FR2557886A1 - Media for the production and culture of secretory cells or their hybridomas - Google Patents
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Abstract
Description
"Milieux pour la production et la culture de cellules secrétantes ou de leurs hybridomes."
L'invention a pour objet de nouvelles compositions utiles, notamment, comme milieux pour les cultures cellulaires."Media for the production and culture of secretory cells or their hybridomas."
The subject of the invention is new compositions useful, in particular, as media for cell cultures.
Elle.vise plus particulièrement des compositions appropriées à la production et à la culture des cellu- les secrétantes ou de leurs hybridomes n vue de produire et de purifier des a ors monoclonaux ou des facteurs variés secrétés par ceux-ci. It more particularly relates to compositions suitable for the production and culture of secreting cells or of their hybridomas in order to produce and purify monoclonal gold or various factors secreted by them.
En effet, la culture d'hybridomes est largement utilisée pour obtenir des anticorps monoclonaux ou des facteurs tels que hormones, facteurs de croissance, inhibiteurs variés... Indeed, the culture of hybridomas is widely used to obtain monoclonal antibodies or factors such as hormones, growth factors, various inhibitors ...
Selon les techniques classiques, les hybridomes secrétant des anticorps sont obtenus par exemple par fusion d'un myélome et d'une cellule B secrétant l'anticorps, la cellule B étant elle-même obtenue par immunisation in vivo ou in vitro. According to conventional techniques, hybridomas secreting antibodies are obtained for example by fusion of a myeloma and of a B cell secreting the antibody, the B cell itself being obtained by immunization in vivo or in vitro.
On utilise un milieu sélectif permettant d'éliminer les cellules non hybrides. Les hybrides formés sont clonés et sélectionnés pour leur spécificité pour un antigène donné et sont ensuite mis en culture pour secréter l'anticorps ou le facteur considéré. A selective medium is used to eliminate the non-hybrid cells. The hybrids formed are cloned and selected for their specificity for a given antigen and are then cultured to secrete the antibody or factor considered.
Ces cultures sont généralement réalisées dans des sérums, plus spécialement du sérum foetal de veau. I1 s'agit donc de milieux de cultures contenant de nombreux facteurs non identifiés, ce qui constitue autant de paramètres dont les effets ne sont pas tou
Jours connus. De plus, la séparation des anticorps ou des facteurs produits à partir des facteurs non identifiés ou connus du sérum s'avère souvent très difficile.These cultures are generally carried out in sera, more especially fetal calf serum. These are therefore culture media containing many unidentified factors, which constitute as many parameters whose effects are not always
Known days. In addition, the separation of antibodies or factors produced from unidentified or known factors in the serum is often very difficult.
Un autre inconvénient de ces milieux avec sérum résulte de la présence d'agents de différenciation qui favorisent l'instabilité des hybridomes, lesquels ont une forte tendance à perdre leurs chromosones.Another drawback of these serum media results from the presence of differentiating agents which promote the instability of hybridomas, which have a strong tendency to lose their chromosones.
Enfin, la possibilité dans un milieu défini d'immuniser "in vitro" peut être très-importante dans le cas d'antigènes précieux, instables ou à courte demi-vie
L'invention a donc pour but ae f6urnir de nouveaux milieux de cultures pour hybridomes, faciles à élaborer, de faible coût de revient, entièrement définis moléculairement et contenant très peu de facteurs afin de faciliter la séparation des facteurs produits par les hybridomes.Finally, the possibility in a defined medium of immunizing "in vitro" can be very important in the case of precious, unstable or short half-life antigens
The invention therefore aims to develop new culture media for hybridomas, easy to develop, low cost, fully molecularly defined and containing very few factors to facilitate the separation of factors produced by hybridomas.
Elle vise plus spécialement à fournir des milieux de culture favorisant la prolifération des hybridomes tout en assurant un taux de secrétion équivalent ou supérieur à celui obtenu en présence de sérum. It more specifically aims to provide culture media promoting the proliferation of hybridomas while ensuring a secretion rate equivalent to or greater than that obtained in the presence of serum.
Les milieux pour culture cellulaire, en particulier pour culture d'hybridomes, selon l'invention, sont caractérises essentiellement-par le fait qu'ils renferment un milieu moléculairement défini comprenant au moins un composé de type glucocorticoide et au moins un composé lipidique, ces composés étant mélangés à un milieu de base apportant les éléments nutritionnels indispensables d'une manière générale à la grande majorité des cellules, tels que sucres, acides aminés, sels, vitamines et autres et à un transporteur de fer, tel que la transferrine, si la culture n'en contient pas. Par le terme "glucocorti coude11, on désigne des produits représentés plus spécialement par la structure de l'hydrocortisone. The media for cell culture, in particular for culture of hybridomas, according to the invention, are essentially characterized by the fact that they contain a molecularly defined medium comprising at least one compound of glucocorticoid type and at least one lipid compound, these compounds being mixed with a basic medium providing the nutritional elements generally necessary for the vast majority of cells, such as sugars, amino acids, salts, vitamins and the like, and with an iron transporter, such as transferrin, if culture does not contain it. The term "glucocorti coude11" denotes products more particularly represented by the structure of hydrocortisone.
Ce terme s'étend naturellement aux glucocorti
coides naturels ou de synthèse et aux dérivés tels
qu'acides ou sels, dès lors que l'effet conféré par le
composé résulte principalement de la structure corti
coide en question. Généralement, on entend par milieu
de base, la partie définie qui avec le sérum, constitue
le milieu de culture.This term naturally extends to glucocorti
natural or synthetic coides and derivatives such
acids or salts, since the effect conferred by
compound mainly results from the corti structure
coide in question. Generally, we mean by environment
basic, the defined part which, together with the serum, constitutes
the culture medium.
Selon une disposition avantageuse de l'invention, les milieux en question sont, en outre, moléculairement définis, c'est-à-dire qu'ils sont élaborés à partir de produits déterminés, en quantités déterminées. According to an advantageous arrangement of the invention, the media in question are, moreover, molecularly defined, that is to say that they are produced from given products, in given quantities.
On notera la simplicité de composition des milieux de l'invention et par là leur intérêt économique. Note the simplicity of composition of the media of the invention and thereby their economic interest.
De plus, ces milieux permettent avantageusement de réaliser la production d'anticorps monoclonaux d'origines diverses et ce à des taux au moins équivalents à ceux obtenus avec des sérums. In addition, these media advantageously allow the production of monoclonal antibodies of various origins and at rates at least equivalent to those obtained with sera.
Ils sont également utilisables pour réaliser l'immunisation in vitro, la fusion et la sélection d'hybridomes. They can also be used to carry out in vitro immunization, fusion and the selection of hybridomas.
Dans un mode préféré de réalisation de l'invention, le milieu de culture renferme au moins un glucocorticoide naturel tel que l'hydrocortisone ou un dérivé de cette dernière tel qu'un acide, un ester, un éther ou un sel et/ou un glucorticolde de synthèse tel que la déxaméthasone ou un dérivé de cette dernière. In a preferred embodiment of the invention, the culture medium contains at least one natural glucocorticoid such as hydrocortisone or a derivative of the latter such as an acid, an ester, an ether or a salt and / or a synthetic glucorticold such as dexamethasone or a derivative thereof.
Ces milieux préférés renferment avantageusement des composés lipidiques. Il peut s'agir , par exemple, de dérivés tels que les LDL... Avantageusement, on utilise des mélanges d'acides gras saturés et d'acides
gras insaturés, selon des proportions respectives
équilibrées pour obtenir un effet favorable et avanta
geusement un effet synergique. Des mélanges appropriés
comprennent l'acide linoléique, l'acide oléique,
l'acide palmitique, l'acide stéarique, l'acide arachidonique
ou leurs dérivés tels que les esters.These preferred media advantageously contain lipid compounds. It can be, for example, derivatives such as LDL ... Advantageously, mixtures of saturated fatty acids and acids are used
unsaturated fat, in respective proportions
balanced to obtain a favorable and advantageous effect
a synergistic effect. Appropriate mixtures
include linoleic acid, oleic acid,
palmitic acid, stearic acid, arachidonic acid
or their derivatives such as esters.
Tout autre composé lipidique capable d'apporter
des acides gras à la cellule peut être utilisé en
remplacement des mélanges simples d'acides gras ci-dessus.Any other lipid compound capable of providing
fatty acids to the cell can be used in
replacement of the simple fatty acid mixtures above.
La mise en oeuvre d'acides gras à raison de
2 à 100 pg/ml de milieu, de préférence de 10 à 35 jig
permet un apport satisfaisant d'acides gras à la cellule.The use of fatty acids at a rate of
2 to 100 µg / ml medium, preferably 10 to 35 µg
allows a satisfactory supply of fatty acids to the cell.
Pour assurer une dissolution satisfaisante des acides gras ou de leurs dérivés dans le milieu de culture et, par la', leur transport jusqu'aux membranes cellulaires on utilise avantageusement un composé capable de complexer les acides gras tel qu'un biopolymère lipophile; en une concentration non cytotoxique. To ensure satisfactory dissolution of the fatty acids or their derivatives in the culture medium and, thereby, their transport to the cell membranes, a compound capable of complexing the fatty acids is advantageously used such as a lipophilic biopolymer; in a non-cytotoxic concentration.
Un compose de ce type plus spécialement pré zébré, est constitué par de l'albumine délipidée et cristallisée. Ce composé est avantageusement utilisé à raison de - 0,3 à 30 mghl de préférence de 1 à 3 mg/ml . A compound of this type, more especially pre-zebra, is constituted by delipidated and crystallized albumin. This compound is advantageously used at a rate of - 0.3 to 30 mghl, preferably from 1 to 3 mg / ml.
En variante; on utilise des transporteurs de synthèse ou encore des protéines telles que la caséine ou l'ovalbumine ou toute autre protéine formant naturellement des complexes lipoprotéiques. As a variant; synthetic transporters or proteins such as casein or ovalbumin or any other protein naturally forming lipoprotein complexes are used.
Le milieu de culture contient généralement des éléments capables d'apporter du fer aux cellules tels que la transferrine-Des effets satisfaisants sont obtenus avec des concentrations de l'ordre de 10 9 à 10 5M; de préférence de l'ordre de 3 x 10-8 M. The culture medium generally contains elements capable of bringing iron to cells such as transferrin. Satisfactory effects are obtained with concentrations of the order of 10 9 to 10 5M; preferably around 3 x 10-8 M.
Les divers éléments entrant dans la constitution des milieux de l'invention sont mis en.oeuvre en mélangé dans un milieu de base. The various elements forming part of the media of the invention are implemented by mixing in a basic medium.
I1 s'agit avantageusement de milieux qui additionnés de sérum sont utilisés de façon habituelle pour la culture des cellules. Advantageously, these are media which, with added serum, are used in the usual manner for cell culture.
Des milieux appropriés comprennent, le cas échéant en combinaison, le milieu de Dulbecco modifié par Iscove, le milieu F 12 DMEM (milieu d'Eagle modifié par Dulbecco), RPMI 1640 et analogues. Suitable media include, where appropriate in combination, Dulbecco medium modified by Iscove, F 12 DMEM medium (Eagle medium modified by Dulbecco), RPMI 1640 and the like.
D'une manière avantageuse; l'invention
permet ainsi de disposer de milieux stables et identi
ques d'un lot à l'autre et de sélectionner des
hybridomes stables.Advantageously; the invention
thus provides stable and identi
from batch to batch and select
Stable hybridomas.
I1 est également possible de purifier les
immunoglobulines ou les facteurs sécrétés de façon
simple et sûre et de stimuler la secrétion à des
niveaux supérieurs à ceux obtenus en présence du sérum
qui contient de nombreux inhibiteurs non identifiés.It is also possible to purify the
immunoglobulins or the secreted factors
simple and safe and stimulate secretion to
higher levels than those obtained in the presence of serum
which contains many unidentified inhibitors.
Les milieux de l'invention présentent,
en outre, l'avantage de permettre certains marquages
spécifiques de façon quantitative, ce qui n'est pas
possible en présence de sérum. The media of the invention present,
in addition, the advantage of allowing certain markings
specific quantitatively, which is not
possible in the presence of serum.
EXEMPLE 1 : Préparation d'un milieu de culture
renfermant de 1'hydrocortisone
On utilise comme milieu de base le milieu connu
sous la dénomination IMDM (Iscove modiìed Dulbecco medium) commercialisé notamment par Gibco, Flobio,
Europio et Serimed et qui est décrit dans J.exp.Med.EXAMPLE 1 Preparation of a culture medium
containing hydrocortisone
The known medium is used as the basic medium
under the name IMDM (Iscove modiìed Dulbecco medium) marketed in particular by Gibco, Flobio,
Europio and Serimed and which is described in J.exp.Med.
1978, 2147 p 923 par Iscove N.M et Melchers F. 1978, 2147 p 923 by Iscove N.M and Melchers F.
On ajoute ensuite les éléments suivants selon les
proportions indiquées
- 1 mg/ml d'albumine de sérum bovin ou humain
délipidée telle que celle commercialisée par les
Laboratoires MILES sous le code 82-002
- 5 lug/ml de transferrine telle que la transferrine
humaine commercialisée par la Société SIGMA sous le
Code T 2252
- 10 7 moie d'un dérivé d'hydrocortisone dissoute dans
de l'méthanol tel que le succinate de sodium H-21 d'hydro
cortisone commercialisé par la Société SIGMA sous le
code H. 4881, et
- 5 Lug/ml d'acide linoléiqué, 5 ug/ml d'acide oléique,
tels que ceux commercialisés par la Société SIGMA
respectivement sous les codes L 1376 et 0-0750, et
1 jug/ml d'acide palmitique tel que celui commercialisé
par la Société MERCI sous la référence 509 (ces
différents acides gras sont utilisés en dissolution dans
de l'éthanol). The following elements are then added according to the
indicated proportions
- 1 mg / ml of bovine or human serum albumin
delipidated such as that marketed by
MILES laboratories under code 82-002
- 5 lug / ml of transferrin such as transferrin
human marketed by SIGMA under the
Code T 2252
- 10 7 mies of a hydrocortisone derivative dissolved in
methanol such as sodium succinate H-21 hydro
cortisone marketed by SIGMA under the
code H. 4881, and
- 5 Lug / ml of linoleic acid, 5 ug / ml of oleic acid,
such as those marketed by SIGMA
respectively under the codes L 1376 and 0-0750, and
1 jug / ml of palmitic acid such as that sold
by the company MERCI under the reference 509 (these
different fatty acids are used in dissolution in
ethanol).
EXEMPLE 2
On établit un milieu tel que défini dans 11 exemple l,
mais renfermant 10-8 M de dexaméthasone.EXAMPLE 2
We establish a medium as defined in 11 example l,
but containing 10-8 M dexamethasone.
EXEMPLE 3
On établit un milieu tel que défini dans l'exemple 1
mais renfermant comme milieu de base DMEM/F12
dans des proportions 1/1.EXAMPLE 3
We establish a medium as defined in Example 1
but containing DMEM / F12 as base medium
in proportions 1/1.
EXEMPLE 4 : Obtention d'hybridomes
On opère comme décritpar KOHLER G et MILSTEIN C
dans Nature 1975, 256, p. 495.EXAMPLE 4 Obtaining hybridomas
We operate as described by KOHLER G and MILSTEIN C
in Nature 1975, 256, p. 495.
Etude de la secrétion immunoglobulines Des hybridomes d'ori glanes variées ont été cultivés dans le milieu de lexem- ple 1 produisant des quantités d'immunoglobulines semblables à celles obtenues en présence de sérum soit, suivant l'hybridome,généralement de l'ordre de 10 à 100 pg/ml mais pouvant dans certains cas aller jusqu'à 1 mg/ml.Study of the secretion of immunoglobulins Various hybridomas of orians glans were cultivated in the medium of lexample 1 producing quantities of immunoglobulins similar to those obtained in the presence of serum or, according to the hybridoma, generally of the order 10 to 100 pg / ml but in some cases up to 1 mg / ml.
L'invention fournit donc des milieux simples,
économiques, faciles à commercialiser sous forme
liquide ou lyophilisée et permettant toutes les
étapes aboutissant à l'obtention d'anticorps
monoclonaux. Ces milieux qui avantageusement sont
molêculairement définis permettent la croissance
de myélomes d'origines variées, la fusion nécessaire
pour former des hybridomes avec des cellules d'origines
variées (souris, rat, homme, etc..), la sélection d'hybridomes ainsi que la production d'anticorps monoclonaux facilement séparables des constituants du milieu de culture.The invention therefore provides simple media,
economical, easy to market as
liquid or freeze-dried and allowing all
steps leading to obtaining antibodies
monoclonals. These environments which advantageously are
molecularly defined allow growth
of myelomas of various origins, the necessary fusion
to form hybridomas with original cells
various (mice, rats, humans, etc.), the selection of hybridomas as well as the production of monoclonal antibodies easily separable from the constituents of the culture medium.
Naturellement, divers facteurs peuvent être ajoutés aux milieux de l'invention tels que des conservateurs de milieux (par exemple la vitamine C, des antioxydants, le dithiothréitol ou analogues), des stimulants du métabolisme lipidique tels que lléthanolamine, la phosphoéthanolamine ou analogue, des protecteurs des produits de secrétions comme des antiprotéases, ou encore des facteurs de croissance ou des stimulateurs de secrétion- comme l'insuline. Naturally, various factors can be added to the media of the invention such as media preservatives (for example vitamin C, antioxidants, dithiothreitol or the like), stimulants of lipid metabolism such as ethanolamine, phosphoethanolamine or the like, protectors of secretion products like antiproteases, or growth factors or secretion stimulators - like insulin.
Claims (10)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8400177A FR2557886B1 (en) | 1984-01-06 | 1984-01-06 | MEDIA FOR THE PRODUCTION AND CULTURE OF SECRETANT CELLS OR THEIR HYBRIDOMAS |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| FR8400177A FR2557886B1 (en) | 1984-01-06 | 1984-01-06 | MEDIA FOR THE PRODUCTION AND CULTURE OF SECRETANT CELLS OR THEIR HYBRIDOMAS |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2557886A1 true FR2557886A1 (en) | 1985-07-12 |
| FR2557886B1 FR2557886B1 (en) | 1986-10-24 |
Family
ID=9299895
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR8400177A Expired FR2557886B1 (en) | 1984-01-06 | 1984-01-06 | MEDIA FOR THE PRODUCTION AND CULTURE OF SECRETANT CELLS OR THEIR HYBRIDOMAS |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR2557886B1 (en) |
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| EP0184640A2 (en) * | 1984-11-07 | 1986-06-18 | Siegel, Rolf, Dr. | SUpport for the in vitro culture of cells, and its use |
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1984
- 1984-01-06 FR FR8400177A patent/FR2557886B1/en not_active Expired
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2557886B1 (en) | 1986-10-24 |
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