ES2918773T3 - Métodos y composiciones relacionadas con enfermedades neurodegenerativas - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona un método para diagnosticar o evaluar una enfermedad neurodegenerativa en un sujeto de prueba, que comprende: (i) proporcionando una muestra que contiene proteína que se ha obtenido del sujeto de prueba; (ii) determinar la concentración, cantidad o grado de expresión de al menos una isoforma de proteína específica y/o glucoforma derivada de un biomarcador de proteína seleccionado del grupo que consiste en: precursor de clusterina; Apolipoproteína A-IV precursor; Apolipoproteína C-III precursor; transtiretina; galectina 7; Complemento precursor C4; precursor de alfa-2-macroglobulina; IG alfa-1 cadena C; histona 2b; Ig Lambda Chain C Región; precursor de la cadena gamma de fibrinógeno; factor de complemento h; Precursor H4 de cadena pesada entre alfa-tripsina; Complemento precursor C3; gamma o beta actina; precursor de haptoglobina; y el precursor de albúmina sérico, o un fragmento del mismo; (iii) Comparación de dicha concentración, cantidad o grado determinado en (ii) con una referencia de un sujeto de control con una enfermedad neurodegenerativa específica, demencia o etapa de enfermedad, o de un sujeto de control que no tiene una enfermedad neurogenerativa o demencia; y (iv) basado en el nivel de al menos una isoforma de proteína específica y/o glicosaformación del biomarcador de proteínas en el sujeto de prueba en relación con la referencia, haciendo un diagnóstico o evaluación en cuanto a la presencia y/o etapa de la enfermedad neurodegenerativa o demencia del sujeto de prueba. También se proporcionan productos y sistemas relacionados para su uso en dicho método. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos y composiciones relacionadas con enfermedades neurodegenerativas

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos relacionados con enfermedades neurodegenerativas, incluida la enfermedad de Alzheimer. Específicamente, la presente invención identifica y describe isoformas de proteínas que se expresan diferencialmente en el estado de la enfermedad de Alzheimer con respecto a su expresión en el estado normal y, en particular, identifica y describe proteínas asociadas con la enfermedad de Alzheimer.

Antecedentes de la invención

La demencia es uno de los principales problemas de salud pública de los ancianos y en nuestras poblaciones envejecidas, el creciente número de pacientes con demencia está imponiendo una importante carga financiera para los sistemas de salud en todo el mundo. Más de la mitad de los pacientes con demencia tienen la enfermedad de Alzheimer (EA). Se ha demostrado que la prevalencia y la incidencia de EA aumentan exponencialmente. La prevalencia para la EA en Europa es del 0,3% para las edades de 60 a 69 años, 3,2% para las edades de 70-79 años y 10,8% para las edades de 80 a 89 años (Rocca, Hofman et al. 1991). El tiempo de supervivencia después del inicio de EA es de aproximadamente 5 a 12 años (Friedland 1993).

La enfermedad de Alzheimer (EA), la causa más común de demencia en individuos mayores, es una enfermedad neurodegenerativa debilitante para la cual actualmente no hay cura. Destruye las neuronas en partes del cerebro, principalmente el hipocampo, el cual es una región involucrada en la codificación de recuerdos. La enfermedad de Alzheimer da lugar a una pérdida progresiva irreversible de funciones cognitivas y de autonomía funcional. Los primeros signos de EA pueden confundirse con un olvido simple, pero en aquellos que finalmente son diagnosticados con la enfermedad, estos signos iniciales progresan inexorablemente a síntomas más graves de deterioro mental. Si bien el tiempo que tarda en desarrollarse variará de persona a persona, los signos avanzados incluyen deterioro de la memoria severa, confusión, alteraciones del lenguaje, personalidad y cambios de comportamiento y juicio deteriorado. Las personas con EA pueden volverse no comunicativas y hostiles. A medida que la enfermedad avanza, su curso termina en demencia profunda, los pacientes no pueden cuidarse a sí mismos y, a menudo, requieren ser internados en instituciones o atención profesional en el hogar. Si bien algunos pacientes pueden vivir durante años después de ser diagnosticados con EA, la esperanza de vida promedio después del diagnóstico es de ocho años.

En el pasado, la EA solo podía ser diagnosticada definitivamente por medio de biopsia cerebral o tras la autopsia después de que un paciente murió. Estos métodos, que demuestran la presencia de la placa característica y las lesiones tipo ovillos en el cerebro, todavía se consideran el estándar máximo para los diagnósticos patológicos de la EA. Sin embargo, en el entorno clínico rara vez se realiza una biopsia cerebral y el diagnóstico depende de una serie de pruebas neurológicas, psicométricas y bioquímicas, incluida la medición de marcadores bioquímicos, como las proteínas ApoE y tau o el péptido beta-amiloide en el líquido cefalorraquídeo y la sangre.

Los biomarcadores posiblemente poseen la clave en el siguiente paso para diagnosticar la EA y otras demencias. Un marcador biológico que cumple con los requisitos para la prueba de diagnóstico para la EA tendría varias ventajas. Un marcador biológico ideal sería uno que identifica los casos de EA en una etapa muy temprana de la enfermedad, antes de que se observe degeneración en las imágenes del cerebro y en las pruebas neuropatológicas. Un biomarcador podría ser el primer indicador para comenzar el tratamiento lo antes posible y también muy valioso para detectar la efectividad de nuevas terapias, particularmente aquellas que se centran en prevenir el desarrollo de cambios neuropatológicos. La medición repetitiva de los marcadores biológicos de la invención también sería útil para seguir el desarrollo y la progresión de la enfermedad.

Los marcadores relacionados con características patológicas de la EA; las placas y los ovillos (AI3 y tau) han sido las características más ampliamente estudiadas. Lo más prometedor han sido los estudios de concentración de LCR de AI3(1-40), AI3(1-42) y tau o la combinación de ambas proteínas en la EA. Muchos estudios han informado una disminución en AI3(1-42) en lCr , mientras que la concentración total de proteína AI3 o AI3(1-40) permanece sin cambios (Ida, Hartmann et al. 1996; Kanai, Matsubara et al. 1998; Andreasen, Hesse et al. 1999).

Al reconocer que el LCR es una muestra menos deseable y que los marcadores "clásicos" de la patología de la EA, incluidos los amiloides y el tau, no son detectables de manera confiable en otros fluidos, se han realizado varios esfuerzos para identificar marcadores de proteínas adicionales en sangre y productos sanguíneos como suero y plasma. Un grupo de proteínas sanguíneas que se expresan diferencialmente en el estado de la EA, en relación con su expresión en el estado normal, se describen en WO2006/035237 e incluye la proteína clusterina, la cual se ha asociado previamente con la patología de la EA en el cerebro de los individuos afectados. El valor de la clusterina como biomarcador potencial en la EA ha sido explorado por varios grupos, tanto en el líquido cefalorraquídeo (LCR) como en la sangre, a menudo con resultados contradictorios. Una posible explicación de la discrepancia entre los niveles de clusterina LCR y los que se encuentran en el cerebro, es el efecto de la glicosilación de proteínas que puede servir para enmascarar los epítopos reconocidos por los anticuerpos utilizados en los inmunoensayos para medir la clusterina. De hecho, Nilselid et al. (2006) demostraron que la cuantificación precisa de la clusterina en el LCR humano solo era posible cuando todos los restos de glucano se eliminaron enzimáticamente de la clusterina, antes de la medición por medio de ELISA. En su estudio, encontraron que la cantidad de clusterina medida por dos anticuerpos específicos contra las cadenas alfa y beta de clusterina aumentó en aproximadamente un 70% después de la desglicosilación. Es importante destacar que los niveles de clusterina generalmente se elevaron en pacientes masculinos con EA, en relación con los controles masculinos sanos, su estudio no pudo mostrar la utilidad del diagnóstico para medir los niveles de LCR de los niveles de clusterina glicosilada naturalmente o de los de la proteína ex vivo desglicosilada. Además, no encontraron diferencia en los niveles de clusterina entre las mujeres con EA y el grupo de control femenino. Los autores concluyen que no hubo una diferencia general en los niveles de glicosilación de clusterina entre EA y los grupos de control, sino que contradicen esto al sugerir que la microheterogeneidad de la proteína (glucosilación, fosforilación, etc.) podría ser otro objetivo útil en el diagnóstico o monitoreo pronóstico de la enfermedad.

En Maja Amedjkouh Puchades: "Development of proteomic methods for studying cerebrospinal fluid proteins involved in Alzheimer 's disease.",1 de enero de 2003 (2003-01-01), páginas 1-68, se informa sobre dos isoformas de clusterina presentes en el LCR, que se alteran en pacientes con EA frente a controles normales.

Breve descripción de la invención

A la luz de esta técnica incierta y deseando desarrollar una prueba de diagnóstico mínimamente invasiva usando sangre en lugar de LCR, los inventores han demostrado sorprendentemente que la glucosilación de clusterina en el plasma humano es altamente heterogénea, con más de 40 isoformas diferentes identificadas hasta la fecha. Además, un pequeño subconjunto de solo 8 de las glicoformas identificadas se regula constantemente entre pacientes con EA y aquellos con deterioro cognitivo leve. Además, los niveles de estas mismas glicoformas pueden predecir la gravedad y la tasa de progresión de la EA dentro de un individuo.

Los inventores actuales han determinado previamente varios biomarcadores de plasma para la enfermedad de Alzheimer (ver US7,897,361). Sin embargo, encontraron que los inmunoensayos y los experimentos de monitoreo de reacción seleccionados no replicaron completamente los resultados que obtuvieron para los mismos biomarcadores, utilizando electroforesis en gel 2-dimensional (2DE). Los inventores investigaron si esta diferencia podría deberse a eventos postraduccionales específicos que no se estaban replicando en los experimentos de validación.

Los inventores descubrieron sorprendentemente que los eventos postraduccionales crearon isoformas distintas de la proteína, por ejemplo, glicoformas, que se expresaron diferencialmente en diferentes formas y etapas de demencia. En consecuencia, los inventores han identificado biomarcadores más potentes para la demencia y, como resultado, pueden proporcionar métodos más sofisticados para el diagnóstico, pronóstico y monitoreo de la demencia, como la enfermedad de Alzheimer.

En términos generales, la presente invención se refiere a un método para evaluar el nivel de atrofia del hipocampo en un sujeto de prueba con la enfermedad de Alzheimer (EA).

Una proteína in vivo puede estar presente en varias formas diferentes. Estas diferentes formas pueden ser producidas por empalme alternativo; por alteraciones entre alelos, por ejemplo, polimorfismos de un solo nucleótido (SNP); o puede ser el resultado de eventos post-traduccionales como la glicosilación (glicoformas). Una glicoforma es una isoforma de una proteína que difiere solo con respecto al número o tipo de adhesión de glicano.

La presente invención proporciona un método para evaluar el nivel de atrofia del hipocampo en un sujeto de prueba con la enfermedad de Alzheimer (EA), que comprende:

(i) proporcionar una muestra que contiene proteína que se ha obtenido del sujeto de prueba;

(ii) determinar la concentración, la cantidad o grado de expresión de al menos una glicoforma de clusterina, en donde las tetra-glicoformas antenarias de la al menos una glicoforma de clusterina, como proporción del total de todas las glicoformas del mismo fragmento de glicoproteína, se cuantifica;

(iii) comparar dicha concentración, cantidad o grado determinado en (ii) con una referencia de un sujeto de control que tiene eA con un nivel bajo de atrofia del hipocampo;

(iv) con base en el nivel de la al menos una glicoforma de clusterina en el sujeto de prueba en relación con la referencia, haciendo una evaluación del nivel de atrofia del hipocampo en el sujeto de prueba,

en donde, un nivel relativo más bajo de glicoformas tetra-antenarias en la muestra del sujeto de prueba, en comparación con el nivel relativo de glicoformas tetra-antenarias en la referencia del sujeto de control, indica que se prevé que el sujeto de prueba tenga un nivel relativamente más alto de atrofia del hipocampo;

en donde dicha al menos una glicoforma de clusterina comprende un fragmento glicosilado de clusterina humana que consiste en HN*STGCLR (SEQ ID NO: 2), en donde "N*" indica el residuo de adhesión de glicano; y

en donde, la muestra que contiene proteína se selecciona del grupo que consiste: plasma en sangre, células sanguíneas o suero.

Dicho al menos un glicoforma de clusterina puede además comprender:

a) cualquiera de los glicopéptidos de clusterina expuestos en la Tabla 3A, Tabla 3B, Tabla 3C, Tabla 5, Tabla 6 y/o Tabla 7; y/o

b) un glicano I364N seleccionado del group que consiste en:

IJ64N_SA1-(HexNAc-Hex)2-central; G64N_SA2-(HexNAc-Hex)2-central; G64N_SA1-(HexNAc-Hex)3-central; G64N_SA2-(HexNAc-Hex)3-central; G64N_SA1-(HexNAc-Hex)4-central; G64N_SA3-(HexNAc-Hex)3-central; G64N_SA2-(HexNAc-Hex)4-central; y G64N_SA3-(HexNAc-Hex)4-central.

La persona calificada será consciente de que existen una variedad de técnicas adecuadas para medir la cantidad o concentración de glicoformas específicas. Esto incluye el uso de anticuerpos no humanos generados por inmunización con isoformas específicas de las proteínas de esta invención, en donde tales anticuerpos tienen la especificidad requerida para la isoforma diagnóstica, particularmente glicoformas. En particular, el uso de péptidos sintéticos de las Secuencias ID 2-10 con las estructuras de glicano apropiadas. Dichos péptidos no se encuentran en la naturaleza y, por lo tanto, deben prepararse ex vivo a través de la digestión natural de la clusterina o mediante el uso de la química sintética in vitro.

Más específicamente, en este documento se contemplan métodos que incluyen la medición mediante electroforesis en gel o LC-MS/MS.

En algunos casos, la cantidad relativa de cada glicoforma se calcula por comparación con una glicoforma de referencia equivalente, marcada con isótopos pesados, utilizando espectrometría de masas de Monitoreo de Reacciones Seleccionadas. En particular, la glicoforma de referencia marcada con isótopos pesados puede ser un glicopéptido sintético en el que uno o más isótopos pesados de H, C, N u O están sustituidos dentro del péptido o los componentes de azúcar de dicha glicoforma.

En algunos casos, la glicoforma de referencia marcada con isótopos pesados es una glicoforma natural enriquecida que ha sido marcada con una etiqueta de masa isotópica, en donde dicha etiqueta de masa isotópica con uno o más isótopos pesados de H, C, N u O y en donde dicha etiqueta de masa es capaz de reaccionar con los componentes peptídicos o de azúcar de dicha glicoforma.

En algunos casos, la cantidad relativa de cada glicoforma se calcula por comparación, con una glicoforma equivalente marcada con una etiqueta de masa isobárica, como se divulga generalmente en la Patente Europea 2,115,475, en donde:

(i) cada muestra tomada del sujeto de prueba se marca con un miembro de un conjunto de etiquetas de masa isobárica, para crear una muestra analítica etiquetada;

(ii) un panel de referencia estándar de glicoformas enriquecidas se separa en entre dos y seis alícuotas y cada alícuota se marca por separado con miembros adicionales del mismo conjunto de etiquetas de masa isobárica que la muestra analítica marcada y cada alícuota marcada de forma independiente, del panel de referencia, se mezcla en una proporción predefinida para crear una curva de concentración clínicamente relevante, como una mezcla de referencia estándar; (iii) un volumen igual de la muestra analítica marcada y la mezcla de referencia estándar se mezclan para formar la muestra del calibrador MS; y

(iv) la muestra del calibrador MS preparada en el paso (iii) se analiza mediante espectrometría de masas. En particular, el conjunto de etiquetas de masa isobárica puede ser un conjunto de Etiquetas de Masa en Tándem.

En ciertos casos, de acuerdo con la presente invención, las glicoformas se miden usando espectrometría de masas de Monitoreo de Reacción Seleccionada (SRM) a escala de suma.

En ciertos casos de acuerdo con la presente invención, las glicoformas no están marcadas.

En determinados casos de acuerdo con la presente invención, el método no comprende someter la muestra a separación electroforética en gel y/o no comprende someter la muestra a enriquecimiento por inmunoprecipitación.

En ciertos casos de acuerdo con la presente invención, las glicoformas son glicoformas y se miden mediante un método esencialmente como se describe en el Ejemplo 6.

En algunos casos, de acuerdo con la presente invención, la al menos una glicoforma puede medirse mediante un ensayo inmunológico, como Western Blot o ELISA.

La medición de estructuras de glicano sobre clusterina puede realizarse por varios métodos. En la electroforesis en gel bidimensional, la adición o eliminación de grupos de azúcar dentro de la estructura de glicano afectará tanto la masa molecular aparente como el punto de enfoque isoeléctrico de la clusterina, lo que generará un "tren" de manchas dentro del gel. Dichos trenes de manchas son bien conocidos por el experto en la materia. A modo de ejemplo, una proteína plasmática de un sujeto sospechoso de sufrir demencia se somete a electroforesis en gel bidimensional. Después de completar la segunda dimensión, el gel se tiñe con un tinte selectivo de proteína o azúcar para revelar manchas de proteína individuales o manchas de glicoproteína, respectivamente. Por lo general, se captura una imagen de todo el gel con una cámara CCD y se calcula la abundancia relativa de cada mancha en función de la intensidad de la tinción con un software disponible en el mercado, tal como SameSpots (Non-Linear Dynamics, UK). El tren de manchas que comprende las isoformas de clusterina puede identificarse por comparación con un gel de referencia. Como alternativa, las manchas se pueden cortar del gel y las proteínas se pueden identificar mediante espectrometría de masas. En última instancia, se determina la abundancia relativa de cada mancha que representa las diferentes isoformas de clusterina.

Esta invención también proporciona un método para estratificar una pluralidad de sujetos de prueba, según su etapa de la enfermedad de Alzheimer (EA), que comprende:

llevar a cabo el método de acuerdo con la presente invención en al menos una muestra de prueba de cada uno de los sujetos de prueba humanos; y

con base en el nivel de la al menos una glicoforma de clusterina específica en cada uno de los sujetos de prueba, estratificar los sujetos de prueba en una etapa de EA en estado más o menos avanzado; en donde los sujetos de prueba se clasifican según su grado previsto de atrofia del hipocampo.

Esta invención también proporciona un método para determinar la eficacia de un tratamiento para la enfermedad de Alzheimer (EA) en un sujeto mamífero, que comprende:

determinar el nivel de una o más glicoformas de clusterina llevando a cabo el método de acuerdo con la presente invención, antes del tratamiento del sujeto y al menos una vez durante o después del tratamiento del sujeto, en donde el tratamiento exitoso se demuestra, por el nivel de dicha o más glicoformas de clusterina, que permanece estable o vuelve a niveles más normales, en donde, el sujeto es humano.

La invención se describirá ahora con más detalle, a modo de ejemplo y sin limitación, con referencia a los dibujos adjuntos.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Distribuciones teóricas y reales de glicoforma de clusterina en 2DE. Panel A - Modelado matemático de la cadena alfa y beta de clusterina. Se pueden modelar series adicionales para estructuras tetra-antenarias de manera similar (no se muestra). Panel B - manchas 2DE de proteína inmunoprecipitada. Se analizaron 16 manchas distintas y los N-glicanos completamente sialilados fueron la estructura más abundante en cada sitio de glicosilación en las 16 manchas. El cambio en el pI observado para diferentes manchas de gel probablemente se deba a la glicosilación a través de alteraciones en el número de antenas y ácidos siálicos.

Figura 2. Representación tabular de glicoformas individuales de cuatro péptidos de clusterina detectados en 16 manchas en geles 2DE (Péptido A: SEQ ID NO: 2; Péptido B: SEQ ID NO: 11; Péptido C: SEQ ID NO: 7; Péptido D: SEQ ID NO: 10).

Figura 3. Diagrama vectorial que ilustra el cambio en las coordenadas 2DE asociado con la eliminación de unidades de glicano específicas de los carbohidratos con enlace N.

Figura 4. Estructura del sustrato NA3 (Dextra-UK Ltd, Catálogo No: C1124) Peso Molecular = 2006,82 Da Fórmula Química: C76H127N5O56.

Figura 5. Espectro ESI-TOF del sustrato NA3 intacto que muestra la presencia de iones moleculares doblemente cargados en m/z 1003,87 y cationes de sodio y potasio relacionados.

Figura 6. Espectro MS/MS de m/z 1050,74 de [M+3H]3+ ion molecular para glicopéptido de clusterina de Peso Molecular 3149,22 Da. Los iones de fragmento permiten deducir la estructura del glicano con el ion de fragmento en m/z 574,47 representando el [Péptido+HexNac]+ resto. Por lo tanto, la secuencia del Péptido "desnudo" es HN*STGCLR (SEQ ID NO: 2) y una estructura de glicano bi-antenaria completamente sialilada, SA2-(HexNAc-Hex)2, se une al residuo de asparagina (N*).

Figura 7. Espectro de masas que muestra los iones moleculares de dos formas sialiladas de los glicopéptidos tetraantenarios HN*STGCLR (SEQ ID NO: 2) observado en instancias de baja atrofia y no observado en atrofia alta.

Figura 8. Porcentaje relativo de glicoformas tetra-antenarias dentro de ocho individuos con niveles bajos y altos de atrofia del hipocampo.

Figura 9. Muestra diagramas de caja de glicopéptidos de clusterina I364N significativamente regulados de la Cohorte de Descubrimiento (Orbitrap Fusión) A) l364N_SA1-(HexNAc-Hex)2-central; B) l364N_SA2-(HexNAc-Hex)2-central; C) l364N_SA1-(HexNAc-Hex)3-central; D) l364N_SA2-(HexNAc-Hex)3-central; E) l364N_SA3-(HexNAc-Hex)3-central; y F) l3B4N_SA3-(HexNAc-Hex)4-central.

Figura 10. Muestra diagramas de caja de glicopéptidos de clusterina I364N significativamente regulados de la Cohorte de Replicación (Orbitrap Fusion) A) l364N_SA1-(HexNAc-Hex)2-central; B) l364N_SA1-(HexNAc-Hex)3-central; y C) 1364N_SA2-(HexNAc- Hex)3-central.

Figura 11. Muestra diagramas de caja de glicopéptidos de clusterina I364N significativamente regulados de Cohortes de Replicación y de Descubrimiento combinadas (Orbitrap Fusión) A) l364N_SA1-(HexNAc-Hex)2-central; B) I364N_SA2-(HexNAc-Hex)2-central; C) l364N_SA1-(HexNAc-Hex)3-central; y D) l364N_SA2-(HexNAc-Hex)3-central.

Figura 12. Muestra diagramas de caja de glicopéptidos de clusterina I364N significativamente regulados de Cohorte de Descubrimiento por análisis SRM (TSQ Vantage) A) l364N_SA1-(HexNAc-Hex)2-central; B) l364N_SA2-(HexNAc-Hex)2-central; C) l364N_SA1-(HexNAc-Hex)3-central; D) l364N_SA2-(HexNAc-Hex)3-central; y E) l364N_SA1-(HexNAc-Hex)4-central.

Figura 13. Muestra una imagen SDS-PAGE de plasma humano normal sin albúmina/IgG. Las barras rojas representan puntos de corte y los números representan el número de banda utilizado para el análisis Orbitrap, para identificar glicopéptidos de clusterina.

Figura 14. Muestra el cromatograma de iones totales (TIC) de la banda #4 - #9 del plasma empobrecido utilizando el método glyco-SRM. Como precursores se sirvieron ocho glicopéptidos de clusterina I364n (m/z 953,71, 1050,74, 1075,42, 1172,45, 1197,13, 1269,49, 1294,17, 1391,53) y los iones de fragmento en m/z 366,14, 574,56 y 657,24 se establecieron como iones de transición para cada precursor.

Figura 15. Muestra XIC de la banda #7 que presenta varios tiempos de retención y áreas de pico de ocho glicoformas en el sitio I364N.

Figura 16. Muestra diagramas de caja de glicopéptidos de clusterina I364N significativamente regulados de Cohortes de Descubrimiento y Validación combinados mediante análisis SRM (TSQ Vantage) A) l364N_SA1-(HexNAc-Hex)2-central; B) 1364N_SA2-(HexNAc- Hex)2-central; C) l364N_SA1-(HexNAc-Hex)3-central; D) l364N_SA2-(HexNAc-Hex)3-central; E) 1364N_SA1 -(HexNAc- Hex)4-central; F) l364N_SA3-(HexNAc-Hex)3-central; G) l364N_SA2-(HexNAc-Hex)4-central; y H) l364N_SA3-(HexNAc- Hex)4-central.

Figura 17. Muestra la Tabla 1A - La base de datos Clusterin GlycoMod v1,0 (plasma de control) (SEQ ID NOs: 2 - 7 y 10, respectivamente).

Figura 18. Muestra la Tabla 1B - La base de datos Clusterin GlycoMod v1,1 (plasma DCL/EA) (SEQ ID NOs: 2 - 7, 9, 10, y 8 respectivamente).

Descripción detallada

Al describir la presente invención, se emplearán los siguientes términos y se pretende que se definan como se indica a continuación.

El término "sujeto" incluye un ser humano o un animal. De acuerdo con ciertas realizaciones de la presente invención, el sujeto puede haber sido previamente diagnosticado con EA y/o previamente diagnosticado con deterioro cognitivo leve (DCL). El sujeto es preferiblemente un ser humano. El sujeto puede ser un ser humano de al menos 60 años de edad, opcionalmente al menos 70 o al menos 80 años de edad.

El término "diagnóstico", como se usa aquí, incluye el suministro de cualquier información relativa a la existencia, inexistencia o probabilidad del trastorno en un paciente. Incluye además el suministro de información sobre el tipo o la clasificación del trastorno o de los síntomas que se experimentan o pueden experimentarse en relación con él. Esto puede incluir, por ejemplo, el diagnóstico de la gravedad del trastorno. Abarca el pronóstico del curso médico del trastorno, por ejemplo, su duración, gravedad y el curso de la progresión, de DCL a la enfermedad de Alzheimer.

Actualmente, el estado de la enfermedad se evalúa por la duración de la enfermedad desde el inicio hasta el presente (una mayor duración equivale a una enfermedad más grave) y las medidas de evaluación clínica. Estas medidas de evaluación incluyen pruebas clínicas de memoria y otras cogniciones, pruebas clínicas de función (habilidades de la vida diaria) y evaluaciones clínicas de gravedad global. Los ensayos de terapias potenciales en EA se evalúan actualmente contra estas medidas. La FDA y otros organismos de aprobación de medicamentos requieren, como parte de estas evaluaciones, medidas tanto de cognición como de función global. La Escala de Demencia Global es una de esas medidas de función global. Se evalúa mediante una evaluación posterior de la gravedad, incluida la cognición y la función, frente a un conjunto estandarizado de criterios de gravedad.

El término "aliviar", como se usa en este documento, en relación con la enfermedad de Alzheimer, significa cualquier forma de reducir uno o más síntomas o efectos no deseados de la misma. Cualquier mejora de la enfermedad de Alzheimer del paciente cae dentro del término "alivio". La mejora también puede incluir la desaceleración de la progresión de la enfermedad.

Tal como se usa en el presente documento, "evaluar" la EA incluye el suministro de información relativa al tipo o clasificación de la enfermedad o de los síntomas que se experimentan o pueden experimentarse en relación con la misma. Esto incluye específicamente el pronóstico del curso médico de la enfermedad, por ejemplo, su duración, gravedad y el curso y la tasa de progresión de, por ejemplo, DCL o EA presintomática a EA clínica. Esto también incluye el pronóstico de la patología cerebral asociada con la EA, como la carga de amiloide fibrilar, la atrofia cortical y del hipocampo y la acumulación de ovillos neurofibrilares. La evaluación puede ser de una forma agresiva de EA y/o un mal pronóstico.

Como se usa en el presente documento, "muestra biológica" se refiere a cualquier líquido biológico, muestra celular o tisular aislada u obtenida del sujeto. De acuerdo con la presente invención, la "muestra que contiene proteínas" puede ser cualquier muestra biológica como se define en el presente documento. La muestra biológica puede, en determinados casos, comprender plasma sanguíneo, células sanguíneas, suero, saliva, orina, líquido cefalorraquídeo (LCR) o una biopsia de tejido. La muestra biológica puede haber sido almacenada (por ejemplo, congelada) y/o procesada (por ejemplo, para eliminar desechos celulares o contaminantes) antes de determinar la cantidad (por ejemplo, concentración) de al menos una isoforma de proteína y/o glicoforma en cuestión que se encuentra en la muestra.

Análisis de glicoforma de clusterina ejemplar

La clusterina (Apolipoproteína J; SP-40,40; TRPM-2; SGP-2; pADHC-9; CLJ; T64; GP III; XIP8) es una glicoproteína heterodimérica secretada unida por disulfuro altamente conservada de 75-80 kDa, pero también se han identificado formas truncadas dirigidas al núcleo. La proteína es secretada constitutivamente por varios tipos de células, incluidas las células epiteliales y neuronales, y es una proteína importante en los fluidos fisiológicos, incluidos el plasma, la leche, la orina, el líquido cefalorraquídeo y el semen.

Preferiblemente, la clusterina comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o 100% de identidad con la secuencia de la clusterina humana descrita en UniProt No. Acceso: P10909, secuencia versión 1 y GI No. 116533 (SEQ ID NO: 1), calculado sobre la longitud total de dicha secuencia de clusterina humana; o un fragmento de la misma, que comprende al menos 5, 10, 15, 20, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 425 o 449 aminoácidos contiguos.

La expresión del gen de la clusterina está significativamente elevada en el cerebro con enfermedad de Alzheimer (EA) (May et al., 1990) y también se ha demostrado que los niveles de clusterina en plasma se correlacionan con la progresión de la EA (Thambisetty et al., 2010). Los inventores han identificado previamente varias isoformas de clusterina plasmática como biomarcadores candidatos para EA, utilizando electroforesis en gel bidimensional (2DE).

Sin embargo, el uso de inmunoensayos y péptidos no modificados en experimentos de monitoreo de reacciones seleccionadas (SRM) no replicó completamente la regulación observada en 2D^e . Los inventores plantearon la hipótesis de que esta desconexión quizás se deba a alteraciones en eventos postraduccionales específicos que no se replicaron en los estudios de validación. Clusterina es una proteína secretada altamente glicosilada y porque la glicosilación juega un papel importante en las funciones fisiológicas de clusterina (Stuart et al., 2007) los inventores propusieron que el perfilado detallado de la clusterina plasmática y la comparación de los perfiles de glicosilación observados en distintos sujetos clasificados clínicamente, por ejemplo, pacientes con baja o atrofia alta del hipocampo, pueden revelar isoformas de biomarcadores más potentes.

Guiados por las observaciones relativas a la glicoformas de clusterina, que demuestran una actividad de 13-N-acetilglucosamin-idasa en plasma, los inventores también idearon un nuevo ensayo utilizando un sustrato definido para medir esta actividad específica.

Ejemplo 1. Análisis por electroforesis en gel de plasma de isoformas de clusterina

Métodos

La clusterina humana se enriqueció mediante inmunoprecipitación (IP) a partir de plasma empobrecido en albúmina/IgG, utilizando un anticuerpo monoclonal anticlusterina (Millipore). Las proteínas inmunoprecipitadas se analizaron primero mediante Western blot como control de calidad y luego se separaron mediante electroforesis bidimensionales (2DE) o SDS-PAGE. Las manchas y la banda única (#3) de interés se extirparon, redujeron, alquilaron y digirieron en gel con tripsina antes del análisis por espectrometría de masas (MS). Las muestras se analizaron a través de LC-MS/MS utilizando cromatografía de fase inversa de nanoflujo (EASY-nLC II, ThermoFisher Scientific) y un método de disociación inducida por colisión (CID) Top20 (Orbitrap Velos, ThermoFisher Scientific). Los glicopéptidos se identificaron manualmente por la presencia de fragmentos de iones oxonio específicos de glicano, m/z 204,08 para N-acetilhexosamina, [HexNAc]+, m/z 366,14 para hexosa-N-acetilhexosamina, [Hex-HexNAc]+ y m/z 657,24 para N-ácido acetilneuramínico-hexosa-N-acetilhexosamina [NeuAc-Hex-HexNAc]+ en los espectros MS/MS.

Resultados

Manchas 2DE

Inicialmente, se utilizó un modelo matemático para crear un mapa artificial de las diversas glicoformas de clusterina para las cadenas alfa y beta separadas (Figura 1A). Se usó un mayor refinamiento de este enfoque para clasificar las glicoformas relacionadas con clusterinas individuales usando coordenadas simples (x, y). De esta forma, los inventores pudieron predecir el contenido de las manchas individuales 2DE y demostrar que múltiples glicoformas comparten coordenadas discretas. Por lo tanto, es probable que las manchas 2DE sean mezclas compuestas que contengan varias glicoformas. Luego, esta información se usó para ayudar en la interpretación de datos complejos de LC/MS/MS, que posteriormente proporcionaron algunos conocimientos bastante útiles.

En primer lugar, se hizo evidente que los componentes principales dentro de cada una de las manchas 2DE eran, sin excepción, formas siempre completamente sialiladas, siendo estructuras tetra, tri o biantenarias (Figura 1B). Esto fue sorprendente porque originalmente se había predicho que las diferencias en el ácido siálico eran la causa principal de la separación de distintas formas durante la electroforesis, con pérdida de 291Da concurrente con una carga decreciente, lo que resultaba en un cambio hacia un punto isoeléctrico más básico. Sin embargo, los resultados de LC/MS/MS (Figura 2) indicaron una tendencia hacia un menor número de antenas y esto sugirió la eliminación sucesiva de antenas completas como un efecto más pronunciado en la ubicación de las manchas 2DE. Se ideó un vector básico para ilustrar este fenómeno (Figura 3) y resulta que las glicoformas de clusterina detectadas ahora indican evidencia para respaldar tanto la eliminación de los ácidos siálicos solos, como la eliminación de antenas completas que sugieren distintas actividades de neurominidasa y 3-N-acetil-glucosaminidasa, respectivamente.

Ejemplo 2- Diseño de un ensayo de sustrato para medir la actividad específica de n-acetil-glucosaminidasa en plasma

Los resultados del análisis de glicanos de 16 isoformas de clusterina diferentes visibles en electroforesis en gel bidimensional mostraron una eliminación secuencial de ácidos siálicos y antenas completas. Varias de las glicoformas truncadas parecían correlacionarse con manchas de proteína clusterina previamente identificadas como biomarcadores candidatos de EA y DCL. Hasta ahora, no se ha realizado un análisis detallado de la glicosilación de estas isoformas de clusterina y fue sorprendente descubrir que la mayoría de las modificaciones asociadas a la enfermedad en el clusterina de plasma podrían explicarse por la actividad de una única glicosidasa, a saber, la 3-N-acetil-glucosaminidasa.

Los inventores establecieron así un método de ensayo específico para determinar la actividad de 3-N-acetilglucosaminidasa en muestras de tejidos o fluidos corporales tomadas de sujetos sospechosos de tener o previamente diagnosticados con DCL, EA u otra demencia. El sustrato de glicano NA3 artificial (Figura 4) contiene enlaces 131,2 y 131,4 entre las subunidades 13-N-acetil-glucosamina y manosa contiguas y es un sustrato preferido para diferenciar la actividad 31,2 y 31,4 N-acetil-glucosamina-idasa en plasma. El peso molecular del sustrato es 2006,82Da y un ión [M+2H]2+ se detectó a m/z 1003,8, utilizando un espectrómetro de masa ESI-TOF (Figura 6).

El sustrato NA3 se agrega a una muestra adecuada de tejido o fluido corporal de un sujeto con sospecha de demencia o con un diagnóstico previo de demencia, para lograr una concentración final de 300 - 1,000 pg/|jl y se incubó a 37°C durante 4-24 horas. Luego, la muestra de prueba se centrifuga para eliminar los desechos y una parte alícuota se envía al análisis LC-MS/MS. La medición de los iones moleculares correspondientes a la pérdida de dos o una antena indican actividad 31,2 y 31,4 de N-acetil-glucosaminidasa respectivamente.

Ejemplo 3 - Análisis de clusterina inmunoprecipitada para crear un recurso de referencia de glicopéptido único para la clusterina:_La base de datos Clusterin GlycoMod v1,0

Se utilizó una muestra de plasma clínico agrupada representativa para desarrollar la metodología y ensamblar una base de datos "basada en la observación" que contenía 41 glicoformas distintas asociadas con sitios de consenso de glicosilación anticipados, dentro de la secuencia de aminoácidos. Para cada glicopéptido se tabuló el estado de carga m/z y el tiempo de retención (RT) del analito (ver Tabla 1A). La anotación inequívoca del glicopéptido requería la detección del [Péptido+HexNAc]+ ión fragmento en los espectros MS/MS correspondientes e interpretación de iones fragmento adicionales, relacionados con la disociación secuencial de las subunidades de glicano individuales. Se muestra un ejemplo de espectro MS/MS (Figura 7) y la iteración actual de la base de datos Clusterin GlycoMod se proporciona en la Tabla 1^a . Una iteración actualizada de la base de datos Clusterin GlycoMod se proporciona en la Tabla 1B.

Utilizando inmunoprecipitación y LC/MS/MS, se han caracterizado 41 glicopéptidos que abarcan 5 de los 6 sitios de consenso de glicosilación anticipados ligados a N en clusterina de plasma. En total se han caracterizado 41 diferentes glicopéptidos ligados a N y se enumeran aquí. La distribución de glicanos en estos 5 sitios fue consistente con un CV de <15% (n=3 de dos muestras de plasma) indicando la reproducibilidad técnica y biológica del método.

Los inventores han demostrado previamente 5 de 6 sitios de glicosilación ligados a N previstos dentro de clusterina de plasma humano (base de datos GlycoMod v1,0). El experto en la materia entendería que la expansión de la base de datos GlycoMod para cubrir todos los sitios ligados a N y ligados a O de todos los biomarcadores de proteínas, está dentro del alcance de la presente invención. De hecho, los inventores han completado posteriormente el mapeo del sexto sitio ligado a N en clusterina humana, como se establece en la Tabla 1B (Figura 18), mostrando glicopéptidos de clusterina de la versión 1,1 de la base de datos Clusterin GlycoMod (plasma DCL/EA).

Ejemplo 4 - Análisis de clusterina inmunoprecipitada para comparar individuos con atrofia baja y alta

Los inventores han identificado ciertas isoformas de clusterina reguladas diferencialmente en el plasma de pacientes con EA, en relación con los controles sin demencia. Además, también se ha demostrado que ciertas manchas que comprenden clusterina en geles 2DE se correlacionan con el nivel de atrofia del hipocampo, mientras que otras isoformas se correlacionan con la tasa posterior de progresión de la enfermedad en EA.

Los inventores obtuvieron muestras de plasma de cuatro sujetos previamente diagnosticados con EA que tenían un nivel bajo de atrofia del hipocampo y de cuatro sujetos previamente diagnosticados con EA con atrofia alta del hipocampo. La clusterina se enriqueció mediante inmunoprecipitación y se sometió al método LC-MS/MS descrito anteriormente. Sorprendentemente, identificaron que la extensión de la poda de glicanos se correlacionaba con la atrofia del hipocampo. En pacientes con niveles bajos de atrofia del hipocampo hubo poca evidencia de poda de clusterina de plasma. Por el contrario, la clusterina de plasma de sujetos con niveles altos de atrofia del hipocampo generalmente se podaba para eliminar una o más antenas completas dentro de los glicanos ligados a N.

Como ejemplo, dos formas sialiladas del glicopéptido tetra-antenario HN*STGCLR (SEQ ID NO: 2) se observan como iones moleculares triplemente cargados en m/z 1391 y m/z 1294,17, pero solo en individuos con atrofia baja (Figura 7). Estos restos son, por lo tanto, biomarcadores alternativos potenciales concordantes con el grado de atrofia del hipocampo.

Utilizando datos de todos los glicanos ligados a N monitorizados por el método LC-MS/MS, los inventores observaron una reducción constante en el nivel de glicanos tetra-antenarios en sujetos con niveles altos de atrofia del hipocampo, en comparación con aquellos con niveles bajos. Con base en la señal de glicoforma total para el sitio de glicosilación ligado a N en el péptido tríptico HN*STGCLR (SEQ ID NO: 2) de la cadena beta de la clusterina (Figura 8).

Ejemplo 5 - Análisis de validación de clusterina inmunoprecipitada para comparar individuos con atrofia baja y alta

Habiendo identificado que los cambios en los patrones de glicosilación de clusterina se correlacionan con el grado de atrofia dentro de una pequeña cohorte de muestras clínicas, se realizó un estudio de validación adicional en una cohorte adicional de pacientes con enfermedad de Alzheimer con niveles conocidos de atrofia del hipocampo. También se evaluaron enfoques bioinformáticos adicionales por su impacto en los perfiles de segregación de clases basados en glicoforma y se empleó un nuevo espectrómetro de masas de mayor sensibilidad con la expectativa de identificar glicoformas de clusterina de diagnóstico adicionales. Para garantizar la correlación con los datos anteriores, las muestras de la Cohorte original de 4 x 4 (Cohorte de Descubrimiento) utilizadas en el Ejemplo 4, se volvieron a analizar usando los nuevos métodos junto con una cohorte separada de 20 nuevas muestras de EA (n=10) y controles emparejados (n=10)(Cohorte de Replicación). Todos los detalles de la muestra se proporcionan en la Tabla 2.

Detalles de la muestra de cohorte

Tabla 2. Detalles de muestra asociados con cohortes 4 vs 4 10 vs 10

Métodos

La clusterina se enriqueció a partir de cada muestra, como se describe anteriormente. La banda de proteína relevante fue escindida, reducida, alquilada y digerida con tripsina. Después de la limpieza, los compendios de clusterina se dividieron en dos alícuotas y cada una se analizó mediante cromatografía líquida de alto rendimiento nanoflow y Orbitrap Velos Pro o sistemas de cromatografía líquida de rendimiento ultra alto y Orbitrap Fusion Tribrid LC-MS/MS (todos los equipos de Thermo Scientific, Hemel Hempstead, Reino Unido). Los datos fueron aparentemente similares pero, como se esperaba, se identificaron más péptidos de clusterina glicosilados en Fusion, por lo que todos los análisis posteriores se realizaron en el conjunto de datos de Fusion.

Bioinformática

Los datos sin procesar del espectrómetro de masas se procesaron utilizando el software Proteome Discoverer (Thermo Scientific). Las intensidades de iones para los péptidos de clusterina glicosilados y sus fragmentos descritos en las Tablas 1A y 1B se exportaron a una hoja de cálculo de Excel (Microsoft Corp). Se empleó una técnica de escalado de suma para normalizar los datos y calcular los valores de significancia (p) para cada glicopéptido, comparando los valores de las medias entre los grupos de atrofia baja y alta en la Cohorte de Descubrimiento, la Cohorte de Replicación y en un análisis combinado de ambos Cohortes como un solo grupo. Se usó la prueba T de Student para identificar las glicoformas asociadas a péptidos que cambian significativamente entre la atrofia alta y baja, lo que da como resultado valores de p de una cola para cada glicopéptido (ver Tablas 3A, 3B y 3C).

Resultados

Utilizando el flujo de trabajo IP-LC/MS/MS en el Orbitrap Fusion Tribrid, se pudo ampliar la cobertura a los seis sitios conocidos de N-glicosilación de clusterina: a64N, a81N, a123N, I364N, I3127N y I3147N. Al monitorear los fragmentos específicos de glicanos, también se pudieron asignar varias estructuras antenarias en los seis sitios y realizar una cuantificación relativa basada en recuentos de iones totales. En total se detectaron 42 estructuras de glicano diferentes. Mientras que la mayoría de los sitios de glicosilación no mostraron regulación en las estructuras de glicano entre los niveles altos y bajos de atrofia del hipocampo, dos sitios - I364N and I3147N - mostraron regulaciones significativas entre los grupos clínicos. Las estructuras de glicano específicas que muestran (p < 0,05) los cambios entre los grupos clínicos en los análisis de Descubrimiento, Replicación y Cohortes combinadas, se indican en las Tablas 3A, 3B y 3C respectivamente. Se crearon diagramas de caja para cada glicopéptido para ilustrar la separación lograda entre los dos grupos (Figuras 9-11).

Curiosamente, seis glicoformas en el sitio de glicosilación I364N HN*STGCLR (SEQ ID NO: 2) se encontraron significativamente disminuidos en las 4 muestras de atrofia alta (Alzheimer) en comparación con las 4 muestras de atrofia baja (deterioro cognitivo leve) de la Cohorte de Descubrimiento, cuando se midieron en el Orbitrap Fusion. Esto incluyó las formas sialiladas del glicopéptido tetra-antenario observadas, como iones moleculares triplemente cargados en m/z 1391,54 lo cual fue consistente con el análisis de datos anterior de Velos, lo que confirma la solidez de esta glicoforma como marcador de diagnóstico para diferenciar el deterioro cognitivo leve de la enfermedad de Alzheimer, cuando se mide en una plataforma LC-MS/MS diferente.

En la Cohorte de Replicación más grande, tres glicoformas de glicopéptidos I364N se redujeron significativamente en las muestras de atrofia alta. Estos incluyen las glicoformas SA1-(HexNAc-Hex)2, SA1-(HexNAc-Hex)3 y SA2-(HexNAc-Hex)3 vistas a m/z 953,71, 1075,42, 1172,45 en los espectros. Como todas estas glicoformas también se vieron reducidas en pacientes con atrofia alta en la Cohorte de Descubrimiento, esto respalda aún más su utilidad como biomarcadores pronósticos en pacientes con enfermedad de Alzheimer confirmada.

Cuando se combinaron los resultados de las dos cohortes, nuevamente vimos que los cambios en las glicoformas encontradas en el sitio I364N se correlacionaron con la atrofia, con cuatro glicoformas significativamente reducidas sobre la atrofia alta, por ejemplo, SA1-(HexNAc-Hex)2, SA2-(HexNAc-Hex)2, SA1-(HexNAc-Hex)3 y SA2-(HexNAc-Hex)3 en m/z 953,71, 1050,74, 1075,42 y 1172,45 respectivamente.

T l A m i i nifi iv n l li i l rin 4 v 4)

T l B m i i nifi iv n l li i l rin v 1 )

Tabla 3 m i i nifi iv n l li i ^ l rin m in 13 vs 14)

Conclusión

El uso de Orbitrap Fusión aumentó la cobertura total de glicoforma de 4 a 6 sitios de unión a N. Varias glicoformas de sitio I364N están significativamente reducidas en el plasma de pacientes con enfermedad de Alzheimer, en comparación con individuos con deterioro cognitivo leve. Cuatro de estas glicoformas también están reducidas en pacientes de Alzheimer con niveles altos de atrofia del hipocampo. En combinación, esto confirma la utilidad de las isoformas de clusterina como marcadores de diagnóstico y pronóstico para la enfermedad de Alzheimer.

Ejemplo 6 - Desarrollo y prueba preliminar de un método de Monitoreo de Reacción Selectiva (SRM) para 8 glicoformas de clusterina en plasma humano

En preparación para mediciones de mayor rendimiento dentro de un número mucho mayor de muestras clínicas, también se desarrolló un método de Monitoreo de Reacción Selectiva (SRM) específico para medir glicopéptidos específicos de clusterina. Este flujo de trabajo TSQ-SRM recientemente establecido utilizó ocho glicoformas de glicopéptidos de clusterina I364N como precursores y dos iones oxonio fragmento específicos de glicano en m/z 366,14 y m/z 657,24 como transiciones (ver la Tabla 4). Además, el ión péptido en m/z 574,56 que representa [HN*STGCLR]2+ (SEQ ID NO: 2) donde N* = residuo de asparagina HexNac, se incluyó para servir como el tercer ión de transición que proporciona la confirmación de la información específica del sitio. Los detalles de cada transición monitoreada se proporcionan en la Tabla 4.

T l 4. M l - RM n li i T .

En estudios previos (datos no mostrados), se pudo extraer glicopéptidos de clusterina de suero humano sin inmunoprecipitación previa. Dadas las posibles ganancias de sensibilidad que ofrecen los métodos SRM, se siguió un método geLC más directo para el enriquecimiento de clusterina que sería más compatible con el análisis de alto rendimiento, tal como se requeriría para un diagnóstico clínico.

Inicialmente, para identificar la ubicación de la clusterina en un experimento de electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS unidimensional (SDS-PAGE), en plasma humano normal (Dade-Behring, Alemania) se agotó la albúmina y el IgG y las proteínas se extrajeron en tampón de Laemmli y se sometieron a SDS-PAGE. La Figura 13 muestra el análisis Gel-l0 de agotamiento albúmina/IgG del plasma. Las diez bandas se extirparon, redujeron, alquilaron y digirieron con tripsina antes del análisis de MS en un Orbitrap Velos Pro. Se identificaron glicopéptidos de clusterina en los compendios trípticos de las bandas #5, #6 y #7 (datos no mostrados) viéndose la mayoría en la banda #7 con 45% de cobertura de péptido.

Las diez bandas de gel digeridas con tríptico también se enviaron para su análisis utilizando el método SRM glicoforma de clusterina recientemente desarrollado para confirmar la idoneidad del método geLC para la preparación de muestras. La Figura 14 muestra que se encontraron glicopéptidos de clusterina en las bandas #5, #6 and #7 y la mayoría de la clusterina se identificó en la banda #7, lo que sugiere que estos resultados de glyco-SRM coinciden con los datos de descubrimiento anteriores de Orbitrap Velos Pro.

Cuando se examinaron los archivos de datos SRM para los cromatogramas de iones extraídos (XIC) de ocho precursores de glicopéptido I364N (Figura 15), se pudo determinar que la mayoría de ellos eluyeron entre 7 y 8 minutos. La identificación precisa del tiempo de elución permite la programación posterior de SRM o el ajuste de los tampones de elución para mejorar la separación de especies estrechamente relacionadas, si posteriormente se deben desarrollar métodos más complejos.

Es una ventaja particular del presente método que el área de pico integrado para cada especie monitoreada se puede usar para la cuantificación sin etiqueta usando un enfoque de escala de suma. Además, dado que este método Gel10-glyco-SRM no requiere inmunoprecipitación y los Glicopéptidos de clusterina pueden detectarse en 30 minutos por TSQ, en lugar de en una hora en Orbitrap, este nuevo método proporciona una forma más eficiente y rápida de verificar el biomarcador potencial glicopéptido de la clusterina. El mismo método también se puede usar para la evaluación clínica de muestras de pacientes para ayudar al diagnóstico de DCL y la enfermedad de Alzheimer, así como para proporcionar información de pronóstico sobre la tasa de atrofia del hipocampo y deterioro cognitivo. También se entendería que el mismo método SRM se puede aplicar con poca optimización adicional al plasma, suero, saliva, orina o líquido cefalorraquídeo humanos, digeridos sin la necesidad de una separación SDS-PAGE previa.

También es posible emplear el mismo método SRM para el análisis de clusterina enriquecida a partir de plasma humano por inmunoprecipitación. Por lo tanto, para validar aún más nuestro biomarcador específico glicopéptidos, se aplicó el método clusterina glicol-SRM para evaluar la clusterina inmunoprecipitada de la Cohorte de Descubrimiento. Como era de esperar, el método SRM arrojó resultados cuantitativos más ajustados y esta precisión mejorada resultó en niveles más altos de significación para la reducción de glicoformas específicas en pacientes con Alzheimer con niveles más altos de atrofia del hipocampo (Tabla 5). En total, cinco de los ocho glicopéptidos monitoreados en I364N se redujeron significativamente en casos de atrofia alta.

En la Figura 12 se proporciona una selección de diagramas de caja para la cuantificación SRM de glicoformas de clusterina individuales.

Tabla 5 Cambios significativos en los glicopéptidos de clusterina empleando el método Gel10-glyco-SRM (4 vs 4) cohorte de descubrimiento

Ejemplo 7 - Estudio de validación del ensayo de monitoreo de reacción seleccionado GEL10-glyco-SRM

El octavo ensayo de glicopéptido de clusterina GEL10-glyco-SRM desarrollado en el Ejemplo 6 se aplicó al análisis de la Cohorte de Validación de las muestras de plasma de pacientes con la enfermedad de Alzheimer, que comprenden 9 casos con nivel [alto] de atrofia hipocampal y 10 casos con nivel [bajo] de atrofia del hipocampo. Las muestras fueron como se describen en la Tabla 2 y todos los métodos de preparación de muestras y analíticos se realizaron como se describe en el Ejemplo 6.

En esta cohorte, tres glicoformas específicas de sitio específico I364N mostraron una diferencia estadísticamente significativa entre los pacientes con niveles altos de atrofia del hipocampo y aquellos con tasas más bajas de atrofia del hipocampo (Tabla 6).

Ta l - R n imi n l n l1 - l - RM li f rm l rin n l h r v li ión

Cuando se combinaron los resultados para las Cohortes de Descubrimiento y Validación, sorprendentemente, las ocho glicoformas obtuvieron significancia estadística para concentraciones reducidas en el grupo atrofia alta, en comparación con aquellos con atrofia baja del hipocampo (Tabla 7). La capacidad de estos ocho glicopéptidos de clusterina para diferenciar a los pacientes con base en su volumen del hipocampo, proporciona un medio mínimamente invasivo para diagnosticar y predecir la progresión de la enfermedad de Alzheimer.

Tabla 7 - Rendimiento combinado de Gel10-glyco-SRM de glicoforma de clusterina SRM en las cohortes de descubrimiento validación combinadas

Conclusiones

Un método SRM de alta sensibilidad para ocho glicopéptidos específicos unidos a N en I364n de clusterina humana puede diferenciar entre los casos de enfermedad de Alzheimer con atrofia alta del hipocampo y casos de deterioro cognitivo leve con atrofia baja del hipocampo. Este método puede proporcionar la base para una prueba clínica de rutina para evaluar la atrofia del hipocampo, con base en la detección del nivel de glicoformas específicas en un paciente individual y compararlo con niveles conocidos para representar niveles específicos de atrofia del hipocampo.

Referencias

Andreasen, N., C. Hesse, et al. (1999). "Cerebrospinal fluid beta-amyloid(1-42) in Alzheimer disease: differences between early- and late-onset Alzheimer disease and stability during the course of disease." Arch Neurol 56(6): 673-80.

Bosman, G. J., I. G. Bartholomeus, et al. (1991). "Erythrocyte membrane characteristics indicate abnormal cellular aging in patients with Alzheimer's disease." Neurobiol Aging 12(1): 13-8.

Butterfield, D. A., J. B. Owen (2011). "Lectin-affinity chromatography brain glycoproteomics and Alzheimer disease: insights into protein alterations consistent with the pathology and progression of this dementing disorder. "Proteomics Clin Appl. 5(1-2) :50-6

Friedland, R. P. (1993). "Epidemiology, education and the ecology of Alzheimer's disease." Neurology 43(2): 246-9.

Ida, N., T. Hartmann, et al. (1996). "Analysis of heterogeneous A4 peptides in human cerebrospinal fluid and blood by a newly developed sensitive Western blot assay." J Biol Chem 271(37): 22908-14.

Kanai, M., E. Matsubara, et al. (1998). "Longitudinal study of cerebrospinal fluid levels of tau, A beta1-40 and A beta1-42(43) in Alzheimer's disease: a study in Japan." Ann Neurol 44(1): 17-26.

Kawarabayashi, T., L. H. Younkin, et al. (2001). "Age-dependent changes in brain, LCR y plasma amyloid (beta) protein in the Tg2576 transgenic mouse model of Alzheimer's disease." J Neurosci 21(2): 372-81.

Killick, R., E. M. Ribe, et al. (2012). "Clusterina regulates p-amyloid toxicity via Dickkopf-1-driven induction of the wnt-PCP-JNK pathway." Mol Psychiatry. doi: 10,1038/mp,2012,163. [Epub antes de la impresión]

Kosaka, T., M. Imagawa, et al. (1997). "The beta APP717 Alzheimer mutation increases the percentage of plasma amyloidbeta protein ending at A beta42(43)." Neurology 48(3): 741-5.

Kuo, Y. M., T. A. Kokjohn, et al. (2000). "Elevated abeta42 in skeletal muscle of Alzheimer disease patients suggests peripheral alterations of AbetaPP metabolism." Am J Pathol 156(3): 797-805.

Lindner, M. D., D. D. Gordon, et al. (1993). "Increased levels of truncated nerve growth factor receptor in urine of mildly demented patients with Alzheimer's disease." Arch Neurol 50(10): 1054-60.

Nuutinen T., T. Suuronen, et al. (2009) "Clusterin: a forgotten player in Alzheimer's disease." Brain Res Rev. 61(2):89-104.

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Un método para evaluar el nivel de atrofia del hipocampo en un sujeto de prueba con enfermedad de Alzheimer (EA), caracterizado porque comprende:

(i) proporcionar una muestra que contiene proteínas que se ha obtenido del sujeto de prueba;

(ii) determinar la concentración, cantidad o grado de expresión de al menos una glicoforma de clusterina, en donde glicoformas tetra-antenarias de los al menos un glicoforma de clusterina, como una proporción del total de todas las glicoformas del mismo fragmento de glicoproteína, se cuantifican;

(iii) comparar dicha concentración, cantidad o grado determinado en (ii) con una referencia de un sujeto de control que tiene EA con un nivel bajo de atrofia del hipocampo;

(iv) Con base en el nivel de al menos una glicoforma de clusterina en el sujeto de prueba relativo a la referencia, realizar una evaluación del nivel de atrofia del hipocampo en el sujeto de prueba,

en donde un nivel relativo más bajo de glicoformas tetra-antenarias en la muestra del sujeto de prueba, en comparación con el nivel relativo de glicoformas tetra-antenarias en la referencia del sujeto de control, indica que se prevé que el sujeto de prueba tenga un nivel relativamente más alto de atrofia del hipocampo,

en donde dicho al menos un glicoforma de clusterina comprende un fragmento glicosilado de clusterina humana que consiste en HN*STGCLR (SEQ ID NO: 2), en donde "N*" indica el residuo de adhesión de glicano, y

en donde la muestra que contiene proteínas se selecciona del grupo que consiste en: plasma sanguíneo, células sanguíneas o suero.

2. El método según la reivindicación 1, caracterizado porque, dicha al menos una glicoforma de clusterina comprende además:

a) cualquiera de los glicopéptidos de clusterina expuestos en la Tabla 3A, Tabla 3B, Tabla 3C, Tabla 5, Tabla 6 y/o Tabla 7; y/o

b) un glicano I364N seleccionado del group que consiste en: IJ64N_SA1-(HexNAc-Hex)2-central; IJ64N_SA2-(HexNAc-Hex)2-central; IJ64N_SA1-(HexNAc-Hex)3-central; IJ64N_SA2-(HexNAc-Hex)3-central; IJ64N_SA1-(HexNAc-Hex)4-central; IJ64N_SA3-(HexNAc-Hex)3-central; IJ64N_SA2-(HexNAc-Hex)4-central; y IJ64N_SA3-(HexNAc-Hex)4-central.

3. El método según la reivindicación 1 o reivindicación 2, caracterizado porque, las glicoformas de clusterina se miden usando:

a) electroforesis en gel; o

b) LC-MS/MS; y en donde, preferiblemente, la cantidad relativa de cada glicoforma se calcula en comparación con un isótopo pesado equivalente marcado con una glicoforma de referencia, utilizando espectrometría de masas de Monitoreo de Reacción Seleccionada.

4. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque, las glicoformas de clusterina son:

a) medidas usando espectrometría de masas de Monitoreo de Reacción Seleccionada (SRM) a escala de suma; y/o b) no estan marcadas;

5. El método según la reivindicación 3, caracterizado porque, el isótopo pesado marcado como glicoforma de clusterina de referencia es:

a) un glicopéptido sintético, en donde uno o más isótopos pesados de H, C, N o O se sustituyen dentro de los componentes de péptido o azúcar de dicha glicoforma; or

b) una glicoforma de clusterina enriquecida y natural que se ha marcado con una etiqueta de masa isotópica, en donde dicha etiqueta de masa isotópica comprende uno o más isótopos pesados de H, C, N u O y en donde, dicha etiqueta de masa es capaz de reaccionar con los componentes del péptido o azúcar de dicha glicoforma.

6. El método según la reivindicación 3, caracterizado porque, la cantidad relativa de cada glicoforma de clusterina se calcula en comparación con una glicoforma de clusterina equivalente, marcada con una etiqueta de masa isobárica, en donde:

(i) cada muestra tomada del sujeto de prueba está marcada con un miembro de una etiqueta de masa isobárica establecida, para crear una muestra analítica marcada;

(ii) un panel de referencia estándar de glicoformas de clusterina enriquecidas se dividen entre dos y seis alícuotas y cada alícuota se marca por separado con miembros adicionales del mismo conjunto de etiquetas de masa isobárica que la muestra analítica marcada y cada alícuota marcada independientemente del panel de referencia, se mezcla en una proporción predeterminada para crear una curva de concentración clínicamente relevante, como mezcla referencia estándar;

(iii) un volumen igual de la muestra analítica marcada y la mezcla de referencia estándar se mezclan, para formar la muestra del calibrador MS; y

(iv) la muestra del calibrador MS preparada en el paso (iii) se analiza por espectrometría de masas;

en donde, preferiblemente, el conjunto de etiquetas de masa isobárica es un conjunto de Etiquetas de Masa en Tándem.

7. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque, la al menos una glicoforma de clusterina se mide mediante un ensayo inmunológico, en donde, preferiblemente el ensayo inmunológico comprende Western blot o ELISA.

8. Un método para estratificar una pluralidad de sujetos de prueba de acuerdo con su etapa de la enfermedad de Alzheimer (EA), caracterizado porque comprende:

realizar el método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en al menos una muestra de prueba de cada uno de los sujetos de prueba humanos; y

con base en el nivel de al menos una glicoforma de clusterina específica en cada uno de los sujetos de prueba, clasificar a los sujetos de prueba en estados más o menos avanzados de EA; en donde los sujetos de prueba se clasifican de acuerdo con su grado previsto de atrofia del hipocampo.

9. Un método para determinar la eficacia de un tratamiento para la enfermedad de Alzheimer (EA) en un sujeto mamífero, que comprende:

determinar el nivel de una o más glicoformas de clusterina mediante la realización del método según cualquiera de las reivindicaciones 1 to 7, antes del tratamiento del sujeto y al menos una vez durante o después del tratamiento del sujeto, en donde el éxito del tratamiento se demuestra por el nivel de dicha o más glicoformas de clusterina permaneciendo estable o volviendo a niveles más normales, en donde, el sujeto es humano.