ES2973215T3

ES2973215T3 - Agente terapéutico para la esclerosis lateral amiotrófica y composición para el tratamiento

Info

Publication number: ES2973215T3
Application number: ES17846481T
Authority: ES
Inventors: Hideyuki Okano; Koki FUJIMORI; Hironobu Okuno
Original assignee: Keio University
Current assignee: Keio University
Priority date: 2016-09-02
Filing date: 2017-08-29
Publication date: 2024-06-19
Anticipated expiration: 2037-08-29
Also published as: PL3508202T3; JPWO2018043476A1; EP3508202B1; JP2022059650A; RS65277B1; HUE066272T2; WO2018043476A1; EP3508202A1; CA3038623C; JP7285599B2; CN109843290A; EP3508202A4; US20210113525A1; PT3508202T; DK3508202T3; CA3038623A1

Abstract

Se proporciona un agente terapéutico para la esclerosis lateral amiotrófica, que comprende: un compuesto representado por la fórmula (1) (en la fórmula (1), R1 representa cada uno independientemente un grupo alquilo que contiene de 1 a 6 átomos de carbono o un grupo 4-hidroxifenetilo, y n representa un número entero de 1-3); una sal farmacológicamente aceptable del mismo; o un solvato del compuesto y la sal, como ingrediente eficaz. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Agente terapéutico para la esclerosis lateral amiotrófica y composición para el tratamiento

Campo técnico

La presente invención se refiere a un agente terapéutico y a una composición que comprende dicho agente para su uso en el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica (ALS) esporádica, o ALS familiar que tiene una mutación en el gen de FUS o el gen de la proteína de unión al ADN TAR de 43 kDa (TDP-43). Se reivindica la prioridad en la solicitud de patente japonesa número 2016-172255, presentado en Japón el 2 de septiembre de 2016.

Antecedentes de la técnica

La ALS es una enfermedad neurodegenerativa que causa atrofia muscular severa y debilidad muscular y es un tipo de enfermedad de la neurona motora. En la ALS, se observan lesiones específicas de las neuronas motoras y la enfermedad progresa muy rápidamente con un tiempo promedio de supervivencia después del inicio de varios años. No existe un tratamiento efectivo para la ALS, y se desea desarrollar un agente terapéutico lo antes posible. Aunque la mayoría de los casos de ALS son esporádicos, el 10 % de los pacientes tienen ALS familiar y existen claros factores genéticos implicados.

Se ha usado un ratón mutante conocido como ratón wobbler como modelo de ALS, ya que el ratón exhibe atrofia muscular de las extremidades anteriores y de los músculos faciales a medida que crece y eventualmente exhibe atrofia muscular de las extremidades traseras (consulte, por ejemplo, NPL 1). Sin embargo, se conoce que la mutación wobbler no se observa en pacientes con ALS.

Además, el SOD1 es conocido como uno de los principales genes causantes de la ALS familiar, y un ratón transgénico en el que se ha introducido el mutante SOD1 (NPL 2) se usa en la investigación de descubrimiento de fármacos, pero aún se encuentra por desarrollar un fármaco que exhiba efectos terapéuticos claros en la práctica clínica. Más bien, los fármacos seleccionados mediante el uso del modelo SOD1-ALS no exhiben utilidad en pacientes reales con ALS en la mayoría de los casos, y actualmente existe la preocupación de que el modelo SOD1-ALS pueda no ser un modelo funcional debido a una desconexión entre el modelo SOD1-ALS y práctica clínica real. El documento WO 2012/048330 proporciona un método para tratar una enfermedad de la neurona motora en un paciente humano que comprende administrar a dicho paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente que regula corriente arriba la expresión del gen IGF-II.

Por tanto, no existía un buen modelo de ALS en la técnica relacionada. Ésta podría ser una razón por la que el desarrollo de agentes terapéuticos para la ALS no progresa.

Sin limitarse a la ALS, existen enfermedades intratables para las que no existe un modelo efectivo de enfermedad. En los últimos años, se esperaba ampliamente que la investigación de enfermedades mediante el uso de células iPS produjera modelos de enfermedades intratables.

Lista de citas

Literatura no relacionada con patentes

[NPL 1] Moser J. M., y otros, The wobbler mouse, an ALS animal model., Mol. Genet. Genomics., 288 (5-6), 207 229, 2013.

[NPL 2] Julien J. P., Kriz J., Transgenic mouse models of amyotrophic lateral sclerosis, Biochimica et Biophysica Acta, 1762(11-12), 1013-1024, 2006.

Resumen de la invención

La presente invención se define por las reivindicaciones. Cualquier materia que quede fuera del alcance de las reivindicaciones se proporciona únicamente para información.

Problema técnico

Un objetivo de la presente invención es proporcionar un agente terapéutico y una composición que comprende dicho agente para su uso en el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica (ALS) esporádica, o ALS familiar que tiene una mutación en el gen de FUS o el gen de la proteína de unión al ADN TAR de 43 kDa (TDP-43).

Solución al problema

No es exagerado decir que las células iPS específicas de la enfermedad son el único medio para reproducir in vitro los fenómenos que ocurren in vivo en los pacientes, especialmente en el sistema nervioso. Mediante el uso de células iPS específicas de la enfermedad hace posible producir modelos de enfermedad más precisos que con las células cultivadas y ratones modelo de enfermedad existentes. En particular, con respecto a las enfermedades del sistema nervioso central, mediante el uso de neuronas diferenciadas de las células iPS específicas de la enfermedad del sistema nervioso central hace posible seleccionar candidatos a fármacos terapéuticos efectivos con alta precisión, no sólo aclarando el mecanismo de la enfermedad sino también haciendo a las neuronas un modelo de enfermedad más preciso/modelo de evaluación de eficacia.

Como se describirá más abajo en los Ejemplos, los presentes inventores indujeron células iPS derivadas de pacientes con ALS para que se diferenciaran en neuronas motoras y administraron un agente terapéutico para la ALS, que se describirá más abajo, a neuronas motoras que reflejan la enfermedad de ALS, para aclarar que la enfermedad de ALS mejoró en las neuronas motoras. En consecuencia, es posible tratar la ALS con el agente terapéutico para ALS que se describirá más abajo.

Además, la mayoría de los pacientes con ALS tienen ALS esporádica y, como se describe más abajo en los Ejemplos, los inventores encontraron que el agente terapéutico para la ALS que se describirá más abajo mejora la enfermedad tanto para las neuronas motoras que reflejan la enfermedad de ALS familiar como para las neuronas motoras que reflejan la enfermedad de ALS esporádica. En consecuencia, el agente terapéutico para la ALS que se describe más abajo tiene un efecto terapéutico tanto en ALS familiar como en ALS esporádica.

Dado que el agente terapéutico para la ALS que se describirá más abajo es un compuesto obtenido al establecer un fenotipo encontrado a partir del análisis mediante el uso de un modelo de enfermedad mediante el uso de células iPS derivadas de pacientes como un modelo de evaluación y cribado mediante el uso de una enfermedad expresada en un período de transición cuando el fenotipo de la enfermedad es observa como un indicador, más que en una etapa tardía cercana a la muerte celular, el efecto terapéutico de la ALS es alto.

La presente invención incluye los siguientes aspectos.

[1] Un agente terapéutico para su uso en el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica (ALS) esporádica o a Ls familiar que tiene una mutación en el gen de FUS o en el gen de la proteína de unión al a Dn Ta R de 43 kDa (TDP-43), que incluye un compuesto representado por la Fórmula (1), una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o un solvato del mismo, como ingrediente efectivo

[en la Fórmula (1), R1 cada uno representa independientemente un grupo alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono o un grupo 4-hidroxifenetilo, y n representa un número entero de 1 a 3].

[2] El agente terapéutico para la ALS de acuerdo con [1], en donde n en la Fórmula (1) es 2.

[3] El agente terapéutico para la ALS de acuerdo con [1] o [2], en donde R1 en la Fórmula (1) es un grupo npropilo.

[4] El agente terapéutico para la ALS de acuerdo con cualquiera de [1] a [3], en el que el compuesto representado por la Fórmula (1) es 4-[2-(dipropilamino)etil]-1,3-dihidro-2H-indol-2-uno.

[5] El agente terapéutico para ALS de acuerdo con cualquiera de [1] a [4], en el que la sal farmacéuticamente aceptable del compuesto representado por la Fórmula (1) es clorhidrato de 4-[2-(dipropilamino)etil]-1,3-dihidro-2H-indol-2-ona.

[6] El agente terapéutico para la ALS de acuerdo con cualquiera de [1] a [5], que tiene un efecto terapéutico tanto en la ALS familiar como en la ALS esporádica.

[7] Una composición para el tratamiento de ALS que incluye el agente terapéutico para ALS de acuerdo con cualquiera de [1] a [5] y un portador farmacéuticamente aceptable. Efectos ventajosos de la invención

De acuerdo con la presente invención, es posible proporcionar un agente terapéutico y una composición que comprende dicho agente para su uso en el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica (ALS) esporádica, o de la ALS familiar que tiene una mutación en el gen de FUS o en el gen de la proteína de unión al ADN TAR 43 kDa (TDP-43).

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 es un gráfico que muestra los resultados de los cambios de medición a lo largo del tiempo en la longitud de las neuritas de las neuronas motoras en el Ejemplo I-2.

La Figura 2 es un gráfico que muestra una relación de neuronas positivas para caspasa 3 CV en cada neurona motora medida en el Ejemplo 1-3.

La Figura 3 es un gráfico que muestra una relación de fuga de LDH en cada neurona motora medida en el Ejemplo I-4.

La Figura 4 es un gráfico que muestra los resultados de la medición de la relación de neuronas motoras en las que se observó la localización de la proteína FUS en el citoplasma en el Ejemplo 1-5.

La Figura 5 es un gráfico que muestra los resultados de la medición del número de inclusiones de proteína TDP-43 fosforilada por neurona motora en el Ejemplo 1-6.

La Figura 6 es un gráfico que muestra el número de gránulos de estrés por neurona motora medidos en el Ejemplo I-7.

La Figura 7 es un gráfico que muestra cambios a lo largo del tiempo en la relación de fuga de LDH en cada neurona motora medida en el Ejemplo II-3.

La Figura 8 es un gráfico que muestra cambios a lo largo del tiempo en la relación de neuronas positivas para caspasa 3 CV en cada neurona motora medida en el Ejemplo II-4.

La Figura 9 es un gráfico que muestra cambios a lo largo del tiempo en el número de gránulos de estrés por neurona motora medidos en el Ejemplo II-5.

La Figura 10 es un gráfico que muestra la longitud de las neuritas de cada neurona motora medida en el Ejemplo 111-1.

La Figura 11 es un gráfico que muestra la relación de neuronas positivas para caspasa 3 CV medida en el Ejemplo III-2.

La Figura 12 es un gráfico que muestra la relación de fuga de LDH de cada neurona motora medida en el Ejemplo III-3.

La Figura 13 es un gráfico que muestra el número de gránulos de estrés de cada neurona motora medidos en el Ejemplo III-4.

La Figura 14(a) es un gráfico que muestra cambios a lo largo del tiempo en la longitud de las neuritas de cada neurona motora medida en el Ejemplo I-9. La Figura 14(b) es un gráfico que amplía la porción encuadrada del gráfico de la Figura 14(a). La Figura 14(c) es un gráfico que muestra la longitud de las neuritas de cada neurona motora en los días 50 y 62 a partir de la inducción de la diferenciación, medida en el Ejemplo I-9.

La Figura 15 es un gráfico que muestra la relación de neuronas positivas para caspasa 3 CV en cada neurona motora medida en el Ejemplo III-5.

Descripción de las modalidades

Agente terapéutico para la ALS

La presente invención proporciona un agente terapéutico para su uso en el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica (ALS) esporádica, o ALS familiar que tiene una mutación en el gen de FUS o el gen de la proteína de unión al ADN tAr de 43 kDa (TDP-43), que contiene un compuesto representado por la Fórmula (1), una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o un solvato del mismo, como un ingrediente efectivo.

[En la Fórmula (1), R1 cada uno representa independientemente un grupo alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono o un grupo 4-hidroxifenetilo, y n representa un número entero de 1 a 3.]

El agente terapéutico de la presente invención para su uso en el tratamiento de la ALS familiar que tiene una mutación en el gen de FUS o en el gen de la proteína de unión al ADN TAR de 43 kDa (TDP-43). Además, como se describe más abajo en los Ejemplos, el agente terapéutico también tiene un efecto terapéutico sobre la ALS esporádica.

En el agente terapéutico para la ALS de la presente modalidad, n en la Fórmula (1) puede ser 1,2 o 3.

Además, en la Fórmula (1), R1 puede ser un grupo alquilo lineal, ramificado o cíclico que tiene de 1 a 6 átomos de carbono y ejemplos más específicos del mismo que incluyen un grupo metilo, un grupo etilo, un grupo n-propilo, un grupo isopropilo, un grupo n-butilo, un grupo isobutilo, un grupo sec-butilo, un grupo terc-butilo, un grupo ciclobutilo, un grupo n-pentilo, un grupo ciclopentilo, un grupo n-hexilo, un grupo ciclohexilo, y similares.

En el agente terapéutico para la ALS de la presente modalidad, el compuesto representado por la Fórmula (1) puede ser 4-[2-(dipropilamino)etil]-1,3-dihidro-2H-indol-2-ona. Es decir, el compuesto representado por la Fórmula (1) puede ser ropinirol. La fórmula química del ropinirol se muestra en la Fórmula (2).

El ropinirol se desarrolló como un fárma

agonista del receptor D2 de dopamina en las neuronas de dopamina. Por esta razón, ya se han completado los ensayos clínicos del mismo y se ha confirmado suficientemente la seguridad en caso de administración a cuerpos vivos. Dado que el ropinirol es un fármaco existente cuyo mecanismo de acción está claro, es posible desarrollar rápidamente un agente terapéutico para la ALS al ampliar su aplicación.

La ALS es una enfermedad causada por un trastorno de la neurona motora. Un hallazgo sorprendente fue que los compuestos que son agonistas del receptor D2 mostrarían un efecto terapéutico en enfermedades degenerativas de las neuronas motoras sin receptores D2. También es posible anticipar el hallazgo de pistas con respecto al mecanismo de la enfermedad de ALS y una aclaración completa de la enfermedad de ALS a partir del análisis del mecanismo de acción del ropinirol.

El agente terapéutico para la ALS de la presente modalidad puede ser una sal de un compuesto representado por la Fórmula (1), un solvato de un compuesto representado por la Fórmula (1), o un solvato de una sal de un compuesto representado por la Fórmula (1).

La sal no se encuentra particularmente limitada siempre que la sal sea una sal farmacéuticamente aceptable, y ejemplos de la misma incluyen sales de ácidos inorgánicos tales como clorhidrato, sulfato, bromhidrato, nitrato, y fosfato; sales de ácidos orgánicos tales como acetato, mesilato, succinato, maleato, fumarato, citrato y tartrato; sales de metales alcalinos tales como sal de sodio y sal de potasio; sales de metales alcalinotérreos tales como sal de magnesio y sal de calcio; sales metálicas tales como sales de aluminio y sales de zinc; sales de amonio tales como sales de amonio y sales de tetrametilamonio; sales de adición de aminas orgánicas tales como morfolina y piperidina; sales de adición de aminoácidos tales como glicina, fenilalanina, lisina, ácido aspártico, y ácido glutámico, y similares.

Además, el solvato del compuesto representado por la Fórmula (1) y el solvato de la sal del compuesto representado por la Fórmula (1) no se encuentran particularmente limitados siempre que los solvatos sean farmacéuticamente aceptables y ejemplos de los mismos incluyan hidratos, solvatos orgánicos, y similares.

El agente terapéutico para la ALS de la presente modalidad puede ser clorhidrato de 4-[2-(dipropilamino)etil]-1,3-dihidro-2H-indol-2-ona, es decir, clorhidrato de ropinirol.

Composición para el tratamiento de la ALS

La presente invención proporciona una composición para su uso en el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica (ALS) esporádica, o<a>L<s>familiar que tiene una mutación en el gen de FUS o el gen de la proteína de unión al ADN Ta R de 43 kDa (TDP-43), que contiene el agente terapéutico para ALS que se describe anteriormente y un portador farmacéuticamente aceptable.

La composición para el tratamiento de ALS de la presente modalidad se puede preparar como una composición farmacéutica y, por ejemplo, es capaz de administrarse por vía oral en forma de tabletas, cápsulas, elixires, microcápsulas, o similares, o por vía parenteral en forma de una inyección, un supositorio, una preparación externa para la piel, o similares. Con mayor especificidad, ejemplos de preparación externa para la piel incluyen formulaciones tales como ungüentos y parches.

Como portadores farmacéuticamente aceptables, es posible usar portadores farmacéuticamente aceptables usados usualmente para preparar composiciones farmacéuticas sin limitación particular. Ejemplos más específicos de los mismos incluyen un aglutinante tal como hipromelosa, dextrina, Macrogol 400, gelatina, almidón de maíz, goma tragacanto y goma arábiga; excipientes tales como hidrato de lactosa, D-manitol, almidón, celulosa cristalina, y ácido algínico; solventes para inyecciones como agua, etanol, y glicerina; adhesivos tales como adhesivos en base a caucho y adhesivos en base a silicona, y similares.

La composición para el tratamiento de ALS puede incluir aditivos. Ejemplos de aditivos incluyen lubricantes tales como estearato de calcio y estearato de magnesio; edulcorantes tales como sacarosa, lactosa, sacarina y maltitol; agentes aromatizantes tales como menta y aceite de akamono; estabilizadores tales como carmelosa de sodio, aceite hidrogenado, ácido silícico anhidro ligero, povidona, éster de ácido graso de glicerina, alcohol bencílico y fenol; agentes tampón tales como fosfato y acetato de sodio; solubilizantes tales como benzoato de bencilo y alcohol bencílico; agentes colorantes tales como óxido férrico amarillo, óxido férrico, óxido de hierro negro, óxido de titanio, y similares.

Es posible preparar la composición para el tratamiento de ALS combinando y mezclando apropiadamente el agente terapéutico para ALS que se describe anteriormente y el portador y los aditivos farmacéuticamente aceptables que se describen anteriormente en forma de una unidad de dosis requerida para la práctica farmacéutica generalmente aceptada. En la composición para el tratamiento de ALS de la presente modalidad, se puede usar un tipo de agente terapéutico para ALS solo, o se pueden usar dos o más tipos en una mezcla.

Generalmente, la dosis diaria apropiada de la composición para el tratamiento de ALS es una cantidad que incluye la dosis más baja del ingrediente efectivo (agente terapéutico para ALS) efectivo para producir un efecto terapéutico. La dosis mínima efectiva que se describe anteriormente se determina en base a varios factores, que incluyen la actividad del ingrediente activo contenido en la composición para el tratamiento de la ALS, la modificación del grupo funcional que define la solubilidad en lípidos/solubilidad en agua, la vía de administración, el tiempo de administración, la velocidad de liberación del ingrediente efectivo específico, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o sustancias usadas en combinación con ellos, edad, sexo, peso corporal, enfermedades, condiciones médicas, historial médico del paciente, y otros factores bien conocidos en medicina. Usualmente, la dosis de la composición para el tratamiento de ALS para un paciente es una cantidad que incluye el ingrediente efectivo de aproximadamente 0,0001 a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal por día. La composición para el tratamiento de ALS se puede administrar una vez al día o por separado aproximadamente de 2 a 4 veces.

En particular, en un caso donde el agente terapéutico para la ALS sea el compuesto representado por la Fórmula (2), para la dosis de la composición para el tratamiento de la ALS, preferentemente, se administran por vía oral 2 mg del ingrediente activo una vez al día, la cantidad se aumenta cada semana y la cantidad se debe administrar por vía oral dentro de un intervalo en el que el ingrediente efectivo no exceda los 16 mg por día.

Ejemplos

A continuación, se dará una descripción detallada de la presente invención al mostrar Ejemplos, pero la presente invención no se limita a los siguientes Ejemplos.

<1. Examen mediante el uso de células iPS derivadas de pacientes familiares con ALS>

Ejemplo 1-1

(Diferenciación en neuronas motoras)

Se sabe que la ALS familiar incluye la ALS causada por una mutación del gen de FUS y la ALS causada por una mutación del gen TDP-43.

Por lo tanto, las células iPS derivadas de sujetos sanos, las células iPS derivadas de pacientes con ALS que tienen una mutación en FUS y las células iPS derivadas de pacientes con ALS que tienen una mutación en TDP-43 se diferenciaron en neuronas motoras. Las líneas celulares iPS usadas se muestran en la Tabla 1 y todas derivaron de fibroblastos de piel.

Tabla 1

Específicamente, cada una de las líneas celulares anteriores se cultivó primero en un medio que contenía SB431542 (Número CAS: 301836-41-9) a una concentración final de 3 pM, CHIR99021 (Número CAS: 252917-06-9) a una concentración final de 3 j M, y Dorsomorfina (Número CAS 866405-64-3) a una concentración final de 3 j M por 5 días para inducir células madre pluripotentes promotoras de la diferenciación (DiSC). El medio se cambió cada día. Más abajo, el momento de inicio de la inducción de diferenciación se refiere al inicio de la inducción DiSC.

Posteriormente, las DiSC obtenidas se disociaron en células una por una y se cultivaron adicionalmente en un medio que tenía la composición que se muestra en la Tabla 2 en una incubadora con bajo contenido de oxígeno por 7 días. La concentración de oxígeno se estableció en 5 % (v/v). El medio se cambió cada 2 o 3 días.

___________________ Tabla 2___________________

Mezcla 1:1 de medio DMEM y medio F-12__________

Glucosa al 0,6 %______________________________

Glutamina 2 mM______________________________

Bicarbonato de sodio 3 mM______________________

HEPES 5 mM________________________________

25 jg/ml de insulina___________________________

100 jg/ml de transferrina_______________________

Progesterona 20 nM___________________________

Cloruro de selenio 30 nM_______________________

Putrescina 60<j>M_____________________________

Suplemento de B 27 al 2 % (Thermo Fisher Scientific)

20 ng/ml de bFGF_____________________________

Y-2763210 j M (Wako Pure Chemical Industries)

10 ng/ml de hLIF______________________________

CH1R99021 3 j M_____________________________

SB4315422<j>M______________________________

Posteriormente, las células se cultivaron adicionalmente en un medio que tenía la composición que se muestra en la Tabla 3 en una incubadora con bajo contenido de oxígeno por 4 días. La concentración de oxígeno se estableció en 5 % (v/v). El medio se cambió cada 2 o 3 días. DAPT (Número CAS: 208255-80-5) se añadió al medio el día 4 de cultivo en el medio que tenía la composición que se muestra en la Tabla 3 de manera que la concentración final fuera de 5 j M.

Tabla 3

El día 14 de cultivo con el medio que tenía la composición que se muestra en la Tabla 3, las células se disociaron otra vez una por una, y se cultivaron adicionalmente por 5 a 40 días en un medio de inducción de diferenciación neuronal que tiene la composición que se muestra en la Tabla 4. Esto indujo la diferenciación en las neuronas motoras.

Tabla 4

Mediante el uso de las neuronas motoras inducidas por diferenciación, se examinaron los niveles de expresión de cada gen para la diferenciación neurogénica 1 (NeuroDI), SRY-Box 1 (SOX 1), el factor de transcripción del linaje de oligodendrocitos 2 (OLIG 2), LIM caja homeótica 3 (LHX 3), ISLET 1, Hb9, y colina acetiltransferasa (ChAT). Se usó tejido de la médula espinal como control positivo. Como resultado, se confirmó que las neuronas motoras obtenidas exhibían patrones de expresión de gen similares a los de la médula espinal. A partir de estos resultados, se confirmó que era posible inducir que las células iPS se diferenciaran en neuronas motoras.

Además, se inmunotiñeron las neuronas motoras inducidas por diferenciación y se examinó la expresión de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP), pIII-tubulina, HB9 y ChAT. Como resultado, a partir del resultado de la inmunotinción se confirmó que era posible inducir a las células iPS a diferenciarse en neuronas motoras.

Ejemplo 1-2

(Análisis de longitud de las neuritas)

Para cada neurona motora inducida por diferenciación en el Ejemplo I-1, se midieron los cambios a lo largo del tiempo en la longitud de la neurita. Se usó una Bio station CT (Nikon Corp.) para medir la longitud de las neuritas a lo largo del tiempo. La Figura 1 es un gráfico que muestra los resultados de las mediciones de los cambios a lo largo del tiempo en la longitud de las neuritas. El eje vertical representa la longitud de las neuritas (valor relativo) y el eje horizontal representa el número de días de cultivo a partir del inicio de la inducción de la diferenciación. Como resultado, se reveló que, en las neuronas motoras inducidas a diferenciarse de células iPS derivadas de sujetos sanos, la longitud de las neuritas aumentaba continuamente, mientras que en las neuronas motoras inducidas a diferenciarse de células iPS derivadas de pacientes con ALS, la longitud se acortó aproximadamente 40 días después del inicio de la inducción de la diferenciación como pico. Este resultado indica que las neuronas motoras inducidas por la diferenciación reflejan la enfermedad de ALS.

Ejemplo I-3

(Análisis de la relación positiva de caspasa 3 tipo escindida)

El día 40 a partir del inicio de la inducción de la diferenciación, cada neurona motora inducida por la diferenciación en el Ejemplo I-1 se inmunotiñó mediante el uso de anticuerpos con respecto a la caspasa 3 de tipo escindida (escindida, CV) (se puede denominar "caspasa 3 CV"), y se midió la relación de neuronas positivas para caspasa 3 de tipo escindida (escindida, CV) (se puede denominar "caspasa 3 CV"). Las neuronas positivas para caspasa 3 CV son neuronas para las que se indujo la apoptosis.

La Figura 2 es un gráfico que muestra la relación de neuronas positivas para caspasa 3 CV en cada neurona motora. En el diagrama, "**" indica que existe una diferencia significativa cuando el riesgo es menor de 1 %. Como resultado, se reveló que, en comparación con las neuronas motoras inducidas para diferenciarse de células iPS derivadas de sujetos sanos, la relación de neuronas positivas para caspasa 3 CV era significativamente más alta en las neuronas motoras inducidas para diferenciarse de células iPS derivadas de pacientes con ALS. Este resultado apoya adicionalmente las neuronas motoras inducidas por la diferenciación que reflejan la enfermedad de ALS. Ejemplo I-4

(Análisis de la relación de fuga de LDH)

El día 40 a partir del inicio de la inducción de la diferenciación, se midió la fuga de lactato deshidrogenasa (LDH) de las células mediante el uso de cada neurona motora inducida por la diferenciación en el Ejemplo I-1. La cantidad de LDH que se escapa al medio es un indicador de citotoxicidad. Para medir la relación de fuga de LDH, se usó un kit disponible comercialmente (modelo "LDH Cytotoxicity Detection Kit", Takara Bio Inc.).

La Figura 3 es un gráfico que muestra los resultados de la medición (valor relativo) de la relación de fuga de LDH en cada neurona motora. En el diagrama, "**" indica que existe una diferencia significativa cuando el riesgo es menor de 1 %. Como resultado, se reveló que, en comparación con las neuronas motoras inducidas para diferenciarse de células iPS derivadas de sujetos sanos, la relación de fuga de LDH era significativamente más alta en las neuronas motoras inducidas para diferenciarse de células iPS derivadas de pacientes con ALS. Este resultado apoya adicionalmente las neuronas motoras inducidas por la diferenciación que reflejan la enfermedad de ALS.

Ejemplo 1-5

(Análisis de localización de la proteína FUS)

La proteína FUS es una proteína de unión a ARN localizada en el núcleo. Por el contrario, se sabe que la localización ectópica de la proteína FUS en el citoplasma se observa en pacientes con ALS que tienen una mutación en FUS.

Por tanto, el día 40 a partir del inicio de la inducción de la diferenciación, se inmunotiñó cada neurona motora inducida por la diferenciación en el Ejemplo 1-1 y se examinó la localización de la proteína FUS en el citoplasma. La Figura 4 es un gráfico que muestra los resultados de la medición de la relación de neuronas en las que se observó la localización de la proteína FUS en el citoplasma en cada neurona motora. En el diagrama, "**" indica que existe una diferencia significativa cuando el riesgo es menor de 1 %.

Como resultado, se reveló que, en comparación con las neuronas motoras inducidas para diferenciarse de las células iPS derivadas de sujetos sanos, la relación de neuronas en la que se observó que la localización de la proteína FUS en el citoplasma era significativamente más alta en las neuronas motoras inducidas para diferenciarse de células iPS derivadas de pacientes con ALS (FUS-ALS) que tienen una mutación en FUS.

Por otro lado, en las neuronas motoras inducidas a diferenciarse de células iPS derivadas de pacientes con ALS (TDP-43-ALS) que tienen una mutación en TDP-43, no se observó un aumento significativo en la localización de la proteína FUS en el citoplasma.

Este resultado apoya adicionalmente la diferenciación de neuronas motoras inducidas que reflejan la enfermedad de ALS con mutaciones en FUS.

Ejemplo 1-6

(Formación de inclusiones de proteína TDP-43 fosforilada)

La proteína TDP-43 es una proteína de unión a ARN localizada en el núcleo. En pacientes con ALS que tienen una mutación en TDP-43, se sabe que son visibles inclusiones de proteína TDP-43 anormalmente fosforilada.

Por tanto, el día 40 a partir del inicio de la inducción de la diferenciación, se inmunotiñó cada neurona motora inducida por la diferenciación en el Ejemplo 1-1 y se examinó la formación de inclusiones de proteína TDP-43 fosforilada.

La Figura 5 es un gráfico que muestra los resultados de medición del número de inclusiones de proteína TDP-43 fosforilada (pTDP-43) por neurona en cada neurona motora. En el diagrama, "**" indica que existe una diferencia significativa cuando el riesgo es menor de 1 %.

Como resultado, se reveló que, en comparación con las neuronas motoras inducidas para diferenciarse de células iPS derivadas de sujetos sanos, en las neuronas motoras inducidas para diferenciarse de células iPS derivadas de pacientes con ALS (TDP-43-ALS) que tienen una mutación en TDP-43, el número de inclusiones de la proteína TDP-43 fosforilada por neurona aumentó significativamente.

Por otro lado, en las neuronas motoras inducidas a diferenciarse de células iPS derivadas de pacientes con ALS (FUS-ALS) que tienen una mutación en FUS, no se observó un aumento significativo en el número de inclusiones de la proteína TDP-43 fosforilada.

Este resultado apoya adicionalmente la diferenciación de neuronas motoras inducidas que reflejan la enfermedad de ALS con mutaciones en TDP-43.

Ejemplo I-7

(Análisis de gránulos de estrés)

El día 40 a partir del inicio de la inducción de la diferenciación, se examinó la formación de gránulos de estrés mediante el uso de cada neurona motora inducida por la diferenciación en el Ejemplo I-1. La detección de gránulos de estrés se realizó mediante inmunotinción con G3BP, que es un marcador de gránulos de estrés.

La Figura 6 es un gráfico que muestra los resultados de la medición del número de gránulos de estrés por neurona en cada neurona motora. En el diagrama, "**" indica que existe una diferencia significativa cuando el riesgo es menor de 1 %. Como resultado, se reveló que, en comparación con las neuronas motoras inducidas para diferenciarse de células iPS derivadas de sujetos sanos, el número de gránulos de estrés por neurona aumentó significativamente en las neuronas motoras inducidas para diferenciarse de células iPS derivadas de pacientes con ALS. Este resultado apoya adicionalmente las neuronas motoras inducidas por la diferenciación que reflejan la enfermedad de ALS. Ejemplo 1-8

(Detección de agente terapéutico para ALS)

Mediante el uso de las neuronas motoras inducidas por diferenciación en el Ejemplo 1-1, se seleccionaron fármacos que causan la restauración del fenotipo de ALS a partir de bibliotecas de fármacos existentes con la longitud de las neuritas, la localización ectópica de la proteína FUS, la formación de gránulos de estrés, la relación de fuga de LDH y la relación positiva para caspasa 3 CV, formación de inclusión de proteína TDP-43 fosforilada y similares como índices.

Como resultado del cribado, se descubrió que el ropinirol es un agente terapéutico prometedor para la ALS. Las tablas 5 y 6 muestran la relación de mejora (%) en el fenotipo de ALS debido a la adición de ropinirol al medio. En este caso, se añadió ropinirol al medio los días 35 a 40 a partir del inicio de la inducción de la diferenciación de cada célula iPS. Aquí, se supone que los días 35 a 40 desde el inicio de la inducción de diferenciación corresponden a la etapa temprana de la enfermedad de ALS.

La relación de mejora (%) del fenotipo de ALS se calculó mediante la ecuación (1).

Relación de mejora (%) = (A-B)/(A-C) x 100 ... (1)

[En la ecuación (1), A representa un valor de medición de las neuronas motoras inducidas a diferenciarse de células iPS derivadas de pacientes con ALS en ausencia de ropinirol, y B representa un valor de medición de neuronas motoras inducidas a diferenciarse de células iPS derivadas de pacientes con ALS en presencia de ropinirol, y C representa un valor de medición de las neuronas motoras inducidas a diferenciarse de células iPS derivadas de sujetos sanos en ausencia de ropinirol.]

La Tabla 5 muestra los resultados de añadir ropinirol a concentraciones finales de 0,1, 1 y 10 pM a un medio de neuronas motoras inducidas y diferenciadas de células iPS derivadas de pacientes con ALS (FUS-ALS) que tienen una mutación en FUS, y la Tabla 6 muestra los resultados de añadir ropinirol en concentraciones finales de 0,1, 1 y 10 pM a un medio de neuronas motoras inducidas a diferenciarse de células iPS derivadas de pacientes con ALS (TDP-43-ALS) que tienen una mutación en TDP-43.

Tabla 5

Tabla 6

Como se muestra en las Tablas 5 y 6, se reveló que el ropinirol exhibe un efecto de mejora notable tanto en ALS que tiene una mutación en FUS como en ALS que tiene una mutación en TDP-43.

Posteriormente, de la misma manera que anteriormente, se evaluó la eficacia en los casos de administración de concentraciones inferiores de ropinirol. La Tabla 7 muestra los resultados de añadir ropinirol en concentraciones finales de 0,1, 1, 10 nM a un medio de neuronas motoras inducidas para diferenciarse de células iPS derivadas de pacientes con ALS (FUS-ALS) que tienen una mutación en FUS, y la Tabla 8 muestra los resultados de añadir ropinirol en concentraciones finales de 0,1, 1 y 10 nM a un medio de neuronas motoras inducidas para diferenciarse de células iPS derivadas de pacientes con ALS (TDP-43-ALS) que tienen una mutación en TDP-43.

Tabla 7

Tabla 8

Como se muestra en las Tablas 7 y 8, se reveló que el ropinirol exhibe efectos de mejora tanto en ALS que tiene una mutación en FUS como en ALS que tiene una mutación en TDP-43 incluso en las concentraciones finales de 0,1 a 10 nM, en particular, exhibiendo efectos de mejora notable para todos los elementos de 1 a 10 nM.

Además, las Tablas 9 y 10 más abajo muestran los resultados de realizar el mismo examen anterior excepto que, en lugar de ropinirol, se añadieron riluzol y edaravona, que son fármacos existentes para la ALS, y ceftriaxona, un fármaco usado anteriormente para estudios clínicos de ALS. Cada fármaco se añadió al medio a una concentración final de 10 pM.

La Tabla 9 muestra los resultados de añadir cada fármaco al medio de neuronas motoras inducidas para diferenciarse de células iPS derivadas de pacientes con ALS (FUS-ALS) que tienen una mutación en FUS. Además, la Tabla 10 muestra los resultados de añadir cada fármaco a un medio de neuronas motoras inducidas para diferenciarse de células iPS derivadas de pacientes con ALS (TDP-43-ALS) que tienen una mutación en TDP-43.

Tabla 9

Tabla 10

Como resultado, se reveló que el ropinirol exhibe efectos de mejora más notables tanto en la ALS que tiene una mutación en FUS como en la ALS que tiene una mutación en TDP-43 en comparación con riluzol, edaravona, y ceftriaxona.

Ejemplo 1-9

(Evaluación de la eficacia del ropinirol en la enfermedad de ALS en etapa tardía)

La eficacia del ropinirol se evaluó de la misma manera que en el Ejemplo I-8, excepto que el momento de añadir ropinirol se cambió a los días 50 a 62 a partir del inicio de la inducción de la diferenciación de cada célula iPS. Se asume que los días 50 a 62 a partir del inicio de la inducción de la diferenciación corresponden a la etapa tardía de la enfermedad de ALS.

Específicamente, se añadió ropinirol a un medio de neuronas motoras inducidas para diferenciarse de células iPS derivadas de pacientes con<a>L<s>(FUS-ALS) que tenían una mutación en FUS y neuronas motoras inducidas para diferenciarse de células iPS derivadas de pacientes con ALS (TDP-43-ALS) que tenía una mutación en TDP-43 y se midieron los cambios a lo largo del tiempo en la longitud de las neuritas. La medición de la longitud de las neuritas se llevó a cabo de la misma manera que en el Ejemplo I-2. Se añadió ropinirol al medio a una concentración final de 1 |jM.

La Figura 14(a) es un gráfico que muestra los resultados de la medición de los cambios a lo largo del tiempo en la longitud de las neuritas de cada neurona motora. En la Figura 14(a), el eje vertical representa la longitud de las neuritas (valor relativo), el eje horizontal representa el número de días de cultivo a partir del inicio de la inducción de la diferenciación y "+ROPI" representa el resultado de añadir ropinirol al medio. Además, la Figura 14(b) es un gráfico que amplía la porción encuadrada del gráfico de la Figura 14(a). Además, la Figura 14(c) es un gráfico que muestra la longitud de las neuritas de cada neurona motora en el día 50 y el día 62 a partir del inicio de la inducción de diferenciación. En la Figura 14(c), "**" y "++" indican que existe una diferencia significativa cuando el riesgo es menor de 1 %, y "+ROPI" representa el resultado de añadir ropinirol al medio.

Como resultado, incluso en los días 50 a 62 a partir del inicio de la inducción de la diferenciación, se observó una acción neuroprotectora (mantenimiento de la longitud de las neuritas) debido a la adición de ropinirol. Este resultado indica que el ropinirol tiene el efecto de mejorar la enfermedad de ALS incluso en la última etapa de la enfermedad de ALS.

<II. Examen mediante el uso de células iPS derivadas de pacientes con ALS esporádica>

Ejemplo II-1

(Diferenciación en neuronas motoras)

De la misma manera que en el Ejemplo I-1, las células iPS derivadas de pacientes con ALS esporádica (se puede hacer referencia más abajo como "SALS") se diferenciaron en neuronas motoras. Todas las células iPS usadas derivaron de fibroblastos dérmicos. La información clínica sobre los pacientes de los que se derivaron las células iPS usadas se muestra en la Tabla 11. Más abajo, cada neurona motora diferenciada se identifica por el número de paciente del que se deriva la neurona.

Tabla 11

Ejemplo II-2

(Análisis de longitud de las neuritas)

Con respecto a cada una de las neuronas motoras inducidas por diferenciación en el Ejemplo 11-1, los cambios a lo largo del tiempo en la longitud de las neuritas se analizaron de la misma manera que en el Ejemplo 1-2. Como resultado, se reveló que, en los días 40 a 45 a partir el inicio de la inducción de la diferenciación, se acortó la longitud de las neuritas, que hasta entonces habían continuado alargándose. Este resultado muestra que las neuronas motoras inducidas por la diferenciación reflejan la enfermedad de ALS.

Ejemplo 11-3

(Análisis de la relación de fuga de LDH)

La relación de fuga de LDH de las células se midió a lo largo del tiempo mediante el uso de cada neurona motora inducida por diferenciación en el Ejemplo II-1. La relación de fuga de LDH se midió de la misma manera que en el Ejemplo 1-4.

La Figura 7 es un gráfico que muestra cambios a lo largo del tiempo en la relación de fuga de LDH (valor relativo) en cada neurona motora. El eje horizontal muestra el número de días a partir del inicio de la inducción de diferenciación. Como resultado, se reveló que la relación de fuga de LDH aumenta a lo largo del tiempo en las neuronas motoras inducidas a diferenciarse de las células iPS derivadas de pacientes con ALS esporádica. Este resultado apoya adicionalmente las neuronas motoras inducidas por la diferenciación que reflejan la enfermedad de ALS.

Ejemplo II-4

(Análisis de la relación positiva para Caspasa 3 CV)

Mediante el uso de cada neurona motora inducida por diferenciación en el Ejemplo II-1, se midió la relación de neuronas positivas para caspasa 3 CV a lo largo del tiempo de la misma manera que en el Ejemplo 1-3.

La Figura 8 es un gráfico que muestra los cambios a lo largo del tiempo en la relación de neuronas positivas para caspasa 3 CV en cada neurona motora. El eje horizontal muestra el número de días a partir del inicio de la inducción de diferenciación. Como resultado, se reveló que, en las neuronas motoras inducidas a diferenciarse de las células iPS derivadas de pacientes con ALS esporádica, la relación de neuronas positivas para caspasa 3 CV aumenta con el tiempo. Este resultado apoya adicionalmente las neuronas motoras inducidas por la diferenciación que reflejan la enfermedad de ALS.

Ejemplo II-5

(Análisis de gránulos de estrés)

Mediante el uso de cada neurona motora inducida por diferenciación en el Ejemplo II-1, se midió la formación de gránulos de estrés a lo largo del tiempo de la misma manera que en el Ejemplo 1-7.

La Figura 9 es un gráfico que muestra los cambios a lo largo del tiempo en el número de gránulos de estrés por neurona en cada neurona motora. El eje horizontal muestra el número de días a partir del inicio de la inducción de diferenciación. Como resultado, se reveló que, en las neuronas motoras inducidas a diferenciarse de las células iPS derivadas de pacientes con ALS esporádica, el número de gránulos de estrés aumenta a lo largo del tiempo. Este resultado apoya adicionalmente las neuronas motoras inducidas por la diferenciación que reflejan la enfermedad de ALS.

<111. Evaluación de la eficacia del ropinirol mediante el uso del modelo de ALS esporádica>

Ejemplo III-1

(Análisis de longitud de las neuritas)

De la misma manera que en el Ejemplo II-1, se indujo que las células iPS derivadas de pacientes con ALS esporádica (SALS) se diferenciaran en neuronas motoras, y entonces se añadió al medio ropinirol con una concentración final de 1 pM. Con mayor especificidad, por el período de los días 35 a 40 a partir del inicio de la inducción de la diferenciación, se añadió al medio ropinirol que tenía una concentración final de 1 pM. Además, se preparó como control un grupo para el que no se añadió ropinirol al medio. Además, a modo de comparación, las células iPS derivadas de sujetos sanos se diferenciaron en neuronas motoras de la misma manera que en el Ejemplo 1-1. No se añadió ropinirol al medio de estas neuronas motoras. Como células iPS derivadas de un sujeto sano, se usaron las mismas células que se usaron en el Ejemplo 1-1.

Posteriormente, el día 40 a partir del inicio de inducción de la diferenciación, se midió la longitud de las neuritas para cada neurona motora de la misma manera que en el Ejemplo 1-2.

La Figura 10 es un gráfico que muestra los resultados de la medición de la longitud de las neuritas de cada neurona motora. En el diagrama, "**" y "++" indican que existe una diferencia significativa cuando el riesgo es menor de 1 %. Como resultado, se reveló que, en presencia de ropinirol, la reducción de la longitud de las neuritas en las neuronas motoras inducida para diferenciarse de las células iPS derivadas de pacientes con SALS se suprimió significativamente.

Este resultado muestra que el ropinirol es efectivo no sólo para la ALS familiar sino también para el tratamiento de la ALS esporádica.

Ejemplo 111-2

(Análisis de la relación positiva para caspasa 3 CV)

Posteriormente, el día 40 a partir del inicio de la inducción de diferenciación, se midió la relación de neuronas positivas para caspasa CV 3 para cada neurona motora de la misma manera que en el Ejemplo 1-3.

La Figura 11 es un gráfico que muestra los resultados de la medición de la relación de neuronas positivas para caspasa 3 CV. En el diagrama, "**" y "++" indican que existe una diferencia significativa cuando el riesgo es menor de 1 %. Como resultado, se reveló que, en presencia de ropinirol, la relación de neuronas positivas para caspasa 3 CV en las neuronas motoras inducidas a diferenciarse de las células iPS derivadas de pacientes con SALS se redujo significativamente.

Este resultado apoya adicionalmente la eficacia del ropinirol no sólo para la ALS familiar sino también para el tratamiento de la ALS esporádica.

Ejemplo III-3

(Análisis de la relación de fuga de LDH)

De la misma manera que en el Ejemplo II-1, se indujo que las células iPS derivadas de pacientes con ALS esporádica (SALS) se diferenciaran en neuronas motoras, y entonces se añadió al medio ropinirol con una concentración final de 1 pM. Con mayor especificidad, por el período de los días 35 a 40 a partir del inicio de la inducción de la diferenciación, se añadió al medio ropinirol que tenía una concentración final de 1 pM. Además, se preparó como control un grupo para el que no se añadió ropinirol al medio. Además, a modo de comparación, las células iPS derivadas de sujetos sanos se diferenciaron en neuronas motoras de la misma manera que en el Ejemplo 1-1. No se añadió ropinirol al medio de estas neuronas motoras. Como células iPS derivadas de un sujeto sano, se usaron las mismas células que se usaron en el Ejemplo I-1.

Posteriormente, el día 40 a partir del inicio de la inducción de diferenciación, se midió la relación de fuga de LDH para cada neurona motora de la misma manera que en el Ejemplo I-4.

La Figura 12 es un gráfico que muestra el resultado de la medición de la relación de fuga de LDH. En el diagrama, "**" y "++" indican que existe una diferencia significativa cuando el riesgo es menor de 1 %. Como resultado, se reveló que, en presencia de ropinirol, la relación de fuga de LDH en las neuronas motoras inducidas a diferenciarse de las células iPS derivadas de pacientes con SALS disminuyó significativamente.

Ejemplo 111-4

(Análisis de gránulos de estrés)

De la misma manera que en el Ejemplo II-1, se indujo que células iPS derivadas de pacientes con ALS esporádica (SALS) se diferenciaran en neuronas motoras, y se añadió al medio ropinirol con una concentración final de 1 pM. Con mayor especificidad, por el período de los días 35 a 40 a partir del inicio de la inducción de la diferenciación, se añadió al medio ropinirol que tenía una concentración final de 1 pM. Además, se preparó como control un grupo para el que no se añadió ropinirol al medio. Además, a modo de comparación, las células iPS derivadas de sujetos sanos se diferenciaron en neuronas motoras de la misma manera que en el Ejemplo 1-1. No se añadió ropinirol al medio de estas neuronas motoras. Como células iPS derivadas de un sujeto sano, se usaron las mismas células que se usaron en el Ejemplo I-1.

Posteriormente, el día 40 a partir del inicio de la inducción de la diferenciación, se midió el número de gránulos de estrés para cada neurona motora de la misma manera que en el Ejemplo 1-7.

La Figura 13 es un gráfico que muestra el resultado de la medición del número de gránulos de estrés. En el diagrama, "**" y "++" indican que existe una diferencia significativa cuando el riesgo es menor de 1 %. Como resultado, se reveló que la cantidad de gránulos de estrés en las neuronas motoras inducidas a diferenciarse de las células iPS derivadas de pacientes con SALS disminuyó significativamente en presencia de ropinirol.

Ejemplo III-5

(Evaluación de la eficacia del ropinirol mediante el uso del modelo de ALS esporádica)

De la misma manera que en el Ejemplo 11-1, las células iPS derivadas de 24 pacientes con ALS esporádica (SALS) se diferenciaron en neuronas motoras y entonces se añadió al medio ropinirol con una concentración final de 1 pM. Además, a modo de comparación, se preparó un grupo para el que no se añadió ropinirol al medio. Además, como control, se usó un grupo para el cual las células iPS derivadas de sujetos sanos se diferenciaron en neuronas motoras de la misma manera que en el Ejemplo 1-1. No se añadió ropinirol al medio de estas neuronas motoras. Como células iPS derivadas de un sujeto sano, se usaron las mismas células que se usaron en el Ejemplo I-1. La siguiente Tabla 12 muestra la información clínica de los pacientes de los que se derivaron las células iPS usadas. Más abajo, cada neurona motora diferenciada se identifica por el número de paciente del que se deriva la neurona.

Tabla 12

En todas las neuronas motoras, el período de adición de ropinirol fue de 5 días. El tiempo para iniciar la adición de ropinirol varió en dependencia del caso y fue del día 30 al día 70 a partir del inicio de la inducción de la diferenciación de cada una de las células iPS.

Posteriormente, para cada neurona motora el día 5 después de la adición de ropinirol, se midió la relación de neuronas positivas para caspasa 3 CV de la misma manera que en el Ejemplo 1-3.

La Figura 15 es un gráfico que muestra los resultados de la medición de la relación de neuronas positivas para caspasa 3 CV. En el diagrama, "**" y "++" indican que existe una diferencia significativa cuando el riesgo es menor de 1 %, y "+ROPI" representa el resultado de añadir ropinirol al medio. Como resultado, entre los 24 casos del modelo SALS, hubo 22 casos en los que se confirmó un aumento en la relación positiva para caspasa 3 CV. Además, entre estos 22 casos, hubo 16 casos en los que el aumento de la relación positiva para caspasa 3 CV se suprimió mediante la adición de ropinirol (72,73 % de los casos SALS).

Aplicabilidad industrial

De acuerdo con la presente invención, es posible proporcionar un agente terapéutico para la ALS y una composición para el tratamiento de la ALS. Es posible tratar no sólo la ALS familiar sino también la ALS esporádica con el agente terapéutico para la ALS o la composición para el tratamiento de la ALS de la presente invención. Además, es posible aclarar el mecanismo de la enfermedad de ALS al analizar el mecanismo de acción del agente terapéutico para ALS de la presente invención con respecto a neuronas motoras diferenciadas de células iPS derivadas de pacientes de ALS.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un compuesto representado por la Fórmula (1), una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o un solvato del mismo, para su uso en el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica (ALS) esporádica, o ALS familiar que tiene una mutación en el gen de FUS o el gen de la proteína de unión al ADN TAR de 43 kDa (TDP-43),

en donde en la Fórmula (1), cada R1 representa independientemente un grupo alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono o un grupo 4-hidroxifenetilo, y n representa un número entero de 1 a 3.
2. El compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde n en la Fórmula (1) es 2.
3. El compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde R1 en la Fórmula (1) es un grupo n-propilo.
4. El compuesto para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el compuesto representado por la Fórmula (1) es 4-[2-(dipropilamino)etil]-1,3-dihidro-2H-indol-2-ona.
5. El compuesto para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la sal farmacéuticamente aceptable del compuesto representado por la Fórmula (1) es clorhidrato de 4-[2-(dipropilamino)etil]-1,3-dihidro-2H-indol-2-ona.
6. El compuesto para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la ALS a tratar es posterior al inicio del fenotipo de ALS.
7. Una composición, que comprende: un compuesto representado por la Fórmula (1), una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o un solvato del mismo, y un portador farmacéuticamente aceptable para su uso en el tratamiento de ALS esporádica o ALS familiar que tiene una mutación en el gen de FUS o el gen de la proteína de unión al ADN TAR de 43 kDa (TDP-43),

en donde en la Fórmula (1), cada R1 representa independientemente un grupo alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono o un grupo 4-hidroxifenetilo, y n representa un número entero de 1 a 3.
8. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 7, en donde la ALS a tratar es después del inicio del fenotipo de ALS.