comprising said fragment and allowing its expression in a host cell. une cellule transformée exprimant ledit fragment. a transformed cell expressing said fragment. La présente invention a également pour objet toute xylanase produite par une cellule ainsi transformée et l'utilisation de ladite xylanase pour différentes applications industrielles. The present invention also relates to any xylanase produced by a cell thus transformed and the use of said xylanase for various industrial applications.

Figure img00010002

Il est connu depuis 1977 que le champignon thermophile Thermoascus allra11liaCIIS produit une xylanase thermostable (Trans. Br. Mycol. Soc., 1977, 69(2), pp. It is known since 1977 that the thermophilic fungus Thermoascus allra11liaCIIS produces a thermostable xylanase (Trans. Br. Mycol. Soc., 1977, 69 (2), pp.

316-317). 316-317).

Les études menées sur différentes souches de Thermoascus aurantiacus ont permis en principe de sélectionner les souches produisant les concentrations les plus élevées possibles de xylanase dans le milieu de culture et de définir en principe les milieux de culture convenant le mieux pour cette production, Par exemple, le brevet US 4,966,850 décrit un procédé de production de xylanase thermostable par culture d'une Studies on various strains of Thermoascus allowed aurantiacus in principle to select the strains producing the highest possible levels of xylanase in the culture medium and set in principle the culture media best suited for this production, for example, U.S. patent 4,966,850 discloses a thermostable xylanase production process by culturing a

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souche sélectionnée de Thermoascus arrrarniacrrs sur milieu contenant au moins un substrat cellulosique ou hémicellulosique. selected strain of Thermoascus arrrarniacrrs on medium containing at least one cellulosic or hemicellulosic substrate.

Cependant, le champignon Thermoascus n'est pas un très bon producteur de xylanase au plan économique. However, Thermoascus fungus is not a very good producer of xylanase economically. De plus, industriellement, il est parfois intéressant de pouvoir obtenir cette xylanase sous forme d'une préparation enzymatique pure. Moreover, industrially, it is sometimes interesting to get this xylanase as a pure enzyme preparation. Il est donc d'un grand intérêt de transformer un organisme connu pour ses capacités à produire rapidement des protéines enzymatiques à haute concentration dans le milieu de culture en y introduisant le gène codant la protéine qu'on veut obtenir en grande quantité. It is therefore of great interest to transform an organization known for its ability to quickly produce enzymatic proteins in high concentration in the culture medium by introducing the gene encoding the protein is to be obtained in large quantities.

Pour transformer ce micro-organisme excréteur, dit "souche productrice" ou "souche hôte", avec un gène d'intérêt, il est indispensable de disposer de la séquence nucléique dudit gène. To make this excretory microorganism, said "producing strain" or "host strain", with a gene of interest, it is necessary to have the nucleic acid sequence of said gene. Cependant, jusqu'à présent ce résultat n'avait pas pu être obtenu. However, until now this result could not be obtained.

Figure img00010004

En 1989, la xylanase thermostable d'une souche de Thermoascus aurantiacus a été isolée et purifiée (Khandke et al., 1989, Archives of Biochemistry and Biophysics, vol. 274, pp. 491-500) et une séquence des acides aminés correspondant à cette protéine a été publiée (Srinivasa et al., Protein Séquences and Data Analyses, 1991, vol. 4, pp. 15- 20). In 1989, the thermostable xylanase from a strain of Thermoascus aurantiacus was isolated and purified (Khandke et al., 1989, Archives of Biochemistry and Biophysics, vol. 274, pp. 491-500) and an amino acid sequence corresponding to this protein has been published (Srinivasa et al., protein Sequences and Data Analysis, 1991, vol. 4, pp. 15- 20). Cette séquence semble au moins partiellement inexacte selon les résultats objets de This sequence seems at least partially inaccurate results depending on the objects

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la présente invention et qui sont décrits ci-après. the present invention and which are described below. De toute manière, aucune conclusion ne pouvait en être tirée quant à la séquence nucléique compte tenu des problèmes de dégénérescence du code génétique, et par ailleurs jusqu'à maintenant il n'avait pas été possible de réaliser une banque d'ADN de Thermoascus. In any event, no conclusions could be drawn as to the given nucleic sequence of degeneracy of the genetic code problems, and also until now it was not possible to make a DNA library Thermoascus. Et de fait, jusqu'à maintenant, aucun gène d'intérêt de Thermoascus n'a été clone. In fact, until now, no gene of interest Thermoascus has been cloned.

Plusieurs gènes de xylanases thermostables issus de différents micro-organismes ont été séquences et leurs séquences publiées dans différents documents. Several genes thermostable xylanase from different micro-organisms have been sequenced and their sequences published in different documents. Parmi ces documents, les deux documents WO 96/23062 et WO 97/27292 méritent une attention particulière car ils revendiquent toutes les séquences d'ADN homologues à celles publiées dans ces documents et codant pour une xylanase, lesdites séquences pouvant notamment être isolées à partir d'une banque d'ADNc préparée à partir de Thermoascus. Among these documents, both 96/23062 and WO WO 97/27292 deserve special attention because they claim all homologous DNA sequences to those issued in these documents and encoding a xylanase, said sequences can be isolated from such from a cDNA library prepared from Thermoascus.

Ces documents démontrent s'il en était besoin l'intérêt de disposer du gène codant pour la xylanase thermostable XynA de Thermoascus. These documents show if need be the value of having the gene coding for thermostable xylanase XynA of Thermoascus. Ces deux documents font cependant l'impasse sur deux problèmes essentiels : . Both documents, however, fail to address two key issues:. la production d'une banque génomique d'ADN de Thermoascus était un problème non résolu, a fortiori celle d'une banque d'ADN complémentaire (ADNc), . the production of a DNA genomic library Thermoascus was an unsolved problem, let alone that of a complementary DNA (cDNA). les taux d'identité ou d'homologie très variables entre les différentes xylanases, y compris les xylanases d'une même famille. the level of identity or homology vary between different xylanases, including xylanases of the same family. On peut estimer qu'entre les xylanases de la famille 10 provenant de genres différents, les taux d'homologie calculés sur l'ensemble de la protéine mature varient entre 11 et 62 % sur la base des séquences connues. One can estimate that between xylanases from family 10 from different genera, homology rate calculated on the whole of the mature protein range between 11 and 62% based on the known sequences.

De fait, le document WO 96/23062 décrit une xylanase thermostable de Indeed, WO 96/23062 describes the document a thermostable xylanase

Figure img00020001

Thermomyces = Humicola lamiginostts appartenant à la famille 11 des glycosyl- hydrolases selon la classification de Henrissat (Henrissat B., Biochem. J., 1991, vol 280, pp.309-316) (voir page 13, lignes 4 à 9 document WO 96/23062) alors que la xylanase XynA de Thermoascus appartient à la famille 10 des glycosyl-hydrolases. Thermomyces = lamiginostts Humicola belonging to the family 11 glycosyl hydrolases according to the classification of Henrissat (Henrissat B., Biochem. J., 1991, vol 280, pp.309-316) (see page 13, lines 4-9 WO 96/23062) while XynA xylanase Thermoascus belongs to the family 10 glycosyl hydrolases. Le document WO 97/27292 décrit une xylanase de Myceliophtora thermophila qui appartient à la famille 10 des glycosyl-hydrolases (page 4, lignes 16 à 24) comme la xylanase XynA de Thermoascus, mais l'identité ou l'homologie entre les deux protéines matures est égale à 39 % selon les calculs effectués avec le logiciel GAP défini ci-après. WO 97/27292 describes the document xylanase Myceliophthora thermophila which belongs to the family 10 glycosyl hydrolases (page 4, lines 16 to 24) as the XynA xylanase Thermoascus, but the identity or homology between the two proteins mature is equal to 39% as calculated with the GAP program defined below. Aucune identité significative n'a pu être calculée à l'aide de ce logiciel entre la protéine mature XynA de No significant identity could not be calculated using the software between XynA mature protein

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Thermoascus et la xylanase de Thermomyces dont la séquence d'acides aminés est donnée dans le document WO 96/23062. Thermoascus and Thermomyces xylanase whose amino acid sequence is given in WO 96/23062.

De manière générale, jusqu'à présent, la génétique moléculaire de Thermoascus In general, so far, molecular genetics of Thermoascus

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Gllra1lli"CIiS était mal connue. Malgré l'intérêt suscité par les applications industrielles des enzymes de ce micro-organisme et malgré le fait qu'il ne semble pas un bon producteur industriel d'enzymes, aucun gène de ce micro-organisme codant pour des protéines n'avait été clone. Ceci s'explique par les difficultés spécifiques pour travailler au plan de la génétique moléculaire de ce micro-organisme et notamment les difficultés Gllra1lli "CIIS was unknown. Despite the interest in industrial applications of enzymes in the organism and although he does not seem a good industrial enzyme producer, no gene of this microorganism encoding protein had been cloned. this is explained by the specific difficulties to work at the molecular genetic map of this organism and in particular the difficulties
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pour obtenir une banque d'ADN génomique de Tfiermoascus anramiacus. to obtain a genomic DNA library of Tfiermoascus anramiacus.

La présente invention permet de résoudre ces difficultés et notamment de construire des souches transformées hyperproductrices capables de produire industriellement la xylanase thermostable XynA de Thermoascus. The present invention solves these problems and in particular to build hyperproductive transformed strains capable of producing industrially thermostable xylanase XynA of Thermoascus.

La présente invention a pour objet un fragment d'ADN de séquence nucléique choisie parmi les séquences suivantes : a) la séquence SEQ ID N 1 ou la séquence de l'un de ses fragments d'au moins The present invention relates to a DNA fragment of the nucleic sequence selected from the following sequences: a) sequence SEQ ID No. 1 or the sequence of a fragment thereof of at least
300 nucléotides, de préférence d'au moins 500 nucléotides, et encore de préférence d'au moins 700 nucléotides ; 300 nucleotides, preferably at least 500 nucleotides, and more preferably at least 700 nucleotides; b) la séquence complémentaire à l'une des séquences telles que définies en a) ; b) the complementary sequence to one of the sequences as defined in a); c) une séquence présentant une identité d'au moins 60 %, de préférence au moins c) a sequence having an identity of at least 60%, preferably at least
70 % et encore de préférence au moins 75 % avec l'une des séquences telles que définies en a) ou b) ; 70% and more preferably at least 75% using one of the sequences as defined in a) or b); d) une séquence codant pour un polypeptide ayant une activité xylanase et dont la séquence d'acides aminés présente une identité d'au moins 70 %, de préférence au moins 80 % et encore de préférence au moins 85 % avec la séquence d'acides aminés d'un polypeptide codé par l'une des séquences telles que définies en a) ou b) ou c). d) a sequence encoding a polypeptide having xylanase activity and whose amino acid sequence has an identity of at least 70%, preferably at least 80% and more preferably at least 85% with the amino acid sequence amino of a polypeptide encoded by one of the sequences as defined in a) or b) or c).

Le fragment d'ADN selon l'invention est de manière préférée caractérisé en ce qu'il est susceptible d'être isolé à partir d'un champignon thermophile appartenant au genre Thermoascus ou appartenant à la même famille, et en ce qu'il code pour un polypeptide thermostable ayant une activité enzymatique xylanase. The DNA fragment according to the invention is preferably characterized in that it is capable of being isolated from a thermophilic fungus belonging to the genus Thermoascus or belonging to the same family, and in that it codes for a thermostable polypeptide having a xylanase enzymatic activity.

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De préférence, le fragment d'ADN selon l'invention sera issu du genre Thermoascus. Preferably, the DNA fragment of the invention is derived from the genus Thermoascus. De préférence également, ledit fragment d'ADN codera pour une xylanase appartenant à la famille 10 des glycosyl-hydrolascs selon la classification de Henrissat et Also preferably, said DNA fragment will encode a xylanase belonging to the family 10 of glycosyl hydrolascs according to classification and Henrissat

Figure img00040001

encore de préférence cette xylanase sera thermostable, c'est-a1-dirc qu'elle résistera au moins deux heures à 70 C en perdant moins de 10 % de son activité. more preferably this xylanase is thermostable, that is a1-DIRC it will withstand at least two hours at 70 C by losing less than 10% of its activity.

Les définitions des termes employés sont les suivantes : The definitions of the terms used are:
Thermoascus : champignon filamenteux de la famille des Trichocomaceae selon le Dictionary of the Fungi, 8ème édition, préparé par l'International Mycological Institute, CAB International, 1995, référence ISBN 0-85198-885-7. Thermoascus: filamentous fungus of the family Trichocomaceae according to the Dictionary of the Fungi, 8th edition, prepared by the International Mycological Institute, CAB International, 1995. ISBN 0-85198-885-7 reference.

L'expression tout champignon filamenteux de la même famille signifie tout champignon appartenant à la famille des Trichocomaceae ou tout champignon anamorphe correspondant à la forme asexuée imparfaite de Thermoascus à savoir tout champignon comme ceux appartenant aux genres Paecilomyces ou Polypaecilum ou Colpomella. The phrase any filamentous fungus of the family means any fungus belonging to the family of Trichocomaceae or anamorphic fungus corresponding to the imperfect form of asexual Thermoascus is any fungus as those belonging to the genera Paecilomyces or Polypaecilum or Colpomella.

Fragment d'ADN ou séquence d'ADN ou gène codant pour une xylanase : on entend par ces expressions la région de la séquence d'ADN qui correspond à une région qui est transcrite sous forme d'un polypeptide ayant une activité xylanase, DNA fragment or DNA sequence or gene encoding a xylanase: is meant by these expressions the region of the DNA sequence which corresponds to a region which is transcribed in the form of a polypeptide having xylanase activity,
Dans la séquence d'ADN de séquence SEQ ID N 1, la séquence codante est la région située entre le codon ATG de départ en position 859 pour la base A de l'ATG, et le codon stop en position 2773, pour la base A du codon stop TGA. In the DNA sequence of sequence SEQ ID No. 1, the coding sequence is the region between the ATG start codon at position 859 to the base A of the ATG and the stop codon at position 2773 to the base A of the stop codon TGA.

Le polypeptide traduit comprend, en addition à la séquence mature ayant une activité xylanase, une séquence signal N-terminal d'environ une vingtaine d'acides aminés, probablement 26 acides aminés, cette séquence signal ayant en principe pour rôle de permettre la sécrétion du polypeptide. The translated polypeptide comprises, in addition to the mature sequence having a xylanase activity, a N-terminal signal sequence of about twenty amino acids, probably 26 amino acids, this signal sequence having in principle role is to allow the secretion of polypeptide.

Dans la présente description, on entend désigner par xylanase dans l'expression fragment d'ADN codant pour une xylanase ou toute expression équivalente, d'une part l'ensemble du polypeptide qui est transcrit et d'autre part la partie mature ayant une activité xylanase. In the present specification, is meant by xylanase in the expression DNA fragment encoding a xylanase or an equivalent expression, first the entire polypeptide that is transcribed and secondly the mature part having activity xylanase.

La séquence SEQ ID N 1 comprend en plus entre la base 1 et la base 858, une partie du promoteur de Thermoascus ; The sequence SEQ ID No. 1 comprises in addition between the base 1 and the base 858, a portion of Thermoascus promoter; entre la base 2774 et la base 2966, une partie between base 2774 and base 2966, a portion

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du terminateur de Thermoascus. Thermoascus the terminator. Ce promoteur ou un fragment dérégulé fonctionnel de ce promoteur est également partie intégrante de l'invention. This promoter or a functional fragment deregulated promoter is also part of the invention.

L'invention a également pour objet un fragment d'ADN selon l'invention, caractérisé en ce que sa séquence comprend tout ou partie de la séquence du promoteur et/ou de la séquence terminatrice et/ou de la séquence signal de la séquence SEQ ID N 1 codant pour ledit polypeptide thermostable ayant une activité enzymatique xylanase. The invention also relates to a DNA fragment according to the invention, characterized in that its sequence comprises all or part of the promoter sequence and / or terminator sequence and / or the signal sequence of the sequence SEQ ID 1 encoding for said thermostable polypeptide having enzymatic activity xylanase.

Le fragment d'ADN selon l'invention dont la séquence est référencée SEQ ID N 1, est obtenu à partir du génome du champignon Thermoascus, de préférence The DNA fragment according to the invention the sequence of which is referenced SEQ ID NO 1, is obtained from the genome of Thermoascus fungus, preferably

Figure img00050001

771ermoasclis alira/1/iaclIs, Il correspond à une partie du gène appelé XY/1A, et code pour la xylanase désignée par XynA, toutes les xylanases selon l'invention étant de manière générale désignées par XynA. 771ermoasclis Alira / 1 / iaclIs, it corresponds to a portion of the gene called XY / 1A and encodes xylanase XynA designated by all the xylanases according to the invention being generally designated by XynA.

Le fragment d'ADN selon la présente invention peut être extrait d'un microorganisme le possédant dans son génome, ou être synthétisé en se fondant sur la séquence divulguée par la présente invention, par n'importe quelle technique appropriée à la disposition de l'homme du métier. The DNA fragment according to the present invention can be extracted from the microorganism having in its genome, or be synthesized based on the sequence disclosed by the present invention by any suitable technique available to the art.

Identité de séquences d'ADN Identity of DNA sequences
L'identité d'une séquence d'ADN, parfois appelée improprement homologie, par rapport à la partie codante de la séquence SEQ ID N 1 (en général sans séquence signal) correspond au degré d'identité entre les deux séquences montrant la divergence d'une séquence par rapport à l'autre. The identity of a DNA sequence, sometimes improperly called homology, with respect to the coding portion of the sequence SEQ ID No. 1 (in general without signal sequence) corresponds to the degree of identity between the two sequences showing the difference of a sequence relative to each other. L'identité peut être déterminée à l'aide de programmes d'ordinateur connus des biologistes moléculaires, comme le programme GAP (Huang X., 1994, Computer Applications in the Biosciences, 10, pp.227-235, University of Michigan, adresse Internet http://genome.cs.mtu,edu). The identity may be determined using computer programs known molecular biologists, like the GAP program (Huang X., 1994 Computer Applications in the Biosciences, 10, pp.227-235, University of Michigan, address Internet http: //genome.cs.mtu,edu). Le programme GAP est utilisé avec les paramètres suivants pour comparer des séquences d'ADN : pénalité de création de 30, pénalité d'extension de 3 et score de divergence de -15. The GAP program is used with the following parameters for comparing DNA sequences: creation penalty 30, extension penalty of 3 and divergence score of -15.

Identité de séquences peptidiques Identity of peptide sequences
L'identité ou homologie entre deux séquences d'acides aminés correspond au degré d'identité entre ces séquences d'acides aminés, faisant apparaître par différence Identity or homology between two amino acid sequences is the degree of identity between amino acid sequences showing the difference

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une divergence entre les séquences comparées. a difference between the compared sequences. L'identité peut être déterminée à l'aide de programmes d'ordinateur connus des biologistes moléculaires, comme le programme GAP (Huang X., 1994, Computer Applications in the Biosciences, 10, pp,227-235, The identity may be determined using computer programs known molecular biologists, like the GAP program (Huang X., 1994 Computer Applications in the Biosciences, 10, pp 227-235,

Figure img00060001

University of Michigan, adresse Internet http://gcnome.cs.nuu cdu). University of Michigan, the internet address http: //gcnome.cs.nuu CDU). Le programme GAP est utilisé avec les paramètres suivants pour comparer des séquences peptidiques : pénalité de création de 10 et pénalité d'extension de 2, matrice Blosum 62 . The GAP program is used with the following parameters to compare the peptide sequences: creation penalty of 10 and extension penalty of 2, Blosum 62 matrix.

Selon ce programme, la séquence peptidique de la xylanase thermostable de Thermoascus publiée par Srinivasa en 1991 ne présente que 59 % d'identité avec la séquence de la protéine mature correspondant à la xylanase thermostable XynA de Thermoascus selon l'invention. According to this program, the peptide sequence of the thermostable xylanase Thermoascus published by Srinivasa 1991 shows only 59% identity with the sequence of the mature protein corresponding to the xylanase XynA thermostable Thermoascus of the invention. Ceci montre que la séquence publiée est erronée et cette erreur était certainement un obstacle supplémentaire pour isoler le gène xynA. This shows that the published sequence is wrong and that error was certainly an additional barrier to isolate the gene xynA.

Un autre aspect de l'invention concerne une construction d'ADN, caractérisée en ce qu'elle comprend un fragment d'ADN selon l'invention et les éléments nécessaires pour l'expression dudit fragment d'ADN dans une cellule hôte. Another aspect of the invention relates to a DNA construct, characterized in that it comprises a DNA fragment according to the invention and the elements necessary for expression of said DNA fragment in a host cell.

Ladite construction d'ADN selon l'invention permet la synthèse du polypeptide correspondant à une xylanase de préférence thermostable, homologue ou totalement identique à la xylanase XynA de Thermoascus, dans une cellule hôte. Said DNA construct according to the invention allows synthesis of the polypeptide corresponding to a xylanase preferably thermostable, homologue or completely identical to the xylanase XynA Thermoascus, in a host cell. Une construction d'ADN selon l'invention peut être notamment toute construction adaptée aux opérations de recombinaison d'ADN, et le choix de ladite construction dépendra souvent de la cellule hôte dans laquelle elle doit être introduite. A DNA construct according to the invention may in particular be any construction suitable for DNA recombination operations and the selection of said construction will often depend on the host cell into which it is to be introduced. Ainsi, la construction d'ADN peut être par exemple un plasmide réplicatif ou un vecteur intégratif. Thus, the DNA construct may be for example a replicative plasmid or an integrative vector.

Dans ladite construction d'ADN, ledit fragment d'ADN selon l'invention codant pour une xylanase homologue ou totalement identique à la xylanase XynA thermostable de Thermoascus est liée de manière fonctionnelle aux éléments nécessaires à sa transcription dans la cellule hôte, c'est-à-dire aux séquences transcriptionnelles et/ou régulatrices adéquates, notamment un promoteur et un terminateur. In said DNA construct, said DNA fragment according to the invention encoding a homologous xylanase or completely identical to the xylanase XynA thermostable Thermoascus is operably linked to elements necessary for its transcription in the host cell, -to say, the transcriptional sequences and / or appropriate regulatory, particularly a promoter and a terminator. Le promoteur peut être toute séquence capable de promouvoir l'expression du gène dans la cellule hôte choisie et notamment il peut dériver de gènes codant pour des protéines de la cellule hôte. The promoter may be any sequence capable of promoting expression of the gene in the selected host cell and in particular it may be derived from genes encoding proteins of the host cell. De préférence, le promoteur utilisé sera constitutif, c'est-à-dire qu'il n'aura pas besoin d'être induit par exemple par du xylane ou du xylose, comme par exemple le Preferably, the promoter used is constitutive, that is to say, he will not need to be induced for example by xylan or xylose, such as

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Figure img00070001

promoteur gpdA (glycéraldéhyde phosphate déhydrogénasc) d'A.,per3illrr.s nidulons, ou un promoteur inductible fort, c'est-à-dire ayant une expression forte sauf en présence d'un répresseur, comme par exemple le promoteur fort cbhI (ccllobiohydrolase 1) de gpdA promoter (glyceraldehyde phosphate déhydrogénasc) of A., per3illrr.s nidulons, or an inducible strong promoter, that is to say having a high expression except in the presence of a repressor, such as the strong CBHI promoter ( ccllobiohydrolase 1) of
Figure img00070002

Trichoderma reesei qui est réprimé par le glucose, Trichoderma reesei which is repressed by glucose,
Par ailleurs, si utile, la séquence signal de xynA peut être modifiée ou changée. Moreover, if useful, the xynA signal sequence may be modified or changed.

De manière générale, la présente invention a aussi pour objet tout fragment d'ADN tel que défini ci-dessus comme étant un objet de l'invention et caractérisé par le fait qu'il a subi l'une des modifications suivantes : # changement du promoteur par un promoteur constitutif comme le promoteur gpdA d'Aspergillus nidulans, ou un promoteur inductible fort comme le promoteur cbhI Generally, the present invention also relates to any DNA fragment as defined above as an object of the invention and characterized in that it has undergone one of the following amendments: # change promoter a constitutive promoter such as the Aspergillus nidulans gpd promoter, or an inducible promoter such as the strong CBHI promoter

Figure img00070003

de Trichoderma reesei, # changement du terminateur, # changement de la séquence signal, ces changements pouvant conduire à un promoteur, une séquence signal ou un terminateur hybride contenant encore éventuellement une partie du promoteur, de la séquence signal ou du terminateur du fragment d'ADN de Thermoascus ou d'un champignon filamenteux de la même famille. Trichoderma reesei, # change the terminator, # change of the signal sequence, these changes may lead to a promoter, a signal sequence or a hybrid terminator further optionally containing a portion of the promoter, signal sequence or terminator fragment DNA Thermoascus or a filamentous fungus of the same family.

Ainsi, l'invention a également pour objet un fragment d'ADN selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend en outre l'une au moins des séquences suivantes : - une séquence hétérologue de promoteur constitutif et non réprimé, notamment le Thus, the invention also relates to a DNA fragment according to the invention, characterized in that it further comprises at least one of the following sequences: - a sequence heterologous constitutive promoter and unchecked, including

Figure img00070004

promoteur pdA d'Aspergillus nidlllans ou une séquence hétérologue de promoteur inductible fort, notamment le promoteur cbhl de Trichoderma reesei ; Aspergillus pdA nidlllans promoter or a heterologous sequence inducible strong promoter, including the cbhl promoter from Trichoderma reesei; - une séquence hétérologue terminatrice ; - a heterologous terminator sequence; - une séquence signal hétérologue. - a heterologous signal sequence.

Bien entendu les séquences homologues d'ADN selon l'invention correspondant aux séquences définies en c) et d) ci-dessus peuvent être obtenues à partir de toute banque d'ADN de champignons filamenteux de la même famille que Thermoascus, par des techniques d'hybridation appropriées, l'homme de l'art ayant tous les éléments pour définir à partir d'un manuel de base comme Sambrook et al., 1989, Molecular cloning: A Laboratory Manual. Of course, the homologous DNA sequences of the invention corresponding to the sequences defined in c) and d) above may be obtained from any DNA library of filamentous fungi of the same family as Thermoascus, by techniques 'suitable hybridization, one skilled in the art that all the elements to define from a basic textbook such as Sambrook et al, 1989, Molecular cloning. a Laboratory manual. Cold Spring Harbor Lab. Cold Spring Harbor Lab. ; ; Cold Spring Harbor, les conditions de stringence à la lumière des définitions données pour ces identités ou homologies. Cold Spring Harbor, the stringency conditions in light of the definitions given for these identities or homologies.

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Les méthodes de ligation de la séquence d'ADN codant pour la xylanase et des séquences transcriptionnclles et/ou régulatrices nécessaires sont bien connues de l'homme de l'art ainsi que les méthodes utilisées pour les intégrer ensuite dans la construction d'ADN désirée pour transformer la cellule hôte choisie (voir par exemple manuel de base cité ci-dessus), Methods of ligation of the DNA sequence encoding the xylanase and the necessary transcriptionnclles sequences and / or regulatory are well known to those skilled in the art and the methods used for subsequent incorporation in the construction of desired DNA to transform the host cell (eg basic textbook cited above)
L'invention comprend également un polypeptide thermostable ayant une activité enzymatique xylanase codé par un fragment d'ADN ou par une construction d'ADN selon l'invention, notamment le polypeptide de séquence d'acides aminés SEQ ID N 2 ou le polypeptide de séquence d'acides aminés SEQ ID N 2 dans lequel le fragment peptidique correspondant au peptide signal a été délété. The invention also includes a polypeptide having a thermostable xylanase enzyme activity encoded by a DNA fragment or a DNA construct according to the invention, including amino acid polypeptide of sequence SEQ ID NO 2 or the polypeptide of sequence amino acid sequence SEQ ID N 2 wherein the peptide fragment corresponding to the signal peptide was deleted.

Un autre aspect de l'invention concerne une cellule hôte contenant la séquence d'ADN hétérologue selon l'invention, codant pour un polypeptide correspondant à une xylanase homologue ou totalement identique à la xylanase thermostable XynA de Thermoascus, ou la construction d'ADN selon l'invention la contenant. Another aspect of the invention relates to a host cell containing the heterologous DNA sequence of the invention encoding a polypeptide corresponding to a homologous xylanase or completely identical to thermostable xylanase XynA of Thermoascus, or the DNA construct according the invention containing it.

Ladite cellule hôte peut être procaryote ou eucaryote. Said host cell may be prokaryotic or eukaryotic. Elle peut être une bactérie, appartenant par exemple au genre Bacillus. It may be a bacterium, for example belonging to the genus Bacillus. Elle peut aussi être une levure, comme par exemple une levure appartenant à un des genres Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Hansenula, Yarrowia. It can also be a yeast, such as a yeast belonging to the genera Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Hansenula, Yarrowia. Elle peut également être choisie parmi les champignons filamenteux, tels que Aspergillus, Trichoderma, Fusarium, Humicola, Tolypocladium, Thermoascus, Penicillium, Talaromyces, Sporotrichum, Beauvaria, Hypocrea. It can also be chosen from filamentous fungi, such as Aspergillus, Trichoderma, Fusarium, Humicola, Tolypocladium, Thermoascus, Penicillium, Talaromyces, Sporotrichum, Beauveria, Hypocrea.

Ladite cellule hôte, une fois transformée avec la construction d'ADN selon l'invention et cultivée dans des conditions adaptées, permet de produire et d'excréter une xylanase thermostable homologue ou totalement identique à la xylanase XynA, éventuellement sous forme pure quand la cellule hôte transformée n'est pas déjà productrice de xylanase, et de préférence n'est pas non plus productrice d'autres hydrolases comme des cellulases. Said host cell, when transformed with the DNA construct of the invention and grown under suitable conditions, can produce and excrete homologous thermostable xylanase or completely identical to the xylanase XynA, optionally in pure form when the cell transformed host is already producing xylanase, and preferably is not producing other hydrolases such as cellulases.

La cellule hôte transformée est cultivée dans des conditions classiques, sur n'importe quel milieu conventionnel convenant à ladite cellule hôte, additionné ou non de xylanes et/ou de xylose et/ou d'un autre inducteur approprié. The transformed host cell is cultured under conventional conditions, on any conventional medium suitable for said host cell, with or without added xylan and / or xylose and / or other suitable inducer. Les xylanases de préférence excrétées dans le milieu de culture sont récupérées par des procédés connus incluant entre autre la séparation des cellules du milieu par centrifugation ou filtration, la The preferably xylanases excreted in the culture medium is recovered by known methods including inter alia the separation of cells from the medium by centrifugation or filtration,

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précipitation des fractions protéiques à l'aide de sels ou la concentration par ultrafiltration, éventuellement suivies de techniques chromatographiques comme la chromatographie par échange d'ions. precipitation of protein fractions using salts or concentration by ultrafiltration, optionally followed by chromatographic techniques such as chromatography by ion exchange. La xylanase XynA obtenue selon ce procédé, de préférence sous forme pure est un autre objet de l'invention. XynA xylanase obtained according to this process preferably in pure form is a further object of the invention. La xylanase XynA étant de Xylanase being XynA

Figure img00090001

préférence thermostable, en cas de production par une cellule hôte non thermophile, elle peut être obtenue sous forme d'activité pure par un traitement thermique de l'ordre de 2 heures à 70 C. preferably thermostable, in case of production by a non-thermophilic host cell, it can be obtained as pure activity by heat treatment of the order of 2 hours at 70 C.

Encore un autre aspect de l'invention concerne l'utilisation de la xylanase XynA produite par une cellule hôte transformée par la construction d'ADN selon l'invention. Yet another aspect of the invention relates to the use of the XynA xylanase produced by a host cell transformed with the DNA construct of the invention.

Figure img00090002

La xylanase thermostable XynA de Thermoascus aurantiacus est une protéine de poids moléculaire d'environ 33 kDa, dont l'activité enzymatique est caractérisée par les propriétés suivantes : pH optimum environ 4,4, température optimum environ 80 C, demi-vie égale à 30 mn à 80 C et pH=8 et à 15 mn à 80 C et pH=3. The thermostable xylanase XynA of Thermoascus aurantiacus is a molecular weight protein of approximately 33 kDa, whose enzymatic activity is characterized by the following properties: optimum pH about 4.4, optimum temperature about 80 ° C, half-life equal to 30 minutes at 80 C and pH = 8 and 15 minutes at 80 C and pH = 3. La perte d'activité totale se produit à 95 C. Ces propriétés rendent cette xylanase et les xylanases thermostables homologues XynA obtenues selon l'invention intéressantes à utiliser dans différentes applications industrielles mettant en #uvre des matières premières végétales ou des plantes contenant des hémicelluloses telles que les céréales. The loss of total activity occurs at 95 C. These properties make this xylanase and thermostable xylanase counterparts XynA obtained according to the interesting invention for use in various industrial applications using #uvre vegetable raw materials or plants containing such hemicellulose than cereals. Ces applications sont nombreuses et se trouvent en particulier dans les domaines de l'alimentation animale, notamment du bétail (ruminants et porcins) ou de la volaille, à la panification, à la brasserie ou à la malterie. These applications are numerous and are found especially in the areas of animal feed, including livestock (ruminants and pigs) or poultry, the bakery, the brewery or malting.

La xylanase XynA peut être utilisée sous forme d'une enzyme pure, ou en mélange avec d'autres activités enzymatiques selon une formulation particulièrement adaptée à l'alimentation animale, notamment du bétail ou de la volaille, à la panification, à la brasserie ou à la malterie. The XynA xylanase can be used as a pure enzyme, or in admixture with other enzymatic activities in a formulation particularly suitable for animal feed, particularly of livestock or poultry, for bread, to the brewery or the malting.

De plus, la xylanase codée par le fragment d'ADN selon l'invention a des propriétés spécifiques particulièrement intéressantes et inattendues en panification. Furthermore, the xylanase encoded by the DNA fragment according to the invention has specific properties that are particularly interesting and unexpected in breadmaking. De manière générale, il apparaît que la xylanase XynA de Thermoascus a des propriétés totalement inattendues en panification, alors que cette application n'avait jamais été décrite. In general, it appears that the xylanase of XynA Thermoascus was totally unexpected properties in breadmaking, while this application was never described.

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la description avec les exemples et la figure dont la légende est représentée ci-après . Other features and advantages of the invention appear in the following description with the examples and the figure whose legend is shown below.

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Légende de la figure Figure 1 : Représentation du plasmide pUT 1122 MILIEUX ET METHODES Milieu de base Mandels : Solution oligo-éléments: Figure Legend Figure 1: Representation of the plasmid pUT 1122 MEDIA AND METHODS Mandels Base medium: Solution trace elements:

Figure img00100001

KH2PO4 2 g/1 FeSO4,7II2O 2,5 g KH2PO4 2 g / 1 2.5 g FeSO4,7II2O
Figure img00100002

<tb> <Tb>
<tb> (NH4)2SO4 <SEP> 1,4 <SEP> g/1 <SEP> MnSO4, <SEP> 7H2O <SEP> 1 <SEP> g <SEP> <Tb> (NH4) 2SO4 <September> 1.4 <September> g / 1 <September> MnSO4, <September> 7H2O <September> 1 <September> g <September>
<tb> MgS047H20 <SEP> 0,3 <SEP> g/l <SEP> ZnSO4, <SEP> 7H20 <SEP> 1,76 <SEP> g <SEP> <Tb> MgS047H20 <September> 0.3 <September> g / l <September> ZnSO4, <September> 7:20 <September> 1.76 <September> g <September>
<tb> <Tb>

Figure img00100003

CaCl2 0,3 gll CoS04, 7H20 1,25 g CaCl2 0.3 gll CoS04, 7:20 1.25 g
Figure img00100004

<tb> <Tb>
<tb> Oligo-éléments <SEP> 1 <SEP> ml/1 <SEP> HCI <SEP> IN <SEP> 5 <SEP> ml <SEP> <Tb> Micronutrients <September> 1 <September> ml / 1 <September> HCI <September> IN <September> 5 <September> ml <September>
<tb> H2O <SEP> 495 <SEP> ml <Tb> H2O <September> 495 <September> ml
<tb> <Tb>
Milieu GS : Milieu BSM : Middle GS: Middle BSM:

Figure img00100005

<tb> <Tb>
<tb> Glucose <SEP> 10 <SEP> g/l <SEP> KH2PO4 <SEP> 1 <SEP> g/l <Tb> Glucose <September> 10 <September> g / l <September> KH2PO4 <September> 1 <September> g / l
<tb> <Tb>

Figure img00100006

Biosoyase (BioMérieux, France) 5 g/1 (NH4)2SO 2,5 gfi Agar 15g MgSO471120 0,3 g/1 Biosoyase (BioMerieux, France) 5 g / 1 (NH4) 2SO 2,5 gfi Agar 15g MgSO471120 0.3 g / 1
Figure img00100007

<tb> <Tb>
<tb> CaCl2 <SEP> 0,2 <SEP> g/1 <Tb> CaCl2 <September> 0.2 <September> g / 1
<tb> Oligo-élémcnts <SEP> 1 <SEP> ml/1 <Tb> Trace élémcnts <September> 1 <September> ml / 1
<tb> <Tb>
Milieu GLCS : Middle GLCS:

Figure img00100008

<tb> <Tb>
<tb> Milieu <SEP> de <SEP> base <SEP> Mandels <SEP> qsp <SEP> 1 <SEP> @ <Tb> Medium <September> of <September> Basic <September> Mandels <September> qs <September> 1 <September> @
<tb> Tween <SEP> 80 <SEP> 1 <SEP> g/1 <SEP> <Tb> Tween <September> 80 <September> 1 <September> g / 1 <September>
<tb> Extrait <SEP> de <SEP> levure <SEP> 1 <SEP> g/l <Tb> sample <September> of <September> yeast <September> 1 <September> g / l
<tb> Phtalate <SEP> de <SEP> potassium <SEP> 10 <SEP> g/I <SEP> <Tb> phthalate <September> of <September> potassium <September> 10 <September> g / I <September>
<tb> Glucose <SEP> 30 <SEP> g/l <Tb> Glucose <September> 30 <September> g / l
<tb> Corn <SEP> Steep <SEP> 5 <SEP> g/1 <Tb> Corn <September> Steep <September> 5 <September> g / 1
<tb> pH <SEP> 5,8 <SEP> non <SEP> ajusté <SEP> <Tb> pH <September> 5.8 <September> not <September> adjusted <September>
<tb> <Tb>
Corn steep = liqueur de trempage du maïs. Corn steep = corn steep liquor.

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Dosage des protéines totales : Determination of total protein:
Le dosage des protéines totales excrété dans le milieu de culture se fait selon la méthode de Lowry et al. The determination of total protein excreted in the culture medium is done according to the method of Lowry et al. (1951, J. Biol. Chem., 193, pp.265-275) après précipitation des protéines par un égal volume de TCAIO % (acide trichloroacétiquc 10 %), lecture des densités optiques (DO) à 540 nm et report à la courbe étalon donnant la correspondance entre l'absorbance et la teneur en protéines. (1951, J. Biol. Chem., 193, pp.265-275) after protein precipitation with an equal volume of TCAIO% (acid trichloroacétiquc 10%), reading of the optical densities (OD) at 540 nm and retained the standard curve giving the correspondence between absorbance and protein content.

Figure img00110001

Dosage de l'activit.c5rlanase d'une préparation enzymatique : Determination of activit.c5rlanase of an enzyme preparation:
L'unité de xylanase est définie comme la quantité d'enzyme qui libère à partir de xylane une micromole de fonction réductrice exprimée en équivalent xylose, par minute et dans les conditions du dosage. The unit of xylanase is defined as the amount of enzyme which liberates from xylan a reducing function micromole expressed as xylose equivalents, per minute under the conditions of the assay.

La méthode utilisée est basée sur la méthode Glucose-DNS décrite par Miller et al. The method used is based on the Glucose-DNS method described by Miller et al. (1959, Anal. Chemistry, vol.31, pp. 426-428). (1959, Anal. Chemistry, vol.31, pp. 426-428). La préparation des tampons, des substrats et des réactifs de dosage, le dosage ainsi que la détermination des activités xylanases totales suivent les Laboratory procedures in growth, enzyme measurement, and related analytical procédures (Mary Mandels, 1977, International Course/Symposium Bioconversion of Cellulose Materials into Energy, Chemicals & Microbial Proteins ). The preparation of buffers, substrates and assay reagents, assay and the determination of the total xylanase activities follow the Laboratory procedures in growth, enzyme measurement, and related analytical procedures (Mary Mandels, 1977 International Walk / Symposium Bioconversion of Cellulose Materials into Energy, Chemicals & Microbial Proteins).

- Préparation du substrat : - Substrate Preparation:
1 g de xylane d'avoine (Sigma) ou de bouleau (Sigma) est dissous dans 50 ml de soude 1N. 1 g oat xylan (Sigma) or birch (Sigma) was dissolved in 50 ml of 1N sodium hydroxide. Lorsque la dissolution est complète, le pH est ajusté à 4,8 par de l'acide chlorhydrique concentré. When dissolution is complete, the pH is adjusted to 4.8 with concentrated hydrochloric acid. On ajoute ensuite 50 ml de tampon citrate 100 mM pH 4,8 de façon à obtenir une solution de xylane à 1 % dans du tampon citrate pH 4,8 à 0,05 M. Then 50 ml of citrate buffer 100 mM pH 4.8 so as to obtain a 1% xylan solution in citrate buffer pH 4.8 0.05 M

- Dosages : - Assays:
A 500 l de préparation enzymatique à la concentration adéquate (de façon à obtenir des DO entre environ 0,150 et 0,300 à 540 nm), sont ajoutés 500 l de solution de xylane à 1 % préparée selon le procédé décrit précédemment. A 500 l of enzyme preparation at the appropriate concentration (so as to obtain OD between about 0.150 and 0.300 to 540 nm) are added 500 l of xylan 1% solution prepared according to the method described above. L'incubation est effectuée à 50 C ou à 70 C pendant 15 minutes. Incubation is performed at 50 C or 70 C for 15 minutes.

On ajoute 3 ml de réactif DNS (Miller et al., 1959), on incube 10 minutes à 3 ml of DNS reagent (Miller et al., 1959), incubated 10 minutes
100 C avant de rajouter 16 ml de tartrate de sodium-potassium à 16 g/1. 100 C before adding 16 ml of sodium-potassium tartrate 16 g / 1.

La lecture des densités optiques est effectuée à 540 nm. Reading the optical density is carried out at 540 nm.

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La détermination de l'activité totale se fait par rapport à une courbe étalon xylose. The determination of the total activity is relative to a xylose standard curve.

Cette activité est exprimée en U par ml, c'est-à-dire en unité xylanase par ml du milieu de culture après séparation de la biomasse par filtration ou en U par mg de protéines totales récoltées, ces protéines étant déterminées par la méthode de Lowry définie ci-dessus. This activity is expressed in U per ml, that is to say in units xylanase per ml of culture medium after separation of the biomass by filtration or U per mg of total protein harvested, these proteins being determined by the method of Lowry defined above.

EXEMPLES EXAMPLES
EXEMPLE 1 : Clonage du gène xynA EXAMPLE 1: Cloning of xynA

Figure img00120001

A) Extraction de l'ADN génomique de Thermoascus aurantiacus A) Extraction of genomic DNA from Thermoascus aurantiacus
De manière générale, il a été constaté que les protocoles d'extraction d'ADN génomique publiés ne convenaient pas pour l'extraction de l'ADN génomique de Thermoascus. In general, it was found that the published genomic DNA extraction protocols were not suitable for the extraction of genomic DNA Thermoascus. Les protocoles suivants ont notamment été essayés sans succès : a) la technique publiée par Wilmotte A. (Syst. Appl. Microbiol., 1993, vol. 16, pp. 436- The following protocols were notably tried without success: a) the published technique A. Wilmotte (Syst Appl Microbiol 1993, vol 16, pp 436-.....
444), qui est une des deux techniques de base pour l'extraction de l'ADN génomique des champignons filamenteux ; 444), which is one of two basic techniques for genomic DNA extraction filamentous fungi; b) la technique CTAB publiée par Rogers et al. b) the CTAB technique published by Rogers et al. (Plant Molecular Biology Manual, A6, (Plant Molecular Biology Manual, A6,
1988, pages 1-10), qui est l'autre technique de base ; 1988, pages 1-10), which is the other basic technique; c) DNeasy# Plant Minikit vendu par QIAGEN, Allemagne. c) DNeasy Plant # Minikit sold by QIAGEN, Germany.

En pratique, il était impossible d'obtenir une seule amplification par PCR. In practice, it was impossible to obtain a single PCR amplification. Quant aux ligations, plus la quantité d'ADN utilisée était grande moins la réaction fonctionnait (habituellement c'est le contraire qui se passe). As for the ligations, the greater the amount of DNA used was large under the reaction working (usually the opposite happens). Ces difficultés non résolues expliquent probablement pourquoi aucun gène de Thermoascus n'avait été cloné jusqu'à présent. These unresolved difficulties probably explain why no Thermoascus gene had been cloned so far.

Pour résoudre ce problème, il a été essayé de laver le mycelium avec différents détergents susceptibles d'éliminer les inhibiteurs des réactions recherchées et notamment les polysaccharides. To solve this problem, it was tried to wash the mycelium with different detergents may remove inhibitors of the desired reactions including polysaccharides. Après de nombreux essais, un protocole a été mis au point, ce protocole repose sur la combinaison des moyens suivants : After extensive testing, a protocol was developed, this protocol is based on the combination of the following:
1) lavage du mycelium dans une solution de 0,1 % Triton X100# (fournisseur SIGMA), ce Triton X100# étant le nom commercial d'une solution de t- 1) mycelium washing in a solution of 0.1% Triton X-100 # (SIGMA supplier), that Triton X-100 # is the trade name for a solution t
Octylphénoxypolyéthoxyéthanol ; octylphenoxypolyethoxyethanol;

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2) emploi du kit de marque Boehringer pour l'extraction d'ADN de plantes (Boehringer 2) use of the trademark Boehringer kit for DNA extraction plant (Boehringer
Mannheim), qui n'est pas connu comme pouvant convenir pour l'extraction de l'ADN des champignons filamenteux, et qui a été adapté en ajoutant un broyage préliminaire complémentaire du mycélium dans l'azote liquide. Mannheim), which is not known as suitable for the extraction of DNA from filamentous fungi, and which has been adapted by adding a supplementary preliminary grinding the mycelium in liquid nitrogen.

Ce mode opératoire spécifique a permis d'obtenir à partir de Thermoascus aurantiacus de l'ADN génomique stable permettant pendant 6 mois des réactions de PCR (Polymerase Chain Reaction) et de ligation, B) Stratégie d'isolement du gène à partir de la banque génomique d'ADN - Conception des amorces This specific procedure was obtained from Thermoascus aurantiacus genomic DNA stable for 6 months PCR reactions (Polymerase Chain Reaction) and ligation, B) isolating Strategy gene from the bank genomic DNA - primer design
Les difficultés très importantes rencontrées pour obtenir une banque d'ADN génomique stable, sont accrues dans le cadre d'un travail avec de l'ARN et excluaient pratiquement la réalisation d'une banque d'ADNc. The very substantial difficulties in obtaining a stable genomic DNA bank, rose through work with RNA and practically exclude the realization of a cDNA library. De plus, les essais réalisés à partir de l'ARN de Thermoascus aurantiacus pour obtenir une telle banque ont été infructueux. Furthermore, tests made from RNA Thermoascus aurantiacus for such a bank were unsuccessful.

La seule voie pratiquement possible était donc de cloner par PCR le gène de la xylanase thermostable XynA de Thermoascus à partir d'une banque d'ADN génomique, malgré la présence prévisible de nombreux introns. The only way feasible was to clone the gene by PCR thermostable xylanase XynA of Thermoascus from a genomic DNA library, despite the expected presence of many introns.

La première démarche fut d'essayer de définir des amorces à partir de la séquence d'acides aminés publiée par Srinivasa en 1991. A partir de cette séquence, diverses amorces dégénérées pour PCR furent conçues. The first step was to try to define the primers from the amino acid sequence published by Srinivasa in 1991. From this sequence, various degenerate PCR primers were designed. Malgré les efforts longs et importants qui furent consacrés à ce travail, ce fut un échec. Despite the long and significant efforts were devoted to this work, it was a failure. Une conclusion s'est alors imposée : la séquence publiée pour cette xylanase XynA de Thermoascus était erronée. A conclusion is then imposed: the published sequence for this XynA xylanase Thermoascus was wrong. Ceci fut confirmé lors de l'obtention du résultat objet de l'invention : la séquence d'acides aminés publiée pour cette protéine mature XynA de Thermoascus ne comporte que 59 % d'identité avec la séquence de cette protéine telle qu'elle peut être déduite du gène xynA qui a été isolé. This was confirmed when obtaining the result object of the invention: the published amino acid sequence for this mature protein XynA Thermoascus has only 59% identity with the sequence of this protein as it can be deducted from the xynA gene was isolated. Cette séquence d'acides aminés est donnée en SEQ ID N 2. En comparant les deux séquences, l'homme de l'art comprend aisément, en tenant compte des problèmes de dégénérescence du code génétique et des difficultés spécifiques à la technique PCR utilisée, pourquoi il a été impossible pratiquement malgré les efforts consentis d'obtenir un résultat en partant de la séquence d'acides aminés publiée. This amino acid sequence is given in SEQ ID NO 2. In comparing two sequences, one skilled in the art readily be understood, taking into account the degeneracy of the genetic code of the specific problems and difficulties in the PCR technique used, why it was virtually impossible, despite efforts to achieve a result, starting from the amino acid sequence published.

Cette première démarche ayant conduit à un échec, la conception des amorces devait être reprise depuis le début. This first step leading to a failure, the design of primers had to be resumed from the beginning. La nouvelle démarche a consisté en premier lieu à The new approach was first to

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rechercher des séquences d'acides aminés de xylanases de la même famille déjà publiées et de rechercher des régions conservées. search for amino acid sequence of xylanase from the same family already published and search for conserved regions. Il a été fait l'hypothèse, contrairement à ce qui pouvait être déduit du document WO 96/23062 cité ci-dessus que cette xylanase thermostable de Thermoascus appartenait à la famille 10 selon la classification de Hcnrissat déjà citée (famille 10 anciennement dénommée famille F). It has been hypothesized, contrary to what could be inferred from WO 96/23062 mentioned above that this thermostable xylanase Thermoascus belonged to the family 10 of the classification Hcnrissat cited above (family 10 formerly family F ).

Ont ainsi été retenues, les séquences d'une cellobiohydrolase de Cellulomonas finit, de la xylanase A de Pénicillium chrysogenum, de la xylanase C d'Aspergillus Were retained, the sequences of a cellobiohydrolase Cellulomonas ends, xylanase A from Penicillium chrysogenum, xylanase C Aspergillus

Figure img00140001

nidulans et la séquence de la xylanase A de Pseudomonas jluorescens, Les régions les mieux conservées de la séquence peptidique de ces glycosyl-hydrolases ont été déterminées à partir des séquences disponibles sur banques de données et ont été comparées au moyen du logiciel Clustal V (Higgins D., 1991, CABIOS, vol.8, pp. nidulans and the sequence of the xylanase Pseudomonas jluorescens, The best conserved regions of the peptide sequence of these glycosyl hydrolases were determined from the sequences available in data banks and were compared using the Clustal V software (Higgins D. 1991, CABIOS, vol.8, pp.

189-191). 189-191).

Plusieurs combinaisons d'amorces ont alors été conçues en tenant compte : . Several primer combinations were then designed taking into account:. des régions homologues identifiées (ou régions conservées), sachant qu'en cas de divergences il était donné la préférence à la séquence des xylanases d'origine fongique {Pénicillium chrysogenum et Aspergillus nidulans), . of the identified homologous regions (or conserved regions), wherein in case of divergences was given preference to the sequence of fungal origin xylanases {Penicillium chrysogenum and Aspergillus nidulans). de la localisation probable des introns, la séquence connue de l'ADN codant pour la xylanase de la famille 10 $ Aspergillus nidulans comporte 7 introns, celle de of probable location of introns, the known sequence of the DNA encoding the xylanase of Family 10 $ Aspergillus nidulans comprises 7 introns, that of
Pénicillium chrysogenum en comporte 9, le résultat de l'invention montre que celle Penicillium chrysogenum comprises 9, the result of the invention shows that the

Figure img00140002

de Thermoascus aliranliaclis en comporte 10 au total, . of Thermoascus aliranliaclis comprises 10 total. des différents triplets de codons qui du fait de la dégénérescence du code génétique, peuvent être à l'origine de chaque acide aminé de la séquence peptidique consensus choisie pour concevoir une amorce. different triplets of codons which, due to the degeneracy of the genetic code, can be at the origin of each amino acid in the consensus peptide sequence selected for designing a primer. De plus, il faut correctement doser l'utilisation de la synthèse dégénérée et l'utilisation d'inosine (nucléotide capable de complémenter n'importe lequel des quatre nucléotides naturels A, T, G, C). Moreover, it must be assayed properly using the degenerated synthesis and use of inosine (nucleotide capable of complementing any of the four naturally occurring nucleotides A, T, G, C). Les inosines ont été utilisées de préférence du côté 5' des amorces, tandis que les dégénérescences ont été placées du côté 3'. The inosines were used preferably on the 5 'primer, while the degeneracies were placed the 3' side.

De nombreuses combinaisons d'amorces et/ou de conditions PCR ont été essayées et plusieurs centaines de réactions ont été effectuées. Many combinations of primers and / or PCR conditions have been tried and several hundred reactions were performed.

Finalement, un fragment du gène xynA a été obtenu avec les deux amorces décrites ci-après dans le tableau 1, avec la séquence de la région conservée Finally, a fragment of the xynA gene was obtained with the two primers described below in Table 1, with the sequence of the conserved region

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correspondante définie dans le cadre de la recherche ci-dessus. corresponding defined within the search above. Dans le tableau cidessous, où les protéines et les bases sont définies par le code international à une lettre, sont repris : . In the table below, where proteins and bases are defined by international single letter code, are included. pour mémoire l'alignement correspondant de la séquence d'acides aminés memory corresponding to the alignment of the amino acid sequence

Figure img00150001

partiellement erronée publiée pour XynA de Thermoascus, altrc1nliaclts (= Ta). partially erroneous posted XynA of Thermoascus, altrc1nliaclts (= Ta). On peut remarquer que pour la région en 5' la séquence est exacte, que par contre ce n'est pas le cas pour la région en 3', . It may be noted that for the 5 'region of the sequence is correct, as against this is not the case with the region 3'. l'alignement des séquences d'acides aminés des glycosyl-hydrolases du groupe 10 the alignment of the amino acid sequences of glycosyl hydrolases Group 10
Figure img00150002

d'Aspergillus nid,dans, Pénicillium chrysogenltm, Cellltlomonas fimi et Pseitdonioiiasj7iiorescetis, . Aspergillus nest in, Penicillium chrysogenltm, Cellltlomonas fimi and Pseitdonioiiasj7iiorescetis,. la séquence d'acides aminés définie pour la région conservée, . the amino acid sequence defined for the conserved region. les différents codons possibles, . the possible codons. les amorces qui en ont été déduites, étant entendu que ces amorces contiennent chacune un site de restriction, pour permettre l'insertion ultérieure dans un plasmide de clonage à savoir le site Asp718I dans l'amorce X25 du côte 5', et le site BamHi dans l'amorce X18du côté 3'. primers which were derived, provided that these primers each contain a restriction site to allow the subsequent insertion into a cloning plasmid namely Asp718I site in the primer X25 5 'side, and the BamHI site in the primer X18du 3 '.
Figure img00150003

<tb> <Tb>
<tb> <Tb>

TABLEAU <SEP> ! TABLE <September>! <SEP> <September>
<tb> Conception <SEP> amorce <SEP> 5': <Tb> Design <September> primer <September> 5 ':
<tb> Ta <SEP> XynA <SEP> (publiée) <SEP> A <SEP> K <SEP> L <SEP> Y <SEP> 1 <SEP> N <SEP> D <SEP> Y <SEP> N <SEP> L <SEP> D <SEP> S <SEP> A <SEP> <Tb> Ta <September> XynA <September> (published) <September> A <September> K <September> L <September> Y <September> 1 <September> N <September> D <September> Y <September> N <September> L <September> D <September> S <September> A <September>
<tb> <Tb>

Figure img00150004

A. nidulans XlnC AKLYINDYNLDSA P. dll}t'i08f'1I6II X)1.1AAKLYINDYNLDSA Nidulans XLNC AKLYINDYNLDSA P. dll} you i08f'1I6II X) 1.1AAKLYINDYNLDSA
Figure img00150005

<tb> <Tb>
<tb> C. <SEP> fimt <SEP> A <SEP> K <SEP> L <SEP> C <SEP> I <SEP> N <SEP> D <SEP> Y <SEP> N <SEP> V <SEP> E <SEP> G <SEP> I <Tb> C. <September> FIMT <September> A <September> K <September> L <September> C <September> I <September> N <September> D <September> Y <September> N <September> V < September> E <September> G <September> I
<tb> CONSENSUS <SEP> A <SEP> K <SEP> L <SEP> Y <SEP> I <SEP> N <SEP> D <SEP> Y <SEP> N <SEP> L <SEP> D <SEP> S <SEP> A <SEP> <Tb> Consensus <SEP> A <SEP> K <SEP> L <SEP> Y <SEP> I <SEP> N <SEP> D <SEP> Y <SEP> N <SEP> L <SEP> D <SEP > S <September> A <September>
<tb> code <SEP> GCN <SEP> AAA <SEP> CTN <SEP> TAC <SEP> ATA <SEP> AAC <SEP> GAC <SEP> TAC <SEP> AAC <SEP> CTN <SEP> GAC <SEP> TCN <SEP> GCN <Tb> code <September> GCN <September> AAA <September> NTC <September> TAC <September> ATA <September> AAC <September> GAC <September> TAC <September> AAC <September> NTC <September> GAC <September > TCN <September> GCN
<tb> génétique <SEP> G <SEP> TTA <SEP> T <SEP> C <SEP> T <SEP> T <SEP> T <SEP> T <SEP> TTA <SEP> T <SEP> AGC <Tb> Genetic <September> G <September> TTA <September> T <September> C <September> T <September> T <September> T <September> T <September> TTA <September> T <September> AGC
<tb> possible <SEP> G <SEP> T <SEP> G <SEP> T <Tb> can <September> G <September> T <September> G <September> T
<tb> X25 <SEP> 5'- <SEP> CA <SEP> GGTACC <SEP> TAY <SEP> ATH <SEP> AAY <SEP> GAY <SEP> TAY <SEP> AA <Tb> X25 <September> 5'<September> CA <September> GGTACC <September> TAY <September> ATH <September> AAY <September> GAY <September> TAY <September> AA
<tb> Asp718I <Tb> Asp718I
<tb> <Tb>

Figure img00150006

<tb> <Tb>
<tb> Conception <SEP> amorce <SEP> 3' <SEP> : <Tb> Design <September> primer <September> 3 <September>:
<tb> Ta <SEP> XynA <SEP> (publiée) <SEP> A <SEP> F <SEP> K <SEP> N <SEP> T <SEP> L <SEP> T <SEP> N <SEP> V <SEP> M <SEP> K <SEP> <Tb> Ta <September> XynA <September> (published) <September> A <September> F <September> K <September> N <September> T <September> L <September> T <September> N <September> V <September> M <September> K <September>
<tb> <Tb>

Figure img00150007

A. nidulans XynC VG 1 TVWGVSDK p, duysogc'Illl1l/ X)11A VG 1 TVWGVADP A. nidulans xynC VG 1 TVWGVSDK p, duysogc'Illl1l / X) 11A VG 1 TVWGVADP
Figure img00150008

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<tb> C. <SEP> fimt <SEP> Q <SEP> GVTVWG <SEP> 1 <SEP> T <SEP> D <SEP> K <SEP> <Tb> C. <September> FIMT <September> Q <September> GVTVWG <September> 1 <September> T <September> D <September> K <September>
<tb> <Tb>

Figure img00150009

RJluorescensXylA GG 1 TVWGIADP RJluorescensXylA GG 1 TVWGIADP

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Figure img00160001

CONSENSUS G 1 TVWGV ? CONSENSUS G 1 TVWGV? D ? D? code GGN ATA ACN GTN TGG GGN GTN GAC génétique CT possible T ATA code GGN ACN TGG GTN GTN GGN genetic GAC possible T CT
X18 3' - TAD TGN CAN ACC CCN CA CCTAGG TG X18 3 '- TAD TGN CAN ACC NCC CA CCTAGG TG
BamHI Dans le tableau ci-dessus, selon le code international : Bam In the table above, according to the International Code:
Y correspond à C ou T Y is C or T
H correspond à A ou C ou T H is A or C or T
D correspond à A ou G ou T D means A or G or T
N correspond à A ou T ou G ou C. N is A or T or G or C.

Les amorces X18 et X25 ainsi définies ont été synthétisées par une société spécialisée. The X18 and X25 thus defined primers were synthesized by a specialized company.

C) Extraction d'une sonde avec les amorces X18et X25 et clonage du gène complet C) Extraction of a probe with X25 X18et primers and cloning of the complete gene
Pour obtenir une amplification spécifique des amorces et pouvoir éliminer les fragments trop courts, il est nécessaire d'estimer la taille approximative des fragments d'ADN attendus, cette taille des fragments dépendant du nombre d'introns entre la région correspondant à chaque amorce. For specific amplification primers and to eliminate fragments too short, it is necessary to estimate the approximate size expected DNA fragments, the fragment size depending on the number of introns between the region corresponding to each primer.

Si on se réfère à la comparaison des 4 séquences protéiques connues de glycosyl- hydrolases de la famille 10, on peut estimer qu'entre les amorces X25 et X18, il y a au moins 98 acides aminés (soit 3 x 98 = 294 pb). Referring to the comparison of four protein sequences known glycosyl hydrolases of the family 10, we can estimate that between X25 and X18 primers, there are at least 98 amino acids (or 3 x 98 = 294 bp) . Une taille d'au moins environ 300 pb est donc la taille minimale absolue. A size of at least about 300 bp is the absolute minimum size. De plus il est très probable que plusieurs introns soient présents dans cette partie du gène. Furthermore it is very likely that many introns are present in this part of the gene. Si on se réfère aux deux séquences génomiques Referring to the two genomic sequences

Figure img00160002

connues de champignons (Aspergillus 1lidu/ans xyrrC et Pénicillium chrysogerrunr xyit4) on peut estimer à au moins 200 pb la taille de séquences introniques. known fungi (1lidu / xyrrC years Aspergillus and Penicillium chrysogerrunr xyit4) can be estimated at at least 200 bp size intronic sequences. Une estimation prudente de la taille minimale attendue est donc de 500 pb. A conservative estimate of the expected minimum size is 500 bp.

Compte tenu de ces éléments, la réaction de PCR permettant d'obtenir la sonde recherchée a été réalisée avec une banque d'ADN génomique de Thermoascus Given these factors, the PCR reaction to obtain the desired probe was carried out with a genomic DNA library of Thermoascus

Figure img00160003

auronliacus, comme décrit ci-dessous, en présence des amorces X 18 et X25, les fragments amplifiés de moins de 500 pb étant éliminés. auronliacus, as described below, in the presence of the primer X 18 and X25, the amplified fragments under 500 bp are eliminated. Les précisions données ci-dessous concernant les réactifs, les fournisseurs, le matériel et les cycles utilisés sont données sous forme résumée et uniquement à titre d'exemple, il s'agit de procédures bien connues de l'homme de l'art, une fois le contexte clairement défini. The details given below regarding reagents, suppliers, equipment and cycles used are given in summary form and only by way of example, it is well known procedures of the man of the art, once the context clearly defined.

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Figure img00170001

Dans un microtube à parois fines de 5001 #urogentec. In a microfuge thin wall 5001 #urogentec. Belgique); Belgium); 1 yl d'ADN génomique de T. auranliacus à 1 yg/pl. 1 ul of genomic DNA of T. auranliacus 1 pg / pl. 1 l d'amorce X25 à 1 g/ l 1 l primer X25 to 1 g / l
Figure img00170002

1 ul d'amorce X18 à 1 iig/lil 1 ul of primer X18 1 iig / lil
2,5 l de tampon Tfl x20 (Epicentre Technologies, USA) 2.5 l buffer x20 Tfl (Epicenter Technologies, USA)
3 l de MgCl2 25 mM (Epicentre Technologies, USA) 3 l of 25 mM MgCl2 (Epicenter Technologies, USA)
5 l de dNTP (nucléotides) 2,5 mM (Pharmacia Biotech, Suède) 5 l of dNTP (nucleotide) 2.5 mM (Pharmacia Biotech, Sweden)
Eau distillée stérile qsp 49 l sterile distilled water to make 49 l
1 l Tfl polymerase à1 u./ l (Epicentre Technologies, USA) Appareil pour réaliser lescycles thermiquesde PCR appeléThermocycler modèle. 1 l Tfl polymerase to1 u. / L (Epicenter Technologies, USA) apparatus for performing PCR lescycles thermiquesde appeléThermocycler model.
Figure img00170003

IThermoieT"@ (Eurogentec#quibio. Belgiq : IThermoieT "@ (# Eurogentec quibio Belgiq.:
1 cycle 1 mn à 94 C 5 cycles : 20s à 94 C / 20sà37 C / 1mn à 72 C 30 cycles : 20s à 94 C / 20s à 50 C / 1mn à 72 C 1 cycle at 94 C 1 min 5 cycles: 20s 94 C / 20sà37 C / 1 min at 72 C 30 cycles: 20s 94 C / 20s 50 C / 1 minute 72 C
1 cycle : 4mn à 72 C 1 cycle: 4 minutes at 72 C
A la suite de l'amplification par PCR avec les amorces X25 et X18, deux fragments ont été obtenus dont l'un d'une taille proche de la taille attendue c'est-à-dire d'environ 700 pb. Following PCR amplification with the X25 and X18 primers, two fragments were obtained, one of a similar size the expected size that is to say of about 700 bp. Il a été élué à partir d'un gel (Nusieve GTG#, fournisseur PMC Bioproducts, USA) et introduit dans le plasmide pBluescript KS+ (Stratagene, USA) à l'aide des sites de restriction asp718I et BamHI prévus dans les amorces. It was eluted from a gel (GTG # Nusieve, PMC supplier Bioproducts, USA) and introduced into pBluescript KS + (Stratagene, USA) using Asp718I restriction sites BamHI and included in the primers. Le plasmide ainsi construit, appelé pBS ::GG, a été séquence pour s'assurer qu'il portait le fragment d'ADN souhaité, à savoir un fragment d'environ 700 pb flanqué des amorces X25 et X18et potentiellement susceptible d'être un fragment du gène codant pour la xylanase xynA. The plasmid thus constructed, called pBS :: GG, was sequenced to ensure it was the desired DNA fragment, ie a fragment of about 700 bp flanked by primers and X25 X18et potentially likely to be a gene fragment encoding the xylanase xynA.

De manière classique, le fragment du gène xynA d'environ 700 pb ainsi obtenu a ensuite servi de sonde (marquage DIG, Boehringer-Mannhcim, Allemagne) pour cribler une banque génomique de Thermoascus aurantiacus. Typically, the fragment of the xynA gene of about 700 bp thus obtained was then used as a probe (DIG labeling, Boehringer-Mannhcim, Germany) to screen a genomic library of Thermoascus aurantiacus. Cette banque a été construite dans Escherichia coli DH5[alpha] tk-, par restriction EcoRI de l'ADN génomique et clonage dans le site EcoRI (dephosphorylé par la Shrimp Alcaline Phosphatase, BoehringerMannheim) du vecteur pBluescript KS+ (Strategene, USA). This library was constructed in E. coli DH5 [alpha] tk, EcoRI restriction of the genomic DNA and cloning into the EcoRI site (dephosphorylated with Shrimp Alkaline Phosphatase, BoehringerMannheim) of the vector pBluescript KS + (Stratagene, USA).

Finalement, un plasmide de grande taille (20kb) fut retenu : pBS::Ta6-1 et partiellement séquence par séquençage double brin à partir d'amorces dans la région déjà séquencée. Finally, a large plasmid (20kb) was retained: pBS :: Ta6-1 and partially sequenced by double stranded sequencing from primers in the already sequenced region.

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Cette séquence a été référencée comme SEQ ID N 1. Elle comporte une partie du promoteur du gène xynA, sa partie codante débute avec l'ATG en position 859 et se termine avec le codon STOP TGA en position 2773. Cette partie codante du gène xynA comporte ) ! This sequence was referenced as SEQ ID NO 1. It comprises part of the promoter of the xynA gene, its coding portion starts with the ATG at position 859 and ends with the TGA stop codon at position 2773. The coding portion of the gene xynA features)! exons et 10 introns. exons and 10 introns. Le polypeptide codé se déduisant de cette séquence est estimé posséder 329 acides aminés, il comporte une séquence signal et une protéine mature, Il paraît probable que la séquence signal corresponde aux 26 premiers acides aminés. The encoded polypeptide sequence deduced from this is estimated to have 329 amino acids, it has a signal sequence and a mature protein, it seems likely that the signal sequence matches the first 26 amino acids. La séquence complète de ce polypeptide avec sa séquence signal estimée de 26 acides aminés est donnée en SEQ ID N 2. The complete sequence of the polypeptide with its estimated signal sequence of 26 amino acids is given in SEQ ID NO 2.

Enfin, la séquence d'ADN référencée comme SEQ ID N 1 comprend une partie du terminateur. Finally, the DNA sequence referenced as SEQ ID NO 1 comprises a portion of the terminator.

La séquence d'ADNc correspondant à la séquence d'ADN génomique codante du gène xynA peut être obtenue plus aisément maintenant qu'elle est connue, à partir d'ARN, ou synthétisée directement. The cDNA sequence corresponding to the coding genomic DNA sequence of the xynA gene can be obtained more easily now that it is known, from RNA, or synthesized directly.

La comparaison de la séquence d'acides aminés correspondant à la protéine mature ainsi déduite a été comparée comme déjà indiqué avec la séquence publiée en 1991, le taux d'homologie est de 59 %. Comparing the amino acid sequence corresponding to the mature protein thus deduced was compared as already indicated with the sequence published in 1991, the degree of homology is 59%.

TABLEAU 2 Micro-organisme donneur Famille glycosyl- % d'identité avec la partie hydrolase mature de la xylanase correspondant à SEQ ID TABLE 2 Microorganism glycosyl donor Family% identity with the hydrolase mature portion of the xylanase corresponding to SEQ ID

Figure img00180001

<tb> <Tb>
<tb> N 2 <Tb> N 2
<tb> Cellulomonas <SEP> fimi <SEP> 10 <SEP> 40 <Tb> Cellulomonas <September> fimi <September> 10 <September> 40
<tb> Fusarium <SEP> oxysporum <SEP> CelF <SEP> 10 <SEP> 47 <Tb> Fusarium <September> oxysporum <September> CELF <September> 10 <September> 47
<tb> <Tb>

Figure img00180002

Pseudomonas j1uorescens 10 22 Pseudomonas j1uorescens October 22
Figure img00180003

<tb> <Tb>
<tb> Aspergillus <SEP> nidulans <SEP> XlnC <SEP> 10 <SEP> 62 <Tb> Aspergillus <September> nidulans <September> XLNC <September> 10 <September> 62
<tb> Pénicillium <SEP> chrysogenum <SEP> XlnA <SEP> 10 <SEP> 62 <Tb> Penicillium <September> chrysogenum <September> xlnA <September> 10 <September> 62
<tb> Myceliophtora <SEP> thermophila <SEP> 10 <SEP> 39 <Tb> Myceliophthora <September> thermophila <September> 10 <September> 39
<tb> Thermotoga <SEP> maritima <SEP> XynA <SEP> 10 <SEP> 11 <Tb> Thermotoga <September> maritima <September> XynA <September> 10 <September> 11
<tb> Termotoga <SEP> neapolilana <SEP> XynA <SEP> 10 <SEP> 11 <Tb> Termotoga <September> neapolilana <September> XynA <September> 10 <September> 11
<tb> Diclyoglomus <SEP> thermophilum <SEP> XynA <SEP> 10 <SEP> 32 <Tb> Diclyoglomus <September> thermophilum <September> XynA <September> 10 <September> 32
<tb> Prevotella <SEP> ruminicola <SEP> XynA <SEP> 10 <SEP> 28 <Tb> Prevotella <September> ruminicola <September> XynA <September> 10 <September> 28
<tb> <Tb>

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Dans le tableau 2 ci-dessus, toutes les glycosyl-hydrolases de la famille 10 citées In Table 2 above, all glycosyl hydrolases family 10 cited

Figure img00190001

sont des xylanases à l'exception de la cellobiohydrolasc de Cellulol1lollas fil1li et de l'cndoglucanase F de Fusarium oxysP rtll1l, Il permet de voir que les taux d'identité de la xylanasc XynA de Thcrmoascus avec les autres xylanascs de la famille 10 varient entre 11et 62 %. are xylanases except the cellobiohydrolasc of Cellulol1lollas fil1li and cndoglucanase F Fusarium oxysP rtll1l, he can see that identity rate of xylanasc XynA Thcrmoascus with other xylanascs family range from 10 11 and 62%. Ces xylanases de la famille 10 sont les xylanases les plus proches, car aucune identité significative, c'est-à-dire égale ou supérieure à 10 %, n'a pu être trouvée avec These xylanases of the family are the 10 closest xylanase since no significant identity, that is to say equal to or greater than 10% could be found with
Figure img00190002

des xylanases de la famille 11 comme les deux xylanases XlnI et Xlnll de Trichoderma reesei, la xylanase A d'Aspergillus uidulans ou la xylanase thermostable de Thermomyces lannginosns. xylanases from family 11 like the two xylanases XlnI Xlnll and Trichoderma reesei xylanase A Aspergillus uidulans or thermostable xylanase from Thermomyces lannginosns. EXEMPLE 2 : dans la souche de Trichoderma reesei LysC du gène de la xylanase A avec sa propre séquence signal et sous la dépendance du promoteur gpdA Example 2: in the strain of Trichoderma reesei LysC gene xylanase A with its own signal sequence and under the control of gpdA promoter
LysC est une souche de laboratoire de Trichoderma reesei sécrétant peu de protéines endogènes, ce qui permet une production relativement pure de la xylanase XynA. LysC is a laboratory strain of Trichoderma reesei secreting little endogenous proteins, which allows a relatively pure production of xylanase XynA. Elle a été transformée avec le plasmide pUT11122 dont la construction est décrite ci-dessous. It was transformed with the plasmid pUT11122 whose construction is described below.

A - Construction du plasmide pUT 1122 A - Construction of plasmid pUT 1122
Le plasmide pBS::Ta6-1, contenant le fragment d'ADN génomique portant le gène xynA, a été digéré par les enzymes Ncol et Hpal. Plasmid pBS :: Ta6-1 containing the genomic DNA fragment carrying the xynA gene, was digested with HpaI and NcoI enzymes. Les fragments obtenus ont été séparés par électrophorèse, et le fragment de 2kb portant le gène xynA, sa séquence signal et un morceau de son terminateur, a été élué du gel et purifié. The fragments obtained were separated by electrophoresis, and the 2kb fragment carrying the xynA gene, its signal sequence and a piece of its terminator, was eluted from the gel and purified. Ce fragment a été cloné dans un vecteur d'expression fongique à savoir le plasmide pAN52.1 (Punt et al., This fragment was cloned into a fungal expression vector namely pAN52.1 plasmid (Punt et al.,
1987, Gene, 56, pp. 1987, Gene, 56, pp. 117-124) de la façon suivante. 117-124) as follows. Le plasmide pAN52.1a été digéré par The plasmid was digested with pAN52.1a
BamHI puis traité par le fragment Klenow de l'ADN Polymerase 1 d'Escherichia coli de façon à remplir le bout cohésif (issu de la digestion par BamHI) pour obtenir un bout franc (donc propice à une ligation au résultat de la digestion par Hpal). BamHI and then treated with the Klenow fragment of DNA Polymerase 1 Escherichia coli so as to fill in the cohesive end (produced by digestion with BamHI) to obtain a blunt end (therefore suitable for ligation to the result of digestion with HpaI ). Ensuite, après dénaturation des enzymes par la chaleur, le plasmide a subi une digestion par Ncol. Then, after denaturation of the enzymes by heat, the plasmid was digested with NcoI. Une nouvelle dénaturation par la chaleur a été effectuée pour détruire Ncol avant la ligation. A new heat denaturation was done to destroy NcoI before ligation.

Les deux morceaux d'ADN ont alors été ligaturés (T4 Ligase Gibco BRL, 2 heures, Both pieces of DNA were then ligated (T4 ligase Gibco BRL, 2 hours
30 C). 30 C).

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Le plasmide obtenu, appelé pUT 1122 (figure 1) comporte une unité transcriptionnelle fongique permettant la production de la xylanase XynA. The resulting plasmid, designated pUT 1122 (Figure 1) comprises a fungal transcriptional unit for the production of xylanase XynA. Elle est She is

Figure img00200001

constituée du promoteur gpdA ( glyceraldeliyde phosphate dehydrogenase ) d'Aspergillus nitlulans, de la séquence signal native du gène de xyitA, du gène xynA de Thermoascus aiiratiliaciis, d'un fragment du teminateur natif du gène de xy"A, et du terminateur 1'1)C (tryptophane synthase) d'Aspergillus ni"l1, lalls En outre, le plasmide comporte une origine de réplication fonctionnelle dans Escherichia coli, et le gène bactérien bla ( beta-lactamase ) qui confère une résistance à l'ampicilline dans Escherichia coli, Ce vecteur ne comporte donc aucun marqueur de résistance fonctionnel en champignon et doit donc être utilisé en cotransformation avec un autre vecteur qui porte un gène de sélection fongique comme le plasmide pANS-1 (Punt et al, 1988, Fungal Genetic News Letter, 35, pp.25-30). consisting of the gpdA promoter (glyceraldeliyde phosphate dehydrogenase) Aspergillus nitlulans, the native signal sequence of xyitA gene, xynA gene Thermoascus aiiratiliaciis, a fragment of the native gene teminateur xy "A, and the terminator 1 ' 1) C (tryptophan synthase) Aspergillus or "l1, LALLS in addition, the plasmid contains an origin of replication functional in Escherichia coli, and bacterial bla gene (beta-lactamase) which confers ampicillin resistance in Escherichia coli This vector thus contains no functional resistance marker mushroom and must therefore be used in cotransformation with another vector which carries a fungal selection gene such as plasmid PANS-1 (Punt et al, 1988, fungal Genetic News Letter, 35, pp.25-30).

B - Protocole d'obtention des spores compétentes et transformation B - Protocol for obtaining competent spores and transformation
Le protocole d'obtention des cellules compétentes, c'est-à-dire de spores compétentes de la souche Trichoderma reesei LysC se trouvant dans un état physiologique favorable à la transformation, et de transformation est celui décrit par Calmels T., Parriche M., Durand H. et Tiraby G. (Curr. Gcnct., 1991, vol. 20, pp. 309- 314). The protocol for obtaining competent cells, that is to say competent spores of Trichoderma reesei strain LysC lying in a physiological condition favorable for processing, and processing is as described in Calmels T., Parriche M. Durand H. and G. Tiraby (Curr. Gcnct., 1991, vol. 20, pp. 309- 314).

Les étapes suivantes ont été mises en #uvre selon le susdit protocole : # obtention des spores compétentes, # cotransformation des spores compétentes à l'aide du plasmide pUT1122 et du plasmide pAN8-l. The following steps have been #uvre according to the above protocol: # obtaining competent spores # cotransformation competent spores using pUT1122 plasmid and plasmid-pAN8 l.

C - Analyse des transformants C - transforming Analysis
Parmi les colonies apparues sur milieu sélectif, une centaine sont repiquées sur différents milieux : - milieu GS (témoin), - milieu GS avec phléomycine pour déterminer les colonies ayant acquis le marqueur de résistance, - milieu BSM contenant du xylane de bouleau (Sigma) pour déterminer les colonies ayant acquis une activité xylanase. Among the colonies appearing on selective medium, a hundred are subcultured on different media: - medium GS (control) - medium GS with phleomycin for colonies that have acquired resistance marker, - medium BSM containing birchwood xylan (Sigma) for colonies having acquired a xylanase activity.

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Les colonies sélectionnées comme produisant la xylanase recombinante sont repiquées sur les mêmes trois milieux pour confirmation. The colonies selected as producing the recombinant xylanase are transplanted on the same three media for confirmation. Les colonies positives sont ensuite mises en culture sur milieu liquide GLCS pour la détermination précise de l'activité xylanase. Positive colonies are then cultured on GLCS liquid medium for the accurate determination of xylanase activity. Les souches recombinantes les plus performantes pour la production de xylanase thermostable XynA sont retenues. The most successful recombinant strains for the production of thermostable xylanase XynA are retained.

Une souche transformée appelée LysC-XynA-1a ainsi été sélectionnée. A transformed strain called LysC-XynA-1a thus been selected.

D - Propriétés de la souche transformée LysC-XynA-1 - Démonstration de la production de xylanase recombinante D - Properties of the strain transformed LysC-XynA-1 - Demonstration of the production of recombinant xylanase
Cette souche transformée LysC-XynA-1 et la souche non transformée LysC ont été cultivées en parallèle sur milieu liquide GLCS pendant 5 jours sous agitation (200 rpm) à 27 C. Les protéines produites dans le milieu de culture ont été récoltées par centrifugation et les préparations enzymatiques ainsi obtenues sous forme liquide ont été testées selon les protocoles définis dans le chapitre Milieux et méthodes. This transformed strain LysC-XynA-1 and the untransformed strain LysC were cultured in parallel on GLCS liquid medium for 5 days with stirring (200 rpm) at 27 C. The proteins produced in the culture medium were harvested by centrifugation and enzyme preparations obtained in liquid form were tested according to the procedures defined in chapter media and methods.

L'activité xylanase des milieux de culture après séparation de la biomasse de Trichoderma a été mesurée en U/ml selon le protocole défini ci-dessus. The xylanase activity of the culture media after separation of the biomass of Trichoderma was measured in U / ml according to the protocol defined above. La quantité de protéines a été également déterminée comme indiqué ci-dessus et les activités spécifiques par mg de protéines ont été calculées. The amount of protein was also determined as described above and the specific activity per mg protein were calculated.

Les résultats sont présentés dans le tableau 3 : The results are presented in Table 3:
TABLEAU 3 TABLE 3
Activités et activités spécifiques xylanases de la souche transformée LysC-XynA-1 et de la souche témoin LysC specific activities and activities of the xylanases strain transformed LysC-XynA-1 and the control strain LysC

Figure img00210001

<tb> <Tb>
<tb> Activité <SEP> Activité <SEP> spécifique <Tb> Activity <September> Activity <September> Specific
<tb> xylanases <SEP> xylanases <SEP> xylanases <SEP> xylanases <Tb> xylanase <September> xylanase <September> xylanase <September> xylanase
<tb> (avoine) <SEP> (bouleau) <SEP> (avoine) <SEP> (bouleau) <Tb> (oats) <September> (birch) <September> (oats) <September> (birch)
<tb> U/ml <SEP> U/ml <SEP> U/mg <SEP> U/mg <Tb> U / ml <September> U / ml <September> U / mg <September> U / mg
<tb> 50 C <SEP> 70 C <SEP> 50 C <SEP> 70 C <SEP> 50 C <SEP> 70 C <SEP> 50 C <SEP> 70 C <Tb> 50 C <September> 70 C <September> 50 C <September> 70 C <September> 50 C <September> 70 C <September> 50 C <September> 70 C
<tb> LysC-XynA-1 <SEP> 66,5 <SEP> 263 <SEP> il <SEP> 263 <SEP> 123 <SEP> 484 <SEP> 20 <SEP> 484 <Tb> LysC-XynA-1 <September> 66.5 <September> 263 <September> it <September> 263 <September> 123 <September> 484 <September> 20 <September> 484
<tb> LysC <SEP> (témoin) <SEP> 0,6 <SEP> 0,6 <SEP> 1,0 <SEP> 0,6 <SEP> 0,7 <SEP> 0,7 <SEP> 1,2 <SEP> 0,75 <Tb> LysC <September> (control) <September> 0.6 <September> 0.6 <September> 1.0 <September> 0.6 <September> 0.7 <September> 0.7 <September> 1 , 2 <September> 0.75
<tb> <Tb>

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LysC produit très peu de xylanases. LysC produces very little xylanase. Les xylanascs produites très faiblement par LysC voient leur activité décroître ou au moins ne pas augmenter à 70 C, elles ne sont pas thermostables. The xylanascs produced very weakly by LysC see their activity decreases or at least does not increase to 70 C, they are not heat-stable.

LysC-XynA-1 produit des quantités importantes de xylanascs et cette activité xylanolytiquc a un optimum d'activité supérieur ou égal à 70 C. De plus, un chauffage de 2 heures à 70 C des préparations obtenues avec LyxC-XynA-1 montre que ces activités xylanolytiques sont conservées. LysC-XynA-1 produced significant amounts of xylanascs xylanolytiquc and this activity has an optimum of activity higher than or equal to 70 C. In addition, heating for 2 hours at 70 C preparations obtained with LyxC-XynA-1 shows that xylanolytic these activities are maintained. On peut donc en conclure que LysC-XynA-1 produit à un niveau appréciable la xylanase thermostable XynA de Thermoascus. We can therefore conclude that LysC-XynA-1 product to an appreciable level thermostable xylanase XynA of Thermoascus.

Ces expériences ont été reprises avec une souche industrielle de Trichoderma reesei comme la souche CL 847 (Durand et al., 1984, Génétique des micro-organismes industriels, 9ème colloque SFM, pp. 39-50) transformée avec pUT1122 ou avec un These experiments were repeated with an industrial strain of Trichoderma reesei strain as the CL 847 (Durand et al., 1984, Genetics of Industrial Microorganisms, 9th symposium MFC, pp. 39-50) or transformed with pUT1122 with

Figure img00220001

plasmide du même type où la partie codante xyu.4 de Thermoascus aurandacus est sous la dépendance du promoteur cbhl de Trichoderma. plasmid of the same type in which the coding portion of Thermoascus xyu.4 aurandacus is under the control of cbhl promoter from Trichoderma. Ces souches cultivées industriellement en fermenteurs donnent des productivités élevées et des concentrations élevées de xylanase thermostable XynA dans le milieu de culture, ces concentrations élevées de xylanase thermostable XynA étant mesurées après traitement 2 à 3 heures à 70 C. Bien entendu, des résultats similaires peuvent être obtenus avec tout microorganisme industriel déjà utilisé industriellement pour la production d'enzymes. These industrial fermenters cultivated strains give high productivity and high concentrations of thermostable xylanase XynA in the culture medium, such high concentrations of thermostable xylanase XynA being measured after treatment 2 to 3 hours at 70 C. Of course, similar results can be obtained with any industrial microorganism already used industrially for the production of enzymes.

EXEMPLE 3 : de la xylanase thermostable XynA de Thermoascus en panification Example 3 thermostable xylanase XynA of Thermoascus in breadmaking
En panification, l'action des xylanases sur le xylane de la farine modifie les équilibres de répartition de l'eau dans les pâtes, ce qui améliore leurs qualités rhéologiques et permet d'obtenir des pains de meilleur volume. In breadmaking, the action of xylanase on the xylan flour changes the distribution of water balances in pasta, which improves their rheological qualities and allows for better volume breads. Par contre, les xylanases donnent souvent du collant à la pâte, ce qui est un défaut ennuyeux, car la pâte ne peut plus être travaillée en machine. By cons, xylanases often give sticky pulp, which is a boring default because the dough can not be worked by machine. La xylanase thermostable XynA selon l'invention peut être utilisée pour la préparation de pâte boulangère à partir de n'importe quel type de farine de blé pour la fabrication de différents pains, sans présenter de défauts de collants. The thermostable xylanase XynA according to the invention can be used for the preparation of bread dough from any type of wheat flour for the production of breads, without presenting tights defects. Elle peut être utilisée pure comme en combinaison avec d'autres enzymes telles qu'amylases, cellulases, oxydases, autres xylanases ou protéases. It can be used pure as in combination with other enzymes such qu'amylases, cellulases, oxidases, proteases or other xylanases.

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On a ajouté : . Was added. d'une part une préparation de xylanases de Trichoderma reesei du commerce, . firstly a xylanase preparation from Trichoderma reesei Trade. d'autre part la préparation de xylanases obtenue après culture de LysC-XynA-11 selon l'exemple 2, dans une panification française classique, avec une formule de pâte classique de type : farine 100 eau 65 levure pressée 2,5 sel 3 acide ascorbique 50 ppm amylase fongique. on the other hand the preparation of xylanases obtainable after culturing LysC-XynA-11 according to Example 2, a conventional French bread, with a conventional paste type of formula: flour 100 water 65 Pressed yeast 2.5 acid salt 3 ascorbic 50 ppm fungal amylase.

Par rapport au témoin, les deux préparations xylanolytiques de Trichoderma reesei et de Thermoascus donnent un gain de volume spécifique du pain de 10 à 15 %, étant entendu que l'essai avec la préparation de Trichoderma donne une pâte relativement collante, et risquant de poser problème lors du passage en machine, alors que l'essai avec celle de Thermoascus donne une pâte libre, passant en machine sans problème. Compared to the control, the two xylanolytic preparations of Trichoderma reesei and Thermoascus give a specific volume gain of 10 to 15% bread, provided that the test with the preparation of Trichoderma gives a relatively sticky dough, and that might pose problem during the machine run, whereas the test with that of Thermoascus gives a free dough, passing machine without problem.

De manière surprenante, la xylanase thermostable XynA de Thermoascus est intéressante en panification, alors que les températures de la fermentation panaire sont éloignées de son optimum d'activité. Surprisingly, thermostable xylanase XynA of Thermoascus is interesting in breadmaking, while temperatures of bread-making fermentation are remote from its optimum activity.

EXEMPLE 4 : de la xylanase XynA de Thermoascus en malterie ou en brasserie EXAMPLE 4 xylanase XynA of Thermoascus malting or brewery
Dans le domaine de la brasserie, les xylanes sont responsables de la diminution de la vitesse de filtration dans les moûts. In the field of brewing, xylan are responsible for the decrease in the filtration rate in musts. L'action des xylanases, en abaissant la viscosité, améliore la filtrabilité et permet un gain de productivité en salle de brassage. The action of xylanase, lowering the viscosity, improves filterability and provides a gain of brewhouse productivity.

Dans un essai de filtration standard, on voit que la xylanase XynA de Thermoascus obtenue selon l'exemple 2 permet d'améliorer la filtrabilité d'un brassin de In a standard filtration test, it is seen that the Thermoascus XynA xylanase obtained according to Example 2 is used to improve the filterability of a brew
50 %. 50%. Sa thermostabilité permet de l'ajouter très en amont, y compris lors du maltage. Its thermal stability allows to add very early stage, including during malting.

Une application particulièrement intéressante de la xylanase thermostable XynA de Thermoascus est la suivante. A particularly interesting application thermostable xylanase XynA of Thermoascus is this. Elle permet d'améliorer l'extraction de l'amidon des It improves the extraction of starch

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matières premières non maltées lors de leur hydrolyse par une alpha-amylase thermostable à 70 C. La xylanasc XynA de Thcrmoascus obtenue selon l'exemple 2, introduite lors de la liquéfaction ou de la cuisson des matières premières non maltées qui sont ajoutées au brassin permet en plus une amélioration du rendement d'extraction de l'amidon, et en conséquence une augmentation du degré alcoolique obtenu pour la bière. raw materials unmalted during their hydrolysis by a thermostable alpha-amylase at 70 C. The xylanasc XynA of Thcrmoascus obtained according to Example 2, introduced during liquefaction or cooking unmalted raw materials that are added to the brew allows in addition an improved extraction yield of the starch, and consequently an increase in the alcohol content obtained for beer.

Figure img00240001

EXEMPLE 5 : Stabilité de la xylannse A de T/#,mo(l!îcll,Ç MMc il la granulation des aliments pour volaille Example 5: Stability of xylannse A T / # mo (the icIL, G MMc it granulation of poultry feed
La xylanase XynA de Thermoascus produite selon l'exemple 2 et une préparation xylanolytique de Trichoderma reesei (complexe xylanolytique produit par une souche industrielle) ont été comparées dans un test in vitro de stabilité à la granulation, Xylanase XynA of Thermoascus produced according to Example 2 and xylanolytic preparation of Trichoderma reesei (xylanolytic complex produced by an industrial strain) were compared in an in vitro test of stability to pelleting,
Les deux enzymes ont été ajoutées en parallèle chacune dans une farine d'aliment (aliment sous forme pulvérulente avant granulation) pour volaille préalablement conditionnée à une humidité et une température similaires à celles qui sont rencontrées lors de la granulation des aliments(30 % d'humidité et 80 C). Both enzymes were added in parallel each in a food flour (in powder form food before granulation) for poultry preconditioned to a moisture and temperature similar to those encountered during granulation Food (30% humidity and 80 C). Les doses employées correspondent aux doses d'utilisation en alimentation animale soit 1400 U/kg de farine d'aliment. The doses used correspond to doses of use in animal feed or 1400 U / kg of food flour. Les enzymes sont intimement mélangées avec la farine d'aliment et maintenues à 80 C sous une légère pression pendant 30 secondes. The enzymes are intimately mixed with feed flour and maintained at 80 C under light pressure for 30 seconds. La farine d'aliment est alors refroidie rapidement par étalement sur une plaque de verre à 4 C. Les enzymes sont ensuite extraites des farines d'aliment par lavage à l'eau et leur activité dosée à l'aide d'une méthode spécialement adaptée au dosage des enzymes dans les aliments pour animaux comme par exemple la méthode de T. Cosson et al., 1998, Animal Feed Science and Technology. Meal feed is then rapidly cooled by spreading on a glass plate at 4 ° C. The enzymes are then extracted from the food flour by washing with water and their activity assayed using a method specially adapted the dosage of enzymes in animal feed such as the method of T. Cosson et al., 1998, animal feed Science and Technology. Le tableau ci-dessous donne les pourcentages d'activité xylanase trouvée pour chaque enzyme après traitement : The table below shows the percentages of xylanase activity found for each enzyme after treatment:
Figure img00240002

<tb> <Tb>
<tb> Pourcentage <SEP> d'activité <SEP> résiduelle <SEP> (%) <Tb> Percent <September> Activity <September> residual <September> (%)
<tb> XynA <SEP> 95,4 <SEP> <Tb> XynA <September> 95.4 <September>
<tb> xylanase <SEP> de <SEP> Trichoderma <SEP> 12,3 <Tb> xylanase <September> of <September> Trichoderma <September> 12.3
<tb> <Tb>

La thermostabilité de la xylanase A de Thermoascus aurantiacus lui confère une bonne stabilité dans les conditions de la granulation des aliments pour volaille, stabilité The thermostable xylanase A Thermoascus aurantiacus gives it good stability under the conditions of granulation of poultry feed, stability

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qui lui permet de rester active dans l'aliment et d'avoir un effet après ingestion de l'aliment par l'animal. which allows him to remain active in the food and have an effect after ingestion of the food by the animal.

La xylanase XynA de Thcrmosascus entraîne de plus une diminution de la viscosité d'une mouture de blé hydratée à 100 % (poids pour poids), incubée 2 heures à pH 4,8 et 40 C, au moins égale à celle de la xylanase de Trichoderma, dans le cadre d'un essai où les deux préparations enzymatiques ont été ajoutées directement, sans traitement thermique préalable à la mouture de blé hydratée. Xylanase XynA of Thcrmosascus causes a further decrease in the viscosity of a grind of 100% hydrated wheat (weight to weight), incubated 2 hours at pH 4.8 and 40 C, at least equal to that of the xylanase of Trichoderma, as part of a trial where the two enzyme preparations were added directly without prior heat treatment of hydrated wheat milling.

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LISTAGE DE SEQUENCES <110> LA SOCIETE LESAFFRE ET CIE <120> FRAGMENT D'ADN CODANT POUR LA XYLANASE THERMOSTABLE SEQUENCE LISTING <110> LESAFFRE THE COMPANY AND ICE <120> FRAGMENT DNA ENCODING XYLANASE HEAT STABLE
XynA DE THERMOASCUS <130> D17799 <140> <141> <160> 2 <170> PatentIn Vers. XynA OF Thermoascus <130> D17799 <140> <141> <160> 2 <170> PatentIn Vers. 2.0 <210> 1 <211> 2966 <212> ADN génomique <213> Thermoascus aurantiacus <220> <221> promoteur <222> (1)..(858) <220> <221> exon <222> (859)..(1102) <220> <221> intron <222> (1103)..(1177) <220> <221> exon <222> (1178)..(1218) <220> <221> intron <222> (1219)..(1292) <220> <221> exon <222> (1293)..(1341) <220> <221> intron <222> (1342)..(1409) <220> <221> exon <222> (1410)..(1531) <220> <221> intron 2.0 <210> 1 <211> 2966 <212> genomic DNA <213> Thermoascus aurantiacus <220> <221> promoter <222> (1) .. (858) <220> <221> exon <222> (859) .. (1102) <220> <221> intron <222> (1103) .. (1177) <220> <221> exon <222> (1178) .. (1218) <220> <221> intron <222 > (1219) .. (1292) <220> <221> exon <222> (1293) .. (1341) <220> <221> intron <222> (1342) .. (1409) <220> <221 > exon <222> (1410) .. (1531) <220> <221> intron

<Desc/Clms Page number 27> <Desc / CRUD Page number 27>

<222> (1532)..(1634) <220> <221> exon <222> (1635)..(1780) <220> <221> intron <222> (1781)..(1849) <220> <221> exon <222> (1850)..(1938) <220> <221> intron <222> (1939)..(2003) <220> <221> exon <222> (2004)..(2022) <220> <221> intron <222> (2023)..(2114) <220> <221> exon <222> (2115)..(2142) <220> <221> intron <222> (2143)..(2210) <220> <221> exon <222> (2211)..(2300) <220> <221> intron <222> (2301)..(2396) <220> <221> exon <222> (2397)..(2462) <220> <221> intron <222> (2463)..(2677) <220> <221> exon <222> (2678)..(2773) <220> <222> (1532) .. (1634) <220> <221> exon <222> (1635) .. (1780) <220> <221> intron <222> (1781) .. (1849) <220> <221> exon <222> (1850) .. (1938) <220> <221> intron <222> (1939) .. (2003) <220> <221> exon <222> (2004) .. (2022 ) <220> <221> intron <222> (2023) .. (2114) <220> <221> exon <222> (2115) .. (2142) <220> <221> intron <222> (2143) .. (2210) <220> <221> exon <222> (2211) .. (2300) <220> <221> intron <222> (2301) .. (2396) <220> <221> exon <222 > (2397) .. (2462) <220> <221> intron <222> (2463) .. (2677) <220> <221> exon <222> (2678) .. (2773) <220>

<Desc/Clms Page number 28> <Desc / CRUD Page number 28>

<221> terminateur <222> (2774)..(2966) <400> 1 taaccttcta acattcccta agacagaccg ttaagggtaa tccgtcgtga cataaggacg 60 tggataatac tccgttggtc gaggttcgct tgatcgagc caggggegaa acatggttct 120 ccccaccacg gtaagtcgcc taaatctagg gttgaaaatt ccgggccgtt aaagctacct 100 accctttctg tcaatgatcc gacgaggggg ggcatctctg cagagttctc cacattcaaa 240 tcggggtcag tacagtggta accgctggga ttaatttagg ctaaagcagt gatgtcacct 300 tattatttat cattgctatt atgtacataa aacaaccgag gagcgaacaa ggcaaaccac 360 cgacgagaac aatggtttgg tttacttttc ttcgacattg cggggcctct tggatcgcga 420 tgtccttttg tccttttctc ccgtcgaaga gagggaaaac agcctgaatg tgaacaatga 480 attgaatttt tccaccacat gtttgcattg ttcgttgagt aagtccaatc accttttaga 540 tgtttagtgg tttggtatta ttagcccctg gaagagacgc tggccttgtg gggtactcct 600 agctaaaatt catgtaagac ataggggctg ttgtaaacga gactttaacc aaactgttac 660 gaccggcaac aagttgcatg attgatgtgt aagatgtccc tgttcgggtc tcaaggggat 720 agttagatgc aaaggtactg tatttgggta tatatatcgt tcaaatgtcg gttccattgc 780 ccttccttca gagatcaatc actacttaaa atctgactgc a <221> terminator <222> (2774) .. (2966) <400> 1 taaccttcta acattcccta agacagaccg ttaagggtaa tccgtcgtga cataaggacg 60 tggataatac tccgttggtc gaggttcgct tgatcgagc caggggegaa acatggttct 120 ccccaccacg gtaagtcgcc taaatctagg gttgaaaatt ccgggccgtt aaagctacct 100 accctttctg tcaatgatcc gacgaggggg ggcatctctg cagagttctc cacattcaaa 240 tcggggtcag tacagtggta accgctggga ttaatttagg ctaaagcagt gatgtcacct 300 tattatttat cattgctatt atgtacataa aacaaccgag gagcgaacaa ggcaaaccac 360 cgacgagaac aatggtttgg tttacttttc ttcgacattg cggggcctct tggatcgcga 420 tgtccttttg tccttttctc ccgtcgaaga gagggaaaac agcctgaatg tgaacaatga 480 attgaatttt tccaccacat gtttgcattg ttcgttgagt aagtccaatc accttttaga 540 tgtttagtgg tttggtatta ttagcccctg gaagagacgc tggccttgtg gggtactcct 600 agctaaaatt catgtaagac ataggggctg ttgtaaacga gactttaacc aaactgttac 660 gaccggcaac aagttgcatg attgatgtgt aagatgtccc tgttcgggtc tcaaggggat 720 agttagatgc aaaggtactg tatttgggta tatatatcgt tcaaatgtcg gttccattgc 780 ccttccttca gagatcaatc actacttaaa has atctgactgc tcaactact tacttgcctc 840 cttacctact aagaagccat ggttcgacca acgatcctac ttacttcact cctgctagct 900 cccttcgcag ctgcgagccc tatcctcgag gaacgccaag ctgcacagag tgtcgaccaa 960 ctgatcaagg ctcgcggcaa ggtgtacttt ggcgtcgcca cggaccaaaa ccggctgacg 1020 accggcaaga atgcggctat catccaggct gatttcggcc aggtcacgcc ggagaatagt 1080 atgaaatggg acgctactga acgtgcgtga gaaagataat ttgatttttt tttcttctat 1140 gaccgctcgg accgttctga ctaggtttat aatatagctt ctcaaggaaa ctttaacttt 1200 gccggtgctg attaccttgt acgtacatac gaccacttga cgtttcttgc acgcaactgc 1260 gatcgaggag aagatactaa tcttcttgaa aggtcaattg ggcccagcaa aatggaaagc 1320 tgatccgtgg ccatactctt ggttagtaga acgccaacct gcttccctaa cttagtgaag 1380 aaggaaaacc gaattgaccg tcccccaagt atggcactcg cagctgccct cgtgggtgag 1440 ctccatcacc gacaagaata cgctgaccaa cgtgatgaaa aatcacatca ccaccttgat 1500 gacccggtac aagggcaaga tccgtgcatg ggtcagtcat cctaccctaa gctgcgtttc 1560 aatgaagaga caaataagaa cacacgtatt tgtccgggcg tttcagaatc agaactgaca 1620 gaatcactga ataggacgtg gtgaacgagg cattcaacga ggatggctcc tcaactact tacttgcctc 840 cttacctact aagaagccat ggttcgacca acgatcctac ttacttcact cctgctagct 900 cccttcgcag ctgcgagccc tatcctcgag gaacgccaag ctgcacagag tgtcgaccaa 960 ctgatcaagg ctcgcggcaa ggtgtacttt ggcgtcgcca cggaccaaaa ccggctgacg 1020 accggcaaga atgcggctat catccaggct gatttcggcc aggtcacgcc ggagaatagt 1080 atgaaatggg acgctactga acgtgcgtga gaaagataat ttgatttttt tttcttctat 1140 gaccgctcgg accgttctga ctaggtttat aatatagctt ctcaaggaaa ctttaacttt 1200 gccggtgctg attaccttgt acgtacatac gaccacttga cgtttcttgc acgcaactgc 1260 gatcgaggag aagatactaa tcttcttgaa aggtcaattg ggcccagcaa aatggaaagc 1320 tgatccgtgg ccatactctt ggttagtaga acgccaacct gcttccctaa cttagtgaag 1380 aaggaaaacc gaattgaccg tcccccaagt atggcactcg cagctgccct cgtgggtgag 1440 ctccatcacc gacaagaata cgctgaccaa cgtgatgaaa aatcacatca ccaccttgat 1500 gacccggtac aagggcaaga tccgtgcatg ggtcagtcat cctaccctaa gctgcgtttc 1560 aatgaagaga caaataagaa cacacgtatt tgtccgggcg tttcagaatc agaactgaca 1620 gaatcactga ataggacgtg gtgaacgagg cattcaacga ggatggctcc ctccgccaga 1680 ctgtcttcct caacgtcatc ggggaggatt acatcccgat tgctttccag accgcccgcg 1740 ccgctgaccc gaatgccaag ctgtacatca acgattacaa gtaagattta aggctcagtg 1800 atattccatt tagtgtgaga agcattgctt atgagcatct gtattacagc ctcgacagtg 1860 cctcgtaccc caagacgcag gccattgtca accgcgtcaa gcaatggcgt gcagctggag 1920 tcccgattga cggcataggt atgtctcact ttctgtttgt gatgtgaccg atctgaaacc 1980 agtctaacgt tagctgggtc taggatcgca aacgcacctc aggtaaataa tcgggaatgc 2040 ctcggagaat aaaagagaaa aaaatgattg tcttatcaga tcgtatcgac tgactcatgg 2100 cttgtccaaa atagcgctgg tcagggagcc agtgttctac aataagtgcc cccctcccct 2160 attttgtttc ctattattgc gagaacggaa caggctgaca accccaaacg gctcttccgc 2220 tccttgctag tgccggaact cccgaggtcg ctatcacgga actggacgtg gctggtgcta 2280 ctccgccaga 1680 ctgtcttcct caacgtcatc ggggaggatt acatcccgat tgctttccag accgcccgcg 1740 ccgctgaccc gaatgccaag ctgtacatca acgattacaa gtaagattta aggctcagtg 1800 atattccatt tagtgtgaga agcattgctt atgagcatct gtattacagc ctcgacagtg 1860 cctcgtaccc caagacgcag gccattgtca accgcgtcaa gcaatggcgt gcagctggag 1920 tcccgattga cggcataggt atgtctcact ttctgtttgt gatgtgaccg atctgaaacc 1980 agtctaacgt tagctgggtc taggatcgca aacgcacctc aggtaaataa tcgggaatgc 2040 ctcggagaat aaaagagaaa aaaatgattg tcttatcaga tcgtatcgac tgactcatgg 2100 cttgtccaaa atagcgctgg tcagggagcc agtgttctac aataagtgcc cccctcccct 2160 attttgtttc ctattattgc gagaacggaa caggctgaca accccaaacg gctcttccgc 2220 tccttgctag tgccggaact cccgaggtcg ctatcacgga actggacgtg gctggtgcta 2280

<Desc/Clms Page number 29> <Desc / CRUD Page number 29>

gctcgacgga ttacgtcaat gtatgtactt cgttgtccct atcccccttg gatactttgt 2340 ataattatct tcccggagcc tgttgatcag atctgacgat catttctcgt ttttaggtcg 2400 tgaacgcttg cctcaacgtg cagtcctgcg tgggcatcac cgtctggggc gtggcagatc 2460 cggtaagcgc ggttcttccg tactccgtac ccaactagac gttcgggctg tcacgtcatg 2520 tcttaagtcg tctgcagtca ggccaaggcc aagacacagg acctgaaacg ggcaggcagc 2580 agctgctaag cagcccaaga agcagccaca tgatgcatga ttattattat tatatctccg 2640 agttctgggc taacgattgg tgataataaa taaataggac tcgtggcgtg ctagcacgac 2700 gcctctcctc ttcgacggca acttcaaccc gaagccggcg tacaacgcca ttgtgcagga 2760 cctgcagcag tgagtataga acggaacaga gtagtaagtc cggcaggact ttctattatt 2820 ttctctcctt ttttttcatt tcttcgatgg attgttaaca agtttcttca cagaaacagc 2880 aatagcaata acaacaacgc cgtcctcaaa gtaagcggaa agtgcgcatg atgggtgggt 2940 aaagtactgt acctaagtac tatgca 2966 <210> 2 <211> 329 <212> PRT <213> Thermoascus aurantiacus <400> 2 Met Val Arg Pro Thr Ile Leu Leu Thr Ser Leu Leu Leu Ala Pro Phe gctcgacgga ttacgtcaat gtatgtactt cgttgtccct atcccccttg gatactttgt 2340 ataattatct tcccggagcc tgttgatcag atctgacgat catttctcgt ttttaggtcg 2400 tgaacgcttg cctcaacgtg cagtcctgcg tgggcatcac cgtctggggc gtggcagatc 2460 cggtaagcgc ggttcttccg tactccgtac ccaactagac gttcgggctg tcacgtcatg 2520 tcttaagtcg tctgcagtca ggccaaggcc aagacacagg acctgaaacg ggcaggcagc 2580 agctgctaag cagcccaaga agcagccaca tgatgcatga ttattattat tatatctccg 2640 agttctgggc taacgattgg tgataataaa taaataggac tcgtggcgtg ctagcacgac 2700 gcctctcctc ttcgacggca acttcaaccc gaagccggcg tacaacgcca ttgtgcagga 2760 cctgcagcag tgagtataga acggaacaga gtagtaagtc cggcaggact ttctattatt 2820 ttctctcctt ttttttcatt tcttcgatgg attgttaaca agtttcttca cagaaacagc 2880 aatagcaata acaacaacgc cgtcctcaaa gtaagcggaa agtgcgcatg atgggtgggt 2940 aaagtactgt acctaagtac tatgca 2966 <210> 2 <211> 329 <212> PRT <213> Thermoascus aurantiacus <400 > 2 Met Val Arg Leu Leu Pro Thr Ile Thr Ser Leu Leu Leu Phe Ala Pro
1 5 10 15 Ala Ala Ala Ser Pro Ile Leu Glu Glu Arg Gln Ala Ala Gln Ser Val January 5 10 15 Ala Ala Ala Ser Pro Glu Glu Ile Leu Arg Gln Ala Ala Ser Gln Val
20 25 30 Asp Gln Leu Ile Lys Ala Arg Gly Lys Val Tyr Phe Gly Val Ala Thr 20 25 30 Gln Asp Leu Ile Lys Ala Gly Arg Lys Val Tyr Phe Gly Val Ala Thr
35 40 45 Asp Gln Asn Arg Leu Thr Thr Gly Lys Asn Ala Ala Ile Ile Gln Ala 35 40 45 Asp Gln Asn Arg Leu Thr Gly Thr Lys Asn Ala Ala Ile Ile Gln Ala
50 55 60 Asp Phe Gly Gln Val Thr Pro Glu Asn Ser Met Lys Trp Asp Ala Thr 50 55 60 Asp Phe Gln Gly Val Thr Pro Glu Asn Ser Met Trp Asp Lys Ala Thr
65 70 75 80 Glu Pro Ser Gln Gly Asn Phe Asn Phe Ala Gly Ala Asp Tyr Leu Val 65 70 75 80 Pro Glu Ser Gln Gly Asn Asn Phe Phe Ala Gly Ala Leu Asp Tyr Val
85 90 95 Asn Trp Ala Gln Gln Asn Gly Lys Leu Ile Arg Gly His Thr Leu Val 85 90 95 Trp Asn Ala Gln Gln Leu Lys Asn Gly Gly Ile Arg Leu His Thr Val
100 105 110 Trp His Ser Gln Leu Pro Ser Trp Val Ser Ser Ile Thr Asp Lys Asn 100,105,110 Trp His Ser Leu Gln Ser Pro Trp Thr Val Ser Ser Ile Lys Asp Asn
115 120 125 Thr Leu Thr Asn Val Met Lys Asn His Ile Thr Thr Leu Met Thr Arg 115 120 125 Thr Leu Thr Asn Met Val Lys Asn His Ile Thr Thr Leu Met Thr Arg
130 135 140 130 135 140
Tyr Lys Gly Lys Ile Arg Ala Trp Asp Val Val Asn Glu Ala Phe Asn Tyr Lys Gly Lys Ile Arg Ala Trp Asp Val Val Asn Glu Ala Phe Asn
145 150 155 160 145 150 155 160
Glu Asp Gly Ser Leu Arg Gln Thr Val Phe Leu Asn Val Ile Gly Glu Glu Asp Gly Ser Leu Arg Leu Gln Thr Val Phe Asn Val Ile Gly Glu
165 170 175 165 170 175

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Asp Tyr Ile Pro Ile Ala Phe Gln Thr Ala Arg Ala Ala Asp Pro Asn Asp Ile Tyr Pro Ile Ala Gln Phe Thr Arg Ala Ala Ala Asp Pro Asn
180 185 190 Ala Lys Leu Tyr Ile Asn Asp Tyr Asn Leu Asp Ser Ala Ser Tyr Pro 180 185 190 Ala Lys Leu Tyr Ile Asn Asp Tyr Asn Leu Asp Ser Ala Ser Tyr Pro
195 200 205 Lys Thr Gln Ala Ile Val Asn Arg Val Lys Gln Trp Arg Ala Ala Gly 195 200 205 Lys Thr Gln Ala Asn Ile Val Lys Val Arg Gln Ala Ala Trp Arg Gly
210 215 220 Val Pro Ile Asp Gly Ile Gly Ser Gln Thr His Leu Ser Ala Gly Gln 225 230 235 240 Gly Ala Ser Val Leu Gln Ala Leu Pro Leu Leu Ala Ser Ala Gly Thr 210 215 220 Pro Val Ile Asp Gly Ile Gly Ser Thr His Gln Leu Ser Ala Gly Gln 225 230 235 240 Gly Ala Ser Val Leu Gln Ala Leu Pro Leu Leu Ala Ser Ala Gly Thr
245 250 255 Pro Glu Val Ala Ile Thr Glu Leu Asp Val Ala Gly Ala Ser Ser Thr 245 250 255 Val Pro Glu Ala Ile Glu Thr Leu Val Asp Ala Gly Ala Ser Ser Thr
260 265 270 Asp Tyr Val Asn Val Val Asn Ala Cys Leu Asn Val Gln Ser Cys Val 260 265 270 Tyr Asp Val Asn Val Asn Ala Val Cys Leu Asn Val Gln Cys Ser Val
275 280 285 Gly Ile Thr Val Trp Gly Val Ala Asp Pro Asp Ser Trp Arg Ala Ser 275 280 285 Gly Ile Val Trp Thr Gly Val Ala Asp Pro Asp Ser Trp Arg Ala Ser
290 295 300 Thr Thr Pro Leu Leu Phe Asp Gly Asn Phe Asn Pro Lys Pro Ala Tyr 305 310 315 320 Asn Ala Ile Val Gln Asp Leu Gln Gln 290 295 300 Thr Thr Pro Leu Leu Phe Asp Gly Asn Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Lys 305 310 315 320 Asn Ala Val Gln Asp Ile Leu Gln Gln
325 325

Claims (16)

  1. REVENDICATIONS 1. Fragment d'ADN, susceptible d'être isolé à partir d'un champignon thermophile appartenant au genre Thcrmoascus ou appartenant à la même famille et codant pour un polypeptide thermostable ayant une activité enzymatique xylanase, de séquence nucléique choisie parmi les séquences suivantes : a) la séquence SEQ ID N 1 ou la séquence de l'un de ses fragments d'au moins 300 nucléotides, de préférence d'au moins 500 nucléotides et encore de préférence d'au moins 700 nucléotides ; CLAIMS 1. A DNA fragment which can be isolated from a thermophilic fungus belonging to the genus Thcrmoascus or belonging to the same family and encoding a thermostable polypeptide having a xylanase enzymatic activity, nucleic sequence selected from the following sequences a) the sequence SEQ ID 1 or the sequence of a fragment thereof of at least 300 nucleotides, preferably at least 500 nucleotides and more preferably at least 700 nucleotides; b) la séquence complémentaire à l'une des séquences telles que définies en a) ; b) the complementary sequence to one of the sequences as defined in a); c) une séquence présentant une identité d'au moins 60 %, de préférence au moins 70 % et encore de préférence au moins 75 % avec l'une des séquences telles que définies ena)oub); c) a sequence having an identity of at least 60%, preferably at least 70% and more preferably at least 75% using one of the sequences as defined ena) orb); d) une séquence codant pour un polypeptide ayant une activité xylanase et dont la séquence d'acides aminés présente une identité d'au moins 70 %, de préférence au moins 80 % et encore de préférence au moins 85 % avec la séquence d'acides aminés d'un polypeptide codé par l'une des séquences telles que définies en a) ou b) ou c). d) a sequence encoding a polypeptide having xylanase activity and whose amino acid sequence has an identity of at least 70%, preferably at least 80% and more preferably at least 85% with the amino acid sequence amino of a polypeptide encoded by one of the sequences as defined in a) or b) or c).
  2. 2. Fragment d'ADN selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est issu d'un champignon appartenant au genre Thermoascus et qu'il code pour une xylanase thermostable du groupe 10. 2. A DNA fragment according to claim 1, characterized in that it is derived from a fungus belonging to the genus Thermoascus and that encodes a thermostable xylanase group 10.
  3. 3. Fragment d'ADN selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que sa séquence comprend tout ou partie de la séquence du promoteur et/ou de la séquence terminatrice et/ou de la séquence signal de la séquence SEQ ID N 1. 3. A DNA fragment according to one of Claims 1 or 2, characterized in that its sequence comprises all or part of the promoter sequence and / or terminator sequence and / or the signal sequence of the sequence SEQ ID N 1.
  4. 4. Fragment d'ADN selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comprend en outre l'une au moins des séquences suivantes : a) une séquence hétérologue de promoteur constitutif et non réprimé ou une séquence hétérologue de promoteur inductible fort ; 4. A DNA fragment according to one of claims 1 to 3, characterized in that it further comprises at least one of the following sequences: a) a heterologous sequence constitutive promoter and unchecked or a heterologous sequence inducible strong promoter; b) une séquence hétérologue terminatrice ; b) a heterologous terminator sequence; c) une séquence signal hétérologue. c) a heterologous signal sequence.
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  5. 5. Fragment d'ADN selon la revendication 4, caractérisé en ce que ledit promoteur 5. A DNA fragment according to claim 4, characterized in that said promoter
    Figure img00320001
    constitutif et non réprimé est le promoteur gpdA d'A.vjcrillrrs nidulans ou en ce que le promoteur inductiblc fort est le promoteur cbhl de 1>-icliolet-lela reesei, constituent and unchecked is the gpdA promoter of A. nidulans or A.vjcrillrrs in that the inductiblc strong promoter is the promoter of cbh 1> -icliolet-lela reesei
  6. 6. Construction d'ADN caractérisée en ce qu'elle comprend un fragment d'ADN selon l'une des revendications 1à 5 et les éléments nécessaires pour l'expression dudit fragment d'ADN dans une cellule hôte. 6. Construction of DNA characterized in that it comprises a DNA fragment according to one of claims 1 to 5 and the elements necessary for expression of said DNA fragment in a host cell.
  7. 7. Polypeptide thermostable ayant une activité enzymatique xylanase codé par un fragment d'ADN selon l'une des revendications 1 à 5 ou par une construction d'ADN selon la revendication 6. 7. A polypeptide having a thermostable xylanase enzyme activity encoded by a DNA fragment according to one of claims 1 to 5 or a DNA construct according to claim 6.
  8. 8. Polypeptide selon la revendication 7 de séquence d'acides aminés SEQ ID N 2 ou polypeptide de séquence d'acides aminés SEQ ID N 2 dans lequel le fragment peptidique correspondant au peptide signal est délété. 8. The polypeptide of claim 7 amino acid sequence SEQ ID NO: 2 or polypeptide sequence of amino acids SEQ ID NO 2, wherein the peptide fragment corresponding to the signal peptide is deleted.
  9. 9. Cellule hôte, procaryote ou eucaryote, comprenant un fragment d'ADN selon l'une des revendications 1 à 5 ou une construction d'ADN selon la revendication 6. 9. A host cell, prokaryotic or eukaryotic, comprising a DNA fragment according to one of claims 1 to 5 or a DNA construct according to claim 6.
  10. 10. Cellule hôte selon la revendication 9, caractérisée en ce que ladite cellule est une bactérie, une levure ou un champignon filamenteux, 10. A host cell according to claim 9, characterized in that said cell is a bacterium, a yeast or a filamentous fungus,
  11. 11. Cellule hôte selon la revendication 10, caractérisée en ce que ladite bactérie est du genre Bacillus, ladite levure du genre Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Hansenula ou Yarrowia et le champignon filamenteux du genre Aspergillus, Trichoderma, Fusarium, Humicola, Tolypocladium, Thermoascus, Pénicillium, Talaromyces, Sporotrichum, Beauvaria ou Hypocrea. 11. A host cell according to claim 10, characterized in that said bacterium is of the genus Bacillus, said yeast of the genus Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Hansenula or Yarrowia and the filamentous fungus of the genus Aspergillus, Trichoderma, Fusarium, Humicola, Tolypocladium, Thermoascus , Penicillium, Talaromyces, Sporotrichum, Beauveria or Hypocrea.
  12. 12. Cellule hôte selon l'une des revendications 10 à 11, caractérisée en ce que ladite cellule est choisie parmi les cellules ne produisant pas à l'état naturel de xylanase ou parmi les cellules ne produisant pas à l'état naturel de xylanase et d'autres hydrolases comme des cellulases. 12. A host cell according to one of claims 10 to 11, characterized in that said cell is selected among cells not producing naturally occurring xylanase or among cells which do not produce naturally occurring xylanase and other hydrolases such as cellulases.
  13. 13. Procédé de production de xylanase thermostable caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) la culture sur un milieu adéquat d'une cellule selon l'une des revendications 9 à 12 ; 13. A process for producing thermostable xylanase characterized in that it comprises the following steps: a) cultivating on a suitable medium of a cell according to one of claims 9 to 12; b) la récupération de ladite xylanase à partir du milieu de culture ou des cellules obtenues à l'étape a). b) recovering said xylanase from the culture medium or the cells obtained in step a).
  14. 14. Xylanase obtenue par un procédé selon la revendication 13. 14. A xylanase obtainable by a process according to claim 13.
    <Desc/Clms Page number 33> <Desc / CRUD Page number 33>
  15. 15. Utilisation de la xylanase selon la revendication 14 ou d'un polypeptide selon l'une des revendications 7 et 8 pour l'hydrolyse de tout substrat végétal contenant des hémicclluloscs, notamment dans le domaine de l'alirncntation animale, de la brasserie et de la malterie, 15. Use of the xylanase according to claim 14 or a polypeptide according to one of Claims 7 and 8 for the hydrolysis of any plant substrate containing hémicclluloscs, particularly in the field of animal alirncntation, brewing and malting,
  16. 16. Utilisation de la xylanase selon la revendication 14 ou d'un polypeptide selon l'une des revendications 7 et 8 pour la panification. 16. Use of the xylanase according to claim 14 or a polypeptide according to one of Claims 7 and 8 for breadmaking.
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