FR2653034A1 - Process for the preparation of a regiospecific porous particulate product, products obtained and application especially to chromatographic separations - Google Patents

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FR2653034A1 FR8913873A FR8913873A FR2653034A1 FR 2653034 A1 FR2653034 A1 FR 2653034A1 FR 8913873 A FR8913873 A FR 8913873A FR 8913873 A FR8913873 A FR 8913873A FR 2653034 A1 FR2653034 A1 FR 2653034A1
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Samain Daniel
Boisnard Florence
Meniali Jaouad
Delrieu Pascal
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
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Abstract

The invention relates to a process for the preparation of a regiospecific porous particulate product in which each porous particle has on its internal surface (3) specific physicochemical properties different from those of its external surface (2). The process consists (a) in grafting onto the particles an especially hydrophobic (5) ligand over all the internal and external surfaces, (b) in filling the pores by means of an enzymatically hydrolysable liquid protective compound, (c) in enzymatically hydrolysing the protective compound present at the external surface of the particles by means of an enzyme with a size greater than the size of the pores, (d) in carrying out an attack, especially chemical, on the particles by means of an agent which is reactive with respect to the ligand and immiscible with the protective compound with a view to selectively removing the ligand from the external surface, (e) in removing the protective compound still present in the particles, in particular by washing by means of a volatile liquid and (f), if appropriate, in grafting a hydrophilic ligand onto the external surface. The product thus prepared has a very marked regiospecific nature and can in particular be used for carrying out chromatographic separations of proteins. <IMAGE>

Description

L'invention concerne un procédé de préparation d'un produit particulaire poreux régiospécifique. The invention relates to a method for preparing a porous particulate product regiospecific.

Par "régiospécifique", ont entend un produit dans lequel chaque particule poreuse possède sur sa surface interne des propriétés physicochimiques spécifiques différentes de celles de sa surface externe ; The term "regiospecific", have meant a product wherein each porous particle has on its internal surface different specific physicochemical properties from its outer surface; la surface interne d'une particule est constituée par la surface des pores qui s'étendent dans son volume interne, cependant que sa surface externe est constituée par la surface périphérique de la particule, qui forme l'interface avec le milieu extérieur. the inner surface of a particle is constituted by the surface of the pores which extend in its internal volume, while its outer surface is constituted by the peripheral surface of the particle which forms the interface with the external environment. L'invention s'étend à des produits particulaires préparés par mise en oeuvre du procédé et aux applications du procédé pour la préparation de produits de séparation chromatographique. The invention extends to particulate products prepared by implementation of the method and applications of the method for the preparation of chromatographic separation of products.

Les produits particulaires poreux régiospécifiques ont des applications intéressantes pour extraire, séparer ou purifier certains composés présents dans des mélanges de composés de tailles hétérogènes. The regiospecific porous particulates have interesting applications to extract, separate or purify certain compounds present in mixtures of heterogeneous sizes compounds. La surface interne des particules peut en effet être adaptée pour exercer une rétention sur les composés de petites tailles à piéger, tandis que leur surface externe est adaptée pour ne pas interagir avec les composés de grosses tailles. The inner surface of the particles can in fact be adapted to exercise a lien on the compounds of small sizes to trap, while their outer surface is adapted to not interact with the compounds of larger sizes. Ainsi on évite les fixations parasites des composés de grosse taille sur la surface externe, écartant de la sorte, d'une part, les phénomènes de colmatage irréversible qui apparaissent avec les produits particulaires non régiospécifiques, d'autre part, la dénaturation d'une certaine proportion des composés de grosses tailles (suite à l'interaction avec la surface externe). This prevents parasitic attachments of large size composed on the outside, away from the way, on one hand, the irreversible clogging phenomena which appear with particulate products not regiospecific, on the other hand, the distortion of certain proportion of compounds of large sizes (due to the interaction with the outer surface).

La préparation des produits particulaires poreux sus-visés consiste à greffer des ligands rétentifs sur des particules poreuses inertes ; The preparation of the above-described porous particulates consists in grafting retentive ligands on inert porous particles; ces ligands se retrouvent aussi bien sur la surface interne que sur la surface externe, de sorte qu'apparaît une difficulté technique pour rendre le produit régiospécifique. these ligands are found as well on the inner surface on the outer surface, so as there is a technical difficulty to make the product regiospecific. Actuellement, deux procédés existent pour résoudre cette difficulté. Currently, two methods exist to solve this problem. L'un de ces procédés, dit "par effet bouclier (shîeld)" est décrit dans la publication suivante : "DARYL J. GISCH, BRIANT. HUNTER and BINYAMIN One such method, called "in effect shield (Shield)" is described in the following publication: "DARYL J. Gisch, BRIANT HUNTER and Binyamin.
FEIBUSH, Journal of Chromatogr. FEIBUSH Journal of Chromatogr. Biomed. Biomed. Appl. Appl. 433, 1988, 264, 268". Il consiste, après greffage des ligands rétentifs (généralement hydrophobes), à enrober chaque particule au moyen d'une couche non rétentîve (généralement hydrophile) pour masquer la réactivité des ligands fixés sur la surface externe.Mais cette couche modifie le calibrage des pores des particules de départ et le produit particulaire obtenu possède seulement la propriété d'éviter la pénétration des protéines à l'intérieur de la particule et ne peut pas être utilisé pour séparer des protéines entre elles par suite de l'absence de pores de tailles définies au niveau de la couche d'enrobage. 433, 1988, 264, 268 ". It is, after grafting retentive ligands (generally hydrophobic) to coat each particle with a non-retentive layer (usually hydrophilic) to mask the reactivity of the ligands attached to the outer surface. but this layer alters the calibration pore obtained starting particles and the particulate only has the property of avoiding the penetration of proteins within the particle and can not be used to separate proteins between them as a result of the absence of pore sizes defined at the coating layer.

L'autre procédé, d'application plus large, est décrit dans le brevet US 4.544.483 (PINKERTON) ; The other method, broader application, is described in US Patent 4,544,483 (PINKERTON); il consiste à greffer un ligand de nature particulière sur les surfaces des particules, ce ligand étant un ligand peptidique apte à être hydrolysable par une peptidase ; it consists in grafting a particular nature of ligand on the particle surfaces, this ligand being a peptide ligand capable of being hydrolysed by a peptidase; les particules sont ensuite traitées au moyen de peptidases de tailles supérieures à celles des pores de façon à hydrolyser et éliminer uniquement les ligands de la surface externe, ceux de la surface interne non accessibles par les enzymes restant intacts. the particles are subsequently processed by peptidases sizes greater than those of the pores so as to hydrolyze and remove only the ligands from the outer surface, those of the inner surface not accessible to the enzymes remain intact. Toutefois, de par son principe même, ce procédé limite la nature des ligands rétentifs utilisables qui sont nécessairement des ligands peptidiques ; However, by its very principle, this method limits the nature of the retentive ligands employable which are necessarily peptide ligands; dans les applications chromatographiques, ces ligands sont inhabituels et conduisent à des comportements difficiles à prévoir et à optimiser (réactions parasites, caractère ionique partiel...).En outre, les ligands peptidiques font appel à des méthodes de synthèse onéreuses, d'un coût beaucoup plus élevé que la synthèse des ligands habituellement utilisés en chromatographie, tels que les octadécyles qui correspondent à 80 y des applications analytiques ; in chromatographic applications, these ligands are unusual and result in behavior difficult to predict and optimize (parasitic reactions, partial ionic character ...). In addition, the peptide ligands rely on expensive synthetic methods, a cost much higher than the synthesis of ligands commonly used in chromatography, such as octadecyl that match 80 are analytical applications; une des conséquences graves de ce coût élevé est qu'il limite le procédé PINKERTON à des applications analytiques et exclut les applications préparatives de produits courants. One serious consequence of this high cost is that it limits the PINKERTON performed analytical applications and excludes preparative applications of common products. De plus dans la chromatographie de protéines, les mélanges contiennent fréquemment des protéases de petite taille qui dénatureraient le ligand de la surface interne si elles y accédaient, de sorte que le procédé More in protein chromatography, the mixtures frequently contain small proteases which would distort the ligand of the inner surface if they are accessed, so that the method
PINKERTON doit se limiter, pour ce type d'applications, à des porosités très faibles (inférieure à 10 nanomètres), interdisant aux protéases l'accès aux surfaces internes.Il est à noter au surplus que dans le cas de surfaces externes très irrégulières, l'hydrolyse par la peptidase est incomplète et laisse des ligands rétentifs sur certains sites desdites surfaces. PINKERTON should be limited to such applications, at very low porosity (less than 10 nanometers), prohibiting access to proteases internes.Il surfaces should be noted, moreover, that in the case of very irregular external surfaces, hydrolysis by peptidase is incomplete and leaves retentive ligands on certain sites of said surfaces.

L'invention se propose de fournir un nouveau procédé de préparation de produits particulaires poreux régiospécifiques. The invention proposes to provide a novel process for the preparation of porous particulates regiospecific.

Un objectif essentiel de l'invention est de permettre d'utiliser des natures de ligands très variées et notamment les ligands chromatographiques classiques (par exemple ligands à chaînes hydrocarbonées en C4, C8, C18...) en vue d'éliminer les inconvénients du procédé PINKERTON dus au ligand peptidique. An essential objective of the invention is to allow the use of very varied types and ligands including conventional chromatographic ligands (e.g. ligands hydrocarbon chains C4, C8, C18 ...) in order to eliminate the disadvantages of PINKERTON method due to the peptide ligand.

Un autre objectif est d'étendre la plage de porosité des produits particulaires obtenus, et ce quelle que soit l'application. Another goal is to extend the range of porosity of the particulate products obtained, and regardless of the application.

Un autre objectif est d'obtenir un produit particulaire poreux à caractère régiospécifique très marqué, c'est-à-dire dans lequel les surfaces internes et externes ont des propriétés physicochimiques très différenciées (désignés par la suite par "pit pour les propriétés des surfaces internes et par "Pe" pour celles des surfaces externes). Another object is to obtain a porous particulate product with a very marked regiospecific nature, that is to say wherein the internal and external surfaces have very different physicochemical properties (referred to as "pit for surface properties internal and "Pe" for those of the outer surfaces).

A cet effet, le procédé de préparation visé par l'invention est du type consistant (a) à greffer sur des particules à porosité calibrée un ligand apte à pénétrer dans les pores desdites particules et à se fixer sur la totalité de leurs surfaces en vue de leur conférer les propriétés physicochimiques (Pi) ; To this end, the preparation process to which the invention is of the type of (a) grafting on particles calibrated porosity to a ligand capable of penetrating into the pores of said particles and to bind to all of their surfaces for to confer the physicochemical properties (Pi); le procédé conforme à la présente invention se caractérise en ce que, après ledit greffage :: the method according to the present invention is characterized in that, after said grafting ::
(b) l'on remplit les pores des particules au moyen d'un composé protecteur liquide, enzymatiquement hydrolysable et possédant une affinité pour le ligand lui permettant de pénétrer dans les pores et d'occuper le volume disponible, (B) filling the pores of the particles by means of a liquid protective compound, enzymatically hydrolyzable and having an affinity for the ligand allowing it to penetrate into the pores and to occupy the available volume,
(c) l'on réalise une hydrolyse enzymatique du composé protecteur présent à la surface externe des particules au moyen d'une enzyme de taille supérieure à la taille des pores en vue d'éliminer sélectivement le composé protecteur sur ladite surface externe, (C) is carried out an enzymatic hydrolysis of the protective compound present in the outer surface of the particles by means of a size greater enzyme of the pore size to selectively remove the protective compound on said outer surface,
(d) l'on réalise une attaque des particules au moyen d'un agent réactif vis à vis du ligand et non miscible avec le composé protecteur en vue d'éliminer sélectîvement le ligand de la surface externe, (D) is carried out an attack on the particles by means of a reactant ligand overlooked and immiscible with the protective compound in order to selectively remove the ligand from the external surface,
(e) et l'on élimine le composé protecteur encore présent dans les particules. (E) and removing the protective compound still present in the particles.

Ainsi dans l'invention, le dégreffage s'effectue par une attaque notamment chimique qui peut s'appliquer à tout type de ligands ; Thus in the invention, the dégreffage is performed by a particular chemical attack which can be applied to any type of ligands; les ligands internes sont préservés par le composé protecteur, ceiui-ci restant confiné dans le volume interne après action de l'hydrolyse enzymatique destinée à débarrasser les surfaces externes dudit composé protecteur. internal ligands are preserved by the protective compound, remaining ceiui latter confined in the internal volume after the action of the enzymatic hydrolysis for clearing the outer surfaces of said protective compound. Il est à noter que cette hydrolyse enzymatique vise le composé protecteur et est donc adaptée à celui-ci (contrairement au procédé PINKERTON où l'hydrolyse enzymatique vise le ligand lui-même avec les défauts déjà développés). It should be noted that enzymatic hydrolysis is the protective compound and is therefore adapted thereto (unlike the method PINKERTON wherein the enzymatic hydrolysis is the ligand itself with defects already developed).

Le procédé de l'invention est donc compatible avec le greffage préalable de n importe quel ligand et en particulier des liqands hydrophobes classiques : méthyle, propyle, butyle, hexyle, octyle, octadécyle, phényle, cyanopropyle, ces ligands étant préférentiellement greffés sur des particules à squelette poreux silicique, qui donnent avec ceux-ci des liaisons siloxanes. The process of the invention is therefore compatible with the prior grafting n any ligand and in particular conventional hydrophobic Ligands: methyl, propyl, butyl, hexyl, octyl, octadecyl, phenyl, cyanopropyl, the ligand is grafted onto the particles silicic porous skeleton, which give therewith siloxane bonds. Le greffage de ces ligands peut être réalisé sur place lors de la mise en oeuvre du procédé ; The grafting of these ligands can be performed on site during the implementation of the method; il est également possible d'utiliser des particules préalablement greffées par le fabricant, le procédé (be) étant mis en oeuvre sur lesdites particules greffées (le greffage du ligand est de toute façon une opération préalable nécessaire, qu'il soit effectué sur place ou par une opération antérieure). it is also possible to use previously grafted particles by the manufacturer, the method (be) being implemented on said grafted particles (the ligand grafting is anyway necessary prior operation to be performed on site or by a previous operation).

Dans le cas des ligands sus-évoqués, le composé protecteur peut être choisi parmi le groupe suivant triglycé ride, per-ester de mono ou droligosaccharide, polypeptide hydrophobe ou leurs dérivés acylés ; In the case of the above-mentioned ligands, the safener compound may be selected from the following group triglycé wrinkle per-ester of mono or droligosaccharide hydrophobic polypeptide or acyl derivatives thereof; l'hydrolyse enzymatique est alors effectuée au moyen d'une hydrolase adaptée au composé protecteur utilisé : lipase, esterase ou peptidase. enzymatic hydrolysis is then carried out by means of a hydrolase in suitable protective compound used: lipase, esterase or peptidase. L'attaque chimique peut être effectuée au moyen d'une solution acide non miscible avec le composé protecteur, en particulier solution acide de pH inférieur à 1, dont le solvant a été choisi non miscible avec le composé protecteur. The etching may be carried out by means of an immiscible acid solution with the protective compound, in particular acid solution of pH less than 1, from which the solvent has been chosen immiscible with the protective compound.

Le procédé de l'invention supprime tous les défauts afférents à l'utilisation de ligands peptidiques du procédé PINKERTON et notamment leur coût élevé. The process of the invention eliminates all the defects associated with the use of peptide ligands PINKERTON process and in particular their high cost. Il préserve la porosité des particules de départ puisque l'effet protecteur n'entraîne pas de modifications de la porosité celle-ci sera choisie en fonction de l'application, en particulier diamètre de pores égal ou inférieur à 30 nanomètres pour la séparation chromatographique des protéines. It preserves the porosity of the starting particles since the protective effect does not result in changes in the porosity thereof is chosen according to the application, in particular pore diameter equal to or less than 30 nanometers for the chromatographic separation of proteins.

Il convient de souligner que l'hydrolyse enzymatique du composé protecteur peut être réalisée aussi bien avec des enzymes naturelles qu'avec des enzymes polymérisées ou fixées sur des macromolécules ; It should be noted that enzymatic hydrolysis of the protective compound can be achieved with both natural enzymes with polymerized or attached to macromolecules enzymes; les techniques de polymérisation et de fixation sont connues en elles-mêmes et permettent d'obtenir des tailles désirées pour les enzymes, en particulier enzymes de grosse taille dans le cas de pores de gros calibres. polymerization and fixing techniques are known in themselves and allow to obtain desired sizes for enzymes, particularly enzymes big size in the case of large caliber pores. Dans le cas de pores de diamètre supérieur à 10 nanomètres, on utilisera notamment des enzymes polymérisées ou fixées sur une macromolécule, ayant un poids moléculaire supérieur à 80 000 leur interdisant toute pénétration dans lesdits pores. In the case of pore diameter greater than 10 nanometers, especially be used include enzymes polymerized or attached to a macromolecule having a molecular weight greater than 80,000 prohibiting their penetration into said pores.

De plus, l'attaque chimique des surfaces externes totalement débarrassées du composé protecteur conduit à une élimination totale des ligands externes et donc à un caractère régiospécifique très marqué. In addition, the etching of the outer surfaces completely freed from the protective compound results in a total elimination of external ligands and thus to a marked regiospecific nature. Les propriétés physicochimiques spécifiques (Pe) des surfaces externes peuvent être ajustées soit en choisissant des particules de départ qui possèdent déjà sur leurs surfaces ces propriétés, soit par un greffage ultérieur d'un autre ligand sur la surface externe ; The specific physicochemical properties (Pe) of the outer surfaces can be adjusted either by selecting from particles that already have these properties on their surfaces or by a subsequent grafting of another ligand on the outer surface; il est à noter que ce greffage ultérieur peut être complet puisque tous les sites sont disponibles (l'autre liqand ayant été totalement éliminé sur les surfaces externes). it should be noted that subsequent grafting may be complete, since all sites are available (the other liqand having been completely eliminated on the external surfaces).

Par ailleurs, l'élimination du composé protecteur encore présent à l'intérieur des particules peut facilement être effectuée par plusieurs processus connus en eux-mêmes, et en particulier par un lavage au moyen d'un liquide volatil présentant une affinité pour le ligand au moins égale à celle dudit composé protecteur, ledit liquide étant ensuite éliminé par évaporation. Furthermore, removal of the protecting compound still present inside of the particles can easily be made by several processes known in themselves, and in particular by washing with a volatile liquid having an affinity for the ligand least equal to that of said protective compound, said liquid is removed by evaporation. Dans le cas des composés protecteurs cités plus haut, on peut notamment choisir comme liquide de lavage un composé du groupe suivant alcane, organochloré, cétone, éther, alcool volatil. In the case of protective compounds mentioned above, there may be selected as a washing liquid composed of the following group alkane, organochlorine, ketone, ether, volatile alcohol.

Le procédé de l'invention s'applique dans tous les cas où il est intéressant de disposer d'un produit particulaire poreux régiospécifique, et en particulier pour la préparation de produit de séparation chromatographique permettant de séparer deux groupes de composés qui présentent des tailles différentes. The process of the invention is applicable in all cases where it is advantageous to have a porous particulate product regiospecific and in particular for the preparation of chromatographic separation material for separating two groups of compounds having different sizes . Dans ce cas, le procédé est mis en oeuvre, d'une part, en choisissant des particules ayant une porosité calibrée pour permettre la pénétration d'un groupe de composés et interdire celle de l'autre groupe, lesdites particules possédant la propriété physicochimique (Pe) de ne pas interagir avec les composés à séparer et, d'autre part, en greffant sur ces particules un ligand possédant la propriété physicochimique (Pi) de retenir les composés à séparer. In this case, the method is implemented on the one hand, by selecting particles having a calibrated porosity to permit the penetration of a group of compounds and prohibit that of the other group, said particles having the physico-chemical property ( Pe) not interact with the compounds to be separated and, secondly, by grafting onto these particles a ligand having the physico-chemical property (P) to hold the components to be separated.

Le procédé de l'invention permet de fabriquer des produits particulaires particulièrement bien adaptés pour la séparation chromatographique des protéines : par exemple séparation dans un plasma des protéines de grosses tailles des molécules de petites tailles en vue d'isoler ces dernières notamment dans un but analytique, ou de purification des protéines de grosses tailles d'un plasma (notamment Ig.M.) vis-à-vis des autres protéines et autres composés de tailles plus petites. The method of the invention enables the production of particulate products particularly well suited for the chromatographic separation of proteins: e.g. separation in plasma of large sizes of the protein molecules of small size in order to isolate the latter in particular for analytical purposes or protein purification large sizes of plasma (including Ig.M.) vis-à-vis other proteins and other compounds in smaller sizes.

L'invention s'étend à certains produits particulaires poreux régiospécifiques préparés par le procédé de l'invention et que ne permettent pas d'obtenir les procédés antérieurs ; The invention extends to certain porous particulates regiospecific prepared by the process of the invention and that do not allow to obtain the prior methods; ces produits sont composés de particules poreuses siliciques se caractérisant these products are composed of porous particles silicic characterized
par la présence sur leur surface interne d'un ligand hydrophobe possédant au moins l'un des groupements suivants : méthyle, propyle, butyle, hexyle, octyle, octadécyle, phényle, cyanopropyle, en vue de présenter la propriété (Pi) de retenir les composés hydrophobes, by the presence on their inner surface a hydrophobic ligand having at least one of the following groups: methyl, propyl, butyl, hexyl, octyl, octadecyl, phenyl, cyanopropyl, to have the property (P) to hold the hydrophobic compounds,
par la présence sur leur surface externe d'un ligand hydrophile, en particulier glycéropropyle, en vue de présenter la propriété (Pe) de ne pas interagir avec les composés hydrophobes. by the presence on their outer surface a hydrophilic ligand, particularly glycéropropyle in order to have the property (Pe) not to interact with hydrophobic compounds.

Ces produits peuvent avoir une large plage de porosité en vue de s'appliquer à des séparations de molécules de tailles très variées. These products may have a wide range of porosity to be applied to separations of varied sizes of molecules. Dans le cas d'une séparation de protéines de grosses tailles, on choisira généralement un diamètre de pores égal ou inférieur à 30 nanomètres en fonction du point de coupure désiré. In the case of separation of proteins large sizes, one will generally choose a pore diameter equal to or less than 30 nanometers depending on the desired cutting point.

La description qui suit fournit plusieurs exemples de mise en oeuvre du procédé de préparation de l'invention et des exemples d'application ; The description below provides several examples of carrying out the preparation process of the invention and examples of application; la mise en oeuvre de l'exemple 1 est illustrée par les dessins annexés ; the implementation of Example 1 is illustrated in the accompanying drawings; sur ces dessins in these drawings
- les figures 1 à 12 illustrent les étapes du procédé de préparation conforme à l'invention, - Figures 1 to 12 illustrate the steps of the preparation process according to the invention,
- les figures 13 et 14 sont des chromatogrammes obtenus au terme des séparations décrites respectivement à l'exemple 2 et à l'exemple 4. - Figures 13 and 14 are chromatograms obtained after separations described respectively in Example 2 and in Example 4.

EXEMPLE 1 EXAMPLE 1
Préparation d'un produit poreux régiospécifique bifonctionnalisé C18 et diol Preparing a porous product regiospecific bifunctionalized and C18 diol
a) Greffage de ligands octadecyles sur des particules de silice a) Grafting of octadecyl ligands on silica particles
On utilise 5 g de silice "NucléosilR" (diamètre des particules 15-25 micromètres, diamètre des pores 100 Angstrom, "Macherey-Nagel n0 712-32") ; 5 g of silica is used "NucléosilR" (particle diameter 15-25 micrometers, pore size 100 Angstrom, "Macherey-Nagel n0 712-32"); une particule est symbolisée à la fiqure 1 avec ses pores 1, sa surface externe 2, sa surface interne 3 ; a particle is symbolized in the fiqure 1 with its pores 1, its outer surface 2, the inner surface 3; ces surfaces portent à l'origine des groupements silanols 4. these surfaces are originally 4 silanol groups.

Ces particules préalablement séchées 15 h à 1100 C sont mises en suspension dans 50 ml de toluène anhydre contenant 0,75 g de diméthyloctadécylchlorosilane et 1 ml de pyridine anhydre. These previously dried particles 15 h at 1100 C were suspended in 50 ml of anhydrous toluene containing 0.75 g of diméthyloctadécylchlorosilane and 1 ml of anhydrous pyridine. Après 24 h de réaction à 1100 C (reflux du toluène) et sous agitation (agitation magnétique 500 tr/min), la silice est filtrée, lavée successivement avec 30 ml de toluène et 30 ml d'éther éthylique puis séchée 15 h à 450 C. After 24 h of reaction at 1100 C (refluxing toluene) and stirring (magnetic agitation 500 rev / min), the silica is filtered, washed successively with 30 ml of toluene and 30 ml of ethyl ether and then dried 15 hours at 450 C.

On obtient 4,5 g de silice modifiée octadécyle (C18), telle que symbolisée à la figure 2. Les ligands hydrophobes octadecyle 5 sont fixés sur les surfaces internes et externes par des liaisons siloxanes. 4.5 g of octadecyl modified silica (C18), as symbolized in Figure 2. The hydrophobic ligands octadecyl 5 are fixed to the inner and outer surfaces by siloxane bonds.

b) Remplissage des pores de la silice C18 par le composé protecteur b) filling the pores of the C18 silica by the protective compound
La silice C18 greffée précédemment obtenue (1 g) est dispersée dans une solution de tridécanoate de glycérol (1,5 g) dans 10 ml de chloroforme. C18 grafted silica obtained above (1 g) is dispersed in a glycerol tridecanoate solution (1.5 g) in 10 ml of chloroform. Le chloroforme est évaporé à l'évaporateur rotatif. Chloroform was evaporated on a rotary evaporator. Comme le symbolise la figure 3, chaque particule est imbibée de tridécanoate de glycérol 6 qui remplit ses pores et couvre sa surface externe. As symbolized in Figure 3, each particle is soaked in glycerol tridecanoate 6 which fills its pores and covers its outer surface.

c) Hydrolyse enzymatique c) Enzymatic hydrolysis
On ajoute au résidu précédemment obtenu, 50 mi de tampon tris-maléate 0,2 M puis la suspension est soniquée 15 minutes au bain pour obtenir une bonne dispersion. Was added to the residue obtained above, 50 ml of tris-maleate buffer 0.2 M and the suspension is sonicated 15 minutes to the bath to obtain a good dispersion.

La suspension est alors placée dans une enceinte thermostatée à 450 C et agitée à 500 rpm. The suspension is then placed in a chamber thermostatically maintained at 450 C and stirred at 500 rpm. Le pH est maintenu à 7 par l'intermédiaire d'un pH stat qui permet grâce à un enregistrement de suivre l'état d'avancement de la réaction. The pH was maintained at 7 by means of a pH stat which allows through a recording track the progress of the reaction condition.

On ajoute alors 100 mg de lipase extraite de Candida cvlindracae et possédant une activité enzymatique de 2 unités par mg. then added 100 mg of lipase derived from Candida cvlindracae and having an enzymatic activity of 2 units per mg. Une unité enzymatique correspond à la quantité d'enzyme nécessaire pour produire une m icromole d'acide gras par minute à 370 C à pH7. One enzymatic unit corresponds to the amount of enzyme required to produce an m icromole fatty acid per minute at 370 C in pH7. La lipase de C. cylindracae, symbolisée en 7 à la figure 4, a un poids moléculaire d'environ 67 000 et n'a donc pas la possibilité de pénétrer à l'intérieur des pores de la silice C18. C. cylindracae lipase, symbolized by 7 in Figure 4, has a molecular weight of about 67,000 and is therefore not able to penetrate inside the pores of the C18 silica. Lorsqu'on n'observe plus de production d'acide gras (la quantité d'acide gras produite correspond à l'hydrolyse de 900 mg de triglycéride) on décante la silice, on la lave avec 10 ml d'eau puis avec 2 X 10 ml d'un mélange Methanol/ H20, 50/50 (V/V). When no longer observed production of fatty acid (the amount of produced fatty acid corresponds to the hydrolysis of triglyceride 900 mg) was decanted silica, washed with 10 ml of water and then with 2 X 10 ml of a methanol / H20 mixture, 50/50 (V / V). On obtient une particule dont la surface externe 2 est totalement débarrassée du composé protecteur comme le symbolise la figure 5. This gives a particle whose outer surface 2 is completely freed from the protective compound as symbolized in figure 5.

d) Attaque chimique d) Chemical Attack
La silice est alors resuspendue dans un mélange Methanol/ H2S04 2N, 50/50 (V/V) (comme le symbolise la figure 6) et est maintenue agitée au moyen d'un agitateur à plateaux à 370 C pendant 24 H. Les particules obtenues sont symbolisées à la figure 7, leur surface externe étant totalement débarrassée des ligands. The silica was then resuspended in methanol / 2N H2S04, 50/50 (V / V) (as symbolized in figure 6) and is kept stirred using a plate shaker at 370 C for 24 hours The particles obtained are represented in Figure 7, the external surface being completely free of ligands.

e) Elimination du composé protecteur e) Elimination of the protective compound
La silice hydrolysée est alors décantée, lavée avec 3 X 20 ml de Methanol puis avec 2 X 30 ml de chloroforme et 2 X 30 mi d'hexane (e). The hydrolyzed silica is then decanted, washed with 3 X 20 ml of methanol and then with 2 X 30 ml of chloroform and 2 X 30 ml of hexane (e). Le solvant est symbolisé en 8 aux figures 8 et 9 qui illustrent la dissolution du composé protecteur. The solvent is symbolized by 8 in Figures 8 and 9 illustrate that the dissolution of the protective compound. Après évaporation du solvant, on obtient 0,8 g de silice C18 hydrolysée régiosélectivement. After evaporation of the solvent gave 0.8 g of C18 silica regioselectively hydrolysed. Les particules sont symbolisées à la figure 10 : elles portent des ligands hydrophobes uniquement sur leur surface interne, tous les sites de la surface externe étant disponibles. The particles are symbolized in Figure 10: they are hydrophobic ligands only on their internal surface, all sites of the outer surface available. Au niveau macroscopique, cette silice ne présente plus le caractère de non mouillabilité de la silice At the macroscopic level, this silica not present the non-wettable character of the silica
C18 de départ. starting C18. Elle se disperse, au contraire, parfaitement dans l'eau. She scatters, however, perfectly in water.

f) Fixation de greffons diols sur la surface externe f) graft fixation diols on the outer surface
1 g de silice hydrolysée régiosélectivement est mis en suspension dans 20 ml d'une solution aqueuse de glycidoxypropyltriméthoxysilane ajustée à pH 3,5. 1 g of regioselectively hydrolysed silica is suspended in 20 ml of glycidoxypropyltrimethoxysilane aqueous solution adjusted to pH 3.5. Le mélange est chauffé à 900 C sous agitation pendant 2 H. La silice est ensuite filtrée et lavée avec 20 ml d'eau, 20 ml d'acétone et 20 ml d'éther éthylique successivement. The mixture was heated to 900 C with stirring for 2 H. The silica is then filtered and washed with 20 ml of water, 20 ml of acetone and 20 ml of ethyl ether in succession. Les conditions moyennement acides utilisées lors du couplage sont suffisantes pour convertir l'oxirane en glycol. The mildly acidic conditions used during coupling are sufficient to convert the oxirane glycol. Les particules obtenues sont symbolisées à la figure 11 ; The particles obtained are represented in Figure 11; elles se caractérisent par la présence sur leur surface interne des ligands 5 hydrophobes they are characterized by the presence on their inner surface of hydrophobic ligands 5
C18 et la présence sur leur surface externe des ligands 9 hydrophiles diol, leur conférant un caractère régiospécifique très marqué.Ce caractère a été mis en évidence par des mesures de rétention, d'une part, du naphtalène (petite molécule hydrophobe) qui rentre dans les pores et est retenu de façon similaire à ce qui se passe avec une silice C18 connue, d'autre part, de protéines de tailles supérieures à celles des pores (poids moléculaire 67 000) qui ne sont pas retenues par la surface externe (mesure "Break Through"). C18 and the presence on the external surface 9 of the hydrophilic diol ligands, conferring a regiospecific nature very marqué.Ce character has been highlighted by retention measures, firstly, naphthalene (small hydrophobic molecule) which enters the pores and is retained similarly to what happens with known C18 silica, on the other hand, those pore sizes larger protein (molecular weight 67 000) which are not retained by the outer surface (measuring "Break Through").

EXEMPLE 2 EXAMPLE 2
séparation chromatographique au moyen du produit obtenu à lrexemple 1 chromatographic separation using the product obtained in lrexemple 1
On réalise une chromatographie d'un mélange de deux principes actifs, le nesdonal (0,1 mg/ml) et le phénobarbital (0,3 mg/ml) et d'une protéine plasmatique l'albumine bovine sérique (BSA) (5 mg/ml). chromatography is carried out with a mixture of two active ingredients, Nesdonal (0.1 mg / ml) and phenobarbital (0.3 mg / ml) and a plasma protein bovine serum albumin (BSA) (5 mg / ml). On injecte 10 du mélange précédent sur une colonne 30 X 4,6 mm remplie avec le produit C18/diol préparé plus haut. Was injected 10 of the above mixture on a column 30 x 4.6 mm filled with the product C18 / diol prepared above. Cette chromatographie est symbolisée à la figure 12 (albumine en 10 et petites molécules en 11). This chromatography is symbolized in Figure 12 (albumin and small molecules 10 in 11). Phase mobile : méthanol/ tampon acétate 0,lM pH 5, 40/60. mobile phase: methanol / acetate buffer 0, lM pH 5, 40/60. Débit 1 ml/minute, détection UV 265 nm.On observe sur le chromatogramme correspondant (figure 13) un pic très important d'albumine bovine élué avant t (temps de rétention correspondant au volume mort) suivi des pics correspondant au nesdonal et au phénobarbital. Flow rate 1 ml / minute, detection UV 265 nm.On observed on the corresponding chromatogram (Figure 13) a major peak of bovine albumin eluted before t (retention time corresponding to the dead volume), followed by peaks corresponding to Nesdonal and phenobarbital . La rétention de ces composés est analogue sur la phase C18/diol à celle sur une phase C18 conventionnelle. The retention of these compounds is similar to the phase C18 / diol to that on a conventional C18 phase. Toute l'albumine a été éluée, sans interaction avec le produit poreux. All albumin was eluted, without interaction with the porous product.

EXEMPLE 3 Préparation d'un produit t poreux réqiospécifique bifonctionnalisé à partir de silice 5 C4, 300 Angström EXAMPLE 3 Preparation of a t porous réqiospécifique bifunctionalized from silica 5 C4 300 Angstrom
a) La silice C4 n'a pas été synthétisée mais a été obtenue auprès de la société "Macherey-Nagei" ("Nucléosil 300-5C4 réf 71262"). a) Silica C4 was not synthesized but has been obtained from the company "Macherey-Nagei" ( "Nucleosil 300-5C4 ref 71262").

Cette silice à larges pores possède un point de coupure à 250 000 daltons pour les protéines. This large pore silica has a breakpoint to 250,000 daltons for proteins.

b) Remplissage des pores de la silice C4 avec l'agent protecteur. b) filling the pores of the silica C4 with the protecting agent.

1 g de silice C4 est dispersé dans une solution de tridécanoate de glycérol (2 g) dans 20 mI de chloroforme qui est évaporé à l'évaporateur rotatif. 1 g of C4 silica is dispersed in a glycerol tridecanoate solution (2 g) in 20 mI of chloroform is evaporated in a rotary evaporator.

c) Hydrolyse enzymatique c) Enzymatic hydrolysis
La lipase de C. cylindracae ayant un poids moléculaire de 67 000 a donc la possibilité de pénétrer à l'intérieur des pores du produit. C. cylindracae lipase having a molecular weight of 67,000 therefore has the ability to penetrate inside the pores of the product. Pour la maintenir à l'extérieur, on effectue une polymérisation préalable. To maintain the outside, a preliminary polymerization is carried out.

Polymérisation de la lipase de Polymerization lipase
C. cylindracae C. cylindracae
1 g de lipase est dissous dans 50 ml d'une solution à 5 a de glutaraldéhyde dans un tampon phosphate O,lM à pH 8. Après une nuit à température ambiante, les sites non bloqués sont saturés par une solution de glycine (0,1 M concentration finale). 1 g of lipase was dissolved in 50 ml of a solution containing 5 to glutaraldehyde in phosphate buffer O, lM, pH 8. After a night at room temperature, non-blocked sites are saturated with a solution of glycine (0, 1 M final concentration). Le mélange réactionnel est dialysé puis purifié par chromatographie sur une colonne de perméation de gel Nucléosil 300-70H. The reaction mixture was dialyzed and purified by chromatography on a gel permeation column Nucleosil 300-70H. Les fractions correspondant au volume mort de la colonne et contenant les aggrégats de lipase de taille supérieure à celle des pores du support sont récupérées, dialysées et lyophilisées. The fractions corresponding to the void volume of the column and containing the lipase size aggregates greater than that of the support pores are recovered, dialyzed and lyophilized. On obtient 200 mg d'enzyme polymérisée possédant une activité enzymatique d'l unité/mg. Obtained 200 mg of polymerized enzyme having an enzymatic activity of the unit / mg.

Hydrolyse Hydrolysis
On ajoute au résidu 50 ml de tampon trismaleate 0,2 M. Le mélange est soniqué 15 mn au bain, puis placé dans une enceinte agitée, chauffée à 450 C et dont le pH est maintenu à 7 par un pH stat. to the residue 50 ml of buffer was added trismaleate 0.2 M. The mixture was sonicated 15 min in the bath, then placed in a stirred vessel, heated to 450 C and the pH is maintained at 7 by a pH stat. On ajoute 200 mg de lipase polymérisée obtenue précédemment que l'on laisse agir jusqutà ce que l'on n'observe plus de production d'acide gras. Was added 200 mg of previously polymerized lipase obtained which is allowed to act jusqutà that is no longer observed for producing fatty acid. La silice C4 est alors décantée, lavée à l'eau (20 ml) puis avec un mélange Methanol/ H20, 50/50 (v/v), (2 x 20 ml). The C4 silica is then decanted, washed with water (20 ml) and then with methanol / H20 50/50 (v / v) (2 x 20 ml).

d) Attaque chimique d) Chemical Attack
La silice C4 est ensuite resuspendue dans un mélange Methanol/ H2S04 2N, 50/50 (v/v) et agitée sur un agitateur à plateaux à 370 C pendant 24 H. La silice est alors décantée, lavée avec 20 ml d'eau, 2 x 20 ml de Methanol, 2 x 20 ml de chloroforme et 2 x 20 mI d'hexane puis séché(e). Silica C4 is then resuspended in methanol / 2N H2S04, 50/50 (v / v) and shaken on a plate shaker at 370 C for 24 hours then the silica was decanted, washed with 20 ml of water, 2 x 20 ml of methanol, 2 x 20 ml of chloroform and 2 x 20 ml of hexane and then dried (e). On obtient 0,8 g de silice C4 hydrolysée qui est regreffée diol selon le même protocole que précédemment (f). 0.8 g of hydrolyzed C4 silica is obtained which is regreffée diol according to the same protocol as above (f).

EXEMPLE 4 EXAMPLE 4
Chromatographie d'un mélange de deux protéines plasmatiques de poids moléculaire différent, la BSA (67 000) et l'Ig.M. Chromatography of a mixture of two plasma proteins of different molecular weight, BSA (67 000) and the Ig.M. (900 000) (900,000)
La chromatographie est effectuée sur une colonne de 30 x 4,6 mm remplie de produit préparé à l'exemple 3, dans un tampon acétate pH 5, 0,1 M avec une détection UV à 280 nm et un débit de 1 ml/minute. Chromatography is performed on a column of 30 x 4.6 mm filled with the product prepared in Example 3 in an acetate buffer pH 5, 0.1 M with UV detection at 280 nm and a flow rate of 1 ml / minute . On injecte 10 1 d'une solution de BSA (5 mg/ml) et d'Ig.M. Injecting 10 1 of a solution of BSA (5 mg / ml) and Ig.M. (0,1 mg/ml). (0.1 mg / ml).

On n'observe sur le chromatogramme (figure 14) qu'un seul pic correspondant à l'Ig.M. Is observed on the chromatogram (Figure 14) a single peak corresponding to the Ig.M. et élué avant tos la BSA est piégée sur le support. and eluted before tos BSA is trapped on the support.

Claims (13)

    REVENDICATIONS
  1. 1/ - Procédé de préparation d'un produit particulaire poreux régiospécifique, dans lequel chaque particule poreuse possède sur sa surface interne des propriétés physicochimiques spécifiques (Pi) différentes de celles de sa surface externe, consistant (a) à greffer sur des particules à porosité calibrée un ligand apte à pénétrer dans les pores desdites particules et à se fixer sur la totalité de leurs surfaces en vue de leur conférer les propriétés physicochimiques (Pi), caractérisé en ce que, après ledit greffage 1 / - A process for preparing a porous particulate product regiospecific, wherein each porous particle has on its inner surface specific physicochemical properties (Pi) different from its outer surface, comprising (a) grafting on particle porosity calibrated a ligand capable of penetrating into the pores of said particles and to bind to all of their surfaces in order to impart their physicochemical properties (Pi), characterized in that, after said grafting
    (b) l'on remplit les pores des part-icules au moyen d'un composé protecteur liquide, enzymatique ment hydrolysable et possédant une affinité pour le ligand lui permettant de pénétrer dans les pores et d'occuper le volume disponible, (B) filling the pores of the hand-icules by means of a hydrolyzable liquid protective compound, enzyme ment and having an affinity for the ligand allowing it to penetrate into the pores and to occupy the available volume,
    (c) l'on réalise une hydrolyse enzymatique du composé protecteur présent à la surface externe des particules au moyen d'une enzyme de taille supérieure à la taille des pores en vue d'éliminer sélectivement le composé protecteur sur ladite surface externe, (C) is carried out an enzymatic hydrolysis of the protective compound present in the outer surface of the particles by means of a size greater enzyme of the pore size to selectively remove the protective compound on said outer surface,
    (d) l'on réalise une attaque des particules au moyen d'un agent réactif vis à vis du ligand et non miscible avec le composé protecteur en vue d'éliminer sélectivement le ligand de la surface externe, (D) is carried out an attack on the particles by means of a reactant ligand overlooked and immiscible with the protective compound in order to selectively remove the ligand from the external surface,
    (e) et l'on élimine le composé protecteur encore présent dans les particules. (E) and removing the protective compound still present in the particles.
  2. 2/ - Procédé selon la revendication 1 pour préparer des particules poreuses possédant sur leur surface externe des propriétés physicochimiques spécifiques (P ) différentes de celles (Pi) de leur surface interne, dans lequel après élimination sélective du ligand (d) 2 / - Method according to claim 1 to prepare porous particles having on their outer surface specific physicochemical properties (P) different from those (Pi) of their inner surface, wherein after selective removal of the ligand (d)
    (f) l'on greffe un autre ligand sur la surface externe des particules en vue de conférer à celle-ci les propriétés spécifiques (Pe) (F) the other ligand is grafted on the outer surface of the particles in order to impart to it specific properties (Pe)
  3. 3/ - Procédé selon la revendication 1 pour préparer des particules poreuses possédant sur leur surface externe des propriétés physicochimiques spécifiques (Pe) différentes de celles (Pi) de leur surface externe, dans lequel l'on choisit des particules de départ possédant sur la totalité de leurs surfaces les propriétés spécifiques (Pe) 3 / - Method according to claim 1 to prepare porous particles having on their outer surface specific physicochemical properties (Pe) different from those (Pi) of their outer surface, wherein are chosen from particles having on the screen their specific properties surfaces (Pe)
  4. 4/ - Procédé selon la revendication 2 caractérisé en ce que 4 / - Method according to claim 2 characterized in that
    (a) l'on choisit des particules à squelette poreux silicique et l'on greffe sur celle-ci un ligand hydrophobe capable de donner avec la silice des liaisons siloxane, (A) particles is selected to silicic porous skeleton and grafted thereon a ligand capable of giving hydrophobic silica with the siloxane bonds,
    (b) l'on remplit les pores des particules siliciques au moyen d'un composé protecteur hydrophobe, apte à se décomposer en sous-éléments ayant un caractère hydrophobe plus faible, (B) filling the pores of the siliceous particles with a hydrophobic protective compound capable to break down into sub-elements having a low hydrophobicity,
    (c) l'on réalise l'hydrolyse enzymatique du composé protecteur présent à la surface externe des particules au moyen d'une hydrolase en vue de le décomposer en ses souséléments, (C) is carried out the enzymatic hydrolysis of the protective compound present in the outer surface of the particles by means of a hydrolase in order to decompose it into its subelements,
    (d) l'on réalise une attaque chimique des particules au moyen d'une solution acide, non miscible avec le composé protecteur hydrophobe. (D) is carried out an etching of the particles by means of an acid solution, immiscible with the hydrophobic protective compound.
  5. 5/ - Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que 5 / - Method according to claim 4, characterized in that
    (a) l'on greffe sur les particules siliciques un ligand hydrophobe possédant au moins l'un des groupements suivants : méthyle, propyle, butyle, hexyle, octyle, octadécyle, phényle, cyanopropyle, (A) is grafted onto the particles hydrophobic silicic a ligand having at least one of the following groups: methyl, propyl, butyl, hexyl, octyl, octadecyl, phenyl, cyanopropyl,
    (b) l'on remplit les pores des particules au moyen d'un composé protecteur du groupe suivant triglycéride, per-ester de mono ou d'oligosaccharide, polypeptide hydrophobe ou leurs dérivés acylés, (B) filling the pores of the particles by means of a protective compound of the following group triglyceride per-ester of mono- or oligosaccharide, hydrophobic polypeptide or their acylated derivatives,
    (c) l'on réalise l'hydrolyse au moyen d'une hydrolase adaptée au composé protecteur : lipase, estérase, peptidase, (C) the hydrolysis is carried out by means of a hydrolase in suitable protective compound: lipase, esterase, peptidase,
    (d) l'on réalise l'attaque chimique au moyen d'une solution d'acide fort de pH inférieur à 1, le solvant de ladite solution étant choisi non miscible avec le composé protecteur. (D) is carried out etching using a strong acid solution of pH less than 1, the solvent of said solution being chosen immiscible with the protective compound.
  6. 6/ - Procédé selon l'une des revendications 1 à 5 pour la préparation d'un produit particulaire de porosité supérieure à 10 nanomètres, caractérisé en ce que (c) l'on réalise l'hydrolyse enzymatique au moyen d'une enzyme polymérisée ou fixée sur une macromolécule en vue de lui conférer un poids moléculaire supérieur à 80 000. 6 / - Process according to one of claims 1 to 5 for the preparation of a particulate product of porosity greater than 10 nanometers, characterized in that (c) is carried out the enzymatic hydrolysis with a polymerized enzyme or attached to a macromolecule to impart a molecular weight greater than 80,000.
  7. 7/ - Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que : 7 / - Process according to one of claims 1 to 6, characterized in that:
    (e) l'on élimine le composé protecteur par un lavage au moyen drun liquide-volatil présentant une affinité pour le ligand au moins égale à celle dudit composé protecteur, ledit liquide étant ensuite éliminé par évaporation. (E) the compound is deprotected by washing the liquid-volatile drun means having an affinity for the ligand at least equal to that of said protective compound, said liquid is removed by evaporation.
  8. 8/ - Procédé selon les revendications 6 et 7 prises ensemble, caractérisé en ce que (e) l'on élimine le composé protecteur par lavage au moyen d'un liquide du groupe suivant : alcane, organochloré, cétone, éther, alcool volatil. 8 / - Process according to Claims 6 and 7 taken together, characterized in that (e) the compound is deprotected by washing with a liquid following group: alkane, organochlorine, ketone, ether, volatile alcohol.
  9. 9/ - Application du procédé selon l'une des revendications 1 à 8 pour la préparation d'un produit de séparation chromatographique permettant de séparer deux groupes de composés présentant des tailles différentes, dans laquelle (a) l'on choisit des particules ayant une porosité calibrée pour permettre la pénétration d'un groupe de composés et interdire celle de l'autre groupe, lesdites particules possédant la propriété physicochimique (Pe) de ne pas interagir avec les composés à séparer et l'on greffe sur ces particules un ligand possédant la propriété physicochimique (Pi) de retenir les composés à séparer. 9 / - Application of the process according to one of claims 1 to 8 for the preparation of a chromatographic separation material for separating two groups of compounds having different sizes, wherein (a) is selected particles having a calibrated porosity to permit the penetration of a group of compounds and prohibit that of the other group, said particles having the physico-chemical property (Pe) to not interact with the compounds to be separated and grafted onto these particles a ligand having the physico-chemical property (P) to hold the components to be separated.
  10. 10/ - Application selon la revendication 9 pour la a préparation d'un produit de séparation chromatographique permettant de séparer dans un plasma les molécules de petites tailles des protéines de grosses tailles en vue d'isoler lesdites molécules de petites tailles. 10 / - Use according to claim 9 for the preparation of a chromatographic separation material for separating into a plasma the small molecules of proteins large sizes to isolate said small molecules.
  11. 11/ - Application selon la revendication 9 pour la préparation d'un produit de séparation chromatographique permettant de purifier les protéines de grosses tailles d'un plasma vis à vis des autres protéines et autres composés de plus petites tailles. 11 / - Use according to claim 9 for the preparation of a chromatographic separation material for purifying the proteins of large sizes of a overlooked plasma from other proteins and other compounds of the smaller sizes.
  12. 12/ - Produit particulaire poreux régiospécifique préparé par mise en oeuvre du procédé conforme à la revendication 6, comprenant des particules poreuses siliciques se caractérisant 12 / - porous particulate regiospecific product prepared by implementing the method according to claim 6, comprising porous particles silicic characterized
    par la présence sur leur surface interne d'un ligand hydrophobe possédant au moins l'un des groupements suivants : méthyle, propyle, butyle, hexyle, octyle, octadécyle, phényle, cyanopropyle, en vue de présenter la propriété (Pi) de retenir les composés hydrophobes, by the presence on their inner surface a hydrophobic ligand having at least one of the following groups: methyl, propyl, butyl, hexyl, octyl, octadecyl, phenyl, cyanopropyl, to have the property (P) to hold the hydrophobic compounds,
    par la présence sur leur surface externe d'un ligand hydrophile, en particulier glycéropropyle, en vue de présenter la propriété (Pe) de ne pas interagir avec les composés hydrophobes. by the presence on their outer surface a hydrophilic ligand, particularly glycéropropyle in order to have the property (Pe) not to interact with hydrophobic compounds.
  13. 13/ - Produit particulaire poreux selon la revendication 12 pour la séparation chromatographique de protéines, dans lequel les pores des particules sont de diamètre égal ou inférieur à 30 nanomètres. 13 / - porous particulate product according to claim 12 for the chromatographic separation of proteins, wherein the pores of the particles are of diameter equal to or less than 30 nanometers.
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