ES2970186T3

ES2970186T3 - Formulaciones farmacéuticas y métodos de uso de las mismas

Info

Publication number: ES2970186T3
Application number: ES16869289T
Authority: ES
Inventors: Elizabeth Bartlett
Original assignee: Immunogen Inc
Current assignee: Immunogen Inc
Priority date: 2015-11-25
Filing date: 2016-11-23
Publication date: 2024-05-27
Anticipated expiration: 2036-11-23
Also published as: EP4335851A2; PT3380525T; FI3380525T3; US20170348427A1; DK3380525T3; EP3380525A4; EP4335851A3; WO2017091745A1; EP3380525A1; JP2021119171A; US20200222552A1; RS65120B1; US20170189548A1; US11278628B2; JP7157204B2; EP3380525B1; JP2019501139A

Abstract

Esta divulgación está dirigida a conjugados anticuerpo-fármaco. Más específicamente, esta divulgación se dirige a composiciones que comprenden (i) conjugados anticuerpo-fármaco que comprenden benzodiazepinas y (ii) una pequeña molécula hidrófoba, métodos de tratamiento usando las composiciones y métodos de formulación de las composiciones. Además, esta divulgación está dirigida a métodos para reducir la autoasociación reversible en anticuerpos y en conjugados anticuerpo-fármaco. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Formulaciones farmacéuticas y métodos de uso de las mismas

Reivindicación de prioridad

Esta solicitud reivindica prioridad de la Solicitud Provisional de EE. UU. No. 62/368,156, presentada el 28 de julio de 2016, y de la Solicitud Provisional de EE. UU. No. 62/260,104, presentada el 25 de noviembre de 2015.

Campo

La presente divulgación se refiere a productos farmacéuticos. Más específicamente, esta divulgación se refiere a formulaciones para conjugados de anticuerpo-fármaco y composiciones de conjugado de anticuerpo-fármaco para su uso en métodos.

Antecedentes

En los últimos años, el tratamiento del cáncer es más dirigido a través del desarrollo de conjugados de anticuerpofármaco (en la presente memoria denominados "ADC", "conjugados" o "inmunoconjugados"). Los investigadores han identificado y aprovechado los receptores de la superficie celular y los antígenos expresados selectivamente por las células cancerosas para desarrollar fármacos basados en anticuerpos que se unen a antígenos específicos de tumor o asociados a tumor. Esta unión específica permite el suministro a las células cancerosas de compuestos citotóxicos unidos al anticuerpo. La selectividad proporcionada por los ADC minimiza la toxicidad para las células normales, mejorando así la tolerabilidad del fármaco en el paciente.

A modo de ejemplo, WO2015/075201A1 describe formulaciones liofilizadas libres de tensioactivos de conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC), tales como ADC anti-factor tisular, y formulaciones reconstituidas, procesos y usos de los mismos. Las formulaciones son particularmente adecuadas para un ADC anti-TF basado en un derivado de auristatina u otro fármaco similarmente hidrófobo. Típicamente, los excipientes de las formulaciones comprenden o consisten en histidina, sacarosa, trehalosa, manitol y glicina. WO2015/104385A2 se refiere a conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC) que contienen duocarmicina para su uso en el tratamiento de tumores sólidos humanos y malignidades hematológicas que expresan HER2. En particular, este documento describe ADC que contienen duocarmicina para su uso en el tratamiento de tumores sólidos humanos con estado tisular por IHC HER22+ o 1 y negativos para HER2 por FISH.

A pesar de la selectividad tumoral proporcionada por los ADC, el uso de los ADC en un contexto clínico está limitado por una serie de factores. Entre esos factores está la capacidad de los ADCs para agregarse y autoasociarse reversiblemente. Los ADC son capaces de agregarse entre sí a través de varios mecanismos, incluyendo enlaces covalentes e interacciones hidrófobas. Los ADC también son capaces de autoasociarse reversiblemente a través de interacciones débiles que crean equilibrio entre monómeros y especies de orden superior. En cualquier caso, la agregación y la autoasociación reversible inhiben la capacidad del ADC para unirse a la diana, reduciendo así la eficacia clínica del ADC. En consecuencia, los investigadores continúan trabajando para descubrir maneras de limitar la agregación y la autoasociación reversible de los ADC y aumentar la eficacia de los ADC.

Compendio

Esta divulgación se dirige a composiciones de ADC con autoasociación reversible reducida, tales composiciones para su uso en métodos de tratamiento de cáncer, métodos de formulación de tales composiciones, y métodos para reducir la autoasociación reversible.

Según un primer aspecto de la divulgación, se proporciona una formulación acuosa como se define en la reivindicación 1. Otras realizaciones de la invención reivindicada en la presente memoria se exponen en las reivindicaciones 2 a 10.

La composición tiene un pH entre aproximadamente 4,0 y aproximadamente 4,5. La formulación comprende una benzodiazepina, que es una indolinobenzodiazepina. La benzodiazepina se selecciona del grupo que consiste en D5 y D5(a), que se describen a continuación en la Tabla 1. En particular, el ADC se selecciona del grupo que consiste en Ab-Cys-D5 y Ab-Cys-D5(a), que se describen a continuación en la Tabla 2. La composición es una solución acuosa. El anticuerpo es un anticuerpo de CD123 humanizado. En ciertos ejemplos, el anticuerpo es un anticuerpo de CD123 humanizado descrito en la Publicación de Solicitud de PCT No. WO2017004026A1. Tal y como se usa en la presente memoria, "AbX" se refiere a anticuerpos de CD123 humanizados descritos en la Publicación de Solicitud de PCT No. WO2017004026A1. El anticuerpo AbX presente en la formulación reivindicada comprende las secuencias de CDR definidas en la reivindicación 1. En algunas realizaciones, el anticuerpo AbX comprende las secuencias de dominio de región variable de cadena pesada y las secuencias de dominio de región variable de cadena ligera divulgadas en la presente memoria. En realizaciones adicionales, la composición es una composición liofilizada reconstituida.

El número de benzodiazepinas por anticuerpo en un ADC puede variar. En algunas realizaciones, el ADC comprende al menos una benzodiazepina. En ciertas realizaciones, el ADC comprende al menos dos benzodiazepinas. En realizaciones adicionales, el ADC comprende al menos tres benzodiazepinas. En más realizaciones adicionales, el ADC comprende al menos cuatro benzodiazepinas. En otras realizaciones, el ADC comprende al menos cinco benzodiazepinas. En ciertas realizaciones, el ADC comprende al menos seis benzodiazepinas. En algunas realizaciones, el ADC comprende aproximadamente siete benzodiazepinas. En composiciones que comprenden más de un ADC, se puede medir el número promedio de benzodiazepinas por anticuerpo. Este número se denomina la relación fármaco a anticuerpo, o "DAR". En algunas realizaciones, una composición que comprende más de un ADC tiene una DAR entre aproximadamente 1 y aproximadamente 4. En algunas realizaciones, una composición que comprende más de un ADC tiene una DAR entre 0 y aproximadamente 1. En otras realizaciones, una composición que comprende más de un ADC tiene una DAR entre aproximadamente 1 y aproximadamente 2. En aún otras realizaciones, una composición que comprende más de un ADC tiene una DAR entre aproximadamente 2 y aproximadamente 3. En realizaciones adicionales, una composición que comprende más de un ADC tiene una DAR de entre aproximadamente 3 y aproximadamente 4. En aún otras realizaciones, una composición que comprende más de un ADC tiene una DAR entre aproximadamente 4 y aproximadamente 5. En aún otras realizaciones, una composición que comprende más de un ADC tiene una DAR entre aproximadamente 5 y aproximadamente 6. En algunas realizaciones, la benzodiazepina se conjuga con el anticuerpo de una manera específica de sitio, por ejemplo, a través de conjugación con un residuo de cisteína o serina diseñado por ingeniería.

Se ha descubierto que las composiciones que comprenden un ADC exhiben autoasociación reversible reducida cuando se formulan con un tampón (p. ej., tampón de succinato) a un pH que varía de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 4,5. Por consiguiente, el primer aspecto de esta divulgación se dirige a composiciones que comprenden un ADC que comprende una benzodiazepina, en donde el ADC exhibe autoasociación reversible, y un tampón, en donde la composición tiene un pH que varía de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 4,5. La benzodiazepina se selecciona del grupo que consiste en D5 y D5(a). En particular, el ADC se selecciona del grupo que consiste en Ab-Cys-D5 y Ab-Cys-D5(a). El anticuerpo es un anticuerpo de CD123 humanizado. En ciertos ejemplos, el anticuerpo es AbX y se refiere a anticuerpos de CD123 humanizados descritos en la Publicación de Solicitud de PCT No. WO2017004026A1. El anticuerpo AbX comprende las secuencias de CDR definidas en la reivindicación 1. En algunas realizaciones, el anticuerpo AbX comprende las secuencias de dominio de región variable de cadena pesada y las secuencias de dominio de región variable de cadena ligera divulgadas en la presente memoria.

La composición comprende además un azúcar. El azúcar es trehalosa. En particular, la trehalosa es dihidrato de trehalosa. El tampón es succinato. La composición es una formulación acuosa. En algunas realizaciones, la composición comprende además un agente de carga. En ciertas realizaciones, el agente de carga es glicina. En otras realizaciones, el agente de carga es manitol.

En particular, la formulación acuosa comprende (a) agua; (b) AbX-D5 o AbX-D5(a); (c) succinato de sodio 10 mM; y (d) trehalosa al 8 %, en donde la formulación tiene un pH que varía de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 4,5 y opcionalmente incluye bisulfito de sodio 2 - 200 pM. En algunas realizaciones, la formulación acuosa comprende (a) agua; (b) 2 mg/mL de AbX-D5 o AbX-D5(a); (c) succinato de sodio 10 mM; (d) dihidrato de trehalosa al 8 %; (e) bisulfito de sodio 50 pM; y polisorbato 20 al 0,01 % (p/v), en donde la formulación tiene un pH de aproximadamente 4,2. En algunas realizaciones, la composición es una composición liofilizada de cualquiera de las composiciones acuosas descritas en la presente memoria. En algunas realizaciones, el pH de cualquiera de las composiciones descritas anteriormente es 4,2. El anticuerpo AbX comprende las secuencias de CDR definidas en la reivindicación 1. En algunas realizaciones, el anticuerpo AbX comprende las secuencias de dominio de región variable de cadena pesada y las secuencias de dominio de región variable de cadena ligera divulgadas en la presente memoria.

En algunas realizaciones, la composición comprende además un tensioactivo. En algunas realizaciones, el tensioactivo es polisorbato 20 al 0,01 %. En algunas realizaciones, la composición comprende además bisulfito de sodio. En algunas realizaciones, la composición comprende bisulfito de sodio 2-200 pM. En otras realizaciones, la composición comprende además bisulfito de sodio 5-100 pM. En ciertas realizaciones, la composición comprende además bisulfito de sodio aproximadamente 50 pM.

En algunas realizaciones, el pH de la composición es de aproximadamente 4,2. En algunas realizaciones, la formulación acuosa comprende (a) agua; (b) 2 mg/mL de AbX-D5 o AbX-D5(a); (c) succinato de sodio 10 mM; (d) dihidrato de trehalosa al 8 %; (e) bisulfito de sodio 50 pM; y polisorbato 20 al 0,01 % (p/v), en donde la formulación tiene un pH de aproximadamente 4,2.

Otro ejemplo de esta divulgación se dirige a un método para reducir la autoasociación reversible, que comprende (a) proporcionar un ADC que comprende una benzodiazepina en una solución acuosa a un primer pH, en donde el ADC exhibe autoasociación reversible; y (b) ajustar el pH de la solución acuosa a un segundo pH que varía de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 4,5, en donde el ajuste del pH del primer pH al segundo pH reduce la autoasociación reversible. En algunos ejemplos, el segundo pH es aproximadamente 4,2.

En algunos ejemplos de los métodos divulgados, la benzodiazepina se selecciona del grupo que consiste en D5 y D5(a). En algunos ejemplos, el ADC se selecciona del grupo que consiste en Ab-Cys-D5 y Ab-Cys-DS(a).

En algunos ejemplos, la autoasociación reversible se reduce en aproximadamente un 70 % a aproximadamente un 80 %. En ejemplos adicionales, la autoasociación reversible se reduce en aproximadamente un 80 % a aproximadamente un 90 %. En más ejemplos adicionales, la autoasociación reversible se reduce en aproximadamente un 90 % a aproximadamente un 100 %.

En algunos ejemplos, el método comprende además liofilizar la solución acuosa, creando así una composición liofilizada. En más ejemplos adicionales, el método también comprende reconstituir la composición liofilizada. El ADC comprende un anticuerpo de CD123 humanizado. En algunos ejemplos, el anticuerpo de CD123 humanizado es AbX. En algunos ejemplos, el anticuerpo AbX comprende las secuencias de CDR divulgadas en la presente memoria. En algunos ejemplos, el anticuerpo AbX comprende las secuencias de dominio de región variable de cadena pesada y las secuencias de dominio de región variable de cadena ligera divulgadas en la presente memoria.

Esta divulgación se dirige además a una composición que comprende (a) un ADC que comprende una benzodiazepina y (b) trehalosa, en donde la composición tiene un rango de pH de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 4,5. La composición comprende además succinato de sodio. En algunas realizaciones, la composición comprende además bisulfito de sodio. En realizaciones adicionales, la composición comprende además un tensioactivo. La benzodiazepina se selecciona del grupo que consiste en D5 y D5(a). En particular, el ADC se selecciona del grupo que consiste en Ab-Cys-D5 y Ab-Cys-D5(a).

Breve descripción de las figuras

La FIG. 1 muestra el gráfico de dispersión dinámica de luz de un sistema de autoasociación reversible usando huM9-6-sSPDB-DGN462 como ejemplo.

Las FIG. 2A y 2B muestran la distribución de SV-AUC de un sistema de autoasociación reversible usando huM9-6-sSPDB-DGN462 como ejemplo.

La FIG. 3 muestra los cambios en el diámetro hidrodinámico en relación con la relación fármaco a anticuerpo medido por dispersión dinámica de luz.

La FIG. 4 muestra el gráfico de dispersión dinámica de luz de diferentes composiciones de ADC.

La FIG. 5 muestra la distribución de SV-AUC de diferentes composiciones de ADC.

La FIG. 6 muestra los datos de espectrometría de masas para el conjugado huMOV19-90 desglicosilado.

La FIG. 7 muestra los datos de espectrometría de masas para el conjugado huMov19-sSPDB-107 desglicosilado. La FIG. 8 muestra el gráfico de dispersión dinámica de luz de diferentes composiciones de ADC.

La FIG. 9 muestra el gráfico de dispersión dinámica de luz de diferentes composiciones de ADC.

La FIG. 10 muestra datos obtenidos de una evaluación de RSA para una formulación de succinato-trehalosa en un rango de pH.

La FIG. 11 muestra RSA de ADC en succinato de sodio 10 mM, trehalosa al 8 %, polisorbato-20 al 0,01 %, pH 4,0 Descripción detallada

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto en la técnica a la que se pertenece esta divulgación. Aunque se pueden usar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria en la práctica o ensayo de la presente invención, a continuación, se describen métodos y materiales adecuados ejemplares. En caso de conflicto, prevalecerá la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones. Además, los materiales, métodos y ejemplos son sólo ilustrativos y no pretenden ser limitativos.

Definiciones

Tal y como se usan en la presente memoria, los términos "un" o "una" significan uno o más, a menos que estos términos estén limitados de otro modo en su uso.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "aproximadamente" significa ± 10 % de un valor establecido.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "sujeto" significa un ser humano o un animal. Los animales ejemplares incluyen, pero no están limitados a, mamíferos tales como ratón, rata, cobaya, perro, gato, caballo, vaca, cerdo, mono, chimpancé, babuino o mono rhesus.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación en una forma que puede administrarse a un sujeto mientras que permite que la actividad biológica del ingrediente activo sea efectiva.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término “cantidad terapéuticamente efectiva” se refiere a una cantidad de un fármaco que es efectiva para tratar una enfermedad o trastorno.

Tal y como se usa en la presente memoria, "tratar", "tratando" o "tratamiento" se refiere a la reducción, alivio o mejora de una enfermedad o trastorno, o la reducción, alivio o mejora de al menos un síntoma de una enfermedad o trastorno.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "agregado irreversible" se refiere a la agregación no covalente que típicamente resulta de una interacción hidrófoba debido al despliegue parcial.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo en donde la secuencia de aminoácidos de la molécula de inmunoglobulina deriva de dos o más especies. Típicamente, la región variable tanto de cadenas pesadas como ligeras corresponde a la región variable de anticuerpos derivados de una especie de mamíferos (p. ej., ratón, rata, conejo, etc.) con la capacidad, afinidad y especificidad deseadas, mientras que las regiones constantes son homólogas a las secuencias en anticuerpos derivados de otra (normalmente humana) para evitar o reducir la probabilidad de incitar una respuesta inmune en dicha especie (p. ej., ser humano). En ciertos ejemplos, un anticuerpo quimérico puede incluir un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende al menos un polipéptido de cadena pesada y/o ligera humana, tal como, por ejemplo, un anticuerpo que comprende polipéptidos de cadena ligera murina y de cadena pesada humana.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad de unirse específicamente a un antígeno.

Tal y como se usa en la presente memoria, anticuerpos "policlonales" se refiere a poblaciones heterogéneas de anticuerpos, contenidas típicamente en el suero de animales inmunizados.

Tal y como se usa en la presente memoria, anticuerpos "monoclonales" se refiere a poblaciones homogéneas de moléculas de anticuerpos que son específicas para un antígeno particular.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término “conector”, “grupo conector” o “resto conector” se refiere a un resto que conecta dos grupos, tal como un anticuerpo y un compuesto citotóxico entre sí.

Tal y como se usan en la presente memoria, los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a o describen las afecciones fisiológicas en mamíferos en las que una población de células se caracteriza por crecimiento celular no regulado. El cáncer puede incluir un cáncer hematológico o un tumor sólido.

Agregados y autoasociación reversible

El desarrollo de composiciones de ADC comercialmente viables y clínicamente útiles se complica por los comportamientos impredecibles de diferentes anticuerpos y ADC durante la formulación. La capacidad de los anticuerpos y los ADC para agregarse y autoasociarse reversiblemente puede conducir a muchos efectos indeseables comercial y clínicamente. La agregación y la autoasociación reversible pueden conducir a potencia reducida, estabilidad disminuida, toxicidad incrementada, viscosidad incrementada, decoloración de la solución, y otros efectos indeseables. En algunas circunstancias, los agregados pueden desencadenar una respuesta del sistema inmune, un problema de seguridad potencial en los pacientes.

Los agregados covalentes ocurren a través de la formación de un enlace químico entre al menos dos monómeros. Por ejemplo, los agregados covalentes pueden resultar de enlaces disulfuro formados entre cisteínas no emparejadas en un monómero, o como resultado de mezclado de disulfuro intermolecular, o a través de enlace tioéter.

En ciertos casos, la agregación es irreversible. La agregación irreversible de inmunoglobulinas conduce a una actividad o funcionalidad disminuida de las inmunoglobulinas en las formulaciones. Los agregados irreversibles pueden ser inhibidos por agentes tales como urea, guanidina o dodecilsulfato de sodio ("SDS"), pero no mediante la reducción de la concentración del anticuerpo.

La autoasociación reversible ("RSA") se produce como resultado de la capacidad de un ADC para formar especies oligoméricas a través de interacciones intermoleculares débiles, no covalentes. La cantidad de estas interacciones para cualquier ADC dado en solución depende de una variedad de factores, incluyendo el propio anticuerpo (p. ej., estructuras primaria y secundaria) y características de la solución tales como pH, así como la concentración del ADC. Además, se ha descubierto que la cantidad y el grado de la autoasociación varía según el ADC dependiendo de las características del compuesto citotóxico y del anticuerpo. Los compuestos citotóxicos que son hidrófobos, insolubles y/o comprenden múltiples anillos aromáticos pueden aumentar la RSA. Por lo tanto, los ADC más hidrófobos tienen una mayor tendencia a autoasociarse reversiblemente en solución. Los ADC se autoasocian y alcanzan el equilibrio en solución entre monómeros y en especies oligoméricas de orden superior.

La autoasociación reversible de ADC tiene numerosos efectos perjudiciales en las formulaciones. La RSA puede crear problemas para la fabricación, estabilidad, suministro y seguridad del ADC en un contexto terapéutico. Desde una perspectiva de suministro, la RSA puede aumentar la viscosidad de una solución, lo que puede obstaculizar el émbolo de una jeringa precargada. Desde una perspectiva de estabilidad y seguridad, la r Sa puede reducir la potencia (porque las especies oligoméricas no funcionan terapéuticamente) y aumentar la posibilidad de desencadenar una respuesta inmune.

Los investigadores tienen varios métodos a su disposición para evaluar la cantidad de monómero de ADC en solución. Por ejemplo, la cantidad de monómero de ADC en solución se puede medir por cromatografía de exclusión de tamaño (tanto SEC como SEC-MS) y velocidad de sedimentación (SV). En el análisis SEC, los agregados de ADC eluyen más rápidamente que los monómeros de ADC que son más pequeños y capaces de viajar más profundamente en los poros del material de empaquetamiento de la SEC. La SEC puede proporcionar una buena separación entre agregados y monómeros, proporcionando así una buena estimación de la cantidad de monómero en la solución.

Como se explica con mayor detalle en los Ejemplos a continuación, la SV analiza el comportamiento del ADC en solución aplicando aceleración angular a la solución (generalmente a través de centrifugación) para provocar que los ADC sedimenten. Generalmente, las partículas más grandes, p. ej., agregados de ADC u oligómeros autoasociados reversiblemente, sedimentan más rápidamente. Por lo tanto, la SV se puede usar para evaluar la cantidad de monómero de ADC en solución porque los agregados y oligómeros sedimentan más rápidamente que los monómeros.

En algunos casos, la SEC o SEC-MS y SV pueden dar diferentes porcentajes de monómeros para el mismo anticuerpo. Tales discrepancias pueden indicar la presencia de monómeros reversiblemente autoasociados. Además, los cambios en las características de concentración y solución típicamente reducen la RSA, pero pueden no afectar la cantidad de agregados covalentes o irreversibles presentes.

La dispersión de luz de múltiples ángulos ("MALS") se puede utilizar para determinar la cantidad de oligómeros asociados reversiblemente en una solución dada basándose en cómo los monómeros y los oligómeros de diferente orden dispersan la luz. A medida que aumenta la concentración de un anticuerpo en solución, la MALS detecta típicamente el aumento de una especie de mayor peso molecular, p. ej., un oligómero, que el monómero. Este aumento indica un aumento de la RSA.

La dispersión dinámica de la luz ("DLS") también se puede usar para determinar la existencia y grado de RSA en una solución. La DLS implica medir el cambio dependiente del tiempo en la intensidad de la luz dispersada por una especie en solución. Típicamente, los instrumentos de medición de DLS producen el diámetro hidrodinámico de una partícula. A medida que aumenta la concentración de un anticuerpo en solución, un instrumento de medición de DLS detectará una mayor presencia de especies que tienen mayores diámetros hidrodinámicos, p. ej., oligómeros. Este aumento indica un aumento de la RSA. Los instrumentos de medición de DLS también se pueden usar para determinar los coeficientes de difusión de la especie en solución. Los coeficientes de difusión disminuyen con el aumento de la concentración de anticuerpos, lo que indica la existencia de RSA.

ADC

Esta divulgación se dirige a ADC, composiciones que comprenden ADC, métodos de tratamiento, métodos de formulación de composiciones de ADC, y métodos para reducir RSA en ADC. Los ADC comprenden un anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo, conjugado con un compuesto citotóxico. En algunos ejemplos, el compuesto citotóxico se conjuga con un anticuerpo a través de un conector. En otros ejemplos, el compuesto citotóxico se une directamente al anticuerpo. Los tipos de anticuerpos, conectores y compuestos citotóxicos abarcados por esta divulgación se describen a continuación.

Anticuerpos

En la presente memoria, se divulgan composiciones que comprenden anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos. Los anticuerpos son grandes glicoproteínas que pueden existir como formas solubles y unidas a membrana y comprenden cinco isotipos naturales - IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, basándose en la identidad de sus dominios constantes de cadena pesada referidos como alfa, delta, épsilon, gamma y mu, respectivamente. Las diferentes clases de inmunoglobulinas tienen estructuras de subunidades y configuraciones tridimensionales diferentes y muy conocidas. Como reconocerá un experto en la técnica, las composiciones divulgadas pueden comprender anticuerpos policlonales y anticuerpos monoclonales. En ejemplos particulares, los anticuerpos comprenden anticuerpos tales como anticuerpos multiespecíficos tales como anticuerpos biespecíficos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados y anticuerpos humanos. Las composiciones también pueden comprender anticuerpos que tienen una o más sustituciones de aminoácidos conservativas o no conservativas. Además, las composiciones pueden comprender glicosilación modificada en uno o más residuos de aminoácidos. Tales anticuerpos modificados o fragmentos de unión se encuentran dentro del alcance de las composiciones divulgadas en la presente memoria, siempre que los anticuerpos modificados muestren la actividad biológica deseada.

Tal y como se usa en la presente memoria, un anticuerpo "humanizado" es uno en el que las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de un anticuerpo monoclonal de ratón, que forman los bucles de unión a antígeno del anticuerpo, se injertan en el marco de una molécula de anticuerpo humano o en el que los dominios variables del marco de un anticuerpo murino han sido modificados en superficie (es decir, los residuos expuestos se reemplazan con los residuos que están presentes en las posiciones correspondientes de los anticuerpos humanos). Véase, p. ej., Roguska et.al, Protein Engineering, Vol 9. No. 10, pp. 895-904, 1996. Los anticuerpos ejemplares incluyen anticuerpos monoclonales humanizados, cuyos ejemplos incluyen huMy9-6, huB4, huDS6, huMov19 y huCD37-3. Los anticuerpos ejemplares también incluyen anticuerpos de CD123 humanizados, cuyas secuencias ejemplares se describen en la publicación PCT No. WO2017004026A1 y se denominan en la presente memoria "AbX".

Los ejemplos específicos de anticuerpos de CD123 humanizados (AbX) descritos en la solicitud de PCT No. WO20l7004026Al e incluidos en las realizaciones de AbX descritas en la presente memoria son:

Anticuerpos de CD123 humanizados que incluyen las siguientes secuencias de aminoácidos de CDR de región variable de cadena pesada:

Vh CDR1: SSIMH (Secuencia de Referencia 1 - SEQ ID NO: 1)

Vh CDR2: YIKPYNDGTKYNEKFKG (Secuencia de Referencia 2 - SEQ ID NO: 2)

V<h>CDR3: EGGNDYYDTMDY (Secuencia de Referencia 3 - SEQ ID NO: 3)

Anticuerpos de CD123 humanizados que incluyen las siguientes secuencias de aminoácidos de CDR de región variable de cadena ligera:

Vl CDR1: RASQDINSYLS (Secuencia de Referencia 4 - SEQ ID NO: 4)

V<l>CDR2: RVNRLVD (Secuencia de Referencia 5 - SEQ ID NO: 5)

Vl CDR3: LQYDAFPYT (Secuencia de Referencia 6 - SEQ ID NO: 6)

Anticuerpos anti-CD123 humanizados que incluyen las siguientes secuencias de aminoácidos de región variable de cadena pesada:

AbX-,:

Q(F/V)QLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASÜYIFTSSIMHVVVRQAPGQÜLEWIÜYIKPYND GTKYNEKFKGRATLTSDRSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGGNDYYDTMDYWG QGTLVTVSS (S ec u en c ia ele R eferencia 7 - SEQ ID NO: 7}

AbX2:

Q VQL VQSG AE VKKPG A SVK VSCKASG YGFTSS J MHW V RQ A PGQGLEWMG YIK PYND GT K Y N EK FK GRVTM T RDT STSTVYM EL S SL R SEDT AVYYCA REGGXD Y Y DTM DYW G QGTLVTVSS (S ecu en cia ele R eferencia 8 - SEQ ID NO: 8}

Anticuerpos anti-CD123 humanizados que incluyen las siguientes secuencias de aminoácidos de región variable de cadena ligera:

AbX-i:

DIQM TQ5PS SLS AS VGDR VT1TOIASQDINS Y LSW F QQKPGK APKTLIYRVN RL VDGVPS

RFSGSGSGNDYTLTISSUQPEDFATYYCLQYDAFPYTFGQGI^VEIKR (S ecuencia

tle R eferencia 9 - SEQ ID NO: 9}

AbX2:

DfQMTQSPSSLS ASVCDR VTITCRA SQDl NS YLAWFQQK PGK A PK S LIY RVN R.L VSGVPS

RFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATVyCLQYD A FPYTFGQGTKVEfKR {S ecu en c ia

tle R eferencia 10 - SEQ ID NO: 10}

En otras realizaciones específicas, el anticuerpo anti-CD 123 o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende un residuo de Cys diseñado por ingeniería (p. ej., C442); un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina al menos aproximadamente un 90 %, 95 %, 99 % o 100 % idéntico a QXQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSSIMHWVRQAPGQGLEWIGYIKPYNDGTKYNEKFKGRATLTSDR STSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGGNDYYDTMDYWGQG TLVTVSS (Secuencia de Referencia 7 - SEQ ID NO: 7); y una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 90 %, 95 %, 99 % o 100 % idéntica a DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDINSYLSWFQQKPGKAPKTLIYRVNRLVDGVPS RF SGSGSGNDYTLTIS SLQPEDFATYYCLQ YD AFP YTFGQGTKVEIKR (Secuencia de Referencia 9 - SEQ ID NO: 9). En ciertas realizaciones, Xaa, el segundo residuo desde el extremo N de la Secuencia de Referencia 7 (SEQ ID NO: 7), es Phe. En otras realizaciones, Xaa es Val.

En otras realizaciones específicas, el anticuerpo anti-CD 123 o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende un residuo de Cys diseñado por ingeniería (p. ej., C442); un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina al menos aproximadamente un 90 %, 95 %, 99 % o 100 % idéntico a QVQLVQ SGA<e>V<k>KPGAS VKV SCKASGYGFTS SIMHW VRQAPGQGLEWMGYIKPYND GTKYNEKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREGGNDYYDTMDYWG QGTLVTVSS (Secuencia de Referencia 8 - SEQ ID NO: 8); y una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 90 %, 95 %, 99 % o 100 % idéntica a

DfQMTQS PSSLS ASVGDR VTITCRA SQDlN S YLAW FQQK FGK A PfCS LIY RVN R.L VSGVPS

KFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQYDAEPYTFGQGTKVEfKR (S ecuencia

ele R eferencia 10 - SEQ ID NO: 10}

Anticuerpos anti-CD123 humanizados que incluyen las siguientes secuencias de aminoácidos de cadena pesada:

AbX-i:

QíF/V )QI. VQSGAFVK K PG A S VK VSC K A SGY1FT SSIMI f W VRQAPGQGI, FWIGY1K PYND

GTK YNEKFKGRATLTSDR STS TAYME LS SLRSEDTAVYYCARE GGND’rTDTMDYWG

QGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV

HTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTC

PPCPAPELLGGP S VFLFPPKP KD TLM ]SRTPEVT C V W D V SHEDPEVKF N WYYDGVEVH

NAK TKPREEQYNSTYRW S VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISK AK GQP

REPQ VYTLPPSRDELUCNQ VSL.TCLVKGF YP SDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDG

SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (S ecu en c ia tle

R eferencia 11 - SEQ ID NO: 11}

AbXic:

Q< F/V )QI r VQSGAE VK K PG A SVKVSC K A SGY] FT S ST M\IW V RQA PÜQGI - F.W IG Y [ K P YND

GTK YNEK FKGRATLTSDR STS TAYME LS SLRSEDTAVYYCARE GGND\TDTM DYW G

QGTL VT Y S S ASTK GP S V FP L A PS S K ST SG GT A A LGC L VK D Y F PE P VT V S WN SG A LTS G V HTFP A VLQSSGLY5LSS WTVPSSSLGTQTY1CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTC PPCPAPELU<j>CPSVFLFPPKPKDTLM1SRTPEVTCVVVDVS! IEDPEVKFNWYVDG VEVIInaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqpKEPQVYILP PS RDELTK N Q VSLTCL V KGKY P SDl A VEW E SNG QPEN N YKTTPPVL DS DG

SFH-YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSIjCLSPG<(S ec u en c ia de>

R eferencia 12 - SEO ID NO: 12}

AbX2:

<QV'OL VQSOAEVKfí P í jA>s<VK VSC'K A SG Y( ÍFTSSIM H W V RQA P( jQG L EWMGYDÍPYND>GTKYNEKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREGGNDYYDTMDYWG QGTLVT VSS ASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGfTAALGCL VKD YFPEP VT VSWN SG ALTSGV

HTFP A VL QS SGL Y SLS S V VT VPS SS LGTQT YJG N V NHKPS NTK VDKK VEPKS C DK THTC PPC P APEL EÜG P S VF L FPP K PK DT L MISIU PE VTC V V VD VS H EDPE V K FN W Y V DG V E V H NAKTKPREEOYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP REP Q VYTLPP 5RDELTK NQ VSLTC L V K GFYPSD LA VEWE£NGQ PENNYKTTPP VLDS DG SFFLYSKLTVDKSRWQOGNVFSCSVMUCALHNHY FQKSLSLSPG (S ecu en cia de

R eferencia 13 - SEQ ID NO: 13}

Anticuerpos anti-CD123 humanizados que incluyen las siguientes secuencias de aminoácidos de cadena ligera:

AbXi:

DlQMTQSPSSLSASVGDRVnTCRASQDINSYLSWFQQKPGKAPKTLlYRVNRLVDGVPS RFSGSGSGNDYTLHS SEQPEDF ATY YC LQYDA FPYTFGQGTK VE1KRTVAAPSVFIFPPS DEQLK SGTAS V VCLL N NF YPREAK.VQW K VDNALQSGNSQES YTEQDSKDSTYSLS STX TLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (S ecu en cia de R eferencia 14 -SEG ID NO: 14)

AbX2:

DlQMTQSPSSLSASVGDRVTlTCRASQDlNSYLAWFQOKPGKAPKSLlYltVNIlLVSGVPS RFSOSGSGTDFTLTlSfiLQPEDFATYYCLQYDAFPYTFGQGTKVHKRTVAAPSVFrFPPS DEQLKSGTASVVCLLNNFYFREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTL TLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (S ecu en cia de R eferencia 15 -SEQ ID NO: 15}

En otras realizaciones específicas, el anticuerpo anti-CD 123 o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende un residuo de Lys diseñado por ingeniería; un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina al menos aproximadamente un 90 %, 95 %, 99 % o 100 % idéntico a Q(F/V)QLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSSIMHWVRQAPGQGLEWIGYIKPYNDGTKYNEKFKGRATLTS DRSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGGNDYYDTMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEP KSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP REPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (Secuencia de Referencia 11 - SEQ ID NO: 11); y una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 90 %, 95 %, 99 % o 100 % idéntica a DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDINSYLSWFQQKPGKAPKTLIYRVNRLVDGVPS RFSGSGSGNDYTLTISSLQPEDFATYYCLQYDAFPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPS DEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTL TLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (Secuencia de Referencia 14 - SEQ ID NO: 14). En ciertas realizaciones, Xaa, el segundo residuo desde el extremo N de la Secuencia de Referencia 11 - SEQ ID NO: 11, es Phe. En otras realizaciones, Xaa es Val.

En otras realizaciones específicas, el anticuerpo anti-CD 123 o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina al menos aproximadamente un 90 %, 95 %, 99 % o 100 % idéntico a Q(F/V)QLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTSSIMHWVRQAPGQGLEWIGYIKPYNDGTKYNEKFKGRATLTS DRSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAREGGNDYYDTMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEP KSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK SLCLSPG (Secuencia de Referencia 12 - SEQ ID NO: 12); y una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 90 %, 95 %, 99 % o 100 % idéntica a DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDINSYLSWFQQKPGKAPKTLIYRVNRLVDGVPSRFSGSGSGNDYTLTIS SLQPEDFATYYCLQYDAFPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (Secuencia de Referencia 14 - SEQ ID NO: 14). En ciertas realizaciones, Xaa, el segundo residuo desde el extremo N de la Secuencia de Referencia 12 - SEQ ID NO: 12, es Phe. En otras realizaciones, Xaa es Val.

En otras realizaciones específicas, el anticuerpo anti-CD 123 o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende un dominio variable de cadena pesada de inmunoglobulina al menos aproximadamente un 90 %, 95 %, 99 % o 100 % idéntico a QVQLVQ SGAEVKKPGAS VKV SCKASGYGFTS SIMHW VRQAPGQGLEWMGYIKPYND GTKYNEKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREGGNDYYDTMDYWG QGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV HTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTC PPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP REPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (Secuencia de Referencia 13 - SEQ ID NO: 13); y una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 90 %, 95 %, 99 % o 100 % idéntica a

DlQMTQSPSSLSASVGDRVTTTCRASQDrNSYLAWFQQKPGKAPKSLlYRVNRLVSGVPS

RFSOSGSGTDFTLTISSLQPHDFATYYCLQYDAFPyTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFlFPPS

DEQLKSGTA S VVCLLNNFYPREAK VQ WKVDN ALQSGN SQE$ VTEQDSKDST YSLSSTL

TLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVHCSFNRGEC (S ecuencia de R eferencia 15 -

SEQ ID NO: 15).

Las secuencias ejemplares para huDS6 se describen en la Patente de EE. UU. No. 7,834,155 y en las Publicaciones de Solic. de Pat. Internacional No.: WO2005/009369 y WO2007/024222. Las secuencias detalladas para huMov19 se describen en las Patentes de EE. UU. No. 8,557,966 y 8,709,432 y la Publicación de Solic. de Pat. Internacional No.: WO2011/106528. Las secuencias ejemplares para la porción de región variable de cadena pesada de huMy9-6 se describen en la Publicación de Patente de EE. UU. No. 20060177455. Las secuencias ejemplares para la porción de región variable de cadena ligera de huMy9-6 se conocen en la técnica y se describen en las Patentes de EE. UU. No. 7,557,189, 7,342,110, 8,119,787 y 8,337,855. Las secuencias ejemplares para huCD37-3 se describen en la Patente de EE. UU. No. 8,765,917 y la Publicación de Solic. de Pat. Internacional No. WO2011/112978. Las secuencias ejemplares para huB4 se describen en la Publicación de Solic. de Pat.

Internacional No. WO2012/156455.

Los anticuerpos ejemplares adicionales incluyen anticuerpos que se dirigen a antígenos específicos. Los ejemplos incluyen anticuerpos que se dirigen a CD33, CD19, CD37, CA6 o FOLR1. Además, también se incluyen en la presente memoria anticuerpos que se dirigen a CD123.

Generalmente, la expresión "anticuerpo humanizado" se refiere a formas de anticuerpos no humanos (p. ej., murinos) que son cadenas de inmunoglobulina específicas, inmunoglobulinas quiméricas o fragmentos de las mismas que contienen secuencias no humanas mínimas (p. ej., murinas). Típicamente, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas en las que se reemplazan residuos de la región determinante de la complementariedad (CDR) por residuos de la CDR de una especie no humana (p. ej., ratón, rata, conejo, hámster) que tienen la capacidad, afinidad y especificidad deseadas (Jones et al, Nature 321:522-525, 1986; Riechmann et al, Nature 332:323-327, 1988; Verhoeyen et al, Science 239:1534-1536, 1988).

Los anticuerpos pueden humanizarse usando una variedad de otras técnicas que incluyen injerto de CDR (EP 0 239400; w O 91/09967; Pat. de EE. UU. No. 5,530,101; y 5,585,089), revestimiento o modificación en superficie (EP 0592 106; EP 0519596; Padlan E. A., 1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498; Studnicka G. M. et al., 1994, Protein Engineering 7(6):805-814; Roguska M. A. et al., 1994, PNAS 91:969-973), e intercambio de cadenas (Pat. de EE. UU. No. 5,565,332). Los anticuerpos humanos se pueden preparar mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica incluyendo métodos de presentación en fagos. Véanse también las Patentes de EE. UU. No. 4,444,887, 4,716,111, 5,545,806 y 5,814,318 y las Publicaciones de Solic. de Pat. Internacional No.: WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, y WO 91/10741.

En algunos casos, se reemplazan los residuos de la región marco (FR) Fv de una inmunoglobulina humana por los residuos correspondientes en un anticuerpo de una especie no humana que tienen la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. El anticuerpo humanizado se puede modificar adicionalmente mediante la sustitución de residuos adicionales en la región marco Fv y/o en los residuos no humanos reemplazados para refinar y optimizar la especificidad, afinidad y/o capacidad del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno y típicamente, dos o tres dominios variables que contienen todas, o sustancialmente todas, las regiones CDR que corresponden a la inmunoglobulina no humana mientras que todas, o sustancialmente todas, las regiones FR son aquellas de una secuencia de inmunoglobulina humana de consenso. El anticuerpo humanizado también puede comprender al menos una parte de una región o dominio constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Se describen ejemplos de métodos utilizados para generar anticuerpos humanizados en las Pat. de EE. UU. 5,225,539 y 5,639,641, Roguska et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(3):969-973, 1994; y Roguska et al, Protein Eng. 9(10):895-904, 1996. En algunos ejemplos, un "anticuerpo humanizado" es un anticuerpo modificado en superficie. En algunos ejemplos, un "anticuerpo humanizado" es un anticuerpo con injerto de<c>D<r>.

Además, el anticuerpo puede ser un anticuerpo quimérico.

Las composiciones divulgadas pueden comprender fragmentos de unión a antígeno tales como fragmentos de anticuerpo (tales como fragmentos Fab, Fab', F(ab)2 y Fv) o mutantes de Fv de cadena única (scFv). En otros ejemplos, los fragmentos de unión se unen a una proteína, péptido u oligopéptido separados para formar una proteína de fusión. En ciertos ejemplos, la proteína de fusión comprende una porción de determinación de antígeno de un anticuerpo fusionada a uno o más péptidos, oligopéptidos o polipéptidos.

Un experto en la técnica apreciará que la selección de un anticuerpo apropiado dependerá de la población celular a la que se dirige. A este respecto, el tipo y el número de moléculas de la superficie celular (es decir, antígenos) que se expresan selectivamente en una población celular particular (típicamente, una población celular enferma) informarán de la selección de un anticuerpo apropiado para su uso en las composiciones divulgadas. Los perfiles de expresión en la superficie celular son conocidos para una amplia variedad de tipos celulares, incluyendo tipos de células tumorales, o, si se desconocen, pueden determinarse usando técnicas de biología molecular e histoquímica de rutina.

Como se indica en la presente memoria, los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales. Los anticuerpos monoclonales se producen típicamente por un único clon de linfocitos B ("células B"). Los anticuerpos monoclonales se pueden obtener usando una variedad de técnicas conocidas por los expertos en la técnica, incluyendo tecnología de hibridoma estándar (véase, p. ej., Kohler y Milstein, Eur. J. Immunol., 5, 511-519 (1976), Harlow y Lane (eds.), Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988), y C. A. Janeway et al. (eds.), Immunobiology, 5a Ed., Garland Publishing, Nueva York, NY (2001)). Brevemente, el método de hibridoma para producir anticuerpos monoclonales suele implicar inyectar a cualquier animal adecuado, típicamente un ratón, un antígeno (es decir, un "inmunógeno"). El animal es posteriormente sacrificado, y las células B aisladas de su bazo se fusionan con células de mieloma humano. Se produce una célula híbrida (es decir, un "hibridoma"), que prolifera indefinidamente y secreta continuamente altos títulos de un anticuerpo con la especificidad deseada in vitro. Cualquier método apropiado conocido en la técnica se puede usar para identificar células de hibridoma que producen un anticuerpo con la especificidad deseada. Tales métodos incluyen, por ejemplo, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA), análisis de transferencia Western y radioinmunoensayo. La población de hibridomas se criba para aislar clones individuales, cada uno de los cuales secreta una sola especie de anticuerpo frente al antígeno. Dado que cada hibridoma es un clon derivado de la fusión con una única célula B, todas las moléculas de anticuerpo que produce son idénticas en cuanto a su estructura, inclusive sus sitios de unión a antígeno y su isotipo. Los anticuerpos monoclonales también se pueden generar usando otras técnicas adecuadas que incluyen tecnología de EBV-hibridoma (véase, p. ej., Haskard y Archer, J. Immunol. Methods, 74(2), 361-67 (1984), y Roder et al., Methods Enzymol., 121, 140-67 (1986)), o sistemas de expresión de vectores de bacteriófagos (véase, p. ej., Huse et al., Science, 246, 1275-81 (1989)). Para preparar fragmentos de anticuerpos monoclonales, típicamente se emplean métodos recombinantes.

El anticuerpo monoclonal puede aislarse de o producirse en cualquier animal adecuado. En algunos ejemplos, el anticuerpo se produce en un mamífero. En algunos ejemplos, el mamífero es un ratón. En algunos casos el mamífero es un ser humano. Los métodos para producir un anticuerpo en ratones son bien conocidos por los expertos en la técnica y se describen en la presente memoria. Con respecto a los anticuerpos humanos, un experto en la técnica apreciará que los anticuerpos policlonales pueden aislarse de los sueros de sujetos humanos vacunados o inmunizados con un antígeno apropiado. De manera alternativa, se pueden generar anticuerpos humanos mediante la adaptación de técnicas conocidas para producir anticuerpos humanos en animales que no son humanos, como ratones (véanse, p. ej., las Patentes de EE. UU. 5,545,806, 5,569,825 y 5,714,352, y la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. No. 2002/0197266 A1).

Aunque son efectivos para su uso terapéutico en los seres humanos, los anticuerpos humanos, en especial los anticuerpos monoclonales humanos, son normalmente más difíciles de generar que los anticuerpos monoclonales de ratón. Los anticuerpos monoclonales de ratón, sin embargo, inducen una rápida respuesta de anticuerpos del huésped cuando se administran a los seres humanos, lo que puede reducir el potencial diagnóstico o terapéutico de un ADC. Para evitar estas complicaciones, un anticuerpo monoclonal preferiblemente no es reconocido como "extraño" por el sistema inmune humano. Con este fin, se puede utilizar la presentación en fagos para generar el anticuerpo. A este respecto, pueden generarse bibliotecas de fagos que codifican dominios variables de unión a antígeno (V) de anticuerpos usando técnicas estándar de biología molecular y ADN recombinante (véase, p. ej., Sambrook et al. (eds.), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (2001)). Los fagos que codifican una región variable con la especificidad deseada se seleccionan por la unión específica al antígeno deseado, y se reconstituye un anticuerpo humano completo que comprende el dominio variable seleccionado. Las secuencias de ácido nucleico que codifican el anticuerpo reconstituido se introducen en una línea celular adecuada, tal como una célula de mieloma utilizada para la producción de hibridoma, de manera que los anticuerpos humanos que tienen las características de anticuerpos monoclonales se secretan por la célula (véase, p. ej., Janeway et al., supra, Huse et al., supra, y Patente de e E. UU. 6,265,150). Alternativamente, pueden generarse anticuerpos monoclonales a partir de ratones que son transgénicos para genes específicos de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera humana. Tales métodos son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en las Patentes de EE. UU. 5,545,806 y 5,569,825 y Janeway et al., supra. En algunos ejemplos, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado. Debido a la similitud de los marcos de anticuerpos de ratón y humanos, se acepta generalmente en la técnica que este enfoque produce un anticuerpo monoclonal que es antigénicamente idéntico a un anticuerpo humano, pero que se une al mismo antígeno que el anticuerpo monoclonal de ratón del que se derivaron las secuencias de CDR. Los métodos para generar anticuerpos humanizados se conocen en la técnica y se describen en detalle, por ejemplo, en Janeway et al., supra, Patentes de EE. UU. 5,225,539, 5,585,089 y 5,693,761, Patente Europea No. 0239400 B1 y Patente de Reino Unido No. 2188638. Los anticuerpos humanizados también se pueden generar usando la tecnología de modificación en superficie de anticuerpos descrita en la Patente de EE. UU. 5,639,641, Pedersen et al., J. Mol. Biol., 235, 959-973 (1994), Roguska et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(3):969-973, 1994; y Roguska et al, Protein Eng. 9(10):895-904, 1996.

Los fragmentos de anticuerpo que tienen al menos un sitio de unión a antígeno, y por lo tanto reconocen y se unen al menos a un antígeno o receptor presente en la superficie de una célula diana, también están dentro del alcance de esta divulgación. A este respecto, la escisión proteolítica de una molécula de anticuerpo intacta puede producir una variedad de fragmentos de anticuerpo que retienen la capacidad de reconocer y unirse a antígenos. Por ejemplo, la digestión limitada de una molécula de anticuerpo con la proteasa papaína produce típicamente tres fragmentos, dos de los cuales son idénticos y se denominan fragmentos Fab, ya que retienen la actividad de unión a antígeno de la molécula de anticuerpo parental. La escisión de una molécula de anticuerpo con la enzima pepsina normalmente produce dos fragmentos de anticuerpo, uno de los cuales retiene ambos brazos de unión a antígeno de la molécula de anticuerpo, y por lo tanto se denomina fragmento F(ab')2. Un fragmento de anticuerpo de fragmento de región variable de cadena única (sFv), que consiste en un fragmento Fab truncado que comprende el dominio variable (V) de una cadena pesada de anticuerpo unido a un dominio V de una cadena de anticuerpo ligera a través de un péptido sintético, se puede generar usando técnicas de tecnología de ADN recombinante de rutina (véase, p. ej., Janeway et al., supra). De manera similar, pueden prepararse fragmentos de región variable estabilizados con disulfuro (dsFv) mediante tecnología de ADN recombinante (véase, p. ej., Reiter et al., Protein Engineering, 7, 697-704 (1994)). Los fragmentos de anticuerpo de la presente divulgación, sin embargo, no se limitan a estos tipos ejemplares de fragmentos de anticuerpo. Puede emplearse cualquier fragmento de anticuerpo adecuado que reconozca y se una a un receptor o antígeno de la superficie celular deseado. La unión anticuerpoantígeno se puede ensayar usando cualquier método adecuado conocido en la técnica, tal como, por ejemplo, radioinmunoensayo (RIA), ELISA, transferencia Western, inmunoprecipitación y ensayos de inhibición competitiva (véase, p. ej., Janeway et al., supra, y la Publicación de Solicitud de Patente de EE. UU. No. 2002/0197266 A1).

Conectores

Las composiciones divulgadas en la presente memoria comprenden anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos unidos a un conector. Puede usarse cualquier conector adecuado con los ADC de la presente divulgación siempre que el conector no impida que el anticuerpo se una a su diana o elimine la citotoxicidad de un compuesto citotóxico. Típicamente, el conector es sustancialmente inerte en las condiciones para la unión de dos grupos. En algunas realizaciones, un resto conector comprende dos grupos reactivos, de modo que se pueda hacer reaccionar primero un grupo reactivo con el compuesto citotóxico para proporcionar un compuesto que lleva el resto conector y un segundo grupo reactivo, que después puede reaccionar con un anticuerpo. Alternativamente, un grupo reactivo del resto conector puede hacerse reaccionar primero con un anticuerpo para proporcionar un anticuerpo y un resto conector y un segundo grupo reactivo, que puede reaccionar después con un compuesto citotóxico.

Los conectores ejemplares incluyen, pero no se limitan a, conectores de disulfuro, conectores de tioéter, conectores unidos a amida, conectores lábiles a peptidasa, conectores lábiles a ácido, y conectores lábiles a esterasa. En algunos ejemplos, el conector es escindible. Los conectores escindibles ejemplares incluyen, pero no se limitan a, 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo (SPDP), 4-(2-piridilditio)butanoato de N-succinimidilo (SPDB), 4-(2-piridilditio)2-sulfobutanoato de N-succinimidilo (sulfo-SPDB), 4-(2-piridilditio)pentanoato de N-succinimidilo (SPP), o 4-metil-4-[2-(5-nitro-piridil)-ditio]pentanoato de N-succinimidilo (SMNP). En algunos ejemplos, el conector no es escindible. Los conectores no escindibles ejemplares incluyen, pero no se limitan a, 2-iminotiolano, anhídrido acetilsuccínico, y 4-(maleimidometil)ciclohexanocarboxilato de succinimidilo (SMCC). Otros conectores ejemplares, tales como CX1-1 (como se describe en la Publicación de Pat. de EE. UU. No. US20120253021) y el anhídrido acetilsuccínico pueden usarse como conectores escindibles o no escindibles.

En algunos ejemplos, el resto de unión puede contener un enlace químico que permite la liberación del compuesto citotóxico en un sitio particular. Los enlaces químicos adecuados son conocidos en la técnica e incluyen enlaces disulfuro, enlaces tioéter, enlaces lábiles frente a ácido, enlaces fotolábiles, enlaces lábiles frente a peptidasa y enlaces lábiles a esterasa (véanse, por ejemplo, las Patentes de EE. UU. 5,208,020; 5,475,092; 6,441,163; 6,716,821; 6,913,748; 7,276,497; 7,276,499; 7,368,565; 7,388,026 y 7,414,073). Otros conectores adecuados incluyen conectores no escindibles, tales como los que se describen detalladamente en la Publicación de EE. UU. número 20050169933, o conectores cargados o conectores hidrófilos y se describen en US 2009/0274713, US 2010/01293140 y WO 2009/134976.

Compuestos citotóxicos

Los ejemplos descritos en esta divulgación están dirigidos a varios compuestos citotóxicos. Estos compuestos citotóxicos pueden inducir citotoxicidad en células. Cuando se acoplan a cualquiera de los anticuerpos descritos anteriormente para formar los ADC de esta divulgación, estos compuestos citotóxicos pueden suministrarse directamente a las células diana. Como resultado de los mecanismos de aclaramiento farmacológico normales, un anticuerpo empleado en un ADC entra en contacto y se une a las células diana solo en cantidades limitadas. Por lo tanto, el agente citotóxico empleado en el conjugado debe ser altamente citotóxico de manera que se produzca la destrucción celular suficiente para provocar un efecto terapéutico.

Los compuestos citotóxicos de esta divulgación comprenden benzodiazepinas. En algunos ejemplos, el compuesto citotóxico es una pirrolobenzodiazepina. En algunos ejemplos, el compuesto citotóxico es una indolinobenzodiazepina. En algunos ejemplos, el compuesto citotóxico es un compuesto de la Tabla 1. DGN462 se describe, por ejemplo, en la Patente de EE. UU. No. 8,765,740. El compuesto D3 se describe, por ejemplo, en las Patentes de E<e>. UU. 8,426,402, 8,809,320 y 8,802,667. Los compuestos D1, D2 y D4 se describen, por ejemplo, en las Solic. Provisionales de EE. UU. con No. de Ser. 14/483,604 y 14/483,520, respectivamente, y "Antibody-Drug Conjugates (ADCs) of Indolino-Benzodiazepine DNA-Alkylating Agents", 2015 AACR, número de resumen 652.

Las benzodiazepinas, incluyendo los compuestos en la Tabla 1, se unen a anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos con los conectores descritos en la presente memoria. En algunos ejemplos de los ADC, las benzodiazepinas pueden estar unidas por Cys. En otros ejemplos, las benzodiazepinas pueden estar unidas por Ser.

Esta divulgación también se dirige a variaciones de los compuestos de la Tabla 1, tales como la modificación de un compuesto de la Tabla 1 por sulfonación. Otras variaciones de los compuestos de la Tabla 1 son fácilmente evidentes para los expertos en la técnica. Tales variaciones están abarcadas por esta divulgación.

RSA aumentada en los ADC

En la presente memoria, se muestra que los ADC que comprenden benzodiazepinas exhiben RSA incrementadas. Se cree que el aumento de RSA resulta de las interacciones hidrófobas incrementadas de las benzodiazepinas que dan lugar a interacciones intermoleculares reversibles adicionales. Como se demuestra a continuación en los Ejemplos, un aumento en la carga de fármaco (la "DAR" o relación fármaco a anticuerpo) da como resultado un aumento de RSA. Las composiciones con DAR superiores tienen mayores cantidades de benzodiazepinas por anticuerpo. Las benzodiazepinas son hidrófobas e insolubles y comprenden múltiples anillos aromáticos. Por lo tanto, se cree, las benzodiazepinas interaccionan con otros componentes en un ADC. Estas interacciones intermoleculares reversibles adicionales dan como resultado una RSA incrementada para los ADC divulgados en la presente memoria. Por lo tanto, la cantidad de RSA aumenta a medida que aumenta la carga de fármaco. Como resultado, es aún más difícil desarrollar formulaciones farmacéuticas para los ADC que comprenden moléculas hidrófobas (p. ej., benzodiazepinas o indolinobenzodiazepinasj de esta divulgación.

Composiciones con RSA reducida

Se ha descubierto sorprendentemente que ciertas moléculas hidrófobas pequeñas inhiben o reducen RSA en composiciones que comprenden los ADC de esta divulgación. Estas moléculas pequeñas se encuentran en dos clases: (1) aminoácidos con cadenas laterales hidrófobas, incluyendo prolina, alanina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, triptófano, tirosina y valina; y (2) betaínas, pequeñas moléculas neutras con un grupo funcional catiónico cargado positivamente y un grupo funcional cargado negativamente. El grupo funcional catiónico y el grupo funcional cargado negativamente no necesitan ser adyacentes. Los grupos funcionales catiónicos incluyen iones onio tales como amonio cuaternario y fosfonio cuaternario. Los grupos funcionales cargados negativamente incluyen carboxilato, sulfito y fosfito. Una betaína ejemplar es trimetilglicina. Históricamente, el término betaína se refería a trimetilglicina. Por lo tanto, dependiendo del contexto como se usa en la presente memoria, el término "betaína" puede referirse a betaínas en general o a trimetilglicina específicamente.

Un ejemplo adicional de esta divulgación se dirige a una composición que comprende: (a) un ADC que comprende una benzodiazepina; y (b) una molécula hidrófoba pequeña seleccionada del grupo que consiste en betaínas y/o aminoácidos con cadenas laterales hidrófobas. En algunos ejemplos, la molécula hidrófoba pequeña es un aminoácido con una cadena lateral hidrófoba. En algunos ejemplos, la molécula hidrófoba pequeña es una betaína. En algunos ejemplos, la molécula hidrófoba pequeña es trimetilglicina. En algunos ejemplos, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en huMy9-6, huB4, huDS6, huMov19 y huCD37-3. En otros ejemplos, el anticuerpo es un anticuerpo de CD123 humanizado. En ciertos ejemplos, el anticuerpo es AbX. En algunos ejemplos, la benzodiazepina es una indolinobenzodiazepina. En algunos ejemplos, la benzodiazepina es un compuesto de la Tabla 1. En algunos ejemplos, el ADC es un ADC de la Tabla 2.

Tabla 2

En donde, en la Tabla 2, r es un número entero de 1 a 10; Ab-NH es un anticuerpo unido covalentemente al compuesto a través de una lisina; Ser indica un anticuerpo unido al compuesto a través de una serina N-terminal; Cys indica un anticuerpo unido al compuesto a través de una cisteína; y M es H+, Na+, K+, o cualquier catión farmacéuticamente aceptable.

Esta divulgación también se dirige a otras variaciones en el conector de los ADC en la Tabla 2, que son fácilmente evidentes para aquellos con experiencia ordinaria en la técnica. Por ejemplo, el grupo SO3 M mostrado en el conector puede sustituirse con 'H' para obtener un ADC en donde el anticuerpo Ab se une a través del conector SPDB a los compuestos citotóxicos D1, D1(a), D2, D2(a), DGN462, DGN462(a), D3, D3(a), D4, D4(a), D5, D5(a), D6 , y D6(a), respectivamente. Tales variaciones y variaciones similares están abarcadas por esta divulgación. En algunos ejemplos, la RSA se elimina en las composiciones divulgadas. En algunos ejemplos, la RSA disminuye en aproximadamente un 90 % a un 100 % en las composiciones divulgadas. En ciertos ejemplos, la RSA disminuye en aproximadamente un 80 % a aproximadamente un 90 % en las composiciones divulgadas. En algunos ejemplos, la RSA disminuye en aproximadamente un 70 % a aproximadamente un 80 % en las composiciones divulgadas. En ejemplos adicionales, la RSA disminuye en aproximadamente un 60 % a aproximadamente un 70 % en las composiciones divulgadas. En más ejemplos adicionales, la RSA disminuye en aproximadamente un 50 % a aproximadamente un 60 % en las composiciones divulgadas. En más ejemplos adicionales, la RSA disminuye en aproximadamente un 40 % a aproximadamente un 50 % en las composiciones divulgadas. En algunos ejemplos, la RSA disminuye en aproximadamente un 30 % a aproximadamente un 40 % en las composiciones divulgadas. Formulaciones anteriores para anticuerpos o ADC se han tamponado a un pH de aproximadamente 5-6,5 con el fin de mantener la estructura y estabilidad del anticuerpo o el ADC. Sorprendentemente, hemos descubierto que el pH puede afectar la cantidad y el grado de la RSA en una solución y, específicamente, que un pH más bajo de lo esperado de aproximadamente 4-4,5, puede reducir la RSA para un ADC. Otro ejemplo de esta divulgación se dirige a composiciones que comprenden ADC que comprenden una benzodiazepina, en donde la composición tiene un pH bajo. Se cree que un pH más bajo permite una mayor cantidad de iones H+ que pueden interaccionar de manera no covalente con los anticuerpos en solución e inhibir la capacidad de los anticuerpos para formar especies oligoméricas a través de interacciones intermoleculares, reduciendo así la RSA. La composición tiene un pH entre aproximadamente 4,0 y aproximadamente 4,5. Otro ejemplo de esta divulgación se dirige a una composición que tiene un pH entre aproximadamente 4,0 y aproximadamente 4,5 y que comprende una betaína y un ADC que comprende una benzodiazepina. En algunos ejemplos, la betaína es trimetilglicina. Otro ejemplo de esta divulgación se dirige a una composición que tiene un pH entre 4,0 y 4,5 y que comprende un aminoácido con una cadena lateral hidrófoba y un ADC que comprende una benzodiazepina. En algunos ejemplos, la benzodiazepina es un compuesto de la Tabla 1. En algunos ejemplos, el ADC es un ADC de la Tabla 2.

Las composiciones de esta divulgación se formulan para ser aceptables para uso farmacéutico, tal como, por ejemplo, la administración a un ser humano que lo necesite. En algunas realizaciones, el ADC se formula en una composición que comprende un vehículo fisiológicamente aceptable (p. ej., excipiente o diluyente). Los vehículos fisiológicamente aceptables son bien conocidos y están fácilmente disponibles, e incluyen agentes tamponantes, antioxidantes, bacteriostáticos, sales y solutos que hacen que la composición sea isotónica con la sangre u otro fluido corporal del paciente humano, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión, solubilizantes, agentes espesantes, estabilizantes (p. ej., tensioactivos) y conservantes. La elección del vehículo estará determinada, al menos en parte, por la ubicación del tejido y/o células diana, y el método particular utilizado para administrar la composición. Los ejemplos de vehículos y excipientes adecuados para su uso en formulaciones farmacéuticas de ADC se describen, por ejemplo, en las Solicitudes de Patente Internacional (PCT) No. WO 00/02587, WO 02/060955, y WO 02/092127, y Ghetie et al., J. Immunol. Methods, 112, 267-277 (1988).

Pueden usarse agentes tamponantes farmacéuticamente aceptables en conexión con las composiciones divulgadas. El succinato se usa como un agente tamponante en conexión con las composiciones reivindicadas en la presente memoria. En otros ejemplos, el citrato se puede usar como un agente tamponante en conexión con las composiciones divulgadas. En algunos ejemplos, se puede usar bisulfito de sodio además de succinato. Otros agentes tamponantes ejemplares que se pueden usar con las composiciones divulgadas incluyen acetato y fosfato. El agente tamponante puede estar presente en composiciones ejemplares de esta divulgación en cualquier concentración adecuada, siempre que se logre suficiente estabilidad de la composición en las condiciones deseadas. En la formulación reivindicada en la presente memoria, la concentración del agente tamponante en la composición es 10 mM. El agente tamponante es succinato de sodio. El agente tamponante está típicamente presente en las composiciones ejemplares divulgadas de manera que el pH se mantiene dentro de un rango deseado.

Las composiciones de esta divulgación también contienen opcionalmente un tensioactivo. Se puede usar cualquier tensioactivo adecuado. Los tensioactivos adecuados son bien conocidos por los expertos en la técnica. En algunas realizaciones, el tensioactivo es un polisorbato. En algunas realizaciones, el tensioactivo es polisorbato 20 o polisorbato 80. El tensioactivo puede estar presente en las composiciones de esta divulgación en cualquier concentración adecuada, siempre que se logre suficiente estabilidad de la composición en las condiciones deseadas. A este respecto, la concentración del tensioactivo en la composición es de aproximadamente el 0,002 % a aproximadamente el 0,1 % peso/vol (p. ej., aproximadamente el 0,002-0,01 %, aproximadamente el 0,005 0,02 %, o aproximadamente el 0,01-0,1 % peso/vol) del volumen total de la composición. En algunas realizaciones, la concentración del tensioactivo en la composición es de aproximadamente el 0,005-0,02 % peso/vol (p. ej., aproximadamente el 0,01 % peso/vol) del volumen total de la composición.

La composición de esta divulgación puede estabilizarse además mediante la adición de azúcar. En la formulación reivindicada, el azúcar es trehalosa. La composición también puede comprender además agentes de carga. En algunas realizaciones, el agente de carga es manitol. En otras realizaciones, el agente de carga es glicina.

Las composiciones de esta divulgación pueden liofilizarse. La liofilización se refiere al secado por congelación bajo vacío. La liofilización se logra típicamente congelando una formulación particular de manera que los solutos se separan del disolvente o disolventes. El disolvente se elimina entonces por sublimación (es decir,secado primario) y,a continuación, por desorción (es decir, secado secundario). Cuando las composiciones de esta divulgación se liofilizan y luego se reconstituyen, la RSA aún se reduce o inhibe. Por lo tanto, aunque la molécula hidrófoba pequeña se puede añadir a las composiciones antes de la liofilización, los beneficios de la RSA reducida o inhibida todavía se realizan en las composiciones que se reconstituyen después de la liofilización.

Con el fin de evitar la degradación de la composición durante la congelación y el secado, la composición liofilizada opcionalmente comprende además un crioprotector. En algunas realizaciones, el crioprotector es un crioprotector amorfo. El término "crioprotector", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a un excipiente que protege moléculas inestables durante la congelación. Los crioprotectores adecuados para su uso en las composiciones de esta divulgación son conocidos por los expertos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, glicerol, dimetilsulfóxido (DMSO), polietilenglicol (PEG), dextrano, glucosa, trehalosa y sacarosa. En algunas realizaciones, el crioprotector es sacarosa. El crioprotector puede estar presente en la composición liofilizada en cualquier cantidad adecuada. En algunas realizaciones, la composición liofilizada comprende de aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 5 mg (p. ej., de aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 2 mg) del crioprotector por mg del conjugado (p. ej., aproximadamente 0,8 mg de crioprotector por mg del conjugado. En algunas realizaciones, la composición liofilizada comprende aproximadamente 2 mg de crioprotector por mg del conjugado. En algunas realizaciones, la composición liofilizada comprende aproximadamente 4 mg de crioprotector por mg del conjugado. En algunas realizaciones, el crioprotector es sacarosa y la composición liofilizada comprende aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 2 mg (p. ej., aproximadamente 1 mg) de sacarosa por mg del conjugado

Los métodos de liofilización son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Wang, W., Int. J. Pharm., 203, 1-60 (2000). Por ejemplo, las composiciones liofilizadas de esta divulgación pueden producirse usando un ciclo de liofilización que comprende las siguientes etapas: (1) preenfriamiento a una temperatura de almacenamiento de 4 °C y presión de la cámara ambiental durante 2,5 horas, (2) congelación a una temperatura de almacenamiento de -50 °C y presión de la cámara ambiental durante 14 horas, (3) recristalización de glicina a una temperatura de almacenamiento de -20 °C y presión de la cámara ambiental durante 6 horas, (4) recongelación a una temperatura de almacenamiento de -50 °C y presión de la cámara ambiental durante 16 horas, (5) secado primario a una temperatura de almacenamiento de -13 °C y 100 mTorr de presión durante 24 horas, (6) secado secundario a una temperatura de almacenamiento de 24 °C y 100 mTorr de presión durante 10 horas, y (7) fase de tope a una temperatura de almacenamiento de 24 °C y presión de la cámara ambiental. Sin embargo, las composiciones liofilizadas de esta divulgación no se limitan a composiciones producidas por el método descrito anteriormente. De hecho, puede usarse cualquier método de liofilización adecuado para producir las composiciones liofilizadas de esta divulgación, y será evidente para los expertos en la técnica que los parámetros de liofilización elegidos (p. ej., tiempos de secado) variarán dependiendo de una variedad de factores, incluyendo el volumen de la solución a liofilizar.

Las composiciones de esta divulgación son ventajosas sobre las formulaciones de la técnica anterior por muchas razones. El aumento en la cantidad de monómero da como resultado composiciones de potencia incrementada. La eficacia aumenta porque cada composición proporciona un mayor efecto terapéutico por dosis. Esto es ventajoso porque reduce el número de dosis que necesitan los sujetos.

Además de la potencia incrementada, las composiciones de esta divulgación también disminuyen la toxicidad, mejorando así la seguridad del paciente. Las composiciones de esta divulgación suministran más de los compuestos citotóxicos a los sitios diana en virtud de la RSA reducida, reduciendo así la cantidad de compuestos citotóxicos que pueden interaccionar con sitios no diana. Además, la RSA reducida disminuye la viscosidad de una solución, mejorando así la eficacia de algunos modos de administración debido a que las composiciones divulgadas son menos propensas a obstruir u obstaculizar el émbolo de una jeringa.

Métodos de tratamiento

Las referencias a los métodos de tratamiento por terapia en la siguiente descripción deben interpretarse como referencias a composiciones y formulaciones de las reivindicaciones adjuntas para su uso en tales métodos. Esta divulgación también se dirige a métodos ejemplares para tratar cáncer en un sujeto que comprenden administrar al sujeto una composición que comprende (a) una cantidad efectiva de un ADC que comprende una benzodiazepina y (b) una molécula hidrófoba pequeña seleccionada del grupo que consiste en betaínas y aminoácidos con cadenas laterales hidrófobas, en donde el ADC es citotóxico en una o más células, tratando así el cáncer. En las formulaciones reivindicadas, la composición tiene un pH de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 4,5. Las descripciones de los ADC que comprenden una benzodiazepina, las moléculas hidrófobas pequeñas, excipientes (p. ej., agentes tamponantes, tensioactivos, azúcares, etc.), y otros componentes descritos en la presente memoria también son aplicables a las composiciones que se utilizan en los métodos de tratamiento.

Aunque se puede usar cualquier medio adecuado para administrar la composición a un sujeto, en algunas realizaciones, las composiciones divulgadas se administran a un ser humano mediante inyección. En algunas realizaciones, las composiciones divulgadas se administran a un ser humano por infusión. Tal y como se usa en la presente memoria, el término "inyección" se refiere a la introducción forzada de las composiciones divulgadas en un tejido diana del ser humano. Tal y como se usa en la presente memoria, el término "infusión" se refiere a la introducción de las composiciones divulgadas en un tejido, p. ej., una vena, del ser humano. La composición puede administrarse al ser humano por cualquier ruta adecuada. En algunas realizaciones, las composiciones se administran al ser humano por la ruta intravenosa o intraperitoneal. En algunas realizaciones, la administración es intratumoral. Cuando la composición se administra mediante inyección, se puede usar cualquier dispositivo de inyección adecuado para administrar la composición. Por ejemplo, la jeringa médica común se puede usar para inyectar directamente la composición en un tumor subcutáneo. Alternativamente, la composición puede aplicarse tópicamente al tumor bañando el tumor en la composición líquida divulgada. Asimismo, el tumor puede perfundirse con la composición divulgada durante un período de tiempo utilizando cualquier dispositivo de administración adecuado, p. ej., un catéter. Se pueden usar otras rutas de administración para administrar la composición al ser humano. Algunas rutas pueden proporcionar una reacción más inmediata y más efectiva que otras rutas. En algunas realizaciones, la composición se administra a una superficie del sujeto seleccionada del grupo de superficies dérmicas y mucosales y combinaciones de las mismas. Por ejemplo, las composiciones divulgadas pueden aplicarse o instilarse en cavidades corporales, absorberse a través de la piel, inhalarse o administrarse por la ruta parenteral mediante, por ejemplo, administración intramuscular o intraarterial. En algunas realizaciones, las composiciones divulgadas administradas parenteralmente a un ser humano se dirigen específicamente a células particulares, p. ej., células cancerosas.

Métodos de Formulación

Esta divulgación también se dirige a métodos de formulación, que comprenden proporcionar un ADC que comprende una benzodiazepina en una solución acuosa, añadir a la solución acuosa que comprende el ADC una molécula hidrófoba pequeña seleccionada del grupo que consiste en betaínas y aminoácidos con cadenas laterales hidrófobas. En algunos ejemplos, el método comprende además ajustar el pH de la solución acuosa entre aproximadamente 4,0 y aproximadamente 4,5. En algunos ejemplos, el método comprende además liofilizar la solución. En algunos ejemplos, el método comprende además reconstituir la composición liofilizada.

En ejemplos adicionales del método, la adición de una molécula hidrófoba pequeña reduce la RSA en la solución acuosa en aproximadamente un 30 % a aproximadamente un 40 %. En algunos ejemplos, la adición de una molécula hidrófoba pequeña reduce la RSA en la solución acuosa en aproximadamente un 40 % a aproximadamente un 50 %. En ciertos ejemplos, la adición de una molécula hidrófoba pequeña reduce la RSA en la solución acuosa en aproximadamente un 50 % a aproximadamente un 60 %. En ejemplos adicionales, la adición de una molécula hidrófoba pequeña reduce la RSA en la solución acuosa en aproximadamente un 60 % a aproximadamente un 70 %. En más ejemplos adicionales, la adición de una molécula hidrófoba pequeña reduce la RSA en la solución acuosa en aproximadamente un 70 % a aproximadamente un 80 %. En más ejemplos adicionales, la adición de una molécula hidrófoba pequeña reduce la RSA en la solución acuosa en aproximadamente un 80 % a aproximadamente un 90 %. En algunos ejemplos, la adición de una molécula hidrófoba pequeña reduce la r Sa en la solución acuosa en aproximadamente un 90 % a un 100 %. En más ejemplos adicionales, la adición de una molécula hidrófoba pequeña elimina la RSA en la solución acuosa. En algunos ejemplos, la cantidad de RSA se mide por dispersión de luz de múltiples ángulos. En algunos ejemplos adicionales, la cantidad de RSA se mide por dispersión dinámica de luz.

En algunos ejemplos, el método comprende además liofilizar la solución acuosa, obteniendo así una composición liofilizada. En ciertos ejemplos, el método comprende además reconstituir la composición liofilizada, creando así una composición liofilizada reconstituida. En ejemplos adicionales del método, la adición de una molécula hidrófoba pequeña reduce la RSA en la composición liofilizada reconstituida en aproximadamente un 30 % a aproximadamente un 40 %. En algunos ejemplos, la adición de una molécula hidrófoba pequeña reduce la RSA en la composición liofilizada reconstituida en aproximadamente un 40 % a aproximadamente un 50 %. En ciertos ejemplos, la adición de una molécula hidrófoba pequeña reduce la RSA en la composición liofilizada reconstituida en aproximadamente un 50 % a aproximadamente un 60 %. En ejemplos adicionales, la adición de una molécula hidrófoba pequeña reduce la RSA en la composición liofilizada reconstituida en aproximadamente un 60 % a aproximadamente un 70 %. En más ejemplos adicionales, la adición de una molécula hidrófoba pequeña reduce la RSA en la composición liofilizada reconstituida en aproximadamente un 60 % a aproximadamente un 70 %. En más ejemplos adicionales, la adición de una molécula hidrófoba pequeña reduce la RSA en la composición liofilizada reconstituida en aproximadamente un 70 % a aproximadamente un 80 %. En algunos ejemplos, la adición de una molécula hidrófoba pequeña reduce la RSA en la composición liofilizada reconstituida en aproximadamente un 80 % a aproximadamente un 90 %. En ciertos ejemplos, la adición de una molécula hidrófoba pequeña reduce la RSA en la composición liofilizada reconstituida en aproximadamente un 90 % a un 100 %. En algunos ejemplos, la adición de una molécula hidrófoba pequeña elimina la RSA en la composición liofilizada reconstituida.

Las descripciones de los ADC que comprenden una benzodiazepina, las moléculas hidrófobas pequeñas, excipientes (p. ej., agentes tamponantes, tensioactivos, azúcares, etc.), y otros componentes descritos en la presente memoria también son aplicables a las composiciones que se utilizan en los métodos de tratamiento.

Métodos para reducir la RSA

Esta divulgación también se dirige a métodos para reducir la RSA en ADC que comprenden benzodiazepinas. Un ejemplo se dirige a métodos para reducir la<r>S<a>en un ADC que comprende una benzodiazepina, comprendiendo el método proporcionar un ADC que comprende una benzodiazepina en una solución acuosa, en donde el ADC exhibe RSA, añadir a la solución acuosa una molécula hidrófoba pequeña seleccionada del grupo que consiste de betaínas y aminoácidos con cadenas laterales hidrófobas, en donde la molécula hidrófoba pequeña reduce o inhibe la RSA. En algunos ejemplos, el método comprende además detectar la autoasociación reversible. En ciertos ejemplos, el método comprende además liofilizar la solución acuosa. En ejemplos adicionales, el método comprende además reconstituir una composición liofilizada.

En algunos ejemplos, la RSA se elimina en las composiciones divulgadas. En algunos ejemplos, la RSA disminuye en aproximadamente un 90 % a un 100 % en las composiciones divulgadas. En ciertos ejemplos, la RSA disminuye en aproximadamente un 80 % a aproximadamente un 90 % en las composiciones divulgadas. En algunos ejemplos, la RSA disminuye en aproximadamente un 70 % a aproximadamente un 80 % en las composiciones divulgadas. En ejemplos adicionales, la RSA disminuye en aproximadamente un 60 % a aproximadamente un 70 % en las composiciones divulgadas. En más ejemplos adicionales, la RSA disminuye en aproximadamente un 50 % a aproximadamente un 60 % en las composiciones divulgadas. En más ejemplos adicionales, la RSA disminuye en aproximadamente un 40 % a aproximadamente un 50 % en las composiciones divulgadas. En algunos ejemplos, la RSA disminuye en aproximadamente un 30 % a aproximadamente un 40 % en las composiciones divulgadas. En algunos ejemplos, el método comprende además ajustar el pH de la solución entre aproximadamente 4,0 y aproximadamente 4,5.

Las descripciones de los ADC que comprenden una benzodiazepina, las moléculas hidrófobas pequeñas, excipientes (p. ej., agentes tamponantes, tensioactivos, azúcares, etc.), y otros componentes descritos en la presente memoria también son aplicables a las composiciones que se utilizan en los métodos para reducir la RSA.

Ejemplos

Ejemplo 1: Examen de la RSA

Este ejemplo demuestra el uso de la dispersión dinámica de luz y la ultracentrifugación analítica de velocidad de sedimentación como técnicas para evaluar el grado de autoasociación reversible en un ADC de indolinobenzodiazepina, huMy9-6-DGN462.

La dispersión dinámica de luz mide la fluctuación dependiente del tiempo en la intensidad de luz dispersada desde las proteínas o anticuerpos en solución en un ángulo de dispersión fijo. A medida que las moléculas de proteína o anticuerpo o ADC experimentan movimiento browniano, sus posiciones relativas cambian con el tiempo. Las moléculas pequeñas, que se difunden rápidamente, generan señales que fluctúan rápidamente, mientras que las proteínas y anticuerpos más grandes generan fluctuaciones de la señal más lentas. El coeficiente de difusión traslacional, Dt, está relacionado con la función de autocorrelación de intensidad de la fluctuación dependiente del tiempo en intensidad. El diámetro hidrodinámico puede determinarse usando la relación de Stokes-Einstein [dh = KT/3nr|Dt, donde dh es el diámetro hidrodinámico, K<t>es la constante de Boltzmann, n es viscosidad, y Dt es el coeficiente de difusión traslacional]. Los datos de intensidad de dispersión se procesan usando el software del instrumento DLS para determinar el valor para el coeficiente de difusión traslacional y la distribución del tamaño de las moléculas de dispersión, es decir, la proteína o muestra de anticuerpo.

Todas las proteínas se agregarán en cierta medida durante el almacenamiento quiescente como resultado de la exposición de parches hidrófobos a partir del despliegue parcial que ocurre con las fluctuaciones entre los estados nativo y no nativo. Estos agregados no se disocian con cambios en el pH o dilución, sino que requieren la introducción de caotrópicos tales como guanidina o urea para disociarse. Cuando se examinan mediante técnicas de dispersión dinámica de la luz, las soluciones que contienen pequeñas cantidades de proteína agregada, no se ven sustancialmente diferentes de una solución de proteína monomérica pura,es decir,el diámetro hidrodinámico y los coeficientes de difusión permanecen relativamente constantes independientemente de las características de la solución tales como la concentración.

Sin embargo, en el caso de autoasociación reversible, donde un cambio en las propiedades de la solución, tal como dilución, puede producir un cambio en el estado de asociación (es decir, interrumpir la autoasociación), se puede usar<d>L<s>para medir un coeficiente de difusión único para una concentración dada. Un gráfico del coeficiente de difusión traslacional frente a la concentración de proteína o anticuerpo produce una línea de mejor ajuste con la pendientemy un corte con el eje de y,b.Una línea en la que la pendientem,es positiva, indica una interacción repulsiva neta de las proteínas o anticuerpos, mientras que una pendiente negativa es indicativa de una interacción atractiva neta. Esto puede verse en la Figura 1.

La ultracentrifugación analítica de velocidad de sedimentación (SV-AUC) mide la velocidad a la que se mueven las moléculas en solución en respuesta a la fuerza centrífuga generada en una centrífuga. En SV-AUC, la muestra se centrifuga a una velocidad muy alta (42-60 k rpm) y la evolución del gradiente de concentración se monitoriza mediante ópticas de absorbancia UV. La alta fuerza centrífuga rápidamente agota la proteína o anticuerpo del centro del rotor y forma un límite que se mueve hacia el exterior del rotor con el tiempo. La velocidad a la que se mueve este límite es una medida del coeficiente de sedimentación y está relacionada con el peso molecular y la forma molecular, generalmente representados por la ecuación s = m/6nnro donde m es peso molecular, n es viscosidad, y ro es el radio de la partícula. A partir de estos datos, se puede medir una distribución de los componentes de diversos tamaños en la muestra.

La velocidad a la que se mueve el límite también depende de las fuerzas de difusión y fricción que actúan en la dirección opuesta de sedimentación de la molécula. La anchura mínima del límite de sedimentación está relacionada con el coeficiente de difusión. La presencia de varias especies con coeficientes de sedimentación similares hará que el límite sea más amplio de lo esperado.

En el caso de moléculas que se autoasocian reversiblemente, el límite de sedimentación es más amplio de lo esperado debido a la presencia de oligómeros más ordenados que son estables a lo largo de la escala de tiempo de sedimentación. Esto se manifiesta como difusión que es mucho más rápida de lo que se esperaría para moléculas de los coeficientes de sedimentación medidos. Para tener esto en cuenta, se calcula que la forma de la molécula, que se infiere de la relación de fricción f/fo, donde f es el coeficiente de fricción para la proteína o anticuerpo y fo es el coeficiente de fricción para una esfera sólida dura de radio r, es más esférica. Para anticuerpos autoasociados reversiblemente que son más alargados que globulares, la relación de fricción es considerablemente más pequeña (~1) que para anticuerpos no asociados (~1,5).

En el caso de moléculas que se autoasocian reversiblemente, también hay una medida dependiente de la concentración de la distribución de los componentes en la muestra. En SV-AUC, cuando se ejecuta un conjunto de muestras diluidas en serie, las proporciones relativas de los componentes cambian, así como el coeficiente de sedimentación medido. A medida que la solución se diluye más, el coeficiente de sedimentación comienza a aproximarse al valor esperado. En el caso de los anticuerpos, esto es -6,5 s. Esto puede verse en las Figuras 2A y 2B.

Ejemplo 2a: Influencia de la carga de fármaco sobre la RSA

Este ejemplo demuestra el impacto de la carga de fármaco (DAR) en el grado de autoasociación reversible en un ADC de indolinobenzodiazepina. La DAR representa un promedio de moléculas de indolinobenzodiazepina unidas a los anticuerpos.

Se prepararon conjugados que comprenden el anticuerpo monoclonal huMy-9-6 acoplado químicamente a la indolinobenzodiazepina DGN462 mediante un conector de éster de ácido 4-(2-piridinilditio)-2-sulfo-,1 -(2,5-dioxo-1 -pirrolidinil) butanoico (sSPDB) (el ADC se denomina "huMy9-6-sSPDB-DGN462") usando métodos descritos en la presente memoria y conocidos en la técnica (véase, p. ej., la Patente de EE. UU. No. 8,889,669) para proporcionar relaciones fármaco a anticuerpo (DAR) de 1,8, 2,4 y 2,8. Los conjugados huMy9-6-sSPDB-DGN462 con diferentes cargas de fármaco, pero la misma concentración de anticuerpo (aproximadamente 2 mg/mL), se formularon en histidina 20 mM, trehalosa al 8 %, polisorbato 20 al 0,02 %, pH 6,1.

Como se puede ver en la Figura 3, las composiciones con una carga más baja de fármaco tenían diámetros hidrodinámicos más pequeños que aquellas con cargas de fármaco más altas, lo que sugiere que las interacciones intermoleculares son entre los restos de indolinobenzodiazepina unidos a cada anticuerpo.

Ejemplo 2b: Composiciones con RSA reducida

Este ejemplo demuestra la producción de una composición que reduce o inhibe la autoasociación reversible que comprende un ADC que comprende un anticuerpo acoplado químicamente a una indolinobenzodiazepina (DGN462), agente tamponante, tensioactivo, aminoácido hidrófobo, azúcar y agua.

Se preparó un conjugado que comprende el anticuerpo monoclonal huMy-9-6 acoplado químicamente a una indolinobenzodiazepina DGN462 mediante un conector de éster de ácido 4-(2-piridinilditio)-2-sulfo-,1-(2,5-dioxo-1 -pirrolidinil) butanoico (sSPDB) (el ADC se denomina "huMy9-6-sSPDB-DGN462") usando métodos descritos en la presente memoria y conocidos en la técnica (véase, p. ej., la Patente de EE. UU. No. 8,889,669). Los conjugados huMy9-6-sSPDB-DGN462 se formularon como sigue: (a) 0,2 mg/mL de ADC, histidina 20 mM, trehalosa al 8 %, polisorbato 20 al 0,02 %, pH 6,1; (b) 0,2 mg/mL de ADC, succinato 10 mM, trehalosa al 8 %, pH 4,2; (c) 0,5 mg/mL de ADC, succinato de sodio 10 mM, betaína 280 mM, pH 4,2; y (d) 0,5 mg/mL de ADC, succinato de sodio 10 mM, prolina 280 mM, pH 4,2. Los resultados del análisis de la dispersión dinámica de la luz que demuestra los efectos del pH de la formulación y los excipientes sobre la autoasociación reversible se exponen en la FIG. 4. Como puede verse en la FIG. 4, las formulaciones con prolina y betaína tienen la pendiente menos negativa, lo que indica una cantidad menor de interacción atractiva neta cuando se compara con las otras formulaciones. Los resultados de SV-AUC para la formulación de succinato 10 mM, prolina 280 mM y la formulación de succinato 10 mM, betaína 280 mM se exponen en la FIG. 5. Los resultados muestran que las formulaciones de succinato/prolina o succinato/betaína son superiores a las formulaciones de trehalosa/histidina pH 6,1 para reducir la RSA.

Estos experimentos demuestran la RSA sorprendentemente reducida en las composiciones de esta divulgación.

Ejemplo 3a: Formulación con RSA reducida: conjugado AbX-D2 con prolina

Este ejemplo demuestra la producción de una composición que reduce o inhibe la autoasociación reversible que comprende un conjugado que comprende un anticuerpo acoplado químicamente a una indolinobenzodiazepina D2, agente tamponante, tensioactivo, aminoácido hidrófobo, azúcar y agua.

Un conjugado que comprende un anticuerpo monoclonal AbX acoplado químicamente a la indolinobenzodiazepina D2 (en la presente memoria denominado "AbX-D2") se prepara usando los métodos descritos en la presente memoria y en la Solicitud de EE. UU. No. 14/843,520. Las composiciones que comprenden el conjugado AbX-D2 se formulan como sigue: (a) histidina 20 mM, trehalosa al 8 %, polisorbato 20 al 0,02 %, pH 6,1; (b) acetato 10 mM, trehalosa al 8 %, pH 4,2; (c) succinato de sodio 10 mM, prolina 280 mM o betaína 280 mM, pH 4,2; y (d) succinato de sodio 10 mM, trehalosa al 8 %, y opcionalmente polisorbato al 0,02 %, pH4,2. Para cada una de las composiciones, también se puede incluir bisulfito 2-200 pM.

Ejemplo 3b: Formulación con RSA reducida: conjugado huMov19-sSPDB-D1 con leucina

Este ejemplo demuestra la producción de una composición que reduce o inhibe la autoasociación reversible que comprende un conjugado que comprende un anticuerpo acoplado químicamente a una indolinobenzodiazepina D3, agente tamponante, tensioactivo, aminoácido hidrófobo, azúcar y agua.

Se prepara un conjugado que comprende el anticuerpo monoclonal huMov19 acoplado químicamente a la indolinobenzodiazepina D1 (en la presente memoria denominado "huMov19-sSPDB-D1") usando los métodos descritos en la presente memoria (véase, p. ej., la Patente de EE. UU No. 9,381,256). Las composiciones que comprenden el conjugado huMov19-sSPDB-D1 se formulan como sigue: (a) histidina 20 mM, trehalosa al 8 %, polisorbato 20 al 0,02 %, pH 6,1; (b) acetato 10 mM, trehalosa al 8 %, pH 4,2; (c) succinato de sodio 10 mM, leucina 125 mM, pH 4,2; y (d) succinato de sodio 10 mM, trehalosa al 8 %, y opcionalmente polisorbato al 0,02 %, pH4,2.

Ejemplo 3c: Formulación con RSA reducida: conjugado huMov19-sSPDB-D4 con isoleucina

Este ejemplo demuestra la producción de una composición que reduce o inhibe la autoasociación reversible que comprende un conjugado que comprende un anticuerpo acoplado químicamente a una indolinobenzodiazepina D4, agente tamponante, tensioactivo, aminoácido hidrófobo, azúcar y agua.

Se prepara un conjugado que comprende el anticuerpo monoclonal huMov19 acoplado químicamente a la indolinobenzodiazepina D4 (en la presente memoria denominado "huMov19-sSPDB-D4") usando los métodos descritos en la presente memoria (véase, p. ej., la Patente de EE. UU No. 9,669,102). Las composiciones que comprenden el conjugado huMov19-sSPDB -D4 se formulan como sigue: (a) histidina 20 mM, trehalosa al 8 %, polisorbato 20 al 0,02 %, pH 6,1; (b) acetato 10 mM, trehalosa al 8 %, pH 4,2; (c) succinato de sodio 10 mM, isoleucina 125 mM, pH 4,2; y (d) succinato de sodio 10 mM, trehalosa al 8 %, y opcionalmente polisorbato al 0,02 %, pH4,2.

Ejemplo 4: Métodos para preparar D1

Compuesto 1a:a una solución agitada de (5-amino-1,3-fenileno)dimetanol (1,01 g, 6,59 mmoles) en dimetilformamida anhidra (16,48 mL) y tetrahidrofurano anhidro (16,48 mL) se añadió ácido 4-metil-4-(metildisulfanil)pentanoico (1,281 g, 6,59 mmoles), hidrocloruro de N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida (2,53 g, 13,19 mmoles) y 4-dimetilaminopiridina (0,081 g, 0,659 mmoles). La mezcla resultante se agitó durante 18 horas a temperatura ambiente. La reacción se inactivó con solución de cloruro de amonio saturada y se extrajo con acetato de etilo (3 x 50 mL). Los extractos orgánicos se lavaron con agua y salmuera, después se secaron sobre sulfato de sodio anhidro. La disolución se filtró y se concentró en vacío y el residuo resultante se purificó por cromatografía en gel de sílice (Acetato de etilo/Hexanos) para obtener el compuesto1acomo un sólido blanco (0,70 g, 32 % de rendimiento). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6: 59,90 (s, 1H), 7,43 (s, 2H), 6,93 (s, 1H), 5,16 (t, 2H,J= 5,7 Hz), 4,44 (d, 4H,J= 5,7 Hz), 2,43 (s, 3H), 2,41-2,38 (m, 2H), 1,92-1,88 (m, 2H), 1,29 (s, 6H). MS (m/z), encontrado 330,0 (M 1)+.

Compuesto1b: a una solución enfriada (-10 °C) del compuesto1a(219 mg, 0,665 mmoles) en diclorometano anhidro (6,65 mL) se añadió trietilamina (463 ^L, 3,32 mmoles) seguido de la adición gota a gota de anhídrido metanosulfónico (298 mg, 1,662 mmoles). Se agitó la mezcla a -10 °C durante 2 horas, después la mezcla se inactivó con agua helada y se extrajo con acetato de etilo frío (2 x 30 mL). Los extractos orgánicos se lavaron con agua helada, se secaron con sulfato de sodio anhidro, se filtraron y se concentraron bajo presión reducida para obtener el dimesilato bruto.

Se disolvieron el dimesilato bruto (227 mg, 0,467 mmoles) y el monómero A de IGN (303 mg, 1,028 mmoles) en DMF anhidro (3,11 mL). Se añadió carbonato de potasio (161 mg, 1,169 mmoles) y la mezcla se agitó durante 18 horas a temperatura ambiente. Se añadió agua desionizada y el precipitado resultante se filtró y se enjuagó con agua. El sólido se redisolvió en diclorometano y se lavó con agua. La capa orgánica se secó con sulfato de magnesio anhidro, se filtró y se concentró. El residuo crudo se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (metanol/diclorometano) para dar el compuesto 1b (227 mg, 36% de rendimiento). MS (m/z), encontrado 882,5 (M 1)+.

Compuesto1c: a una suspensión del compuesto1b(227 mg, 0,167 mmoles) en 1,2-dicloroetano anhidro (3,346 mL) se añadió triacetoxiborohidruro de sodio (STAB) (37,3 mg, 0,167 mmoles). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante una hora tras cual se inactivó con solución de cloruro de amonio saturado. La mezcla se extrajo con diclorometano y se lavó con salmuera. La capa orgánica se secó con sulfato de magnesio anhidro, se filtró y se concentró. El residuo crudo se purificó mediante RP-HPLC (C18, agua/acetonitrilo). Las fracciones que contenían el producto deseado se extrajeron con diclorometano, se secaron con sulfato de magnesio anhidro, se filtraron y se concentraron para dar el compuesto1c(35 mg, 19% de rendimiento). MS (m/z), encontrado 884,3 (M 1)+.

Compuesto1d: a una solución del compuesto1c(18 mg, 0,017 mmoles) en acetonitrilo (921 ^L) y metanol (658 ^L) se añadió hidrocloruro de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) (17,51 mg, 0,060 mmoles) (neutralizado con una solución de bicarbonato de sodio saturado (0,2 mL) en tampón fosfato de sodio (132 ^L, 0,75 M, pH 6,5). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 3,5 horas, después se diluyó con diclorometano y agua desionizada. La capa orgánica se separó, se lavó con salmuera, se secó con sulfato de sodio anhidro, se filtró y se concentró a presión reducida para obtener el tiol bruto. MS (m/z), encontrado 838,3 (M 1)+.

Se disolvió el tiol bruto de la etapa 5 (15,5 mg, 0,018 mmoles) en 2-propanol (1,23 mL). Se añadieron agua desionizada (617 ^L) y bisulfito de sodio (5,77 mg, 0,055 mmoles) y la mezcla se agitó durante cinco horas a temperatura ambiente. La reacción se congeló en un baño de acetona/hielo seco, se liofilizó y se purificó mediante RP-HPLC (C18, agua desionizada/acetonitrilo). Se congelaron las fracciones que contenían el producto deseado y se liofilizaron para proporcionar el compuesto ácido (12S,12aS)-9-((3-(4-mercapto-4-metilpentanamido)-5-((((R)-8-metoxi-6-oxo-11,12,12a,13-tetrahidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oxi)metil)bencil)oxi)-8-metoxi-6-oxo-11,12,12a,13-tetrahidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-12-sulfónico (compuesto1d, también denominado en la presente memoria D1) (6,6 mg, 39 % de rendimiento). MS (m/z), encontrado 918,2 (M - 1)-.

Ejemplo 5: Preparación de huMOV19-sulfo-SPDB-1d

Una reacción que contenía 2,0 mg/mL de anticuerpo huMOV19 y 6 equivalentes molares de mezcla in situ de sulfo-SPDB-1dpor conector en 50 mM de tampón HEpES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazina etanosulfónico) a pH 8,5 y el 15 % v/v de codisolvente DMA (N,N-dimetilacetamida) se dejó conjugar durante 6 horas a 25 °C. Se preparó la mezcla in situ haciendo reaccionar conector sulfo-SPDB 1,5 mM con 1,95 mM de compuesto1den DMA al 100 % durante 4 horas en presencia de N,N-diisopropiletilamina (DIPEA) 10 mM. Se tapó el tiol libre añadiendo un exceso de 3 veces de ácido maleimido-propiónico.

Después de la reacción, el conjugado se purificó y el tampón se intercambió en arginina 100 mM, histidina 20 mM, sacarosa al 2 %, Tween-20 al 0,01 %, tampón de formulación de bisulfito de sodio 50 ^M pH 6,1 utilizando columnas de desalación NAP (Illustra Sephadex G-25 DNA Grade, GE Healthcare). Se realizó la diálisis en el mismo tampón durante 20 horas a 4 °C utilizando casetes de diálisis Slide-a-Lyzer (ThermoScientific 20.000 MWCO).

Se encontró que el conjugado purificado tenía un promedio de 2,5 moléculas del compuesto1dunidas por anticuerpo (mediante UV-Vis utilizando coeficientes de extinción molar £330 nm= 15,280 cm-1M-1 y £28o nm= 30, 115 cm-1M-1 para el compuesto1d, y £280 nm= 201,400 cm-1M-1 para el anticuerpo huMOV19), 95 % de monómero (por cromatografía de exclusión por tamaño), <0,1 % de compuesto1dno conjugado (por precipitación con acetona, análisis de HPLC en fase inversa) y una concentración final de proteína de 1,8 mg/mL. Se encontró que el anticuerpo conjugado estaba en >80 % intacto mediante análisis de chip de gel.

Ejemplo6:Métodos para preparar D2

Síntesis de 6-(((S)-1-(((S)-1-((3-((((S)-8-metoxi-6-oxo-11,12,12a,13-tetrahidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oxi)metil)-5-((((R)-8-metoxi-6-oxo-12a, 13-dihidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oxi)metil) fenil)amino)-1-oxopropan-2-il)amino)-1-oxopropan-2-il)amino)-6-oxohexanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo, compuesto90, también denominado en la presente memoria D2.

Etapa 1:se disolvieron ácido (S)-2-(((benciloxi)carbonil)amino)propanoico (5 g, 22,40 mmoles) e hidrocloruro de 2-aminopropanoato de (S)-ferc-butilo (4,48 g, 24,64 mmoles) en DMF anhidro (44,8 mL). Se añadieron EDCHCl (4,72 g, 24,64 mmoles), HOBt (3,43 g, 22,40 mmoles) y DI<p>E<a>(9,75 mL, 56,0 mmoles). La reacción se agitó bajo argón a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se diluyó con diclorometano y después se lavó con cloruro de amonio saturado, bicarbonato de sodio saturado, agua y salmuera. La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio y se concentró. El aceite bruto se purificó por cromatografía en gel de sílice (Hexanos/Acetato de Etilo) para rendir el compuesto81(6,7 g, 85%de rendimiento). 1H RMN (400 MHz, CDCl3): 57,38-7,31 (m, 5H), 6,53-6,42 (m, 1H), 5,42-5,33 (m, 1H), 5,14 (s, 2H), 4,48-4,41 (m, 1H), 4,32-4,20 (m, 1H), 1,49 (s, 9H), 1,42 (d, 3H,J= 6,8 Hz), 1,38 (d, 3H,J= 7,2 Hz).

Etapa 2: el compuesto81(6,7 g, 19,12 mmoles) se disolvió en metanol (60,7 mL) y agua (3,03 mL). La disolución se purgó con argón durante cinco minutos. Se añadió lentamente paladio sobre carbón (húmedo, al 10 %) (1,017 g, 0,956 mmoles). La reacción se agitó durante la noche en una atmósfera de hidrógeno. La disolución se filtró a través de Celite, se enjuagó con metanol y se concentró. Se destiló en forma azeotrópica con metanol y acetonitrilo y el aceite resultante se colocó directamente en alto vacío para dar el compuesto82(4,02 g, 97 % de rendimiento) que se usó directamente en la siguiente etapa. 1H RMN (400 MHz, CDCh): 57,78-7,63 (m, 1H), 4,49-4,42 (m, 1H), 3,55-3,50 (m, 1H), 1,73 (s, 2H), 1,48 (s, 9H), 1,39 (d, 3H,J= 7,2 Hz), 1,36 (d, 3H,J= 6,8 Hz).

Etapa 3: el compuesto82(4,02 g, 18,59 mmoles) y mono metiladipato (3,03 mL, 20,45 mmoles) se disolvieron en DMF anhidro (62,0 mL). Se añadieron EDCHCl (3,92 g, 20,45 mmoles), HOBt (2,85 g, 18,59 mmoles) y DIPEA (6,49 mL, 37,2 mmoles). La mezcla se agitó durante la noche a temperatura ambiente. La reacción se diluyó con diclorometano/metanol (150 mL, 5:1) y se lavó con cloruro de amonio saturado, bicarbonato de sodio saturado y salmuera. Se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y depuró. El compuesto se destiló en forma azeotrópica con acetonitrilo (5x), después se bombeó en alto vacío a 35 °C para proporcionar el compuesto83(6,66 g, 100 % de rendimiento). El material bruto se llevó a la siguiente etapa sin purificación. 1H RMN (400 MHz, CDCh): 56,75 (d, 1H,J= 6,8 Hz), 6,44 (d, 1H,J= 6,8 Hz), 4,52-4,44 (m, 1H), 4,43-4,36 (m, 1H), 3,65 (s, 3H), 2,35-2,29 (m, 2H), 2,25-2,18 (m, 2H), 1,71-1,60 (m, 4H), 1,45 (s, 9H), 1,36 (t, 6H,J= 6,0 Hz).

Etapa 4: el compuesto83(5,91 g, 16,5 mmoles) se agitó en TFA (28,6 mL, 372 mmoles) y agua desionizada (1,5 mL) a temperatura ambiente durante tres horas. La mezcla de reacción se concentró con acetonitrilo y se colocó en alto vacío para proporcionar el compuesto bruto84como un sólido pegajoso (5,88 g, 100 % de rendimiento). 1H RMN (400 MHz, CDCh): 57,21 (d, 1H,J= 6,8 Hz), 6,81 (d, 1H,J= 7,6 Hz), 4,69-4,60 (m, 1H), 4,59-4,51 (m, 1H), 3,69 (s, 3H), 2,40-2,33 (m, 2H), 2,31-2,24 (m, 2H), 1,72-1,63 (m, 4H), 1,51-1,45 (m, 3H), 1,42-1,37 (m, 3H).

Etapa 5:el compuesto84(5,6 g, 18,52 mmoles) se disolvió en diclorometano anhidro (118 mL) y metanol anhidro (58,8 mL). Se añadieron (5-amino-1,3-fenilen)dimetanol (2,70 g, 17,64 mmoles) y EEDQ (8,72 g, 35,3 mmoles) y la reacción se agitó a temperatura ambiente toda la noche. El disolvente se depuró y se añadió acetato de etilo. La suspensión de sólidos resultante se filtró, se lavó con acetato de etilo y se secó bajo vacío/N2 para proporcionar el compuesto85(2,79 g, 36 % de rendimiento). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6): 5 9,82 (s, 1H), 8,05, (d, 1H,J= 9,2 Hz), 8,01 (d, 1H,J= 7,2 Hz), 7,46 (s, 2H), 6,95 (3, 1H), 5,21-5,12 (m, 2H), 4,47-4,42 (m, 4H), 4,40-4,33 (m, 1H), 4,33-4,24 (m, 1H), 3,58 (s, 3H), 2,33-2,26 (m, 2H), 2,16-2,09 (m, 2H), 1,54-1,46 (m, 4H), 1,30 (d, 3H,J= 7,2 Hz), 1,22 (d, 3H,J= 4,4 Hz).

Etapa 6: el compuesto85(0,52 g, 1,189 mmoles) y tetrabromuro de carbono (1,183 g, 3,57 mmoles) se disolvieron en DMF anhidro (11,89 mL). Se añadió trifenilfosfina (PPH3) (0,935 g, 3,57 mmoles) y la reacción se agitó en argón durante cuatro horas. La mezcla de reacción se diluyó con DcM/MeOH (10:1) y se lavó con agua y salmuera, se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró. El material bruto se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (DCM/MeOH) para proporcionar el compuesto86(262 mg, 39%de rendimiento). 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6):510,01 (s, 1H), 8,11 (d, 1H,J= 6,8 Hz), 8,03 (d, 1H,J= 6,8 Hz), 7,67 (s, 2H), 7,21 (s, 1H), 4,70-4,64 (m, 4H), 4,40-4,32 (m, 1H), 4,31-4,23 (m, 1H), 3,58 (s, 3H), 2,34-2,26 (m, 2H), 2,18-2,10 (m, 2H), 1,55-1,45 (m, 4H), 1,31 (d, 3H,J= 7,2 Hz), 1,21 (d, 3H,J= 7,2 Hz).

Etapa 7:se disolvieron el compuesto dibromuro86y el compuesto monómero IGN10en DMF (1,84 mL). Se añadió carbonato de potasio y se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Se añadió agua a la mezcla de reacción para precipitar el producto. La suspensión de sólidos se agitó a temperatura ambiente y luego se filtró y se secó bajo vacío/N2. El material bruto se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (diclorometano/metanol) para proporcionar el compuesto87(336 mg, 74 % de rendimiento). LCMS = 5,91 min (método de 15 min). m S (m/z): 990,6 (M 1)+.

Etapa 8:se disolvió el compuesto diimina87en 1,2-dicloroetano. Se añadió NaBH(OAc)3 (STAB) a la mezcla de reacción y se agitó a temperatura ambiente durante 1 h. La reacción se diluyó con CH2Cl2 y se inactivó con solución ac saturada de NH4CL Las capas se separaron y se lavaron con salmuera, se secaron sobre Na2SO4 y se concentraron. El material bruto se purificó mediante RPHPLC (columna C18, acetonitrilo/agua) para proporcionar el compuesto88(85,5 mg, 25 % de rendimiento). LCMS =6,64 min (método de 15 min). MS (m/z): 992,6 (M 1)+.

Etapa 9:se disolvió el compuesto metiléster88en 1,2-dicloroetano. Se añadió trimetilestananol a la mezcla de reacción y se calentó a 80 °C durante toda la noche. La mezcla de reacción se enfrió hasta temperatura ambiente y se diluyó con agua. Se acidificó la capa acuosa hasta pH ~ 4 con HCl 1 M. La mezcla se extrajo con CH2Ch/MeOH (10: 1, 3 x 20 mL). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera y se secaron sobre Na2SO4 y se concentraron. El material bruto se pasó a través de un tapón de sílice para proporcionar el compuesto89(48,8 mg, 80 % de rendimiento). LCMS = 5,89 min (método de 15 min). MS (m/z): 978,6 (M 1)+.

Etapa 10:se añadió EDCHCl a una solución agitada de compuesto ácido89y N-hidroxisuccinamida en CH2Cl2 a rt. La mezcla de reacción se agitó durante 2 h. La mezcla de reacción se diluyó con CH2Cl2 y se lavó con agua y salmuera. La capa orgánica se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró. El material bruto se purificó a través de RPHPLC (columna C18, acetonitrilo/agua) para proporcionar 6-(((S)-1-(((S)-1-((3-((((S)-8-metoxi-6-oxo-11,12,12a,13-tetrahidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oxi)metil)-5-((((R)-8-metoxi-6-oxo-12a,13-dihidro-6H-benzo[5,6][1,4]diazepino[1,2-a]indol-9-il)oxi)metil) fenil)amino)-1-oxopropan-2-il)amino) -1-oxopropan-2-il)amino)-6-oxohexanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ilo , compuesto90(8,2 mg, 30 % de rendimiento). LCMS = 6,64 min (método de 15 min). MS (m/z): 1.075,4 (M 1)+.

Ejemplo 7: Preparación de huMOV19-90

Una reacción que contenía 2,0 mg/mL de anticuerpo huMOV19 y 3,9 equivalentes molares del compuesto90(pretratados con un exceso de 5 veces de bisulfito de sodio en 95:5 DMA:succinato 50 mM pH 5,5 durante 4 horas a 25 °C) en tampón HEPES 15 mM (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazina etanosulfónico) pH 8,5 y codisolvente DMA al 15 % v/v (N,N-dimetilacetamida) se incubó durante 4 horas a 25 °C. Después de la reacción, el conjugado se purificó y el tampón se intercambió en succinato 10 mM, de cloruro de sodio 50 mM, sacarosa al 8,5 % p/v, Tween-20 al 0,01 %, tampón de formulación de bisulfito de sodio 50 ^M pH 6,2 utilizando columnas de desalación NAP (Illustra Sephadex G-25 DNA Grade, GE Healthcare). Se realizó la diálisis en el mismo tampón durante 4 horas a temperatura ambiente y luego durante la noche a 4 °C utilizando casetes de diálisis Slide-a-Lyzer (ThermoScientific 30.000 MWCO).

Se encontró que el conjugado purificado tenía una concentración final de proteína de 1,8 mg/mL y un promedio de 2,7 moléculas del compuesto90unidas por anticuerpo (mediante UV-Vis utilizando coeficientes de extinción molar £330 nm= 15,280 cm-1M-1 y £280 nm= 30, 115 cm-1M-1 para el compuesto90,y £280 nm= 201,400 cm-1M-1 para el anticuerpo huMOV19); 98,3 % de monómero (por cromatografía de exclusión por tamaño); y <1,1 % de compuesto90no conjugado (por precipitación con acetona, análisis por HPLC de fase inversa). Los datos de espectrometría de MS se muestran en la FIG. 6. DAR0 representa un anticuerpo no conjugado,es decir,un anticuerpo que no tiene benzodiazepinas conjugadas con él. DAR6 representa un anticuerpo con seis benzodiazepinas unidas a él. Los picos en el medio corresponden, de izquierda a derecha, a DAR1, DAR2, DAR3, DAR4 y dAr 5.

Ejemplo 8. Síntesis del Compuesto 107, también denominado en la presente memoria D4.

Etapa 1: se disolvieron el compuesto82(500 mg, 2,31 mmoles), ácido 4-metil-4-(metildisulfanil)pentanoico (449mg, 2,31mmoles), EDCHCl (465 mg, 2,43 mmoles), HOBt (354 mg, 2,31 mmoles) y DIPeA (0,81 mL, 4,62 mmoles) en Dm F (7,7 mL) y se agitó durante la noche hasta que la reacción se completó. La reacción se diluyó con acetato de etilo y se lavó con bicarbonato de sodio saturado, cloruro de amonio saturado y dos veces con agua. El orgánico se secó y se concentróin vacuopara proporcionar el compuesto100(875 mg, 96 % de rendimiento) que se usó directamente en la siguiente etapa. 1H RMN (400 MHz, DMSO): 58,15 (d, 1H,J= 6,8 Hz), 8,02 (d, 1H,J= 6,8 Hz), 4,26-4,33 (m, 1H), 4,03-4,12 (m, 1H), 2,41 (s, 3H), 2,18-2,22 (m, 2H), 1,76-1,80 (m, 2H), 1,39 (s, 9H), 1,24 (s, 6H), 1,24 (d, 3H,J= 7,2 Hz), 1,19 (d, 3H,J= 7,2 Hz).

100 <101

Etapa 2: se añadieron TFA (2,6ml) y agua (0,17ml) al compuesto puro 100 (875 mg, 2,23 mmoles) y se agitó a temperatura ambiente hasta que la reacción se completó. La reacción se diluyó y se destiló de forma azeotrópica con acetonitrilo para obtener un aceite pegajoso. Luego, se diluyó con acetonitrilo y agua, se congeló y se liofilizó para proporcionar el compuesto101(1g, 100% de rendimiento) como un sólido blanquecino que se utilizó sin purificación adicional. L<c>M<s>= 3,99 min (método de 8 min). MS (m/z): 337,0 (M 1)+.

Etapa 3: se disolvieron el compuesto101(923 mg, 1,65mmoles) y (5-amino-1,3-fenilen)dimetanol (240mg, 1,57mmoles) en DMF (5,2ml). Se añadieron EDCHCl (601 mg, 3,13 mmoles) y DMAP (96 mg, 0,78 mmoles) a temperatura ambiente y la reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. Se diluyó la reacción con acetato de etilo y se lavó con agua tres veces. La capa orgánica se secó, se concentróin vacuoy se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (DCM/MeOH) para proporcionar el compuesto102(150 mg, 20 % de rendimiento). LCMS = 3,91 min (método de 8 min). MS (m/z): 472,2 (M 1)+. 1H RMN (400 MHz, MeOD): 59,69 (s, 1H), 8,21 (d, 1H,J= 6,8 Hz), 8,18 (d, 1H,J= 6,8 Hz), 7,52 (s, 2H), 7,12 (s, 1H), 4,58 (s, 4H), 4,44-4,48 (m, 1H), 4,29-4,32 (m, 1H), 3,34 (s, 2H), 2,38 (s, 3H), 2,34-2,40 (m, 2H), 1,90-1,95 (m, 2H), 1,43 (d, 3H,J= 7,2 Hz), 1,36 (d, 3H,J= 7,2 Hz), 1,30 (s, 6H).

Etapa 4:el compuesto102se suspendió en DCM anhidro. Se añadió DMF anhidro hasta que la solución se volvió homogénea. La solución se enfrió hasta -10 °C en un baño de acetona/hielo seco. Se añadió trietilamina, seguido de anhídrido metanosulfónico. La mezcla se agitó a -10 °C durante 1 hora. La reacción se inactivó con agua helada y se extrajo con acetato de etilo/metanol helado (20:1). La capa orgánica se lavó con agua helada y se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró y se concentró. El material bruto se secó en vacío alto para proporcionar el compuesto 103 (174 mgs, 101 % de rendimiento) que se utilizó directamente en la siguiente etapa sin purificación adicional. LCMS = 4,95 min (método de 8 min).

Etapa 5:se disolvió compuesto de dimesilato103(435 mg, 1,11 mmoles) en DMF. Se añadió compuesto10de monómero de IGN, seguido de K2CO3 y se agitó a temperatura ambiente en Ar durante la noche. Se añadió agua para retirar el producto por precipitación. La suspensión de sólidos se agitó durante 5 min, se filtró y se secó en vacío/N2. El sólido bruto contenía el compuesto 104 (203 mg, 44 % de rendimiento, 60 % de pureza) que se utilizó sin purificación adicional. LCMS = 5,68 min (método de 8 min). MS (m/z): 1.024,3(M 1)+.

Etapa 6:se disolvió el compuesto diimina104en 1,2-dicloroetano. Se añadió NaBH(OAc)3 a la mezcla de reacción y se agitó a rt. La reacción se diluyó con CH2Cl2 y se inactivó con solución ac saturada de NH4Cl (15mL). Las capas se separaron y se lavaron con salmuera, se secaron sobre Na2SO4 y se concentraron. El residuo bruto se purificó mediante RPHPLC (columna C18, CH3CN/H2O, gradiente, 50 % al 65 %) para rendir el compuesto mono imina105como un sólido (22 mg, 16 % de rendimiento, 90 % puro). LCMS = 6,00 min (método de 8 min). MS (m/z): 1.027,3(M 1)+.

Etapa 7:se disolvió el compuesto106en THF (0,5 mL) y ACN (0,23 mL) a temperatura ambiente. Se preparó entonces de manera similar al compuesto98en el Ejemplo 9. La mezcla se agitó hasta completarse y luego se diluyó con DCM y agua DI. La capa orgánica se lavó con salmuera, se secó y se filtró. El filtrado se concentró para proporcionar el tiol bruto, el compuesto 106 (21 mg, 100% de rendimiento) que se utilizó directamente en la siguiente reacción. LCMS = 5,67 min (método de 8 min). MS (m/z): 980,4 (M l)+.

Etapa 8:el compuesto106(21 mg, 0,021 mmoles) se suspendió en 2-propanol (1.428 ^L) y agua (714 ^L). Se añadió metabisulfito de sodio (22,30 mg, 0,214 mmoles) y la reacción se agitó a temperatura ambiente hasta completarse. La mezcla de reacción se diluyó con acetonitrilo/agua, se congeló y se liofilizó. El polvo blanco resultante se purificó por RPHPLC (columna C18, CH3CN/H2O, gradiente, 20 % al 40 %) y las fracciones deseadas se recogieron y se liofilizaron para proporcionar el compuesto107(5,3 mg, 23 % de rendimiento). LCMS = 5,67 min (método de 8 min). MS (m/z): 1.060,2 (M - 1)-.

Ejemplo 9. Preparación del conjugado huMOV19-sulfo-SPDB-107 (o huMOV19-107)

Una mezcla in situ que contenía concentraciones finales de Compuesto1071,95 mM y conector sulfo-SPDB 1,5 mM en tampón succinato (pH 5) : DMA (30 : 70) se incubó durante 6 h antes de añadir un exceso de 7 veces de107-sulfo-SPDB-NHS a una reacción que contenía 4 mg/mL de anticuerpo huMOV19 en HEPES 15 mM pH 8,5 (87:13, agua: DMA). La solución se dejó conjugar durante la noche a 25 °C.

Después de la reacción, el conjugado se purificó y el tampón se intercambió en Tris 10 mM, NaCl 80 mM, bisulfito 50 uM, sacarosa al 3,5 %, tampón de formulación Tween-20 al 0,01 % pH 7,6 utilizando columnas de desalación NAP (Illustra Sephadex G-25 D<n>A Grade, GE Healthcare). Se realizó la diálisis en el mismo tampón durante la noche a 4 °C utilizando casetes de diálisis Slide-a-Lyzer (ThermoScientific 10.000 MWCO).

Se encontró que el conjugado purificado tenía un promedio de 2,7 moléculas del compuesto107unidas por anticuerpo (mediante UV/Vis y SEC utilizando coeficientes de extinción molar £330 nm= 15,484 cm-1M-1 y £280 nm= 30, 115 cm-1M-1 para el compuesto107, y £28o nm= 201,400 cm-1M-1 para el anticuerpo huMOV19), 95 % de monómero (por cromatografía de exclusión por tamaño), y una concentración final de proteína de 1,1 mg/mL. Los datos de espectrometría de MS se muestran en la FlG. 7. DAR0 representa un anticuerpo no conjugado, es decir, un anticuerpo que no tiene benzodiazepinas conjugadas con él. DAR5 representa un anticuerpo con cinco benzodiazepinas unidas a él. Los picos en el medio corresponden, de izquierda a derecha, a DAR1, DAR2, DAR3, y DAR4.

Ejemplo 10. RSA reducida con tampones succinato de pH bajo

Este ejemplo demuestra la producción de composiciones que reducen, inhiben o eliminan la autoasociación reversible en donde las composiciones incluyen un conjugado que comprende un anticuerpo con una cisteína diseñada por ingeniería (p. ej., una cisteína no natural introducida en la cadena pesada o cadena ligera del anticuerpo en lugar de otro aminoácido distinto de cisteína) acoplado químicamente a una indolinobenzodiazepina, agente tamponante, tensioactivo, azúcar y agua.

Se produjeron conjugados que comprenden el anticuerpo monoclonal AbX acoplado químicamente a la indolinobenzodiazepina D2(a) a través de cisteínas diseñadas por ingeniería. Los conjugados se formularon como (a) histidina 10 mM, trehalosa al 8 %, polisorbato 20 al 0,01 %, pH 5,5; o (b) succinato de sodio 10 mM, trehalosa al 8 %, polisorbato 20 al 0,01 %, pH 4,2.

Como se muestra en la Figura 8, la combinación de succinato y trehalosa a pH 4,2 (fórmula (b)) mostró una mayor reducción de la autoasociación reversible medida por DLS cuando se comparó con la combinación de histidina trehalosa (fórmula (a)).

Estos resultados demuestran la capacidad de las composiciones divulgadas en la presente memoria para reducir, inhibir o eliminar la autoasociación reversible a rangos de pH más bajos tales como pH 4,2.

Ejemplo 11. RSA reducida con tampón succinato

Este ejemplo demuestra la producción de composiciones que reducen, inhiben o eliminan la autoasociación reversible que comprenden un conjugado que comprende un anticuerpo acoplado químicamente a una indolinobenzodiazepina, agente tamponante basado en succinato, tensioactivo, azúcar y agua.

Se prepararon conjugados que comprenden el anticuerpo monoclonal huMy-9-6 acoplado químicamente a la indolinobenzodiazepina DGN462 a través del conector de éster de ácido 4-(2-piridinilditio)-2-sulfo-,1-(2,5-dioxo-1-pirrolidinil)butanoico (sSPDB) ("huMy-9-6-sSPDB-DGN462") usando métodos descritos en la presente memoria y conocidos en la técnica (véase, p. ej., la Patente de EE. UU. 6,441,163). El conjugado huMy-9-6-sSPDB-DGN462 se formuló como sigue: (a) histidina 20 mM, trehalosa al 8 %, polisorbato 20 al 0,02 %, pH 6,1; (b) acetato 10 mM, trehalosa al 8 %, pH 4,2; y (c) succinato de sodio 10 mM, trehalosa al 8 %, pH 4,2.

Los resultados del análisis por dispersión dinámica de luz que demuestran los efectos del pH de la formulación y el agente tamponante sobre la autoasociación reversible se exponen en la Figura 9. Estos resultados indican que el succinato (fórmula (c)) como agente tamponante es más efectivo para reducir la autoasociación reversible que el acetato (fórmula (b)) en el rango de pH de 4,0 a 4,5, y ambos son más efectivos que la histidina (fórmula (a)) a pH 6,1.

Como también se muestra en la Figura 9, la combinación de succinato trehalosa (fórmula (c)) es más efectiva que la combinación de acetato trehalosa (fórmula (b)) para reducir la autoasociación reversible a pH 4,2.

Además, los datos mostrados en la Figura 10 resultan de la evaluación de la autoasociación reversible para la combinación de succinato-trehalosa en el rango de pH4,2 a pH5,7. Los resultados muestran que la reducción de la autoasociación reversible aumenta a medida que disminuye el pH, como se muestra en la presente memoria con el uso de un tampón succinato.

Ejemplo 12. RSA reducida con tampones succinato de pH bajo

Se produjeron conjugados que comprenden el anticuerpo monoclonal AbX acoplado químicamente a la indolinobenzodiazepina D2(a) a través de cisteínas diseñadas por ingeniería. El conjugado se formuló como succinato de sodio 10 mM, trehalosa al 8 %, polisorbato 20 al 0,01 %, pH 4,0.

Como se muestra en la Figura 11, la combinación de succinato y trehalosa a pH 4,0 mostró una reducción equivalente o mayor de la autoasociación reversible medida por DLS cuando se comparó con la formulación de succinato/trehalosa a pH 4,2.

Usando un conjugado específico de sitio, este ejemplo muestra la reducción de RSA incluso en un conjugado con una DAR inferior. Estos resultados demuestran además la capacidad de las composiciones descritas en la presente memoria para reducir, inhibir o eliminar la autoasociación reversible, particularmente en rangos de pH más bajos, tales como pH 4,0-4,5, incluso para conjugados específicos de sitio con una DAR de, por ejemplo, 2,0.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Una formulación acuosa que comprende: (a) agua; (b) 2 mg/mL de un conjugado de la siguiente fórmula:

(c) succinato de sodio 10 mM; y (d) dihidrato de trehalosa al 8 %; en donde Ab es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende una secuencia de región determinante complementaria (CDR1) de región variable de cadena pesada (VH) de SEQ ID NO: 1, una secuencia de CDR2 de VH de SEQ ID<n>O: 2, y una secuencia de CDR3 de<v>H de S<e>Q ID NO: 3 y una secuencia de CDR1 de región variable de cadena ligera (VL) de SEQ ID NO: 4, una secuencia de CDR2 de VL de SEQ ID NO: 5, y una secuencia de CDR3 de VL de SEQ ID No : 6; en donde r es un número entero de 1 a 10; M es Na+, K+, H+, o cualquier catión farmacéuticamente aceptable; y en donde la formulación tiene un pH que varía de 4,0 a 4,5.
2. La formulación acuosa de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende un dominio de región variable de cadena pesada al menos aproximadamente un 90 % idéntico a la SEQ ID NO: 7 y una región variable de cadena ligera al menos aproximadamente un 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 9.
3. La formulación acuosa de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende un dominio de región variable de cadena pesada al menos aproximadamente un 90 % idéntico a la SEQ ID NO: 11 y una región variable de cadena ligera al menos aproximadamente un 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 14.
4. La formulación acuosa de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende un dominio de región variable de cadena pesada al menos aproximadamente un 90 % idéntico a la SEQ ID NO: 12 y una región variable de cadena ligera al menos aproximadamente un 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 14.
5. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende además entre aproximadamente el 0,005 % y aproximadamente el 0,1 % peso/vol de polisorbato 20 o el 0,01 % peso/vol de polisorbato 20.
6. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el pH es aproximadamente 4,2.
7. La formulación acuosa de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende: (i) una región variable de cadena pesada al menos aproximadamente un 95%idéntica a la SEQ ID NO: 7 y una región variable de cadena ligera al menos aproximadamente un 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 9; o (ii) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 7 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 9.
8. La formulación acuosa de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende: (i) una secuencia de aminoácidos de cadena pesada al menos aproximadamente un 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 11 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera al menos aproximadamente un 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 14; o (ii) una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 11 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 14.
9. La formulación acuosa de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende: (i) una secuencia de aminoácidos de cadena pesada al menos aproximadamente un 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 12 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera al menos aproximadamente un 95 % idéntica a la SEQ ID NO: 14; o (ii) una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 12 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 14.
10. La formulación acuosa de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende además bisulfito de sodio 2-200 |<j>M, o bisulfito de sodio 50<j>M.