FR2750221A1

FR2750221A1 - Optical microscope alignment device

Info

Publication number: FR2750221A1
Application number: FR9607840A
Authority: FR
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1996-06-25
Filing date: 1996-06-25
Publication date: 1997-12-26

Abstract

The device includes a laser which generates a light beam transmitted through a microscope objective towards the surface of a sample. The reflected beam is transmitted through the objective, reflected by a beam splitter (S2) and focused in a point A3. When the microscope is aligned the point A3 is in a plane normal to the optical axis of the system. A detector (D) determines the position of the point A3 relative to that of the plane. It also triggers the microscope alignment when the point is not in the plane.

Description

Le réglage de mise au point d'un microscope optique est généralement fait manuellement, même si le microscope est équipé d'un appareil de prise de vues ou d'une caméra. Pour des observations immédiates lorsque l'utilisateur doit rester à proximité du microscope, cette nécessité de réglage manuel ne constitue généralement pas un problème majeur.The focus adjustment of an optical microscope is usually done manually, even if the microscope is equipped with a camera or camera. For immediate observations when the user has to stay close to the microscope, this need for manual adjustment is generally not a major problem.

Cependant, de plus en plus souvent, des observations microscopiques s'intègrent dans des processus automatisés. C'est le cas par exemple pour les examens et comptages bactériologiques sur échantillons multiples, et pour le suivi de cultures cellulaires nécessitant des examens à intervalles de temps réguliers. I1 est nécessaire de refaire périodiquement le réglage de la mise au point du microscope, soit suite à un déplacement ou un changement de l'échantillon, soit simplement pour compenser les dérives des structures mécaniques. Un réglage simplement manuel est tout à fait inadapté à ce genre de situations.However, more and more often, microscopic observations are integrated into automated processes. This is the case, for example, for bacteriological examinations and counts on multiple samples, and for monitoring cell cultures requiring examinations at regular time intervals. It is necessary to periodically redo the adjustment of the focusing of the microscope, either following a displacement or a change of the sample, or simply to compensate for the drifts of the mechanical structures. Simply manual adjustment is completely unsuitable for this kind of situation.

Certains dispositifs ont été imaginés pour rendre automatiques ces réglages de mise au point. Ces systèmes se composent essentiellement d'une partie détection qui permet de dire si la mise au point est réalisée, et d'une partie actionneur qui agit mécaniquement sur le réglage du microscope au cas où la mise au point doit être retouchée. Le fonctionnement de la partie détection repose généralement sur l'analyse de l'image fournie par le microscope, cette image étant saisie par une caméra et traitée par logiciel. La critère de mise au point est basé sur l'optimisation du contraste ou des hautes fréquences spatiales de l'image. Ce mode de caractérisation de la mise au point est directement inspiré de la démarche humaine de l'utilisateur qui règle le microscope en fonction de l'image qu'il observe.Some devices have been devised to make these focus adjustments automatic. These systems essentially consist of a detection part which makes it possible to say whether the focusing is carried out, and an actuator part which acts mechanically on the adjustment of the microscope in case the focusing has to be retouched. The operation of the detection part is generally based on the analysis of the image provided by the microscope, this image being captured by a camera and processed by software. The focus criterion is based on the optimization of the contrast or high spatial frequencies of the image. This mode of characterization of the focus is directly inspired by the human approach of the user who adjusts the microscope according to the image he observes.

Régler la mise au point d'un microscope consiste à placer le plan d'observation P, défini par la construction du microscope, dans le plan de l'échantillon qui intéresse l'observateur.Adjusting the focus of a microscope consists of placing the observation plane P, defined by the construction of the microscope, in the plane of the sample which interests the observer.

Un tel réglage revient donc à placer le plan de ltéchantillon à examiner à une distance bien définie du plan principal objet de l'objectif.Such an adjustment therefore amounts to placing the plane of the sample to be examined at a well-defined distance from the main plane object of the objective.

La présente invention concerne un dispositif de caractérisation de mise au point destiné à être intégré dans un microscope optique. Un faisceau lumineux issu de l'objectif du microscope se réfléchit sur une surface solidaire de ltéchantillon. Cette réflexion permet d'ajuster la distance surface réfléchissante/objectif, donc la distance échantillon/objectif c'est à dire la distance de mise au point. La surface réfléchissante peut être de toute nature.The present invention relates to a focusing characterization device intended to be integrated into an optical microscope. A light beam from the microscope objective is reflected on a surface integral with the sample. This reflection makes it possible to adjust the distance between the reflecting surface and the objective, therefore the distance between the sample and the objective, that is to say the focusing distance. The reflecting surface can be of any kind.

I1 peut s'agir par exemple de la surface de l'échantillon elle même, ou d'une surface de lamelle couvre-objet ou porte-objet dans le cas d'observation d'objets biologiques. It can be for example the surface of the sample itself, or a surface of a coverslip or an object holder in the case of observation of biological objects.

Le schéma général est porté sur la figure 1. Un faisceau, qui peut être visible ou infrarouge est issu d'un point lumineux A1 situé sur l'axe optique dans un plan Hi perpendiculaire à cet axe. Ce point lumineux A1 peut être matérialisé par le trou très fin d'un diaphragme ou par le point de focalisation d'un faisceau lumineux. Ce faisceau peut en particulier être un faisceau laser. Dans un mode particulier de réalisation, on peut considérer le plan H1 rejeté à l'infini. Dans ce cas le faisceau lumineux sera un faisceau collimaté. Ce faisceau lumineux pourra être visible ou infrarouge.The general diagram is shown in FIG. 1. A beam, which can be visible or infrared, comes from a light point A1 located on the optical axis in a plane Hi perpendicular to this axis. This light point A1 can be materialized by the very fine hole of a diaphragm or by the focal point of a light beam. This beam can in particular be a laser beam. In a particular embodiment, we can consider the plane H1 rejected to infinity. In this case the light beam will be a collimated beam. This light beam may be visible or infrared.

Ce faisceau est introduit dans le tube du microscope au moyen d'un séparateur de faisceau
Si et est réfracté par l'objectif du microscope O. n converge en un point A2. Après réflexion sur la surface réfléchissante R solidaire de l'échantillon E, ce faisceau est à nouveau réfracté par l'objectif. Après réflexion sur un séparateur S2 il est focalisé en un point A3. La position de ce point A3 dépend des positions relatives des divers éléments optiques réfléchissant ou réfractant le faisceau. Elle dépend en particulier de la position de la surface réfléchissante R par rapport à l'objectif du microscope. Quand la mise au point est correcte, le point A3 se trouve dans un plan H3 perpendiculaire à l'axe optique du système; c'est ce qui définit la position du plan fui3. This beam is introduced into the microscope tube by means of a beam splitter
If and is refracted by the objective of the microscope O. n converges at a point A2. After reflection on the reflecting surface R secured to the sample E, this beam is again refracted by the objective. After reflection on a separator S2 it is focused at a point A3. The position of this point A3 depends on the relative positions of the various optical elements reflecting or refracting the beam. It depends in particular on the position of the reflecting surface R relative to the objective of the microscope. When the focusing is correct, the point A3 is in a plane H3 perpendicular to the optical axis of the system; this is what defines the position of the plane fled3.

La surface réfléchissante R étant solidaire de l'échantillon, un défaut de mise au point se traduit par une modification du chemin optique suivi par le faisceau. Dans ce cas le point de convergence A3 se trouve hors du plan H3. The reflecting surface R being integral with the sample, a focusing defect results in a modification of the optical path followed by the beam. In this case the point of convergence A3 is outside the plane H3.

Un détecteur de position de foyer D renseigne sur la position du point A3 par rapport au plan 3. La position de ce détecteur est définie de sorte que lorsque la mise au point est correcte, c'est à dire le point A3 dans le plan H3 le détecteur génère un signal constituant une référence. Lorsque la mise au point n'est pas correcte, le point A3 ne se trouve pas dans le plan fui3. Dans ce cas, le détecteur génère un signal, autre que le signal de référence et qui renseigne sur la position de A3.A focus position detector D provides information on the position of the point A3 relative to the plane 3. The position of this detector is defined so that when the focus is correct, that is to say the point A3 in the plane H3 the detector generates a signal constituting a reference. When the focus is not correct, point A3 is not in the plane fui3. In this case, the detector generates a signal, other than the reference signal, which provides information on the position of A3.

Ce signal engendre alors une action de correction de la mise au point.This signal then generates a focus correction action.

Divers types de détecteurs de position de foyer D ont été imaginés. On peut citer en particulier le dispositif à couteau présenté en figure 2. Un couteau (C) est placé dans le plan H3. et délimite deux demi-espaces dont la frontière coupe l'axe optique du système.Various types of focus position detectors D have been devised. Mention may in particular be made of the knife device presented in FIG. 2. A knife (C) is placed in the plane H3. and delimits two half-spaces whose border intersects the optical axis of the system.

Un détecteur deux cadrans Q est placé derrière le couteau, la ligne de séparation des deux cadrans étant parallèle à la bordure du couteau. Si le point A3 se trouve dans le plan H3 juste sur la lame du couteau. Les deux cadrans du détecteur Q sont également éclairés (figure 2a). Le signal issu du détecteur constitue alors le signal de référence. Par contre, si le point A3 ne se trouve pas dans le plan H3 un seul des cadrans est éclairé. Cet éclairage différentiel est à l'origine d'un signal autre que le signal de référence et qui agit sur le réglage de la mise au point (figures 2b et 2c). A two-dial Q detector is placed behind the knife, the line dividing the two dials being parallel to the edge of the knife. If point A3 is in plane H3 just on the knife blade. The two Q detector dials are also lit (Figure 2a). The signal from the detector then constitutes the reference signal. On the other hand, if point A3 is not in the H3 plane, only one of the dials is lit. This differential lighting is the source of a signal other than the reference signal and which acts on the adjustment of the focus (Figures 2b and 2c).

Les positions relatives de H1 et H3 sont telles que lorsque la mise au point est correcte, ils sont conjugués optiques. N'importe quel couple de plans vérifiant cette condition peut être choisi.The relative positions of H1 and H3 are such that when the focus is correct, they are optical conjugates. Any couple of plans verifying this condition can be chosen.

I1 peut néanmoins être judicieux de choisir ces plans conjugués optiques avec la surface réfléchissante R par l'objectif du microscope. Dans une telle configuration, un défaut d'orientation de la surface réfléchissante ne déportera pas le point A3 hors de l'axe optique. It may nevertheless be wise to choose these optical conjugate planes with the reflecting surface R by the objective of the microscope. In such a configuration, a defect in orientation of the reflecting surface will not move point A3 off the optical axis.

Ceci facilite généralement la détection.This generally facilitates detection.

Des composants optiques additionnels peuvent être placés sur le chemin optique du faisceau afin de placer les plans nl et H3 dans des positions accessibles. Considérons par exemple le cas d'un microscope avec image intermédiaire à l'infini. Si, comme dans le cas de la figure 3, la surface réfléchissante R est confondue avec le plan de l'objet à examiner (ce qui est généralement vrai pour les observations biologiques, la surface réfléchissante étant le dioptre de la lamelle de verre en contact avec l'échantillon), placer H1 et H3 dans des plan conjugués de la surface réfléchissante signifie les placer à l'infini, ou, ce qui est équivalent du point de vue optique, dans les plans focaux d'optiques convergentes L1 et
L3.Additional optical components can be placed on the optical path of the beam in order to place the planes nl and H3 in accessible positions. Consider for example the case of a microscope with an infinite intermediate image. If, as in the case of FIG. 3, the reflective surface R is merged with the plane of the object to be examined (which is generally true for biological observations, the reflective surface being the diopter of the glass slide in contact with the sample), placing H1 and H3 in conjugate planes of the reflecting surface means placing them at infinity, or, which is equivalent from the optical point of view, in the focal planes of converging optics L1 and
L3.

Les avantages de ce dispositif de caractérisation et de réglage de mise au point par rapport aux systèmes passant par une analyse d'images sont nombreux. On peut citer entre autres: - la rapidité, - la simplicité de réalisation (en particulier dans le cas de l'utilisation d'un laser comme
faisceau lumineux, - la possibilité de faire une mise au point même sans image visible. Ceci est
particulièrement intéressant en microscopie de fluorescence sur des objets très peu
lumineux et pour lesquels les images sont enregistrés par un film photographique ou
une caméra à intégration mettant en jeu des temps de pose importants. The advantages of this device for characterizing and adjusting focus compared to systems passing through an image analysis are numerous. We can cite among others: - the speed, - the simplicity of realization (in particular in the case of the use of a laser as
light beam, - the possibility of focusing even without a visible image. this is
particularly interesting in fluorescence microscopy on very few objects
bright and for which the images are recorded by a photographic film or
an integration camera involving significant exposure times.

Claims

1) Optical microscope focusing characterization device characterized in that a light beam is reflected on a surface R secured to the sample to be examined E and is led to a detector D which makes it possible to know the relative position of the reflecting surface relative to the microscope objective in order to correct it by means of a displacement system.

2) Device according to claim 1 characterized in that after the reflection on the surface R the light beam is focused at a point A3 whose position depends on that of R, the detector D being sensitive to the position of this point A3.

3) Device according to claim 1 characterized in that a light beam is injected into the optical path of the microscope by means of a beam splitter.

4) Device according to claims 1 to 3 characterized in that the light beam comes from a laser.

5) Device according to any one of the preceding claims, characterized in that the light beam is an infrared beam.

6) Device according to claims 1 and 2 characterized in that the reflecting surface R is constituted by a face of the microscope slide or cover glass in contact with the sample.

7) Device according to any one of the preceding claims, characterized in that the detector D is sensitive to the position of the beam focusing point.