FI82891C - Produkt och foerfarande foer oekning av enzymadsorption. - Google Patents

Description

1 82891

Tuote ja menetelmä entsyymiadsorption lisäämiseksi Tämä keksintö koskee entsyymin irnmobilisoimista. Lähemmin määriteltynä keksintö koskee menetelmää rakei-5 seksi muutettujen selluloosan ioninvaihtokoostumusten adsorptiokyvyn parantamiseksi sekä tällä tavalla valmistettua parannettua tuotetta.

Elintarvikkeiden käsittelyssä ja muissa kaupallisissa sovellutuksissa on mikrobiaalisten tai fungaalis-10 ten entsyymien käyttö adsorboituna inertisiin kantaja- aineisiin tai niihin sidottuna liikkumattomiksi tehtyjen biologisten katalysaattorien aikaansaamiseksi on suuressa määrin syrjäyttänyt vanhemmat menetelmät, joissa käytettiin liukoisia entsyymejä tai mikro-organismien 15 kokonaisia soluja. Immobilisoitujen entsyymien käyttö tuottaa yleensä lukuisia huomattavia etuja vanhempiin menetelmiin verrattuna. Pääasiallisin etu on se, että immobilisoidut entsyymit soveltuvat käytettäviksi jatkuvissa muutosprosesseissa. Tällä tavoin saavutetaan ent-20 syymin tehokkaaitpi käyttö ja entsyymin ja substraatin välinen kosketusaika lyhenee, josta on seurauksena tuotteen parantunut laatu ja entsyymi- ja tuotantokustannusten pieneneminen.

Selluloosa esiintyy luonnossa lineaarisena poly-25 meerinä, joka koostuu glukoosianhydridiyksiköistä, jot ka ovat liittyneet toisiinsa £-1,4-glykosidisilla sidoksilla. Jokaiien glukoosianhydridiyksikkö sisältää 3 vapaata hydroksyyliryhmää, jotka kykenevät reagoimaan sopivien reagenttien kanssa muodostaen liukenemattomia 30 selluloosajohdannaisia, joilla niiden suhteellisen iner tian, suuren pinta-alan ja avoimen, huokoisen rakenteen johdosta on suuri adsorptio- tai ioninvaihtokyky proteii-nimolekyyleihin nähden.

Selluloosasta johdettujen ioninvaihtoentsyymiad-35 sorbentticn valmistus ja hyväksikäyttö on tekniikassa tunnettua. Peterson ja Sober, J.A.C.S. 78, 751 (1956) 2 82891 ja Guthrie ja Bullock, I/EC, 52, 935 (1960) ovat selostaneet menetelmiä adsorboivien selluloosatuotteiden valmistamiseksi, joita voitiin käyttää entsyymien ja muiden proteiinien erottamiseen tai puhdistamiseen.

5 Tsumura et ai., Nippon Shakuhin Kogyo Gakkaishi. 14, (12), (1967), ovat esittäneet glukoosi-isomeraasin sitomista DEAK-Sephadex1 iin.

Sipos'in nimissä myönnetty US-patentti nro 3 708 397 koskee menetelmää glukoosi-isomeraasin immobi- 10 lisoimiseksi emäksisiin anioninvaihtoselluloosalajeihin. Hurst'in ja muiden nimissä myönnetty US-patentti nro 3 823 133 kohdistuu menetelmään kationisten selluloosa-eetterien valmistamiseksi, joilla on suuri adsorptiokykv ^ entsyymeihin ja muihin proteiinipitoisiin materiaalei hin nähden. Van Velzen'in nimissä myönnetty US-patentti nro. 3 838 007 esittää menetelmän, jossa entsyymivalmis-te saadaan erillisten osasten muodossa. US-patentit nrot 3 788 945 ja 3 909 354, jotka molemmat on myönnetty Thompson'in ia muiden nimissä, selostavat jatkuvia me- 20 netelmiä glukoosin muuttamiseksi fruktoosiksi johtamalla glukoosia sisältävä liuos kiinteän tai leijukerrok-sen läpi, jotka sisältävät glukoosi-isomeraasia sidottuna erilaisiin selluloosatuotteisiin. Dinelli'n ja mui-2^. den nimissä myönnetty US-patentti nro 3 947 325 koskee selluloosaa sisältävän palloiksi muodostetun entsymaat-tisen materiaalin valmistusta. Selluloosa muodostetaan emulsiosta, joka sisältää entsyymin vesiliuosta ja nit-roselluloosaa. Idaszak'in ja muiden nimissä myönnetty US-patentti nro 3 956 065 koskee jatkuvaa menetelmää 30 glukoosin muuttamiseksi fruktoosiksi, jolloin glukoosia sisältävä liuos johdetaan kerroksen läpi, joka käsittää selluloosajohdannaista, johon glukoosi-isomeraasia on immobilisoitu, sekä ei-huokoisia tai rakeisia ^ polystyreenihelmiä. Helmet estävät kerroksen paakkuun- 3 82891 tumisen ja holvautumisen, kun tällaisia käytetään vir-tausreaktoreissa. Peska ja muut selostavat artikkelissa, jonka otsikkona on "Helmimäisen selluloosan ioninvaihto johdannaisia" Die Angewandte Makromolekulare Chemie, 5 53, sivut 73-80 (1976), erilaisia helmien muotoon muutet tuja selluloosa-lajeja.

US-patentit nrot 4 110 164 ja 4 168 250, jotka molemmat on myönnetty Sutthoff in ja muiden nimissä, koskevat agglomeroituja kuitumaisia ioninvaihtoselluloosa-10 koostumuksia sekä menetelmiä niiden valmistamiseksi.

Näissä menetelmissä yhdistetään hydrofobinen polymeeri kuitumaisen selluloosan kanssa, jota on aikaisemmin muutettu siten, että sille on saatu ioninvaihto-ominaisuuksia. Vaikkakin nämä koostumukset toimivat tyydyttävästi 15 monissa sovellutuksissa, ei niiden ioninvaihtokyky ja kyky adsorboida tai sitoa glukoosi-isomeraasia ole toivotun suuruinen. Näiden menetelmien taloudellisuudet ovat sitäpaitsi sellaiset, että ne tekevät koostumusten valmistuksen kalliimmaksi kuin mitä on suositeltavaa.

20 Antrim'in ja muiden nimissä myönnetty US-patentti nro 4 355 117 esittää menetelmän agglomeroidun DEAE-sel-luloosakoostumuksen valmistamiseksi, jolla vältetään monet edellä tarkastellut heikkoudet, ja tämä on edullinen menetelmä koostumuksen valmistamiseksi, joka on käyttö-25 kelpoinen tätä keksintöä käytäntöön sovellettaessa.

Tämä keksintö tarjoaa menetelmän agglomeroidun DEAE-selluloosakoostumuksen valmistamiseksi, joka kykenee adsorboimaan tai sitomaan varautuneita makromolekyylejä, jossa menetelmässä DEAE-selluloosa agglomeroidaan 30 hydrofobisen polymeerin kanssa rakeisen koostumuksen muodostamiseksi, menetelmän käsittäessä parannuksen, jonka mukaan koostumusta käsitellään vesipitoisen väliaineen kanssa kohotetussa lämpötilassa ja riittävän pitkän ajan koostumuksen adsorptio- tai sitomiskyvyn paranta-35 miseksi.

4 82891 Tämä keksintö tarjoaa lisäksi menetelmän rakeisen DEAE-selluloosakoostumuksen adsorptio- tai sito-miskyvyn parantamiseksi varautuneisiin makromolekyyleihin nähden, jonka menetelmän mukaan: 5 a) agglomeroidaan selluloosaa hydrofobisen poly meerin kanssa rakeisen koostumuksen muodostamiseksi; b) muutetaan koostumuksessa oleva agglomeroitu selluloosa muuttamiskykyisen aineen kanssa ioninvaihto-ominaisuuksien tuottamiseksi sille, jolloin ainakin osa 10 selluloosajohdannaisesta on vapaana adsorboimaan varau tuneita makromolekyylejä; c) pysytetään muutettu koostumus rakeisessa muodossa; ja d) käsitellään rakeista, muutettua koostumusta 15 vesipitoisen väliaineen kanssa kohotetussa lämpötilassa riittävän pitkän ajan mainitun muutetun koostumuksen makromolekyylejä adsorboivan kyvyn parantamiseksi.

Selluloosa voidaan muuttaa ioninvaihtomateriaalien saamiseksi, joilla on suuret kuormituskyvvt adsorboiviin 20 tai immobilisoituihin makromolekyyleihin nähden. Tässä tarkoituksessa selluloosa voidaan muuttaa siten, että saadaan ioninvaihtomateriaaleja, joilla on joko anionin-tai kationinvaihtokyky, riippuen adsorboitavassa materiaalissa olevasta varauksesta. Jos adsorboitava materiaali on 25 glukoosi-isomeraasi, muutetaan selluloosa edullisesti anioninvaihtomuotoon, koska tässä muodossa sen kuormitus-kyky tähän entsyymiin nähden on erittäin suuri. Anionin-vaihtomuodon valmistamiseksi käsitellään agglomeroitua selluloosaa tyypillisesti sopivien reagenttien kanssa 30 muiden muassa di- ja tri-etyyliaminoetyyliselluloosien, kuten DEAE-selluloosan ja TEAE-selluloosan valmistamiseksi ja epikloorihydriinin ja trietanoliamiinin selluloosa johdannaisten, kuten ECTEOLA-selluloosan valmistamiseksi. Taustatietoa ja menetelmiä selluloosajohdan-35 naisten valmistamiseksi on esitetty Hurst'in ja muiden nimissä myönnetyssä US-patentissa nro 3 823 133.

5 82891

Vaikkakin seuraava selostus ja esimerkit ovat pääasiallisesti kohdistetut agglomeroidun ioninvaihto-selluloosan hyväksikäyttöön glukoosi-isomeraasin adsor-boimiseksi ja immobilisoimiseksi, osoitetaan myöskin, 5 että agglomeroidulla materiaalilla on kyky adsorboida muuta proteiinipitoista materiaalia ja otetaan mahdollisena lukuun se, että agglomeroidulla materiaalilla on kyky adsorboida muita varautuneita makromolekyylejä, kuten nukleiinihappoja ja niiden kaltaisia, ja lisäk-10 si sillä saattaa olla kykyä ottaa talteen mainittuja molekyylejä erilaisista aineista, kuten elintarvikkeiden jätevirroista, esim. kyky ottaa talteen proteiinia maidon herasta, lihankäsittelyn jäteaineista ja kasvisten käsittelyn jäteaineista, B0D:n vähentämiseksi jätein aineista jne..

Glukoosi-isomeraasia sisältävien ioninvaihtosel-luloosavalmisteiden suuren kuormituskyvyn johdosta voidaan, käytettäessä tällaisia teollisuussovellutuksissa, käyttää suhteellisen pieniä reaktoreita suurten glukoo-20 simäärien muuttamiseksi fruktoosiksi.

Tämän suuren kuormituskyvyn johdosta pysytetään lisäksi substraatti ja saatu tuote isomerointiolosuh-teissa vain lyhyen ajan. Tällaiset isomerointiolosuh-teet vaikuttavat yleensä osaltaan ei-toivottujen sivu-25 tuotteiden pienien määrien muodostumiseen fruktoosin reaktiivisen luonteen johdosta, ja tämän vuoksi mitä pitemmän ajan fruktoosia pidetään tällaisissa olosuhteissa, sitä suuremmat määrät ei-toivottuja sivutuotteita muodostuu. Ioninvaihtoselluloosan suuresta kuormitus-30 kyvystä on tällöin tuloksena substraatin isomeroituminen toivotussa määrin lyhyessä ajassa, mikä lyhentää sitä aikaa, jonka fruktoosikomponenttia pidetään isomeroin-tiolosuhteissa. Tällaiset ei-raemaista ioninvaihtosellu-loosaa sisältävät valmisteet kärsivät "paakkuuntumis"-35 haitasta ja sen vuoksi niitä käytetään yleensä matalina kerroksina liiallisen vastapaineen aiheuttamien prob- ___ -· τ 6 82891 leemojen kehittymisen estämiseksi. Siinäkin tapauksessa, että käytetään matalia kerroksia, on olemassa hol-vautumisen mahdollisuus, jolloin substraatti ei pääse kosketukseen toivotussa määrässä sidotun tai immobili-5 soidun glukoosi-isomeraasin kanssa. Joskin eräitä immo- bilisoituja glukoosi-isomeraasivalmisteita on kehitetty näiden probleemojen minimoimiseksi, kärsivät ne yleensä muista haitoista, esim. niiden entsyymikapasiteetti eli aktiviteetti tilavuusyksikköä kohti ei ole niin suu-10 ri kuin mitä toivotaan, ja/tai ne eivät ole taloudellisia ioninvaihtoselluloosana.

Esillä olevaa keksintöä käytäntöön sovellettaessa voidaan käyttää lukuisia polymeerejä selluloosan agg-lomeroitumiseen. Esimerkkejä näistä ovat sellaiset poly-15 meerit, kuten melamiiniformaldehydihartsit, epoksihart- sit, polystyreeni ja näiden kaltaiset. Edullinen polymeeri on polystyreeni.

US-patenteissa nrot 4 110 164 ja 4 168 250 esitetään, että kun selluloosa, jota on muutettu ioninvaih-20 tomateriaalin valmistamiseksi, agglomeroidaan hydrofobi sen polymeerin kanssa sopivissa olosuhteissa, säilyttää tällainen selluloosa kykynsä immobilisoida tai sitoa glukoosi-isomeraasia. Edullisen menetelmän mukaan ainekoostumusten valmistamiseksi käsitellään alkaliselluloo-25 saa dietyyliaminoetyylikloridihydrokloridin (DEC) liuok sella ja sen jälkeen agglomeroidaan saatu muutettu io-ninvaihtoselluloosa polystyreenin kanssa. Sen johdosta, että polystyreeni on liukoinen DEC:n reaktioseokseen, voidaan kuitenkin ennakolta odottaa, että selluloosa 30 ei muutu tehokkaasti, jos agglomeraatit muodostetaan ennen selluloosan johdannaisen valmistusta.

Kuten edellä mainittiin, ovat Antrim ja muut todenneet ja esittäneet US-patentissa 4 355 117, että selluloosa voidaan tehokkaasti muuttaa hydrofobisen po-35 lymeerin läsnäollessa valvomalla prosessin olosuhteita johdannaisen valmistuksen aikana niin, että polymeeri 7 82891 saadaan estetyksi muuttumasta liukoiseksi muutoksen aiheuttavaan liuokseen. Niinpä todettiin, että lisäämällä muutoksen aiheuttavaa ainetta valvotulla nopeudella agglomeraatin vesisuspensioon aikalisissä olosuh-5 teissä, ei rakeisen ainekoostumuksen hydrofobinen poly- meerikomponentti muutu liukoiseksi huomattavassa määrässä.

Vielä eräs odottamaton havainto oli se, että kun selluloosan johdannainen muodostettiin sen agglomeroin-nin jälkeen, voidaan selluloosakoostumuksen johdannai-10 sen muodostaminen viedä pitemmälle ja siten saada sille suurempi ioninvaihtokyky kuin sillä agglomeroidulla sel-luloosakoostumuksella on, joka valmistetaan tekniikan aikaisemman tason tuntemalla menetemällä, jossa selluloosan johdannaisen muodostaminen suoritetaan ennen agg-15 lomerointia. Samalla kun tämän keksinnön mukaisen agglo- meroidun kuitumaisen selluloosakoostumuksen ioninvaihtokyky voi vaihdella laajasti, tulee ioninvaihtokyvyn olla tyypillisesti vähintään noin 0,1 mekv. g ja edullisesti vähintään noin 0,2 mekv. g 20 Nyt on yllättäen huomattu, että muutetun koostu muksen valmistuksen jälkeen käsittely kuumalla vesipitoisella väliaineella voi dramaattisesti suurentaa koostumuksen adsorptiokykyä. Kuumalla vesipitoisella väliaineella suoritetulla käsittelyllä tarkoitetaan käsittelyä 25 kohotetuissa lämpötiloissa väliaineessa, kuten vesijoh tovedessä, deionisoidussa vedessä tai laimeissa suolaliuoksissa, joiden johtokyky on enintään noin 7000 ^.umho tai suurempi, edullisesti noin 1000 ^umho.

Ainekoostumuksen valmistamiseksi on edullista 30 käyttää Antrim'in ja muiden menetelmää, joka on selos tettu US-patentissa nro 4 355 117, jonka sisältö on sisällytetty tähän viittauksena.

Erityisesti valmistettiin kahta eri tyyppistä selluloosajohdannaista, tyyppiä I-GDC, joka sisälsi 35 alumiinioksidia tiivistävänä aineena, kun taas tyyppi II-GDC sisälsi titaanidioksidia tiivistävänä aineena.

8 82891

Kummankin koostumuksen valmistamiseksi käytettiin seuraavaa valmistusmenetelmää. Agglomeraatti valmistettiin sekoittamalla 30 osaa CEPO S-100 selluloosaa (Swesish Cellulose Powder and Woodflower Milk Ltd, 5 Göteborcr, Ruotsi) ja 20 osaa täyteainetta (joko alu miinioksidia tyypin I tapauksessa tai titaanidioksidia tyypin II tapauksessa) ja seos sekoitettiin 50 osan kanssa polystyreeniä kuumennetulla (180°-200°C), vals-siparin muodostamalla sekoittajalla 10 minuutin ajan.

10 Jäähdytyksen jälkeen seostettu ainekoostumus jauhettiin ja seulottiin 40-80 mesh'in osaskokoon.

Toiseen 2-litran vetoisesta nelikaulaisesta muoviastiasta, jotka oli varustettu hämmennvslaitteella, lämpömittarilla, jossa oli Therm-0-Watch-säätäjä, lauh-15 duttajalla sekä kuumennusvaipalla, pantiin 300 g joko tyyppiä I tai tyyppiä II olevaa rakeista selluloosaa (GC-j- tai GCj ) ja 942 ml deionisoitua vettä. Samalla kun seosta hämmennettiin, lisättiin 300 g kidevedetöntä natriumsulfaattia, sen jälkeen 82 g 50 %:ista natrium-20 hydroksidiliuosta. Kumpaankin reaktioseokseen, jotka oli kuumennettu 40°C:seen, lisättiin käyttäen Technicon-pumppua 117 g 50 %:ista dietyyliaminoetyylikloridihydro-kloridireagenttia. (DEC). Reagentti lisättiin 2 tunnin kuluessa. Seosta hämmennettiin 40°C:ssa 30 minuuttia, 25 sen jälkeen lisättiin 62 g NaOH kumpaankin hartsiin ja lisäksi lisättiin 117 g DEC-reagenttia 2 tunnin kuluessa. Reaktioseoksia kuumennettiin sen jälkeen 60°C:ssa noin 30 minuuttia, sen jälkeen jäähdytettiin ja pH säädettiin arvoon 6,5 käyttämällä 30 %:ista H2SO4. Tuotteis-3Q ta käytetään merkintöjä rakeinen selluloosajohdannai nen tyyppi I (GDCj) ja rakeinen selluloosajohdannainen tyyppi II (GDC-j-j) .

Seuraavat esimerkit valaisevat tätä keksintöä, mutta niiden tarkoituksena ei ole rajoittaa sitä.

9 82891

Esimerkki 1 Tämä esimerkki kuvaa entsyymiglukoosi-isomeraa-siin nähden saavutettua adsorptiokyvyn suurenemista kun alumiinioksidia täyteaineena käyttäen valmistettua ra-5 keistä selluloosajohdannaista (GDCj) käsiteltiin vedellä noin 90°C:ssa.

Käyttämällä U.S. numero 60 mesh’in ruostumatonta terästä olevaa seulaa seulottiin 50 g (tuorepainona, t.p., engl. f.b.) kuivattua GDCj käyttäen 10 noin 24 litraa suihkuttimesta suihkutettua vettä. Seulotusta GDCj:sta poistettiin vesi sintratun lasisuodatti-men ja tyhjöpullon avulla ja pidättynyt aine pullotettiin sen jälkeen ja merkittiin näytteeksi A.

600 ml:an deionisoitua vettä, joka oli 1000 ml:n 15 vetoisessa ruostumatonta terästä olevassa laboratorioas-tiassa, pantiin 21,7 g (kuiva-ainetta, k.a., engl. d.b.) edellä mainittua seulottua GDCj. Astia pantiin vesihauteeseen, joka oli kuumennettu noin 90°C:seen, ja seosta hämmennettiin 90°C:eisessa vesihauteessa 30 minuuttia.

20 Kuuma seos suodatettiin käyttämällä karkeata sint- rattua lasisuodatinta ja imupulloa ja sen jälkeen GDC:n kiinteät aineet pantiin takaisin 1000 ml:n vetoiseen ruostumattomaan astiaan. Astiaan lisättiin toinen 600 ml:n suuruinen erä deionisoitua vettä ja seosta kä-25 siteltiin samalla hämmentäen toisen kerran 30 minuuttia 90°C:eisessa vesihauteessa.

Kuuma seos suodatettiin edellä kuvatulla tavalla ja sen jälkeen GDC:n kiinteitä aineita käsiteltiin kolmannen kerran 600 ml:n suuruisen määrän kanssa deioni-30 soitua vettä 30 minuutin ajan 90°C:eisessa vesihautees sa. Lopullisen suodatuksen jälkeen kolmasti käsitelty GDCj, josta vesi oli erotettu, pullotettiin ja merkittiin näytteeksi B.

Käsitellyn GDC:n adsorbtiokyky glukoosi-isome-35 raasiin nähden määritettiin käyttämällä yksivaiheista menetelmää. Tällöin pantiin 140 ml:n vetoiseen, kan- 10 82891 neliä varustettuun muovipulloon 4.8358 g (t.p.) (2.0262 g k.a.) käsiteltyä GDC^. (näyte B) ja 50.0 ml deionisoitua vettä. Tähän seokseen lisättiin 0,5 ml 1 M tris-puskuria, pH 7,0, ja 1,25 ml glukoosi-isome-5 raasia (5412 (IGIU/ml), jonka aktiviteetti oli 6765 IGIU. Glukoosi-isomeraasi voidaan puhdistaa uutoksista, jotka sisältävät entsyymiä, menetelmillä, jotka ovat tällä alalla hyvin tunnettuja, kuten sellaisilla puhdistusmenetelmillä, joita ovat, joskaan eivät ainoas-taan, sentrifugointi, suolalla (esim. ammoniumsulfaatilla) seostaminen ja pylväskromatografia (esim. ioninvaihtoon tai affiniteettiin perustuva). Kansainvälinen glukoosi-isomeraasiyksikkö (IGIU) on se entsyymimäärä, joka muuttaa yhden mikromoolin glukoosia fruktoosiksi 15 minuutissa liuoksessa, joka sisältää 2 6,84 - 6,85 (0,2 M natriummaleaatti) 60°C:n lämpötilassa. Natrium-kloridia lisättiin johtavuuden saamiseksi arvoon 3 noin 9,5 x 10 yumho ja seosta hämmennettiin tunnin ajan. pH säädettiin arvoon 7,1 käyttämällä laimeata 20 HC1 ja näytettä hämmennettiin 4 tuntia. Laskeutumisen jälkeen näyte kirkasta nestettä laimennettiin suhteessa 1:10 ja analysoitiin Technicon-kokeen avulla, jonka ovat selostaneet Lloyd, et ai. Cereal Chemistry 49(5): 544-553 (1972). Todettiin, että kirkkaan nesteen glukoo-25 si-isomeraasiaktiviteetti oli kaikkiaan 803 IGIU. Täl löin 2,0262 g (k.a.) GDC adsorboi kaikkiaan 5960 IGIU glukoosi-isomeraasia eli 2940 IGIU/g (k.a.) GDCj.

Käyttämällä samaa menetelmää lähtöaineelle GDC (näyte A) ja samalle entsyymille saatiin adsorptio-30 kapasiteetiksi 1955 IGIU/g GDC^ (k.a.). Käsittelys tä korkeassa lämpötilassa oli tällöin tuloksena 50 %:n suureneminen GDC^:n entsyymin adsorptiokyvyssä.

Esimerkki 2 Tämä esimerkki kuvaa saavutettua entsyymin ad-35 sorptiokyvyssä tapahtuvaa suurenemista, kun titaanidiok sidia täyteaineena käyttäen valmistettua rakeista selluloosa johdannaista (GDCjj) käsiteltiin vedellä noin 90°C:ssa.

n 82891 Näytettä, joka käsitti 65,5 g t.p. (34,5 g k.a.) GDCj-j., hämmennettiin laboratorioastiassa, joka sisälsi noin 600 ml deionisoitua vettä (huoneen lämpötila), ja sen jälkeen seulottiin käyttämällä vesisuihkutinta U.S.

5 numero 60 mesh'in ruostumatonta terästä ole valla seulalla käyttäen noin 24 litraa vettä. Pestystä GDC:sta poistettiin vesi sintratulla lasisuodattimella, pidättynyt aine pullotettiin ja merkittiin näytteeksi A. Tätä näytettä käytettiin vertailukohteena; tällöin ei 10 käytetty mitään 90°C:eista käsittelyvaihetta.

Toinen näyte, joka käsitti 34,5 g (k.a.) GDC^, pantiin ruostumatonta terästä olevaan laboratorioastiaan yhdessä 600 ml:n kanssa deionisoitua vettä. Astia pantiin kuumaan vesihauteeseen, jonka lämpötila oli noin 15 90°C, ja lietettä hämmennettiin tässä haudelämpötilassa $ tuntia. Saatu tuote pestiin U.S. numero 60 mesh'in ruostumatonta terästä olevalla seulalla hienon jauheen poistamiseksi käyttäen noin 24 litraa vettä. Näytteestä poistettiin vesi sintratulla lasisuodattimel-20 la, pidättynyt aine pullotettiin ja merkittiin näytteek si B.

Vielä yksi näyte, joka käsitti 34,5 g (k.a.) GDCjj., pantiin yhdessä 600 ml:n kanssa deionisoitua vettä, ruostumatonta terästä olevaan astiaan ja käsiteltiin 25 edellä kuvatulla tavalla 90°C:eisessa vesihauteessa $ tuntia. Kiinteät aineet suodatettiin, suspendoitiin uudelleen vielä toiseen 600 ml:n määrään deionisoitua vettä ja käsiteltiin 90°C:eisessa vesihauteessa i tuntia toisen kerran. Tuote pestiin U.S. numero 30 60 mesh’in seulalla hienon jauheen poistamiseksi, sen jälkeen siitä poistettiin vesi käyttämällä sintrattua lasisuodatinta, pidättynyt aine pullotettiin ja merkittiin näytteeksi C.

Vielä yhtä 34,5 g:n (k.a.) suuruista GDC^in näy- 35 tettä käsiteltiin 3 kertaa 600 ml:n suuruisella erällä o deionisoitua vettä kulloinkin \ tunnin ajan 90 C:eisessa ________ .. T— ΐ2 82891 vesihauteessa. Saatu tuote pestiin sen jälkeen U.S. pestiin U.S. 60 mesh'in seulalla hienon jauheen poistamiseksi käyttäen noin 24 litraa vettä. GDCjj-tuotteesta poistettiin vesi, tuote pullotettiin ja ^ merkittiin näytteeksi D.

4 GDC-tuotetta punnittiin ja analysoitiin glu-koosi-isomeraasientsvymin adsorptiokyvyn osalta. Tulokset esitetään seuraavassa.

Näyte A B C D

10 GI'n adsorptiokyky 2492 3455 3456 3660 (IGIU/g GDCTI, k.a.) Käsittelystä 90°C:ssa oli tuloksena 45 %:n keskimääräinen suureneminen glukoosi-isomeraasientsyymin ad-sorptiokyvyssä.

15 Esimerkki 3 Tämä esimerkki kuvaa sellaisen rakeisen selluloosan (GC) näytteiden adsorptiokykyä, joka selluloosa on ensiksi muutettu erisuuruisilla DEC-reagenttimääril-la ja sen jälkeen käsitelty vedellä noin 90°C:ssa.

20 Johdannaisen valmistus

Kuuteen 2-litran vetoiseen, nelikaulaiseen muoviastiaan, jotka oli varustettu hämmennyslaitteilla, lämpömittarilla, jossa oli Therm-0-Watch-säädin, lauh-duttimella ja kuumennusvaipalla, pantiin 300 g standar-25 di GC:tä (yhdistettä, joka on saatu käyttämällä polysty- reeniä, CEPO S-100 selluloosaa ja titaanidioksidia täyteaineena; 50 %, 30 % ja 20 % vastaavasti valmistettuna edellä kuvatulla tavalla) sekä 942 ml deionisoitua vettä. Samalla kun seosta hämmennettiin, lisättiin sii-30 hen 300 g kidevedetöntä natriumsulfaattia ja sen jäl keen 82 g 50 %:ista natriumhydroksidiliuosta. Jokaiseen reaktioseokseen, joka oli kuumennettu 40°C:seen, lisättiin Technicon-pumppua käyttäen sellainen määrä 50 ?,:istn dietyyliaminoctyylikloridihydrokloridi (DEC) 35 reagenttia, joka vastasi joko 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, i3 82891 90 tai 100 ?. DEC-reagentin standardimäärästä- 50 %:nen DEC-roaqentti lisättiin 2 tunnin kuluessa.

Reaktioseoksia hämmennettiin 40°C:ssa 30 minuuttia ja sen jälkeen jokaiseen hartsiastiaan lisättiin 5 62 g 50 ?,:ista NaOH ja toinen puoli 50 Piisestä DEC- reagentistä lisättiin 2 tunnin kuluessa.

Reaktioseoksia kuumennettiin 60°C:ssa noin 30 minuutin ajan, sen jälkeen jäähdvtettiin ja pH säädettiin arvoon 5 käyttäen 30 %:ista H2S0^. Seuraavassa 10 on esitetty kullekin tuotteelle käytetyt reaktio-olo suhteet .

50 %:nen DBC-reagentti 50 :nen NaOH (g) % % 15 Lähtöaine fiC ensim- ensim- „ mainen toinen mäincn loinen

Esim. .... . . .. lisavs - vettä -i . i · -· lisavs nro (q) (q) Na?SO^ '_ _______ o (o) Uh 1 942 300 300 82 62 100 117 117 2 942 300 300 82 62 90 105 105 20 3 942 300 300 82 62 80 93,.6 93,6 4 942 300 300 82 62 70 81,9 81,9 5 942 300 300 82 62 60 70,2 70,2 6 942 300 300 82 62 50 58,5 58,5 1 c '.Seulonta ja pesu

Reaktiotuotteet seulottiin U.S. nro 30 mesh'in seulan läpi ja koottiin U.S. nro 60 mesh'in seulalle käyttäen kulloinkin noin 24 litraa suihkuttimesta suihkutettua vettä. Kustakin reaktiosta saatua tuotetta -50 (s.o., U.S. seulasuuruudet nro 30 - nro 60 mesh'iä) hämmennettiin 2000 mltssa vettä ja pestiin U.S. nro 60 mesh'in seulalla käyttäen suihkutinta ja 24 litraa vettä. Kiinteät aineet dispergoitiin uudelleen 2000 ml:an vettä ja pestiin uudelleen U.S. nro 60 mesh'in seulal-35 la käyttäen suihkutinta ja kulloinkin 24 litraa vettä.

i4 82891

Kuudesta reaktiotuotteesta poistettiin vesi sintrattua lasia olevalla suodatinsuppilolla.

Käsittely korkeassa lämpötilassa 1000 ml:n vetoisiin ruostumatonta terästä oleviin 5 astioihin pantiin 50,0 g (k.a.) jokaista tuotetta ja 600 ml deionisoitua vettä. Astiat pantiin 90°C:n lämpöiseen vesihauteeseen ja GDC-lietteitä hämmennettiin 2 tuntia hauteen lämpötilan ollessa 90°C. Kiinteät aineet otettiin talteen suodattamalla kuumana käyttäen 10 karkeasintrattua lasista suodatinsuppiloa, sen jälkeen suspendoitiin 600 ml:an deionisoitua vettä ja hämmennettiin uudelleen 2 tuntia 90°C:eisessa vesihauteessa. Saadut kuumat GDC-lietteet suodatettiin käyttäen karkeasintrattua lasisuodatinsuppiloa, jonka jälkeen 15 kiinteät aineet suspendoitiin uudelleen 600 ml:an deionisoitua vettä ja jälleen hämmennettiin 2 tuntia 90°C:eisessa hauteessa. Suodatuksen jälkeen seulottiin kolmesti käsitellyt GDC-tuotteet U.S. nro 60 mesh'in seulalla käyttäen noin 24 litraa vettä ja 20 suihkutinta. Tuotteista poistettiin vesi ja adsorp-tiokyky glukoosi-isomeraasiin nähden mitattiin. Tulokset esitetään seuraavassa: 50 %:sen DBC-reagentin määrä (%) Näyte nro 100 90 80 70 60 50 25 adsorptiokyky 90°C:ssa 3130 2714 2538 2538 2468 1953 suoritetun käsittelyn jälkeen (IGIU/g GDC, k.a.)

Kuten voidaan odottaa, pienenee adsorptiokyky 30 glukoosi-isomeraasiin nähden DEC-reagentin määrän funktiona. Kuitenkin GDC-tuotteella, joka oli valmistettu käyttäen vain 60 % DEC-reagentin standardimäärästä, oli adsorptiokyky, joka oli ekvivalenttinen GDC:n kanssa, joka oli johdettu käyttäen 100 % standardi DEC-määräs-35 tä, mutta jota ci ollut käsitelty 90°C:ssa. Katso esimerkkiä 2.

i is 82891

Esimerkki 4 Tämä esimerkki kuvaa kasittelylämpötilan vaikutusta GDC:n adsorptiokykyyn.

300 g (k.a.) GDC-j-^in näytettä seulottiin ja 5 pestiin 60 mesh'in seulalla oleellisesti siten kuin esimerkissä 2 on selostettu. Seulotusta GDCrstä poistettiin vesi sintratulla lasisella suodatinsuppilolla ja pidättynyttä ainetta sekoitettiin perusteellisesti. Sekoitetusta GDCj^tsta otettiin näytteet ja suspendoi-j^q tiin deionisoituun veteen (10 ml/g k.a.). Näytteitä hämmennettiin 2 tuntia eri lämpötiloissa, jotka olivat välillä 50-100°C. GDC^-näytteet koottiin sen jälkeen suodattamalla sintrattua lasia olevalla suodatinsuppilolla. Näyte kustakin GDC^-erästä erotettiin analyy-25 siä varten ja jäljellä oleva GDC^ suspendoitiin uudelleen tuoreeseen veteen toista 2 tunnin pituista käsittelyä varten. Toisen käsittelyn jälkeen GDC^-erät koottiin suodattamalla, niistä otettiin näytteet analyysiä varten ja erät suspendoitiin uudelleen ve-2Q teen kolmatta kahden tunnin pituista käsittelyä varten. Kolmannen käsittelyn jälkeen GDC^-erät pestiin kylmällä vedellä 60 mesh'in seulalla, niistä poistettiin vesi suodattamalla ja ne sekoitettiin perusteellisesti. Yksinkertaisesta ja kaksinkertaisesta käsittelystä 25 jäljelle jääneet näytteet seulottiin myöskin, niistä poistettiin vesi ja niitä sekoitettiin.

Jokaisen edellämainitun GDCj^in erän adsorptio-kykv määritettiin glukoosi-isomeraasin kanssa oleellisesti siten kuin esimerkissä 1 on esitetty lukuunotta-3Q matta sitä, että käytettiin monivaiheadsorptioita käyttäen vaihtelevia määriä GDC^ yhdessä vakioisen entsyymimäärän kanssa. Adsorptiokyky laskettiin esittämällä graafisesti adsorboitunut isomeraasi-aktivi-teetti lisätyn GDC^-painomäärän funktiona. Tulokset 35 on luetteloitu seuraavassa taulukossa.

ie 82891 Käsiteltyjen GDC^-erien adsorptiokyvyt 5 Käsittelyläm- Käsittelyjen Adsorptiokykv pötila lukumäärä IGIU/cr k.a. _ °r 1° - o 2550 50 1 2465 2 2762 3 2830 60 1 2489 15 2 2841 3 3303 70 1 2592 2 2756 3 3147 20 80 1 3058 2 2913 3 3460 90 1 2858 2 3491 25 3 3438 L00 1 4876 2 5216 3 5158 Kaikissa tutkituissa lämpötiloissa adsorptio- 30 kykyä paransivat moninkertaiset käsittelyt. Adsorptio- kyky parani käsittelylämpötilaa kohotettaessa, niin että adsorptiokyky oli miltei kaksinkertaistunut kahden tai kolmen 100°C:ssa suoritetun käsittelyn johdosta.

I’ 82891

Esimerkki 5 Tämä esimerkki kuvaa korkeassa lämpötilassa suoritetun käsittelyn vaikutusta GDCj-^n adsorptioky-vyn parantamiseen muuhun proteiiniin kuin glukoosi-5 isomeraasiin nähden.

Sen seikan määrittämiseksi parantaisiko kuuma-vesikäsittely adsorptiokykyä muihin proteiineihin samoin kuin glukoosi-isomeraasiin nähden valmistettiin naudan seerumin albumiinin (BSA) (Sigma, fraktio V) 0,2 %:nen liuos liuottamalla proteiini 10 mM tris-puskuriin, pH 7,0. Tämän liuoksen johtokyky säädettiin arvoon 9000 ^umho lisäämällä natriumkloridia.

Pestyn ja seulotun GDCjjjn näytettä ja sellaisen GDC^m näytettä, jota oli käsitelty 3 kertaa ^5 100°C:ssa esimerkissä 4 kuvatulla tavalla, käytettiin adsorptiokyvyn määrittämiseen BSA:n suhteen. Punnitut määrät kumpaakin GDCjj lietettiin 50 ml:n suuruisiin määriin BSA-liuosta ja hämmennettiin 60 minuuttia. GDCjj.:n annettiin laskeutua painovoiman vaikutuksesta 20 ja näytteet kirkkaasta sakan yläpuolisesta nesteestä otettiin liukoisen BSA-konsentraation määrittämiseksi ultraviolettiabsorption avulla arvolla 280 nm. Adsorp-tiokyky laskettiin liukoisen BSA:n konsentraatiossa ennen GDCjjin lisäystä ja sen jälkeen ilmenneen ero-25 tuksen avulla.

100°C:ssa käsitelty GDCjj adsorboi 19,7 mg BSA/g k.a., kun taas suoritettu käsittely suurensi tällöin adsorptiokykyä naudan seerumin albumiiniin nähden noin 70 %:lla.

30 Esimerkki 6 Tämä esimerkki esittää korkeassa lämpötilassa suoritetun käsittelyn vaikutusta muihin kantaja-aineisiin, joiden tiedetään adsorboivan glukoosi-isome-raasia.

ie 82891

Sen seikan määrittämiseksi onko adsorptio-kyvyssä tapahtuva paraneminen GDC:n kuumavesikäsit-telyn jälkeen isomeraasi-adsorbenttien yleinen ominaisuus, käsiteltiin useita kantaja-aineita, joiden 5 tiedettiin adsorboivan glukoosi-isomeraasia,· kahden tunnin ajan veden kanssa 90°C:ssa. Isomeraasin ad-sorptiokyky määritettiin sen jälkeen käyttäen ei-kä-siteltyä kantaja-ainetta. Tällöin koestettiin kuitumaista DEAE-selluloosaa (Whatman DE-23), makrohuokois-10 ta polystyreeni-kvaternäärinen amiini-hartsia (Amberlite IRA-900, Rohm & Haas) ja makrohuokoista polyfenoli-tertiäärinen amiini-hartsia (Duolite A-568, Diamond Shamrock). 10 g:n suuruiset erät kutakin hartsia liotettiin 100 ml:an deionisoitua o 15 vettä ja hämmennettiin 2 tuntia 90 C:ssa. Hartsit koottiin ja niistä poistettiin vesi sintratuilla lasisuodattimilla ja osia niistä käytettiin isomeraasin adsorptiokyvyn määrittämiseen oleellisesti siten kuin esimerkissä 4 on selostettu. Tällöin ei todet-20 tu mitään eroa käsitellyn ja käsittelemättömän kan taja-aineen isomeraasin adsorptiokyvyn välillä kysymyksen ollessa tuotteista IRA-900, IRA-932 tai Duolite A-568. Adsorptiokyky kysymyksen ollessa tuotteesta Whatman DE-23 pieneni arvosta 3407 IGIU/g 25 kysymyksen ollessa ei käsitellystä kantaja-aineesta arvoon 2429 IGIU/g kysymyksen ollessa käsitellystä kantaja-aineesta. Niinpä kuumavesikäsittely ei paranna minkään muun mainitun ei-GDC-hartsin adsorptio-kykyä.

30 Esimerkki 7 Tämä esimerkki osoittaa, että korkeassa lämpötilassa joko vesijohtoveden tai laimean suolaliuoksen kanssa suoritetut käsittelyt ovat myös tehokkaita parantamaan GDC:n adsorptiokykyä.

35 Deionisoidun veden, vesijohtoveden (johtoky ky 620 ^umho) ja laimean natriumkloridiliuoksen (johtokyky 5000 ^umho) vaikutuksen vertaamiseksi käsi- 19 82891 teltiin GDC II:n näytteitä 3 kertaa 90°C:ssa kullakin liuoksella oleellisesti samalla tavalla kuin esimerkissä 4 on selostettu. Käsitellyn GDC:n adsorptiokapasi-teetti määritettiin glukoosi-isomeraasin kanssa siten 5 kuin esimerkissä 1 on selostettu. Tällöin saatiin seu- raavat tulokset.

Väliaine Adsorptiokyky (IGIU/g k.a.) 10 ei lainkaan 2550 deionisoitu vesi 3438 vesijohtovesi 3170 suolaliuos 4070 Käsittely vesijohtoveden kanssa oli miltei yhtä 15 tehokas kuin käsittely deionisoidun veden kanssa GDC:n adsorptiokyvyn parantamisessa. Laimea suolaliuos (0,05 NaCl) oli tehokkaampaa kuin deionisoitu vesi tai vesijohtovesi.

Esimerkki 8 20 Tämä esimerkki osoittaa johtokyvyn (suolakonsent- raatio) vaikutusta GDC:n käsittelyyn.

Johtokyvyn vaikutuksen määrittämiseksi käsittelyn tehokkuuteen käsiteltiin GDC-412:n näytteitä 3 kertaa 100°C:ssa natriumkloridiliuoksilla, joilla oli erilai-25 nen johtokyky, oleellisesti samalla tavalla kuin esi merkissä 4 on selostettu. Jokaisen käsitellyn GDC:n adsorptiokyky määritettiin glukoosi-isomeraasin kanssa siten kuin esimerkissä 1 on esitetty- Tällöin saatiin seuraavat tulokset.

20 82891

Johtokyky Adsorptiokyky (yumho) (IGIU/g k.a.) 52 4259 1000 4642 5 3000 4260 7000 3980 vertailukohde 2750 (ei käsitelty)

Kaikissa tapauksissa käsittely paransi GDC:n 10 adsorptiokykyä ei-käsiteltyyn vertailukohteeseen ver rattuna. Optimaalinen parannus nähtiin sen jälkeen kun käsittely oli suoritettu suolaliuoksella (<^0.01 N NaCl), jonka johtokyky oli 1000 ^umho.

Claims (14)

21 82891

1. Menetelmä agglomeroidun DEAE-selluloosakomposii-tin valmistamiseksi, joka kykenee adsorboimaan tai sito- 5 maan varautuneita makromolekyylejä, jossa menetelmässä DEAE-selluloosa agglomeroidaan hydrofobisen polymeerin kanssa rakeisen komposiitin muodostamiseksi, tunnet-n e t t u siitä, että rakeista DEAE-selluloosaa käsitellään vesipitoisen väliaineen kanssa kohotetussa lämpöti- 10 lassa ja riittävän pitkän ajan komposiitin adsorptio- tai sitomiskyvyn parantamiseksi.

2. Menetelmä rakeisen DEAE-selluloosakomposiitin adsorptio- tai sitomiskyvyn parantamiseksi varautuneisiin makromolekyyleihin nähden, tunnettu siitä, että 15 a) agglomeroidaan selluloosa hydrofobisen polymee rin kanssa rakeisen komposiitin muodostamiseksi, b) agglomeroitu selluloosa saatetaan reagoimaan muuttamiskykyisen aineen kansa ioninvaihto-ominaisuuksien tuottamiseksi komposiitille, jolloin ainakin osa saadusta 20 selluloosajohdannaisesta on vapaana adsorboimaan varautu neita makromolekyylejä, c) pysytetään muunneltu komposiitti rakeisessa muodossa, ja d) käsitellään rakeista muunneltua komposiittia 25 vesipitoisen väliaineen kanssa kohotetussa lämpötilassa riittävän pitkän ajan mainitun muutetun komposiitin makromolekyylejä adsorboivan kyvyn parantamiseksi.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu muuttamiskykyinen 30 aine on dietyyliaminoetyylikloridi.

4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu hydrofobinen polymeeri on polystyreeni.

5. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, 35 tunnettu siitä, että mainitussa komposiitissa on _______ - T— 22 82891 läsnä tiivistävää ainetta.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu tiivistävä aine on valitty ryhmästä, johon kuuluvat jauhemaiset metalliok- 5 sidit, metallisilikaatit ja näiden seokset.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu tiivistävä aine on alumiinioksidi tai titaanidioksidi.

8. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että käsittelylämpötila on välillä n. 50°C - n. 100°C.

9. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käsittelyaika on n. ½ tuntia - 3 tuntia.

10. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu vesipitoinen väliaine on valittu ryhmästä, johon kuuluvat vesijohtovesi, deionoitu vesi ja laimea suolaliuos.

11. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että mainittu käsittely toistetaan n. 3 kertaa tai useammin.

12. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu makromolekyyli on proteiini.

13. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu proteiini on entsyymi .

14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu entsyymi on glu-30 koosi-isomeraasi. 23 82891