ES2909707T3

ES2909707T3 - Mofezolaco y dos derivados para su uso en el tratamiento de la neuroinflamación

Info

Publication number: ES2909707T3
Application number: ES17723517T
Authority: ES
Inventors: Antonio Scilimati; Maria Grazia Perrone; Paola Vitale
Original assignee: Universita degli Studi di Bari Aldo Moro
Current assignee: Universita degli Studi di Bari Aldo Moro
Priority date: 2016-04-27
Filing date: 2017-04-26
Publication date: 2022-05-10
Anticipated expiration: 2037-04-26
Also published as: WO2017187352A1; EP3782990B1; US20190111025A1; EP3782990A1; US20210023055A1; ES2953884T3; EP3448840B1; EP3448840A1; US12011433B2

Abstract

Un compuesto para usar en el tratamiento de la neuroinflamación en donde dicho compuesto se selecciona entre el grupo que consiste en (el azúcar de GALMOF0 es D-galactosa): **(Ver fórmula)**

Description

DESCRIPCIÓN

Mofezolaco y dos derivados para su uso en el tratamiento de la neuroinflamación

Campo técnico de la invención

La invención se refiere a tres compuestos dirigidos a la COX-1 para su uso en el tratamiento de la neuroinflamación (es decir, la inflamación del tejido nervioso), en particular en enfermedades neurológicas (p. ej., trastornos del espectro autista) y neurodegenerativas (p. ej., enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), esclerosis múltiple (EM), traumatismo craneoencefálico (TCE), demencia por VIH y enfermedades priónicas).

Antecedentes de la invención

Las ciclooxigenasas (COX), conocidas como dos isoformas COX-1 y COX-2, son las enzimas clave en la conversión del ácido araquidónico en prostaglandinas y tromboxano. El ácido araquidónico (AA) se libera de la membrana celular también ante estímulos inflamatorios y mitógenos. La inflamación es una fase común de muchas enfermedades.

La COX-1 desempeña una función previamente no reconocida en la neuroinflamación. La ablación genética o la inhibición farmacológica de la actividad catalítica de la COX-1 atenúa la respuesta inflamatoria y la pérdida neuronal. En este contexto, el tratamiento de células microgliales estimuladas por LPS (un modelo de neuroinflamación aceptado en todo el mundo) mediante inhibidores selectivos de la COX-1 (P6, P10, SC-560, aspirina) y coxibs (celecoxib y etoricoxib) determina la supresión total de la expresión de COX-1 o COX-2 por sus respectivos inhibidores selectivos; NF-kB permaneció casi completamente inactivo en presencia de coxibs, como se esperaba, y totalmente inactivo en presencia de P6; P6 también contrarrestó notablemente LPS mejorando la expresión de ARNm de cPGES y la producción de PGE². A continuación, ya que la COX-1 se localiza predominantemente en la microglía, su inhibición muy selectiva, en lugar de COX-2 (por coxibs), es más probable que reduzca la neuroinflamación y, por lo tanto, debe considerarse como un enfoque terapéutico potencial para tratar la neuroinflamación y prevenir farmacológicamente enfermedades neurológicas (p. ej., trastornos del espectro autista) y neurodegenerativas (p. ej., enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), esclerosis múltiple (EM), traumatismo craneoencefálico (TCE), demencia por VIH y enfermedades priónicas) con un componente inflamatorio marcado [Scilimati et al. Pharmacol. Res. 65 (2012) 137-148]. Hasta el momento, entre los fármacos antiinflamatorios no esteroideos tradicionales (AINEt), solo se han identificado algunos ejemplos de inhibidores selectivos de la COX-1.

Por tanto, sigue existiendo una necesidad en la técnica de potentes inhibidores específicos de la COX-1 que sean eficaces en el tratamiento o la detección de trastornos o enfermedades relacionados con la COX-1 tales como la neuroinflamación.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a tres compuestos dirigidos a la COX-1 y capaces de atravesar la barrera hematoencefálica y, por lo tanto, útiles para tratar la neuroinflamación.

Por lo tanto, un objeto de la invención es mofezolaco, su éster metílico o GALMOF⁰mostrado a continuación en el presente documento para su uso en el tratamiento de la neuroinflamación, en particular en enfermedades neurológicas (p. ej., trastornos del espectro autista) o neurodegenerativas (p. ej., enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), esclerosis múltiple (EM), traumatismo craneoencefálico (TCE), demencia por VIH y enfermedades priónicas).

Los compuestos son útiles para tratar la neuroinflamación relacionada con la COX-1 y, por lo tanto, enfermedades neurológicas y neurodegenerativas, porque dichos compuestos seleccionados pueden atravesar la barrera hematoencefálica (a través de los transportadores GLUT) y después alcanzar el sistema nervioso central.

Un objeto adicional de la invención es una composición farmacéutica que comprende mofezolaco, éster metílico de mofezolaco o GALMOF⁰como principio activo y un excipiente y/o vehículo farmacológicamente aceptable para su uso en el tratamiento de la neuroinflamación.

Otros objetos resultarán evidentes a la luz de la siguiente descripción detallada.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Curvas de respuesta a la concentración de mofezolaco y actividad inhibidora de COX-1 GALMOFn (n = 0, 4, 10).

Figura 2. Representación esquemática de la monocapa de Caco-2 en un sistema transwell.

Figura 3. Imágenes de Perkin-Elmer Operetta (ampliación 20x) adquiridas de canales de Hoechst 33342 (a,a') y Alexa Fluor® 594 (b, b') (a,b: anticuerpo monoclonal de ratón anti-Glut-1; a',b': control no inmunitario). Las imágenes combinadas de ab ad a'-b' se muestran en c y c', respectivamente.

Figura 4. Gráfico de calibración de GALMOFo.

Figura 5. Perfil de elución de HPLC de GALMOF⁰.

Figura 6. Perfil de elución de HPLC de GALMOF⁰después de 48 h de incubación a 37 °C y pH = 7,3.

Figura 7. Perfil de elución de HPLC de GALMOF⁰después de 48 h de incubación a 37 °C y pH = 8.

Figura 8. Perfil de elución de HPLC de GALMOF⁰incubado con los microsomas y el sistema de regeneración de NADPH. Cmicr+NADPH = 68,02 mUA*s es la concentración después de la incubación. Se descubrió que el GALMOF⁰era metabólicamente estable. De hecho, se encontró 96 % de GALMOF⁰residual después de 30 min de tratamiento con microsomas.

Figura 9. Perfil de elución de HPLC de GALMOF⁰incubado solo con los microsomas. Cmicr = 70,51 mUA*s es la concentración después de la incubación.

Figura 2S. Inmunorreactividad de GFAP en el hipocampo (A), caudado - putamen (B), lóbulo frontal (C) y sustancia negra (D), en cortes de control (CTR), vehículo de LPS (v-LPS), LPS, ratones tratados con mofezolaco y LPS (M-LPS).

Figura 3S. Inmunorreactividad de Iba-1 en el hipocampo (A), caudado - putamen (B), lóbulo frontal (C) y sustancia negra (D), en cortes de control (CTR), vehículo de LPS (v-LPS), LPS, ratones tratados con mofezolaco y LPS (M-LPS).

Figura 4S. Efecto de mofezolaco en la expresión de GFAP, Iba-1, COX y plkBa en caudado-putamen de ratones tratados con LPS solo y LPS en presencia de mofezolaco. La cuantificación de las intensidades relativas de las bandas se expresó como densidad relativa, después de la normalización frente a la densitometría de p-actina. Los valores representan las medias ± ET de tres experimentos independientes. C = control, vLPS = vehículo de LPS, vM = vehículo de mofezolaco, M vLPS = mofezolaco y vehículo de LPS, vM LPS = vehículo de mofezolaco y LPS, M LPS = mofezolaco y LPS. §§§ p < 0,001 en comparación con control o vLPS; *** p < 0,001 en comparación con LPS solo.

Figura 5S. Efecto de mofezolaco en la expresión de GFAP, Iba-1, COX y plkBa en hipocampo de ratones tratados con LPS solo y LPS en presencia de mofezolaco. La cuantificación de las intensidades relativas de las bandas se expresó como densidad relativa, después de la normalización frente a la densitometría de p-actina. Los valores representan las medias ± ET de tres experimentos independientes. C = control, vLPS = vehículo de LPS, vM = vehículo de mofezolaco, M vLPS = mofezolaco y vehículo de LPS, vM LPS = vehículo de mofezolaco y LPS, M LPS = mofezolaco y LPS. §§§ p < 0,001 en comparación con control o vLPS; *** p < 0,001 en comparación con LPS solo.

Figura 6S. Efecto de mofezolaco en la expresión de GFAP, Iba-1, COX y plkBa en el lóbulo frontal de ratones tratados con LPS solo y LPS en presencia de mofezolaco. La cuantificación de las intensidades relativas de las bandas se expresó como densidad relativa, después de la normalización frente a la densitometría de p-actina. Los valores representan las medias ± ET de tres experimentos independientes. C = control, vLPS = vehículo de LPS, vM = vehículo de mofezolaco, M vLPS = mofezolaco y vehículo de LPS, vM LPS = vehículo de mofezolaco y LPS, M LPS = mofezolaco y LPS. §§§ p < 0,001 en comparación con control o vLPS; *** p < 0,001 en comparación con LPS solo.

Figura 7S. Efecto de mofezolaco en la expresión de GFAP, Iba-1, COX y pIkBa en la sustancia negra de ratones tratados con LPS solo y LPS en presencia de mofezolaco. La cuantificación de las intensidades relativas de las bandas se expresó como densidad relativa, después de la normalización frente a la densitometría de p-actina. Los valores representan las medias ± ET de tres experimentos independientes. C = control, vLPS = vehículo de LPS, vM = vehículo de mofezolaco, M vLPS = mofezolaco y vehículo de LPS, vM LPS = vehículo de mofezolaco y LPS, M LPS = mofezolaco y LPS. §§§ p < 0,001 en comparación con control o vLPS; *** p < 0,001 en comparación con LPS solo.

Figura 8S. Efectos de los inhibidores de COX-1 sobre la expresión de COX y la fosforilación de NF-kB inducida por LPS en células microgliales BV2. La proteína total se sometió a SDS-PAGE, seguido de inmunotransferencia usando el anticuerpo pIkBa. La cuantificación de las intensidades relativas de las bandas se expresó como densidad relativa, después de la normalización frente a la densitometría de p-actina. Cada barra representa las medias ± ET de tres experimentos independientes. Las células microgliales BV2 incubadas con medio solo (control) o tratadas con LPS solo o en presencia de P6 y mofezolaco (M) durante 48 h. §§§ p < 0,001 frente al control, *** p < 0,001 frente a LPS solo.

Descripción detallada de la invención

Compuestos para uso de la invención

La invención se refiere a tres compuestos que tienen las siguientes fórmulas (GALMOF⁵y GALMOF¹¹son compuestos de referencia):

Compuestos dirigidos a la COX-1 en el sistema nervioso central (SNC)

Más en detalle, los compuestos son útiles en el tratamiento de procesos inflamatorios que están estrechamente relacionados con los procesos degenerativos del cerebro. La neuroinflamación es la etapa principal en la progresión de varios trastornos neurodegenerativos tales como la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, esclerosis múltiple, traumatismo craneoencefálico y encefalitis por VIH, y en enfermedades mentales tales como los trastornos del espectro autista.

La ciclooxigenasa (COX)-1 ejerce una función importante en el proceso neuroinflamatorio y se expresa de manera constitutiva en la microglía, que a su vez se activa por lesiones del sistema nervioso central (SNC). La COX-1 microglial responde rápidamente a estos estímulos causales al producir la prostaglandina proinflamatoria, tal como la PGE². Por tanto, se espera que una inhibición selectiva de la COX-1 sea útil en el tratamiento de la etapa temprana de la neuroinflamación.

El cruce de la barrera hematoencefálica (BHE) por parte de los fármacos es uno de los desafíos de todos los científicos que se enfocan en las enfermedades del sistema nervioso central. La baja permeabilidad de la BHE es el principal impedimento para los fármacos dirigidos al SNC. Algunos de los compuestos son capaces de "transportar" la molécula completa al SNC mediante el transportador GLUT-1, que está ubicado en la membrana de las células endoteliales vasculares. GLUT-1 pertenece a la familia de proteínas homólogas GLUT (GLUT-1-5 que difieren en su distribución tisular y afinidad por las hexosas). GLUT-1 está presente en eritrocitos, la BHE y la placenta y tiene la misma constante de afinidad por D-glucosa y D-galactosa (Km = 17 nM).

Por lo tanto, según una realización de la presente invención, el mofezolaco conjugado con D-galactosa (GALMOF⁰) se puede usar en la composición farmacéutica para el tratamiento de procesos inflamatorios y el tratamiento de varias enfermedades seleccionadas del grupo que consiste en neuroinflamación, enfermedades neurológicas y enfermedades neurodegenerativas. Son ejemplos de trastornos neurodegenerativos la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, esclerosis múltiple, traumatismo craneoencefálico y encefalitis por VIH.

Composiciones farmacéuticas

Estas composiciones farmacéuticas y tipos de formulación pueden contener de 0,1 a aproximadamente 500 mg del principio activo seleccionado de los compuestos descritos en la presente invención. Las formas habituales de dosificación unitaria contienen de 1 a 100 mg del principio activo.

Aplicaciones terapéuticas

Una neuroinflamación es difícil de tratar debido a la dificultad que tienen la mayoría de los fármacos antiinflamatorios no esteroideos tradicionales (AINEt) para atravesar la barrera hematoencefálica y, por lo tanto, alcanzar el sistema nervioso central. Según una realización de la invención, GALMOF⁰puede ser reconocido por los transportadores de azúcar (GLUT 1 y GLUT 2) expresados en la barrera hematoencefálica como también se muestra en la sección experimental de la presente solicitud.

Método de tratamiento

En el método de tratamiento, la cantidad efectiva administrada y la frecuencia de administración de los compuestos dependerán de la afección particular que se va a tratar, la gravedad de la afección que se va a tratar, la edad, el peso y la condición física general del paciente en particular, así como de otros medicamentos que el paciente esté tomando, como conocen bien los expertos en el campo.

La cantidad efectiva de los compuestos que se van a administrar diariamente o por dosis, está dentro de un intervalo de 0,1 ng a 100 mg por kg de peso corporal, preferentemente dentro de un intervalo de 1 ng a 10 mg por kg de peso corporal.

EJEMPLOS, DATOS QUÍMICOS Y BIOLÓGICOS

La invención se detalla a continuación en el presente documento a través de los siguientes ejemplos de preparación de los compuestos ya través de su ensayo biológico.

Ejemplos

1.1 Síntesis de los compuestos GALMOFn (n = 0, 4, 10)

1,2:3,4-d¡-0-¡soprop¡l¡den-a-D-galactop¡ranosa

1,2:3,4-Di-0-isopropiliden-6-0-{2-[3,4-bis(4-metoxifenil)isoxazol-5-il1acetil}-D-galactopiranosa. A una solución fría (baño de hielo) de ácido 2-(3,4-bis(4-metoxifenil)isoxazol-5-il)acético (mofezolaco, 300 mg, 0,885 mmol) y 1,2:3,4-D¡-O-isopropilideno-D-galactosa (230 mg, 0,885 mmol) en CH²Cl²(5 ml), se le añadieron 4-(dimetilamino)piridina (DMAP) (27 mg, 0,22 mmol) y clorhidrato de W-(3-dimetilaminopropil)-W-etilcarbodiimida (EDC HCl, 680 mg, 3,56 mmol) en porciones en una atmósfera de argón. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 24h y después se inactivó añadiendo agua destilada. La fase acuosa se extrajo tres veces con EtOAc. Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 anhidro, se filtraron y el disolvente se retiró a presión reducida. El producto (375 mg) se aisló por cromatografía en columna (gel de sílice; CHCb/MeOH 95:5) del material en bruto de la reacción. Rendimiento del 73 %. RMN 1H (300 MHz, CDCb, 8): 7,41-7,36 (m, 2H, protones aromáticos); 7,19-7,14 (m, 2H, protones aromáticos); 6,94-6,89 (m, 2H, protones aromáticos); 6,85-6,81 (m, 2H, protones aromáticos); 5,53 (d, 1H, J = 4,95 Hz); 4,61 (dd, 1H, J = 8,0 Hz, J = 2,5 Hz); 4,34-4,25 (m, 2H); 4,18 (dd, 2H, J = 8,0 Hz, J = 1,9 Hz); 4,05-3,99 (m, 1H); 3,83 (s, 3H OCHa); 3,80 (s, 3H, OCH³); 3,79 (s, 2H, CH²); 1,45 (s, 6H, ²CH³); 1,32 (s, 3H); 1,31 (s, 3H). IEN-EM m/z (%): C³¹H³⁵NO¹⁰(M Na)+: 604.

((2S.3R4S.6ft)-3,4,5,6-tetrahidroxitetrahidro-2H-pirano-2-il-)metil-(2-(3,4-di(4-metoxifenil)isoxazol-5-il)acetato. Se añadió ácido trifluoracético (TFA, 1,3 ml, d = 1,47 g/ ml, 16,7 mmol)) a una solución de 1,2:3,4-di-O-iso-propilideno-6-O-{2-[3,4-bis(4-metoxifenil)isoxazol-5-il]acetil}-D-galactopiranose (440 mg, 0,76 mmol) en CH²Cl²seco (5 ml). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 24 h. El progreso de la reacción se monitorizó por TLC. Después, el disolvente se destiló a presión reducida y el producto se aisló en forma de un sólido de color blanco (148 mg, rendimiento del 39 %) mediante una columna cromatografía (gel de sílice; CHCb/MeOH = 9:1) del residuo en bruto. Pf 117-119 °C. RMN 1H (500 MHz, CDCb, 8): 7,29-7,27 (m, 2H, protones aromáticos); 7,26-7,05 (m, 2H, protones aromáticos); 6,81-6,80 (m, 2H, protones aromáticos); 6,76-6,73 (m, 2H, protones aromáticos); 5,50-5,35 (s a, 4H, OH: intercambio con D²O); 5,38 (s, 1H, 1'H galactosa); 4,60 (s, 1H, 3'H galactosa); 4,29-4,22 (m, 2H, 2'H-4'H galactosa); 4,07-4,02 (m, 1H, 5'H galactosa); 3,84-3,81 (dd, 2H, 6'H galactosa); 3,84 (s, 3H, OCH³); 3,73 (s, 3H, OCH³); 3,74 (s, 2H, OCH²). RMN 13C (75 MHz, CDCb, 8): 168,1,161,9, 161,8, 160,7, 160,5, 159,3, 131, 129,7, 121,2, 120,8, 117,5, 114,3, 113,9, 72,4, 55,15, 31,6, 29,6. IEN-EM m/z (%): C²⁵H²⁷NO¹⁰(M Na)+: 524.

Clorhidrato de 5-aminopentanoato de metilo. A una solución agitada de ácido 5-aminopentanoico (500 mg, 4,27 mmol) en MeOH seco (5 ml) mantenida a -10 °C, se le añadió gota a gota SOCb (1,1 ml, d = 1,631 g/ ml, 15 mmol). La mezcla de reacción obtenida se calentó a reflujo durante 3 h. Después, el exceso de SOCb y MeOH se destilaron a presión reducida, usando una trampa de NaOH. El producto se obtuvo en forma de un sólido de color blanco con un rendimiento del 79 % (645 mg) y se usó en la siguiente reacción sin purificación adicional. RMN 1H (300 MHz, CDCb, 8): 8,28 (s a, 3H, NH³); 3,67 (s, 3H, OCH³); 3,04 (m, 2H, CH²NH²); 2,38 (t, 2H, CH²CO); 1,8-1,73 (m, 4H, CH²CH²).

5-{2-[3.4-D¡(4-metox¡fen¡l)¡soxazol-5-¡l1acetam¡do}pentanoato de metilo. Se solubilizaron diisopropil etilamina (DIEA, 0,215 ml, 1,237 mmol) y clorhidrato de 5-aminopentanoato de metilo (100 mg, 0,60 mmol) en CH²Cb seco (5 ml) y se agitaron a 0 °C durante 1 h. Después, esta solución se añadió gota a gota a gota a una solución agitada de N.N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC, 170 mg, 0,825 mmol), monohidrato de 1-hidroxibenzotriazol (HOBt H²O, 180 mg, 1,05 mmol) y ácido 2-[3,4-bis(4-metoxifenil)isoxazol-5-il]acético (mofezolaco) (200 mg, 0,59 mmol) en CH²Cb seco (20 ml) manteniéndose a 0 °C. La reacción se agitó durante 19 h a temperatura ambiente. Después, se añadió H²O y la solución acuosa se extrajo con CH²Cl². Las capas orgánicas combinadas se lavaron con una solución sat. de K²CO³, se secó sobre Na2SO4 anhidro y el disolvente se retiró a presión reducida. La cromatografía en columna del residuo en bruto (gel de sílice; EtOAc/Hexano = 3:7) proporcionó el producto en forma de un sólido (107 mg, rendimiento del 40 %). FT-IR (KBr): 3458, 3089, 2987, 2948, 1737, 1652, 1609, 1562, 1516, 1455, 1441, 1426, 1253, 1233, 1175, 1108, 1029, 1019, 949, 831, 729 cm-1. RMN 1H (300 MHz, CDCb, 8): 7,41-7,37 (m, 2H, protones aromáticos), 7,17 7,14 (m, 2H, protones aromáticos), 6,92-6,89 (m, 4H, protones aromáticos), 5,9 (s a, 1H, NH: intercambios con D²O), 3,83 (s, 3H, OCH³), 3,80 (s, 3H, OCH³), 3,67 (s, 2H, CH²CONH), 3,65 (s, 3H, OCH³), 3,27 (c, 2H, J = 6,9 Hz, NHCH²), 2,33 (t, 2H, J = 6,9 Hz, CH²CO²), 1,65-1,50 (m, 4H, CH²CH²). RMN 13C (75 MHz, CDCla, 8): 174,1, 166,8, 162,8, 161,4, 160,8, 159,7, 131,2, 130,0, 121,6, 121,2, 117,8, 114,6, 114,2, 55,5, 55,4, 39,7, 34,4, 33,6, 29,0, 22,2. IEN-EM: m/z (%): C²⁵H²⁸N²O⁶(M Na)+: 475.

Ácido 5-(2-(3.4-d¡(4-metox¡fen¡l)isoxazol-5-¡l)acetam¡do)pentano¡co. A una solución de 5-(2-(3,4-bis(4-metoxifenil)isoxazol-5-il)acetamido)pentanoato de metilo (50 mg, 0,11 mmol) en THF (2 ml) se le añadió gota a gota a gota una solución de LiOH 0,5 N (68 mg, 2,83 mmol, en 6 ml de H²O) a temperatura ambiente. Después de 2 h, se añadió HCl 1 N (5 ml) y la fase acuosa se extrajo con EtOAc. Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 anhidro y el disolvente se evaporó a presión reducida proporcionando el producto en forma de un sólido de color blanco (30 mg, rendimiento del 63 %). FT-IR (KBr): 3330, 2921, 1720, 1641, 1607, 1540, 1514, 1468, 1424, 1406, 1303, 1247, 1180, 1030, 952, 901, 831 cm-1. RMN 1H (300 MHz, CDCb, 8): 7,37-7,34 (m, 2H, protones aromáticos), 7,15-7,12 (m, 2H, protones aromáticos); 6,90-6,87 (m, 2H, protones aromáticos), 6,83-6,81 (m, 2H, protones aromáticos), 6,28 (s a, 1H, NH: intercambios con D²O), 3,81 (s, 3H, OCH³); 3,78 (s, 3H, OCH³); 3,67 (s, 2H, CH²CONH); 3,26 (c, 2H, J = 6,1 Hz, NHCH²); 2,37 (t, 2H, J = 6,6 Hz, CH²CO²); 1,61-1,41 (m, 4H, CH²CH²). RMN 13C (75 MHz, CDCl3, 8): 177,2, 166,9, 162,8, 161,4, 160,9, 159,7, 131,3, 130,1, 121,5, 121,1, 117,8, 114,6, 114,2, 55,6, 55,4, 39,7, 34,4, 33,3, 28,9, 21,9. IEN-EM m/z (%): C²⁴H²⁶N²O⁶(M+Na)+: 461; (M-H)- 437.

1,2:3,4-Di-O-isopropilideno-6-O-(5-{2-[3,4-bis(4-metoxifenil)isoxazol-5-il]acetamido}pentanoil)-D-galactopiranosa. A una solución de ácido 5-{2-[3,4-bis(4-metoxifenil)isoxazol-5-il]acetamido}pentanoico (85 mg, 0,194 mmol) y 1,2:3,4-Di-O-isopropilideno-D-galactosa (51 mg, 0,196 mmol) en CH²Cl²(5 ml), mantenida en agitación y a 0 °C, se le añadieron 4-(dimetilamino)piridina (DMAP, 5 mg, 0,041 mmol) y clorhidrato de A/-(3-dimetilaminopropil)-W'-etilcarbodiimida (EDC HCl, 149 mg, 0,78 mmol) en porciones en una atmósfera de argón. Después, la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 24 h, la capa orgánica se lavó con agua y salmuera, se secó sobre Na2SO4, se filtró y el disolvente se retiró a presión reducida. El producto se aisló en forma de un sólido de color blanco (71,3 mg, rendimiento del 54 %) por cromatografía en columna (gel de sílice; CHCl3/MeOH 95:5) del material en bruto de la reacción. RMN 1H (300 MHz, CDCb, 8): 7,38-7,35 (m, 2H, protones aromáticos); 7,25-7,15 (m, 2H, protones aromáticos); 6,92-6,85 (m, 2H, protones aromáticos); 6,84-6,80 (m, 2H, protones aromáticos); 6,16-6,13 (s a, 1H, NH: intercambios con D²O), 5,52 (m, 1H); 4,61-4,58 (m, 1H); 4,33-4,19 (m, 5H); 3,81 (s, 3H, OCH³); 3,78 (s, 3H, OCH³); 3,65 (s, 2H, CH²CONH); 3,33-3,17 (m, 2H, NHCH²); 2,34-2,29 (m, 2H, CH²CO²); 1,66-1,5 (m, 4H, CH²CH²); 1,50 (s, 3H, CH³); 1,42 (s, 3H, CH³); 1,317 (s, 3H, CH³); 1,3 (s, 3H, CH³). IEN-EM: m/z (%): C³⁶H⁴⁴N²O¹¹(M Na)+: 703.

6-O-(5-{2-[3.4-b¡s(4-metox¡fen¡l)¡soxazol-5-¡llacetamido}pentano¡l)-D-qalactop¡ranosa. Se añadió ácido trifluoroacético (TFA, 0.31 ml. d = 1.47 g/ ml. 4 mmol) a una solución de 1,2:3,4-di-0-¡soprop¡l¡deno-6-0-(5-{2-[3,4-b¡s(4-metox¡fenil) isoxazol-5-il]acetam¡do}pentano¡l)-D-galactop¡ranosa (68 mq. 0.10 mmol) en CH²CI²(2 ml) y la mezcla se mantuvo a temperatura ambiente durante 48 horas y se monitorizó mediante TLC. El disolvente se evaporó a sequedad a presión reducida. para dar un residuo semisólido cuya columna de cromatografía (qel de sílice; cHcb/MeOH = 9:1) permitió aislar el producto (35 mq. 58 %. a/p 1/3.7). Pf 85-87 °C. RMN 1H (500MHz. CDCb. 5): 7.36-7.28 (m. 2H. protones aromáticos); 7.20-7.18 (m. 2H. protones aromáticos); 6.98-6.90 (m. 2H. protones aromáticos); 6.90-6.84 (m. 2H. protones aromáticos); 5.65-5.40 (s a. 4H. OH: intercambio con D²O); 5.32-5.31 (m. 1H); 4.30-4.27 (m. 1H); 4.10-4.09 (m. 2H); 3.85-3.83 (m. 2H); 3.76 (s. 3H. OCH³); 3.73 (s. 3H. OCH³); 3.53-3.50 (m. 3H. CH²CONH y Hqa.) ; 3.07-3.01 (m. 2H. NHCH²); 2.38-2.30 (m. 2H. CH²CO²); 1.5-1.38 (m. 4H. CH²CH²). IEN-EM m/z (%): CapH36N2On (M Na)+: 623.

SOCI2, MeOH c i H3N ^ A

reflujo '10 ^O w ^CHq 3

ácido 11-aminoundecanoico clorhidrato de 11-aminoundecanoato de metilo

Clorhidrato de 11-aminoundecanoato de metilo. Se añadió qota a qota SOCl²(0.55 ml. 7.6 mmol) a una solución aqitada de ácido 11-aminoundecanoico (500 mq. 2.49 mmol) solubilizada en MeOH seco (5 ml) mantenida a 0 °C. La mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 5 h. Cuando la reacción se completó. el exceso de SOCl²y MeOH se destilaron a presión reducida. usando una trampa de NaOH. El producto se aisló en forma de un sólido de color blanco (535 q. rendimiento del 86 %). RMN 1H (300 MHz. CDCb. 5): 3.64 (s. 3H. OCH³); 2.8-2.5 (m. 2H. NH²CH²); 2.5-2.2 (m.

2H. CH²CO); 2.19 (s a. 3H. NH³: intercambio con D²O). 1.61-1.56 (m. 2H. CH²CH²CO); 1.42-1.41 (m. 2H. CH²CH²NH²); 1.36-1.18 (m. 12H. CH²).

11-{2-[3.4-B¡s(4-metox¡fen¡l)isoxazol-5-¡llacetam¡do}undecanoato de metilo. A una solución aqitada de mofezolaco (500 mq. 1.47 mmol) en CH²CI²seco (25 ml). mantenida a 0 °C mediante un baño de hielo. se le añadieron monohidrato de HOBt (253 mq. 1.48 mmol) y clorhidrato de EDC (303 mq. 1.58 mmol). De manera separada. se mezcló una solución aqitada de clorhidrato de 11-aminoundecanoato de metilo (370 mq. 1.38 mmol) en CH²CI²seco (13 ml) con DIEA (0.45 ml. 2.6 mmol) a temperatura ambiente. Después de 2 h. esta solución se añadió qota a qota a qota a la mezcla de reacción y se aqitó durante una noche a temperatura ambiente. Después. se añadió NaHCO3 ac. sat. y la solución acuosa se extrajo tres veces con EtOAc. Las capas orqánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 anhidro y el disolvente se destiló a presión reducida. La cromatoqrafía en columna (qel de sílice; CHCb/MeOH = 5:5) del residuo en bruto proporcionó el producto en forma de un sólido de color blanco (573 mq. rendimiento del 72 %). ^{RMN 1H (300 MHz.}CdC|³.^{5): 7.41-7.26 (m. 2H protones aromáticos); 7.25-7.13 (m. 2H protones aromáticos); 6.93 6.71 (m.}4h ^{protones aromáticos). 5.80 (s a. 1H. intercambios con D2O). 3.82 (s. 3H. OCH3). 3.80 (s. 3H. OCH3). 3.67}(s. 2H. CH²). 3.65 (s. 3H. COOCH³). 3.23-3.21 (m. 2H. NHCH²). 2.31-2.26 (t. 2H. CH²CO). 1.62-1.57 (m. 2H. CH²CH²CO). 1.49-1.45 (m. 2H. CH²CH²NH); 1.25-1.10 (m. 12H. CH²). IEN/EM m/z: C³¹H⁴⁰N²O⁶(M Na)+: 559.

11-{2-[3.4-B¡s(4-metox¡fen¡l)¡soxazol-5-¡llacetamido)undecanoato de metilo. A una solución de 11-{2-[3,4-bis (4-metoxifenil)isoxazol-5-il]acetamido}undecanoato de metilo (345 mg, 0,64 mmol) en THF (10 ml) se le añadió gota a gota una solución 0,5 M de LiOH (36 ml, 18 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 h. Después, se añadió HCl 3 M (3 ml). La mezcla de reacción se extrajo tres veces con EtOAc y los extractos orgánicos combinados se secaron sobre Na2SO4 anhidro y el disolvente se destiló a presión reducida. El producto se aisló en forma de un polvo de color blanco (261 mg, rendimiento del 78 %). RMN 1H (300 MHz, CDCb, 8): 10,50-10,40 (s a, 1H, OH: intercambios con D²O); 7,39-7,36 (m, 2H, protones aromáticos); 7,17-7,12 (m, 2H, protones aromáticos); 6,92-6,81 (m, 4H, protones aromáticos); 5,81 (s a, 1H, NH: intercambios con D²O); 3,82 (s, 3H, OCH³), 3,80 (s, 3H, OCH³); 3,68 (s, 2H, CH²CONH); 3,28-3,21 (m, 2H, NHCH²); 2,32 (t, 2H, CH²CO²H); 1,63-1,59 (t, 2H, CH²CH²CO²H); 1,63-1,59 (t, 2H, CH²CH²CH²CO²H); 1,47-1,44 (t, 2H, CH²CH²NH); 1,42-1,19 (m, 10H, CH²). RMN 13C (75 MHz, CDCb, 8): 178,7, 174,1, 167,0, 166,8, 162,9, 161,3, 160,9, 159,7, 131,2, 130,0, 121,4, 121,0, 117,7, 114,6, 114,2, 55,6, 55,3, 40,3, 34,4, 34,0, 29,5, 29,4, 29,3, 29,2, 29,1, 26,9, 24,8. IEN-EM m/z (%): C³⁰H³⁸N²O⁶[M - H]v 521. IEN-EM-EM m/z (%): 489 (4), 388 (50), 356 (54), 320 (100), 293 (9).

11-{2-[3.4-B¡s(4-metox¡fen¡l)¡soxazol-5-¡llacetam¡do}undecanoato_______ de______ ^^JJ-te tram etilte trah idro^aH -bisfH^ldioxolo^^-fr^^'-dlpiran^-iD iT ietNo. Una solución fría (0 °C mediante un baño de hielo) de 11-{2-[3,4-bis(4-metoxifen¡l)¡soxazol-5-¡l]acetam¡do}undecanoato de metilo (260 mg, 0,5 mmol), DMAP (14 mg, 0,11 mmol) y clorhidrato de EDC (383 mg, 2 mmol) en CH²Cl²seco (5 ml) se añadió a 1,2:3,4-di-O-isoprop¡l¡deno-a-D-galactop¡ranosa (129 mg, 0,5 mmol) solubilizada en CH²Cl²seco (5 ml) y la mezcla de reacción obtenida se agitó a temperatura ambiente durante 24 h. La reacción se interrumpió con agua destilada y se extrajo tres veces con EtOAc. Los extractos orgánicos combinados se secaron sobre Na2SO4 anhidro y el disolvente se destiló a presión reducida. La cromatografía en columna (gel de sílice; CHCb/MeOH = 9:1) del residuo en bruto proporcionó el producto en forma de un sólido de color blanco (95 mg, rendimiento del 25 %). r Mn 1H (300 MHz, CDCb, 8): 7,45-7,37 (m, 2H, protones aromáticos); 7,19 7,13 (m, 2H, protones aromáticos); 6,97-6,89 (m, 2H, protones aromáticos); 6,86-6,82 (m, 2H, protones aromáticos); 5,75 (s a, 1H, NH: intercambios con D²O); 5,53 (d, 1H, J = 4,9 Hz, 1'-H); 4,63-4,59 (dd, 1H, J = 2,5 y 7,9 Hz, 3'-H); 4,33-4,28 (m, 2H, 2'-H y 4'-H); 4,25-4,13 (m, 2H, 6'-H); 4,04-3,98 (m, 1H, 5'-H); 3,83 (s, 3H, OCH³); 3,80 (s, 3H, OCH³); 3,67 (s, 2H, CH²CONH); 3,28-3,21 (m, 2H, NHCH²); 2,35-2,29 (m, 2H, CH²CO²); 1,57, 1,50, 1,44, 1,42 (4s, 12H, cetales); 1,33-1,24 (m, 16H, CH²(CH²) ⁸CH²). IEN-EM m/z (%): C⁴²H⁵⁶N²O¹¹[M - H]v 763. IEN-EM-EM m/z (%): 503 (36), 294 (100), 264 (66).

11-{2-[3.4-b¡s(4-metox¡fen¡l)¡soxazol-5-¡llacetam¡do}undecanoato de [^S ^ ft^S ^ ffl^ ^^^ -te tra h id ro x ite tra h id ro ^H -piran-2-il-lmetilo. Se añadió ácido trifluoracético (TFA, 0,7 ml, d = 1,47 g/ ml, 8,72 mmol)) a una solución de 11-{2-[3,4bis(4-metoxifenil)isoxazol-5-il]acetamido}undecanoato de (2,2,7,7-tetrametiltetrahidro-2aH-b¡s([1,3]d¡oxolo)[4,5-£):4’5’-d]piran-5-il)metilo (173 mg, 0,226 mmol) en CH²CI²seco (5 ml). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 48 h. Después, el disolvente se destiló y el producto aislado en forma de un sólido de color blanco (70 mg, rendimiento del 45 %) mediante una columna cromatografía (gel de sílice; CHCb/MeOH = 9:1) del residuo en bruto. Pf 88-90 °C. RMN 1H (500 MHz, CDCb, 6): 7,32-7,30 (m, 2H, protones aromáticos); 7,13-7,11 (m, 2H, protones aromáticos); 6,86-6,84 (m, 2H, protones aromáticos); 6,80-6,78 (m, 2H, protones aromáticos); 5,80-5-65 (s a, 4H, OH: intercambio con D²O); 5,32-5,30 (m, 1H, 1’-H); 4,71-4,53 (m, 1H, 3’-H); 4,24-4,19 (m, 2H, 2’-H y 4’-H); 4,09-3,96 (m, 2H, 6’-H); 3,78 (s, 3H, OCH³); 3,76 (s, 3H, OCH³); 3,61-3,53 (m, 4H, CH²CONH y 5’-H); 3,20-3,19 (m, 2H, NH²CH²); 3,0-2,34 (m, 2H, CH²CO²); 1,55-1,46 (m, 4H, NHCH²CH², CH²CH²CO²); 1,26-1,11 (m, 12H, CH²(CH²) ⁶CH²). RMN 13C (75 MHz, DMSO-d6, 6): 173,6, 166,8, 165,0, 160,8, 159,6, 131,6, 130,0, 122,0, 121,6, 117,0, 114,8, 73,7, 72,4, 55,8, 55,7, 34,0, 33,5, 29,6, 29,4, 29,1, 27,0, 25,1. IENVEM m/z: C³⁶H⁴⁸N²O¹¹: 707 [M Na]+; IENVEM/EM m/z: 689 (8), 647 (24), 584 (100), 545 (25). Anal. C, H, N [].

1.2 Inhibición de la ciclooxigenasa por GALMOFn (n = 0, 4, 10)

La actividad inhibidora de la ciclooxigenasa humana se determinó mediante un ensayo colorimétrico de detección de inhibidores de la COX que mide el componente de peroxidasa de las ciclooxigenasas, supervisando la aparición de W^W'W-tetrametN-p-fenilendiamina (TMPD) oxidada a 590 nm. El mofezolaco es un inhibidor de COX-1 selectivo y potente con CI⁵⁰= 0,0079 pM y 38 % de inhibición de COX-2 a la concentración de inhibidor más alta de 50 pM (figura 1 y tabla 1). La conjugación directa de mofezolaco con D-galactosa (GALMOF⁰) determina una reducción de la potencia inhibidora y selectividad: CI⁵⁰de COX-1 = 0,1 pM y CI⁵⁰de COX-2 = 3,1 pM con un 87 % de inhibición de la isoforma COX-2 a 50 pM.

La inserción de un conector C⁴(GALMOF⁵) entre los dos restos (mofezolaco y D-galactosa) es perjudicial porque la ^{CI50 de COX-1 es >50 pM y el porcentaje de inhibición a 50 pM resultó ser 38 y 24 % para}CoX-1 ^ycOx-2, respectivamente.

Un espaciador más largo como para conector C¹⁰(GALMOF¹¹) determina una recuperación de la actividad y selectividad de la COX-1, Galmofn resultó ser un potente inhibidor de la COX-1 con una CI⁵⁰de 0,4 pM y un porcentaje de inhibición de la COX-1 igual al 90 %, pero no selectivo, de hecho la CI⁵⁰sobre COX-2 fue de 0,27 pM y un porcentaje de inhibición del 64 %.

Tabla 1. Actividad inhibidora3 de la COX de mofezolaco y GALMOFn.

Inhibidor CI50 pM Inhibición de COX-1 (%)b CI50 pM Inhibición de COX-2 (%)b mofezolaco 0,0079 100 - 38

GALMOF0 _{0 ,1}100 3,1 87

galmof5 >50 38 >50 24

GALMOF11 0,4 90 0,27 64

(a) Los valores son las medias de al menos tres mediciones independientes.

(b) Porcentaje (%) de inhibición determinada a 50 pM, la concentración más alta del inhibidor probado.

1.3 Experimentos de permeabilidad de GALMOF⁰

En un ensayo de eflujo de monocapa, se determinó la permeabilidad aparente (Pap) en las direcciones tanto basolateral a apical [Pap(B^-A)] como apical a basolateral [Pap(A^-B)] para cada compuesto (figura 2). La línea celular de adenocarcinoma de colon humano (Caco-2) presenta un sistema de transporte facilitado en la superficie apical y basolateral. Las células Caco-2 expresan altos niveles de GLUT-1 que se ubican en la membrana basolateral y transportan glucosa al lado seroso.

Se ha determinado el flujo Pap(B^A) de cada compuesto solo o en presencia de floretina, un inhibidor de GLUT-1. Ya que el GLUT-1 se expresa en el compartimento basolateral, un flujo B^-A alto significa que el transporte está mediado por GLUT-1 porque el flujo B^-A representa el transporte activo.

El flujo A^-B, que representa el transporte pasivo, también se ha determinado para cada compuesto (tabla 2).

Tabla 2. Valores de Pap (nm/s) de GALMOFn sola y en presencia de floretina 100 mM.

Pap B-->A Pap A ^ B

Mofezolaco 461 - 414 -Floretina Floretina

GALMOF0 875 610 380 368

GALMOF5 749 472 321 321

GALMOF¹¹772 622 292 292

Se determinaron los flujos de mofezolaco B ^ A y A^-B y los Pap correspondientes, como cabía esperar, son similares, ya que no hay transporte activo implicado en el transporte de mofezolaco. Se observan valores de Pap (B^-A) mucho mayores para todos los GALMOF con respecto al mofezolaco, lo que indica que está implicado un mecanismo de transporte activo mediado por un transportador.

GALMOFo muestra una permeabilidad aparente de 875 nm/s mientras que en presencia de floretina se observó una reducción del 30 % del flujo basolateral a apical (Pap(B^A) = 610 nm/s) mientras que el transporte pasivo no está influido por el pretratamiento de inhibidor de GLUT-1.

Para GALMOF⁵el porcentaje de la reducción de la permeabilidad aparente es del 37 %, similar a la de GALMOFo (Pap(B^A) que varía de 749 a 472 nm/s en presencia del inhibidor de GLUT-1.

La permeabilidad aparente de GALMOF¹¹(Pap(B^-A) = 772 nm/s) en presencia de floretina disminuye en un 20 % (Pap(B^A) = 622 nm/s). El transporte pasivo permanece sin cambios sea cual sea la longitud del conector independientemente de la preincubación con floretina.

Estas reducciones demuestran indirectamente la participación de Glut-1 en el transporte de GALMOF a través de la monocapa de células Caco-2 y se puede suponer que el mofezolaco unido a la galactosa es capaz de atravesar la monocapa más rápido que el mofezolaco solo, Pap (B^-A) de 461 nm/s se convierte en 875.749 y 772 nm/s para GALMOFo, GALMOF⁵y GALMOF¹¹, respectivamente.

1.4 Experimentos de inmunofluorescencia de GALMOFn

Para confirmar la presencia de GLUT-1 en la línea celular Caco-2, las células se fijaron y se tiñeron con inmunofluorescencia con un anticuerpo monoclonal de ratón anti-Glut1. El anticuerpo primario se visualizó usando el anticuerpo secundario marcado con AlexaFluor® 594 y los núcleos se contratiñeron con Hoechst 33342.

Hubo tinción de señal GLUT-1 positiva en las células incubadas con anticuerpo monoclonal de ratón anti-Glut-1, mientras que no se observó tinción en las células incubadas con BSA 3 % (control no inmunitario) (figura 3).

1.5 GALMOFo Estabilidad química

Se realizaron análisis de HPLC para determinar la estabilidad química y el grado de pureza de GALMOFo como compuesto representativo del conjunto.

Se usó una columna de aminica, se usó CH3CN/Tris-HCl 1o mM (pH = 8) (15:85) como fase móvil, T = 4o °C; A= 254 nm.

Tabla 3. Concentr i n ALM F r n r ir l " r fi n n ración" (Figura 4).

Se añadieron 2oo pl de 2,5 mg/ ml de di GALMOFo en CH³CN a 18oo pl de un tampón (pH = 1, 3, 7,3 y 8). Cada muestra se mantuvo agitada a 37 °C. El tampón con pH = 1 y 3, obtenido con HCl o,1 N y HEPES 5o mM, se seleccionó para simular la estabilidad química a nivel gástrico, mientras que pH = 7,3 y 8, obtenido con TRIS-HCl 5o mM, simuló su estabilidad en sangre y tripa, respectivamente.

A los 15, 3o, 6o min y 48h se extrajeron 3oo pl de la muestra, se diluyeron con 3oo pl de CH³CN (concentración final = o,o75 mg/ml) y se ensayaron por HPLC. Para todos los valores de pH y hasta los 6o min, el tiempo de retención (T r) se mantuvo constante (7,5 min) y no se observó variación del perfil cromatográfico (Figura 5).

A las 48 h y pH = 7,3 y 8, apareció otro pico en el cromatograma a los 7,9 min, que fue del 32 % a pH = 7,3 (Figura 6) y del 53 % a pH = 8 (Figura 7).

1.6 Estabilidad metabólica de GALMOFo

La estabilidad metabólica de GALMOFo se determinó a través de su incubación con microsomas de hígado de rata y supervisando la desaparición de su pico cromatográfico en 3o min.

La prueba in vitro se llevó a cabo en presencia de la fracción S9 de hígado de rata (Tebu-bio, Milán, Italia).

^{En resumen, GALMOF0 (10}jM) ^{en 100 mM de tampón de fosfato (pH = 7,4) se mezcló con el sistema de regeneración}de NADPH hasta una concentración final de NADP+ 1,3 mM, glucosa 6-fosfato 3,3 mM y glucosa 6-fosfato dihidrogenasa 0,4 U/ml y MgCb 3,3 mM. El experimento comenzó con la adición de microsomas de rata (1 mg/ml) que se incubaron durante 30 min a 37 °C. La reacción se bloqueó añadiendo un volumen igual de CH³CN frío. Las muestras se centrifugaron a 4600 rpm durante 15 min a 4 °C. Se separó el sobrenadante y se analizó la fase orgánica por HPLC en las mismas condiciones usadas para las muestras del "estudio de estabilidad química".

El porcentaje de GALMOF⁰residual después de 30 min se calculó según la siguiente ecuación:

GALMOF⁰residual (%) a los 30 min = Cmicr+NADPH / Cmicr x 100 donde Cmicr+NADPH es la concentración de GALMOF⁰después de la incubación con los microsomas y el sistema de regeneración de NADPH (figura 8); Cmicr es la concentración de GALMOF⁰después de la incubación solo con los microsomas (figura 9).

4. Inhibición de la actividad catalítica de COX-1 y COX-2 ovina

Se evaluó la capacidad de los compuestos diana para inhibir la actividad catalítica de las enzimas COX-1 y COX-2 ovinas (porcentaje de inhibición a 50 mm, a menos que se indique lo contrario). Los valores de CI⁵⁰se determinaron solo para los compuestos que mostraron una actividad inhibidora razonable de la COX-1 (>50 %) a 50 mm. Cada valor de CI⁵⁰presentado y el porcentaje de inhibición (medido a 50 mm como la concentración del compuesto ensayado) es el promedio de los resultados de tres ensayos separados (por triplicado). La inhibición enzimática se determinó usando un equipo de ensayo colorimétrico de detección de inhibidores de COX (ovino) (Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI, EE. UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las soluciones de reserva de los compuestos de prueba se disolvieron en un volumen mínimo de DMSO.

continuación

Más datos experimentales sobre modelos in vitro e in vivo de neuroinflamación

1. Material y métodos

Reactivos

Se sintetizó P6 (3-(5-clorofuran-2-il)-5-metil-4-fenilisoxazol) según Di Nunno L. et al. (2004), mientras que se sintetizó mofezolaco siguiendo el protocolo de Micetich (Micetich, 1981). Todos los demás reactivos y disolventes se adquirieron de Sigma-Aldrich (Milán, Italia) y se usaron sin ninguna purificación adicional.

Se adquirió lipopolisacárido (LPS) de serotipo 0127:B8 de Escherichia coli de Sigma-Aldrich (Milán, Italia). El anticuerpo (Ab) policlonal de cabra a p-kB(sc-7977) se adquirió de Santa Cruz Biotechnology (DBA, Milán, Italia), los Ab de COX-1 (Ab 695), COX-2 (Ab 15191) se obtuvieron de Abcam (Cambridge, Reino Unido). Se adquirieron IgG de cabra anti-conejo (sc-2004), IgG de cabra anti-ratón (sc-2005) e IgG de burro anti-cabra (sc-2020) de Santa Cruz Biotechnology; anticuerpo monoclonal primario de ratón (mAb) anti-proteína ácida fibrilar glial (GFAP) (Merck Millipore, Milán, Italia), mAb de ratón anti-molécula adaptadora de unión a calcio ionizado-1 (Iba-1) (Merck Millipore). El equipo de Elisa para la evaluación PGE²se adquirió Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, EE. UU.). El MTT [bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio], la 3,3'-diaminobencidina y el tribromoetanol se obtuvieron de Sigma-Aldrich, Milán, Italia.

Cultivos celulares y tratamiento

Se cultivaron células de microglía BV2 (ICLC HTL 03001-Interlab Cell Line Collection) en medio de Eagle modificado por Dulbecco con alto contenido de glucosa (DMEM) complementado con suero bovino fetal al 10 %, 100 unidades/ml de penicilina y 100 |jg/ml de estreptomicina. Se mantuvieron a 37 °C en un ambiente humidificado con 5 % de CO^{2 /95}% de aire ambiental.

A continuación, se sembraron células microgliales, a una densidad de 25 x 104/pocillo en placas de 6 pocillos (Falcon) y se trataron con los inhibidores de la COX elegidos (P6, mofezolaco) cuando alcanzaron el 80 % de confluencia. Se realizaron experimentos preliminares para establecer la concentración óptima y los tiempos de exposición necesarios para el tratamiento con LPS (1 |jg/ml), que se descubrió que estaban de acuerdo con otros informes (Bi et al., 2014; Haw et al., 2014), así como para establecer la dosis óptima de los inhibidores de la COX y los tiempos de exposición para detectar sus efectos sobre la función de las células microgliales BV2 estimuladas por LPS. En este sentido, se llevó a cabo una serie de experimentos en los que las células microgliales se pretrataron durante 1 hora con los inhibidores selectivos de la COX-1 P6 (0,5 y 1,0 j M) o mofezolaco (0,1 y 0,5 j M). A continuación, las células se incubaron durante diferentes tiempos a 37 °C con LPS, como estímulo proinflamatorio. Los experimentos incluyeron células cultivadas en medio solo (control).

Prueba de viabilidad celular

La viabilidad celular de las células microgliales se cuantificó mediante el ensayo de reducción de MTT. Las células (8 x 103/pocillo) se cultivaron en placas de 96 pocillos (Becton Dickinson Labware) en medio completo y se trataron con diferentes concentraciones de inhibidores de la COX, en presencia o ausencia de LPS. Las células sin tratar se usaron como control. Se preparó una solución de PBS 1X de MTT (5 mg/ml) y se añadió al medio celular a una concentración final de 0,5 mg/ml. Las células se incubaron durante 4 h a 37 °C y 5 % de CO²para permitir el metabolismo del MTT. Los cristales de formazán formados (a partir de MTT) en las células se solubilizaron con DMSO (Sigma-Aldrich). Los niveles de formazán de MTT se determinaron midiendo la densidad óptica a A = 560 nm y restando el fondo (A = 670 nm) con un lector de multiplacas Victor (Wallac). La densidad óptica se correlacionó directamente con la cantidad de células.

Ensayo de inmunotransferencia

Después del tratamiento de cultivos como se ha descrito anteriormente, las células se recogieron y se lisaron por tampón de lisis helado [Triton X-100 al 1 %, Tris-HCl 20 mM, NaCl 137 mM, glicerol al 10 %, EDTA 2 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 1 mM, sal de hemisulfato de leupeptina 20 j M, aprotinina 0,2 U/ml (todas de Sigma-Aldrich)] durante 30 min en un baño de hielo.

La pars compacta de la sustancia negra (SNpc), el hipocampo, el lóbulo frontal y el caudado de cerebros de ratones se trituraron en PBS helado, se lavaron y después se homogeneizaron en un tampón que contenía tampón de lisis (Tris 50 mM pH 8, NaCl 0,02 g/ml, SDS al 0,2 %, Triton-X al 1 %, aprotinina 4 u/ml, leupeptina 2 mM, fluoruro de fenilmetanosulfonilo 100 mM).

Los lisados de cultivo tisular y celular se agitaron vorticialmente durante 15-20 s y, a continuación, se centrifugaron a 12.800 x g durante 20 min. La concentración de proteínas en el sobrenadante se determinó por espectrofotometría mediante el ensayo de proteínas de Bradford (Bradford, 1976). Las muestras de proteínas se diluyeron con tampón de muestra (Tris-Hcl 0,5 M pH = 6,8, glicerol al 10 %, SDS al 10 % (p/v), 2-mercaptoetanol al 5 %, azul de bromofenol al 0,05 % (p/v)) y después se hirvieron durante 3 min. Las proteínas (25 jg/carril) y patrones preteñidos (BioRad Laboratories, Hercules, CA, EE. UU.) se cargaron en geles de poliacrilamida premoldeados con SDS al 7 % o al 12 % (BioRad Laboratories).

Tras la electroforesis, las proteínas resueltas se transfirieron del gel a membranas de nitrocelulosa. Se usó un tampón de transferencia [Tris 20 mM/glicina 150 mM, pH = 8,0, metanol al 20 % (v/v)] para la saturación y transferencia del gel y la membrana. A continuación, las membranas se incubaron en la oscuridad con 1 jg/m l de anticuerpo monoclonal de ratón (MoAb) anti-COX-1 y Ab policlonal de conejo anti-COX-2 (1:1000) (ambos de AbCam, Cambridge, Reino Unido), Ab policlonal de conejo anti p-IkB-a (1:200), Ab policlonal de ratón anti p-actina (1:500) (todos de Santa Cruz Biotechnology), MoAb de ratón anti-proteína ácida fibrilar glial (GFAP) (1:200) y mAb de ratón anti-molécula-1 adaptadora de unión a calcio ionizada (Iba-1) (1:200) (ambos de Merck Millipore) durante una noche a 4 °C.

Las membranas se lavaron con Tween 20-PBS al 0,1 % (durante 20 min, 3 veces) y después se incubaron con el anticuerpo secundario diluido 1:2000 durante 60 min. Las bandas se visualizaron mediante detección de quimioluminiscencia (Invitrogen, Milán, Italia). El nivel de p-actina se usó como control de carga de proteína. Para el análisis de tejidos, las bandas obtenidas se normalizaron con respecto al nivel de p-actina realizado para cada área cerebral analizada. Para cultivos celulares, las bandas se normalizaron con respecto al nivel de p-actina en cada condición experimental.

Animales y protocolos de tratamiento

Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con la Directiva del Consejo Europeo 86/609/CEE y la legislación italiana sobre bienestar animal (art. 4 y 5 del D.L. 116/92). Se adquirieron setenta ratones machos adultos 129/SV (22 24 g de masa corporal, 8-10 semanas de edad) en Harlan - Italia y se mantuvieron en condiciones ambientales controladas (20 ± 2 °C, 50-80 % de humedad, ciclo de luz/oscuridad de 12 horas, alimentos y agua a voluntad).

Los ratones recibieron el inhibidor selectivo de la COX-1 mofezolaco (6 mg/kg, i.p.; indicado como M en todas las figuras) o vehículo (DMSO al 40 % en tampón de fosfato 0,1 M, pH = 7,4; VM en todas las figuras) una vez al día durante 10 días.

La cantidad de mofezolaco para inyectar se eligió teniendo en cuenta el estudio previo y sus valores de CI⁵⁰de COX [14]. En el séptimo día, los ratones se anestesiaron con tribromoetanol (250 mg/kg, i.p.) y se situaron en un aparato estereotáctico (Kopf Instruments, Tujunga, CA, EE. UU.). Se administró vehículo (solución salina estéril, 5 j l; V-LPS en todas las figuras) o 5 |jg de LPS en 5 |jl de solución salina estéril (LPS en todas las figuras) en el ventrículo lateral cerebral usando una jeringa de vidrio de aguja fina (Hamilton, Lyon, Francia) y una bomba de jeringa (KD Scientific, Holliston, MA, EE. u U.) a razón de 1 jl/min. Esta dosis de LPS y punto temporal (72 h) indujeron la mejor respuesta neuroinflamatoria después de un estudio preliminar de titulación (datos no mostrados). Las coordenadas de las inyecciones esterotácticas fueron: 2,3 mm dorsal/ventral, 1,0 mm lateral y 0,5 mm anterior/posterior desde el bregma. El mofezolaco se administró 30 min antes de la inyección de LPS (M LPS en todas las figuras).

Tinción inmunohistoquímica

Los ratones recibieron perfusión transcardíaca con solución salina tamponada con tris (pH = 7,6) seguido de paraformaldehído al 4 % en PBS pH = 7,4 a 4 °C. Posteriormente, los cerebros se fijaron posteriormente en el mismo fijador, se incluyeron en parafina y se obtuvieron cortes de 10 jm con un micrótomo rotativo (Leica, Milán, Italia). La inmunohistoquímica se realizó siguiendo un procedimiento convencional de complejo avidina-biotina. En resumen, las muestras se incubaron con anticuerpo monoclonal primario de ratón (mAb) anti-proteína ácida fibrilar glial (GFAP) en una relación de 1:1000 (Merck Millipore, Milán, Italia) o un mAb de ratón anti-molécula adaptadora de unión al calcio ionizado-1 (Iba-1) en una relación de 1:500 (Merck Millipore) durante una noche a 4 °C y después con un Ab secundario biotinilado anti-ratón (Dako, Milán, Italia), a una dilución 1:1000 durante 1 h a temperatura ambiente. Los complejos antígeno-Ab se visualizaron mediante secciones de incubación durante 1 h con extravidina peroxidasa (Sigma-Aldrich) diluida 1:1500 y oxidación de 3,3'-diaminobencidina en presencia de H²O².

Ensayo de PGE²

Las células microgliales se cultivaron en placas de 6 pocillos a una densidad de 3 x 106 células/pocillo. A continuación, las células se pretrataron con inhibidores selectivos de COX-1 P6 o mofezolaco durante 1 h y, posteriormente se estimularon con LPS (1 jg/ml). Los cultivos se mantuvieron a 37 °C durante 24 y 48 h en aire humidificado que contenía 5 % de CO². Los niveles de PGE²se determinaron en el sobrenadante usando un inmunoensayo de unión competitiva (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, EE. UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las células sin estimular se incluyeron como control. La determinación de la cantidad de PGE²en el cerebro se realizó en los extractos tisulares, según las instrucciones del fabricante. La densidad óptica se midió a A = 405-420 nm con un lector de microplacas de precisión y la cantidad de PGE²(ng/ml) se calculó usando una curva patrón de PGE².

Análisis densitométrico

Las bandas obtenidas después de inmunotransferencia y RT-PCR se sometieron a análisis densitométrico usando un programa informático de análisis de imágenes ID (Kodak Digital Science). Los resultados se expresaron como unidades arbitrarias.

Análisis estadístico

Se realizó la prueba de la t de Student y el análisis de varianza (ANOVA de una vía) sobre los resultados de al menos cinco repeticiones biológicas independientes. Los valores de p < 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.

2. Resultados

Ensayo de viabilidad de células microgliales BV2

Se usó el ensayo MTT para evaluar cuantitativamente la viabilidad celular. Esto se realizó para verificar si los inhibidores de COX-1 selectivos probados (P6 y mofezolaco) causaron toxicidad en la línea celular BV2 tratada con LPS. De manera preliminar, se evaluó el efecto de dos concentraciones diferentes de P6 (0,5 y 1 jM ) y mofezolaco (0,1 y 0,5 jM ) sobre la viabilidad de las células microgliales BV2. No se ejerció ninguna toxicidad celular por P6, mofezolaco, LPS solo o una combinación de LPS y cada uno de los dos inhibidores a las 24 h. Las dos concentraciones de P6 y mofezolaco se eligieron en función de estudios previos y sus valores de CI50 de COX (Calvello et al., 2012).

Se descubrió que la viabilidad celular era significativamente (p < 0,001) más baja, tras 48 h de tratamiento con LPS (porcentaje de viabilidad celular igual a 78,4±0,15 frente a 99,8±0,07 del control), que las células sin tratar (control). Ninguno de los inhibidores usados en las dosis indicadas anteriormente fue tóxico para las células microgliales BV2, cuando se usaron en ausencia de LPS (variando el porcentaje de viabilidad celular entre 95,5±0,22 y 98,2±0,16 frente al control). Adicionalmente, los inhibidores usados a las mismas dosis resultaron protectores hacia las células microgliales BV2 después de 48 h de tratamiento con LPS (1 jg/ml), siendo el porcentaje de viabilidad celular comparable al observado en el control.

Evaluación de la activación glial en ratones

La activación astroglial se caracterizó por inmunorreactividad y análisis de inmunotransferencia de la expresión de GFAP, un marcador usado para distinguir los astrocitos de otras células gliales del SNC. El tratamiento con LPS determinó un aumento de los cuerpos celulares inmunorreactivos en comparación con los ratones sin tratar, lo que sugiere la activación de los astrocitos en diferentes regiones del cerebro. En particular, el caudado, el lóbulo frontal, el hipocampo y la sustancia negra se seleccionaron para evaluar la activación de los astrocitos después de diferentes tratamientos de animales [Fig. 2S (A-D)]. Las imágenes presentan la reactividad de GFAP en muestras del grupo de control de ratones (CTR), ratones tratados con LPS-vehículo (V-LPS), LPS solo (LPS) o en combinación con mofezolaco (M+LPS). En las secciones de CTR, hay una distribución astroglial fisiológica con pocos elementos inmunorreactivos que rodean los vasos sanguíneos como parte de la barrera hematoencefálica, lo que significa que no hay signos de astrogliosis reactiva. En ratones tratados con V-LPS, la expresión es similar a CTRL, con inmunorreactividad perivascular y la presencia de algunos astrocitos en el tejido, debido a la inflamación probablemente causada por la inyección. En ratones tratados con LPS, las imágenes muestran un aumento notable de los elementos inmunorreactivos, mientras que la administración in vivo de mofezolaco redujo la presencia de células inmunorreactivas GFAP en todas las áreas cerebrales analizadas [fig. 2S (A-D)].

La inmunorreactividad de Iba-1, también se evaluó un marcador de microglía activada [fig. 3S]. Las células positivas para Iba-1 de los ratones tratados con LPS fueron más numerosas, y mostraron una inmunorreactividad más intensa, así como un fenotipo ramificado, en comparación con ratones sin tratar [fig. 3S (A-D)]. La administración de mofezolaco determinó la reducción de la inmunorreactividad de Iba-1 en ratones en los que se ha inyectado LPS en todas las áreas del cerebro analizadas [fig. 3S (A-D)], lo que sugiere que el mofezolaco reduce, al menos en parte, la activación microglial inducida por la lesión neurotóxica.

También se realizó un análisis de inmunotransferencia para evaluar semicuantitativamente la activación de astrocitos y microglía en muestras procedentes de los grupos de ratones descritos anteriormente. En ratones tratados con LPS, se detectó un aumento significativo de la expresión de GFAP en todas las regiones del cerebro analizadas en comparación con los controles o el LPS con vehículo (figs. 4S-7S). Se obtuvieron resultados similares para el análisis de expresión de Iba-1 (figs. 4S-7S). Existe un aumento evidente del porcentaje de expresión de GFAP e Iba-1 en todas las regiones del cerebro de los ratones tratados con LPS en comparación con los ratones de control (tabla 1).

Tabla 1. El porcentaje (%) de aumento de la expresión de GFAP e Iba-1 y el porcentaje (%) de reducción de la expresión de COX-1 y COX-2, y la liberación de PGE2 por mofezolaco en diversas regiones del cerebro de ratones tratados con LPS frente al control.

Por el contrario, en animales tratados con mofezolaco a los que previamente se ha inyectado LPS, los niveles de GFAP así como de Iba-1 resultaron significativamente reducidos en comparación con los animales que recibieron LPS solo (figs. 4S-7S).

Efecto de los inhibidores de la COX-1, P6 y mofezolaco, sobre la expresión de COX en la línea celular microglial BV2 y cerebros de ratones

El efecto de mofezolaco y P6 sobre la expresión de COX-1 en células microgliales tratadas con LPS se evaluó mediante análisis de transferencia de Western. Después de 24 h, no se observó ninguna diferencia significativa entre las células estimuladas con LPS en presencia o ausencia de ambos inhibidores de la COX-1 (datos no mostrados).

Curiosamente, las células BV2 estimuladas con LPS presentaron, a las 48 h, mayores niveles de expresión de la COX-1 en comparación con las células sin tratar (fig. 8S). Los niveles de expresión de la COX-1 evaluados a las 48 h de incubación con LPS se redujeron significativamente en células pretratadas durante 1 h con inhibidores selectivos de la COX-1 P6 o mofezolaco (fig. 8S). Por lo tanto, se descubrió que la expresión de COX-1 fue reducida de forma dependiente del tiempo por ambos inhibidores selectivos probados (tabla 1).

También se evaluó la expresión de COX-2 en los mismos lisados celulares. Curiosamente, los niveles de proteína COX-2 no se vieron afectados por la presencia de P6 o mofezolaco. En estas condiciones, la expresión de COX-2 resultó similar al nivel observado en células estimuladas con LPS solo (fig. 8S).

Por lo tanto, en la línea de células microgliales BV2 tratadas con LPS, P6 y mofezolaco pudieron reducir la expresión de la COX-1 sin afectar a la COX-2. De hecho, la administración de P6 en células activadas por LPS redujo la expresión de COX-1 en un 67 % y un 79 % a 0,5 pM y 1,0 pM, respectivamente. Por otra parte, mofezolaco redujo la expresión de COX-1 (78 %) independientemente de su concentración (tabla 1).

La expresión de COX también se evaluó in vivo, ensayando diferentes regiones del cerebro (fig. 4S-7S). Los ratones expuestos a LPS presentaron mayores niveles de COX-1 tanto en comparación con los controles como con los animales a los que se les administró vehículo-LPS (vLPS) en todas las diferentes áreas analizadas (fig. 4S-7S).

Curiosamente, los ratones expuestos a LPS que recibieron tratamiento con mofezolaco presentaron una reducción significativa de la expresión de COX-1 en todas las áreas del cerebro analizadas, donde el porcentaje de reducción varió del 82 al 95 % (tabla 1).

Se detectaron niveles de proteínas similares a los controles en ratones tratados con vehículo de LPS mofezolaco, mientras que en ratones tratados con el vehículo de mofezolaco LPS, los niveles de COX-1 resultaron similares a los detectados en ratones tratados con LPS (figs. 4S-7S).

Se realizó un ensayo de inmunotransferencia en tejidos de las mismas áreas del cerebro para analizar los efectos in vivo de la administración de mofezolaco en el grado de expresión de COX-2. COX-2 resultó sobreexpresado en todas las regiones del cerebro analizadas en ratones a los que se administró LPS. Curiosamente, el mofezolaco no presentó ningún efecto sobre la modulación de la COX-2 en ratones tratados con LPS, siendo los niveles de proteínas casi similares a los ratones tratados con LPS (fig. 4S-7S).

Efecto de los inhibidores de COX-1 en la biosíntesis de PGE2 en células microgliales BV2 y cerebro de ratón

El grado de biosíntesis de PGE2 se evaluó en sobrenadantes de cultivos celulares a las 48 h de tiempo de incubación (tabla 2A). La producción de PGE2 en células estimuladas con LPS fue significativamente mayor que su nivel basal presente en las células sin tratar (control). Curiosamente, ambos inhibidores de la COX-1 fueron capaces de reducir de forma dependiente de la dosis la liberación de PGE2 en células tratadas con LPS (tabla 2A).

En particular, P6 determinó una reducción del 78 y 88 % a 0,5 y 1 pM, respectivamente, mientras que, en presencia de mofezolaco, la producción de PGE2 se redujo en un 94 y un 97 % a 0,5 y 1 pM, respectivamente.

En las regiones cerebrales analizadas de ratones tratados con LPS, los niveles de PGE2 aumentaron significativamente con respecto a los animales de control o ratones que recibieron el vehículo de LPS (tabla 2B). Curiosamente, se detectó una reducción significativa de los niveles de PGE2 en ratones tratados con mofezolaco antes de la exposición a LPS (tabla 2B). La reducción de PGE2 por mofezolaco en tejidos cerebrales de ratones tratados con l Ps varió entre el 39 % y el 67 % (tabla 1).

T l 2. Li r i n ^ P E2 in vir in viv f r l inhi i r X-1 P m f z l M.

Efecto de los inhibidores de la COX-1 sobre la activación de NF-kB en células microgliales BV2 tratadas con LPS y cerebro de ratón

Ya que la fosforilación y la degradación de IkBa, el complejo inhibidor de NF-kB, es una etapa esencial para la activación de NF-kB, se evaluaron los niveles de expresión de la forma fosforilada de IkBa (p-IkBa) (fig. 8). En este contexto, Las células microgliales BV2 expuestas a LPS presentaron un aumento significativo de p-IkBa en comparación con las células sin estimular (control) (fig. 8).

El análisis densitométrico reveló poco p-IkBa en las células sin tratar, mientras que el pretratamiento con todos los inhibidores de COX-1 analizados redujo significativamente la fosforilación de IkBa en células estimuladas con LPS (fig.

8).

Se obtuvieron resultados similares en un modelo in vivo. De hecho, en todas las áreas del cerebro analizadas de ratones tratados con LPS, se detectó un aumento de p-IkBa en comparación con los animales de control, así como con los ratones a los que se ha administrado vehículo de LPS (vLPS). Por el contrario, en ratones que recibieron mofezolaco (M), se detectó una reducción significativa de p-IkBa en todas las áreas analizadas (figs. 4-7).

Se detectaron niveles de p-IkBa similares a los controles en ratones tratados con vehículo de LPS mofezolaco, mientras que, en ratones tratados con vehículo de mofezolaco LPS, los niveles de p-IkBa fueron similares a los detectados en ratones tratados con LPS (figs. 4-7).

Conclusiones

Estos resultados demostraron que tanto P6 como mofezolaco fueron capaces de reducir la liberación de PGE2 derivada de COX-1 que regula negativamente la ruta de activación de NF-kB, proporcionando de este modo información mecánica acerca del efecto supresor de estos inhibidores de la COX-1 sobre la respuesta neuroinflamatoria inducida por LPS por microglía.

En conclusión, este trabajo consolidó la hipótesis de que los inhibidores selectivos de la COX-1 pueden modificar positivamente la respuesta inflamatoria en modelos neuroinflamatorios inducidos por LPS. En general, estos resultados, de experimentos in vitro e in vivo, indican la capacidad de dos inhibidores muy selectivos de COX-1 P6 y mofezolaco para modular la ruta de señalización de NF-kB. Estos hallazgos enfatizan el efecto neuroprotector y el potencial terapéutico de los inhibidores de la COX-1, tales como el P6 y el mofezolaco, útiles en el control de enfermedades neuroinflamatorias.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto para usar en el tratamiento de la neuroinflamación en donde dicho compuesto se selecciona entre el grupo que consiste en (el azúcar de GALMOFo es D-galactosa):

2. El compuesto para el uso según la reivindicación 1 para el tratamiento de la neuroinflamación en una enfermedad neurológica o neurodegenerativa.

3. El compuesto para el uso según la reivindicación 2, en donde dicha enfermedad neurodegenerativa se selecciona del grupo de la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), esclerosis múltiple (EM), traumatismo craneoencefálico (TCE), demencia por VIH y enfermedades priónicas.

4. El compuesto para el uso según la reivindicación 1 para el tratamiento de la neuroinflamación en el autismo.

5. El compuesto para el uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicho compuesto es mofezolaco o su éster metílico.

6. El compuesto para usar de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 4, en donde dicho compuesto se selecciona entre:

7. Una composición farmacéutica que comprende como principio activo un compuesto según la reivindicación 1 y un excipiente y/o vehículo farmacológicamente aceptable para su uso en el tratamiento de la neuroinflamación.

8. La composición farmacéutica para usar de acuerdo con la reivindicación 7, en donde dicho compuesto es mofezolac o su éster metílico.

9. La composición farmacéutica para usar de acuerdo con la reivindicación 7, en donde dicho compuesto se selecciona entre:

10. La composición farmacéutica para usar de acuerdo con la reivindicación 7, en donde dicho compuesto es mofezolac.