FR2733754A1 - Clavibacter michiganensis DNA fragments - Google Patents

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    • C12Q1/689Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria

Abstract

Single-stranded fragments of Clavibacter michiganensis genomic DNA coding for 16S RNA are new, where the fragments comprise at least one sequence having at least 70% homology with sequence (I) and/or (II) or their complementary sequences. GCGAAAGTGACGGTACCTGCA (I) TATACCGACTTGCGCGGCACA (II).

Description

Frayent de l'ADN génomique de Clavibacter michianensis, sonde d'hybridation, amorce d'amplification, réactif et procédé de détection de Clavibacter michianensis.  Spawn genomic DNA of Clavibacter michianensis, hybridization probe, amplification primer, reagent and method for detection of Clavibacter michianensis.

La présente invention concerne un fragment de l'ADN génomique de Clavibacter michiganensis, une sonde susceptible de s'hybrider spécifiquement avec l'ADN génomique de Clavibacter michiganensis, une amorce pour amplifier spécifiquement l'ADN génomique de Clavibacter michiganensis, un réactif et un procédé pour détecter sélectivement dans un échantillon biologique ladite bactérie, mis en oeuvre avec la sonde ou l'amorce de l'invention.The present invention relates to a fragment of the genomic DNA of Clavibacter michiganensis, a probe capable of hybridizing specifically with the genomic DNA of Clavibacter michiganensis, a primer to specifically amplify the genomic DNA of Clavibacter michiganensis, a reagent and a method. for selectively detecting in a biological sample said bacterium, used with the probe or the primer of the invention.

Les Clavibacter sont des bactéries Gram(+) appartenant aux actinomycètes, aérobies strictes non sporulantes.Clavibacter are Gram (+) bacteria belonging to actinomycetes, strict aerobic non-sporulating.

Jusqu'en 1988, les Clavibacter étaient classés dans les
Corynébactéries (Collins et Bradbury, 1986), groupe taxonomique ayant subi de nombreuses modifications ces dernières années. Depuis 1988, ces Corynébactéries phytopathogènes ont été reclassées dans le nouveau groupe des
Clavibacter suivant en cela les travaux de Cars son et
Vidaver, qui, dès 1982, montraient que 7 des 14 corynébactéries phytopathogènes pouvaient former un groupe taxonomique comprenant 4 espèces différentes (aujourd'hui appelées Clavibacter michiganensis, tritici, rathayi et iranicum), les Clavibacter michiganensis se divisant euxmêmes en 4 sous espèces : Clavibacter michiganensis sousespèce michiganensis, nebraskense, sepedonicum et insidiusum.
Until 1988, Clavibacter were classified in the
Corynebacteria (Collins and Bradbury, 1986), a taxonomic group which has undergone numerous modifications in recent years. Since 1988, these phytopathogenic Corynebacteria have been reclassified in the new group of
Clavibacter following in this the work of Cars son and
Vidaver, which, as early as 1982, showed that 7 of the 14 phytopathogenic corynebacteria could form a taxonomic group comprising 4 different species (today called Clavibacter michiganensis, tritici, rathayi and iranicum), the Clavibacter michiganensis dividing themselves into 4 subspecies: Clavibacter michiganensis subspecies michiganensis, nebraskense, sepedonicum and insidiusum.

Une des principales caractéristiques des Clavibacter est que chaque espèce ou sous-espèce n'est pathogène que d'une seule plante, et qu'il est rare de pouvoir en isoler à partir d'autres plantes. Ainsi, le Clavibacter michiganensis sousespèce michiganensis est un pathogène de la tomate (Lycopersicon esculantum), responsable de la maladie du chancre de la tomate, affection majeure des variétés de plein-champ et de serre. Le Clavibacter michiganensis sousespèce michiganensis n'est transmis en général que par les semences de tomate, semences sur ou dans lesquelles on peut le retrouver (Tsiatos, 1986 ; Rat, 1984). Dans le cas d'une transmission par des techniques culturales (taille, rempotage, arrosage...), les effets plus tardifs du pathogène sont moins dommageables pour les cultures (Dullahide, 1983
Dhanvantari, 1989).
One of the main characteristics of Clavibacter is that each species or subspecies is pathogenic from only one plant, and that it is rare to be able to isolate it from other plants. Thus, Clavibacter michiganensis subspecies michiganensis is a tomato pathogen (Lycopersicon esculantum), responsible for the disease of tomato canker, a major affection of open field and greenhouse varieties. Clavibacter michiganensis subspecies michiganensis is generally transmitted only by tomato seeds, seeds on or in which it can be found (Tsiatos, 1986; Rat, 1984). In the case of transmission by cultural techniques (pruning, potting, watering, etc.), the later effects of the pathogen are less damaging for crops (Dullahide, 1983
Dhanvantari, 1989).

Ce pathogène peut survivre en conservant son pouvoir pathogène pendant 18 mois dans des sols infestés par des cultures précédentes de tomates contaminées et quelques mois sur les structures et le matériel d'une exploitation (Strider, 1967 ; Moffet, 1984).This pathogen can survive by retaining its pathogenicity for 18 months in soils infested with previous crops of contaminated tomatoes and for a few months on the structures and equipment of a farm (Strider, 1967; Moffet, 1984).

Les symptômes externes, caractérisés par des tâches brunes entourées d'un halo blanc (dites en oeil d'oiseaux) se transformant en zones de nécroses, n' apparaissent, en général, que vers la maturité de la plante sur les feuilles, les tiges, les inflorescences et les fruits, bien que la bactérie puisse être présente dans la plante bien avant l'apparition de ces symptômes. Ceci rend son diagnostic precoce difficile. External symptoms, characterized by brown spots surrounded by a white halo (called a bird's eye) transforming into areas of necrosis, do not generally appear until the maturity of the plant on the leaves, stems , inflorescences and fruit, although the bacteria may be present in the plant long before these symptoms appear. This makes its early diagnosis difficult.

Les symptômes internes n'apparaissent eux aussi que sur les plantes adultes. Ils consistent en l'apparition de tâches jaunes ou brun foncé sur les vaisseaux du bois ; la moelle paraît intacte au début, mais peut se creuser par la suite. A terme, le feuillage devient grillé et les fruits verts ont tendance à tomber (Strider, 1969).Internal symptoms also only appear on adult plants. They consist of the appearance of yellow or dark brown spots on the wood vessels; the marrow appears intact at first, but may become hollow later. Ultimately, the foliage becomes roasted and the green fruits tend to fall (Strider, 1969).

Ces atteintes se répandent ensuite rapidement sur l'ensemble de la plante et conduisent à la perte des fruits (Lelliott, 1988). Ainsi, des pertes de récolte en champs de près de 70 % peuvent être observées (Lelliott, 1988).These attacks then spread quickly over the whole plant and lead to the loss of fruit (Lelliott, 1988). Thus, crop losses of almost 70% in the field can be observed (Lelliott, 1988).

Décrite pour la première fois en 1910 par E.F. Smith, la maladie s'est étendue depuis dans toutes les zones du globe.Described for the first time in 1910 by E.F. Smith, the disease has since spread to all areas of the globe.

Actuellement, la caractérisation des germes fait appel à des techniques biochimiques appliquées à des bactéries isolées de macérats de graines de tomate, méthodes complétées par des tests d'inoculation sur matériel végétal sain, pour vérifier le pouvoir pathogène des souches. Ceci nécessite 3 à 4 semaines de délai pour obtenir un résultat (Gardan et
Luisetti, 1986).
Currently, the characterization of germs uses biochemical techniques applied to bacteria isolated from macerates of tomato seeds, methods supplemented by inoculation tests on healthy plant material, to check the pathogenic power of the strains. This requires 3 to 4 weeks of delay to obtain a result (Gardan and
Luisetti, 1986).

Bien que des tests de détection par immunofluorescence aient été décrits précédemment (Trigalet, 1974 ; De Boer, 1982), aucune technique d'enzymologie, d'immunologie ou de biologie moléculaire rapide et suffisamment fiable pour être homologuée n' a pu être développée pour le diagnostic des
Clavibacter (Thompson et coll., 1988 ; Johansen et coll., 1989), et ce malgré l'existence de 2 sondes d'ADN spécifiques du Clavibacter michiganensis sous-espèce michiganensis (Thompson et coll., 1988) et du Clavibacter michiganensis sous-espèce insidiusum (Rassmussen et coll., 1989).Ceci tient au fait que l'utilisation de ces sondes nécessite d'avoir recours au préalable à des techniques très lourdes d'extraction des acides nucléiques, comprenant en particulier des séparations par centrifugation en gradient de caesium.
Although immunofluorescence detection tests have been described previously (Trigalet, 1974; De Boer, 1982), no rapid and sufficiently reliable enzymology, immunology or molecular biology technique could be developed to the diagnosis of
Clavibacter (Thompson et al., 1988; Johansen et al., 1989), despite the existence of 2 specific DNA probes of Clavibacter michiganensis subspecies michiganensis (Thompson et al., 1988) and Clavibacter michiganensis under -species insidiusum (Rassmussen et al., 1989). This is due to the fact that the use of these probes necessitates first having to resort to very heavy techniques of nucleic acid extraction, including in particular separation by centrifugation in caesium gradient.

Aucune variété de tomate cultivée n'est aujourd'hui résistante à ce pathogène (Leterrot et coll., 1978), et aucun traitement n'a pu être mis au point pour combattre la maladie ou désinfecter de façon efficace les semences contaminées (Tsiantos, 1987 ; Dhanvantari, 1989). I1 apparaît donc aujourd'hui primordial de pouvoir diagnostiquer de manière fiable, rapide et économique la présence du Clavibacter michiganensis sous-espèce michiganensis sur des lots de semences.No cultivated tomato variety is today resistant to this pathogen (Leterrot et al., 1978), and no treatment has been developed to combat the disease or effectively disinfect contaminated seeds (Tsiantos, 1987; Dhanvantari, 1989). It therefore seems essential today to be able to diagnose reliably, quickly and economically the presence of Clavibacter michiganensis subspecies michiganensis on seed lots.

Le but de la présente invention est donc de proposer une ou plusieurs séquences nucléotidiques utilisées sous forme de sonde, d'amorce ou de réactif à visée de diagnostic pour permettre de détecter la présence du Clavibacter michiganensis dans les semences de tomates, suffisamment spécifiques pour détecter le Clavibacter michiganensis sousespèce michiganensis parmi d'autres espèces bactériennes les plus proches, simples à mettre en oeuvre et suffisamment fiables pour ne pas détecter en particulier des bactéries mortes.The aim of the present invention is therefore to propose one or more nucleotide sequences used in the form of a probe, primer or reagent for diagnostic purposes to make it possible to detect the presence of Clavibacter michiganensis in tomato seeds, sufficiently specific to detect Clavibacter michiganensis subspecies michiganensis among other closest bacterial species, simple to implement and sufficiently reliable not to detect in particular dead bacteria.

La présente invention concerne à cet effet un fragment monocaténaire de l'ADN genomique de Clavibacter michiganensis codant pour l'ARN 16S, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une séquence nucléotidique présentant au moins 70 * d'homologie avec au moins une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences nucléotidiques, séquence N"1, séquence N"2 identifiées dans la description, et leurs séquences complémentaires respectives. Par séquence complémentaire on entend toute séquence s'hybridant totalement avec la sequence représentée.The present invention relates for this purpose to a single-stranded fragment of the genomic DNA of Clavibacter michiganensis coding for 16S RNA, characterized in that it comprises at least one nucleotide sequence having at least 70 * of homology with at least one sequence nucleotide chosen from the nucleotide sequences, sequence N "1, sequence N" 2 identified in the description, and their respective complementary sequences. By complementary sequence is meant any sequence that completely hybridizes with the sequence shown.

Un second objet de l'invention concerne une sonde susceptible de s'hybrider spécifiquement avec l'ADN génomique de
Clavibacter michiganensis, ladite sonde comprenant au moins une séquence nucléotidique présentant au moins 70 % d'homologie avec au moins une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences nucléotidiques, séquence N"1, séquence N"2 et leurs séquences complémentaires respectives.
A second object of the invention relates to a probe capable of hybridizing specifically with the genomic DNA of
Clavibacter michiganensis, said probe comprising at least one nucleotide sequence having at least 70% homology with at least one nucleotide sequence chosen from the nucleotide sequences, sequence N "1, sequence N" 2 and their respective complementary sequences.

Un troisième objet de l'invention est de réaliser une amorce (ou "primer") pour la polymérisation de l'ADN génomique de
Clavibacter permettant une amplification de l'ADN génomique de Clavibacter michiganensis par différents moyens tels que par la technique de réaction en chaîne de la polymérase encore appelée PCR, par transcription inverse ou par réaction de ligation en chaîne. Cette amorce comprend une séquence nucléotidique présentant au moins 70 % d'homologie avec au moins une partie d'une séquence de l'ADN génomique de
Clavibacter michiganensis, cette séquence étant choisie parmi les séquences nucléotidiques, séquence N"1, séquence N"2 et leurs séquences complémentaires respectives.
A third object of the invention is to produce a primer (or "primer") for the polymerization of genomic DNA from
Clavibacter allowing amplification of the genomic DNA of Clavibacter michiganensis by various means such as by the polymerase chain reaction technique also called PCR, by reverse transcription or by chain ligation reaction. This primer comprises a nucleotide sequence having at least 70% homology with at least a part of a genomic DNA sequence of
Clavibacter michiganensis, this sequence being chosen from the nucleotide sequences, sequence N "1, sequence N" 2 and their respective complementary sequences.

Selon les techniques d'amplification envisagées, il est préférable d'utiliser un couple d'amorces comprenant au moins une amorce de 1 invention. De préférence, pour obtenir le degré de specificité voulu, il est nécessaire d'utiliser une première amorce ayant au moins 70 % d'homologie avec la séquence N"1 et une deuxième amorce ayant au moins 70 % d'homologie avec la séquence N"2. According to the amplification techniques envisaged, it is preferable to use a pair of primers comprising at least one primer of the invention. Preferably, to obtain the desired degree of specificity, it is necessary to use a first primer having at least 70% homology with the sequence N "1 and a second primer having at least 70% homology with the sequence N "2.

Chaque amorce peut indifféremment jouer le rôle d'amorce de capture ou d'amorce de révélation. L'amorce de capture comprend ladite séquence N"1 ou N"2 couplée à un marqueur ou associée à une séquence nucléotidique particulière. L'amorce de révélation comprend ladite séquence N"1 ou N"2 couplee à un marqueur permettant la révélation.Each primer can indifferently play the role of capture primer or revelation primer. The capture primer comprises said sequence N "1 or N" 2 coupled to a marker or associated with a particular nucleotide sequence. The revelation primer comprises said N "1 or N" 2 sequence coupled to a marker allowing the revelation.

Le quatrième objet de l'invention est un réactif pour détecter sélectivement le Clavibacter michiganensis dans un échantillon biologique mettant en application une sonde ou un couple de sondes de l'invention telles que décrites cidessus. Dans ce cas, les techniques mises en oeuvre sont constituées par des techniques d'hybridation moléculaire comprenant une phase d'hybridation et une phase de detection. The fourth object of the invention is a reagent for selectively detecting Clavibacter michiganensis in a biological sample using a probe or a pair of probes of the invention as described above. In this case, the techniques used are constituted by molecular hybridization techniques comprising a hybridization phase and a detection phase.

Pour permettre la mise en oeuvre de la phase de détection, la sonde nucléique est couplée au préalable à une molécule dont la présence pourra être révélée.To allow the implementation of the detection phase, the nucleic acid probe is coupled beforehand to a molecule whose presence can be revealed.

De manière analogue, le procédé de détection sélectif de
Clavibacter michiganensis dans un échantillon biologique peut consister à exposer 1'ADN génomique ou l'ARN des bactéries, contenu dans ledit échantillon sous forme de fragment monocatenaire, à au moins une sonde puis à detecter les zones d'hybridation de manière directe ou indirecte. En variante ce procedé peut consister à réaliser une amplification de l'ADN génomique de Clavibacter michiganensis en présence d'un système enzymatique adapte et au moins un couple d'amorces et indentifier les fragments amplifiés.Toutes les techniques d'hybridation moléculaire ou d'amplification génique connues à ce jour peuvent être mises en oeuvre dans les procédés cidessus et notamment les techniques dites "Dot Blot" "Southern" et d'hybridation sandwich ou les techniques de réaction de ligation en chaîne ou Ligase Chain Reaction (LCR), les techniques d'amplification par transcription inverse ou TAS et les techniques de réaction en chaîne de la polymérisation dites PCR.
Similarly, the method of selective detection of
Clavibacter michiganensis in a biological sample can consist in exposing the genomic DNA or the RNA of the bacteria, contained in said sample in the form of a single-stranded fragment, to at least one probe and then detecting the zones of hybridization directly or indirectly. As a variant, this process may consist in carrying out an amplification of the genomic DNA of Clavibacter michiganensis in the presence of an adapted enzymatic system and at least one pair of primers and in identifying the amplified fragments. All the techniques of molecular hybridization or gene amplification known to date can be implemented in the above processes and in particular the so-called "Dot Blot""Southern" and sandwich hybridization techniques or the techniques of chain ligation reaction or Ligase Chain Reaction (LCR), amplification techniques by reverse transcription or TAS and polymerase chain reaction techniques called PCR.

L'invention sera bien comprise à la lecture de la description suivante d'exemples de réalisation, en référence aux dessins annexés dans lesquels
la figure 1 représente la structure secondaire de
l'ARN 16S des procaryotes
la figure 2 représente les séquences respectives de
l'ADN codant pour l'ARN 16S de la zone variable V3
des bactéries Clavibacter michiganensis, Clavibacter
non michiganensis et Curtobactérium et
la figure 3 représente les séquences respectives de
l'ADN codant pour l'ARN 16S de la zone variable V6
des bactéries Clavibacter michiganensis, Clavibacter
non michiganensis et Curtobactérium.
The invention will be clearly understood on reading the following description of exemplary embodiments, with reference to the accompanying drawings in which
Figure 1 shows the secondary structure of
prokaryotic 16S RNA
FIG. 2 represents the respective sequences of
DNA encoding variable V3 16S RNA
bacteria Clavibacter michiganensis, Clavibacter
non michiganensis and Curtobacterium and
FIG. 3 represents the respective sequences of
DNA encoding V6 variable region 16S RNA
bacteria Clavibacter michiganensis, Clavibacter
non michiganensis and Curtobacterium.

Il a été montré que les ARN de transfert, ARNt compris entre les séquences exprimant les ARNr, peuvent différer d'une bactérie à l'autre (Lewin, 1986) et que les séquences exprimant l'ARNr 16S présentent des régions variables, numérotées classiquement de V1 à V9 (la région V4 n' existant que chez les eucaryotes). Cette structure secondaire des ARNr 16S des procaryotes (établie d'après Gutell et coll., 1990) est représentée à la figure 1. L'extrémité 5'P est symbolisée par un cercle noir, l'extrémité 3'OH par une flèche. En gras sont représentées les régions relativement conservées. Les régions variables sont numérotées de V1 à V9.It has been shown that transfer RNAs, tRNA included between the sequences expressing rRNA, can differ from one bacterium to another (Lewin, 1986) and that the sequences expressing 16S rRNA have variable regions, classically numbered from V1 to V9 (the V4 region only exists in eukaryotes). This secondary structure of the prokaryotic 16S rRNAs (established after Gutell et al., 1990) is represented in FIG. 1. The 5'P end is symbolized by a black circle, the 3'OH end by an arrow. In bold are shown the relatively preserved regions. The variable regions are numbered from V1 to V9.

Les séquences N"1 et 2, objet de l'invention, ont été obtenues après séquençage des régions variables V3 et V6 des
ADN codant pour les ARN 16S de différents Clavibacter michiganensis, Curtobactérium et Rhodococcus. Le positionnement de ces séquences d'ADN codant pour des ARN 16S est décrit par rapport à la séquence de référence de l'ARN ribosomique de E. Coli, telle que décrite dans : NEEFS J.M.
The sequences N "1 and 2, object of the invention, were obtained after sequencing of the variable regions V3 and V6 of the
DNA coding for the 16S RNAs of different Clavibacter michiganensis, Curtobacterium and Rhodococcus. The positioning of these DNA sequences coding for 16S RNA is described with respect to the reference sequence of the ribosomal RNA of E. Coli, as described in: NEEFS JM

VAN DE PEER Y. ; HENDRIKS L. ; de WACHTER R. (1990) "Compilation of small ribosomal subunit RNA sequences".VAN DE PEER Y.; HENDRIKS L.; de WACHTER R. (1990) "Compilation of small ribosomal subunit RNA sequences".

Nucleic Acids Research ; 18, supplement ; 2237-2317.Nucleic Acids Research; 18, supplement; 2237-2317.

La figure 2 représente les séquence s obtenues après séquençage des régions variables V3 à V6 des ADN codant pour des ARN ribosomiques ARNr 16S de trois groupes de souches différents correspondant chacun à une ligne de séquence. Le groupe N"1 correspondant à la liste de séquence de bases représentée à la première ligne.Les souches concernées, dont la numérotation correspond à celle de la collection française
INRA de bactéries phytopathogènes, auprès de laquelle les souches peuvent être obtenues, comprennent
Groupe N"1 1. le Clavibacter michiganensis sous-espèce michiganensis N" 2352, souche type ; Lycopersicon esculentum (tomate) 2. le Clavibacter michiganensis sous-espèce michiganensis N" 2499, Solanum nigrum 3. le Clavibacter michiganensis sous-espèce michiganensis N" 2501, Capsicum annuum (piment) 4. le Clavibacter michiganensis sous-espèce insidiusum ; N" 2404, souche type ; Medicago sativa (tabac) 5. le Clavibacter michiganensis sous-espèce nebraskensis ; N" 2405, souche type ; Zea mays (maïs).
FIG. 2 represents the sequences s obtained after sequencing of the variable regions V3 to V6 of the DNAs coding for ribosomal RNA 16S rRNA from three groups of different strains each corresponding to a sequence line. The group N "1 corresponding to the list of base sequences represented in the first line. The strains concerned, the numbering of which corresponds to that of the French collection
INRA of phytopathogenic bacteria, from which the strains can be obtained, include
Group N "1 1. Clavibacter michiganensis subspecies michiganensis N" 2352, type strain; Lycopersicon esculentum (tomato) 2. Clavibacter michiganensis subspecies michiganensis N "2499, Solanum nigrum 3. Clavibacter michiganensis subspecies michiganensis N" 2501, Capsicum annuum (chili pepper) 4. Clavibacter michiganensis subspecies insidiusum; No. 2404, type strain; Medicago sativa (tobacco) 5. Clavibacter michiganensis subspecies nebraskensis; No. 2405, type strain; Zea mays (corn).

Le groupe N"2 correspondant à la deuxième ligne de la liste des séquences établies dans la figure 2 comprend 7. le Clavibacter iranicus ; N" 807, souche type ; Triticum aestivum (blé) 8. le Clavibacter rathayi ; N" 2406, souche type ; Dactylis glomerata 9. le Clavibacter tritici ; N" 1385, souche type ; Triticum aestivum (blé) ;
Le troisième groupe correspondant à la troisième ligne de séquence représentée comprend 10. Curtobactérium flaccumfaciens pv. betae ; n" 2402, souche type ; Beta vulgaris 11. Curtobactérium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens ; N" 1389 ; Phaseolus sp. (haricot) 12. Curtobactérium flaccumfaciens pv. oortii ; N" 1384, souche type ; Tulipa gesneriana 13. Curtobactérium flaccumfaciens pv. poinsettiae ; N" 2403, souche type ; Euphorbia pulcherrima.
The group N "2 corresponding to the second line of the list of sequences established in FIG. 2 comprises 7. Clavibacter iranicus; N" 807, type strain; Triticum aestivum (wheat) 8. Clavibacter rathayi; No. 2406, type strain; Dactylis glomerata 9. Clavibacter tritici; No. 1385, type strain; Triticum aestivum (wheat);
The third group corresponding to the third line of sequence represented comprises 10. Curtobacterium flaccumfaciens pv. betae; n "2402, type strain; Beta vulgaris 11. Curtobactérium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens; N"1389; Phaseolus sp. (bean) 12. Curtobacterium flaccumfaciens pv. oortii; N "1384, type strain; Tulipa gesneriana 13. Curtobacterium flaccumfaciens pv. Poinsettiae; N" 2403, type strain; Euphorbia pulcherrima.

La séquence N"1 a été identifiée comme suit.The sequence N "1 has been identified as follows.

La séquence cible constituée par l'ADNr (ribosomique) codant pour la région V3 de l'ARNr 16S a été amplifiée à partir de 105 bactéries appartenant à l'un des groupes 1, 2 ou 3 précités. Cette amplification a été réalisée à partir des amorces répondant aux séquence N"3, séquence N"4 dont les séquences sont représentées à la fin de la description. La dimension du fragment amplifié obtenu y compris les amorces est de 199 bases. Ce fragment est flanqué à son extrémité 5' de l'amorce correspondant à la séquence N"3 et à son extrémité 3'OH de l'amorce correspondant à la séquence N"4. The target sequence constituted by the (ribosomal) rDNA coding for the V3 region of the 16S rRNA was amplified from 105 bacteria belonging to one of the groups 1, 2 or 3 above. This amplification was carried out using primers corresponding to sequence N "3, sequence N" 4, the sequences of which are shown at the end of the description. The size of the amplified fragment obtained, including the primers, is 199 bases. This fragment is flanked at its 5 'end of the primer corresponding to the sequence N "3 and at its 3'OH end of the primer corresponding to the sequence N" 4.

La technique d'amplification retenue est la technique de la réaction en chaîne de la polymérase encore appelée PCR (Polymerase Chain Reaction, Sacki et Coll 1983).The amplification technique chosen is the polymerase chain reaction technique also called PCR (Polymerase Chain Reaction, Sacki et Coll 1983).

Cette technique de polymérase par réaction en chaîne comprend trois étapes - une première étape de dénaturation de l'ADN double brin en deux matrices simple brin - une hybridation avec un couple d'amorces (séquence N"3, séquence N"4) délimitant la région à amplifier - la synthèse par une enzyme, en général une polymérase thermorésistante, du brin complémentaire.This polymerase chain reaction technique comprises three steps - a first step of denaturing double stranded DNA into two single stranded templates - hybridization with a pair of primers (sequence N "3, sequence N" 4) delimiting the region to be amplified - the synthesis, by an enzyme, generally a heat-resistant polymerase, of the complementary strand.

La température de mise en oeuvre de la PCR est de 66"C. Les conditions de PCR sont telles que suit : milieu réactionnel 1,5 mM MgCL2, 30 ng de chaque amorce, 0,25 U Taq Polymerase (Red GOLDSTAR, marque déposée commercialisée par Eurogentec
SA). Cette étape est suivie d'une étape de purification par filtration des produits d'amplification au moyen d'un système
Centricon 100 (marque déposée) commercialisé par la Société
Amicon SA. Dans une étape suivante, il est réalisé une amplification différentielle de ces fragments pour produire l'ADN simple brin.Cette étape d'amplification est réalisée dans les mêmes conditions que ci-dessus à l'exception des concentrations d'amorces qui sont telles que suit
Amorce représentée par la séquence N"3 : 2 pmoles 13,4 ng
Amorce représentée par la séquence N"4 : 50 pmoles 333 ng
Une nouvelle étape de purification par filtration des produits est réalisée au moyen d'un système de type Centricon 100 (marque déposée) commercialisé par Amicon SA. Ensuite, la séquence nucléotidique complète des brins d'ADN complémentaires de chaque fragment est déterminée par la méthode de SANGER F. ; NICKLEN S. ; COULSON A.R. (1977) : DNA sequencing with chain-terminating inhibitors ; "Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 74 ; 5463".
The PCR processing temperature is 66 "C. The PCR conditions are as follows: reaction medium 1.5 mM MgCL2, 30 ng of each primer, 0.25 U Taq Polymerase (Red GOLDSTAR, registered trademark marketed by Eurogentec
HER). This stage is followed by a stage of purification by filtration of the amplification products by means of a system
Centricon 100 (registered trademark) marketed by the Company
Amicon SA. In a following step, a differential amplification of these fragments is carried out to produce single-stranded DNA. This amplification step is carried out under the same conditions as above except for the concentrations of primers which are such that follows
Primer represented by the sequence N "3: 2 pmoles 13.4 ng
Primer represented by the sequence N "4: 50 pmoles 333 ng
A new product purification step by filtration is carried out using a Centricon 100 type system (registered trademark) marketed by Amicon SA. Then, the complete nucleotide sequence of the DNA strands complementary to each fragment is determined by the method of SANGER F.; NICKLEN S.; COULSON AR (1977): DNA sequencing with chain-terminating inhibitors; "Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 74; 5463".

Les alignements de ces séquences permettent de mettre en évidence la série de bases encadrée sur la ligne N"1 correspondant à une séquence de Clavibacter michiganensis.The alignments of these sequences make it possible to highlight the series of bases framed on the line N "1 corresponding to a sequence of Clavibacter michiganensis.

Cette séquence correspond à la séquence N"1 représentée en fin de description.This sequence corresponds to the sequence N "1 shown at the end of the description.

De manière analogue, on a obtenu les séquences représentées à la figure 3 après séquençage des régions variables V6 des ADN ribosomiques codant pour les ARNr 16S des trois groupes de souches suivants:
Le groupe N"1 comprend 1. le Clavibacter michiganensis sous-espèce michiganensis N" 2352, souche type ; Lycopersicon esculentum (tomate) 5. le Clavibacter michiganensis sous-espèce nebraskensis ; N" 2405, souche type ; Zea mays (maïs).
Similarly, the sequences shown in FIG. 3 were obtained after sequencing the V6 variable regions of the ribosomal DNA coding for the 16S rRNAs of the following three groups of strains:
The group N "1 comprises 1. Clavibacter michiganensis subspecies michiganensis N" 2352, type strain; Lycopersicon esculentum (tomato) 5. Clavibacter michiganensis subspecies nebraskensis; No. 2405, type strain; Zea mays (corn).

Le groupe N"2 comprend 8. le Clavibacter rathayi ; N" 2406, souche type ; Dactylis glomerata 9. le Clavibacter tritici ; N" 1385, souche type ; Triticum aestivum (blé)
Le groupe N"3 comprend 11. Curtobactérium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens ; N" 1389 ; Phaseolus sp. (haricot) 12. Curtobactérium flaccumfaciens pv. oortii ; N" 1384, souche type ; Tulipa gesneriana 13. Curtobactérium flaccumfaciens pv. poinsettiae ; N" 2403, souche type ; Euphorbia pulcherrima.
Group N "2 includes 8. Clavibacter rathayi; N" 2406, type strain; Dactylis glomerata 9. Clavibacter tritici; No. 1385, type strain; Triticum aestivum (wheat)
Group N "3 includes 11. Curtobacterium flaccumfaciens pv. Flaccumfaciens; N"1389; Phaseolus sp. (bean) 12. Curtobacterium flaccumfaciens pv. oortii; N "1384, type strain; Tulipa gesneriana 13. Curtobacterium flaccumfaciens pv. Poinsettiae; N" 2403, type strain; Euphorbia pulcherrima.

Ces séquences ont été obtenues de la manière suivante : la séquence cible constituée par l'ADNr (ribosomique) codant pour la région V6 de l'ARNr 16S a été amplifiée par PCR à partir de 105 bactéries appartenant à l'un des groupes 1, 2 ou 3 précités. Cette amplification a été réalisée à partir d'un couple d'amorces correspondant aux séquences N"5 et 6 qui sont représentées à la fin de la description. La taille du fragment amplifié obtenu est de 173 bases.Ce fragment est flanqué à son extrémité 5' de l'amorce représentée par la séquence N"5 et à son extrémité 3'OH de l'amorce représentée par la séquence N"6. La température de mise en oeuvre de la
PCR est de 60"C. Les conditions de PCR sont identiques à celles décrites pour l'obtention de la séquence N"1 cidessus.
These sequences were obtained in the following manner: the target sequence constituted by the (ribosomal) rDNA coding for the V6 region of the 16S rRNA was amplified by PCR from 105 bacteria belonging to one of the groups 1, 2 or 3 above. This amplification was carried out using a pair of primers corresponding to the sequences N "5 and 6 which are shown at the end of the description. The size of the amplified fragment obtained is 173 bases. This fragment is flanked at its end 5 'of the primer represented by the sequence N "5 and at its 3'OH end of the primer represented by the sequence N" 6. The processing temperature of the
PCR is 60 "C. The PCR conditions are identical to those described for obtaining the sequence N" 1 above.

Les alignements des séquences obtenues permettent de mettre en évidence la série de bases encadrée sur la ligne N"1 correspondant à une séquence de Clavibacter michiganensis.The alignments of the sequences obtained make it possible to highlight the series of bases framed on the line N "1 corresponding to a sequence of Clavibacter michiganensis.

Cette séquence correspond à la séquence N"2 représentée en fin de description.This sequence corresponds to the sequence N "2 shown at the end of the description.

Ce séquençage de 1'ADN ribosomique codant pour les ARNr 16S des zones variables V3 à V6 permet d'identifier deux zones de séquences encadrées sur les figures 2 et 3 correspondant respectivement aux séquences cibles des séquence N"1 et séquence N"2 utilisées comme sondes ou comme amorces. On constate cependant que la sonde correspondant à la séquence N"1 ne permet pas d'établir une distinction entre les
Clavibacter michiganensis et les Curtobactérium. Tel n'est pas le cas de la sonde correspondant à la séquence N"2. C'est pourquoi, pour obtenir le degré de spécificité voulu, on utilisera la plupart du temps un couple d'amorces ou de sondes qui correspondent respectivement aux séquences N"1 et N"2.
This sequencing of the ribosomal DNA coding for the 16S rRNAs of the variable zones V3 to V6 makes it possible to identify two zones of sequences framed in FIGS. 2 and 3 corresponding respectively to the target sequences of the sequence N "1 and sequence N" 2 used as probes or as primers. However, it can be seen that the probe corresponding to the sequence N "1 does not allow a distinction to be made between the
Clavibacter michiganensis and Curtobacterium. This is not the case for the probe corresponding to the sequence N "2. This is why, in order to obtain the desired degree of specificity, most of the time a pair of primers or probes will be used which correspond respectively to the sequences N "1 and N" 2.

L'identification de Clavibacter michiganensis au moyen de sondes ou d'amorces conformes à l'invention peut être obtenue au moyen de différentes techniques. Ainsi, on distingue les techniques d'hybridation et les techniques d'amplification.The identification of Clavibacter michiganensis by means of probes or primers in accordance with the invention can be obtained by means of various techniques. Thus, a distinction is made between hybridization techniques and amplification techniques.

La technique d'hybridation retenue peut par exemple être celle dite d'hybridation "sandwich". Dans ce cas, l'ADN purifié est obtenu, selon par exemple la technique d'extraction de l'ADN des Clavibacter mettant en oeuvre le protocole décrit par Thompson dans : THOMPSON E. ; LEARY
J.V.; CHUN W.W.WC. (1989) : "Specific detection of
Clavibacter michiganensis sous-espèce michiganensis by a homologous DNA probe". Gentics 79(3). 311-314.
The hybridization technique chosen may for example be that known as "sandwich" hybridization. In this case, the purified DNA is obtained, according for example to the DNA extraction technique of Clavibacter using the protocol described by Thompson in: THOMPSON E.; LEARY
JV; CHUN WWWC. (1989): "Specific detection of
Clavibacter michiganensis subspecies michiganensis by a homologous DNA probe ". Gentics 79 (3). 311-314.

L'identification de Clavibacter michiganensis peut également être réalisée par hybridation directe sur colonies en utilisant un système de détection non-radioactif et semiautomatisé décrit dans le brevet français N" 90.07249 dont le contenu est incorporé à la présente description, si besoin est. L'identification des souches de Clavibacter michiganensis à partir des souches décrites dans les groupes 1 ci-dessus a été confirmée selon cette technologie de détection non radioactive.The identification of Clavibacter michiganensis can also be carried out by direct hybridization on colonies using a non-radioactive and semi-automated detection system described in French patent No. 90.07249, the content of which is incorporated into the present description, if necessary. Identification of Clavibacter michiganensis strains from the strains described in groups 1 above has been confirmed using this non-radioactive detection technology.

L'extraction de l'ADN total à partir des colonies est réalisée de la manière suivante. Une colonie bactérienne standardisée à un inoculum lO9 bactéries est reprise dans 400 pl d'une solution de citrate de sodium 0,1 M contenant 0,85 g de chlorure de sodium. On ajoute 40 ul de détergent désoxychlorate de sodium (1 %). Après incubation 5 minutes à température ambiante, 4 extractions phénol-chloroforme sont effectuées (Maniatis et coll. 1982). L'ADN est précipité à l'éthanol. Le culot est repris dans 100 ul de tampon citrate de sodium. Cette solution est soniquée avec un sonicateur 60
W (Société Bioblock sous la réf. C72442) utilisant une sonde de type "cuphorn" (Société Bioblock sous la réf. C72438) afin d'obtenir une population de fragments de taille majoritaire de 1 kilobase.
The extraction of total DNA from the colonies is carried out as follows. A bacterial colony standardized to a l9 bacteria inoculum is taken up in 400 μl of a 0.1 M sodium citrate solution containing 0.85 g of sodium chloride. 40 μl of sodium deoxychlorate detergent (1%) are added. After incubation for 5 minutes at room temperature, 4 phenol-chloroform extractions are carried out (Maniatis et al. 1982). The DNA is precipitated with ethanol. The pellet is taken up in 100 μl of sodium citrate buffer. This solution is sonicated with a sonicator 60
W (Bioblock Company under ref. C72442) using a "cuphorn" type probe (Bioblock Company under ref. C72438) in order to obtain a population of fragments of majority size of 1 kilobase.

Un aliquote correspondant à 108 bactéries dans 10 p1 est alors identifié par hybridation selon le protocole suivant.An aliquot corresponding to 108 bacteria in 10 p1 is then identified by hybridization according to the following protocol.

Dans une plaque de microtitration (Nom commercial Nunc 439454) est déposée une solution de la sonde oligonucléotidique de capture (sonde séquence N"1) à 1 ng/l dans du PBS 1X (0,15 M NaCl, 0,05 M phosphate de sodium, pH 7,0). La plaque est incubée 2 h à 37"C puis lavée 3 fois avec 300 pl de PBST (PBS + détergent de marque TWEEN de la Société
MERCK). La cible constituée par 10 ul de l'ADN total soniqué est mélangée avec 70 pl de tampon PBS saumon [PBS3X + ADN de sperme de saumon 10 pg/ml, (Société Sigma sous la réf.
In a microtiter plate (Trade name Nunc 439454) is deposited a solution of the oligonucleotide capture probe (probe sequence N "1) at 1 ng / l in PBS 1X (0.15 M NaCl, 0.05 M phosphate of sodium, pH 7.0) The plate is incubated for 2 h at 37 ° C. and then washed 3 times with 300 μl of PBST (PBS + TWEEN brand detergent from the Company
MERCK). The target constituted by 10 μl of the total sonicated DNA is mixed with 70 μl of salmon PBS buffer [PBS3X + salmon sperm DNA 10 μg / ml, (Sigma company under ref.

D9156)j et 10 u1 de soude 2N. L'ensemble est neutralisé 5 minutes après, par l'addition de 10 ul d'acide acétique 2N. D9156) j and 10 u1 of 2N sodium hydroxide. The whole is neutralized 5 minutes later, by the addition of 10 μl of 2N acetic acid.

L'ensemble est ajouté dans le puits en plus de 50 pl d'une solution du conjugué composée de la sonde de détection (séquence complémentaire de la séquence N"2) marquée à la péroxydase à la concentration de 0,1 ng/ul dans un tampon PBS cheval [PBS3X + 10 % sérum de cheval, (Société bioMérieux SA réf. 55842)].The whole is added to the well in addition to 50 μl of a solution of the conjugate composed of the detection probe (sequence complementary to the sequence N "2) labeled with peroxidase at the concentration of 0.1 ng / μl in a PBS horse buffer [PBS3X + 10% horse serum, (Société bioMérieux SA ref. 55842)].

La plaque est incubée 1 h à 37"C et lavée par 3X 300 pl de
PBS Tween [PBS1X + 0,5 % Tween 20 (Société Merck réf.
The plate is incubated for 1 hour at 37 "C and washed with 3X 300 μl of
PBS Tween [PBS1X + 0.5% Tween 20 (Merck company ref.

822184)].822184)].

200 pl de substrat PPD (Sigma SA, réf. PS187) sont ajoutés par puits. Après 20 minutes de réaction, l'activité enzymatique est bloquée par 100 ul d'H2S04 1N et la lecture est effectuée sur un lecteur de microplaques à 492 nm.200 μl of PPD substrate (Sigma SA, ref. PS187) are added per well. After 20 minutes of reaction, the enzymatic activity is blocked by 100 μl of 1N H2SO4 and the reading is carried out on a microplate reader at 492 nm.

Le système ne génère pas de bruit de fond puisque le puits contenant l'ADN de saumon du tampon d'hybridation qui est soniqué de la même manière que l'ADN des souches testées, ne génère pas de signal.The system does not generate background noise since the well containing the salmon DNA of the hybridization buffer which is sonicated in the same way as the DNA of the strains tested, does not generate a signal.

D'autres techniques d'hybridation moléculaire peuvent également être mises en oeuvre dans le cadre de l'invention.Other molecular hybridization techniques can also be used in the context of the invention.

Ces techniques d'hybridation moléculaire comportent toujours une phase d'hybridation suivie d'une phase de détection. La phase d'hybridation peut être réalisée dans des conditions très variées. Il s'agit le plus souvent d'hybridation sur membrane, comme dans le cas des dot-blot (où les acides nucléiques sont déposés et fixés directement en des endroits précis de la membrane) ou de Southern blot dans le cas desquels, après migration sur un gel d'électrophorèse, les acides nucléiques sont transférés puis fixés sur la membrane.These molecular hybridization techniques always include a hybridization phase followed by a detection phase. The hybridization phase can be carried out under a wide variety of conditions. It is most often hybridization on a membrane, as in the case of dot-blot (where the nucleic acids are deposited and fixed directly in precise places on the membrane) or Southern blot in the case of which, after migration on an electrophoresis gel, the nucleic acids are transferred and then fixed on the membrane.

Dans ce cas, ce sont les acides nucléiques cibles, correspondant dans le cadre de l'invention à 1'ADN génomique de Clavibacter michiganensis qui sont fixés sur la membrane.In this case, it is the target nucleic acids, corresponding in the context of the invention to the genomic DNA of Clavibacter michiganensis which are fixed on the membrane.

Au contraire, dans le cas d'hybridation sur des supports solides de type microplaques ou billes magnétiques, ce sont les sondes nucléiques correspondant aux séquences N"1 et N"2 qui sont fixées sur ledit support. Le support est sous toute forme appropriée telle que tube, cône, puits, plaque de microtitration, feuille, polymère soluble. Il est constitué par un matériau naturel, de synthèse, modifié chimiquement ou non et est, selon la technique retenue, choisi parmi les polystyrènes, les copolymères styrène-butadiène, les copolymères styrène-butadiène en mélange avec des polystyrènes, des polypropylènes, des polycarbonates, des copolymères polystyrène-acrylonitrile, des copolymères styrène-méthylméthacrylate de méthyle, parmi les fibres synthétiques Nylon et naturelles, parmi les polysaccharides et les dérivés de la cellulose.On the contrary, in the case of hybridization on solid supports of the microplate or magnetic bead type, it is the nucleic probes corresponding to the sequences N "1 and N" 2 which are fixed on said support. The support is in any suitable form such as tube, cone, well, microtiter plate, sheet, soluble polymer. It consists of a natural, synthetic material, chemically modified or not and is, depending on the technique chosen, chosen from polystyrenes, styrene-butadiene copolymers, styrene-butadiene copolymers in admixture with polystyrenes, polypropylenes, polycarbonates , polystyrene-acrylonitrile copolymers, styrene-methyl methacrylate copolymers, among nylon and natural synthetic fibers, among polysaccharides and cellulose derivatives.

Après cette phase d'hybridation, une phase de détection intervient. Pour ce faire, la sonde nucléique est couplée au préalable à une molécule dont la présence pourra être révélée.After this hybridization phase, a detection phase occurs. To do this, the nucleic acid probe is coupled beforehand to a molecule whose presence can be revealed.

Trois types de couplage existent a) les couplages avec un isotope radioactif (32p, 35sol ...), pour lesquels la révélation se fera par autoradiographie.Three types of coupling exist a) couplings with a radioactive isotope (32p, 35sol ...), for which the revelation will be by autoradiography.

b) les couplages avec une molécule enzymatique, pour lesquels la révélation se fait directement, comme la péroxydase ou la phosphatase alcaline ou une enzyme susceptible d'hydrolyser un substrat chromogène, fluorigène ou luminescent (Jablonski et coll., 1986 ; Li et coll., 1987).b) couplings with an enzymatic molecule, for which the revelation takes place directly, such as peroxidase or alkaline phosphatase or an enzyme capable of hydrolyzing a chromogenic, fluorigenic or luminescent substrate (Jablonski et al., 1986; Li et al. , 1987).

c) les couplages avec des séquences nucléotidiques particulières, des composés chimiques chromophores, des composés chromogènes, fluorigènes ou luminescents, des analogues de bases nucléotidiques ou des molécules inertes (acétyl amino fluorène, biotine, groupement sulfoné, la digoxygénine, des stéroïdes naturels, la digitale), révélées de façon indirecte grâce à des anticorps liés à des systèmes de révélation reconnaissant la molécule couplée à la sonde (Urdea et coll., 1988 ; Heino et coll., 1989 ; Grimont et coll., 1989 ; King et coll., 1989, Cuppels et coll., 1990;
Wood et coll., 1990).
c) couplings with particular nucleotide sequences, chromophoric chemical compounds, chromogenic, fluorigenic or luminescent compounds, analogs of nucleotide bases or inert molecules (acetyl amino fluorene, biotin, sulfonated group, digoxygenin, natural steroids, digital), revealed indirectly through antibodies linked to revelation systems recognizing the molecule coupled to the probe (Urdea et al., 1988; Heino et al., 1989; Grimont et al., 1989; King et al. , 1989, Cuppels et al., 1990;
Wood et al., 1990).

Dans les deux derniers cas b) et c), les systèmes de révélation font intervenir des réactions colorimétriques, la fluorescence ou la chimioluminescence.In the last two cases b) and c), the revelation systems involve colorimetric reactions, fluorescence or chemiluminescence.

L'exemple précité faisait intervenir un couplage de type b.The above example involved type b coupling.

A ces techniques d'hybridation moléculaire, il est toutefois préféré, dans le cadre de l'invention, les techniques d'amplification génique. On citera pour mémoire la technique de réaction de ligation en chaîne et la technique d'amplification par transcription inverse. La technique de réaction de ligation en chaîne ou LCR (Ligase Chain Reaction ; Barany, 1991) est une technique proche de la PCR. Cette technique utilise les propriétés d'une ligase thermorésistante qui permet de lier deux amorces contigües hybridées à la matrice d'ADN, ces deux amorces étant constituées par les séquences N"1 ou N"2 et une amorce choisie parmi les séquences décrites des régions V3 et V6 contigües de celle-ci.L'intérêt de la technique réside dans le fait que si des mésapariments apparaissent lors de l'hybridation des amorces, la réaction de ligation ne peut avoir lieu.It is preferred, in the context of the invention, to these molecular hybridization techniques, gene amplification techniques. As a reminder, the chain ligation reaction technique and the reverse transcription amplification technique will be mentioned. The Ligation Chain Reaction (LCR) technique (Ligase Chain Reaction; Barany, 1991) is a technique close to PCR. This technique uses the properties of a heat-resistant ligase which makes it possible to link two contiguous primers hybridized to the DNA template, these two primers being constituted by the sequences N "1 or N" 2 and a primer chosen from the sequences described from the regions V3 and V6 contiguous to it. The advantage of the technique lies in the fact that if mesapariments appear during the hybridization of the primers, the ligation reaction cannot take place.

La technique d'amplification par transcription inverse, ou
TAS (Transcription-based Amplification System, Kwoh et coll., 1989 ; Compton, 1991), est basée sur l'utilisation simultanée de deux enzymes - la transcriptase inverse du virus aviaire de la myéloblastose, qui permet la synthèse d'un ADN complémentaire à partir d'un hétéroduplex ARN/ADN constitué de la matrice
ARN à amplifier, hybridée à un oligonucléotide choisi - l'ARN polymérase du phage T7, qui, à partir du cDNA cible hybridé à un deuxième obligonucléotide portant la séquence de reconnaissance de cette enzyme, synthétise de 10 à 1000 copies d'ARN.
The amplification technique by reverse transcription, or
TAS (Transcription-based Amplification System, Kwoh et al., 1989; Compton, 1991), is based on the simultaneous use of two enzymes - avian myeloblastosis virus reverse transcriptase, which allows the synthesis of complementary DNA from an RNA / DNA heteroduplex made up of the matrix
RNA to be amplified, hybridized to a chosen oligonucleotide - phage T7 RNA polymerase, which, from target cDNA hybridized to a second obligonucleotide carrying the recognition sequence of this enzyme, synthesizes from 10 to 1000 copies of RNA.

Ainsi, à chaque cycle, le coefficient d'amplification obtenu est bien supérieur à 2, comme dans le cas de la PCR, et à partir d'une seule copie de la séquence à amplifier, il est possible en 4 cycles seulement d'obtenir 106 copies identiques (Kowh et coll., 1989).Thus, at each cycle, the amplification coefficient obtained is much greater than 2, as in the case of PCR, and from a single copy of the sequence to be amplified, it is possible in just 4 cycles to obtain 106 identical copies (Kowh et al., 1989).

Cependant, en raison du développement technique de ces différents procédés, il apparaît aujourd'hui que la technique la plus adaptée aux séquences objet de l'invention est la réaction en chaîne de la polymérase, ou PCR (Polymerase Chain
Reaction ; Saiki et coll., 1983).
However, due to the technical development of these different processes, it now appears that the technique most suited to the sequences which are the subject of the invention is the polymerase chain reaction, or PCR (Polymerase Chain
Reaction; Saiki et al., 1983).

Un exemple de mise en oeuvre de cette technique va être décrit ci-après.An example of implementation of this technique will be described below.

1. Préparation des échantillons
Il convient tout d'abord dans un premier temps de préparer des échantillons sur lesquels les sondes pourront être testées. Ces échantillons sont obtenus à partir de lots de semences de tomates ayant été soumises à une macération. La macération s'effectue dans les conditions suivantes : 50 ml de semence, soit environ 25 g de semence, sont mises à macérer pendant 24 heures sous agitation à 28 dans une solution de macération constituée de tampon phosphate 0,01M ajusté à pH 7,2 et d'acide nalidixique d'une concentration de 4 mg/l. La solution mère de ce tampon phosphate lOX présente une composition telle que suit 32,626gNa2HP0412H20 1, 088gKH2P04 H2Oqspll 2.Préparation des amorces
Il convient d'utiliser les séquences N"1 et N"2 spécifiques à l'identification de Clavibacter michiganensis. Ces séquences vont être utilisées sous forme d'amorce spécifique pour l'amplification par la polymérisation de l'ADN génomique codant pour l'ARN ribosomique 16S desdites bactéries. Ces amorces sont généralement utilisées sous forme de couple comportant la séquence N"1 et la séquence N"2. La séquence N"1 comme la séquence N"2 peuvent indifféremment constituer l'amorce de capture ou l'amorce de détection.
1. Preparation of samples
It is first of all advisable to prepare samples on which the probes can be tested. These samples are obtained from batches of tomato seeds which have been subjected to maceration. The maceration is carried out under the following conditions: 50 ml of semen, or approximately 25 g of semen, are macerated for 24 hours with stirring at 28 in a maceration solution consisting of 0.01M phosphate buffer adjusted to pH 7, 2 and nalidixic acid at a concentration of 4 mg / l. The mother solution of this lOX phosphate buffer has a composition as follows 32.626gNa2HP0412H20 1.0888gKH2P04 H2Oqspll 2. Preparation of primers
The sequences N "1 and N" 2 specific to the identification of Clavibacter michiganensis should be used. These sequences will be used in the form of a specific primer for the amplification by polymerization of the genomic DNA coding for the 16S ribosomal RNA of said bacteria. These primers are generally used in the form of a pair comprising the sequence N "1 and the sequence N" 2. The sequence N "1 as the sequence N" 2 can indifferently constitute the capture primer or the detection primer.

Le test est basé sur le fait que, si la bactérie recherchée est présente dans l'échantillon, l'oligosonde spécifique correspondant aux séquences N"1 et N"2 va pouvoir s'hybrider à sa séquence cible et l'amplification aura lieu. Sinon, en l'absence de la bactérie recherchée, l'oligosonde ne pourra pas s'hybrider et l'amplification ne s'effectuera pas.The test is based on the fact that, if the bacteria sought is present in the sample, the specific oligoprobe corresponding to the sequences N "1 and N" 2 will be able to hybridize to its target sequence and the amplification will take place. Otherwise, in the absence of the desired bacteria, the oligoprobe will not be able to hybridize and the amplification will not take place.

Dans l'exemple décrit, le couple séquence N"1, séquence N"2 détermine une région à amplifier de 592 paires de bases. La température d'hybridation utilisée pour la PCR correspondante (Tm) doit être de 66"C pour assurer la spécificité du test.In the example described, the pair sequence N "1, sequence N" 2 determines a region to be amplified by 592 base pairs. The hybridization temperature used for the corresponding PCR (Tm) must be 66 "C to ensure the specificity of the test.

Conditions de PCR
Milieu réactionnel : 1,5 mM MgCl2, 100 ng de chaque amorce, 0,25 U Taq Polymerase (Red GOLDSTAR, Eurogentec SA). 10 pL d'échantillon, volume final de 50 ,ul
Cycles PCR 1 cycle : 10 mn, 95"C 30 cycles : 1 mn 95"C ; 1 mn 66 C ; 30 s 72 C 1 cycle : 10 mn, 72"C.
PCR conditions
Reaction medium: 1.5 mM MgCl2, 100 ng of each primer, 0.25 U Taq Polymerase (Red GOLDSTAR, Eurogentec SA). 10 µL of sample, final volume of 50 µl
PCR cycles 1 cycle: 10 min, 95 "C 30 cycles: 1 min 95"C; 1 min 66 C; 30 s 72 C 1 cycle: 10 min, 72 "C.

On obtient ainsi en 2 heures correspondant à environ 30 cycles de réaction 230 séquences double brin théoriquement identiques à celle choisie initialement.There are thus obtained in 2 hours corresponding to approximately 30 reaction cycles 230 double strand sequences theoretically identical to that chosen initially.

Chaque amorce peut jouer indifféremment un rôle d'amorce de capture ou d'amorce de révélation. L'amorce de capture qui comprend ladite séquence N"1 ou N"2 est fixée sur un support par absorption passive ou couplée à un marqueur ou associée à une séquence nucléotidique particulière, par exemple, la séquence de reconnaissance spécifique de CGN4 comme cela est mis en oeuvre dans le kit captagène -GCN4 commercialisé par
Amrad Corporation Australie.
Each primer can play either a capture primer or a revelation primer. The capture primer which comprises said sequence N "1 or N" 2 is fixed on a support by passive absorption or coupled to a marker or associated with a particular nucleotide sequence, for example, the specific recognition sequence of CGN4 as is implemented in the captagen kit -GCN4 marketed by
Amrad Corporation Australia.

L'amorce de révélation comprend ladite séquence N"1 ou N"2 couplée à une molécule biochimique de révélation. Ainsi, dans l'exemple précité, l'amorce de capture (séquence N"1) était fixée directement sur la microplaque de révélation tandis que l'amorce de révélation (séquence N"2) était couplée à la péroxydase.The revealing primer comprises said N "1 or N" 2 sequence coupled to a biochemical revealing molecule. Thus, in the above example, the capture primer (sequence N "1) was fixed directly on the development microplate while the development primer (sequence N" 2) was coupled to peroxidase.

Parmi les marqueurs susceptibles d'être couplés à l'amorce de capture ou à l'amorce de révélation, on peut citer notamment des isotopes radioactifs, des séquences nucléiques, des molécules enzymatiques telles que la péroxydase ou la phosphatase alcaline, ou toute autre enzyme susceptible d'hydrolyser un substrat chromogène, fluorigène ou luminescent, des composés chimiques chromophores, des composés chromogènes, fluorigènes ou luminescents, des analogues de bases nucléotidiques ou des molécules inertes (acétyl amino fluorène, la biotine, groupement sulfoné, la digoxygénine, des stéroïdes naturels, la digitale), révélées de façon indirecte grâce à des anticorps liés à des systèmes de révélation reconnaissant la molécule couplée à la sonde (Urdea et coll., 1988 ; Heino et coll., 1989 ; Grimont et coll., 1989 ; King et coll., 1989, Cuppels et coll., 1990
Wood et coll., 1990).
Among the markers capable of being coupled to the capture primer or to the revelation primer, mention may be made in particular of radioactive isotopes, nucleic sequences, enzymatic molecules such as peroxidase or alkaline phosphatase, or any other enzyme capable of hydrolyzing a chromogenic, fluorigenic or luminescent substrate, chemical chromophoric compounds, chromogenic, fluorigenic or luminescent compounds, analogs of nucleotide bases or inert molecules (acetyl amino fluorene, biotin, sulfonated group, digoxygenin, steroids natural, digitalis), revealed indirectly through antibodies linked to revelation systems recognizing the molecule coupled to the probe (Urdea et al., 1988; Heino et al., 1989; Grimont et al., 1989; King et al., 1989, Cuppels et al., 1990
Wood et al., 1990).

Il est ainsi possible, pour permettre l'automatisation de cette étape de révélation, de réaliser une révélation par hybridation sur support solide de type microplaque, pour visualiser les fragments amplifiés. Pour ce faire, deux sondes (par exemple, la séquence N"1 et la séquence complémentaire de la séquence N"2), du type de celles décrites ci-dessus, situées à l'intérieur de la séquence amplifiée, sont utilisées : la première, correspondant à l'amorce de capture, est fixée sur le support et permet de "capter" le fragment amplifié ; la seconde, correspondant à l'amorce de détection, couplée à un système de marquage non radioactif, entraînant une réaction colorimétrique, permet la révélation.It is thus possible, to allow the automation of this revelation step, to carry out a revelation by hybridization on solid support of microplate type, to visualize the amplified fragments. To do this, two probes (for example, the sequence N "1 and the sequence complementary to the sequence N" 2), of the type of those described above, located inside the amplified sequence, are used: the first, corresponding to the capture primer, is fixed on the support and makes it possible to "capture" the amplified fragment; the second, corresponding to the detection primer, coupled to a non-radioactive labeling system, causing a colorimetric reaction, allows the revelation.

Classiquement, la phase de révélation peut également être réalisée par coloration au bromure d'éthidium des fragments amplifiés séparés sur gel d'électrophorèse.Conventionally, the revelation phase can also be carried out by staining with ethidium bromide the amplified fragments separated on an electrophoresis gel.

Lorsque la PCR est réalisée sur des suspensions de
Clavibacter michiganensis de concentrations connues, par exemple 5.106 bactéries/ml, le seuil minimum de détection atteint par cette méthode, en particulier par révélation au bromure d'éthidïum est de 1 bactérie pour 10 pl d'échantillon, soit une concentration de 100 bactéries / ml pour 30 cycles de PCR. La présence d'un grand nombre de bactéries contaminantes n'affecte pas la sensibilité et la spécificité du test. Pour obtenir des résultats fiables, il convient d'utiliser les séquences N"1 et N"2 simultanément, comme précisé ci-dessus.
When PCR is carried out on suspensions of
Clavibacter michiganensis with known concentrations, for example 5,106 bacteria / ml, the minimum detection threshold reached by this method, in particular by revelation with ethidium bromide is 1 bacteria per 10 μl of sample, ie a concentration of 100 bacteria / ml for 30 PCR cycles. The presence of a large number of contaminating bacteria does not affect the sensitivity and specificity of the test. To obtain reliable results, the N "1 and N" 2 sequences should be used simultaneously, as specified above.

Séquence N"1 : GCGAAAGTGA CGGTACCTGC A
Séquence N"2 : TATACCGACT TGCGCGGCAC A
Séquence N"3 : CCAGACTCCT ACGGGAGGCA
Séquence N 4 : GTATTACCGC GGCTGCTGGC
Séquence N 5 : TTGACGGGGG CCCGCACAAG
Séquence N 6 : TTGCGGGACT TAACCCAACA T
Sequence N "1: GCGAAAGTGA CGGTACCTGC A
Sequence N "2: TATACCGACT TGCGCGGCAC A
Sequence N "3: CCAGACTCCT ACGGGAGGCA
Sequence N 4: GTATTACCGC GGCTGCTGGC
Sequence N 5: TTGACGGGGG CCCGCACAAG
Sequence N 6: TTGCGGGACT TAACCCAACA T

Claims (13)

REVENDICATIONS 1. Fragment monocaténaire de l'ADN génomique de Clavibacter michiganensis codant pour l'ARN 16S, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une séquence nucléotidique présentant au moins 70 % d'homologie avec au moins une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences nucléotidiques, séquence N"1, séquence N"2 identifiées dans la description, et leurs séquences complémentaires respectives.CLAIMS 1. Single-stranded fragment of the genomic DNA of Clavibacter michiganensis encoding 16S RNA, characterized in that it comprises at least one nucleotide sequence having at least 70% homology with at least one nucleotide sequence chosen from the sequences nucleotides, sequence N "1, sequence N" 2 identified in the description, and their respective complementary sequences. 2. Sonde susceptible de s'hybrider spécifiquement avec l'ADN génomique de Clavibacter michiganensis, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une séquence nucléotidique présentant au moins 70 % d'homologie avec au moins une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences nucléotidiques, séquence N"1, séquence N"2 identifiées dans la description, et leurs séquences complémentaires respectives.2. Probe capable of hybridizing specifically with the genomic DNA of Clavibacter michiganensis, characterized in that it comprises at least one nucleotide sequence having at least 70% homology with at least one nucleotide sequence chosen from the nucleotide sequences, sequence N "1, sequence N" 2 identified in the description, and their respective complementary sequences. 3. Sonde de capture selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les sondes de la revendication 2.3. Capture probe according to claim 2, characterized in that it is chosen from the probes of claim 2. 4. Sonde de détection selon la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les sondes de la revendication 2.4. Detection probe according to claim 2, characterized in that it is chosen from the probes of claim 2. 5. Sonde selon l'une des revendications 2 à 4, caractérisée en ce qu'elle est marquée au moyen d'un marqueur choisi parmi des isotopes radioactifs, des molécules enzymatiques telles que la péroxydase et la phosphatase alcaline ou toute autre enzyme susceptible d'hydrolyser un substrat chromogène, fluorigène ou luminescent, des séquences nucléotidiques spécifiques, des composés chimiques chromophores, des composés chromogènes, fluorigènes ou luminescents, des analogues de bases nucléotidiques, des molécules inertes telles que la biotine, la digoxygénine, des stéroïdes.5. Probe according to one of claims 2 to 4, characterized in that it is marked by means of a marker chosen from radioactive isotopes, enzymatic molecules such as peroxidase and alkaline phosphatase or any other enzyme capable of hydrolyze a chromogenic, fluorigenic or luminescent substrate, specific nucleotide sequences, chromophoric chemical compounds, chromogenic, fluorigenic or luminescent compounds, nucleotide base analogs, inert molecules such as biotin, digoxygenin, steroids. 6. Amorce spécifique pour l'amplification par la polymérisation de l'ADN génomique de Clavibacter michiganensis, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une séquence nucléotidique présentant au moins 70 % d'homologie avec au moins une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences nucléotidiques, séquence N"1, séquence N"2 identifiées dans la description, et leurs séquences complémentaires respectives.6. Specific primer for the amplification by polymerization of the genomic DNA of Clavibacter michiganensis, characterized in that it comprises at least one nucleotide sequence having at least 70% homology with at least one nucleotide sequence chosen from the sequences nucleotides, sequence N "1, sequence N" 2 identified in the description, and their respective complementary sequences. 7. Couple d'amorce selon la revendication 6, caractérisé en ce que en ce qu'il est choisi parmi les couples d'amorce constitués par une amorce de capture et une amorce de détection, l'une répondant à une séquence N"1 ou à sa séquence complémentaire et l'autre répondant à une séquence N"2 ou à sa séquence complémentaire.7. Primer pair according to claim 6, characterized in that it is chosen from the primer pairs constituted by a capture primer and a detection primer, one corresponding to a sequence N "1 or to its complementary sequence and the other corresponding to an N "2 sequence or to its complementary sequence. 8. Amorce selon l'une des revendications 6 et 7, caractérisée en ce que l'amorce est fixée sur un support ou marquée au moyen d'un marqueur choisi parmi des isotopes radioactifs, des séquences nucléotidiques spécifiques, des molécules enzymatiques telles que la péroxydase et la phosphatase alcaline ou toute autre enzyme susceptible d'hydrolyser un substrat chromogène, fluorigène ou luminescent, des composés chimiques chromophores, des composés chromogènes, fluorigènes ou luminescents, des analogues de bases nucléotidiques, des molécules inertes telles que la biotine, la digoxygénine, des stéroïdes.8. Primer according to one of claims 6 and 7, characterized in that the primer is fixed on a support or labeled with a marker chosen from radioactive isotopes, specific nucleotide sequences, enzymatic molecules such as peroxidase and alkaline phosphatase or any other enzyme capable of hydrolyzing a chromogenic, fluorigenic or luminescent substrate, chromophoric chemical compounds, chromogenic, fluorogenic or luminescent compounds, nucleotide base analogs, inert molecules such as biotin, digoxygenin , steroids. 9. Réactif pour détecter sélectivement le Clavibacter michiganensis dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une sonde selon l'une des revendications 2 à 5. 9. Reagent for selectively detecting Clavibacter michiganensis in a biological sample, characterized in that it comprises at least one probe according to one of claims 2 to 5. 10. Réactif selon la revendication 9, caractérisé en ce que chaque sonde est en milieu liquide ou fixée sur un support solide directement ou indirectement.10. Reagent according to claim 9, characterized in that each probe is in a liquid medium or fixed on a solid support directly or indirectly. 11. Réactif pour détecter sélectivement le Clavibacter michiganensis dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une amorce selon l'une des revendications 6 à 8.11. Reagent for selectively detecting Clavibacter michiganensis in a biological sample, characterized in that it comprises at least one primer according to one of claims 6 to 8. 12. Procédé de détection sélective de Clavibacter michiganensis dans un échantillon biologique selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'on expose l'ADN génomique ou l'ARN des bactéries contenu dans ledit échantillon sous forme de fragment monocaténaire à au moins une sonde et on détecte les zones d'hybridation avec ladite sonde.12. A method of selective detection of Clavibacter michiganensis in a biological sample according to one of claims 1 to 5, characterized in that the genomic DNA or the RNA of the bacteria contained in said sample is exposed in the form of a single-stranded fragment to at least one probe and the hybridization zones are detected with said probe. 13. Procédé de détection sélective de Clavibacter michiganensis selon l'une des revendications 1 et 7, caractérisé en ce qu'on réalise une amplification de l'ADN génomique de Clavibacter michiganensis en présence d'un système enzymatique adapté et au moins un couple d'amorces, en ce qu'on identifie les fragments amplifiés. 13. A method of selective detection of Clavibacter michiganensis according to one of claims 1 and 7, characterized in that an amplification of the genomic DNA of Clavibacter michiganensis is carried out in the presence of an adapted enzymatic system and at least one pair of primers, in that the amplified fragments are identified.
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