FI60576C - Foerfarande foer framstaellning av lysozym - Google Patents

Description

iMfl'P’»! [el m,KUULUTUSJULKAISU ,λγπ,

Ma m 11 utlAggningsskrift cU5/6 C (45) Patentti ayönnetty 27 12 1982 . ligSÄfj Patent meddelat ' ^ (51) Kv.lk.3/lnt.ci.3 C 12 N 9/56 3 U O M IM FINLAND (21) Pitunttlh»k«mu* — Patuntansekning 782131 (22) Hakemlipilvi — Ansäkningidag 0^ · 07 · 7 8 * ' (23) Alkupttvl—GUtlghetsdag 0^.07.78 (41) Tulkit luikituksi — Bllvit offentilj 05.01.79

Patentti· ja rekisterihallitus .... .......

_ . . . . (44) Nifctivilcslpanon j» kuul.]ulkaltun pvm. — „

Patent- och registerstyrelsen Antökan utlagd och utl.akrlft«n publkerad 30.10.8l (32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus— Baglrd prioritet 0U .07.77

Iso-Britannia-Storbritannien(GB) 2785^/77 Toteennäytetty-Styrkt (71)(7?) Lorenzo Ferrari, 8, Via Biella, 201^3 Milano,

Carlo Trinchera, UU, Via Tito Vignoli, 201^*6 Milano,

Italia-Italien(IT) (7^) Oy Borenius & Co Ab (5U) Menetelmä lysotsyymin valmistamiseksi - Förfarande för fram-ställning av lysozym

Keksinnön kohteena on uusi ja entistä parempi menetelmä lysotsyymin ja sen myrkyttömien ja fysiologisesti siedettävien happojen kanssa muodostettujen suolojen valmistamiseksi munanvalkuaisesta, jolloin heikosti hapan ioninvaihtohartsi saatetaan kosketukseen munanvalkuaisen kanssa, jonka jälkeen lysotsyymi eluoidaan hartsista suolan vesi-liuoksella ja lysotsyymi eristetään eluaatista.

Ennen kuin lysotsyymiä alettiin käyttää lääkehoidossa noin parikymmentä vuotta sitten, eristi Fleming vuonna 1922 lysotsyymiä (EC 3.2.1.17), joka on bakteereita vastustava ja immunoivasti vaikuttava entsyymi, jota aikaisemmin käytettiin rajoitetuin määrin bakteorologisissa laboratorioissa esim. bakteerien soluseinämien rakenteiden ja komponenttien tutkimiseksi. Tulehduksien ja infektioiden hoidossa saavutettujen edullisten kliinisten tulosten ansiosta, ja myöhemmin sen perusteella, että lysotsyymiä on käytetty ruoka-aineissa säilöntäaineena ja homehtu-misen estoaineena, on puhtaan lysotsyymin kysyntä suuresti lisääntynyt, ja on patentoitu lukuisia teollisuusmenetelmiä lysotsyymin valmistamiseksi.

Lysotsyymi on entsyymi, joka voidaan paremmin määritellä N-asetyyli- 2 60576 muramido-glykaano-hydrolaasiksi. Se on luonteeltaan emäksistä, ja sen molekyylipaino on noin 15.000. Se on kohtuullisen stabiilia happamessa väliaineessa, mutta vähemmän stabiilia emäksisessä väliaineessa. Se vaikuttaa erittäin tehokkaasti gram-positiivisia bakteereita vastaan, joista se vapauttaa aineita, jotka voidaan määrittää amino-sokeri-reagenssien avulla.

Jolles (Exp. Ann. Bioch. Med., 27th Series, sivu 1, julk. Masson,

Paris, 1966) on erikoisesti tutkinut sen perusrakennetta emäksisenä polypeptidinä, joka on muodostettu 129 aminohappotähteestä.

Hakijan GB-patenttijulkaisussa no 1.110.466 on selitetty menetelmä lysotsyymin valmistamiseksi munanvalkuaisesta, jolloin munanvalkuainen saatetaan kosketukseen lievästi happamen ioninvaihtohartsin kanssa pH-arvossa 6...7 ja huoneenlämpöä alemmassa lämpötilassa, minkä jälkeen hartsi erotetaan, epäpuhtauksina olevat proteiinit eluoidaan hartsista suolaliuoksella, jonka konsentraatio on enintään 0,2 M ja pH-arvo on enintään 7, minkä jälkeen lysotsyymi eluoidaan suolan vesiliuoksella ja saostetaan eluaatista suurentamalla liuoksen suolakonsentraatiota.

Keksinnön ansiosta saadaan uusi, entistä parempi menetelmä lysotsyymin valmistamiseksi, edullisesti munanvalkuaisesta, mutta myös muista lysotsyymiä sisältävistä lähtömateriaaleista, jotka voivat olla peräisin kasvi- tai eläinkunnasta.

Keksinnön mukaisen menetelmän ansiosta, joka menetelmä perustuu lysotsyymin uuttamiseen munanvalkuaisesta tai muusta lysotsyymipitoisesta materiaalista heikosti kationisten hartsien avulla erikoisissa koeolosuhteissa, saavutetaan etuja verrattuna nykyään tunnettuihin menetelmiin: Käytetty munanvalkuainen ei kontaminoidu vierailla aineilla eikä sen luonnollinen emäksinen pH-arvo noin 9 muutu, minkä lisäksi uut-tamisaika on lyhyt niin, että munanvalkuaisen fysikaaliset ominaisuudet, esim. sen sitovat ja nostattavat ominaisuudet eivät huonone niin, että sitä voidaan käyttää elintarvikkeisiin samalla tavoin kuin alkuperäinen munanvalkuainenkin, joten sen kaupallinen arvo pysyy käytännöllisesti katsoen muuttumattomana, yksinkertainen käsittelytapa ja lyhyet käsittelyajat pienentävät valmistuskustannuksia, 3 60576 lopuksi saadaan eri käsittelyvaiheissa poistetuiksi kaikki sellaiset aineet, joiden läsnäolo viemärivedessä voisi aiheuttaa vakavia saastumisongelmia. Keksinnön mukaista menetelmää käytäntöön sovellettaessa käytetään ainoastaan natriumkloridia ja natriumhydroksidia, joiden liuoksia voidaan käyttää uudelleen peräkkäisissä valmistus-jaksoissa. Natriumkloridin väistämättömät mutta pienet häviöt (jotka osittain johtuvat natriumhydroksidin neutraloinnista kloori-vetyhapon avulla) voidaan huoletta poistaa.

Keksinnön mukaan saadaan näin ollen lysotsyymin valmistamiseksi menetelmä, jolle on tunnusomaista se, että ioninvaihtohartsina käytetään karboksyylihapporyhmiä sisältävää metakryylihartsia, jonka pH ensin säädetään arvoon, joka on suurempi kuin 7,1 ja edullisesti 8 ja 9,5:n välillä, hartsi pestään vedellä ja saatetaan kosketukseen munanvalkuaisen kanssa lämpötilassa 10...15 °C, minkä jälkeen adsorboitunut lysot-syymi eluoidaan hartsista epäorgaanisen suolan vesiliuoksella, edullisesti joko ammoniumsulfaatin 6...10 painoprosenttisella vesiliuoksella tai natriumkloridin 1,5...3 painoprosenttisella vesiliuoksella, ja että lysotsyymi tämän jälkeen erotetaan saostamalla mainitun epäorgaanisen suolan avulla eluaatista, joka mahdollisesti on konsentroitu ultra-suodattamalla, tai ultrasuodattamalla konsentroitu eluaatti, ja sumutusta! pak-astekuivaamalla, ja että saatu lysotsyymi haluttaessa muutetaan suolaksi myrkyttömän ja fysiologisesti siedettävän hapon kanssa.

Hartsin pH voidaan säätää esimerkiksi natriumhydroksidin 30%:isella vesiliuoksella tai kaiiumhydroksidin tai ammoniumhydroksidin vesi-liuoksilla, joiden konsentraatiot eivät ole kriittisiä.

Käyttämällä tasapainoitettua hartsia, jonka pH-arvo on emäksisellä puolella, saavutetaan edellä mainittujen etujen lisäksi kaksi etua, joita ei ole tähän asti saavutettu muissa teollisuusmenetelmissä: a)

Ensi sijassa mainittakoon, että munanvalkuaisen ja hartsiseoksen pH arvo on noin 9, toisin sanoen likimain munanvalkuaisen normaali pH-arvo, mikä vähentää bakteerien tai sienien aiheuttamaa saastumis-vaaraa munanvalkuaisen käsittelyn aikana. Lisäksi keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetty emäksinen liuos lisää lysotsyymin adsorptio- 60576 nopeutta hartsiin siten, että tämän vaiheen käsittelyaika lyhenee huomattavasti, mikä vastaavasti pienentää valmistuskustannuksia. Näin ollen menetelmä voidaan toteuttaa likimain huoneenlämmössä (10...15 °C), mikä on taloudellisesti eduksi, ja munanvalkuaista, jonka ominaisuuksia ja bakteeripitoisuutta ei ole sanottavasti muutettu, voidaan sen lysotsyymisisällön tultua poistetuksi, käyttää muihin tarkoituksiin, (b)

Toinen etu, joka saavutetaan sen ansiosta, että lysotsyymin adsorptio suoritetaan pH-rajoissa 8...9 on, että kosketusjakson kuluttua, kun munanvalkuainen on poistettu ja hartsi on pesty vedellä munanvalkuaisen viimeisten tähteiden poistamiseksi siitä, ei hartsia tarvitse pestä suolaliuoksella proteiiniaineiden poistamiseksi, koska adsorption selektiivisyys on erittäin suuri.

Lysotsyymi voidaan eluoida epäorgaanisen suolan vesiliuoksella, jolloin voidaan käyttää esim. natriumnitraattia, kaliumnitraattia, natrium-kloridia, kaliumkloridia, natriumsulfaattia, kaliumsulfaattia, tai ammoniumsulfaattia, mutta eluointi voidaan myös suorittaa orgaanisten suolojen, esim. natriumasetaatin, etanoliamiinihydrokloridin tai pyridiinihydrokloridin avulla.

Erittäin hyviä tuloksia on saavutettu ammoniumsulfaatin 6...10 paino-% vesiliuoksilla ja natriumkloridin 1,5...3 paino-% vesiliuoksilla.

Lysotsyymi voidaan erottaa eluaatista seuraavien menetelmien avulla: a. entsyymi saostetaan lisäämällä suolaa eluoituihin liuoksiin, b. ultrasuodatetaan eluaatti, minkä jälkeen konsentraattiin lisätään suolaa entsyymin saostamiseksi, c. konsentroidaan ultrasuodattamalla, minkä jälkeen sumutuskuivataan tai lyofiloidaan liuos.

Konsentroiminen ultrasuodattamalla voidaan suorittaa seuraavan kaavan mukaan; 5 60576 100 litran eluointi (1% lysotsyymiä ! (3% natriumkloridia ultrasuodatus ! \k 40 litraa (2,5% lysotsyymiä (3% natriumkloridia laimennus 30 litralla vettä

V

7 0 litraa (1 ,4-5% lysotsyymiä (1,7% natriumkloridia

V

ultrasuodatus 15 litraa (6,65% lysotsyymiä ! (1,7% natriumkloridia i + natriumkloridia ^ lysotsyymiä

Keksinnön mukaisen menetelmän avulla saatua lysotsyymiä voidaan käyttää ilman muuta käsittelyä lääkinnässä ja ruoka-aineissa, mutta lysotsyymi voidaan myös haluttaessa muuttaa suolaksi myrkyttömän ja fysiologisesti siedettävän epäorgaanisen tai orgaanisen hapon avulla.

Seuraavat esimerkit havainnollistavat keksintöä.

Esimerkki 1

Suspendoidaan noin 60 litraan vettä 11 litraa metakryylihartsia, joka on karboksyylihapporyhmiä sisältävää tyyppiä ja jossa karboksyyli-ryhmät ovat vapaina ("Amberlite IRC 50"). Lisätään hitaasti sekoittaen natriumhydroksidin 20% vesiliuosta, kunnes suspension pH-arvo on 8. Neste poistetaan dekantoimalla ja hartsi pestään toistuvasti dekantoi-malla demineraloitua vettä käyttäen. Veden tultua poistetuksi hartsi saatetaan kosketukseen munanvalkuaisen kanssa (66 kg) noin 10 °C:ssa, kunnes munanvalkuaisen lysotsyymipitoisuus on noin 300 γ/ml. Tämän 6 60576 jälkeen hartsi pestään vedellä ja eluoidaan sitten natriumkloridin 3% vesiliuoksella, jolloin saadaan noin 25 litraa eluaattia, jossa on 240...260 g lysotsyymiä. Liuos konsentroidaan ultrasuodattamalla (DDS-kalvo, tyyppiä 600) 10 litran tilavuuteen. Laimennetaan 7,5 litralla vettä, minkä jälkeen jälleen konsentroidaan noin 3,8 litran tilavuuteen ja suodatetaan. pH säädetään arvoon 3,5 lisäämällä suolahappoa, jonka jälkeen lisätään noin 85 g natriumkloridia. Jäähdytetään, sentrifugoidaan ja kuivataan, jolloin saadaan 240...250 g lysotsyymiä, jonka puhtaus on 94...96%.

Esimerkki 2

Toistetaan esimerkin 1 mukainen menetelmä paitsi, että hartsin pH tasapainotetaan arvoon 9. Eluoinnin jälkeen eluaatin pH säädetään arvoon 9,5, ja lisätään natriumkloridia, kunnes tämän konsentraatio on 5%. Reaktioseoksen jäähdyttyä erottuu 240...245 g lysotsyymiä, puhtaus > 94%.

Esimerkki 3

Toistetaan esimerkin 1 mukainen menetelmä. Ultrasuodatuksen jälkeen saadun konsentroidun liuoksen pH säädetään arvoon 3,3 kloorivety-hapon avulla, minkä jälkeen suihkukuivataan. Täten saadun lysotsyymi-hydrokloridin puhtaus on > 94%.

Esimerkki 4

Toistetaan esimerkin 1 mukainen menetelmä. Sen jälkeen kun lysotsyymi on adsorboitunut ja hartsi on pesty vedellä, eluoidaan lysotsyymi ammoniumsulfaatin 8% vesiliuoksella. Ammoniumsulfaatin konsentraatio lisätään tämän jälkeen arvoon 40% lysotsyymin saostamiseksi. Lysot-syymihydrokloridin saamiseksi ja kaikkien epäpuhtauksien poistamiseksi sakka liuotetaan suodatettuun veteen, pH säädetään arvoon 3,3 kloori-vetyhapon avulla ja lysotsyymi saostetaan lisäämällä natriumkloridin vesiliuosta.

Esimerkki 5

Kuuden litran pulloon lisätään 1110 ml hapanta metakryylihartsia, joka on karboksyyliryhmiä sisältävää tyyppiä ("Amberlite IRC 50") ja lisätään hitaasti tiputtaen natriumhydroksidin 30% vesiliuosta sekoittaen, 7 60576 kunnes suspension pH-arvo = 8. Tämän jälkeen sekoittaminen keskeytetään, neste poistetaan dekantoimalla ja hartsi suodatetaan Buchner-suppilon läpi ja pestään moneen kertaan demineraloidulla vedellä.

Tämän jälkeen hartsi saatetaan kosketukseen munanvalkuaisen kanssa (6,6 kg) noin huoneenlämmössä (noin 15 °C), kunnes munanvalkuaisen lysotsyymipitoisuus on 100...200 γ/ml. Tämän jälkeen hartsi pestään vedellä, ja lysotsyymi eluoidaan natriumkloridin 3% vesiliuoksella. Eluaatin pH säädetään arvoon noin 9,5...9,8, ja puhdas emäksinen lysotsyymi saostetaan lisäämällä natriumkloridin konsentraatio arvoon 5%.

Esimerkki 6

Toistetaan esimerkin 5 mukainen menetelmä paitsi, että hartsin pH säädetään arvoon 9 natriumhydroksidin vesiliuoksella. Hartsi eluoidaan natriumkloridin 2,5% vesiliuoksella, jolloin saadaan 1900...2100 ml eluaattia, jossa on 1,4...1,5% lysotsyymiä. Tämän jälkeen liuos ultrasuodatetaan (DDS-kalvo, tyyppiä 600), kunnes tilavuus on supistunut 800 ml:aan, jolloin liuos laimennetaan 600 ml:11a vettä ja konsentroidaan ultrasuodattamalla toisen kerran, kunnes tilavuus on 300 ml. Konsentroinnin aikana samentunut liuos suodatetaan, pH säädetään arvoon 3,5 kloorivetyhapolla, ja lisätään 6 g natriumkloridia. Jäähdytettäessä saostuu 24,5...25,5 g lysotsyymihydrokloridia, puhtaus 95...97%.

Esimerkki 7

Eluoinnin päätyttyä esimerkissä 6 käytetty hartsi pestään demineraloidulla vedellä, kunnes klorideja ei enää voida todeta. Tämän jälkeen hartsi saatetaan kosketukseen munanvalkuaisen kanssa (6,6 kg), minkä jälkeen toistetaan esimerkissä 5 selitetty käsittely. Eluaatin pH säädetään arvoon 3,5 kloorivetyhapolla, ja lisätään natriumkloridia, kunnes sen konsentraatio on 5%. Reaktioseoksen annetaan olla jonkin aikaa jääkaapissa, jolloin erottuu 24 g lysotsyymihydrokloridia.

Claims (1)

1. 60576 8 Patenttivaatimus Menetelmä lysotsyymin tai sen myrkyttömän ja fysiologisesti siedettävän hapen kanssa muodostetun suolan valmistamiseksi munanvalkuaisesta, jolloin heikosti hapan ioninvaihtohartsi saatetaan kosketukseen munanvalkuaisen kanssa, jonka jälkeen lysotsyymi eluoidaan hartsista suolan vesiliuoksella ja lysotsyymi eristetään eluaatista, tunnettu siitä, että ioninvaihtohartsina käytetään karboksyylihapporyhmiä sisältävää metakryylihartsia, jonka pH ensin säädetään arvoon, joka on suurempi kuin 7,1 ja edullisesti 8 ja 9,5 välillä, hartsi pestään vedellä ja saatetaan kosketukseen munanvalkuaisen kanssa lämpötilassa 10.. .15 °C, minkä jälkeen adsorboitunut lysotsyymi eluoidaan hartsista epäorgaanisen suolan vesiliuoksella, edullisesti joko ammoniumsulfaatin 6.. .10 painoprosenttisella vesiliuoksella tai natriumkloridin 1,5...3 painoprosenttisella vesiliuoksella, ja että lysotsyymi tämän jälkeen erotetaan saostamalla mainitun epäorgaanisen suolan avulla eluaatista, joka mahdollisesti on konsentroitu ultrasuodattamalla, tai ultrasuodat-tamalla konsentroitu eluaatti ja sumutus- tai pakastekuivaamalla, ja että saatu lysotsyymi haluttaessa muutetaan suolaksi myrkyttömän ja fysiologisesti siedettävän hapon avulla. Förfarande för framställning av lysozym eller ett sait därav med en icke-giftig ooh fysiologiskt kompatibel syra ur äggvita, varvid ett svagt surt jonbytarharts bringas i kontakt med äggvita, varefter lyso-zymet elueras frän hartset med en vattenlösning av ett sait ooh lyso-zymet isoleras ur eluatet, kännetecknat av att jonbytar-hartset utgörs av ett metakrylharts, som innehäller karboxylsyragrupper, att hartsets pH först regleras tili högre än 7,1, företrädesvis tili mellan 8 ooh 9,5, det tvättas med vatten och bringas i kontakt med äggvita i en temperatur om 10...15 °C, varefter det adsorberade lysozymet elueras frän hartset med en vattenlösning av ett oorganiskt sait, företrädesvis med antingen en 6...10 viktprocentig vattenlösning av ammoniumsulfat eller med en 1,5...3 viktprocentig vattenlösning av natriumklorid och att lysozymet därefter avskiljs genom utfällning frän eluatet medelst nämnda oorganiska sait, vilket eluat eventuellt kon-centrerats genom ultrafiltrering eller medelst ultrafiltrering av det koncentrerade eluatet och spraytorkning eller lyofilisering, varefter det erhällna lysozymet, om sä önskas, omvandlas till sait med icke-giftig och fysiologiskt kompatibel syra.