FR2672301A1 - Process and device for amplifying the number of a defined sequence of nucleic acid in a biological sample - Google Patents

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Abstract

The process and device relate to the amplification of the number of at least one defined sequence of nucleic acid or its complementary sequence, hereinafter called target sequences, in a biological sample, characterised by the fact that, on the one hand, the process comprises a supply of active ingredients to the said sample and at least one preliminary step, designed to increase the accessibility of the nucleic acids present in the sample, followed by an amplification step, on the other hand, that the said sample, as well as the active ingredients, become confined inside a hermetically closed space during the entire period for carrying out the process.

Description

La présente invention s'applique au domaine du diagnostic en biologie, qu'il s'agisse de la santé humaine, de la santé animale ou de l'agro-alimentaire. The present invention applies to the field of diagnostics in biology, be it human health, animal health or the food. En santé humaine et animale, un tel diagnostic s'applique à la mise en évidence d'une infection par un pathogène et à la détection de maladies génétiques. In human and animal health, such a diagnosis is applied to the detection of a pathogen infection and detection of genetic diseases. En agro-alimentaire, ce diagnostic s'applique à la mise en évidence dans les denrées alimentaires d'un contaminant tel qu'un micro-organisme pathogène. In food, this diagnosis applies to the demonstration in food of a contaminant such as a pathogen.

A titre d'exemple, une infection virale chez un individu ne peut, en routine, être décelée qu'à l'aide de tests immunologiques. For example, a viral infection in an individual may routinely be detected only by using immunoassays. En effet, dans la plupart des cas ce sont les anticorps dirigés contre le virus qui sont recherchés, ce qui est une preuve indirecte de la présence du virus. Indeed, in most cases it is the antibodies against the virus that are wanted, which is indirect evidence of the virus. Dans certains cas particuliers où la virémie est importante, les antigènes viraux peuvent être directement recherchés dans le sang des individus. In special cases where viremia is important viral antigens can be directly searched in the blood of individuals. C'est le cas par exemple, pour le diagnostic d'une infection par le virus de l'hépatite B (VHB). This is the case for example for the diagnosis of infection with hepatitis B virus (HBV). De manière générale, les tests immunologiques ont des performances moyennes et ceci du fait de leur manque de sensibilité et de spécificité. In general, immunoassays have average performance and this because of their lack of sensitivity and specificity.

Les tests immunologiques les plus performants permettent de détecter de 105 à 106 particules virales par millilitre. The best performing immunoassays to detect 105 to 106 viral particles per milliliter. Or pour le VHB, un sérum est considéré comme infectieux jusqu'à 102 particules virales par millilitre (Prince et col., 1983). Gold for HBV, a serum is considered up to 102 infectious viral particles per milliliter (Prince et al., 1983). Le nombre de résultats faussement négatifs est donc important, puisque le seuil d'infectiosité est au moins 1000 fois plus faible que le seuil de sensibilité des tests immunologiques. The number of false negative results is important, since the infectivity threshold is at least 1000 times lower than the immunoassay sensitivity threshold.

Le manque de spécificité de ces tests est directement lié aux réactions immunologiques mises en jeu. II en résulte des résultats faussement positifs que l'on tente de mettre en évidence à l'aide d'un second test immunologique, couramment appelé "test de confirmation". The lack of specificity of these tests is directly related to immunological reactions involved. This results in false positive results we are trying to highlight with a second immunoassay, commonly called "confirmatory test ".

Cette approche est en particulier utilisée pour la détection des virus responsables du SIDA (Syndrome d'lmmunodéficience Acquise) This approach is particularly used for detecting AIDS virus responsible (Acquired Syndrome lmmunodéficience)
II existe aujourd'hui dans le domaine de la recherche des méthodes de biologie moléculaire permettant de diagnostiquer une infection par un pathogène avec un sensibilité et une spécificité très supérieures à celles obtenues avec les tests immunologiques. There exists today in the research of molecular biological methods for diagnosing infection by a pathogen with a much higher sensitivity and specificity than those obtained with immunological tests. Ces méthodes basées sur l'hybridation moléculaire des acides nucléiques permettent en outre d'avoir une preuve directe de la présence du pathogène, puisque c'est son propre matériel génétique qui est détecté. These methods based on molecular hybridization of nucleic acids also allow to have a direct proof of the presence of the pathogen, since it is its own genetic material is detected.

Un tel diagnostic, basé sur l'hybridation moléculaire, a pour finalité la mise en évidence d'au moins une séquence définie d'acide désoxyribonucléique (ADN) ou d'acide ribonucléique (ARN) dans un échantillon biologique. Such a diagnosis, based on molecular hybridization, aims the highlighting of at least one acid of defined sequence deoxyribonucleic (DNA) or ribonucleic acid (RNA) in a biological sample. Pour les infections par un pathogène (virus, bactérie, parasite, etc...) c'est une séquence précise du matériel génétique du pathogène qui est mise en évidence. For infections by a pathogen (virus, bacteria, parasites, etc ...) it is a precise sequence of the pathogen genetic material that is highlighted. Pour les maladies génétiques (plus de 3000 chez l'homme), c'est une anomalie dans une séquence précise de 'ADN génomique qui est révélée. For Genetic Diseases (over 3000 humans) is an abnormality in a specific sequence of genomic DNA which is revealed. Pour atteindre une très grande sensibilité il est nécessaire d'amplifier in vitro le nombre de molécules d'ADN ou d'ARN qui doivent être mises en évidence. To achieve very high sensitivity is required in vitro amplifying the number of DNA or RNA molecules that need to be highlighted. Les séquences d'ADN ou d'ARN ainsi amplifiées sont détectées dans un second temps par hybridation moléculaire à l'aide de sondes nucléiques. The DNA or RNA sequences thus amplified are detected in a second step by molecular hybridization using nucleic acid probes.

Les meilleurs résultats sont actuellement obtenus en utilisant la technique d'amplification par réaction en chaine d'une ADN polymérase, plus couramment appelée technique PCR ("Polymerase Chai n Reaction") (Saiki et col., 1985). The best results are currently obtained using the technique of chain reaction amplification of a DNA polymerase, most commonly technique called PCR ( "Polymerase Chai No Reaction") (Saiki et al., 1985).

La technique d'amplification enzymatique in vitro ou technique d'amplification par PCR a été décrite en décembre 1985 et appliquée au diagnostic chez l'homme de l'anémie à hématies falciformes. The technique of in vitro enzymatic amplification or amplification technique by PCR has been described in December 1985 and applied to the diagnosis in humans of sickle cell anemia.

Contrairement à tous les systèmes d'amplification décrits jusqu'ici , la technique PCR permet d'amplifier spécifiquement la quantité de séquences d'ADN double brin cible avant qu'elles ne soient détectées par hybridation moléculaire. Unlike all the amplification systems described so far, the PCR technique allows to specifically amplify the amount of target duplex DNA sequences before they are detected by molecular hybridization. Le principe de la PCR est d'utiliser de manière répétitive l'activité d'une ADN polymérase pour copier la séquence d'ADN à amplifier. The principle of PCR is to use repeatedly the activity of a DNA polymerase to copy the DNA sequence to be amplified. Les bases technologiques de la PCR reposent sur deux points fondamentaux. The technological basis of PCR based on two fundamental points. Le premier point concerne l'utilisation de deux amorces oligonucléotidiques distantes de n nucléotides, I'une complémentaire du brin ADN (+), L'autre du brin ADN (-) et dont les extrémités 3' sont en regard. The first point concerns the use of two spaced oligonucleotide primers of n nucleotides, complementary I'une DNA (+) strand, the other strand of the DNA (-) and whose 3 'ends are opposite. Le second point concerne l'utilisation répétitive de l'activité d'une ADN polymérase.La conséquence immédiate de ces deux points est que, dans des conditions adéquates toutes les séquences néosynthétisées au cycle (n) peuvent être utilisées comme matrice par l'ADN polymérase ati cycle (n+1). The second point concerns the repetitive use of the activity of a DNA polymérase.La immediate consequence of these two points is that, under appropriate conditions all newly synthesized sequences cycle (n) can be used as a template by DNA ati polymerase cycle (n + 1). Ainsi toutes les séquences spécifiques présentes après le cycle (n) peuvent être copiées au cycle (n+1). Thus all specific sequences present after the cycle (n) can be copied at cycle (n + 1). II en résulte une amplification exponentielle du nombre de séquences spécifiques en fonction du nombre de cycles. This results in exponential amplification of the number of specific sequences according to the number of cycles.

Plusieurs étapes successives sont nécessaires au déroulement d'un cycle de PCR. Several successive steps are necessary for the conduct of a PCR cycle. II faut tout d'abord permettre l'hybridation spécifique d'un oligonucléotide avec une séquence d'ADN cible simple brin à amplifier. It must firstly allow specific hybridization of an oligonucleotide with a target single-stranded DNA sequence to be amplified. A partir du complexe d'hybridation ainsi formé une ADN polymérase réalise la synthèse du brin d'ADN complémentaire en utilisant l'oligonucléotide comme amorce et le brin d'ADN cible à amplifier comme matrice. From the hybridization thus formed DNA polymerase complex The synthesis of the complementary DNA strand by using the oligonucleotide as a primer and the target DNA strand to be amplified as a template. De manière plus précise, un cycle d'amplification est composé de trois étapes. More specifically, an amplification cycle comprises three stages. La première étape permet de réaliser la dénaturation des séquences d'ADN double brin à 90-100 C. La seconde étape permet d'aboutir à l'hybridation spécifique des oligonucléotides permise par un abaissement de la température au cours de la phase d' hybridation des amorces.La troisième étape autorise l'extension de l'oligonucléotide hybridé à une température proche de la température optimale de fonctionnement de l'ADN polymérase (37"C pour le fragment de Klenow et 720C pour une ADN polymérase thermorésistante extraite à partir de Thermus aquiticus). The first step allows for denaturation of double-stranded DNA sequences at 90-100 C. The second step makes it possible to achieve specific hybridization of the oligonucleotides permitted by lowering the temperature during the phase of hybridization third step amorces.La allows the extension of the oligonucleotide hybridized to a temperature near the optimum temperature of operation of the DNA polymerase (37 "C for Klenow and 720C for a heat-resistant DNA polymerase derived from Thermus aquiticus).

Lors du cycle d'amplification (n+1), les séquences d'ADN simple brin sont synthétisées en utilisant comme matrices les séquences néosynthétisées au cycle (n), ainsi que les séquences présentes à la fin du cycle (nl). During the amplification cycle (n + 1), the single stranded DNA sequences are synthesized using as template the newly synthesized sequences cycle (n), and the sequences present at the end of cycle (nl). Une séquence néosynthétisée au n ème cycle ne pourra ainsi servir d'amorce au cycle (n+1) que si sa longueur est au moins égale à la distance en bases séparant les deux amorces. A sequence neosynthesized through n'th cycle can thus serve as a primer in the cycle (n + 1) if its length is at least equal to the distance separating the two bases in primers. Dans ces conditions, le nombre de séquences d'ADN amplifiées spécifiquement varie exponentiellement par rapport au nombre de cycles. Under these conditions, the number of specifically amplified DNA sequences varies exponentially relative to the number of cycles.

L'amplification à partir de séquences d'ARN nécessite de réaliser une étape préliminaire de synthèse de l'ADN complémentaire (ADNc). Amplification from RNA sequences requires to carry out a preliminary step of synthesis of complementary DNA (cDNA).

Cette approche est importante pour la détection du génome de rétrovirus comme le virus de l'immunodéficience humaine (VIH) responsable du This approach is important for the detection of retroviral genome as the HIV (HIV) responsible for the
SIDA chez l'homme (Ou et col., 1988). AIDS in humans (Or et al., 1988).

La réaction d'hybridation moléculaire entre deux séquences d'acides nucléiques est directement liée à la température. The molecular hybridization reaction between two nucleic acid sequences is directly related to temperature. Cette hybridation basée sur la complémentarité des bases entre deux séquences peut intervenir, entre deux molécules d'ADN, entre deux molécules d'ARN, ou entre une molécule d'ADN et une molécule d'ARN. This hybridization based on base complementarity between two sequences can occur between two DNA molecules, between two RNA molecules, or between a DNA molecule and an RNA molecule.

L'hybridation moléculaire permet donc de réaliser, soit l'appariement par liaison hydrogène entre deux molécules distinctes, soit l'appariement intra-moléculaire entre deux séquences complémentaires. Molecular hybridization therefore makes it possible, either pairing by hydrogen bonding between two separate molecules, or the intramolecular pairing between complementary sequences. Dans ce dernier cas, il y a formation de structure dite secondaire de molécules d'ADN ou d'ARN. In the latter case, there is formation of so-called secondary structure of DNA or RNA molecules. L'influence de la température sur la réaction d'hybridation est essentielle et chaque séquence d'ADN (ou d'ARN) est définie par son Tm, c'est à dire la température à laquelle 50 % des séquences sont appariées aux séquences complémentaires. The influence of temperature on the hybridization reaction is essential and each DNA sequence (or RNA) is defined by its Tm, ie the temperature at which 50% of the sequences are paired to complementary sequences . Le Tm d'une séquence précise peut être évalué expérimentalement en suivant par spectrophotométrie l'hyperchromicité à 260 nanomètres qui accompagne le désappariement (ou dénaturation) de deux séquences d'ADN complémentaires.La totalité des séquences d'ADN sont sous forme simple brin à température élevée (100"C) et sous forme double brin à température basse (1 0-200C). The Tm of a particular sequence can be evaluated experimentally by following spectrophotometrically the hyperchromicity at 260 nm that accompanies the mismatch (or denaturation) of two DNA sequences complémentaires.La all DNA sequences are single-stranded in high temperature (100 "C) and double-stranded form at low temperatures (0-200C 1).

Le Tm d'une séquence d'ADN dépend finalement des deux paramètres suivants: de la séquence en bases de 'ADN en question et de la force ionique du milieu. The Tm of a DNA sequence ultimately depends on two parameters: the base sequence of DNA in question and ionic strength of the medium. Les Tm généralement rencontrés varient de 20 à 85 "C. Ainsi, la totalité des réactions d'hybridation moléculaire doivent être réalisées dans des conditions thermiques parfaitement définies et contrôlées. Tm generally encountered vary from 20 to 85 "C. Thus, all of the molecular hybridization reactions must be carried out under thermal conditions well defined and controlled.

Pour le diagnostic biologique (santé humaine, santé animale, agro-alimentaire) une séquence d'ADN ou d'ARN définie peut être détectée à l'aide de la séquence d'ADN ou d'ARN complémentaire utilisée comme sonde moléculaire . Laboratory diagnosis (human health, animal health, food) a sequence of DNA or RNA defined can be detected using the DNA sequence or complementary RNA used as molecular probe. La sonde est préalablement marquée, soit à l'aide d'un isotope radioactif, soit à l'aide d'une modification chimique. The probe is labeled beforehand, either with a radioactive isotope, using either a chemical modification. Après hybridation entre la séquence cible et la séquence sonde, cette dernière peut être détectée grâce à son marquage. After hybridization between the target sequence and the probe sequence, the latter may be detected by its marking.

Dans l'état actuel des connaissances, il est possible de détecter la présence d'une seule molécule d'ADN (acide désoxyribonucléique) ou d'ARN (acide ribonucléique) dans un échantillon biologique en associant la technique PCR et l'hybridation moléculaire à l'aide d'une sonde nucléique. In the present state of knowledge, it is possible to detect the presence of a single molecule of DNA (deoxyribonucleic acid) or RNA (ribonucleic acid) in a biological sample by combining the PCR and molecular hybridization using a nucleic probe. En d'autre terme, les tests basés sur l'hybridation moléculaire permettent d'atteindre une sensibilité extrême puisqu'un seul pathogène peut être mis en évidence dans un échantillon (Wong et col., 1987). In other words, the tests based on molecular hybridization achieve extreme since a single pathogen sensitivity can be detected in a sample (Wong et al., 1987). Par comparaison avec un test immunologique, le gain en sensibilité est de 10.000 fois environ. Compared with an immunoassay, the gain in sensitivity is approximately 10,000 times.

La spécificité des réactions d'hybridation moléculaire est excellente puisqu'il est possible de mettre en évidence une infime variation dans la séquence des bases composant le matériel génétique d'un individu. The specificity of molecular hybridization reactions is excellent since it is possible to highlight a tiny variation in the sequence of bases comprising the genetic material of an individual. La modification d'une seule base sur les 3.500.000.000 de bases qui composent le génome humain peut ainsi être mise en évidence. Changing a single base on the basis of 3.5 billion that make up the human genome can thus be detected.

Malgré cette très grande spécificité des réactions d'hybridation, un test de diagnostic ultra-sensible, associant l'utilisation de la PCR et de l'hybridation moléculaire à l'aide d'une sonde nucléique, n'a pas une bonne spécificité. Despite this very high specificity of hybridization reactions, a highly sensitive diagnostic test, involving the use of PCR and molecular hybridization using a nucleic acid probe, does not have good specificity. II n'est en effet pas rare d'obtenir des résultats faussement positifs qui diminuent significativement la spécificité globale du test. It is not uncommon effect of obtaining false positive results which significantly reduce the overall specificity of the test. Ce phénomène est dû à des contaminations moléculaires accidentelles d'échantillons négatifs par au moins une molécule d'ADN ou d'ARN que l'on cherche à détecter (Lo et col., 1988). This phenomenon is due to accidental molecular contamination of negative samples by at least one molecule of DNA or RNA that is to be detected (Lo et al., 1988). Ces contaminations qui altèrent la spécificité globale du test ont lieu entre le prélèvement de l'échantillon biologique et la fin de l'amplification des séquences d'ADN par PCR. These contaminations which affect the overall specificity of the assay take place between the sampling of the biological sample and the end of the amplification of DNA sequences by PCR. Les résultats faussement positifs sont finalement une conséquence directe de la très grande sensibilité du test. False positive results are finally a direct result of the very high sensitivity of the test.

En d'autre terme, l'utilisation d'une technique d'amplification aussi puissante que la PCR, a permis de découvrir l'existence de contaminations moléculaires jusqu'ici insoupçonnées. In other words, the use of so powerful an amplification technique that PCR has revealed the existence of hitherto unsuspected molecular contamination.

La sensibilité extrême atteinte par les tests de diagnostic basés sur la PCR est ainsi à l'origine d'un nouveau type de résultats faussement positifs liés aux contaminations moléculaires. The extreme sensitivity achieved by diagnostic tests based on PCR is at the origin of a new type of false positive results related to molecular contamination. L'ampleur du problème est telle qu'il est aujourd'hui nécessaire d'effectuer les différentes étapes du test dans des locaux différents pour tenter de minimiser ce phénomène. The magnitude of the problem is such that it is now necessary to perform the steps of the test in different rooms to try to minimize this.

Ce cloisonnement permet de séparer physiquement les manipulations pré-PCR, réalisées sur des échantillons pauvres en ADN spécifique, des manipulations post-PCR, réalisées sur des échantillons très riches en This partitioning allows physically separate pre-PCR manipulations performed on poor samples specific DNA post-PCR manipulation performed on very rich samples
ADN spécifique. specific DNA. Un minimum de trois pièces indépendantes (mais 4 de préférence) avec leur propre sas de sécurité commence à être installé dans un grand nombre de laboratoires de recherche dans le monde. A minimum of three independent parts (but preferably four) with its own security gates beginning to be installed in many research laboratories worldwide. Ces pièces sont en surpression ou en dépression selon que l'étape qui s'y déroule est pré-PCR ou post-PCR respectivement. These parts are in positive or negative pressure depending on whether the step which takes place is pre-PCR or post-PCR respectively.

Ce cloisonnement permet de réduire sensiblement le nombre de résultats faussement positifs mais non de les éliminer totalement. This partitioning significantly reduces the number of false positives, but not eliminate them completely. Cette approche reste en tout état de cause coûteuse, et rend très complexe un test qui à la base devait être simple. This approach is costly in any case, and makes a very complex test that the foundation had to be simple.

II existe actuellement dans le circuit commercial un certain nombre d'appareils ne pouvant exécuter qu'une des 3 ou 4 étapes qui composent un test de diagnostic utilisant la PCR et l'hybridation moléculaire à l'aide d'une sonde nucléique. There are presently on the commercial circuit a number of devices capable of performing one of the 3 or 4 steps that make up a diagnostic test using PCR and molecular hybridization using a nucleic probe. Les seules étapes ainsi automatisées sont l'étape d'extraction des acides nucléiques à partir de l'échantillon biologique et l'étape d'amplification des séquences d'ADN par PCR. The only steps are automated and the step of extracting nucleic acids from the biological sample and the step of amplifying DNA sequences by PCR.

Pour réaliser l'étape d'extraction des acides nucléiques à partir de l'échantillon biologique, un seul appareil est aujourd'hui disponible sur le marché mondial. To perform the step of extracting nucleic acids from the biological sample, a single device is now available on the world market. C'est un appareil coûteux, ne pouvant traiter qu'un très faible nombre d'échantillons (8 au maximum) en 6 heures environ. This is an expensive apparatus which can handle only a very small number of samples (maximum 8) in approximately 6 hours.

L'ensemble de ses caractéristiques font que cet appareil ne peut être utilisé que dans un laboratoire de recherche très spécialisé. All of its features make this device to be used in a research laboratory.

Entre 12 et 15 appareils différents permettent de réaliser automatiquement l'étape d'amplification des séquences d'ADN par PCR. Between 12 and 15 different devices to automatically perform the step of amplifying DNA sequences by PCR.

La totalité de ces machines soumettent à différentes températures des tubes plastiques jetables et indépendants, d'une capacité variant de 0,75 ml à 1,50 ml. All of these machines subject to different temperatures disposable self plastic tubes, with a capacity ranging from 0.75 ml to 1.50 ml. Chaque tube contient l'échantillon biologique à traiter. Each tube contains the biological sample to be treated. Deux appareils sont également proposés avec un adaptateur pouvant recevoir une plaque de microtitration. Both devices are also available with an adapter that can receive a microtiter plate.

De manière générale, les appareils existants ont été conçus pour réaliser automatiquement une étape technologique précise. In general, existing devices are designed to automatically perform a technological step precisely. Aucun d'entre eux ne permet de réaliser la totalité d'un test de diagnostic par hybridation moléculaire. None of them permits to carry out all of a diagnostic test by molecular hybridization. Ainsi l'utilisation consécutive d'un appareil d'extraction des acides nucléiques et d'un appareil PCR oblige à effectuer, entre ces deux étapes automatisées, des manipulations sur chaque échantillon. And the subsequent use of an extraction apparatus of the nucleic acids and a PCR apparatus requires to carry out, between the two automated steps, manipulations on each sample. Une telle intervention manuelle est obligatoire entre ces deux étapes et au cours des étapes réalisées après laPCR. Such manual intervention is required between these two stages and in steps taken after laPCR.

Ces manipulations consistent principalement en l'ouverture et la fermeture des tubes jetables avec bouchon amovible, et en pipettage de précision. These operations consist mainly the opening and closing disposable tubes with removable plug, and precision pipettors. Lors de la manipulation des tubes, I'expérimentateur porte des gants en latex ou en vinyle dans un souci de plus grande propreté et surtout pour éviter de contaminer lui même l'échantillon par des nucléases présentes sur la peau. When handling of the tubes, the experimenter carries latex or vinyl gloves for the sake of greater cleanliness and especially to avoid contaminating the sample itself by nucleases present on the skin. Les nucléases sont des enzymes qui dégradent l'ADN et l'A RN. Nucleases are enzymes that degrade DNA and A RN. Malheureusement, les gants sont enduits de talc, ou d'un produit équivalent, qui est une grande source potentielle de contamination de l'échantillon au cours de l'ouverture et de la fermeture du tube. Unfortunately, the gloves are coated with talc, or an equivalent product, which is a large potential source of contamination of the sample during the opening and closing of the tube. De plus, lorsqu'un tube est ouvert, l'important danger de contamination est encore accentué par la présence de tubes voisins contenant potentiellement des molécules contaminantes. In addition, when a tube is opened, the significant risk of contamination is further accentuated by the presence of neighboring tubes containing potentially contaminating molecules. Au cours du pipettage d'une quantité déterminée de liquide dans un tube donneur et du refoulement de ce liquide dans un tube receveur, le liquide pipetté peut être l'échantillon lui même, une solution tampon, une préparation contenant au moins un principe actif (enzymes, oligonucléotides, nucléotides triphosphates, etc...). During the pipetting of a given quantity of liquid into a donor tube and the discharge of this liquid in a receiver tube, the pipetted liquid can be the sample itself, a buffer solution, a preparation containing at least one active principle ( enzymes, oligonucleotides, nucleotide triphosphates, etc ...).

Pour chaque échantillon biologique traité, de 12 à 15 pipettages doivenr être effectués à l'aide d'un appareil de pipettage de à précision pour la seule étape pré-PCR consistant en une extraction des acides nucléiques. For each biological sample treated, 12 to 15 pipetting doivenr be performed with a precision in pipetting apparatus for the only pre-PCR step consisting of a nucleic acid extraction. L'appareil de pipettage de précision est très fréquemment à l'origine de contamination moléculaire entre deux mélanges réactionnels différents. Precision pipetting device is very often the cause of molecular contamination between two different reactions. Face à ce problème majeur, les expérimentateurs utilisent de plus en plus des systèmes de pipettage à déplacement positif qui semblent diminuer légèrement le nombre de contaminations, mais dont le coût est élevé. Faced with this major problem, experimenters use increasingly positive displacement pipetting systems that seem slightly reduce the number of infections, but the cost is high.

En tout état de cause, L'ensemble de ces manipulations sont un danger constant en terme de contaminations moléculaires qui risquent de générer des résultats de test faussement positifs. In any event, All these manipulations are a constant danger in terms of molecular contamination that could lead to false positive test results. Cette situation est un frein important à l'utilisation des technologies d'hybridation moléculaire pour le diagnostic biologique. This is a major obstacle to the use of molecular hybridization technology for laboratory diagnosis. Pour la santé humaine en particulier, il ne peut être envisagé de développer un test fiable, du fait du trop grand nombre de résultats faussement positifs. In particular human health, it can not be envisaged to develop a reliable test, due to too many false positives.

La situation actuelle est donc aujourd'hui paradoxale, puisqu'il existe des technologies d'une très grande puissance, la PCR en particulier, mais qu'elles ne peuvent pas être utilisées du fait de conditions générales de manipulations inadaptées. The current situation is paradoxical today, since there are a very powerful technology, PCR in particular, but they can not be used due to general conditions of inappropriate manipulation. Ces conditions de manipulation, pourtant réputées très strictes dans un laboratoire de biologie moléculaire, ne sont pas suffisantes lorsque la sensibilité des tests développés permet la détection d'une seule molécule d'ADN ou d'ARN. These handling conditions, yet deemed very strict in a molecular biology laboratory, are not sufficient when sensitivity tests developed for the detection of a single molecule of DNA or RNA.

L'impact de l'utilisation des tests de diagnostic par hybridation moléculaire en santé humaine serait considérable puisque diverses estimations rapportent que 10 à 20 % environ des individus testés dans les centres de transfusions, les hôpitaux et les laboratoires spécialisés sont contaminés par un pathogène mais ne sont pas détectés (faux négatifs) par les tests immunologiques conventionnels. The impact of the use of molecular hybridization diagnostic tests on human health would be considerable since various estimates relate only 10 to 20% of individuals tested in transfusion centers, hospitals and laboratories are contaminated with a pathogen but are not detected (false negatives) by conventional immunoassays.

Dans la présente description et dans les revendications, on entendra par le terme "échantillon" un ensemble de molécules à un instant donné au cours du traitement global de l'échantillon biologique, le dit ensemble de molécules étant initialement issu du prélèvement biologique réalisé au cours de l'échantillonnage. In the present specification and claims will be heard by the term "sample" a set of molecules at a given time during the overall treatment of the biological sample, said set of molecules being initially derived from biological specimen carried over sampling. Lorsqu'il y a séparation physique en au moins deux familles de molécules, I'échantillon est celui qui contient le plus grand nombre de séquences d'ADN ou d'ARN spécifiques recherchées dans l'état de purification ou d'association avec d'autres molécules le plus avancé par rapport au traitement global composé de plusieurs étapes successives. When there is physical separation into at least two families of molecules, sample is one that contains the largest number of DNA sequences or specific RNA popular in the state of purification or association with other most advanced molecules relative to the overall process consists of several stages. De la même manière, on entendra par le terme "principe actif" une molécule ou une famille de molécules intervenant au cours du traitement de l'échantillon.Un principe actif peut, en particulier, être une enzyme, un ion, un sel, un nucléotide triphosphate ou un oligonucléotide. Similarly, we hear the term "active ingredient" a molecule or a family of molecules involved in the sample.A active treatment may in particular be an enzyme, an ion, a salt, nucleotide triphosphate or an oligonucleotide. Par le terme "séquence cible", on entendra la séquence d'ADN ou d'ARN qui sera spécifiquement amplifiée au cours de l'étape d'amplification. By the term "target sequence" will be understood the sequence of DNA or RNA which is specifically amplified during the amplification step. La séquence cible une fois amplifiée pouvant éventuellement être mise en évidence par hybridation moléculaire à l'aide d'au moins une séquence sonde. The target sequence once amplified may optionally be detected by molecular hybridization with at least one probe sequence. On entendra par le terme "échantillonnage" le prélèvement de matériel biologique à partir, d'un individu, d'un animal, d'un végétal, ou d'un produit issu de l'industrie agro-alimentaire. We hear the term "sampling" the removal of biological material from, an individual, an animal, a plant, or a product of the food industry. Le matériel biologique ainsi prélevé sera appelé "échantillon initial". The thus collected biological material will be called "initial sample".

L'objectif principal de la présente invention est d'éliminer totalement les problèmes de contaminations moléculaires au cours du traitement automatique d'un échantillon biologique qui comprend une étape d'amplification in vitro du nombre d'une séquence définie d'ADN ou d'ARN. The main objective of the present invention is to eliminate completely the problems of molecular contamination during the automatic processing of a biological sample which comprises a step of amplifying in vitro the number of a defined DNA sequence or RNA. Un tel résultat peut être atteint par l'utilisation d'un procédé pour amplifier le nombre d'au moins une séquence définie d'acide nucléique ou de sa séquence complémentaire, ci-après nommées séquences cibles, dans un échantillon biologique, caractérisé par le fait, d'une part qu'il comporte un apport de principes actifs sur le dit échantillon et au moins une étape préliminaire, destinée à augmenter l'accessibilité des acides nucléiques présents dans l'échantillon, suivie d'une étape d'amplification, d'autre part que le dit échantillon ainsi que les principes actifs se trouvent confinés à l'intérieur d'un espace hermétiquement clos durant toute la durée de réalisation du procédé. Such a result can be achieved by the use of a method to amplify the number of at least one nucleic acid of defined sequence or its complementary sequence, hereinafter named target sequences in a biological sample, characterized Indeed, on the one hand it comprises a supply of active ingredients on said sample and at least one preliminary step, for increasing the availability of nucleic acids present in the sample, followed by an amplification step, on the other hand that the said sample and the active ingredients are contained within a hermetically enclosed space throughout the implementation of the process duration. Afin de surmonter de manière plus efficace ces problèmes de contaminations moléculaires, le procédé peut avantageusement être caractérisé par le fait que l'échantillonnage se fait directement dans le dit espace hermétiquement clos. In order to overcome these problems more effectively molecular contamination, the method may advantageously be characterized in that sampling is done directly in said hermetically enclosed space.

Un tel procédé permet de préférence d'effectuer un test complet de diagnostic biologique comprenant, d'une part une étape préliminaire permettant d'augmenter l'accessibilité de l'ADN et de I'ARN à des molécules contenues dans l'échantillon initial et à au moins un principe actif, comme des enzymes de polymérisation de l'ADN et de 'ARN et des séquences d'ADN et d'ARN partiellement ou totalement complémentaires, d'autre part au moins une étape supplémentaire subséquente à l'étape d'amplification destinée à mettre en évidence la présence éventuelle dans l'échantillon de tout ou partie d'au moins une séquence cible d'acide désoxyribonucléique (ADN) ou d'acide ribonucléique (ARN) dont le nombre s'est accru au cours de l'étape d'amplification. Such a method preferably allows to perform a complete test of biological diagnosis comprising, firstly a preliminary step to increase the accessibility of DNA and RNA with molecules contained in the original sample and at least one active principle, such as DNA polymerizing enzymes and RNA and DNA and RNA sequences partially or fully complementary, on the other hand at least one additional step subsequent to step d amplification intended to highlight the possible presence in the sample of all or part of at least one target sequence of deoxyribonucleic acid (DNA) or ribonucleic acid (RNA) whose number is increased during the amplification step.

L'étape d'amplification précitée utilise de préférence, d'une part l'activité d'une ADN polymérase ou d'une ARN polymérase responsable de la synthèse des séquences d'ADN ou d'ARN amplifiées, d'autre part, soit au moins une séquence d'ADN ou d'ARN reconnue comme amorce par l'enzyme précitée et partiellement ou totalement complémentaire d'une partie de séquence cible à amplifier spécifiquement, soit une séquence promotrice parfaitement définie reconnue par l'enzyme et appartenant à la séquence cible à amplifier. The above-mentioned amplification step is preferably used on the one hand the activity of a DNA polymerase or an RNA polymerase responsible for the synthesis of DNA sequences amplified RNA or, on the other hand, let at least a sequence of DNA or RNA as a primer recognized by the above enzyme and partially or completely complementary to a target sequence portion to be amplified specifically, a promoter sequence perfectly defined recognized by the enzyme belonging to the target sequence to be amplified.

Le procédé en question est avantageusement caractérisé par le fait qu'au moins une étape supplémentaire, située avant ou après l'étape d'amplification, utilise au moins une séquence sonde d'ADN ou d'ARN, modifiée ou non, qui dans des conditions physico-chimiques précises s'hybride spécifiquement par complémentarité entre les bases avec au moins une séquence cible, et qui est présente dans l'échantillon sous forme libre ou supportée. The method in question is advantageously characterized in that at least one additional step, located before or after the amplification step, using at least a probe sequence of DNA or RNA, modified or not, in which specific physicochemical conditions hybridizes specifically by complementarity between the bases with at least one target sequence, and which is present in the sample in free or supported form.

Sous la forme d'un test complet de diagnostic, le procédé précédemment décrit peut avantageusement être caractérisé par le fait, d'une part que l'étape d'amplification utilise la technique de réaction en chaine de la polymérase (PCR) pour augmenter spécifiquement le nombre de molécules d'une séquence cible définie avec une amorce oligonucléotidique modifiée qui porte une molécule pouvant émettre un signal mesurable, d'autre part qu'après l'amplification l'échantillon soit mis en contact avec une sonde d'ADN supportée, au moins partiellement complémentaire de la séquence cible amplifiée, et que la présence de la dite séquence cible amplifiée spécifiquement retenue sur le dit support est évaluée à l'aide de moyens extérieurs à la barrette permettant de détecter de manière quantitative la molécule émettrice d'un signal portée par les séquences amplifiées. In the form of a comprehensive diagnostic test, the method described above may advantageously be characterized by the fact, firstly that the amplifying step uses the chain reaction technique (PCR) to increase specifically the number of molecules of a defined target sequence with a modified oligonucleotide primer that carries a molecule capable of emitting a measurable signal, second amplification after the sample is contacted with a supported DNA probe, at least partially complementary to the amplified target sequence, and that the presence of said amplified target sequence specifically retained on said support is measured by using external means to the strip for sensing quantitatively the emitter molecule a signal carried by the amplified sequences.

La mise en oeuvre du procédé possédant l'une quelconque des caractéristiques précédemment citées est le fait d'un dispositif caractérisé en ce qu'il comporte, d'une part au moins une enceinte renfermant des principes actifs nécessaires pour l'étape préliminaire destinée à augmenter l'accessibilité des acides nucléiques, d'autre part au moins une enceinte renfermant les principes actifs nécessaires pour l'étape d'amplification, et que les enceintes sont reliées hermétiquement l'une à l'autre de manière à constituer un ensemble, ci-après nommé barrette, délimitant un espace clos, des moyens étant prévus pour faire circuler et pour réguler thermiquement l'échantillon et les principes actifs. The implementation of the method with any one of the aforementioned characteristics is the fact of a device characterized in that it comprises, on the one hand at least one enclosure containing active ingredients necessary for the preliminary step for increase the accessibility of the nucleic acids on the other hand at least one enclosure containing the active ingredients necessary for the amplification step, and the speakers are connected tightly to one another so as to form an assembly, hereinafter called strip, defining a closed space, means being provided for circulating and for thermally controlling the sample and the active ingredients. Un tel dispositif utilise de préférence une barrette à usage unique, c'est à dire jetable après le traitement d'un seul échantillon biologique. Such a device preferably uses a disposable strip, i.e. disposable after the processing of a single biological sample.

De manière avantageuse, le dispositif précédemment cité est caractérisé par le fait, d'une part que les moyens assurant partiellement ou totalement le déplacement de l'échantillon et des principes actifs dans la barrette sont constitués d'une pompe péristaltique agissant sur la paroi souple d'un capillaire appartenant à la barrette, d'autre part que les liaisons entre les différentes enceintes sont des capillaires équipés de moyens destinés à permettre ou à empêcher le passage d'un fluide à un instant donné dans au moins un capillaire précis afin d'assurer le bon déroulement du traitement et que les dits moyens sont constitués d'un élément rigide possédant au moins deux positions dans l'espace, tel qu'une position dite fermée permette de comprimer le capillaire souple en cet endroit afin d'empêcher la circulation d'un fluide, et tel que l'autre position dite ouverte n'ait pas cet effet de compression et autorise le passage d'un fluide en cet endroit du capil Advantageously, the aforementioned device is characterized in that, on the one hand that the means for partially or completely the movement of the sample and of the active ingredients in the bar consist of a peristaltic pump acting on the flexible wall a capillary belonging to the bar, on the other hand that the connections between the different speakers are capillary equipped with means for allowing or preventing the passage of a fluid at a given time in at least one capillary specific order ensure the proper course of treatment and that the said means consist of a rigid element having at least two positions in space, such as a so-called closed position makes it possible to compress the flexible capillary at this point to prevent circulation of a fluid, and such that the other said open position has not this compression effect and allows the passage of fluid in this location of Capil laire. lar.

De manière avantageuse, plusieurs barrettes peuvent être regroupées pour former une cartouche permettant de traiter simultanément plusieurs échantillons avec des moyens communs pour assurer la régulation thermique, le déplacement et la circulation sélective des échantillons et des principes actifs. Advantageously, several bars can be grouped to form a cartridge for simultaneously treating several samples with common means for regulating the temperature, the movement and the selective movement of samples and active ingredients.

Le dispositif pour la mise en oeuvre du procédé décrit dans cette invention est constitué, d'une part d'une barrette contenant les principes actifs nécessaires au bon déroulement du procédé, d'autre part de moyens pour assurer le déplacement, la régulation thermique et la circulation sélective de l'échantillon et des principes actifs à l'intérieur de la dite barrette. The device for implementing the process described in this invention consists, on the one hand a strip containing the active ingredients necessary for the proper operation of the process, second means for moving, the thermal regulation and selective movement of the sample and of the active ingredients within the said strip.

La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère aux dessins annexés dans lesquels: The invention will be better understood using the additional description which follows, which refers to the accompanying drawings in which:
- la figure 1 représente une vue schématique en perspective et partiellement coupée d'une barrette équipant un mode de réalisation préférentiel du dispositif selon l'invention. - Figure 1 shows a schematic view in perspective and partly cut of a strip fitted to a preferential embodiment of the device according to the invention.

- les figures 2, 3 et 4 représentent des vues en coupe de certains composants de la barrette représentée dans la figure 1. II s'agit de la plaque de base comportant un réseau de sillons (figure 2), des capillaires formés par l'association de la plaque de base et d'une plaque perforée (figure 3), des mêmes capillaires représentés dans la figure 3 mais coupés en un site de connection de la plaque perforée avec une enceinte de traitement (figure 4). - Figures 2, 3 and 4 show sectional views of certain components of the strip shown in Figure 1. It is the base plate having a network of grooves (Figure 2), capillaries formed by the combination of base plate and a perforated plate (Figure 3), the same capillary shown in Figure 3 but cut in a connection site of the perforated plate with a treatment chamber (Figure 4).

- la figure 5 est une illustration schématique du réseau de capillaires permettant les connections entre les enceintes de traitement appartenant à la barrette représentée dans la figure 1, le dit réseau étant équipé de vannes. - Figure 5 is a schematic illustration of the network of capillaries to the connections between the processing chambers belonging to the array shown in Figure 1, said network being equipped with valves.

- les figures 6, 7, 8 et 9 représentent différentes boucles fonctionnelles du réseau de la figure 5, chaque boucle étant associée à une configuration d'ouverture et de fermeture des vannes. - Figures 6, 7, 8 and 9 show different functional loops of the network of Figure 5, each loop being associated with an open configuration and valve closure.

- la figure 10 représente une vue schématique d'une cartouche équipant un mode de réalisation préférentiel du dispositif selon l'invention. - Figure 10 shows a schematic view of a cartridge fitted to a preferential embodiment of the device according to the invention.

La barrette, totalement ou partiellement représentée sur les figures 1, 2, 3 et 4, ainsi que la cartouche représentée sur la figure 10, sont à usage unique. The web wholly or partially shown in Figures 1, 2, 3 and 4, as well as the cartridge shown in Figure 10, are disposable. Cette approche permet de disposer, à l'intérieur des dites barrette et cartouche, d'un espace hermétiquement clos contenant des principes actifs qui n'ont jamais été en contact avec une source potentielle de contaminations nuisibles au bon déroulement du procédé. This approach allows to have, within the said strip and cartridge, a sealed space containing active ingredients that have never been in contact with a potential source of contamination harmful to the smooth running of the process.

La réutilisation d'au moins une partie de la barrette augmente le risque d'une contamination moléculaire de l'échantillon à un moment donné du traitement, même si la partie réutilisée n'est pas sur le trajet de l'échantillon ou d'un liquide ayant été en contact avec l'échantillon. Reusing at least a portion of the strip increases the risk of sample molecular contamination at a given time of treatment, even if the reused part is not present in the sample path or a liquid having been in contact with the sample. C'est le cas par exemple d'un dispositif constitué de deux partie connectées, d'une part d'une partie à usage unique à l'intérieur de laquelle se déroule la totalité des déplacements de l'échantillon et des principes actifs, d'autre part d'une partie réutilisable constituée d'une cartouche contenant un gaz qui du fait de sa pression sert au déplacement de l'échantillon et des principes actifs.Bien que la partie jetable puisse porter, près de son extrémité connectable, un système de filtration empêchant le passage de molécules contaminantes préalablement définies, les risques de contamination sont supérieurs à ceux inhérents à l'utilisation d'une barrette à usage unique. This is the case for example of a device consisting of two connected part on the one hand a disposable portion within which takes place all the movements of the sample and the active principles, of secondly a reusable part constituted by a cartridge containing a gas which, because of its pressure serves for moving the sample and actifs.Bien principles that the disposable part may carry near its end connectable, a system filter preventing the passage of contaminating molecules previously defined, contamination risks are higher than those inherent in the use of a disposable strip.

La barrette (figures 1 à 4) et la cartouche (figure 10) précitées sont conçues pour effectuer un test complet de diagnostic défini comme un procédé biologique permettant de réaliser toutes les étapes préliminaires à l'amplification, I'amplification elle même et les étapes subséquentes à l'amplification aboutissant à une analyse finale qualitative, semiquantitative ou quantitative. The strip (Figures 1 to 4) and the cartridge (Figure 10) above are designed to perform a complete diagnostic test defined as a biological process for performing all the preliminary steps for the amplification, the amplification itself and the steps subsequent to the amplification resulting in a final analysis qualitative, semiquantitative or quantitative. L'analyse finale précitée est destinée à mettre en évidence la présence éventuelle dans l'échantillon d'au moins une séquence définie d'ADN ou d'ARN dont le nombre s'est accru au cours de l'étape d'amplification. The aforementioned final analysis is intended to highlight the possible presence in the sample of at least one defined sequence of DNA or RNA whose number is increased during the amplification step.

De manière avantageuse, I'introduction de l'échantillon initial dans la barrette ou la cartouche se fera dès l'échantillonnage à partir d'un individu, d'un animal ou d'un produit issu de l'industrie agro-alimentaire. Advantageously, I'introduction of the initial sample in the strip or cartridge will soon sampling from an individual, an animal or a product of the food industry.

L'introduction précitée pourra cependant être réalisée à partir d'un compartiment de stockage servant d'intermédiaire entre le prélèvement et le traitement effectif de l'échantillon dans la barrette ou la cartouche. The above introduction, however, may be made from a storage compartment serving as an intermediary between sampling and the actual treatment of the sample in the strip or cartridge.

La barrette (figures 1 à 4) et la cartouche (figure 10) précitées sont caractérisées par le fait que l'espace hermétiquement clos est entouré d'une barrière physique étanche, avantageusement en matière plastique qui peut posséder des zones de jonction hermétiques entre deux éléments constitutifs distincts. The strip (Figures 1 to 4) and the cartridge (Figure 10) above are characterized in that the hermetically closed space is surrounded by a tight physical barrier, preferably of plastic material which may have sealed junction zones between two individual constituents. Ces zones de jonction peuvent résulter d'un collage, d'un thermosoudage ou d'un assemblage "en force" de deux éléments précités. These junction zones can result from bonding, a heat seal or assembly "strength" of the two aforementioned elements. Du fait des matériaux de construction utilisés, la barrette ne permet pas le passage de molécules contaminantes de l'extérieur vers l'intérieur, ni de l'intérieur vers l'extérieur. Due to the construction materials used, the strip does not allow the passage of contaminating molecules from the outside inward or from the inside outwards. Le passage de telles molécules serait suceptible de perturber le traitement de l'échantillon, en particulier s'il s'agit d'une séquence d'ADN ou d'ARN d'une longueur supérieure ou égale à deux nucléotides. The portion of such molecules would be suceptible to disrupt the processing of the sample, particularly if it is a DNA or RNA sequence of a length greater than or equal to two nucleotides. II s'agit principalement d'empêcher le passage de séquences d'ADN ou d'ARN dont le nombre serait susceptible d'être amplifié au cours du traitement de l'échantillon. It is primarily to prevent the passage of DNA or RNA sequences in which the number is likely to be amplified during sample processing.

La barrette (figure 1) est constituée d'un couvercle (5) fixé sur une plaque de base (1), qui repose elle même sur une plaque perforée souple (2). The web (Figure 1) consists of a cover (5) fixed on a base plate (1), which even it rests on a flexible perforated plate (2). A l'extrémité de la plaque (1), deux sorties permettent de recevoir chacune un tuyau souple (E7,4) d'un diamètre intérieur de 1,2 mm. At the end of the plate (1), two outputs are used to receive each a hose (E7,4) having an internal diameter of 1.2 mm. Le couvercle (5) protège 6 éléments, (El), (E2), (E3), (E4), (E5) et (E6) fixés sur la plaque (1). The lid (5) protects 6-membered (El), (E2), (E3), (E4), (E5) and (E6) fixed to the plate (1). Les éléments (E7) et (4) sont connectés à une enceinte (E8) portant une fenêtre (3). The elements (E7) and (4) are connected to an enclosure (E8) having a window (3).

Le procédé biologique qui se déroule à l'intérieur de cette barrette comporte au moins une étape préliminaire destinée à augmenter l'accessibilité des acides nucléiques contenus dans l'échantillon initial. The biological process that takes place inside this bar includes at least a preliminary step to increase the accessibility of the nucleic acids contained in the original sample.

Ces acides nucléiques seront ainsi plus accessibles à au moins une molécule qui est, soit présente dans l'échantillon au moment de cette étape et issue de l'échantillon initial ou de l'addition d'un principe actif, soit ajoutée sous la forme d'un principe actif lors d'une étape subséquente. These nucleic acids will be more accessible to at least one molecule which is either present in the sample at the time of this step and after the initial sample or the addition of an active principle, is added in the form of an active principle in a subsequent step. L'augmentation de l'accessibilité des acides nucléiques peut être obtenue, soit par modification des molécules et des structures biologiques contenues dans l'échantillon, soit par purification partielle de ces acides nucléiques. Increasing the accessibility of nucleic acids can be obtained either by modification of molecules and biological structures contained in the sample or by partial purification of such nucleic acids. Cette étape permettant d'augmenter l'accessibilité des acides nucléiques est nécessaire car toute cellule vivante, tel qu'un virus, une bactérie, ou une cellule d'eucaryote, contient des structures biologiques plus ou moins évoluées destinées à compartimenter la cellule et permettant de protéger des molécules essentielles comme les acides nucléiques.L'accessibilité aux acides nucléiques nécessite donc la destruction partielle ou totale de telles structures qui sont généralement de nature protéique et lipidique. This step to increase the accessibility of nucleic acids is necessary because every living cell, such as a virus, bacterium, or a eukaryotic cell, contains more or less advanced biological structures to compartmentalize the cell and allowing protect essential molecules such as acids nucléiques.L'accessibilité nucleic acid therefore requires the partial or total destruction of such structures that are typically protein and lipid nature. La technique la plus couramment utilisée consiste à détruire ou à modifier suffisamment des molécules composant cette structure biologique. The most commonly used technique is to destroy or alter enough molecules composing this biological structure. La destruction ou la modification profonde des protéines de structure, soit par une enzyme protéolytique telle que la protéinase K, soit par l'action de la chaleur (traitement à 110"C) est une technique efficace et parfaitement compatible avec le procédé et le dispositif décrits dans cette invention. Destruction or substantial modification of the structure of proteins, or by a proteolytic enzyme such as proteinase K, or by the action of heat (treatment at 110 "C) is an effective and perfectly compatible with the technical process and apparatus described in this invention.

La purification partielle des acides nucléiques peut consister en l'élimination partielle des molécules lipidiques et des protéines contenues dans l'échantillon. Partial purification of the nucleic acids can consist of the partial removal of the lipid molecules and the proteins contained in the sample. Cette méthode permet donc de manière indirecte d'altérer les structures biologiques précitées. This method allows to indirectly alter the above biological structures. La première technique consiste à faire passer l'échantillon sur une colonne composée d'une résine ayant une forte affinité pour les protéines à pH neutre et une très faible affinité pour les acides nucléiques. The first technique consists in passing the sample over a column composed of a resin having a high affinity for proteins at neutral pH and a very low affinity for nucleic acids. Une seconde technique consiste à faire passer au moins une fois l'échantillon sur une colonne échangeuse d'ions qui retiendra les acides nucléiques par liaisons ioniques entre les phosphates chargés négativement de l'ADN ou de l'ARN et les cations fixés à la colonne.Dans un second temps, un tampon d'élution de forte force ionique sera utilisé pour décrocher l'ADN ou l'ARN en créant une compétition entre l'anion de la colonne et l'anion du sel (Na+ de préférence) pour la fixation sur les charges négatives des phosphates. A second technique is to pass at least once the sample on an ion exchange column which will retain the nucleic acid by ionic bonds between the negatively charged phosphates of the DNA or RNA and the cations fixed in column .in a second step, an elution buffer of high ionic strength will be used to pick up the DNA or RNA by creating competition between the anion of the column and the anion of the salt (Na + preferred) for fixation on the negative charges of phosphates. Cette technique simple est tout à fait compatible avec le procédé et le dispositif décrits dans cette invention. This simple technique is quite compatible with the method and apparatus described herein. Une troisième technique consiste à extraire des molécules comme les lipides et les protéines à l'aide de solvants organiques comme le phénol et le chloroforme. A third technique is to extract molecules such as lipids and proteins using organic solvents such as phenol and chloroform. Une quatrième technique consiste à retenir des séquences définies d'ADN ou d'ARN par hybridation avec des séquences supportées au moins partiellement complémentaires présentes sur une colonne. A fourth technique consists in retaining defined sequences of DNA or RNA by hybridization with sequences supported at least partially complementary on this column.

L'étape préliminaire destinée à augmenter l'accessibilité des acides nucléiques présents dans l'échantillon peut être un simple chauffage de ce dernier à une température susceptible de dénaturer certaines protéines, c'est à dire à une température de préférence comprise entre 900C et 1 1 00C. The preliminary step to increase the accessibility of the nucleic acids present in the sample may be a simple heating it to a temperature likely to denature some proteins, ie at a temperature preferably between 900C and 1 1 00C. En suivant un tel protocole, l'étape préliminaire précitée peut être confondue avec le premier traitement thermique servant à dénaturer les séquences d'ADN et d'ARN au cours de l'étape d'amplification. By following such a protocol, the above-mentioned preliminary step can be confused with the first heat treatment for denaturing the DNA and RNA sequences in the amplification step.

De manière avantageuse, deux étapes préliminaires successives sont utilisées au cours du procédé qui se déroule dans la barrette représentée dans la figure 1. La première étape préliminaire consiste en un traitement protéolytique de l'échantillon par la protéinase K. Pour ce faire, I'échantillon est mélangé à cette enzyme dans l'enceinte (E6) puis il se déplace dans l'enceinte (E7) pour y être incubé à 70"C pendant 20 minutes. La seconde étape préliminaire consiste en un passage de l'échantillon, dans des conditions de faible force ionique, sur une colonne échangeuse d'anions située dans (E2). Les acides nucléiques retenus sur la colonne sont ensuite décrochés à l'aide d'un tampon de forte force ionique situé dans (ex). Advantageously, two successive preliminary stages are used during the process which takes place in the strip shown in Figure 1. The first preliminary step consists of a proteolytic treatment of the sample with proteinase K. To do this, I ' sample is mixed with the enzyme in the chamber (E6), then it moves in the enclosure (E7) to be incubated at 70 "C for 20 minutes. the second preliminary step consists of a passage of the sample in low ionic strength conditions, on an anion exchange column located in (E2). the nucleic acids retained on the column are then unhooked with a high ionic strength buffer located in (ex).

Dans la barrette représentée sur la figure 1, il est avantageux, après les deux étapes préliminaires successives destinées à augmenter l'accessibilité des acides nucléiques, d'utiliser la réaction en chaine de la polymérase (PCR) avec au moins une amorce oligonucléotidique portant la fluorescéine molécule signal à son extrémité 5'. In the strip shown in Figure 1, it is advantageous, after the two successive preliminary steps aimed at increasing the accessibility of the nucleic acids, using the chain reaction of the polymerase (PCR) with at least one oligonucleotide primer bearing the fluorescein molecule signal at its 5 'end. Ainsi, une partie au moins des séquences néosynthétisées au cours de l'étape d'amplification porteront la dite molécule signal et pourront être reconnues sélectivement au cours d'une étape subséquente. Thus, at least part of the sequences newly synthesized during the amplification step will said signal molecule and can be selectively recognized in a subsequent step. L'ensemble des principes actifs nécessaires à une telle étape d'amplification sont contenus dans (E5). All of the active ingredients necessary for such an amplification step are contained in (E5).

Après addition des dits principes actifs, l'échantillon est amené dans (E7) où il est soumis de manière cyclique aux différentes températures permettant de réaliser la PCR. After addition of the said active principles, the sample is brought into (E7) which is cyclically submitted at different temperatures for carrying out PCR. De 15 à 40 cycles d'amplification par PCR sont généralement suffisants pour obtenir une sensibilité importante du test de diagnostic. From 15 to 40 amplification cycles of PCR are generally sufficient to obtain a high sensitivity of the diagnostic test. Cependant, pour la détection de certains pathogènes comme les virus VIH (type 1 et 2) et le virus de l'hépatite C (Garson et col., 1990) il est nécessaire d'effectuer une seconde PCR en utilisant des amorces oligonucléotidiques internes à la séquence spécifiquement amplifiée. However, for the detection of certain pathogens such as HIV virus (type 1 and 2) and hepatitis C (Garson et al., 1990) it is necessary to carry out a second PCR using internal oligonucleotide primers the specifically amplified sequence. Cette approche permet d'atteindre une sensibilité importante même lorsque le nombre initial de pathogènes est proche de l'unité. This approach achieves a high sensitivity even when the initial number of pathogens is close to unity.

Selon d'autres versions du procédé décrit dans la présente invention, L'étape d'amplification peut utiliser l'activité d'une ADN polymérase, ou d'une ARN polymérase, responsable de la synthèse des séquences amplifiées, et dans laquelle deux familles d'enzymes peuvent être distinguées. According to other versions of the method described in the present invention, the amplification step may use the activity of a DNA polymerase, or an RNA polymerase, responsible for the synthesis of the amplified sequences, and wherein two families enzymes can be distinguished. La première famille est composée d'enzymes qui nécessitent la présence d'une séquence amorce d'ADN ou d'ARN. The first family consists of enzymes that require the presence of a DNA or RNA primer. De telles enzymes utilisent en effet comme substrat un duplex moléculaire constitué par l'hybridation entre une séquence cible, ou séquence matrice, et une séquence amorce portant une extrémité 3' hydroxyl (OH) libre. Such enzymes used in effect as a molecular substrate duplex formed by hybridization between a target sequence, or sequence matrix, and a primer sequence bearing a 3'-hydroxyl (OH) free. L'enzyme étend alors la séquence amorce à partir de son extrémité 3' en incorporant, pour une position donnée sur la séquence cible, le nucléotide complémentaire en utilisant des nucléotides triphosphates libres présents dans le milieu. The enzyme then extends the primer sequence from its 3 'end by incorporating, for a given position on the target sequence, the additional nucleotide triphosphates using free nucleotides present in the medium. II en résulte la synthèse d'une séquence complémentaire à la séquence cible. This results in the synthesis of a complementary sequence to the target sequence. La seconde famille est constituée d'enzymes qui nécessitent la présence d'une séquence promotrice parfaitement définie qu'elles reconnaissent et à partir de laquelle elle synthétise la séquence complémentaire à la séquence située immédiatement en 3' de la dite séquence promotrice en utilisant des nucléotides triphosphates libres présents dans le milieu. The second family comprises enzymes that require the presence of a promoter sequence perfectly defined and they recognize from which it synthesizes the sequence complementary to the sequence located immediately 3 'to said promoter sequence using nucleotide free triphosphates present in the medium. Les ARN polymérase des bactériophages T7 et SP6 sont des enzymes qui se comportent de cette dernière manière (Stoflet et col., 1988). The RNA polymerase T7 and SP6 bacteriophages are enzymes that behave in this latter way (Stoflet et al., 1988).

De manière avantageuse, il peut être utilisé une molécule signal autre que la fluorescéine pour modifier l'amorce oligonucléotidique servant au cours de l'étape d'amplification de procédé décrit dans la présente invention. Advantageously, it can be used a molecule other than fluorescein signal to modify the oligonucleotide primer used during the amplification process step described in the present invention. En effet, il existe deux familles principales de molécules signal. Indeed, there are two main families of signaling molecules. La première famille est composée de molécules qui, dans des conditions physico-chimiques précises1 peuvent émettre un signal de nature particulaire pouvant être une émission radioactive, de fluorescence, de luminescence, de bio-luminescence et de phosphorescence. The first family is composed of molecules which under physicochemical conditions précises1 can emit a particulate nature of signal may be a radioactive emission, fluorescence, luminescence, bio-luminescence and phosphorescence. La deuxième famille est composée de molécules dont au moins un de leurs paramètres est facilement mesurable. The second family is composed of molecules which at least one of their parameters is easily measurable. II peut s'agir du produit soluble ou précipitable issu de la dégradation d'un substrat en particulier par une enzyme comme la phosphatase alcaline ou la péroxydase.La présence du produit de dégradation soluble peut être détectée par colorimétrie. They may be soluble or precipitable product produced by the degradation of a particular substrate by an enzyme such as alkaline phosphatase or péroxydase.La presence of soluble degradation product can be detected colorimetrically. II existe des produits de dégradation de substrats appartenant à la première famille de molécules signal précitée du fait de la nature de leur émission. There are substrates for degradation products belonging to the first family of molecules above the signal due to the nature of their issue.

Selon d'autres versions encore du procédé décrit dans la présente invention, au moins une amorce oligonucléotidique utilisée au cours de l'étape d'amplification peut être modifiée de différentes façons, autre que celle aboutissant à l'accrochage d'une molécule signal. According to still other versions of the method described in the present invention, at least one oligonucleotide primer used during the amplification step may be modified in various ways other than that leading to the attachment of a signal molecule. En effet, une séquence d'acide nucléique peut être modifiée par addition d'un isotope radioactif (32P, 355, 3H), d'un groupement chimique, d'un haptène, d'une molécule de poids moléculaire supérieur à 300 daltons ou d'une enzyme. Indeed, a nucleic acid sequence may be modified by addition of a radioactive isotope (32P, 355, 3H), a chemical moiety, a hapten, a molecule of molecular weight greater than 300 daltons or of an enzyme.

Le procédé qui se déroule dans la barrette représentée dans la figure 1 comporte de préférence une étape finale d'analyse des séquences spécifiquement amplifiées. The process which takes place in the strip shown in Figure 1 preferably comprises a final step of analysis of the specifically amplified sequences. Pour ce faire, I'échantillon ayant subi l'amplification est mis en contact avec une sonde d'ADN supportée, au moins partiellement complémentaire de la séquence cible amplifiée, puis la présence de la dite séquence cible amplifiée, spécifiquement retenue sur le dit support, est évaluée à l'aide de moyens permettant de détecter de manière quantitative la fluorescéine émettrice d'un signal portée par les séquences amplifiées. To do this, I'échantillon having undergone amplification is contacted with a DNA probe supported at least partially complementary to the amplified target sequence, then the presence of said amplified target sequence, specifically retained on said support is evaluated using means for detecting quantitatively the fluorescein emitting a range signal by the amplified sequences. La séquence sonde est de préférence un oligonucléotide de 20 à 35 nucléotides covalemment lié à un support solide constitué de silice. The probe sequence is preferably an oligonucleotide 20 to 35 nucleotides covalently attached to a solid support consisting of silica.

L'étape finale d'analyse précitée consiste, d'abord en au moins un passage de l'échantillon à une température précise dans une colonne incluse dans (E8) et contenant un support solide sur lequel est immobilisé au moins une séquence sonde précitée, puis en un décrochage et une remise en solution à une température d'élution d'au moins une séquence cible amplifiée à l'aide d'un tampon d'élution stocké dans (E3), suivi d'une détection dans l'éluat de la molécule signal. The final step of said analysis consists, first in at least one passage of the sample at a specific temperature in a column included in (E8) and containing a solid support on which is immobilized at least one sequence said probe, then a stall and redissolved at a temperature of elution of at least one amplified target sequence using an elution buffer stored in (E3), followed by detection in the eluate of the signal molecule. La dite température d'élution est calculée en fonction de la température de fusion (Tm) du duplex moléculaire formé par l'hybridation de la séquence sonde supportée avec au moins une séquence cible amplifiée.Du fait de la variabilité génétique de certaines séquences cibles et donc de la connaissance approximative de la séquence cible réellement contenue dans les échantillons, plusieurs températures d'élution pourront successivement être avantageusement utilisées dans le sens des températures croissantes. Said elution temperature is calculated based on the melting temperature (Tm) of the duplex formed by molecular hybridization of the probe sequence supported with at least one target sequence amplifiée.Du due to the genetic variability of some target sequences and therefore the approximate knowledge of the sequence target actually contained in the samples, various elution temperatures may advantageously be used successively in the direction of increasing temperatures. Au moins un éluat peut alors être soumis à la détection de la molécule signal portée par la séquence cible amplifiée à l'aide d'un détecteur extérieur à la barrette. At least one eluate may then be subjected to the detection of the signal molecule carried by the amplified target sequence with a detector outside the array.

Selon une version simplifiée du procédé décrit dans la présente invention, L'étape d'amplification représente la fin du dit procédé. According to a simplified version of the method described in the present invention, the amplification step is the end of said process. D'autre variantes encore du procédé décrit dans la présente invention peuvent être utilisées selon la nature d'une étape supplémentaire. In yet another variant of the method described in the present invention may be used depending on the nature of an additional step. La dite étape supplémentaire peut se situer avant ou après l'étape d'amplification, et utiliser au moins une séquence sonde d'ADN ou d'ARN, modifiée ou non, qui dans des conditions physico-chimiques précises s'hybride spécifiquement par complémentarité entre les bases avec au moins une séquence cible. Said further step may be before or after the amplification step, and using at least a probe sequence of DNA or RNA, modified or not, which in specific physico-chemical conditions specifically hybridizes by complementary between the bases with at least one target sequence. La séquence sonde précitée peut être présente dans l'échantillon sous forme libre ou supportée.La finalité d'une telle étape supplémentaire est d'aboutir en fin de traitement à une analyse qualitative, semi-quantitative ou quantitative de la présence d'au moins une séquence cible dans l'échantillon initial et donc de disposer d'un test complet de diagnostic réalisé automatiquement et dans les conditions d'isolement préalablement définies. The aforementioned probe sequence may be present in the sample in free form or supportée.La purpose of such an additional step is to reach the end of treatment a qualitative analysis, semi-quantitative or quantitative presence of at least a target sequence in the original sample and therefore provide a complete diagnostic test performed automatically and in isolated conditions previously defined.

Au cours de la dite étape supplémentaire, la séquence sonde peut avantageusement être ajoutée avant l'étape d'amplification et servir d'inhibiteur spécifique lors de l'amplification. During said additional step, the probe sequence can advantageously be added before the amplification step and serve as specific inhibitor during the amplification. En effet, une ADN polymérase ou une ARN polymérase est arrêtée ou fortement ralentie si en cours de sa progression relative sur la séquence matrice, et alors qu'elle synthétise la séquence complémentaire, elle se heurte à l'extrémité 5' d'une séquence d'ADN ou d'ARN, dite bloquante, hybridée à la dite séquence matrice. Indeed, a DNA polymerase or an RNA polymerase is stopped or slowed significantly if during its progression relative to the template sequence, and then it synthesizes the complementary sequence, it encounters the 5 'end of a sequence DNA or RNA, said blocking hybridized to said template sequence. Une séquence sonde, complémentaire d'au moins une séquence cible à amplifier, ajoutée avant l'étape d'amplification se comporte comme une séquence bloquante et a donc un effet inhibiteur sur l'amplification spécifique d'au moins une séquence cible.Pour un échantillon donné, si l'étape d'amplification est appliquée indépendamment, d'une part sur le dit échantillon contenant une séquence sonde ou séquence bloquante, d'autre part sur le dit échantillon ne contenant pas de séquence sonde, la comparaison des analyses des séquences amplifiées dans ces deux cas permet de diagnostiquer avec certitude la présence ou l'absence de la séquence cible dans l'échantillon initial. A probe sequence complementary to at least one target sequence to be amplified, added before the amplification step behaves as a blocking sequence and therefore has an inhibitory effect on the specific amplification of at least one sequence a cible.Pour given sample, where the amplification step is applied independently on the one hand on said sample containing a probe sequence or blocking sequence on the other hand on said sample containing no probe sequence comparison analyzes amplified sequences in these two cases to diagnose with certainty the presence or absence of the target sequence in the original sample. Pour être efficace une telle séquence sonde peut être modifiée à son extrémité 3', de préférence par incorporation d'un didésoxynucléotide, pour ne pas pouvoir être utilisée comme amorce par l'ADN ou l'ARN polymérase au cours de l'amplification. To be effective such a probe sequence may be modified at its 3 'end, preferably by incorporation of a dideoxynucleotide, not to be used as a primer by DNA or RNA polymerase during amplification.

Au cours de la dite étape supplémentaire, la séquence sonde peut de préférence être ajoutée après l'étape d'amplification et s'hybrider spécifiquement à au moins une séquence cible amplifiée. During said additional step, the probe sequence may preferably be added after the amplification step and hybridizing specifically to at least one amplified target sequence. Selon cette approche, de très nombreux modèles d'hybridation différents peuvent être utilisés suivant que la séquence cible est immobilisée sur un support solide ou libre, suivant que la séquence sonde est immobilisée sur un support solide ou libre, suivant le nombre de séquences sondes différentes utilisées et suivant le type de modification éventuelle d'au moins une séquence cible ou d'au moins une séquence sonde. According to this approach, numerous different hybridization patterns may be used depending on whether the target sequence is immobilized on a solid or free carrier, depending on whether the probe sequence is immobilized on a solid or free carrier, according to the number of different probe sequences used and depending on the type of possible modification of at least one target sequence or at least one probe sequence. Le modèle d'hybridation utilisé conditionne les étapes suivantes du traitement de l'échantillon dont l'étape finale est une analyse des séquences amplifiées. The hybridization model used determines the steps of sample treatment including the final step was analysis of the amplified sequences.

De manière avantageuse, lorsque le modèle d'hybridation précité et l'analyse finale ont pour objet de différencier au moins une séquence cible amplifiée de l'ensemble des autres séquences présentes dans l'échantillon, il est nécessaire d'utiliser, soit des moyens permettant de différencier ces molécules en fonction d'un au moins de leurs paramètres physico-chimiques, soit un complexe d'hybridation entre la dite séquence cible amplifiée et au moins une séquence sonde complémentaire. Advantageously, when the above hybridization model and the final analysis are designed to differentiate at least one amplified target sequence for all other sequences present in the sample, it is necessary to use either means to differentiate these molecules as a function of at least one of their physico-chemical parameters, or a hybridization complex between said amplified target sequence and at least one complementary probe sequence. Le paramètre physico-chimique le plus utilisé est le poids moléculaire d'une séquence d'ADN ou d'ARN, ou sa longueur en nombre de nucléotides, mais son évaluation nécessite l'emploi d'une technique séparative comme l'électrophorèse ou la gel-filtration. The physicochemical parameter most commonly used is the molecular weight of a DNA or RNA sequence, or its length in number of nucleotides, but its assessment requires the use of a separation technique such as electrophoresis or gel filtration.

De manière préférentielle, le procédé décrit dans cette invention peut permettre d'effectuer un test complet de diagnostic, la dernière étape étant alors une analyse qualitative, semi-quantitative ou quantitative de la présence d'une molécule signal précise permettant d'estimer la présence d'au moins une séquence cible amplifiée spécifiquement et étant donné qu'il existe une corrélation, dépendant de la nature de l'analyse, entre la présence de la séquence cible amplifiée et la présence de tout ou partie de cette séquence cible dans l'échantillon initial. Preferably, the process described in this invention may allow to perform a complete diagnostic test, the final step then being a qualitative analysis, semi-quantitative or quantitative presence of a molecule specific signal to estimate the presence at least one specifically amplified target sequence and since there is a correlation, depending on the nature of the analysis, between the presence of the amplified target sequence and the presence of all or part of the target sequence in the initial sample. La molécule signal précitée peut être portée soit par une séquence cible amplifiée ou une partie de celle ci, soit par une séquence sonde ou une partie de celle ci. The aforementioned signal molecule may be increased either by a target amplified sequence or a portion of the latter or by a probe sequence or a portion of the latter.

La molécule signal est caractérisée par le fait que sa présence peut être directement mesurée à l'aide d'un appareil détecteur. The signal molecule is characterized by the fact that its presence can be directly measured using a sensor device.

Pour le bon déroulement du procédé mis en oeuvre dans la barrette de la figure 1, certaines enceintes (figure 1) seront avantageusement munies de moyens extérieurs de chauffage et de refroidissement. For the success of the method implemented in the array of Figure 1, some pregnant (Figure 1) are advantageously provided with external heating means and cooling. Ainsi, (E7) est équipé de trois éléments de chauffage indépendants qui permettent, d'une part de soumettre l'échantillon à une température constante comprise entre 37"C et 700C au cours du traitement protéolytique par la protéinase K, d'autre part de soumettre successivement l'échantillon aux trois températures associées à un cycle d'amplification par PCR et permettant de réaliser la dénaturation de I'ADN double brin, I'hybridation des amorces et l'extension par une ADN polymérase. (E8) est également équipée d'un élément chauffant qui permet au cours de l'étape d'analyse précédemment décrite de décrocher une séquence cible amplifiée.La pluralité des étapes composant le traitement global de l'échantillon nécessite une dynamique du système. Thus, (E7) is provided with three independent heating elements which allow, first of subjecting the sample to a constant temperature between 37 "C and 700C during the proteolytic treatment with Proteinase K, on ​​the other hand successively submitting the sample to three temperatures associated with one cycle of amplification by PCR and for performing denaturation of double-stranded DNA, hybridisation of the primers and extension by a DNA polymerase. (E8) is also equipped with a heating element that allows during the analyzing step described above to get a plurality amplifiée.La target sequence of the steps in the overall processing of the sample requires a system dynamics.

Cette dynamique consiste en un déplacement de l'échantillon entre différentes enceintes et en un déplacement vers l'échantillon d'un principe actif nécessaire au traitement. This dynamic involves moving the sample between different speakers and a shift to the sample of an active ingredient required for processing. La dynamique en question est assurée par le fonctionnement d'une pompe péristaltique agissant sur la paroi souple de (E7). The dynamics in question is ensured by the operation of a peristaltic pump acting on the flexible wall (E7).

Selon d'autres versions encore du dispositif pour la mise en oeuvre du procédé décrit dans la présente invention, la vitesse de déplacement de l'échantillon ou du principe actif peut être continue ou discontinue. According to still other versions of the device for implementing the method described in the present invention, the sample moving speed or the active ingredient may be continuous or discontinuous. La force motrice nécessaire à de tels déplacements peut être de différente nature: fluide sous pression, déplacement d'un système magnétique, capillarité passive, gradient thermique, pompe péristaltique agissant sur la paroi d'un capillaire souple, différence de pression entre le fluide (gaz par exemple) en amont de l'échantillon et le fluide en aval de l'échantillon (cette différence de pression étant créée par un système mécanique agissant localement), ou une combinaison des différentes possibilités précédentes. The driving force necessary for such movement may be of different nature: pressure fluid, displacement of a magnetic system, passive capillarity, thermal gradient, peristaltic pump acting on the flexible wall of a capillary, pressure difference between the fluid ( gas) upstream of the sample and the sample downstream fluid (this pressure difference being created by a mechanical system acting locally), or a combination of different above possibilities.

Certains des capillaires (figure 5) de la barrette en question (figure 1) sont équipés de moyens destinés à permettre ou à empêcher le passage d'un fluide d'une enceinte à l'autre. Some of the capillaries (Figure 5) of the strip in question (Figure 1) are provided with means for allowing or preventing the passage of fluid from one chamber to another. Ces moyens sont destinés à permettre ou à empêcher le passage de l'échantillon, d'au moins un gaz ou d'au moins un principe actif à un instant donné dans au moins un capillaire précis afin d'assurer le bon fonctionnement du traitement. These means are designed to allow or prevent the passage of the sample, at least one gas or of at least one active ingredient at a given time in at least a specific capillary in order to ensure proper functioning of the treatment. Pour ce faire (figure 2 à 4), la plaque (2) peut avantageusement être souple et porter des sillons (7) sur l'une de ses faces (figure 2). To do this (Figure 2-4), the plate (2) may advantageously be flexible and wear of the grooves (7) on one of its faces (Figure 2). Le tracé des sillons a été établi pour satisfaire à un schéma fonctionnel précis. The track grooves was established to meet a specific block diagram. Le contact intime, par thermosoudage ou par collage (figure 3), des plaques (1) et (2) permet de délimiter des capillaires issus des sillons (7).La structure souple de la plaque (2) permet à un jeu de cames (9) extérieur à la barrette de venir écraser par intermittence les protubérances (6) des sillons (7). The intimate contact, by heat sealing or adhesive (Figure 3), the plates (1) and (2) allows to delimit the capillaries from the grooves (7) .The structure of the flexible plate (2) allows a set of cams (9) external to the bar to come crashing intermittently the protuberances (6) of the grooves (7). Ceci a pour fonction d'empêcher le passage d'un fluide dans le capillaire concerné ). This has the function of preventing the passage of fluid into the capillary concerned). Le jeu de trois cames (9) solidaire d'un support unique (8) montré sur la figure 3, permet d'écraser, !es trois capillaires simultanément, et donc d'empêcher la circulation d'un fluide dans la zone d'écrasement. The set of three cams (9) fixed to a single support (8) shown in Figure 3, allows crush! Capillaries are three simultaneously, and thus prevent the flow of fluid in the area of crushing. L'ensemble des plaques (1) et (2) forme un réseau de capillaires bien défini, sur lequel sont connectés les enceintes (El), (E2), (E3), (E4), (E5), (E6) et (E7), et le tuyau souple (4).Les connexions (figure 4) avec les éléments enceintes (E) sont assurées par une perforation (10) dans la plaque (1), sur laquelle vient s'emboiter un manchon (11) portant un tuyau (12). The set of plates (1) and (2) forms a well-defined network of capillaries, which are connected to speakers (El), (E2), (E3), (E4), (E5), (E6) and (E7) and the hose (4) .The connections (figure 4) with the speaker elements (E) are provided by a perforation (10) in the plate (1) on which is nested a sleeve (11 ) carrying a tube (12). La connexion avec le tuyau souple (4) est assurée par un système parfaitement semblable. The connection with the hose (4) is ensured by a perfectly similar system. Une vanne (X) (figure 5), correspondant à une came extérieure du type de celles précitées, peut être, soit en position ouverte (X=1) et permettre la libre circulation d'un fluide à son niveau, soit en position fermée (X=0) et empêcher la circulation d'un fluide à son niveau. A valve (X) (Figure 5), corresponding to an outer cam of the kind referred to above, may be either in the open position (X = 1) and allow the free flow of a fluid level or in the closed position (X = 0) and prevent the flow of a fluid level.

L'échantillon biologique brut, sous forme liquide, est introduit dans l'enceinte (E4) où il est mélangé à des principes actifs qui permettront de rendre accessible I'ADN viral. The crude biological sample in liquid form, is introduced into the chamber (E4) where it is mixed with active principles that will make viral DNA accessible. Après mélange, les concentrations sont les suivantes: 25 mM acétate de sodium pH 6,5 ; After mixing, the concentrations are as follows: 25 mM sodium acetate pH 6.5; 2,5 mM EDTA ; 2.5 mM EDTA; 0,5 % SDS; 0.5% SDS; 2,5 mg/ml protéinase K. L'ensemble des vannes (figure 5) étant dans la configuration [X1=0, X2=0, X3=1, X4=0, X5=0, X6=0] (figure 6), 2.5 mg / ml proteinase K. The set of valves (5) being in the configuration [X1 = 0, X2 = 0, X3 = 1, X4 = 0, X5 = 0, X6 = 0] (Figure 6 )
I'échantillon se déplace vers (E7) en traversant les connexions (a16) et (a18). I'échantillon moves (E7) through connections (a16) and (a18). A l'intérieur de l'enceinte (E7), l'échantillon est porté à 700C pendant 15 minutes. Inside the enclosure (E7), the sample is heated at 700C for 15 minutes. L'ensemble des vannes étant dans la configuration [Xi =0, X2=0, X3=1, X4=0, X5=0, X6=0], l'échantillon retourne en (E6) en passant par (au8) et (a16).L'ensemble des vannes étant dans la configuration [X1=0, X2=0, X3=1, X4=0, X5=0, X6=0], I'échantillon circule de (E6) vers (E2) en passant par (a15) et (a5). All the valves are in the configuration [Xi = 0, X2 = 0, X3 = 1, X4 = 0, X5 = 0, X6 = 0], the sample returns to (E6) through (AU8) and (a16) .The assembly of the valves being in the configuration [X1 = 0, X2 = 0, X3 = 1, X4 = 0, X5 = 0, X6 = 0], I'échantillon circulates (E6) to (E2 ) through (a15) and (a5). En (E2), l'échantillon traverse une colonne échangeuse d'ions qui retient spécifiquement les acides nucléiques. In (E2), the sample passes through an ion exchange column which specifically retains nucleic acids. L'éluat non retenu sur la colonne circule de (E2) à (E4) en passant par (a3) et (a9). The eluate not retained on the column circulates (E2) to (E4) through (a3) ​​and (a9). Du fait de la configuration spatiale des connexions (a9) et (a10), lléluat est bloqué dans (E4). Due to the spatial configuration of the connections (a9) and (a10), lléluat is locked in (E4). L'ensemble des vannes étant dans la configuration [X1=1, X2=1, X3=0, X4=0, X5=1, X6=0] (figure 7), le tampon d'élution contenu dans (El) est amené dans (E2) où il traverse la colonne échangeuse d'ions et décroche les acides nucléiques.L'échantillon liquide ainsi formé par cette élution est dilué puis il se déplace de (E2) vers (E5) en passant par (a4) et (a12). All the valves are in the configuration [X1 = 1, X2 = 1, X3 = 0, x4 = 0, X5 = 1, X6 = 0] (Figure 7), the elution buffer contained in (El) brought in (E2) as it passes through the ion exchange column and picks up the liquid nucléiques.L'échantillon acids thus formed by this elution is diluted then it moves (E2) to (E5) through (a4) and (at 12). Du fait de la configuration spatiale des connexions (ail) et (a12), I'échantillon est bloqué dans (E5) où il est mélangé avec les principes actifs nécessaires à la réaction d'amplification par PCR.Après mélange les concentrations sont les suivantes: 200ru désoxyadénosine5'triphosphate; Due to the spatial configuration of the connections (garlic) and (a12), sample is locked in (E5) where it is mixed with the active ingredients necessary for the amplification reaction mixture PCR.Après concentrations are the following : 200ru désoxyadénosine5'triphosphate; 200M désoxythymidine- S'triphosphate; 200M désoxythymidine- S'triphosphate; 200,ut désoxyguanosine-5'triphosphate; 200, deoxyguanosine 5'triphosphate ut; 200C1M désoxycytidine- 5'triphosphate; 200C1M deoxycytidine 5'triphosphate; 250 nM de chaque amorce oligonucléotidique; 250 nM of each oligonucleotide primer; 10mM Tris-HCI ,pH 8,4; 10mM Tris-HCl, pH 8.4; 1,5mM chlorure de magnésium; 1.5 mM magnesium chloride; 100,ug/ml gélatine et lunité pour 50ffi1 dtADN polymérase thermorésistante (Taq polymérase par exemple). 100 .mu.g / ml gelatin and unity for 50ffi1 dtADN heat-resistant polymerase (Taq polymerase, for example).

L'ensemble des vannes étant dans la configuration [X1=0, X2=0, X3=0, All the valves are in the configuration [X1 = 0, X2 = 0, X3 = 0,
X4=0, X5=1, X6=1] (figure 8), I'échantillon circule de (E5) vers (E7), en passant par (a14) et (a18), où il subit le traitement thermique nécessaire à l'étape d'amplification par PCR. X4 = 0, X5 = 1, X6 = 1] (Figure 8), I'échantillon circulates (E5) to (E7) through (a14) and (a18), where it undergoes the heat treatment necessary for the 'amplification step by PCR. Des moyens de chauffage et de refroidissement extérieurs à la barrette permettent de soumettre l'échantillon contenu dans (E7) à 30 cycles thermiques successifs définis comme suit: 1 cycle = 1 minute à 95"C, puis 1 minute à 50 "C, puis 1 minute à 72 "C. L'ensemble des vannes étant dans la configuration [X1=0, X2=0, X3=0, X4=0, X5=1, X6=1], I'échantillon se déplace de (E7) vers (E8) en passant par (a19) et (a21).A l'intérieur de l'enceinte (E8) équipée de moyens de chauffage extérieurs, I'échantillon est mis en contact avec une sonde oligonucléotidique fixée sur un support solide et les séquences spécifiques amplifiées sont sélectivement retenues en soumettant (E8) à 60 "C. Heating means and external cooling to the strip allow subjecting the sample contained in (E7) to 30 successive thermal cycles defined as follows: 1 cycle = 1 minute at 95 "C, then 1 minute at 50" C, then 1 minute at 72 "C. all of the valves are in the configuration [X1 = 0, X2 = 0, X3 = 0, x4 = 0, X5 = 1, X6 = 1], I'échantillon moves (E7 ) to (E8) through (a19) and (a21) .A the interior of the enclosure (E8) equipped with external heating means, sample is contacted with an oligonucleotide probe bound to a solid support and the specific amplified sequences are selectively retained by subjecting (E8) at 60 "C. L'éluat contenant des séquences non spécifiques poursuit sa migration vers (E4), en passant par (a20), (a17) et (a10), où il est bloqué du fait de la configuration spatiale des connexions (a10) et (ail). The eluate containing non-specific sequences continues its migration to (E4) through (a20), (a17) and (a10), where it is blocked because of the spatial configuration of the connections (a10) and (garlic) . L'ensemble des vannes étant dans la configuration [X1=0, All the valves are in the configuration [X1 = 0,
X2=0, X3=0, X4=1, X5=0, X6=I] (figure 9), le tampon contenu dans (E3) est amené dans (E8) où il est mis en contact avec le support retenant les séquences spécifiques d'ADN à détecter.L'enceinte (E8) est alors soumise à une température autorisant la déhybridation entre la séquence sonde supportée et la séquence amplifiée à détecter. X2 = 0, X3 = 0, X4 = 1, X5 = 0, X6 = I] (Figure 9), the buffer contained in (E3) is brought into (E8) where it is brought into contact with the carrier retaining the sequences specific DNA détecter.L'enceinte (E8) is then subjected to a temperature allowing the déhybridation supported between the probe sequence and the amplified sequence to be detected. Cette dernière est donc remise en solution et sa présence directement détectée à l'intérieur de (E8) grâce à un détecteur centré sur l'axe de la fenêtre (3). The latter is redissolved and its presence detected directly inside (E8) using a detector centered on the axis of the window (3). Dans une configuration des vannes identique à celle précédemment citée et après son analyse par le détecteur, I'échantillon poursuit sa migration vers (E4) où il est bloqué du fait de la configuration de (a10) et de (a8). In a valve configuration identical to that previously mentioned and after analysis by the detector, I'échantillon continues its migration to (E4) where it is blocked because of the configuration (a10) and (a8). (E4) est une enceinte piège destinée à accumuler les produits extraits à partir de l'échantillon et les principes actifs déjà utilisés. (E4) is a trap chamber for accumulating products extracted from the sample and the active principles already used. (E4) possède 4 connexions, (a8), (a9), (a10) et (ail), permettant la libre circulation d'un gaz entre deux quelconques de ces connexions. (E4) has four connections, (a8), (a9), (a10) and (garlic), allowing free circulation of gas between any two of these connections. Sa structure compartimentée permet cependant de récolter l'échantillon amplifié et analysé dans un élément non souillé par d'autres liquides issus du traitement. Its compartmentalized structure however enables to collect the amplified and analyzed in a sample unsoiled element other liquid resulting from the treatment. L'échantillon amplifié peut donc être utilisé ultérieurement par simple prélèvement dans (E4). The amplified sample may be used later by simply sampling in (E4).

Plusieurs barrettes peuvent être regroupées pour former une cartouche (figure 10) qui est structurée en 4 parties distinctes : (C1), (C2), (C3) et (C4). Several strips can be joined to form a cartridge (Figure 10) which is divided into four distinct parts: (C1), (C2), (C3) and (C4). La partie (Cl) contient les enceintes (ex), (E2), (E3), (E4), (ES) et (E6). Part (C) contains the speakers (ex), (E2), (E3), (E4) (ES) and (E6). La partie (C2) est une structure de jonction souple entre (C1) et (C3). The part (C2) is a flexible joint structure between (C1) and (C3). La partie (C3) contient l'enceinte (E7) et la partie (C4) contient l'enceinte (E8). The portion (C3) contains the enclosure (E7) and the part (C4) contains the compound (E8).

REFERENCES CITEES REFERENCES CITED

Figure img00230001

Claims (10)

    REVENDICATIONS
  1. 1/ Procédé pour amplifier le nombre d'au moins une séquence définie d'acide nucléique ou de sa séquence complémentaire, ci-après nommées séquences cibles, dans un échantillon biologique, caractérisé par le fait, d'une part qu'il comporte un apport de principes actifs sur le dit échantillon et au moins une étape préliminaire, destinée à augmenter l'accessibilité des acides nucléiques présents dans l'échantillon, suivie d'une étape d'amplification, d'autre part que le dit échantillon ainsi que les principes actifs se trouvent confinés à l'intérieur d'un espace hermétiquement clos durant toute la durée de réalisation du procédé. 1 / A method to amplify the number of at least a defined nucleic acid sequence or its complementary sequence, hereinafter named target sequences in a biological sample, characterized by the fact, firstly it comprises a intake of active ingredients on said sample and at least one preliminary step, for increasing the availability of nucleic acids present in the sample, followed by an amplification step, secondly that the said sample and the active ingredients are contained within a hermetically enclosed space throughout the implementation of the process duration.
  2. 2/ Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que l'échantillonnage se fait directement dans le dit espace hermétiquement clos. 2 / A method according to claim 1, characterized in that sampling is done directly in said hermetically enclosed space.
  3. 3/ Procédé selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé par le fait qu'il permet d'effectuer un test complet de diagnostic biologique comprenant, d'une part une étape préliminaire permettant d'augmenter l'accessibilité de l'ADN et de l'ARN à des molécules contenues dans l'échantillon initial et à au moins un principe actif, comme des enzymes de polymérisation de l'ADN et de L'ART et des séquences d'ADN et d'ARN partiellement ou totalement complémentaires, d'autre part au moins une étape supplémentaire subséquente à l'étape d'amplification destinée à mettre en évidence la présence éventuelle dans l'échantillon de tout ou partie d'au moins une séquence cible d'acide désoxyribonucléique (ADN) ou d'acide ribonucléique (ARN) dont le nombre s'est accru au cours de l'étape d'amplification. 3 / A method according to one of claims 1 and 2, characterized in that it allows a complete biological diagnostic test comprising, firstly a preliminary step to increase the accessibility of DNA and RNA molecules contained in the original sample and at least one active principle, such as polymerizing enzymes of DNA and ART and DNA and RNA sequences partially or fully complementary on the other hand at least one additional step subsequent to the amplification step to highlight the possible presence in the sample of all or part of at least one target sequence of deoxyribonucleic acid (DNA) or ribonucleic acid (RNA) whose number is increased during the amplification step.
  4. 4/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait que l'étape d'amplification utilise, d'une part l'activité d'une ADN polymérase ou d'une ARN polymérase responsable de la synthèse des séquences d'ADN ou d'ARN amplifiées, d'autre part, soit au moins une séquence d'ADN ou d'A RN reconnue comme amorce par l'enzyme précitée et partiellement ou totalement complémentaire d'une partie de séquence cible à amplifier spécifiquement, soit une séquence promotrice parfaitement définie reconnue par l'enzyme et appartenant à la séquence cible à amplifier. 4 / A method according to one of claims 1 to 3, characterized in that the amplifying step uses the one hand the activity of a DNA polymerase or an RNA polymerase responsible for the synthesis of the sequences amplified DNA or RNA, on the other hand, at least one DNA sequence or a RN recognized as primer by the above enzyme and partially or completely complementary to a target sequence portion to be amplified specifically or a perfectly defined promoter sequence recognized by the enzyme belonging to the target sequence to be amplified.
  5. 5/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé par le fait qu'au moins une étape supplémentaire, située avant ou après l'étape d'amplification, utilise au moins une séquence sonde d'ADN ou d'ARN, modifiée ou non, qui dans des conditions physico-chimiques précises s'hybride spécifiquement par complémentarité entre les bases avec au moins une séquence cible, et qui est présente dans l'échantillon sous forme libre ou supportée. 5 / A method according to one of claims 1 to 4, characterized in that at least one additional step, located before or after the amplification step, using at least a probe sequence of DNA or RNA, modified or not, which in specific physico-chemical conditions hybridizes specifically by complementarity between the bases with at least one target sequence, and which is present in the sample in free or supported form.
  6. 6/ Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé par le fait, d'une part que l'étape d'amplification utilise la technique de réaction en chaine de la polymérase (PCR) pour augmenter spécifiquement le nombre de molécules d'une séquence cible définie avec une amorce oligonucléotidique modifiée qui porte une molécule pouvant émettre un signal mesurable, d'autre part que après l'amplification l'échantillon soit mis en contact avec une sonde d'ADN supportée au moins partiellement complémentaire de la séquence cible amplifiée et que la présence de la dite séquence cible amplifiée spécifiquement retenue sur le dit support est évaluée à l'aide de moyens extérieurs à la barrette permettant de détecter de manière quantitative la molécule émettrice d'un signal portée par les séquences amplifiées. 6 / A method according to one of claims 1 to 5, characterized by the fact, firstly that the amplifying step uses the technique of chain reaction of the polymerase (PCR) to specifically increase the number of molecules a target sequence defined with a modified oligonucleotide primer that carries a molecule capable of emitting a measurable signal, second amplification that after the sample is contacted with a DNA probe supported at least partially complementary to the sequence amplified target and that the presence of said amplified target sequence specifically retained on said support is measured by using external means to the strip for sensing quantitatively the emitter molecule of a range signal by the amplified sequences.
  7. 7/ Dispositif pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé par le fait qu'il comporte, d'une part au moins une enceinte renfermant des principes actifs nécessaires pour l'étape préliminaire destinée à augmenter l'accessibilité des acides nucléiques, d'autre part au moins une enceinte renfermant les principes actifs nécessaires pour l'étape d'amplification, et que les enceintes sont reliées hermétiquement l'une à l'autre de manière à constituer un ensemble, ci-après nommé barrette, délimitant un espace clos, des moyens étant prévus pour faire circuler et pour réguler thermiquement l'échantillon et les principes actifs. 7 / Apparatus for carrying out the method according to one of claims 1 to 6, characterized in that it comprises, on the one hand at least one enclosure containing active ingredients necessary for the preliminary step for increasing the accessibility of the nucleic acids on the other hand at least one enclosure containing the active ingredients necessary for the amplification step, and that the speakers are tightly connected to each other so as to constitute a set, it -after appointed strip, defining a closed space, means being provided for circulating and for thermally controlling the sample and the active ingredients.
  8. 8/ Dispositif selon la revendication 7, caractérisé par le fait que l'ensemble défini par l'espace hermétiquement clos et les principes actifs qu'il contient est à usage unique, c'est à dire jetable après le traitement d'un seul échantillon biologique. 8 / Apparatus according to claim 7, characterized in that the set defined by the hermetically closed space and the active ingredients contained therein is disposable, i.e. discarded after the treatment of a single sample biological.
  9. 9/ Dispositif selon l'une des revendications 7 et 8, caractérisé par le fait, d'une part que les moyens assurant partiellement ou totalement le déplacement de l'échantillon et des principes actifs dans la barrette sont constitués d'une pompe péristaltique agissant sur la paroi souple d'un capillaire appartenant à la barrette, d'autre part que les liaisons entre les différentes enceintes sont des capillaires équipés de moyens destinés à permettre ou à empêcher le passage d'un fluide à un instant donné dans au moins un capillaire précis afin d'assurer le bon déroulement du traitement et que les dits moyens sont constitués d'un élément rigide possédant au moins deux positions dans l'espace, tel que une position dite fermée permette de comprimer le capillaire souple en cet endroit afin d'empêcher la circulation d'un fluide, et tel que l'autre position dite ouverte n'ait pas cet effet de compression et autorise le passage d'un fluide en cet endroit du capillaire. 9 / Apparatus according to one of Claims 7 and 8, characterized by the fact, firstly the means to or performing movement of the sample and of the active ingredients in the bar consist of a peristaltic pump acting on the flexible wall of a capillary belonging to the bar, on the other hand that the connections between the different speakers are capillary equipped with means for allowing or preventing the passage of a fluid at a given time in at least one precise capillary in order to ensure the proper course of treatment and that the said means consist of a rigid element having at least two positions in space, such as a so-called closed position makes it possible to compress the flexible capillary at this point in order to prevent the circulation of a fluid, and such that the other said open position has not this compression effect and allows the passage of fluid in that place of the capillary.
  10. 10/ Dispositif selon l'une des revendications 7 à 9, caractérisé par le fait que plusieurs barrettes sont regroupées pour former une cartouche permettant de traiter simultanément plusieurs échantillons avec des moyens communs pour assurer la régulation thermique, le déplacement et la circulation sélective des échantillons et des principes actifs. 10 / Apparatus according to one of Claims 7 to 9, characterized in that several modules are combined to form a cartridge for simultaneously treating several samples with common means for regulating the temperature, the movement and the selective movement of samples and active ingredients.
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