FR2462163A1

FR2462163A1 - Dilution of sperm - by dialysis against diluent

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Publication number: FR2462163A1
Application number: FR7919515A
Authority: FR
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1979-07-30
Filing date: 1979-07-30
Publication date: 1981-02-13
Also published as: FR2462163B1

Abstract

Method of diluting pure sperm (esp. animal sperm for artificial insemination) comprises dialysing the sperm against a diluent via a membrane which is selectively permeable to the sperm. After freezing and thawing, the sperm retains a higher level of viability and mobility (and thus fertility) than sperm diluted by simple mixing, and is capable of surviving for long periods (up to 24 hr.) after thawing.

Description

Procédé de dilution de la semence reproductrice pure, notamment de la semence animale.Method for diluting pure reproductive semen, especially animal semen.

La présente invention concerne les procédés permettant d'obtenir une dilution de la semence reproductrice pure telle qu'elle est prélevée ou collectée chez les béliers, les taureaux, les chevaux, les porcs, les dindes, etc..., mais également telle qu'elle peut l'être chez l'homme. The present invention relates to methods for obtaining a dilution of pure reproductive semen as it is collected or collected from rams, bulls, horses, pigs, turkeys, etc., but also such that 'it can be in humans.

Cette dilution est prévue pour donner à la préparation obtenue la meilleur aptitude possible à la congelabilite, puisqu'une congélation est nécessaire à sa conservation jusqu'à insémi- nation, le taux de dilution étant calculé en fonction, d'une part, de la qualité de la semence (densité, motilité, pourcentage de spermatozoïdes vivants) et d'autre part, du pouvoir fécondant de l'animal, cette dilution permettant d'obtenir, par exemple, 50 à 100 millions de sper matozoldes par millilitre de préparation dans le cas d'un taureau. This dilution is intended to give the preparation obtained the best possible freezability, since freezing is necessary for its preservation until insemination, the dilution rate being calculated as a function, on the one hand, of the quality of the semen (density, motility, percentage of living spermatozoa) and secondly, the fertilizing power of the animal, this dilution making it possible to obtain, for example, 50 to 100 million sper matozoldes per milliliter of preparation in the case of a bull.

Le dilueur, dont la préparation doit être terminée une heure avant la récolte de la semence pour laisser se stabiliser le milieu peut, par exemple, être constitué par un produit à base de poudre de lait écrémé, de sucres riches et d'antibiotiques complètement dissous, par exemple, à raison de 50 g dans 400 ml d'eau distillée portée à 400C, du jaune d'oeuf frais lui-même dissous dans de l'eau distillée étant en outre ajouté a cette solution pour obtenir un meilleur mélange.Cette fraction est en général divisée en deux fractions égales, dont la première est additionnée d'un produit cryo-protecteur tel que le glycérol à raison de 3 % et placée au bain-niarie à 320 C, tandis que la seconde est également addition(::ée de glycérol, mais à raison de 11 %, et placée en milieu réfflgére à 40 C
Dans les procèdes de dol union pratiques jusqu'à ce jour, en matière d'insémination des animaux, chaque éjacu- lat, ou le premier des deux ejaculats dans le cas, par exemple, diun taureau, est tamponné en ajoutant, manuellement et instantanement, au sperme pur un volume égal de la première fraction de dilueur à 3 % de glycérol, ce qui donne donc une dilution à moitié.Dans le cas d'un double éjaculat, le premier ejaculat ainsi dilué est conservé au bain-marie à 32 C pendant la récolte du second éjaculat, auquel il est alors mélangé, ce mélange étant ensuite dilué à moitié du volume final à l'aide de la même fraction de dilueur.The diluent, the preparation of which must be completed one hour before harvesting the semen to allow the medium to stabilize, can, for example, consist of a product based on skimmed milk powder, rich sugars and completely dissolved antibiotics , for example, at a rate of 50 g in 400 ml of distilled water brought to 400C, fresh egg yolk itself dissolved in distilled water is also added to this solution to obtain a better mixture. fraction is generally divided into two equal fractions, the first of which is added with a cryo-protective product such as glycerol at a rate of 3% and placed in a bath at 320 ° C., while the second is also added (: : glycerol, but at a rate of 11%, and placed in a reflective medium at 40 ° C.
In the dol union procedures which have been practical to date, in matters of animal insemination, each ejaculate, or the first of the two ejaculates in the case, for example, of a bull, is stamped by adding, manually and instantly , to pure sperm an equal volume of the first diluent fraction to 3% glycerol, which therefore gives a half dilution. In the case of a double ejaculate, the first ejaculate thus diluted is stored in a water bath at 32 C during the harvest of the second ejaculate, to which it is then mixed, this mixture then being diluted to half the final volume using the same diluent fraction.

La semence ainsi diluée et conservée en récipients de verre, est disposée dans une cuve d'eau à 300 C qui est alors placée dans une enceinte réfrigérée à 40 C, ce qui permet de refroidir régulièrement cette semence jusqu'à cette température en environ 1 heure. La fraction de dilueur à 11 % de glycérol est alors ajoutée à cette préparation à 40 C, de manière à assurer aux cellules la protection indispensable pendant la cristallisation qui se produit lors de la congélation. En effet, dès. la fin de cette glycerolisation, la semence est conditionnée en paillettes, puis placée en containers de congélation à azote liquide dont la température des vapeurs d'azote est réglée à une températurede l'ordre de -100 à - 1600 C en fonc- tion de la dimension des paillettes et de la quantité de paillettes à congeler. The semen thus diluted and preserved in glass containers, is placed in a tank of water at 300 C which is then placed in a refrigerated enclosure at 40 C, which allows to regularly cool this seed to this temperature in about 1 hour. The diluent fraction at 11% glycerol is then added to this preparation at 40 ° C., so as to provide the cells with the essential protection during the crystallization which occurs during freezing. Indeed, from. at the end of this glycerolization, the semen is conditioned in flakes, then placed in freezing containers with liquid nitrogen, the temperature of the nitrogen vapors being adjusted to a temperature of the order of -100 to -1600 C depending on the size of the flakes and the quantity of flakes to be frozen.

On ne conserve en principe que les semences présentant à l'examen, 48 heures après la congélation, une motilité de 3 sur 5 et un pourcentage de spermatozoldes vivants égal ou supérieur à 35 %. In principle, only seeds which are examined, 48 hours after freezing, have a motility of 3 out of 5 and a percentage of living sperm equal to or greater than 35% is retained.

Ainsi, dans l'état connu de la technique, on procède à une dilution effectuée par mélange, soit de manière extrêmement rapide, si ce n'est instantanée. Thus, in the known state of the art, a dilution is carried out by mixing, either extremely rapidly, if not instantaneously.

Or, les spermatozoldes présents dans la semence pure sont particulièrement sensibles, c'est-à-dire sujets à destruction, lors de changements rapides survenant dans l'environnement naturel du liquide séminal, notamment lors d'une variation de la composition chimique de celui-ci, ce qui est en particulier le cas lorsqu'on le met en présence d'un produit cryo-protecteur tel que, par exemple, le glycérol, le diméthylsulfoxyde ou l'éthylène glycol. Par ailleurs, le plasma séminal contient des sels qui, conservés dans la préparation diluée et conditionnee, limitent la congélabilité de celleci et par conséquent sa fertilité. However, the sperm present in pure semen are particularly sensitive, that is to say subject to destruction, during rapid changes occurring in the natural environment of the seminal fluid, in particular during a variation in the chemical composition of that this, which is in particular the case when it is placed in the presence of a cryo-protective product such as, for example, glycerol, dimethylsulfoxide or ethylene glycol. In addition, the seminal plasma contains salts which, stored in the diluted and conditioned preparation, limit its freezing and consequently its fertility.

C'est pourquoi la présente invention a pour but de fournir un procédé de dilution de la semence reproductrice pure qui simultanément évite tout choc environnemental sur les sper matozoldes et réduise l'action néfaste des sels du plasma, qui en somme accroisse la conoelabilité, et par conséquent la fertilité, de cette semence. This is why the present invention aims to provide a method of diluting pure reproductive semen which simultaneously avoids any environmental shock on the sper matozoldes and reduces the harmful action of the plasma salts, which in short increases the conoelability, and therefore fertility, of this seed.

A cet effet, l'invention a pour objet un procédé de dilution de la semence reproductrice pure, caractérisé en ce qu'il consiste à soumettre cette semence à une opération de dialyse en présence du milieu dilueur prévu, avec interposition entre les deux d'un organe sêlectivement perméable à la semence. To this end, the subject of the invention is a method for diluting pure reproductive semen, characterized in that it consists in subjecting this semen to a dialysis operation in the presence of the intended diluting medium, with interposition between the two of an organ selectively permeable to semen.

De manière particulièrement avantageuse, on peut procéder à l'opération de dialyse en soumettant simultanément la semence à un déplacement relatif par rapport au milieu dilueur. In a particularly advantageous manner, the dialysis operation can be carried out by simultaneously subjecting the seed to a relative displacement relative to the diluting medium.

On utilise de préférence, comme organe sélectivement perméable à la semence, une enveloppe que l'on soumet alors-audit déplacement relatif avec la semence, par rapport au milieu dilueur qui est immobile et dans lequel est placée cette enveloppe. Preferably, as an organ selectively permeable to semen, an envelope is used which is then subjected to said relative displacement with the semen, with respect to the diluting medium which is immobile and in which this envelope is placed.

Avantageusement, on utilise une enveloppe constItuée d'un tube dont la paroi latérale est réalisée en un matériau sélectivement perméable à la semence, par exemple en une ma tière telle que l'hydrate de cellulose pure régénérée de la viscose, façonnée en pellicule et connue sous la marque de Cellophane, cette pellicule étant poreuse,
Dans un tel cas, ou l'enveloppe présente deux surfaces opposées en contact avec le milieu dilueur, on soumet cette enveloppe audit déplacement relatif par rapport à ce milieu, de manière alterne et suivant deux directions opposées.Advantageously, an envelope made up of a tube is used, the side wall of which is made of a material which is selectively permeable to semen, for example in a material such as pure cellulose hydrate regenerated from viscose, shaped into film and known. under the Cellophane brand, this film being porous,
In such a case, or the envelope has two opposite surfaces in contact with the diluting medium, this envelope is subjected to said relative displacement relative to this medium, alternately and in two opposite directions.

Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, ou l'enveloppe est constituée par un tube, on utilise un support de tube anime d'un mouvement de rotation alterné à l'inte- rieur d'une enceinte contenant le milieu dilueur. In a particular embodiment of the invention, where the envelope is constituted by a tube, use is made of a tube support animated by an alternating rotational movement inside an enclosure containing the diluent medium.

De manière particulièrement avantageuse, on procède à l'opération de dialyse sur une période de 10 minutes à 3 heures, cette durée étant fonction de l'espèce animale considérée et du volume de semence traité. In a particularly advantageous manner, the dialysis operation is carried out over a period of 10 minutes to 3 hours, this duration being a function of the animal species considered and of the volume of semen treated.

La description qui va suivre, à titre d'exemple non limitatif, a uniquement pour but de bien faire comprendre comment l'invention peut être mIse en pratique. Sur les dessins, la
Figure unique représente schématiquement un appareil permettant de mettre en oeuvre le procédé conforme à l'invention. The description which follows, by way of nonlimiting example, is only intended to make it clear how the invention can be put into practice. In the drawings, the
Single figure schematically represents an apparatus for implementing the method according to the invention.

Cet appareil est constitue par une enceinte 1 fermée par un couvercle 2 que traverse en son centre l'arbre de sortie 3 d'un moteur électrique réversible 4 monté sur ce couvercle. This device is constituted by an enclosure 1 closed by a cover 2 through which the outlet shaft 3 of a reversible electric motor 4 mounted on this cover crosses in its center.

Cet arbre de sortie 3 porte, à son extrémité, un support horizontal 5 constitue de deux bras dont chacun porte lui-même à son extrémité, à travers un orifice 6, un tube#en cellophane poreuse 7. L'extrémité su prieure de chaque tube présente une collerette 8 qui repose sur le bras du support 8, tandis que son extrémité inférieure est obturée par un bouchon en matériau plein 9. Chacun des deux tubes 7 est rempli, sur environ la moitié de sa hauteur, de la semence à diluer 10 (dont le volume est fonction de l'importance de l'éjaculat à traiter), tandis que l'enceinte 1 est elle-même remplie de dilueur 11, jusqu'à un niveau 12 supérieur à celui 13 de la semence dans les tubes.This output shaft 3 carries, at its end, a horizontal support 5 constitutes of two arms, each of which itself carries at its end, through an orifice 6, a tube # made of porous cellophane 7. The end of the prioress of each tube has a flange 8 which rests on the arm of the support 8, while its lower end is closed by a plug made of solid material 9. Each of the two tubes 7 is filled, over approximately half of its height, with semen to be diluted 10 (the volume of which depends on the size of the ejaculate to be treated), while the enclosure 1 is itself filled with diluent 11, up to a level 12 higher than that of the semen in the tubes .

On remplit tout d'abord jusqu'au niveau 12 l'enceinte 1 à l'aide d'une préparation de dilution telle que celle décrite au début de cette description, cette préparation présentant le pourcentage voulu d'un agent cryo-protecteur tel que le glycérol. La semence récoltée est alors versée pure dans les tubes 7 et on place ceux-ci sur leur support 5 dans l'enceinte 1. First of all, enclosure 1 is filled to level 12 using a dilution preparation such as that described at the beginning of this description, this preparation having the desired percentage of a cryoprotective agent such as glycerol. The collected semen is then poured pure into the tubes 7 and these are placed on their support 5 in the enclosure 1.

On alimente alors le moteur 4 de manière que celui-ci entraîne en rotation les tubes 7 alternativement dans un sens, puis dans l'autre, et l'on poursuit cette opération par exemple durant 30 minutes, période au bout de laquelle toute la semence a diffuse à travers les tubes pour se diluer dans le milieu 11. The motor 4 is then supplied so that the latter rotates the tubes 7 alternately in one direction, then in the other, and this operation is continued for example for 30 minutes, period after which all the seed diffuses through the tubes to dilute in the medium 11.

On porte ensuite, à la façon habituelle, cette semence diluée à la température de réfrigération voulue, à la suite de quoi on peut la diluer à nouveau à l'aide d'une seconde fraction de préparation diluante en mettant à nouveau en oeuvre, ou non, le procédé de dilution précedent. On procède enfin, également à la façon habituelle, à son conditionnement en paillettes et on la congèle dans les vapeurs d'azote liquide d'une enceinte cryogénique convenable. This diluted seed is then brought, in the usual way, to the desired refrigeration temperature, after which it can be diluted again using a second fraction of diluent preparation by using again, or no, the previous dilution process. Finally, also in the usual way, its packaging in flakes and it is frozen in the liquid nitrogen vapors of a suitable cryogenic enclosure.

Les résultats de l'examen effectué après congélation montrent que la congélabilité de la semence est considéra- blement accrue par rapport à une semence ayant subi le traitement classique de dilution par mélange. On constate en effet que le pourcentage des spermatozoldes vivants et la mobilité de ceux-ci sont très fortement accrus, ce qui entraîne une augmentation notable de la ferutilité. On note également, après décongélation, une faculté de survie extrêmement importante puisqu'elle peut atteindre jusqu'à 24 heures après la décongélation, ce qui présente un grand intérêt sur le plan pratique puisque ce résultat évite d'avoir à procéder à cette opération de décongêlation juste avant I'insemination,c'est-à-dire en général dans les conditions relativement précaires d'un champ. The results of the examination carried out after freezing show that the freezability of the semen is considerably increased compared to a semen which has undergone the conventional treatment of dilution by mixing. It can be seen that the percentage of living sperm and the mobility of these are very greatly increased, which leads to a notable increase in ferutility. We also note, after thawing, an extremely important faculty of survival since it can reach up to 24 hours after thawing, which is of great practical interest since this result avoids having to carry out this operation of defrosting just before insemination, that is to say in general under the relatively precarious conditions of a field.

Claims

10) - Process for diluting pure reproductive semen, characterized in that it consists in subjecting this semen to a dialysis operation in the presence of the intended diluting medium, with the interposition between the two of an organ selectively permeable to semen.

20) - Method according to claim 1, characterized in that proceeds to the dialysis aperation by simultaneously subjecting the seed to a relative displacement relative to the diluent medium.

30) - Method according to claim 2, characterized in that an organ which is selectively permeable to semen is used, an envelope which is then subjected to said relative displacement with the semen, with respect to the diluting medium which is immobile and in which this envelope is placed.

40) - Method according to claim 3, characterized in that an envelope consists of a tube whose side wall is made of a material selectively permeable to seed.

50) - Process according to claim 4, characterized in that a tube made of porous regenerated pure cellulose hydrate of viscose is used as the envelope.

6) - A method according to any one of claims 3 to 5, characterized in that, in the case where the envelope has two opposite surfaces in contact with the diluting medium, this envelope is placed under said relative displacement relative to this middle, alternately and in two opposite directions.

70) - Method according to claim 6, characterized in that, in the case where the envelope is constituted by a tube, use is made of a tube support animated by an alternating rotation movement inside an enclosure containing the diluting medium.

8) - Method according to claim 7, characterized in that two tubes are used which are moved in opposite relative directions relative to the diluting medium.

9) - Method according to any one of claims 4 to 8, characterized in that the tube is provided at its lower end with a solid plug.

100) - Method according to any one of claims 1 to 9, characterized in that one proceeds to the dialysis operation over a period of 10 minutes to 3 hours.