ES2772817T3

ES2772817T3 - Anticuerpos de unión a antígenos de carbohidrato asociados a tumor, composiciones farmacéuticas y sus usos

Info

Publication number: ES2772817T3
Application number: ES15777370T
Authority: ES
Inventors: Jiann-Shiun Lai; I-Ju Chen; Cheng-Chi Wang; Yi-Chien Tsai; Cheng-Der Yu
Original assignee: OBI Pharma Inc
Current assignee: OBI Pharma Inc
Priority date: 2014-04-10
Filing date: 2015-04-10
Publication date: 2020-07-08
Anticipated expiration: 2035-04-10
Also published as: AU2018253589A1; CA2941029A1; US9902779B2; CN112390887A; TWI695013B; RU2016138744A; EP3129048A4; CN106456727A; CN112390887B; US20170029526A1; AU2018253589B2; CA2941029C; WO2015157629A2; IL246837B; EP3129048A2; WO2015157629A3; AU2015243246A1; AU2015243246B2; CN106456727B; TW201738277A

Abstract

Un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende: un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene entre un 85% y el 100% de identidad con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 3 y un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene entre un 85% y el 100% de identidad con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 4, donde el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo, se une a Globo H, y puede reaccionar de forma cruzada con un antígeno de carbohidrato asociado a tumor seleccionado entre sLex, sTn, Tn, sLea, α-NeuAc-OCH2C6H4-p- NHCOOCH2, Fucα1-2Galβ1-4GalNAcβ, NeuAca2-6Galb, Gala1-3Galb1-4GlaNAcb, (NeuAca2-8)3, 6Gal-HSO3- SiaLex, 6GluNAc-HSO3-SiaLex, N-glicano diantenario α2-6 sialilado o ácido polisiálico.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos de unión a antígenos de carbohidrato asociados a tumor, composiciones farmacéuticas y sus usos

Campo técnico

La presente descripción se refiere a anticuerpos de antígenos de carbohidrato asociados a tumor, que incluyen porciones específicas o variantes específicas para al menos un antígeno de carbohidrato asociado a tumor o un fragmento del mismo, así como ácidos nucleicos que codifican dichos anticuerpos, ácidos nucleicos complementarios, vectores, células hospedantes y métodos de fabricación y uso de los mismos, que incluyen formulaciones terapéuticos y composiciones farmacéuticas que comprenden el anticuerpo. Adicionalmente, se describen métodos para administrar anticuerpos a un sujeto en una cantidad efectiva para inhibir células de cáncer.

Antecedentes

Numerosos carbohidratos superficiales son expresados en células tumorales malignas. Por ejemplo, se ha demostrado que Globo H (Fuc a1 ^ 2Galp1 ^ 3GalNAcp1 ^ 3Gal a1 ^ 4Galp1 ^ 4Glc) está sobreexpresado en una variedad de cánceres epiteliales y se asocia a la agresividad tumoral y a un mal pronóstico en el cáncer de mama y el carcinoma pulmonar de célula pequeña. Estudios previos han demostrado que Globo H y el antígeno 3 embrionario específico de estadio (SSEA3, también denominado Gb5) se observan en células de cáncer de mama y en células madre de cáncer de mama (WW Chang et al. “Expression of Globo H and SSEA3 in breast cancer stem cells and the involvement of fucosyl transferases 1 and 2 in Globo H synthesis”. PNAS, 105 (33): 11667-11672).

El documento US20120177663 proporciona anticuerpos que se unen específicamente a beta oligómeros amiloides solubles. El documento US20130144034 está dirigido a métodos para producir un compuesto de interés usando una célula hospedante microbiana. El documento WO 2006016569 muestra anticuerpos para inhibir las funciones de IGF-I e IGF-II humanas. El documento WO 2015143123 describe anticuerpos anti-Globo H. El documento WO 2004/005349 proporciona una revisión a alto nivel del anticuerpo IGN311, que se une a proteína que esté glicosilada y que presenta un antígeno Lewis Y sobre la superficie. N. Cascinelli et al (Tumori. 1986, 30 junio; 72 (3): 267-71) describe que la inyección de anticuerpo MBr1 en pacientes de cáncer de mama conduce a una toxicidad insuficiente y que el nivel en suero del anticuerpo MBr1 dura 48 horas tras la inyección, y no parece ser efectivo en el tratamiento del cáncer de mama.

Estos descubrimientos apoyan el razonamiento para el desarrollo de anticuerpos de antígenos de carbohidrato asociados a tumor, ya que sigue existiendo una necesidad no cubierta de un tratamiento y/o prevención efectivos para el cáncer. La presente invención proporciona anticuerpos de antígenos de carbohidrato asociados a tumor para satisfacer éstas y otras necesidades.

Sumario de la invención

La presente descripción proporciona anticuerpos, o porciones de unión a antígeno de los mismos, que comprenden un dominio variable que se une a un antígeno de carbohidrato, versiones conjugadas de dichos anticuerpos tal como se describe en la presente memoria, en combinación con lo que se conoce en la técnica. El anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo puede presentar una constante de disociación (KD) de aproximadamente 10E-7 M o inferior, de aproximadamente 10E-8 M o inferior, de aproximadamente 10E-9 M o inferior, de aproximadamente 10E-10 M o inferior, de aproximadamente 10E-11 M o inferior, o de aproximadamente 10E-12 M o inferior. El anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo puede ser humanizado o quimérico.

En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene entre un 85% y el 100% de identidad con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 3 y un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene entre un 85% y el 100% de identidad con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 4, donde el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo, se une a Globo H, y puede reaccionar de forma cruzada con un antígeno de carbohidrato asociado a tumor seleccionado entre sLex, sTn, Tn, sLea, a-NeuAc-OCH2C6H4-p-NHCOOCH2, Fuca1-2Galp1-4GalNAcp, NeuAca2-6Galb Gala1-3Galb1-4GlaNAcb, (NeuAca2-8)3, 6Gal-HSO3-SiaLex, 6GluNAc-HSO3-SiaLex, N-glicano diantenario a2-6 sialilado o ácido polisiálico.

En otra realización adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende un dominio variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 3, y un dominio variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 4.

También se describe un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región de cadena pesada, donde la región de cadena pesada comprende tres regiones determinantes de la complementariedad (CDRs), CDR1, CDR2 y CDR3, que tienen secuencias de aminoácido que son entre aproximadamente un 80% y aproximadamente el 100% homólogas a las secuencias de aminoácido establecidas en las SEQ ID NOs: 5, 6 y 7, respectivamente. En un ejemplo de realización, la cadena pesada comprende además una estructura entre una secuencia líder y dicha CDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos que es entre aproximadamente un 80% y aproximadamente el 100% homóloga a la SEQ ID NO: 87. En otra realización, la cadena pesada comprende además una estructura entre dicha CDR2 y dicha CDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos que es entre aproximadamente un 80% y aproximadamente el 100% homóloga a la SEQ ID NO: 89. En otro ejemplo adicional de realización, la cadena pesada comprende además una estructura entre dicha CDR1 y dicha CDR2 de la cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos que es entre aproximadamente un 80% y aproximadamente el 100% homóloga a la SEQ ID NO: 11, donde la estructura contiene glicina en la posición 9 y el anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo se une a un Globo H.

También se describe un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región de cadena ligera, donde la región de cadena ligera comprende tres CDRs, CDR1, CDR2 y CDR3, que tienen secuencias de aminoácido que son entre aproximadamente un 80% y aproximadamente el 100% homólogas a las secuencias de aminoácido establecidas en las SEQ ID NOs: 8, 9 y 10, respectivamente. En un ejemplo de realización, la cadena ligera comprende además una estructura entre una secuencia líder y dicha CDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos que es entre aproximadamente un 80% y aproximadamente el 100% homóloga a la SEQ ID NO: 88. En otra realización, la cadena ligera comprende además una estructura entre dicha CDR2 y dicha CDR3 de la cadena ligera, que tiene una secuencia de aminoácidos que es entre aproximadamente un 80% y aproximadamente el 100% homóloga a la SEQ ID NO: 90. En otro ejemplo adicional de realización, la cadena ligera comprende además una estructura entre dicha CDR1 y dicha CDR2 de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos que es entre aproximadamente un 80% y aproximadamente el 100% homóloga a la SEQ ID NO: 12, donde la estructura contiene prolina en la posición 12, y el anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo se une a Globo H. En otro ejemplo adicional de realización, la cadena ligera comprende una estructura entre dicha CDR1 y dicha CDR2 de la cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos que es entre aproximadamente un 80% y aproximadamente el 100% homóloga a la SEQ ID NO: 12, donde la estructura contiene triptófano en la posición 13, y el anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo se une a Globo H.

También se describe un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región de cadena pesada y una región de cadena ligera, donde la región de cadena pesada comprende tres CDRs, CDR1, CDR2 y CDR3, que tienen secuencias de aminoácido que son entre aproximadamente un 80% y aproximadamente el 100% homólogas a las secuencias de aminoácido establecidas en las SEQ ID NOs: 5, 6 y 7, respectivamente, y donde la región de cadena ligera comprende tres CDRs, CDR1, CDR2 y CDR3, que tienen secuencias de aminoácido que son entre aproximadamente un 80% y aproximadamente el 100% homólogas a las secuencias de aminoácido establecidas en las SEQ ID NOs: 8, 9 y 10, respectivamente.

En algunas realizaciones, se proporciona un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende: una región de cadena pesada, donde la región de cadena pesada comprende una CDR que tiene una secuencia de aminoácidos que es entre aproximadamente un 80% y aproximadamente el 100% homóloga a la secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEQ ID NOs: 5, 6 y 7. En otras realizaciones, se proporciona un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región de cadena ligera, donde la región de cadena ligera comprende una CDR que tiene una secuencia de aminoácidos que es entre aproximadamente un 80% y aproximadamente el 100% homóloga a la secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEQ ID NOs: 8, 9 o 10.

La presente descripción también proporciona un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende: un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es entre aproximadamente un 80% y aproximadamente el 100% homóloga a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 13.

La presente descripción también proporciona un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende: un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es entre aproximadamente un 80% y aproximadamente el 100% homóloga a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 14.

La presente descripción también proporciona un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende: un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es entre aproximadamente un 80% y aproximadamente el 100% homóloga a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 13; y un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es entre aproximadamente un 80% y aproximadamente el 100% homóloga a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 14.

Un ejemplo de realización proporciona un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región de cadena pesada, donde la región de cadena pesada comprende tres CDRs, CDR1, CDR2 y CDR3, que tienen secuencias de aminoácido que son entre aproximadamente un 80% y aproximadamente el 100% homólogas a las secuencias de aminoácido establecidas en las SEQ ID NOs: 15, 16 y 17, respectivamente. Otro ejemplo de realización proporciona un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región de cadena ligera, donde la región de cadena ligera comprende tres CDRs, CDR1, CDR2 y CDR3, que tienen secuencias de aminoácido que son entre aproximadamente un 80% y aproximadamente el 100% homólogas a las secuencias de aminoácido establecidas en las SEQ ID NOs: 18, 19 y 20, respectivamente.

Otro ejemplo de realización proporciona un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región de cadena pesada y una región de cadena ligera, donde la región de cadena pesada comprende tres CDRs, CDR1, CDR2 y CDR3, que tienen las secuencias de aminoácido que son entre aproximadamente un 80% y aproximadamente el 100% homólogas a las secuencias de aminoácido establecidas en las SEQ ID NOs: 15, 16 y 17, respectivamente, y donde la región de cadena ligera comprende tres CDRs, CDR1, CDR2 y CDR3, que tienen secuencias de aminoácido que son entre aproximadamente un 80% y aproximadamente el 100% homólogas a las secuencias de aminoácido establecidas en las SEQ ID NOs: 18, 19 y 20, respectivamente.

En algunas realizaciones, se proporciona un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende: una región de cadena pesada, donde la región de cadena pesada comprende una CDR que tiene una secuencia de aminoácidos que es entre aproximadamente un 80% y aproximadamente el 100% homóloga a la secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEQ ID NOs: 15, 16 o 17. En otras realizaciones, se proporciona un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región de cadena ligera, donde la región de cadena ligera comprende una CDR que tiene una secuencia de aminoácidos que es entre aproximadamente un 80% y aproximadamente el 100% homóloga a la secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEQ ID NOs: 18, 19 o 20.

Un aspecto de la presente descripción es un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende: un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es entre aproximadamente un 80% y aproximadamente el 100% homóloga a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 21.

Otro aspecto de la presente descripción es un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende: un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es entre aproximadamente un 80% y aproximadamente el 100% homóloga a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 22.

En otro aspecto adicional de la presente descripción es un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende: un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es entre aproximadamente un 80% y aproximadamente el 100% homóloga a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 21; y un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es entre aproximadamente un 80% y aproximadamente el 100% homóloga a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 22.

Un ejemplo de realización proporciona un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región de cadena pesada, donde la región de cadena pesada comprende tres CDRs, CDR1, CDR2 y CDR3, que tienen las secuencias de aminoácidos que son entre aproximadamente un 80% y aproximadamente el 100% homólogas a las secuencias de aminoácido establecidas en las SEQ ID NOs: 23, 24 y 25, respectivamente. Otro ejemplo de realización proporciona un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región de cadena ligera, donde la región de cadena ligera comprende tres CDRs, CDR1, CDR2 y CDR3, que tienen las secuencias de aminoácidos que son entre aproximadamente un 80% y aproximadamente el 100% homólogas a las secuencias de aminoácido establecidas en las SEQ ID NOs: 26, 27 y 28, respectivamente.

Otro ejemplo de realización proporciona un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región de cadena pesada y una región de cadena ligera, donde la región de cadena pesada comprende tres CDRs, CDR1, CDR2 y CDR3, que tienen las secuencias de aminoácidos que son entre aproximadamente un 80% y aproximadamente el 100% homólogas a las secuencias de aminoácido establecidas en las SEQ ID NOs: 23, 24 y 25, respectivamente, y donde la región de cadena ligera comprende tres CDRs, CDR1, CDR2 y CDR3, que tienen las secuencias de aminoácidos que son entre aproximadamente un 80% y aproximadamente el 100% homólogas a las secuencias de aminoácido establecidas en las SEQ ID NOs: 26, 27 y 28, respectivamente.

En algunas realizaciones, se proporciona un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende: una región de cadena pesada, donde la región de cadena pesada comprende una CDR que tiene una secuencia de aminoácidos que es entre aproximadamente un 80% y aproximadamente el 100% homóloga a la secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEQ ID NOs: 23, 24 o 25. En otras realizaciones, se proporciona un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región de cadena ligera, donde la región de cadena ligera comprende una CDR que tiene una secuencia de aminoácidos que es entre aproximadamente un 80% y aproximadamente el 100% homóloga a la secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEQ ID NOs: 26, 27 o 28.

La presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, descrito en la presente memoria y al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable.

También se describe un método para inhibir las células de cáncer que expresan Globo H, que comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad efectiva del anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo descrito en la presente memoria, donde las células de cáncer que expresan Globo H son inhibidas.

La presente invención también proporciona clones de hibridoma designados como 2C2 (depositados con el número de acceso de la “American Type Culture Collection” (ATCC) PTA-121138), 3D7 (depositados con el número de acceso de la “American Type Culture Collection” (ATCC) PTA-121310), y 7A11 (depositados con el número de acceso de la “American Type Culture Collection” (ATCC) PTA-121311), y anticuerpos o porciones de unión a antígeno producidos a partir de los mismos.

Breve descripción de las figuras

Figura 1 : es una representación lineal que muestra el efecto de PBS, mAbs Globo H-VK9, mAbs Globo H-2C2 y mAb Globo H-3D7 sobre el volumen de cáncer pancreático (HPAC) en ratones.

Figura 2 : es una representación lineal que muestra el efecto de salino normal y diferentes dosis de mAbs Globo H-2C2 sobre el volumen de cáncer de mama (MCF7) en ratones.

Figuras 3A-3F: son gráficos de barras que muestran la afinidad de unión de mAb H-2C2 (Fig. 3A), mAb Globo H-7A11 (Fig. 3B), mAb Globo H-3D7 (Fig. 3C), mAb Globo H-2F8 (Fig. 3D), mAb Globo H-1E1 (Fig. 3E) y mAb Globo H-VK9 (Fig. 3F) con diversos antígenos de carbohidratos.

Descripción detallada de la invención

Tal como se usan en la presente memoria, los artículos “un” y “una” se refieren a uno o más de uno (es decir, al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, “un elemento” significa un elemento o más de un elemento.

Una “cantidad efectiva”, tal como se usa en la presente memoria, se refiere a una dosis de la vacuna o composición farmacéutica que es suficiente para reducir los síntomas y signos de cáncer, tal como pérdida de peso, dolor y masa palpable, que es detectable, tanto clínicamente como masa palpable como radiológicamente a través de diversos medios de imagen. Los términos “cantidad efectiva” y “cantidad terapéuticamente efectiva” se usan de forma intercambiable.

El término “sujeto” puede referirse a un vertebrado que tiene cáncer o a un vertebrado que se considere que necesita tratamiento contra el cáncer. Los sujetos incluyen todos los animales de sangre caliente, tal como mamíferos, tal como un primate, y, más preferiblemente, un humano. Los primates no humanos también son sujetos. El término sujeto incluye animales domesticados, tal como gatos, perros, etc., ganado (por ejemplo, vacas, caballos, perros, ovejas, cabras, etc.) y animales de laboratorio (por ejemplo, ratón, conejo, rata, gerbo, cobaya, etc.). Por tanto, en la presente memoria se contemplan usos veterinarios y formulaciones médicas.

En la presente memoria todos los números son aproximaciones y pueden venir modificados por “aproximadamente”.

La presente descripción proporciona composiciones farmacéuticas y métodos para el tratamiento o la inhibición de células de cáncer. Las composiciones farmacéuticas comprenden anticuerpos que reconocen el antígeno de carbohidrato, que incluyen anticuerpos monoclonales de ratón, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos o porciones de unión a antígeno de cualquiera de los anteriores. Dichos anticuerpos (o porción de unión a antígeno de los mismos) pueden neutralizar el antígeno de carbohidrato, y/o inhibir células de cáncer. Por lo tanto, los presentes anticuerpos, o la porción de unión a antígeno de los mismos, pueden usarse en el tratamiento o la inhibición de células de cáncer.

Los anticuerpos descritos en la presente memoria incluyen cualquier proteína o péptido que comprende al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de una cadena pesada o ligera, o una porción de unión a ligando de la misma, derivada de un anticuerpo producido por el hibridoma designado 2C2 (depositado bajo el número de acceso de ATCC PTA-121138), el hibridoma designado 3D7 (depositado bajo el número de acceso de ATCC PTA-121310), o el hibridoma designado 7A11 (depositado bajo el número de acceso ATCC PTA-121311) descritos en la presente memoria. Los anticuerpos incluyen fragmentos de anticuerpo, variantes de anticuerpo, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales y anticuerpos recombinantes y similares. Los anticuerpos pueden generarse en ratones, conejos o humanos.

Se describen adicionalmente anticuerpos monoclonales quimerizados o humanizados generados a partir de anticuerpos de la presente invención.

Así, los anticuerpos anti-cáncer descritos en la presente memoria incluyen en combinación con una región variable de cadena pesada o de cadena ligera, una región constante de cadena pesada o de cadena ligera, una región de estructura, o cualquier porción de las mismas, de origen no murino, preferiblemente de origen humano, que pueden incorporarse a un anticuerpo de la presente invención.

Los anticuerpos de la presente invención son capaces de modular, reducir, antagonizar, mitigar, aliviar, bloquear, inhibir, suprimir y/o interferir con al menos una actividad de célula cancerosa que expresa Globo-H in vitro, in situ y/o in vivo.

El término “anticuerpo” pretende abarcar adicionalmente anticuerpos, fragmentos de digestión, porciones especificadas y variantes de los mismos, que incluyen miméticos de anticuerpo o que comprenden porciones de anticuerpos que imitan la estructura y/o la función de un anticuerpo anticáncer o de un fragmento especificado o porción del mismo, que incluye anticuerpos de cadena sencilla y fragmentos de los mismos, que contienen cada uno al menos una CDR derivada de un anticuerpo anticáncer de la presente invención. Los fragmentos funcionales incluyen fragmentos de unión a antígeno que se unen a células de cáncer que expresan Globo-H. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo capaces de unirse a células de cáncer de expresión de Globo-H, o a porciones de las mismas, que incluyen, aunque sin limitación, fragmentos Fab (p.ej., mediante digestión de papaína), Fab’ (p.ej., mediante digestión de pepsina y reducción parcial) y F(ab’)2 (p.ej., mediante digestión de pepsina), facb (p.ej., mediante digestión de plasmina), pFc’ (p.ej., mediante digestión de pepsina o de plasmina), Fd (p.ej., mediante digestión de pepsina, reducción parcial y reagregación), Fv o scFv (p.ej., mediante técnicas de biología molecular), son contemplados por la invención (véase, p.ej., Colligan, Immunology, ver anterior).

Tal como se usa en la presente memoria, 2C2 se refiere al clon de hibridoma o a los anticuerpos generados por el correspondiente clon de hibridoma.

Una porción de unión a antígeno de un anticuerpo puede incluir una porción de un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno de carbohidrato (p.ej., Globo H, SSEA-3 o SSEA-4).

El anticuerpo humanizado descrito en la presente memoria es un anticuerpo de una especie no humana, en el que la secuencia de aminoácidos en las regiones de unión a no antígeno (y/o las regiones de unión a antígeno) han sido alteradas de tal modo que el anticuerpo se asemeja más a un anticuerpo humano, pero manteniendo su capacidad de unión original.

Los anticuerpos humanizados pueden generarse reemplazando secuencias de la región variable que no están implicadas directamente en la unión a antígeno con secuencias equivalentes procedentes de regiones variables humanas. Los métodos incluyen aislar, manipular y expresar las secuencias de ácido nucleico que codifican la totalidad o parte de las regiones variables de al menos una de las cadenas pesadas o ligeras. Las fuentes de ácido nucleico son bien conocidas por los especialistas en la técnica. A continuación se puede clonar ADN recombinante que codifica el anticuerpo humanizado, o un fragmento del mismo, en un vector de expresión apropiado.

Una región variable de cadena ligera o pesada de un anticuerpo comprende una región estructural interrumpida por tres regiones hipervariables, referidas como CDRs. En una realización, los anticuerpos humanizados son moléculas de anticuerpo de especies no humanas que tienen una, dos o todas las CDRs de la especie no humana, y una, dos o las tres regiones estructurales de una molécula de inmunoglobulina humana.

Según un aspecto de la invención, la localización de las CDRs y de los residuos estructurales se determinan mediante métodos descritos en Kabat, E. A., et al (1991) “Sequences of Proteins of Immunological Interest”, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242. Según otro aspecto de la invención, el anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo puede tener la siguiente estructura:

Secuencia Líder-FW1 -CDR1-FW2-CDR2-FW3-CDR3

en la que las regiones estructurales FW1, FW2, FW3 y las CDRs CDR1, CDR2, CDR3 tienen las secuencias de aminoácido descritas en la Tabla 1.

Los anticuerpos humanizados descritos en la presente memoria pueden producirse mediante métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, una vez obtenidos los anticuerpos no humanos (p.ej., murinos), se pueden secuenciar las regiones variables, y se puede determinar la localización de las CDRs y los residuos estructurales. Kabat, E. A., et al (1991) “Sequences of Proteins of Immunological Interest”, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242. Chotia, C. et al (1987) J. Mol. Biol., 196: 901-917. El ADN que codifica las regiones variables de cadena ligera y pesada puede, opcionalmente, estar ligado a las correspondientes regiones constantes y a continuación subclonarse en un vector de expresión apropiado. Las moléculas de anticuerpo con injerto de CDR pueden producirse mediante anclaje de CDR o sustitución de CDR. Se pueden reemplazar una, dos o todas las CDRs de una cadena de inmunoglobulina. Por ejemplo, todas las CDRs de un anticuerpo particular pueden proceder de al menos una porción de un animal no humano (p.ej., ratón tal como las CDRs mostradas en la Tabla 1), o se pueden reemplazar solo algunas de las CDRs. Solo es necesario mantener las CDRs requeridas para la unión del anticuerpo a un antígeno de carbohidrato predeterminado (p.ej., Globo H). Morrison, S. L., 1985, Science, 229: 1202-1207. Oi et al., 1986, BioTechniques, 4: 214. Patentes de los EE.UU. n25.585.089; 5.225.539; 5.693.761 y 5.693.762. EP 519596. Jones et al., 1986, Nature, 321: 552-525. Verhoeyan et al., 1988, Science, 239: 1534. Beidler et al., 1988, J. Immunol., 141: 4053-4060.

También se describen en la presente memoria anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos, que comprende una o dos regiones variables como las descritas en la presente memoria, estando las otras regiones reemplazadas por secuencias procedentes de al menos una especie diferente, que incluye, aunque sin limitación, humano, conejos, ovejas, perros, gatos, vacas, caballos, cabras, cerdos, monos, simios, gorilas, chimpancés, patos, gansos, pollos, anfibios, reptiles y otros animales.

Un anticuerpo quimérico es una molécula en la que diferentes porciones se derivan de diferentes especies animales. Por ejemplo, un anticuerpo puede contener una región variable derivada de un mAb de ratón y una región constante de inmunoglobulina humana. Los anticuerpos quiméricos pueden producirse mediante técnicas de ADN recombinantes. Morrison, et al., Proc Natl Acad Sci, 81: 6851-6855 (1984). Por ejemplo, un gen que codifica una molécula de anticuerpo de ratón (o de otra especie) es digerida con enzimas de restricción para eliminar la región que codifica el Fc de ratón, y a continuación se sustituye la porción equivalente de un gen que codifica una región constante Fc humana en la molécula de ADN recombinante. Los anticuerpos quiméricos también pueden crearse mediante técnicas de ADN recombinante, donde se puede ligar ADN que codifica regiones V de ratón con ADN que codifica regiones constantes humanas. Better et al., Science, 1988, 240: 1041-1043. Liu et al. PNAS, 198784: 3439-3443. Liu et al., J. Immunol., 1987, 139: 3521-3526. Sun et al. PNAS, 1987, 84: 214-218. Nishimura et al., Canc. Res., 1987, 47: 999-1005. Wood et al. Nature, 1985, 314: 446-449. Shaw et al., J. Natl. Cancer Inst., 1988, 80: 1553-1559. Publicaciones de Patente Internacional n° WO1987002671 y WO 86/01533. Solicitudes de Patente Europea n° 184, 187; 171.496; 125.023; y 173.494. Patente de EE.UU. n24.816.567.

Los anticuerpos pueden ser de longitud completa o pueden comprender un fragmento (o fragmentos) del anticuerpo que tiene una porción de unión a antígeno, que incluye, aunque sin limitación, Fab, F(ab')2, Fab', F(ab)', Fv, Fv de cadena sencilla Fv (scFv), scFv bivalente (bi-scFv), scFv trivalente (tri-scFv), Fd, fragmento dAb (p.ej., Ward et al., Nature, 341: 544-546 (1989)), una CDR aislada, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpo de cadena sencilla, y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo. Los anticuerpos de cadena sencilla producidos uniendo fragmentos de anticuerpo con métodos recombinantes, o un ligando sintético, también son contemplados por la presente invención. Bird et al. Science, 1988, 242: 423-426. Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, 85: 5879-5883.

Los anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos descritos en la presente memoria pueden ser monoespecíficos, biespecíficos o multiespecíficos. Los anticuerpos multiespecíficos o biespecíficos o los fragmentos de los mismos pueden ser específicos para diferentes epítopos de un carbohidrato diana (p.ej., Globo H) o pueden contener dominios de unión a antígeno específicos para más de un carbohidrato diana (p.ej., dominios de unión a antígeno específicos para Globo H, SSEA-3 y SSEA-4). En una realización, un anticuerpo multiespecífico o una porción de unión a antígeno del mismo comprende al menos dos dominios variables diferentes, donde cada dominio variable es capaz de unirse específicamente a un antígeno de carbohidrato separado o un epítopo diferente del mismo antígeno de carbohidrato. Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147: 60-69. Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol. 22: 238-244. Los presentes anticuerpos pueden estar ligados o ser co-expresados con otras moléculas funcionales, p.ej., otro péptido o proteína. Por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento del mismo puede estar ligado funcionalmente (p.ej., mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de cualquier otro modo) a una o más entidades moleculares diferentes, tal como otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo para producir un anticuerpo biespecífico o multiespecífico con una segunda especificidad de unión.

La presente invención contempla todos los isotipos de anticuerpo, que incluyen IgG (p.ej., IgG 1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA (IgA1, IgA2), IgD o IgE (se contemplan todas las clases y subclases en la presente invención). Los anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos pueden ser anticuerpos de mamífero (p.ej., ratón, humano) o porciones de unión a antígeno de los mismos. Las cadenas ligeras del anticuerpo pueden ser de tipo kappa o lambda.

Las regiones variables de los presentes anticuerpos o de las porciones de unión a antígeno de los mismos pueden proceder de una fuente humana o no humana. La estructura de los presentes anticuerpos, o de las porciones de unión a antígeno de los mismos, puede ser humana, humanizada, no humana (p.ej., una estructura de ratón modificada para reducir la antigenicidad en humanos), o puede ser una estructura sintética (p.ej., una secuencia de consenso).

En una realización, los presentes anticuerpos, o las porciones de unión a antígeno de los mismos, comprenden al menos una región variable de cadena pesada y/o al menos una región variable de cadena ligera.

Los presentes anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos se unen específicamente a Globo H con una constante de disociación (K^d) inferior a aproximadamente 10E-7 M, inferior a aproximadamente 10E-8 M, inferior a aproximadamente 10E-9 M, inferior a aproximadamente 10E-10 M, inferior a aproximadamente 10E-11 M, o inferior a aproximadamente 10E-12 M. En una realización, el anticuerpo o la porción de unión a anticuerpo del mismo tiene una constante de disociación (K^d) de 1 ~ 10 x 10E-9 o inferior. En otra realización, la Kd se determina mediante resonancia de plasmón superficial.

Los anticuerpos con una región de cadena pesada variable y una región de cadena ligera variable que son homólogas en al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 81%, al menos aproximadamente 82%, al menos aproximadamente 83%, al menos aproximadamente 84%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 86%, al menos aproximadamente 87%, al menos aproximadamente 88%, al menos aproximadamente 89%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 91%, al menos aproximadamente 92%, al menos aproximadamente 93%, al menos aproximadamente 94%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o aproximadamente 100% a la región de cadena pesada variable y a la región de cadena ligera del anticuerpo producido por el clon 2C2, y también se pueden unir a un antígeno de carbohidrato (p.ej., Globo H). La homología se puede dar tanto a nivel de secuencia de aminoácidos como a nivel de secuencia de nucleótidos.

En algunas realizaciones, los anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos incluyen, por ejemplo, las cadenas pesadas variables y/o las cadenas ligeras variables de los anticuerpos producidos por el hibridoma 2C2, el hibridoma 3D7 y el hibridoma 7A11, que se muestran en la Tabla 1.

En realizaciones relacionadas, los anticuerpos o las porciones de unión a antígeno de los mismos incluyen, por ejemplo, las CDRs de las cadenas pesadas variables y/o las CDRs de las cadenas ligeras variables de los anticuerpos producidos a partir del hibridoma 2C2, el hibridoma 3D7 y el hibridoma 7A11. Las CDRs y las estructuras de las cadenas pesadas variables y de las cadenas ligeras variables de estos clones de hibridoma se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1: SEQ ID NO. 1 - 90

Además se describe un ácido nucleico que codifica el presente anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a un antígeno de carbohidrato. En una realización, el antígeno de carbohidrato es Globo H. En otra realización, el antígeno de carbohidrato es SSEA-3. En otra realización adicional, el antígeno de carbohidrato es SSEA-4. El ácido nucleico se puede expresar en una célula para producir el presente anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo.

En determinadas realizaciones, los anticuerpos o las porciones de unión a antígeno de los mismos incluyen una región de cadena pesada variable que comprende una secuencia de aminoácidos que es homóloga en al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 81%, al menos aproximadamente 82%, al menos aproximadamente 83%, al menos aproximadamente 84%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 86%, al menos aproximadamente 87%, al menos aproximadamente 88%, al menos aproximadamente 89%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 91%, al menos aproximadamente 92%, al menos aproximadamente 93%, al menos aproximadamente 94%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o aproximadamente 100%, a cualquiera de las siguientes:

a) SEQ ID NO: 3 (Hibridoma 2C2);

b) SEQ ID NO: 13 (Hibridoma 3D7); o

c) SEQ ID NO: 21 (Hibridoma 7A11)

En determinados aspectos, los anticuerpos o las porciones de unión a antígeno de los mismos incluyen una región de cadena ligera variable que comprende una secuencia de aminoácidos que es homóloga en al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 81%, al menos aproximadamente 82%, al menos aproximadamente 83%, al menos aproximadamente 84%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 86%, al menos aproximadamente 87%, al menos aproximadamente 88%, al menos aproximadamente 89%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 91%, al menos aproximadamente 92%, al menos aproximadamente 93%, al menos aproximadamente 94%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o aproximadamente 100%, a cualquiera de las siguientes:

a) SEQ ID NO: 4 (Hibridoma 2C2);

b) SEQ ID NO: 14 (Hibridoma 3D7); o

c) SEQ ID NO: 22 (Hibridoma 7A11)

En determinados aspectos, una región de cadena pesada variable de los anticuerpos o de las porciones de unión a antígeno de los mismos comprende una secuencia de aminoácidos que es homóloga en al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 81%, al menos aproximadamente 82%, al menos aproximadamente 83%, al menos aproximadamente 84%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 86%, al menos aproximadamente 87%, al menos aproximadamente 88%, al menos aproximadamente 89%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 91%, al menos aproximadamente 92%, al menos aproximadamente 93%, al menos aproximadamente 94%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o aproximadamente 100%, a la SEQ ID NO: 3, y una región de cadena ligera variable de los anticuerpos o las porciones de unión a antígeno de los mismos que comprende una secuencia de aminoácidos que es homóloga en al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 81%, al menos aproximadamente 82%, al menos aproximadamente 83%, al menos aproximadamente 84%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 86%, al menos aproximadamente 87%, al menos aproximadamente 88%, al menos aproximadamente 89%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 91%, al menos aproximadamente 92%, al menos aproximadamente 93%, al menos aproximadamente 94%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o aproximadamente 100%, a la SEQ ID NO: 4.

En determinados aspectos, una región de cadena pesada variable de los anticuerpos o de las porciones de unión a antígeno de los mismos comprende una secuencia de aminoácidos que es homóloga en al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 81%, al menos aproximadamente 82%, al menos aproximadamente 83%, al menos aproximadamente 84%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 86%, al menos aproximadamente 87%, al menos aproximadamente 88%, al menos aproximadamente 89%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 91%, al menos aproximadamente 92%, al menos aproximadamente 93%, al menos aproximadamente 94%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o aproximadamente 100%, a la SEQ ID NO: 13, y una región de cadena ligera variable de los anticuerpos o las porciones de unión a antígeno de los mismos comprende una secuencia de aminoácidos que es homóloga en al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 81%, al menos aproximadamente 82%, al menos aproximadamente 83%, al menos aproximadamente 84%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 86%, al menos aproximadamente 87%, al menos aproximadamente 88%, al menos aproximadamente 89%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 91%, al menos aproximadamente 92%, al menos aproximadamente 93%, al menos aproximadamente 94%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o aproximadamente 100%, a la SEQ ID NO: 14.

En determinados aspectos, una región de cadena pesada variable de los anticuerpos o las porciones de unión a antígeno de los mismos comprende una secuencia de aminoácidos que es homóloga en al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 81%, al menos aproximadamente 82%, al menos aproximadamente 83%, al menos aproximadamente 84%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 86%, al menos aproximadamente 87%, al menos aproximadamente 88%, al menos aproximadamente 89%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 91%, al menos aproximadamente 92%, al menos aproximadamente 93%, al menos aproximadamente 94%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o aproximadamente 100%, a la SEQ ID NO: 21, y una región de cadena ligera variable de los anticuerpos o las porciones de unión a antígeno de los mismos comprende una secuencia de aminoácidos que es homóloga en al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 81%, al menos aproximadamente 82%, al menos aproximadamente 83%, al menos aproximadamente 84%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 86%, al menos aproximadamente 87%, al menos aproximadamente 88%, al menos aproximadamente 89%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 91%, al menos aproximadamente 92%, al menos aproximadamente 93%, al menos aproximadamente 94%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 96%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, al menos aproximadamente 99% o aproximadamente 100%, a la SEQ ID NO: 22.

En determinados aspectos, una región de cadena pesada variable de los anticuerpos o las porciones de unión a antígeno de los mismos puede comprender uno, dos, tres o más CDRs, que comprende secuencias de aminoácido que son homólogas en al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 99%, aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 81%, aproximadamente 82%, aproximadamente 83%, aproximadamente 84%, aproximadamente 85%, aproximadamente 86%, aproximadamente 87%, aproximadamente 88%, aproximadamente 89%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99% o aproximadamente 100% a cualquiera de las siguientes:

a) CDRs de la región de cadena pesada variable de un anticuerpo producido por el hibridoma 2C2 (SEQ ID NOs: 5, 6 y 7);

b) CDRs de la región de cadena pesada variable de un anticuerpo producido por el hibridoma 3D7 (SEQ ID NOs: 15, 16 y 17); o

c) CDRs de la región de cadena pesada variable de un anticuerpo producido por el hibridoma 7A11 (SEQ ID NOs: 23, 24 y 25)

d) .

En determinados aspectos, una región de cadena ligera variable de los anticuerpos o las porciones de unión a antígeno de los mismos puede comprender una, dos, tres o más CDRs, que comprende secuencias de aminoácido que son homologas en al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 99%, aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 81%, aproximadamente 82%, aproximadamente 83%, aproximadamente 84%, aproximadamente 85%, aproximadamente 86%, aproximadamente 87%, aproximadamente 88%, aproximadamente 89%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99% o aproximadamente 100% a cualquiera de las siguientes:

a) CDRs de la región de cadena ligera variable de un anticuerpo producido por el hibridoma 2C2 (SEQ ID NOs:

8, 9 y 10);

b) CDRs de la región de cadena ligera variable de un anticuerpo producido por el hibridoma 3D7 (SEQ ID NOs:

18, 19 y 20); o

c) CDRs de la región de cadena ligera variable de un anticuerpo producido por el hibridoma 7A11 (SEQ ID NOs:

26, 27 y 28)

Una región de cadena pesada variable de los anticuerpos o las porciones de unión a antígeno de los mismos puede comprender una, dos, tres o más CDRs, que comprende las secuencias de aminoácido que son homólogas en al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 99%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99% o aproximadamente 100% a las CDRs de la región de cadena pesada variable de un anticuerpo producido por el hibridoma 2C2 (SEQ ID NOs: 5, 6, 7) o las CDRs de la región de cadena pesada variable de un anticuerpo producido por el hibridoma 3D7 (SEQ ID NOs: 15, 16 y 17), y una región de cadena ligera variable de los anticuerpos o las porciones de unión a antígeno del mismo puede comprender una, dos, tres o más CDRs que comprenden secuencias de aminoácido que son homólogas en al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 99%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99% o aproximadamente 100% a las CDRs de la región de cadena ligera variable de un anticuerpo producido por el hibridoma 2C2 (SEQ ID NOs: 8, 9, 10) o las CDRs de la región de cadena ligera variable de un anticuerpo producido por el hibridoma 3D7 (SEQ ID NOs: 18, 19 y 20).

En un aspecto, los anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos comprenden además una estructura que es homóloga en al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 99%, aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 81%, aproximadamente 82%, aproximadamente 83%, aproximadamente 84%, aproximadamente 85%, aproximadamente 86%, aproximadamente 87%, aproximadamente 88%, aproximadamente 89%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99% o aproximadamente 100% a la SEQ ID NO: 83 (Estructura 1 de Cadena Pesada del anticuerpo 2C2) o a la SEQ ID NO: 87 (Estructura 1 de Cadena Pesada del anticuerpo 2C2 humanizado, véase la Tabla 1), donde la estructura está entre una secuencia líder y la CDR1 de una región de cadena pesada variable del anticuerpo producido por el hibridoma 2C2. En otra realización, los anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos comprenden una estructura que es homóloga en al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 99%, aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 81%, aproximadamente 82%, aproximadamente 83%, aproximadamente 84%, aproximadamente 85%, aproximadamente 86%, aproximadamente 87%, aproximadamente 88%, aproximadamente 89%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99% o aproximadamente 100% a la SEQ ID NO: 84 (Estructura 1 de Cadena Ligera del anticuerpo 2C2) o a la SEQ ID NO: 88 (Estructura 1 de Cadena Ligera del anticuerpo 2C2 humanizado, véase la Tabla 1) y dicha estructura está entre una secuencia líder y la CDR1 de la región de cadena ligera variable del anticuerpo producido por el hibridoma 2C2.

En un aspecto, los anticuerpos o las porciones de unión a antígeno de los mismos comprenden además una estructura entre CDR1 y CDR2 de la región de cadena pesada variable del anticuerpo producido por el hibridoma 2C2, donde la estructura es homóloga en al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 99%, aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 81%, aproximadamente 82%, aproximadamente 83%, aproximadamente 84%, aproximadamente 85%, aproximadamente 86%, aproximadamente 87%, aproximadamente 88%, aproximadamente 89%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99% o aproximadamente 100% a la SEQ ID NO: 11 (Estructura 2 de Cadena Pesada de la Tabla 1). En un ejemplo de realización, la estructura entre CDR1 y CDR2 de una región de cadena pesada variable que tiene una secuencia de aminoácido homóloga entre aproximadamente un 80% y aproximadamente el 100% a la SEQ ID NO: 11, contiene glicina en la posición 9. La posición del aminoácido de la SEQ ID NO: 11 se ilustra a continuación:

* El aminoácido de la posición 1 de FW2 (W) es el residuo adyacente a CDR1.

** El aminoácido de la posición 14 de FW2 (A) es el residuo adyacente a CDR2.

En otro aspecto, los anticuerpos o las porciones de unión a antígeno de los mismos comprenden además una estructura entre CDR1 y CDR2 de la región de cadena ligera variable de un anticuerpo producido por el hibridoma 2C2, donde la estructura es homóloga en al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 99%, aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 81%, aproximadamente 82%, aproximadamente 83%, aproximadamente 84%, aproximadamente 85%, aproximadamente 86%, aproximadamente 87%, aproximadamente 88%, aproximadamente 89%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99% o aproximadamente 100% a la SEQ ID NO: 12 (Estructura 2 de Cadena Ligera de la Tabla 1). En un ejemplo de realización, la estructura entre CDR1 y CDR2 de una región de cadena ligera variable del anticuerpo producido por el hibridoma 2C2 contiene prolina en la posición 12. En otro ejemplo de realización, la estructura entre CDR1 y CDR2 de una región de cadena ligera variable del anticuerpo producido por el hibridoma 2C2 contiene triptófano en la posición 13. En otro ejemplo adicional de realización, la estructura entre CDR1 y CDR2 de una región de cadena ligera variable del anticuerpo producido por el hibridoma 2C2 contiene prolina en la posición 12 y triptófano en la posición 13. La posición del aminoácido de la SEQ ID NO: 12 se ilustra a continuación:

* El aminoácido de la posición 1 de FW2 (W) es el residuo adyacente a CDR1.

** El aminoácido de la posición 15 de FW2 (Y) es el residuo adyacente a CDR2.

En otro aspecto, los anticuerpos o las porciones de unión a antígeno de los mismos comprenden además una estructura que es homóloga en al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 99%, aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 81%, aproximadamente 82%, aproximadamente 83%, aproximadamente 84%, aproximadamente 85%, aproximadamente 86%, aproximadamente 87%, aproximadamente 88%, aproximadamente 89%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99% o aproximadamente 100% a la SEQ ID NO: 85 (Estructura 3 de Cadena Pesada) o a la SEQ ID NO: 89 (Estructura 3 de Cadena Pesada de anticuerpo humanizado, véase la Tabla 1), donde la estructura está entre CDR2 y CDR3 de una región de cadena pesada variable del anticuerpo producido el hibridoma 2C2. En otra realización, los anticuerpos o las porciones de unión a antígeno de los mismos comprenden además una estructura que es homóloga en al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 99%, aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 81%, aproximadamente 82%, aproximadamente 83%, aproximadamente 84%, aproximadamente 85%, aproximadamente 86%, aproximadamente 87%, aproximadamente 88%, aproximadamente 89%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99% o aproximadamente 100% a la SEQ ID NO: 86 (Estructura 3 de Cadena Ligera) o a ala SEQ ID NO: 90 (Estructura 3 de Cadena Ligera de anticuerpo humanizado, véase la Tabla 1) y dicha estructura está entre CDR2 y CDR3 de una región de cadena ligera variable del anticuerpo producido por el hibridoma 2C2.

En determinados aspectos, una región de cadena pesada variable de los anticuerpos o las porciones de unión a antígeno de los mismos puede comprender una, dos, tres o más CDRs que comprenden secuencias de aminoácido que son homólogas en al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 99%, aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 81%, aproximadamente 82%, aproximadamente 83%, aproximadamente 84%, aproximadamente 85%, aproximadamente 86%, aproximadamente 87%, aproximadamente 88%, aproximadamente 89%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99% o aproximadamente 100% a CDRs de la región de cadena pesada variable del anticuerpo producido por el hibridoma 7A11 (SEQ ID NOs: 23, 24 y 25), y una región de cadena ligera variable de los anticuerpos o las porciones de unión a antígeno de los mismos puede comprender una, dos, tres o más CDRs que comprenden secuencias de aminoácido que son homólogas en al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 99%, aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 81%, aproximadamente 82%, aproximadamente 83%, aproximadamente 84%, aproximadamente 85%, aproximadamente 86%, aproximadamente 87%, aproximadamente 88%, aproximadamente 89%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99% o aproximadamente 100% a CDRs de una región de cadena ligera variable del anticuerpo producido por el hibridoma 7A11 (SEQ ID NOs: 26, 27 y 28).

En determinados aspectos, las regiones variables correspondientes a las regiones variables de la Tabla 1 presentan variaciones de secuencia. Por ejemplo, una región variable de cadena pesada, en la que 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 residuos, o menos del 40%, menos de aproximadamente el 30%, aproximadamente el 25%, aproximadamente el 20%, aproximadamente el 15%, aproximadamente el 10%, aproximadamente el 9%, aproximadamente el 8%, aproximadamente el 7%, aproximadamente el 6%, aproximadamente el 5%, aproximadamente el 4%, aproximadamente el 3%, aproximadamente el 2% o aproximadamente el 1% de los residuos de aminoácido están sustituidos o eliminados, pero mantiene esencialmente las mismas propiedades inmunológicas, que incluyen, aunque sin limitación, la unión a un antígeno de carbohidrato.

En determinados aspectos, las CDRs correspondientes a las CDRs de la Tabla 1 presentan variaciones de secuencia. Por ejemplo, puede haber presentes CDRs, en las que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 residuos, o menos del 20%, menos del 30% o menos de aproximadamente el 40% de los residuos totales de la CDR, están sustituidos o eliminados, en un anticuerpo (o porción de unión a antígeno del mismo) que se une a un antígeno de carbohidrato.

Los anticuerpos o las porciones de unión a antígeno de los mismos pueden ser péptidos. Dichos péptidos pueden incluir variantes, análogos, ortólogos, homólogos y derivados de péptidos, que exhiben una actividad biológica, p.ej., la unión a un antígeno de carbohidrato. Los péptidos pueden contener uno o más análogos de un aminoácido (que incluye, por ejemplo, aminoácidos no naturales, aminoácidos que solo existen de forma natural en un sistema biológico no relacionado, aminoácidos modificados de sistemas de mamífero, etc.), péptidos con enlaces sustituidos, así como otras modificaciones conocidas en la técnica.

También se describen anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos en los que se han sustituido, eliminado o añadido aminoácidos específicos. En un ejemplo de realización, dichas alteraciones no tienen un efecto sustancial sobre las propiedades biológicas del péptido, tal como la afinidad de unión. En otro ejemplo de realización, los anticuerpos pueden presentar sustituciones de aminoácido en la región de estructura, tal como para mejorar la afinidad de unión del anticuerpo al antígeno. En otro ejemplo adicional de realización, se puede reemplazar un número pequeño, seleccionado, de residuos estructurales aceptores por los correspondientes aminoácidos donantes. La estructura donante puede ser una secuencia estructural de anticuerpo humano de línea germinal o maduro, o una secuencia de consenso. Una guía sobre cómo realizar sustituciones de aminoácidos fenotípicamente silenciosas puede encontrarse en Bowie et al., Science, 247: 1306-1310 (1990). Cunningham et a!, Science, 244: 1081-1085 (1989). Ausubel (ed.), “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley and Sons, Inc. (1994). T. Maniatis, E. F. Fritsch y J. Sambrook, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989). Pearson, Methods Mol. Biol. 243: 307-31 (1994). Gonnet et a l, Science 256: 1443-45 (1992).

El anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, puede derivatizarse o unirse a otra molécula funcional. Por ejemplo, un anticuerpo puede ligarse funcionalmente (mediante acoplamiento químico, fusión genética, interacción no covalente, etc.) a una o más entidades moleculares distintas, tal como otro anticuerpo, un agente detectable, un agente citotóxico, un agente farmacéutico, una proteína o péptido que puede mediar en la asociación con otra molécula (tal como una región de núcleo de estreptavidina o una cola de polihistidina), ligandos de aminoácido, secuencias señal, vehículos inmunogénicos, o ligandos útiles en la purificación de proteínas, tal como glutationa-S-transferasa, cola de histidina, y proteína A de estafiloco. Un tipo de proteína derivatizada se produce por reticulación de dos o más proteínas (del mismo tipo o de tipos diferentes). Los reticulantes adecuados incluyen aquellos que son heterobifuncionales, que tienen grupos reactivos distintos separados por un espaciador apropiado (p.ej., éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida) o homobifuncional (p.ej., disuccinimidil suberato). Dichos ligandos están disponibles en Pierce Chemical Company, Rockford, Ill. Los agentes detectables útiles con los que se puede derivatizar (o marcar) una proteína, incluyen compuestos fluorescentes, diversas enzimas, grupos protésicos, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, y materiales radioactivos. Los ejemplos no limitativos de agentes detectables fluorescentes incluyen fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina y ficoeritrina. Una proteína o anticuerpo también se puede derivatizar con enzimas detectables, tal como fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano, betagalactosidasa, acetilcolinesterasa, glucosa oxidasa y similares. También se puede derivatizar una proteína con un grupo protésico (p.ej., estreptavidina/biotina y avidina/biotina).

También se describen ácidos nucleicos que codifican una variante funcionalmente activa del presente anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo. Dichas moléculas de ácido nucleico pueden hibridarse con un ácido nucleico que codifica cualquiera de los presentes anticuerpos, porciones de unión a antígeno de los mismos, en condiciones de severidad media, severidad alta, o severidad muy alta. Una guía para llevar a cabo las reacciones de hibridación se puede encontrar en “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley & Sons, N.Y. 6.3.1-6.3.6, 1989. Las condiciones de hibridación específicas referidas en la presente memoria son las siguientes: 1) condiciones de hibridación de severidad media: 6 X SSC a aproximadamente 45°C, seguido de uno o más lavados en 0,2 X SSC, SDS al 0,1% a 60°C; 2) condiciones de hibridación de severidad alta: 6 X SSC a aproximadamente 45°C, seguido de uno o más lavados en 0,2 X SSC, SDS al 0,1% a 65°C; y 3) condiciones de hibridación de severidad muy alta: fosfato sódico 0,5 M, SDS al 7% a 65°C, seguido de uno o más lavados en 0,2 X SSC, SDS al 0,1% a 65°C.

Un ácido nucleico que codifica el presente anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo puede introducirse en un vector de expresión que puede expresarse en un sistema de expresión adecuado, seguido de aislamiento o purificación del anticuerpo expresado, o de la porción de unión a antígeno del mismo. Opcionalmente, un ácido nucleico que codifica el presente anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo puede ser traducido en un sistema de traducción sin células. Patente de EE.Uu . n° 4.816.567. Queen etal., Proc Natl Acad Sci USA, 86: 10029 10033 (1989).

Los presentes anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos pueden ser producidos mediante células hospedantes transformadas con ADN que codifica cadenas ligeras y pesadas (o porciones de las mismas) de un anticuerpo deseado. Los anticuerpos pueden aislarse y purificarse a partir de dichos sobrenadantes de cultivo y/o de células usando técnicas estándar. Por ejemplo, se puede transformar una célula hospedante con ADN que codifica la cadena ligera, la cadena pesada, o ambos, de un anticuerpo. También se puede usar tecnología de ADN recombinante para eliminar la totalidad o parte del ADN que codifica cadenas ligeras y pesadas, o ambas, que no es necesario para la unión, p.ej., de la región constante.

Los presentes ácidos nucleicos se pueden expresar en diversas células adecuadas, que incluyen células procarióticas y células eucarióticas, p.ej., células bacterianas, (p.ej., E. ^coIⁱ ), células de levadura, células vegetales, células de insecto y células de mamífero. En la técnica se conoce una serie de líneas de células de mamífero e incluyen líneas celulares inmortalizadas disponibles en la “American Type Culture Collection” (ATCC). Los ejemplos no limitativos de las células incluyen todas las líneas celulares de origen mamífero o de características tipo mamífero, que incluyen, aunque sin limitación, células originales, derivados y/o variantes modificadas de células de riñón de mono (COS, p.ej., COS-1, COS-7), HEK293, riñón de hámster bebé (BHK, p.ej., BHK21), ovario de hámster chino (CHO), NS0, PerC6, BSC-1, células de carcinoma hepatocelular humano (p.ej., Hep G2), SP2/0, HeLa, riñón bovino Madin-Darby (MDBK), células de mieloma y linfoma. Las variantes modificadas incluyen, p.ej., derivados de perfil de glicano modificado y/o derivados de sitio de integración sito-específicos.

Se describen además células que comprenden los ácidos nucleicos descritos en la presente memoria. Las células pueden ser un hibridoma o un transfectante, tal como el hibridoma designado como 2C2.

Alternativamente, el presente anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo puede sintetizarse mediante procedimientos en fase sólida bien conocidos en la técnica. “Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach” de E. Atherton y R. C. Sheppard, publicado por IRL en Oxford University Press (1989). “Methods in Molecular Biology”, Vol. 35: “Peptide Synthesis Protocols” (ed. M. W. Pennington y B. M. Dunn), capítulo 7. “Solid Phase Peptide Synthesis”, 2a Ed., Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984). G. Barany y R. B. Merrifield, “The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology”, editores E. Gross y J. Meienhofer, Vol. 1 y Vol. 2, Academic Press, Nueva York, (1980), pp. 3 254. M. Bodansky, “Principles of Peptide Synthesis”, Springer-Verlag, Berlín (1984).

La presente descripción proporciona métodos para fabricar un anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a un antígeno de carbohidrato, (p.ej., Globo H). Por ejemplo, un animal no humano es inmunizado con una composición que incluye un antígeno de carbohidrato (p.ej., Globo H), y a continuación se aísla del animal un anticuerpo específico. El método puede incluir además la evaluación de la unión del anticuerpo a un antígeno de carbohidrato.

Se puede usar cualquiera de una variedad de antígenos de carbohidrato, particularmente Globo H, según la presente descripción. Los ejemplos de antígenos de carbohidrato incluyen, aunque sin limitación, antígenos de Globo tales como Globo H, antígeno 3 embrionario específico de estadio (SSEA-3) (también denominado Gb5), antígeno 4 embrionario específico de estadio (SSEA-4), Gb-4 y Gb-3, antígenos de Lewis tales como sLex, Lex, sLea, Lea y Ley, antígenos de polisacárido tales como ácido polisiálico (PSA), sTn(c) y Tn(c), antígeno de Thomsen-Friedenreich (TF(C)), el gangliosido tal como GD1, GD2, GD3, Fucosil GM1, GM1, g M2, GM3, GD1a y GM2, antígeno de sulfitide tal como 6Gal-HSO3-SiaLex y 6GluNAc-HSO3-SiaLex. Otros antígenos de carbohidrato incluyen, aunque sin limitación: a-Galactosa, a-Man-6-fosfato, a-L-Rhamnosa, a-GalNAc(Tn), a-NeuAc-OCH2C6H4-p-NHCOOCH2, Fuca1-2Galp1-4GalNAcp (H tipos 3), NeuAca2-8NeuAca,(NeuAca2-8)2 ácido polisiálico, NeuAca2-6Galb, NeuAcb2-6Gala(STn), Gala1-3Galb1-4GlaNAcb (NeuAca2-8)3, GalNAcaa-3(Fuca1-2)Galp (grupo sanguíneo A), Gala1-3(Fuca1-2)Galp (grupo sanguíneo B), 6Gal-HSO3-SiaLex, 6GluNAc-HSO3-SiaLex y N-glicanos a2-6 sialilados diantenarios.

En una realización, el anticuerpo anti-Globo H o la porción de unión al mismo pueden reaccionar de forma cruzada con otros antígenos de carbohidrato con alta selectividad, como se ilustra en la Fig. 3A y la Fig. 3B. Los ejemplos no limitativos de los antígenos de carbohidrato son: SSEA-3, SSEA-4, antígenos de Lewis.

En la presente memoria se describe un método para fabricar un hibridoma que expresa un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno de carbohidrato (p.ej., Globo H). El método contiene las siguientes etapas: inmunizar un animal con una composición que incluye antígeno de carbohidrato (p.ej., Globo H); aislar esplenocitos del animal; generar hibridomas a partir de los esplenocitos; y seleccionar un hibridoma que produce un anticuerpo que se une específicamente a Globo H. Kohler y Milstein, Nature, 256: 495, 1975. Harlow, E. y Lane, D. “Antibodies: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988.

En una realización, el antígeno de carbohidrato se usa para inmunizar ratones subcutáneamente. Se pueden administrar, o no, una o dos inyecciones. Se pueden monitorizar los títulos de los anticuerpos en el plasma, p.ej., mediante ELISA (ensayo inmunosorbente ligado a enzima) o citometría de flujo. Los ratones con título suficiente de anticuerpos anti-antígeno de carbohidrato se usan para las fusiones. Los ratones pueden haber sido inyectados, o no, con el antígeno 3 días antes de su sacrificio y extracción del bazo. Se aíslan los esplenocitos de ratón y se fusionan con PEG a una línea celular de mieloma de ratón. Los hibridomas resultantes se criban entonces en función de la producción de anticuerpos específicos de antígeno. Las células se llevan a placa, y a continuación se incuban en medio selectivo. Se criban entonces los sobrenadantes de pocillos individuales mediante ELISA para determinar la presencia de anticuerpos monoclonales anti-antígeno de carbohidrato. Se vuelven a llevar a placa los hibridomas que secretan anticuerpo, se vuelven a cribar, y si siguen siendo positivos para anticuerpos anti-antígeno de carbohidrato, pueden ser subclonados mediante dilución limitativa.

Se pueden usar adyuvante para aumentar la inmunogenicidad de uno o más de los antígenos de carbohidrato. Los ejemplos no limitativos de adyuvantes incluyen fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio, MF59 (4,3% p/v de escualeno, 0,5% p/v de polisorbato 80 (Tween 80), 0,5% p/v de trioleato de sorbitán (Span 85)), ácido nucleico que contiene CpG, QS21 (adyuvante de saponina), a-galactosil-ceramides o análogos sintéticos de los mismos (p.ej., C34, véase el documento US 8.268.969), Mp L (monofosforil lípido A), 3DMPL (MPL 3-O-deacilado), extractos de Aquilla, ISCOMS (véase, p.ej., Sjolander etal. (1998) J. Leukocyte Biol. 64: 713; los documentos WO90/03184; WO96/11711; WO 00/48630; WO98/36772; WO00/41720; WO06/134423 y WO07/026190), mutantes LT/CT, micropartículas de poli(D,L-lactida-co-glicolida) (PLG), Quil A, interleucinas, adyuvante de Freund, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-nor-muramil-L-alanil-D-isoglutamina (CGP 11637, denominada nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (CGP 19835A, denominada MTP-PE), y RIBI, que contiene tres componentes extraídos de bacterias, monosfosforil lípido A, dimicolato de trehalosa y esqueleto de pared celular (MPL+TDM+CWS) en una emulsión de escualeno 2%/Tween 80.

El animal inmunizado puede ser cualquier animal que es capaz de producir anticuerpos recuperables cuando se le administra un inmunógeno, tal como, aunque sin limitación, conejos, ratones, ratas, hámsteres, cabras, caballos, monos, babuinos y humanos. En un aspecto, el hospedante es transgénico y produce anticuerpos humanos, p.ej., un ratón que expresa los segmentos génicos de inmunoglobulina humana. Patente de EE.UU. n° 8.236.311; 7.625.559 y 5.770.429. Lonberg et al., Nature 368(6474): 856-859, 1994. Lonberg, N., “Handbook of Experimental Pharmacology” 113: 49-101, 1994. Lonberg, N. y Huszar, D., Intern. Rev. Immunol., 13: 65-93, 1995. Harding, F. y Lonberg, N., Ann. N.Y. Acad. Sci., 764: 536-546, 1995.

Una vez inmunizado el hospedante y que los anticuerpos han sido producidos, se evalúa los anticuerpos para confirmar que son específicos para el antígeno de interés y para determinar si exhiben alguna reactividad cruzada con otros antígenos. Un método para llevar a cabo dichos ensayos es un ensayo de cribado de sueros como el descrito en la Publicación de Patente de EE.UU. n° 2004/0126829. Los anticuerpos anti-antígeno de carbohidrato se pueden caracterizar en términos de unión al carbohidrato mediante una serie de técnicas conocidas. Por ejemplo, en un ELISA, se recubren placas de microtitulación con la toxina o el antígeno toxoide en PBS, y a continuación se bloquean con proteínas irrelevantes tal como albúmina de suero bovino (BSA) diluida en PBS. Se añaden diluciones de plasma procedente de ratones inmunizados con la toxina a cada pocillo y se incuba. Las placas son lavadas y a continuación incubadas con un anticuerpo secundario conjugado a una enzima (p.ej., fosfatasa alcalina). Tras lavar, las placas son desarrolladas con el sustrato de la enzima (p.ej., ABTS), y analizadas a una DO específica. En otras realizaciones, para determinar si los anticuerpos monoclonales seleccionados se unen al antígeno de carbohidrato diana o a epítopos, el anticuerpo puede ser biotinilado, que puede ser detectado posteriormente con una sonda marcada con estreptavidina. Se puede evaluar la reactividad de los anticuerpos anti-antígeno de carbohidrato mediante un ensayo de transferencia Western blot.

Los hibridomas que producen anticuerpos que se unen, preferiblemente con afinidad elevada, al antígeno de carbohidrato, pueden ser subclonados entonces y caracterizados en mayor profundidad. A continuación, se puede elegir un clon de cada hibridoma, que retiene la reactividad de las células originales (mediante ELISA), para fabricar un banco de células, y para la purificación de anticuerpos.

Los anticuerpos, o los fragmentos de unión a antígeno, variantes o derivados de los mismos, de la presente descripción también pueden describirse o especificarse en términos de su afinidad de unión a un antígeno. La afinidad de un anticuerpo por un antígeno de carbohidrato se puede determinar experimentalmente usando cualquier método adecuado (véase, p.ej., Berzofsky et al., “Antibody-Antigen Interactions”, en “Fundamental Immunology”, Paul, W. E., Ed., Raven Press: Nueva York, N.Y. (1984); Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company: Nueva York, N.Y. (1992); y los métodos descritos en la presente memoria). La afinidad medida de una interacción particular de anticuerpo-antígeno de carbohidrato puede variar si se mide en condiciones diferentes (p.ej., concentración salina, pH). Por tanto, las medidas de afinidad y de otros parámetros de la unión a antígeno (p.ej., K^d, K^a, K^d) se realizan preferiblemente con disoluciones estandarizadas de anticuerpos y antígenos, y con un tampón estandarizado.

Los presentes anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos tienen utilidad terapéutica, profiláctica y/o diagnóstica in vitro e in vivo. Por ejemplo, estos anticuerpos pueden administrarse a células en cultivo, p.ej., in vitro o ex vivo, a un sujeto, p.ej., in vivo, para tratar, inhibir, prevenir la recaída y/o diagnosticar el cáncer.

Los anticuerpos o las porciones de unión a antígeno de los mismos pueden usarse en células en cultivo, p.ej., in vitro o ex vivo. Por ejemplo, se pueden cultivar células in vitro en medio de cultivo y ponerse en contacto con el anticuerpo anti-Globo H, o con un fragmento del mismo. Los métodos pueden llevarse a cabo en células presentes en un sujeto, como parte de un protocolo in vivo (p.ej., terapéutico o profiláctico). Para las realizaciones in vivo, la etapa de puesta en contacto se efectúa en un sujeto e incluye la administración de un anticuerpo anti-toxina, o de una porción del mismo, al sujeto en condiciones efectivas para permitir la unión del anticuerpo, o de la porción del mismo, a un antígeno de carbohidrato (p.ej., Globo H) expresado en una o más células de cáncer en el sujeto, p.ej., en la célula de cáncer de mama.

El anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo puede administrarse solo o en combinación con otro agente terapéutico, p.ej., un segundo anticuerpo monoclonal o policlonal, o una porción de unión a antígeno del mismo, o un agente quimioterapéutico. El producto de combinación puede ser una mezcla de los dos componentes o pueden unirse covalentemente. En un ejemplo, el anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a Globo H, está combinado con un anticuerpo (monoclonal o policlonal) o una porción de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a VEGF. En otro ejemplo, el segundo agente es un agente de quimioterapia (p.ej., ciclofosfamida, 5-fluorouracilo o actinomicina-D). Los anticuerpos también pueden administrarse en combinación con una vacuna de cáncer, p.ej., Globo H conjugado con toxina de difteria y una adyuvante de saponina.

Métodos para inhibir células de cáncer

La descripción también proporciona métodos para inhibir el crecimiento de una célula in vitro, ex vivo o in vivo, donde la célula, tal como una célula de cáncer, se pone en contacto con una cantidad efectiva de un anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo como se describe en la presente memoria. Las células o tejidos patológicos, tal como células o tejidos hiperproliferativos, pueden ser tratados poniendo en contacto dichas células o tejidos con una cantidad efectiva de un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, de esta invención. Las células, tal como células de cáncer, pueden ser células de cáncer primarias o pueden ser células cultivadas disponibles en bancos de tejidos, tal como la “American Type Culture Collection” (ATCC). Las células patológicas pueden ser células de un cáncer que expresa Globo H, gliomas, meningiomas, adenomas de pituitaria o una metástasis al SNC a partir de un cáncer sistémico, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer hematopoiético o cáncer de ovario. Las células pueden ser de un vertebrado, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un humano. Publicación de Patente de EE.UU. n° 2004/0087651. Balassiano et al. (2002) Intem. J. Mol. Med. 10: 785-788. Thome, et al. (2004) Neuroscience 127: 481-496. Femandes, et al. (2005) Oncology Reports 13: 943-947. Da Fonseca, et al. (2008) Surgical Neurology 70: 259267. Da Fonseca, et al. (2008) Arch. Immunol. Ther. Exp. 56: 267-276. Hashizume, et al. (2008) Neuroncology 10: 112-120. En una realización, el cáncer es cáncer que expresa Globo H. En otra realización, el cáncer es cáncer que expresa SSEA-3. En otra realización adicional, el cáncer es cáncer que expresa SSEA-4. El cáncer que expresa Globo H, el cáncer que expresa SSEA-3 y el cáncer que expresa SSEA-4 incluyen, aunque sin limitación, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer pancreático, cáncer gástrico, cáncer de ovario y cáncer endometrial y cáncer de colon, cáncer de hígado, cáncer nasofaríngeo, cáncer de piel, cáncer oral, cáncer renal, cáncer de cerebro, cáncer cervical y cáncer de vejiga.

La eficacia in vitro del presente anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, puede determinarse usando métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede estudiar la citotoxicidad del anticuerpo o de la porción de unión a antígeno del mismo mediante el ensayo de citotoxicidad de MTT [bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolio]. El ensayo MTT se basa en el principio de la captación de MTT, una sal de tetrazolio, por parte de células metabólicamente activas, donde es metabolizado en un producto de formazon de color azul, que puede ser leído espectrométricamente. J. of Immunological Methods 65: 55-63, 1983. La citotoxicidad del presente anticuerpo, o de la porción de unión a antígeno del mismo, puede estudiarse mediante el ensayo de formación de colonia. Los ensayos funcionales para la unión de antígeno de Globo H pueden llevarse a cabo mediante ELISA. Se puede estudiar el bloqueo del ciclo celular por parte del anticuerpo, o de la porción de unión a antígeno del mismo, mediante tinción estándar con yoduro de propidio (PI) y citometría de flujo. La inhibición de la invasión se puede estudiar mediante cámaras de Boyden. En este ensayo se recubre una capa de membrana de base reconstituida, Matrigel, sobre filtros de quimiotaxis que actúa como barrera para la migración de células en las cámaras de Boyden. Solo las células con capacidad invasiva pueden atravesar la barrera Matrigel. Otros ensayos incluyen, aunque sin limitación, ensayos de viabilidad celular, ensayos de apoptosis y ensayos morfológicos.

Los ensayos también pueden realizarse in vivo usando un modelo de ratón. Véase, p.ej., B. Teicher, “Tumor Models for Efficacy Determination”. Mol Cancer Ther 2006; 5: 2435-2443.

Composición farmacéutica

En una realización, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo descrito en la presente memoria, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Se describe además una composición farmacéutica que comprende un ácido nucleico aislado que codifica el presente anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, agentes isotónicos y agentes de retardo de la absorción, y similares que sean fisiológicamente compatibles. En una realización, la composición es efectiva para inhibir células de cáncer en un sujeto.

Las rutas de administración de las presentes composiciones farmacéuticas incluyen, aunque sin limitación, administración intravenosa, intramuscular, intranasal, subcutánea, oral, tópica, subcutánea, intradérmica, transdérmica, subdérmica, parenteral, rectal, espinal o epidérmica.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden prepararse como inyectables, tanto en disoluciones líquidas como en suspensiones líquidas, o en forma de sólidos que son adecuados para disolución o suspensión en vehículos líquidos antes de la inyección. La composición farmacéutica también puede prepararse en forma sólida, emulsificada o se puede encapsular el ingrediente activo en vehículos de liposomas u otros vehículos particulados usados para una administración sostenida. Por ejemplo, la composición farmacéutica puede estar en la forma de una emulsión aceitosa, una emulsión de agua-en-aceite, una emulsión de agua-en-aceite-en-agua, una emulsión específica de sitio, una emulsión de residencia larga, una emulsión pegajosa, una microemulsión, una nanoemulsión, un liposoma, una micropartícula, una microesfera, una nanoesfera, una nanopartícula y diversos polímeros naturales o sintéticos, tales como polímeros impermeables no reabsorbibles tales como copolímeros de etilenvinil acetato y copolímeros Hytrel®, polímeros hinchables tales como hidrogeles, o polímeros reabsorbibles tales como colágeno y determinados poliácidos o poliésteres tal como los usados para fabricar suturas reabsorbibles, que permiten una liberación sostenida de la composición farmacéutica.

Los presentes anticuerpos o las porciones de unión a antígeno de los mismos se formulan en composiciones farmacéuticas para administración a un sujeto mamífero. La composición farmacéutica se administra sola, y/o mezclada con una vehículo, excipiente o portador farmacéuticamente aceptable. Los vehículos adecuados son, por ejemplo, agua, salino, dextrosa, glicerol, etano, o similares, y combinaciones de los mismos. Adicionalmente, el vehículo puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponantes del pH, o adyuvantes. Los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden contener un compuesto fisiológicamente aceptable que actúa para, p.ej., estabilizar, o aumentar o disminuir la absorción o las tasas de eliminación de las composiciones farmacéuticas de la invención. Los compuestos fisiológicamente aceptables pueden incluir, p.ej., carbohidratos, tal como glucosa, sacarosa o dextranos, antioxidantes, tal como ácido ascórbico o glutationa, agentes quelantes, proteínas de bajo peso molecular, detergentes, vehículos liposomales, o excipientes u otros estabilizantes y/o tampones. Otros compuestos fisiológicamente aceptables incluyen agentes humectantes, agentes emulsionantes, agentes dispersantes o conservantes. Véase, p.ej., la 21a edición de “Remington’s Pharmaceutical Science”, Mack Publishing Company, Easton, Pa. (“Remington’s”). Las composiciones farmacéuticas de la presente invención también pueden incluir sustancias complementarias, tal como agentes farmacológicos, citocinas u otros modificadores de respuesta biológica.

Adicionalmente, las composiciones farmacéuticas pueden formularse en composiciones farmacéuticas en forma neutra o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición ácida (formadas con los grupos amino libres de los polipéptidos activos) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, los ácidos clorhídrico o fosfórico, o con ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico, y similares. Las sales formadas a partir de grupos carboxilo libres también pueden derivar de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxido sódico, potásico, amónico, cálcico o férrico, y bases orgánicas como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, y similares.

Los métodos reales para preparar dichas formas de dosis son conocidos, o serán evidentes, por los especialistas en la técnica. Véase, p.ej., “Remington’s Pharmaceutical Sciences”, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 2ia edición.

Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar en un tratamiento de dosis única o en tratamientos de dosis múltiples con un calendario y a lo largo de un periodo de tiempo apropiado para la edad, peso y condición del sujeto, la composición particular usada, y la ruta de administración, si la composición farmacéutica se usa para fines profilácticos o curativos, etc. Por ejemplo, en una realización, la composición farmacéutica según la invención se administra una vez al mes, dos veces al mes, tres veces al mes, cada dos semanas (qow), una vez a la semana (qw), dos veces por semana (biw), tres veces por semana (tiw), cuatro veces por semana, cinco veces por semana, seis veces por semana, cada dos días (qod), diariamente (qd), dos veces al día (qid), o tres veces al día (tid).

La duración de la administración de un anticuerpo según la invención, p.ej., el periodo de tiempo durante el cual se administra la composición farmacéutica puede variar, dependiendo de cualquiera de una variedad de factores, p.ej., la respuesta del sujeto, etc. Por ejemplo, la composición farmacéutica se puede administrar a lo largo de un periodo de tiempo que oscila entre aproximadamente uno o más segundos y una o más horas, entre un día y aproximadamente una semana, entre aproximadamente dos semanas y aproximadamente cuatro semanas, entre aproximadamente un mes y aproximadamente dos meses, entre aproximadamente dos meses y aproximadamente cuatro meses, entre aproximadamente cuatro meses y aproximadamente seis meses, entre aproximadamente seis mese y aproximadamente ocho meses, entre aproximadamente ocho meses y aproximadamente 1 año, entre aproximadamente 1 año y aproximadamente 2 años, o entre aproximadamente 2 años y aproximadamente 4 años, o más.

Para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación, se pueden usar composiciones farmacéuticas orales o parenterales en forma de dosis unitaria. La forma de dosis unitaria tal como se usa en la presente memoria se refiere a unidades físicamente discretas preparadas como dosis unitarias para el sujeto a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido.

Los datos obtenidos a partir de los ensayos de cultivo celular y de estudios animales se pueden usar para formular un rango de dosis para uso en humanos. En una realización, la dosis de dichos compuestos se encuentra en un rango de concentraciones en circulación que incluyen la ED⁵⁰con poca o ninguna toxicidad. La dosis puede variar dentro de dicho rango dependiendo de la forma de dosis empleada y de la ruta de administración utilizada. En otra realización, la dosis terapéuticamente efectiva puede estimarse inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Se puede formular una dosis en modelos animales para alcanzar un rango de concentración en plasma en circulación que incluye la IC⁵⁰(es decir, la concentración del compuesto de ensayo que alcanza una inhibición mitad de la máxima de los síntomas), determinada en cultivo celular. Sonderstrup, Springer, Sem. Immunopathol. 25: 35-45, 2003. Nikula et al., Inhal. Toxicol. 4(12): 123-53, 2000.

Un ejemplo no limitativo de rango para la cantidad terapéuticamente o profilácticamente efectiva de un anticuerpo o una porción de unión a antígeno de la invención está entre aproximadamente 0,001 y aproximadamente 60 mg/kg de peso corporal, entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 30 mg/kg de peso corporal, entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 25 mg/kg de peso corporal, entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 25 mg/kg de peso corporal, entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal, entre aproximadamente 10 y aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal, entre aproximadamente 0,75 y aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal, entre aproximadamente 1 y aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal, entre aproximadamente 2 y aproximadamente 9 mg/kg de peso corporal, entre aproximadamente 1 y aproximadamente 2 mg/kg de peso corporal, entre aproximadamente 3 y aproximadamente 8 mg/kg de peso corporal, entre aproximadamente 4 y aproximadamente 7 mg/kg de peso corporal, entre aproximadamente 5 y aproximadamente 6 mg/kg de peso corporal, entre aproximadamente 8 y aproximadamente 13 mg/kg de peso corporal, entre aproximadamente 8,3 y aproximadamente 12,5 mg/kg de peso corporal, entre aproximadamente 4 y aproximadamente 6 mg/kg de peso corporal, entre aproximadamente 4,2 y aproximadamente 6,3 mg/kg de peso corporal, entre aproximadamente 1,6 y aproximadamente 2,5 mg/kg de peso corporal, entre aproximadamente 2 y aproximadamente 3 mg/kg de peso corporal, o aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal.

La composición farmacéutica se formula para contener una cantidad efectiva del presente anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo, donde la cantidad depende del animal a tratar y de la afección a tratar. En una realización, el presente anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo se administra a una dosis que oscila entre aproximadamente 0,01 mg y aproximadamente 10 g, entre aproximadamente 0,1 mg y aproximadamente 9 g, entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 8 g, entre aproximadamente 2 mg y aproximadamente 7 g, entre aproximadamente 3 mg y aproximadamente 6 g, entre aproximadamente 10 mg y aproximadamente 5 g, entre aproximadamente 20 mg y aproximadamente 1 g, entre aproximadamente 50 mg y aproximadamente 800 g, entre aproximadamente 100 mg y aproximadamente 500 mg, entre aproximadamente 0,01 gg y aproximadamente 10 g, entre aproximadamente 0,05 gg y aproximadamente 1,5 mg, entre aproximadamente 10 gg y aproximadamente 1 mg de proteína, entre aproximadamente 30 gg y aproximadamente 500 gg, entre aproximadamente 40 gg y aproximadamente 300 gg, entre aproximadamente 0,1 gg y aproximadamente 200 gg, entre aproximadamente 0,1 gg y aproximadamente 5 gg, entre aproximadamente 5 gg y aproximadamente 10 gg, entre aproximadamente 10 gg y aproximadamente 25 gg, entre aproximadamente 25 gg y aproximadamente 50 gg, entre aproximadamente 50 gg y aproximadamente 100 gg, entre aproximadamente 100 gg y aproximadamente 500 gg, entre aproximadamente 500 gg y aproximadamente 1 mg, entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 2 mg. El nivel de dosis específico para cualquier sujeto particular depende de una variedad de factores que incluyen la actividad de péptido específico, la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo, la dieta, el tiempo de administración, la ruta de administración, y la velocidad de excreción, la combinación de fármacos y la gravedad de la enfermedad particular a la que se aplica la terapia, y puede ser determinada por un especialista en la técnica sin ninguna experimentación adicional.

Los presentes anticuerpos, y las porciones de unión a antígeno de los mismos, las composiciones farmacéuticas y los métodos se pueden usar en todos los vertebrados, p.ej., mamíferos y no mamíferos, que incluye humanos, ratones, ratas, cobayas, hámsteres, perros, gatos, vacas, caballos, cabras, ovejas, cerdos, monos, simios, gorilas, chimpancés, conejos, patos, gansos, pollos, anfibios, reptiles y otros animales.

Los siguientes ejemplos de aspectos específicos para llevar a cabo la presente invención se ofrecen meramente con fines ilustrativos, y no se pretende que limiten el alcance de la presente invención en modo alguno.

Ejemplos

Ejemplo 1: Fusión de hibridoma y cribado

Se llevó a cabo una fusión de hibridoma clásica. Los ratones recibieron su primera inmunización con Globo H-KLH (hemocianina de lapa de ojo de cerradura) conjugado con adyuvante de saponina y 3 recuerdos posteriores en los días 7, 14 y 24. Los ensayos de sangrado se llevaron a cabo en el día 10, 17, 21 y 24, y se evaluó el suero para comprobar los títulos de anticuerpos anti-Globo H. Se observó que cinco ratones producían títulos elevados de IgG anti-Globo H y de IgM anti-Globo H, y se usaron para la producción de hibridoma. Las células de mieloma fueron usadas para la fusión con los esplenocitos de ratón siguiendo el procedimiento de KOhler y Milstein (KOhler G. y Milstein C., 1975). Los sobrenadantes fueron cribados mediante ELISA de afinidad con 0,2 pg de Globo H-ceramida/pocillo. El mAb anti-Globo H Vk9 sirvió como control positivo. Se seleccionó la DO de clon de hibridoma sin dilución de sobrenadante > señal de fondo x 2. Los cinco primeros clones de hibridoma fueron 1E1, 2C2, 2F8, 3D7, 7A11.

Ejemplo 2: Análisis cinético de anticuerpos monoclonales de ratón

Los experimentos cinéticos de unión se llevaron a cabo a 25°C con Biacore T100 (GE Healthcare) mediante el método de cinética de ciclo sencillo (SCK) y el método de cinética de ciclo múltiple (MCK).

Se inmovilizó Globo H mediante acoplamiento de amina, según las instrucciones del fabricante. La Globo H-amina se diluyó hasta 15 mg/mL en tampón de inmovilización (acetato sódico 10 mM, pH 4,5) y se inmovilizó a 25°C usando un caudal de 5 pL/min.

Los anticuerpos anti-Globo H (mAb Globo H-Vk9, mAb Globo H-2C2 y mAb Globo H-3D7) fueron diluidos en tampón de elución hasta 200 nM (50 nM). Se mezclaron 200 pL de la disolución 200 nM (50 nM) con 200 pL de tampón de elución para obtener una disolución 100 nM (25 nM). La dilución continuó durante la siguiente serie de dilución: 200, 100, 50, 25 y 12,5 nM (concentración de analito: 50 nM, 25 nM, 12,5 nM, 6,25 nM, 3,125 nM). Las muestras de dilución fueron colocadas en Posiciones Rack y evaluadas mediante los métodos MCK y SCK. Las muestras para las series MCK y SCK fueron sometidas a un tiempo de disociación de 420 segundos. La superficie fue regenerada mediante una inyección de 40 segundos de una disolución de glicina 10 mM pH 2,0/1,5 (v/v=1). Los datos de SCK y MCK fueron ajustados con un modelo de unión 1:1 con el software de evaluación Biacore 2.0.

Los resultados fueron analizados para determinar la constante de disociación (K^d), que es la medida usada para describir la fortaleza de unión entre el anticuerpo y el antígeno, k^on(1/Ms), la velocidad de activación a la cual se forman los complejos anticuerpo-antígeno, k^off(1/s), la velocidad de desactivación a la que se disocian los complejos anticuerpo-antígeno, R^max, la máxima cantidad de respuesta de analito. La Tabla 2 muestra los datos de afinidad y cinéticos para los anticuerpos anti-Globo H a partir de los siguientes hibridomas: VK9, 2C2 y 3D7. El anticuerpo 3D7 y el anticuerpo 2C2 presentan una mayor afinidad de unión que el anticuerpo VK9.

Tabla 2. Datos cinéticos para los anticuerpos anti-Globo H

Ejemplo 3: Análisis de afinidad de anticuerpos anti-Globo H

Los siguientes anticuerpos anti-Globo H fueron evaluados para determinar la EC⁵⁰y el % de unión a célula: mAb Globo H-VK9, mAb Globo H-1E1, mAb Globo H-2C2, mAb Globo H-2F8, mAb Globo H-3D7, mAb Globo H-7A11.

Procedimientos:

ELISA de afinidad para EC⁵⁰: los pocillos fueron recubiertos con 0,2 pg de Globo H-ceramida por pocillo en hielo. T ras bloquear, se añadió a los pocillos el anticuerpo evaluado desde 6,2 ng/mL hasta 51200 ng/mL. T ras incubación durante 1 hora a temperatura ambiente, se eliminó el exceso de anticuerpo lavando 3 veces. Se añadió anti-IgG-HRP de ratón (1:533). Se cuantificó el desarrollo de color en un lector de placa a 490 nm. Se determinó la EC⁵⁰mediante el software Prism 5.0.

FACS para % de unión a célula con anticuerpo: se prepararon las líneas de células de cáncer para un total de 200.000 células en 50 pL de tampón FACS por tubo. Se añadió el anticuerpo indicado para alcanzar una concentración final de 1 pg/mL. Tras someter a vórtice de forma suave, los tubos fueron colocados en hielo y se incubaron durante aproximadamente 1 h. Tras lavar con tampón FACS, se añadió IgG-PE anti-ratón en tampón FACS hasta una concentración final de 4 pg/mL. T ras someter un vórtice de forma suave, los tubos se colocaron en hielo y se incubaron durante aproximadamente 30 minutos. Tras lavar con tampón FACS, las células de ensayo se resuspendieron en 200 pL de tampón FACS. Tras llevar a cabo la citometría de flujo, se analizó el porcentaje de unión a célula mediante el software WinMDI. En el gráfico de histograma, solo se usó la incubación de anticuerpo secundario para definir la región de fondo (M1) y de unión (M2). Se determinó el porcentaje de región de unión (M2) del anticuerpo indicado en base a fijar solo el anticuerpo secundario como fondo (M1).

La unión de anticuerpo a Globo H en la línea de células de cáncer de mama (MCF-7), la línea de células de cáncer de pulmón (LLC1) y la línea de células pancreáticas (HPAC) se evaluó usando análisis de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS).

Resultados: La Tabla 3 resume los datos de EC50 de mAb Globo H-2C2, mAb Globo H-2F8, mAb Globo H-3D7, mAb Globo H-7A11, y mAb Globo H-1E1. Los resultados muestran que el mAb Globo H-2C2, mAb Globo H-2F8, mAb Globo H-3D7, y mAb Globo H-7A11 son más efectivos para neutralizar el antígeno de Globo H que el mAb Globo H-VK9. El análisis de FACS muestra que mAb Globo H-2C2 y mAb Globo H-3D7 presentan una mayor afinidad de unión por el antígeno Globo H sobre la línea celular de cáncer de mama en comparación con el mAb Globo H VK9. Adicionalmente, mAb Globo H-2C2 y mAb Globo H-3D7 presentan una mayor afinidad de unión a antígeno de Globo H sobre la línea celular de cáncer pancreático (HPAC) que mAb Globo H VK9. Además, mAb Globo H-1 E1, mAb Globo H-2C2, mAb Globo H-3D7 y mAb H-7A11 presentan una mayor afinidad de unión a antígeno de Globo H sobre la línea celular de cáncer de pulmón (LLC1) que mAb Globo H VK9.

Tabla 3. EC⁵⁰y afinidad de unión de anticuerpos anti-Globo H

El valor EC⁵⁰es la concentración de anticuerpo que neutraliza el 50% de Globo H.

Ejemplo 4: Evaluación anti-tumoral in vivo de anticuerpos anti-Globo H

Se dividieron aleatoriamente ratones nude con un peso de 33 g con xenoinjerto de cáncer pancreático humano (HPAC) en los siguientes 6 grupos de estudio:

Los ratones fueron observados durante un periodo de 29 días en términos de volumen tumoral, y los resultados se registraron y se resumen en la Fig. 1.

Resultados: en el día 29, el volumen tumoral se había reducido en el siguiente orden: grupos VK9=3D7<2C2. El volumen tumoral del grupo 2C2 se vio reducido significativamente en comparación con el grupo de control (P<0,05).

Ejemplo 5: Evaluación anti-tumoral in vivo de anticuerpos anti-Globo H

Se dividieron de forma aleatoria ratones nude con un peso de 27 g con xenoinjerto de cáncer de mama humano (MCF7) en los siguientes 5 grupos de estudio:

Los ratones fueron observados durante un periodo de 18 días en términos de volumen tumoral, y los resultados se registraron y se resumen en la Fig. 2.

Resultados: tal como se muestra en la Fig. 2, el volumen tumoral se había reducido en los siguientes grupos en comparación con el control: 2C2 (4 mg/kg)>2C2 (0,4 mg/kg) después del Día 15. Desde el Día 8, el volumen tumoral de 2C2 (4 mg/kg) se vio reducido significativamente en comparación con el grupo de control (P<0,05).

Ejemplo 6: Reactividad cruzada de anticuerpos anti-Globo H

Se realizó una evaluación de la reactividad cruzada in vitro de anticuerpo anti-Globo H (mAb Globo H 2C2, 7A11 ,3D7, 2F8, 1E1 y Globo H Vk9).

Procedimiento:

Se añadieron cartuchos GlycoDx con 620 pL de tampón de lavado, 100 pL de anticuerpos anti-Globo H diluidos, 100 pL de tampón de bloqueo, 120 pL de tampón conjugado, 120 pL de tampón de sustrato. El cartucho se detectó con el analizador CCD, y los datos se volcaron a la hoja de cálculo Excel para su posterior análisis.

Resultados: tal como se muestra en la Fig. 3A, mAb Globo H 2C2 se une a Globo H y muestra reactividad cruzada con otros antígenos de carbohidrato, tal como los antígenos Lewis (sLex y sLea) y los antígenos S15-S27 (véase la Tabla 4 para la lista de antígenos de carbohidrato). mAb Globo H 7A11 se une a Globo H y muestra reactividad cruzada con otros antígenos de carbohidrato, tal como los antígenos Lewis (sLex y sLea) y los antígenos S15-S17, S19-S22 (véase la Fig. 3B). mAb Globo H 3D7 se une a Globo H y muestra reactividad cruzada con otros antígenos de carbohidrato, tal como los antígenos Lewis (sLex, sLea y Ley) y los antígenos S15-S22 (véase la Fig. 3C). mAb Globo H 2F8 se une a Globo H y muestra reactividad cruzada con otros antígenos de carbohidrato, tal como los antígenos Lewis (sLex y sLea) y los antígenos S15, S17 y S21 (véase la Fig. 3D). mAb Globo H 1E1 se une a Globo H y muestra reactividad cruzada con otros antígenos de carbohidrato, tal como los antígenos Lewis (sLex) y los antígenos S16, S17 y S20-S22 (véase la Fig. 3E). Por el contrario, mAb Globo H VK9 solo se une a Globo H y no muestra reactividad cruzada con otros antígenos de carbohidrato (véase la Fig. 3F).

Tabla 4. Lista de antígenos de carbohidrato en las Figuras 3A-3C.

Ejemplo 7: Afinidad de unión de anticuerpo anti-Globo H

Se realizó una evaluación in vitro de los siguientes anticuerpos anti-Globo H humanizados. La Tabla 5 enumera las secuencias de aminoácido de las regiones de cadena pesada y de las regiones de cadena ligera del anticuerpo humanizado procedente del hibridoma 2C2.

Tabla 5. Secuencias de aminoácido de anticuerpo humanizado 2C2

Los resultados de la afinidad de unión mediante el método ELISA se presentan en las Tablas 6-9.

Tabla 6: Afinidad de unión de un anticuerpo con una cadena ligera quimérica y una cadena pesada humanizada.

Estos resultados muestran que la alteración del aminoácido de la posición 9 (de G a A) en FW2 de la cadena pesada reduce la afinidad de unión del anticuerpo desde 0,4 a 0,17.

Tabla 7: Afinidad de unión de un anticuerpo con una cadena ligera humanizada y una cadena pesada humanizada.

Tabla 8: Afinidad de unión de un anticuerpo con una cadena ligera humanizada y una cadena pesada humanizada.

Tabla 9: Afinidad de unión de un anticuerpo con una cadena ligera humanizada y una cadena pesada humanizada.

Estos resultados muestran que la alteración del aminoácido de la posición 12 de FW2 de la cadena ligera (de P a L) reduce la afinidad de unión desde 0,32-0,53 a 0,07-0,08, y que la alteración del aminoácido de la posición 13 de FW2 de la cadena ligera (de W a L) reduce la afinidad de unión desde 0,32-0,53 a 0,08-0,12.

Listado de Secuencias: SEQ ID NO. 1 - 90

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende:

un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene entre un 85% y el 100% de identidad con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 3 y un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene entre un 85% y el 100% de identidad con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 4,

donde el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo, se une a Globo H, y puede reaccionar de forma cruzada con un antígeno de carbohidrato asociado a tumor seleccionado entre sLex, sTn, Tn, sLea, a-NeuAc-OCH2C6H4-p-NHCOOCH2, Fuca1 -2Galp1-4GalNAcp, NeuAca2-6Galb, Gala1-3Galb1-4GlaNAcb, (NeuAca2-8)3, 6Gal-HSOa-SiaLex, 6GluNAc-HSO3-SiaLex, N-glicano diantenario a2-6 sialilado o ácido polisiálico.

2. Un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, de la reivindicación 1, que comprende:

un dominio variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 3, y un dominio variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 4.

3. Un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende:

una primera región determinante de complementariedad de cadena pesada (HCDR1) que tiene la secuencia de aminoácidos que es idéntica entre un 90% y el 100% a la SEQ ID NO: 5,

una segunda región determinante de complementariedad de cadena pesada (HCDR2) que tiene la secuencia de aminoácidos que es idéntica entre un 90% y el 100% a la SEQ ID ⁿO: 6 o la SEQ ID ⁿO: 24,

una tercera región determinante de complementariedad de cadena pesada (HCDR3) que tiene la secuencia de aminoácidos que es idéntica entre un 90% y el 100% a la SEQ ID NO: 7 o la SEQ ID NO: 25,

una primera región determinante de complementariedad de cadena ligera (LCDR1) que tiene la secuencia de aminoácidos que es idéntica entre un 90% y el 100% a la SEQ ID NO: 8,

una segunda región determinante de complementariedad de cadena ligera (LCDR2) que tiene la secuencia de aminoácidos que es idéntica entre un 90% y el 100% a la SEQ ID NO: 9, y

una tercera región determinante de complementariedad de cadena ligera (LCDR3) que tiene la secuencia de aminoácidos que es idéntica entre un 90% y el 100% a la SEQ ID NO: 10,

donde el anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo, se une a Globo H y puede reaccionar de forma cruzada con un antígeno de carbohidrato asociado a tumor seleccionado entre sLex, sTn, Tn, sLea, a-NeuAc-OCH2C6H4-p-NHCOOCH2, Fuca1-2Galp1-4GalNAcp, NeuAca2-6Galb, Gala1-3Galb1-4GlaNAcb, (NeuAca2-8)3, 6Gal-HSO3-SiaLex, 6GluNAc-HSO3-SiaLex, N-glicano diantenario a2-6 sialilado o ácido polisiálico.

4. El anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, de la reivindicación 3, que además comprende una estructura que tiene una identidad entre el 80% y el 100% con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 11, donde la estructura está entre la HCDR1 y la HCDR2, y

una estructura que tiene una identidad entre el 80% y el 100% con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 12, donde la estructura está entre la LCDR1 y la LCDR2.

5. El anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, de la reivindicación 3, que comprende:

(a) una estructura entre dicha HCDR1 y dicha HCDR2 que tiene una identidad entre el 80% y el 100% con la SEQ ID NO: 11, donde la estructura contiene glicina en la posición 9, y

(b) una estructura entre dicha LCDR1 y dicha LCDR2 que tiene una identidad entre el 80% y el 100% con la SEQ ID NO: 12, donde la estructura contiene prolina en la posición 12 y/o triptófano en la posición 13

donde el anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, se une a Globo H.

6. El anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, de la reivindicación 3, donde

la HCDR1 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5;

la HCDR2 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6;

la HCDR3 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7;

la LCDR1 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8;

la LCDR2 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; y

la LCDR3 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.

7. El anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, de la reivindicación 3, donde

la HCDR1 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5;

la HCDR2 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24;

la HCDR3 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25;

la LCDR1 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8;

la LCDR2 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; y

la LCDR3 tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.

8. Un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende:

un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene entre un 85% y el 100% de identidad con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 21 y un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene entre un 85% y el 100% de identidad con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 22,

donde el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo, se une a Globo H, y puede reaccionar de forma cruzada con un antígeno de carbohidrato asociado a tumor seleccionado entre sLex, sTn, Tn, sLea, a-NeuAc-OCH2C6H4-p-NHCOOCH2, Fuca1 -2Galp1-4GalNAcp, NeuAca2-6Galb, Gala1-3Galb1-4GlaNAcb, (NeuAca2-8)a, 6Gal-HSO3-SiaLex, 6GluNAc-HSO3-SiaLex, N-glicano diantenario a2-6 sialilado o ácido polisiálico.

9. El anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, de la reivindicación 8, que comprende:

un dominio variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 21, y un dominio variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 22.

10. Un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, producido por el hibridoma designado como 2C2 depositado con el Número de Acceso de ATCC PTA-121138; 3D7 depositado con el Número de Acceso de ATCC PTA-121310, o 7A11 depositado con el Número de Acceso de ATCC PTA-121311,

donde el anticuerpo, o la porción de unión a antígeno del mismo, se une a un antígeno de carbohidrato.

11. Un anticuerpo humanizado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende:

(a) una región de cadena pesada, donde la región de cadena pesada comprende tres CDRs, HCDR1, HCDR2 y HCDR3, que tienen secuencias de aminoácidos idénticas entre un 90% y el 100% a las secuencias de aminoácidos establecidas en las SEQ ID NOs: 5, 6 y 7, respectivamente;

una estructura entre una secuencia líder y dicha HCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos idéntica entre un 80% y el 100% a la SEQ ID NO: 87; y

una estructura entre dicha HCDR2 y dicha HCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos idéntica entre un 80% y el 100% a la SEQ ID NO: 89, y

(b) una región de cadena ligera, donde la región de cadena ligera comprende tres CDRs, LCDR1, LCDR2 y LCDR3, que tiene las secuencias de aminoácido idénticas entre un 90% y el 100% a las secuencias de aminoácidos establecidas en las SEQ ID NO: 8, 9 y 10, respectivamente; y

una estructura entre una secuencia líder y dicha LCDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos idéntica entre un 80% y el 100% a la SEQ ID NO: 88, y

una estructura entre dicha LCDR2 y dicha LCDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos idéntica entre un 80% y el 100% a la SEQ ID NO: 90,

donde el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo, se une a Globo H, y puede reaccionar de forma cruzada con un antígeno de carbohidrato asociado a tumor seleccionado entre sLex, sTn, Tn, sLea, a-NeuAc-OCH2C6H4-p-NHCOOCH2, Fuca1 -2Galp1-4GalNAcp, NeuAca2-6Galb, Gala1-3Galb1-4GlaNAcb, (NeuAca2-8)a, 6Gal-HSOa-SiaLex, 6GluNAc-HSO3-SiaLex, N-glicano diantenario a2-6 sialilado o ácido polisiálico.

12. El anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo de las reivindicaciones 1-11, donde el anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo se selecciona entre: (a) una molécula completa de inmunoglobulina; (b) un scFv; (c) un fragmento Fab; (d) un F(ab’)2 o (e) un Fv ligado por disulfuro.

13. Una composición farmacéutica, que comprende:

un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12; y al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable.

14. El anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, para uso en el tratamiento de un cáncer en un humano.

15. El anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, para uso según la reivindicación 14, donde el cáncer es cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer pancreático, cáncer gástrico, cáncer de ovario, cáncer endometrial, cáncer de colon, cáncer de hígado, cáncer nasofaríngeo, cáncer de piel, cáncer oral, cáncer renal, cáncer de cerebro, cáncer cervical o cáncer de vejiga.

16. Un hibridoma designado como 2C2 depositado con el Número de Acceso de ATCC PTA-121138; 3D7 depositado con el Número de Acceso de ATCC PTA-121310, o 7A11 depositado con el Número de Acceso de ATCC PTA-121311.