ES2769918B2 - Formulation comprising extract of Crinodendron patagua and essential oils of Satureja montana for the prevention and treatment of diseases caused by Piscirickettsia salmonis - Google Patents
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Description
DESCRIPCIÓNDESCRIPTION
Formulación que comprende extracto de Crinodendron patagua v aceite esencial de Satureja montana para la prevención v tratamiento de enfermedades causadas por Piscirickettsia salmonis en individuos del género Salmo Formulation comprising extract of Crinodendron patagua and essential oil of Satureja montana for the prevention and treatment of diseases caused by Piscirickettsia salmonis in individuals of the genus Salmo
La presente invención se engloba en el sector de la acuicultura y se refiere a una formulación que comprende una mezcla de un extracto vegetal de la variedad de planta Crinodendron patagua y de aceite esencial de la variedad de planta Satureja montana, que se utiliza en la prevención y tratamiento de enfermedades causadas por la bacteria Piscirickettsia salmonis en individuos del género Salmo, y más preferentemente, en truchas y salmones.The present invention is included in the aquaculture sector and refers to a formulation that comprises a mixture of a plant extract of the Crinodendron patagua plant variety and essential oil of the Satureja montana plant variety, which is used in the prevention and treatment of diseases caused by the bacterium Piscirickettsia salmonis in individuals of the genus Salmo, and more preferably, in trout and salmon.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓNBACKGROUND OF THE INVENTION
La acuicultura sigue siendo el sector productor de alimentos para animales de más rápido crecimiento, ya que representa alrededor del 46% del suministro total de pescado para alimentos para satisfacer las necesidades de proteínas de la creciente población mundial. Ha habido un aumento general en todos los continentes en la participación de la acuicultura en la producción total de peces. Se ha informado que China contribuye con más del 60% de la producción acuícola mundial y también de que administra grandes cantidades de antibióticos para garantizar una productividad adecuada y el manejo de enfermedades causadas por microorganismos bacterianos.Aquaculture remains the fastest growing animal feed producing sector, accounting for around 46% of the total food fish supply to meet the protein needs of the world's growing population. There has been a general increase on all continents in the share of aquaculture in total fish production. China is reported to contribute more than 60% of world aquaculture production and also administer large amounts of antibiotics to ensure adequate productivity and management of diseases caused by bacterial microorganisms.
Los regímenes antimicrobianos se emplean de forma profiláctica y terapéutica para controlar estas enfermedades, así como para mejorar la promoción del crecimiento. En acuicultura, los antibióticos se administran generalmente en alimentos recubiertos en la superficie o en pellets o por otras vías, como la inmersión en agua o la inyección. El uso global de antimicrobianos está aumentando enormemente, se estima en 63.151 toneladas en 2010, y se prevé que aumente en un 67% en 2030. Los antibióticos no siempre se han utilizado de manera responsable en la acuicultura, y el control de su uso no ha proporcionado una garantía adecuada de la prevención de riesgos para los seres humanos. El uso responsable de los antibióticos requiere instrucciones claras por parte de los fabricantes de medicamentos, el manejo y la distribución adecuados por parte de los distribuidores y la supervisión veterinaria de la administración por parte de los acuicultores, respetando los períodos de retiro antes del sacrificio. El uso no regulado de antibióticos en la industria de la acuicultura podría plantear problemas de salud y seguridad alimentaria que en gran parte no se abordan en la mayoría de los países en desarrollo del mundo. La presencia de residuos de antibióticos en los productos de la acuicultura podría resultar en el desarrollo de resistencia bacteriana y toxicidad para los consumidores que puede conducir a la morbilidad y /o la muerte.Antimicrobial regimens are used prophylactically and therapeutically to control these diseases, as well as to enhance growth promotion. In aquaculture, antibiotics are generally administered in surface-coated feed or pellets or by other routes, such as immersion in water or injection. Global antimicrobial use is increasing dramatically, estimated at 63,151 tonnes in 2010, and projected to increase by 67% by 2030. Antibiotics have not always been used responsibly in aquaculture, and control of their use has not has provided an adequate guarantee of the prevention of risks to human beings. Responsible use of antibiotics requires clear instructions from drug manufacturers, proper handling and distribution by distributors, and veterinary supervision of management by farmers, respecting withdrawal periods before slaughter. The unregulated use of antibiotics in the food industry Aquaculture could pose health and food safety issues that are largely unaddressed in most developing countries in the world. The presence of antibiotic residues in aquaculture products could result in the development of bacterial resistance and toxicity to consumers that can lead to morbidity and / or death.
A modo de ejemplo, reseñar que en Chile (potencia mundial en el campo de la acuicultura) se utilizan dieciséis tipos de antibióticos, en comparación con tres en los Estados Unidos (EE. UU.) y cuatro en Noruega. Volviendo a Chile, los antibióticos se utilizaron principalmente en el cultivo de salmón atlántico en agua de mar, que representó el 80% del uso total de antibióticos utilizados para 2015, seguido del 11% para el salmón coho, el 9% para la trucha arco iris y 0% para salmón Chinook. El consumo de antibióticos en la industria del salmón en Chile ha aumentado un 56% desde 2005 hasta 2015, con un aumento de la producción en esos años del 23,48%. El consumo más alto se registró en 2014, con un uso total de 563,2 toneladas de antibióticos con 955.179 toneladas de salmónidos producidos. En 2016, hubo una disminución del 30,66% en el uso de antibióticos en comparación con 2015, utilizando un total de 382,5 toneladas de antibióticos para producir 727.812 toneladas de pescado. Los antibióticos más utilizados en la industria del salmón en Chile son el florfenicol y la oxitetraciclina. El uso de florfenicol ha aumentado de manera constante desde 2013 y representó el 87% y el 82,50% del total de antibióticos utilizados en 2015 y 2016, respectivamente.As an example, note that in Chile (a world power in the field of aquaculture) sixteen types of antibiotics are used, compared to three in the United States (USA) and four in Norway. Returning to Chile, antibiotics were used mainly in the farming of Atlantic salmon in seawater, which accounted for 80% of the total use of antibiotics used for 2015, followed by 11% for coho salmon, 9% for bow trout iris and 0% for Chinook salmon. The consumption of antibiotics in the salmon industry in Chile has increased by 56% from 2005 to 2015, with an increase in production in those years of 23.48%. The highest consumption was recorded in 2014, with a total use of 563.2 tons of antibiotics with 955,179 tons of salmonids produced. In 2016, there was a 30.66% decrease in antibiotic use compared to 2015, using a total of 382.5 tons of antibiotics to produce 727,812 tons of fish. The most widely used antibiotics in the Chilean salmon industry are florfenicol and oxytetracycline. The use of florfenicol has increased steadily since 2013 and accounted for 87% and 82.50% of the total antibiotics used in 2015 and 2016, respectively.
Adicionalmente al uso de antibióticos para el tratamiento de las patologías o enfermedades más comunes en acuicultura, existen otras alternativas comúnmente utilizadas, como la aplicación de vacunas monovalentes, polivalentes y autovacunas y la aplicación de inmunoestimulantes que se utilizan también como medida profiláctica buscando estimular mecanismos de inmunidad innata.In addition to the use of antibiotics for the treatment of the most common pathologies or diseases in aquaculture, there are other commonly used alternatives, such as the application of monovalent, polyvalent and auto-vaccines and the application of immunostimulants that are also used as a prophylactic measure seeking to stimulate mechanisms of innate immunity.
Especial relevancia presenta la bacteria patógena Pisciríckettsia salmonis, identificada a fines de los años 80, y que es la causante de la septicemia por Rickettsias salmónidas (SRS), también conocida como piscirickettsiosis o septicemia rickettsial salmonídea, que es una enfermedad mortal en los salmónidos. Contra esta enfermedad se han ensayado principalmente estrategias de uso de antibióticos y de vacunas, aunque, sin embargo, la naturaleza intracelular de esta bacteria, la existencia de diferentes cepas de P. salmonis y la baja memoria inmunológica en los salmónidos, hace que los tratamientos no sean lo suficientemente efectivos resultando en la muerte de millones de salmónidos de acuicultura todos los años. A modo de ejemplo, desde el aislamiento inicial, P. salmonis ha sido la principal causa de mortalidad de la industria en Chile. Durante 1995, más de 10 millones de salmones murieron durante las operaciones de cultivo marino. La mayoría de las pérdidas se atribuyeron a P. salmonis, con un impacto económico estimado en 49 millones de dólares.Of particular relevance is the pathogenic bacterium Pisciríckettsia salmonis, identified in the late 1980s, which is the cause of Rickettsial salmonid septicemia (SRS), also known as piscirickettsiosis or salmonid rickettsial septicemia, which is a fatal disease in salmonids. Strategies for the use of antibiotics and vaccines have been mainly tested against this disease, although, however, the intracellular nature of this bacterium, the existence of different strains of P. salmonis and the low immunological memory in salmonids, makes the treatments are not effective enough resulting in the death of millions of farmed salmonids every year. As an example, since the initial isolation, P. salmonis has been the main cause of mortality in the industry in Chile. During 1995, more than 10 million salmon died during marine farming operations. Most of the losses were attributed to P. salmonis, with an estimated economic impact of $ 49 million.
Por otra parte, el uso de productos naturales con propiedades terapéuticas es tan antiguo como la civilización humana y, durante mucho tiempo, las principales fuentes de drogas fueron los productos minerales, vegetales y animales. Alrededor del 25% de los medicamentos recetados en todo el mundo provienen de plantas, y actualmente se utilizan 121 de estos compuestos activos. De los 252 medicamentos considerados básicos y esenciales por la Organización Mundial de la Salud (OMS), el 11% son exclusivamente de origen vegetal y un número significativo son medicamentos sintéticos obtenidos de precursores naturales.On the other hand, the use of natural products with therapeutic properties is as old as human civilization and, for a long time, the main sources of drugs were mineral, plant and animal products. About 25% of prescription drugs worldwide come from plants, and 121 of these active compounds are currently used. Of the 252 medicines considered basic and essential by the World Health Organization (WHO), 11% are exclusively of plant origin and a significant number are synthetic medicines obtained from natural precursors.
En relación directa con el tratamiento de la SRS en salmónidos es posible encontrar algún documento de patente que protege el uso de principios activos de origen vegetal, ver por ejemplo:In direct relation to the treatment of SRS in salmonids, it is possible to find a patent document that protects the use of active principles of plant origin, see for example:
- WO2011/119047A1 que reivindica el uso de una composición que comprende un compuesto de propil-metil-fenol que preferentemente se selecciona entre timol y carvacrol, o una mezcla de ambos, para el uso en el tratamiento y/o en la prevención de la SRS y enfermedades causadas por P. salmonis, pero también para el uso en el tratamiento y/o en la prevención de enfermedades causadas por el virus de la anemia del salmón, incluyendo la anemia infecciosa del salmón; o- WO2011 / 119047A1 which claims the use of a composition comprising a propyl-methyl-phenol compound that is preferably selected from thymol and carvacrol, or a mixture of both, for use in the treatment and / or prevention of SRS and diseases caused by P. salmonis, but also for use in the treatment and / or prevention of diseases caused by the salmon anemia virus, including infectious salmon anemia; or
- CL20180000674 que divulga extractos antibacterianos naturales procedentes de plantas de Crinodendron patagua y Aristotelia chilensis o mezclas de las mismas, que se utilizan como formulación alimenticia para peces y que se usan en el tratamiento o prevención de infecciones bacterianas, en especial, infección por Piscirickettsia salmonis, responsable de la septicemia Rickettsial del salmón (SRS).- CL20180000674 that discloses natural antibacterial extracts from Crinodendron patagua and Aristotelia chilensis plants or mixtures thereof, which are used as a food formulation for fish and which are used in the treatment or prevention of bacterial infections, especially infection by Piscirickettsia salmonis , responsible for Rickettsial septicemia of salmon (SRS).
De acuerdo a los anteriores antecedentes, resulta necesario el desarrollo de alternativas biotecnológicas respetuosas con el medio ambiente para combatir de forma eficiente las infecciones bacterianas producidas por P. salmonis y específicamente el SRS, y reducir el uso de los antibióticos. According to the previous antecedents, it is necessary to develop environmentally friendly biotechnological alternatives to efficiently combat bacterial infections caused by P. salmonis and specifically SRS, and reduce the use of antibiotics.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓNDESCRIPTION OF THE INVENTION
La presente invención se basa en la observación de que una formulación que comprende una combinación de compuestos de origen vegetal, concretamente extracto de planta de biomasa de C. patagua y aceite esencial de biomasa de S. montana, en adelante formulación de la invención, se muestra efectiva a la hora de inhibir a la bacteria patógena Pisciríckettsia salmonis en ensayos in vitro (ver Ejemplo 5), y que por lo tanto podría ser de aplicación a poblaciones de trucha y salmón afectadas por SRS, estimándose que podrían llegar a reducir hasta en un 30% su mortalidad.The present invention is based on the observation that a formulation comprising a combination of compounds of plant origin, specifically C. patagua biomass plant extract and S. montana biomass essential oil, hereinafter formulation of the invention, is effective sample when inhibiting the pathogenic bacteria Pisciríckettsia salmonis in in vitro tests (see Example 5), and that therefore could be applied to populations of trout and salmon affected by SRS, estimating that they could reduce up to in 30% their mortality.
Adicionalmente, la ingesta de la formulación de la invención no debería afectar a las tasas de conversión de alimento, a diferencia de lo que sí sucede cuando se utilizan otros tratamientos convencionales como por ejemplo los antibióticos.Additionally, the intake of the formulation of the invention should not affect the feed conversion rates, unlike what happens when using other conventional treatments such as antibiotics.
En la presente invención por “tasa de conversión de alimento o TCA” se entiende la relación entre cantidad de alimento abastecido y el crecimiento del individuo, o en otras palabras, el peso producido por kg de alimento abastecido. El suministro de antibióticos, adicionalmente a su efecto letal sobre la bacteria patógena, afecta a la flora intestinal del sujeto, en este caso un pez, impactando el estado de salud general y por tanto, revirtiendo en tasas menores de conversión del alimento.In the present invention by "feed conversion rate or TCA" is meant the relationship between the amount of feed supplied and the growth of the individual, or in other words, the weight produced per kg of feed supplied. The supply of antibiotics, in addition to its lethal effect on the pathogenic bacteria, affects the intestinal flora of the subject, in this case a fish, impacting the general state of health and therefore, reverting to lower rates of feed conversion.
Preferentemente, la formulación de la invención utiliza materiales vegetales y procedimientos controlados que permiten la producción de biomasa de forma estandarizada y que asegura niveles de fitoquímicos estables en los extractos.Preferably, the formulation of the invention uses plant materials and controlled procedures that allow the production of biomass in a standardized way and that ensure stable levels of phytochemicals in the extracts.
En un primer aspecto, la invención se refiere a una formulación que comprende un extracto etanólico de biomasa de Crinodendron patagua y aceite esencial de biomasa de Satureja montana. In a first aspect, the invention refers to a formulation comprising an ethanolic extract of Crinodendron patagua biomass and essential oil of Satureja montana biomass.
En una realización particular, la formulación de la invención consiste en un extracto etanólico de biomasa de Crinodendron patagua y aceite esencial de biomasa de Satureja montana. In a particular embodiment, the formulation of the invention consists of an ethanolic extract of Crinodendron patagua biomass and essential oil of Satureja montana biomass.
En la presente invención por “extracto etanólico” se entiende el producto obtenido tras la exposición de biomasa con un solvente orgánico de base alcohólica, que preferentemente es etanol y que se caracteriza por comprender un importante contenido en compuestos fenólicos. El extracto etanólico de la invención puede presentarse en estado líquido pero también en estado sólido, por ejemplo utilizando técnicas de liofilización.In the present invention, by "ethanolic extract" is understood the product obtained after exposing biomass with an alcohol-based organic solvent, which is preferably ethanol and which is characterized by having a significant content of compounds phenolics. The ethanolic extract of the invention can be presented in a liquid state but also in a solid state, for example using lyophilization techniques.
En el ámbito de la invención podrían utilizarse otros solventes orgánicos de base alcohólica que tuviesen similar capacidad de extracción de compuestos fenólicos.Within the scope of the invention, other alcohol-based organic solvents that have a similar extraction capacity for phenolic compounds could be used.
El extracto etanólico que se utiliza en la invención, utiliza como base biomasa de la variedad Crinodendron patagua, o patagua o patahua que es una especie arbórea perenne de la familia de las elaeocarpaceas del género Crinodendron, y que es endémica de Chile.The ethanolic extract used in the invention uses biomass from the Crinodendron patagua variety, or patagua or patahua, which is a perennial arboreal species of the elaeocarp family of the Crinodendron genus, and which is endemic to Chile.
Preferentemente, el extracto etanólico de C. patagua se caracteriza por comprender compuestos fenólicos que se seleccionan entre quercetina, ácido gálico y ácido clorogénico.Preferably, the ethanolic extract of C. patagua is characterized by comprising phenolic compounds that are selected from quercetin, gallic acid and chlorogenic acid.
Por “aceite esencial” se entiende el producto obtenido tras el hidrodestilado de biomasa y que tiene un importante contenido en compuestos terpénicos.By "essential oil" is meant the product obtained after hydrodistillation of biomass and which has a significant content of terpenic compounds.
El aceite esencial que se utiliza en la invención procede de biomasa de la especie Satureja montana, que es una especie botánica perenne fanerógama en la familia de las Lamiáceas, nativa de regiones templadas y cálidas del sur de Europa.The essential oil used in the invention comes from biomass of the Satureja montana species, which is a perennial botanical species in the Lamiáceae family, native to temperate and warm regions of southern Europe.
Preferentemente, el aceite esencial de S. Montana se caracteriza por comprender compuestos terpénicos que se seleccionan entre carvacrol, p-cimeno, y-terpineno.Preferably, the essential oil of S. montana is characterized by comprising terpenic compounds that are selected from carvacrol, p-cymene, and-terpinene.
En una realización particular, la formulación de la invención se caracteriza por comprender ácido clorogénico y carvacrol.In a particular embodiment, the formulation of the invention is characterized by comprising chlorogenic acid and carvacrol.
En otra realización particular, la formulación de la invención comprende quercetina, ácido gálico, ácido clorogénico, carvacrol, p-cimeno y y-terpineno.In another particular embodiment, the formulation of the invention comprises quercetin, gallic acid, chlorogenic acid, carvacrol, p-cymene and y-terpinene.
Preferentemente, el extracto etanólico de biomasa de Crinodendron patagua y aceite esencial de biomasa Satureja montana están presentes en la formulación de la invención en una relación 1:1 (en peso o en volumen), aunque también pueden estar presentes en una relación desde 1:2 a 2:1 (en peso o en volumen) o incluso en una relación desde 1:3 a 3:1 (en peso o en volumen). Preferably, the ethanolic extract of Crinodendron patagua biomass and essential oil of biomass Satureja montana are present in the formulation of the invention in a 1: 1 ratio (by weight or by volume), although they may also be present in a ratio from 1: 2 to 2: 1 (by weight or by volume) or even in a ratio from 1: 3 to 3: 1 (by weight or by volume).
Tal y como se demuestra en los ejemplos, es la combinación del extracto de C. patagua y del aceite esencial de S. montana, y por lo tanto de los compuestos que comprenden, la que provocan un efecto sinérgico inesperado que supera el mero efecto aditivo de cada uno de los componentes por separado.As shown in the examples, it is the combination of the extract of C. patagua and the essential oil of S. montana , and therefore of the compounds they comprise, that cause an unexpected synergistic effect that exceeds the mere additive effect. of each of the components separately.
En un segundo aspecto, la invención se relaciona con un procedimiento para la producción de la formulación de la invención que comprende:In a second aspect, the invention relates to a process for the production of the formulation of the invention that comprises:
a) partiendo de biomasa de C. patagua obtener un extracto etanólico,a) starting from biomass of C. patagua obtain an ethanolic extract,
b) partiendo de biomasa de S. montana obtener un aceite esencial por hidrodestilado,b) starting from biomass of S. montana to obtain an essential oil by hydrodistillation,
c) combinar el extracto etanólico de biomasa de C. patagua con el aceite esencial de biomasa S. montana en una proporción que va desde 1:3 hasta 3:1 (en peso o en volumen).c) combine the ethanolic extract of C. patagua biomass with the essential oil of S. montana biomass in a ratio ranging from 1: 3 to 3: 1 (by weight or by volume).
En una realización particular, la biomasa de C. patagua consiste en brotes obtenidos por multiplicación in vitro partiendo de yemas de C. patagua. In a particular embodiment, the biomass of C. patagua consists of shoots obtained by in vitro multiplication starting from buds of C. patagua.
En otra realización particular, la biomasa de S. montana procede de la variedad Martín, con número de solicitud A201804150 ante el Registro de Protección comunitaria de Variedades Vegetales de la Community Plant Variety Office (CPVO) en fecha 19de diciembre de 2018.In another particular embodiment, the biomass of S. montana comes from the Martín variety, with application number A201804150 before the Community Plant Variety Office (CPVO) Registry of Community Protection of Plant Varieties on December 19, 2018.
En una realización particular, el extracto etanólico y el aceite esencial se combinan en una proporción de 1:1 en peso o en volumen.In a particular embodiment, the ethanolic extract and the essential oil are combined in a ratio of 1: 1 by weight or by volume.
En un tercer aspecto, la invención se refiere a una composición que comprende a la formulación de la invención, en adelante composición de la invención.In a third aspect, the invention relates to a composition comprising the formulation of the invention, hereinafter the composition of the invention.
En un cuarto aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica veterinaria que comprende a la formulación de la invención.In a fourth aspect, the invention relates to a veterinary pharmaceutical composition comprising the formulation of the invention.
La composición farmacéutica veterinaria es toda sustancia o combinación de sustancias que se presente como poseedora de propiedades curativas o preventivas con respecto a las enfermedades animales o que pueda administrarse a un individuo con el fin de restablecer, corregir o modificar sus funciones fisiológicas ejerciendo una acción farmacológica, inmunológica o metabólica, o de establecer un diagnóstico veterinario. También se considerarán composiciones farmacéuticas veterinarias las “premezclas para piensos medicamentosos” elaboradas para ser incorporadas a un pienso.Veterinary pharmaceutical composition is any substance or combination of substances that is presented as having curative or preventive properties with respect to animal diseases or that can be administered to an individual in order to restore, correct or modify their physiological functions by exerting a pharmacological action. , immunological or metabolic, or to establish a veterinary diagnosis. I also know Veterinary pharmaceutical compositions will be considered as “medicated feed premixes” prepared for incorporation into feed.
En una realización particular, la composición farmacéutica veterinaria además comprende, al menos, un vehículo y/o un excipiente farmacéuticamente aceptable.In a particular embodiment, the veterinary pharmaceutical composition also comprises at least one pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient.
El “vehículo” o portador, es preferiblemente una sustancia inerte. La función del vehículo es facilitar la incorporación de otros compuestos, permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma a la composición farmacéutica. Por tanto, el vehículo es una sustancia que se emplea en el medicamento para diluir cualquiera de los componentes de la composición farmacéutica veterinaria de la presente invención hasta un volumen o peso determinado; o bien que aún sin diluir dichos componentes es capaz de permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma al medicamento. Cuando la forma de presentación es líquida, el vehículo farmacéuticamente aceptable es el diluyente.The "vehicle" or carrier is preferably an inert substance. The function of the vehicle is to facilitate the incorporation of other compounds, to allow a better dosage and administration or to give consistency and shape to the pharmaceutical composition. Therefore, the vehicle is a substance that is used in the medicine to dilute any of the components of the veterinary pharmaceutical composition of the present invention to a certain volume or weight; or that even without diluting said components it is capable of allowing a better dosage and administration or giving consistency and shape to the medicine. When the presentation form is liquid, the pharmaceutically acceptable carrier is the diluent.
El término “excipiente” hace referencia a una sustancia que ayuda a la absorción de cualquiera de los componentes de la composición de la presente invención, estabiliza dichos componentes o ayuda a la preparación de la composición farmacéutica veterinaria en el sentido de darle consistencia. Así pues, los excipientes podrían tener la función de mantener los componentes unidos como por ejemplo almidones, azúcares o celulosas, función de colorante, función de protección del medicamento como por ejemplo para aislarlo del aire y/o la humedad, función de relleno de una pastilla, cápsula, pellet, gránulo o cualquier otra forma de presentación como, por ejemplo, el fosfato de calcio dibásico, función desintegradora para facilitar la disolución de los componentes y su absorción en el intestino, sin excluir otro tipo de excipientes no mencionados en este párrafo. Por tanto, el término “excipiente” se define como aquella materia que, incluida en las formas galénicas, se añade a los principios activos o a sus asociaciones para posibilitar su preparación y estabilidad, modificar sus propiedades organolépticas o determinar las propiedades físico-químicas de la composición farmacéutica y su biodisponibilidad. El excipiente “farmacéuticamente aceptable” debe permitir la actividad de los compuestos de la composición farmacéutica, es decir, que sea compatible con dichos componentes.The term "excipient" refers to a substance that helps the absorption of any of the components of the composition of the present invention, stabilizes said components or helps the preparation of the veterinary pharmaceutical composition in the sense of giving it consistency. Thus, excipients could have the function of keeping the components together such as starches, sugars or celluloses, a colorant function, a protective function of the drug such as for example to isolate it from air and / or humidity, a filling function of a tablet, capsule, pellet, granule or any other form of presentation such as, for example, dibasic calcium phosphate, disintegrating function to facilitate the dissolution of the components and their absorption in the intestine, without excluding other types of excipients not mentioned in this paragraph. Therefore, the term "excipient" is defined as that material that, included in the galenic forms, is added to the active principles or to their associations to enable their preparation and stability, modify their organoleptic properties or determine the physicochemical properties of the pharmaceutical composition and its bioavailability. The "pharmaceutically acceptable" excipient must allow the activity of the compounds of the pharmaceutical composition, that is, it must be compatible with said components.
Además, como entiende el experto en la materia, el excipiente y el vehículo deben ser farmacológicamente aceptables, es decir, que el excipiente y el vehículo estén permitidos y evaluados de modo que no cause daño a los organismos a los que se administra. Furthermore, as understood by the person skilled in the art, the excipient and the vehicle must be pharmacologically acceptable, that is, the excipient and the vehicle are allowed and evaluated in such a way that it does not cause harm to the organisms to which it is administered.
La composición farmacéutica veterinaria se puede presentar bajo cualquier forma de administración adecuada y en una cantidad terapéuticamente efectiva, preferiblemente en una forma adaptada a la administración oral. La composición farmacéutica veterinaria de la invención se puede formular en formas sólidas, semisólidas, líquidas o gaseosas, tales como comprimido, cápsula, polvo, pellet, gránulo, solución, inyección, gel o microesfera. La forma adaptada a la administración oral se selecciona de la lista que comprende, pero sin limitarse, a gotas, jarabe, tisana, elixir, suspensión, emulsión, suspensión extemporánea, vial bebible, comprimido, cápsula, polvo, granulado, sello, píldora, tableta, pastilla, trocisco o liofilizado.The veterinary pharmaceutical composition can be presented in any suitable administration form and in a therapeutically effective amount, preferably in a form adapted for oral administration. The veterinary pharmaceutical composition of the invention can be formulated in solid, semisolid, liquid or gaseous forms, such as tablet, capsule, powder, pellet, granule, solution, injection, gel or microsphere. The form adapted for oral administration is selected from the list that includes, but is not limited to, drops, syrup, herbal tea, elixir, suspension, emulsion, extemporaneous suspension, drinkable vial, tablet, capsule, powder, granulate, seal, pill, tablet, lozenge, troche or lyophilisate.
En la presente invención, la expresión “cantidad terapéuticamente efectiva” se refiere a aquella cantidad del componente de la composición veterinaria farmacéutica que cuando se administra a un pez es suficiente para producir la prevención y/o el tratamiento, tal como se define más adelante, de una enfermedad o condición patológica de interés en pez. La cantidad terapéuticamente efectiva variará, por ejemplo, según la estabilidad metabólica y la duración de la acción de la formulación de la invención; la edad, el peso corporal, el estado general de salud, el sexo y la dieta del pez; el modo y el tiempo de administración; la velocidad de excreción, la combinación de fármacos; la gravedad del trastorno o la condición patológica particulares; y el sujeto que se somete a terapia.In the present invention, the term "therapeutically effective amount" refers to that amount of the component of the veterinary pharmaceutical composition that when administered to a fish is sufficient to produce prevention and / or treatment, as defined below, of a disease or pathological condition of interest in fish. The therapeutically effective amount will vary, for example, according to the metabolic stability and duration of action of the formulation of the invention; the age, body weight, general health, sex and diet of the fish; the mode and time of administration; the rate of excretion, the combination of drugs; the severity of the particular disorder or pathological condition; and the subject undergoing therapy.
Por “pienso medicamentoso” se entienda una combinación de la formulación de la invención, que puede comprender excipientes y/o vehículos, y un pienso convencional para su administración a un pez.By "medicated feed" is understood a combination of the formulation of the invention, which may comprise excipients and / or vehicles, and a conventional feed for administration to fish.
El “pienso convencional para la administración a un pez” de forma general estará presente en forma de pellets o gránulos y puede comprender, a título enunciativo, carne de pescado, aceite de pescado, proteínas vegetales, monosacáridos o polisacárido, como por ejemplo mananos, glucanos o alginatos y otros excipientes como pigmentos, vitaminas, minerales, aglutinadores y similares.The "conventional feed for administration to fish" will generally be present in the form of pellets or granules and may comprise, by way of example, fish meat, fish oil, vegetable proteins, monosaccharides or polysaccharides, such as mannan, glucans or alginates and other excipients such as pigments, vitamins, minerals, binders and the like.
En una realización particular, la composición farmacéutica veterinaria se presenta en una forma adaptada a la administración oral. La forma adaptada a la administración oral se refiere a un estado físico que pueda permitir su administración oral. Dicha forma adaptada a la administración oral se selecciona de la lista que comprende, pero sin limitarse, gotas, jarabe, tisana, elixir, suspensión, suspensión extemporánea, vial bebible, comprimido, cápsula, granulado, pellet, sello, píldora, tableta, pastilla, trocisco o liofilizado. In a particular embodiment, the veterinary pharmaceutical composition is presented in a form adapted for oral administration. The form adapted for oral administration refers to a physical state that can allow its oral administration. Said form adapted to oral administration is selected from the list that includes, but is not limited to, drops, syrup, herbal tea, elixir, suspension, extemporaneous suspension, drinkable vial, tablet, capsule, granulate, pellet, seal, pill, tablet, lozenge. , troches or lyophilized.
En otra realización particular, la composición farmacéutica veterinaria se presenta en una forma adaptada a la aplicación mediante un baño medicinal, en el cual el pez es situado en un contenedor que la comprende, y mantenido durante un período de tiempo (desde minutos a varias horas).In another particular embodiment, the veterinary pharmaceutical composition is presented in a form adapted to the application by means of a medicinal bath, in which the fish is placed in a container that comprises it, and kept for a period of time (from minutes to several hours ).
En otra realización particular, la composición farmacéutica veterinaria se presenta en una forma adaptada a la aplicación por vía parenteral, por ejemplo por inyección. Las formulaciones inyectables pueden ser también en forma de polvo, pellet o gránulos que pueden ser reconstituidos en un solvente adecuado antes de su uso, o también como soluciones preparadas para su uso.In another particular embodiment, the veterinary pharmaceutical composition is presented in a form adapted for parenteral application, for example by injection. Injectable formulations can also be in powder, pellet or granule form that can be reconstituted in a suitable solvent before use, or also as ready-to-use solutions.
En otra realización particular, la composición farmacéutica veterinaria se presenta en una forma adaptada a su combinación con el pienso convencional para peces.In another particular embodiment, the veterinary pharmaceutical composition is presented in a form adapted to its combination with conventional fish feed.
En una realización particular el pienso medicamentoso está especialmente adaptado para administración oral en forma líquida, de gránulo o pellet, de forma que el pienso convencional sea capaz de absorber o ser combinado con la formulación de la invención.In a particular embodiment, the medicated feed is specially adapted for oral administration in liquid, granule or pellet form, so that the conventional feed is capable of absorbing or being combined with the formulation of the invention.
La formulación de la invención se puede incorporar al pienso antes de la peletización. Alternativamente los pellets o gránulos pueden ser revestidos con la formulación de la invención. Por ejemplo, pellets o gránulos comerciales podrían ser recubiertos con la formulación de la invención y uno o más excipientes como almidón, fumed silica (Aerosil®), celulosa microcristalina, lactosa o similares.The formulation of the invention can be incorporated into the feed before pelleting. Alternatively the pellets or granules can be coated with the formulation of the invention. For example, commercial pellets or granules could be coated with the formulation of the invention and one or more excipients such as starch, fumed silica (Aerosil®), microcrystalline cellulose, lactose or the like.
Sin embargo, la formulación de la invención se puede encapsular utilizando por ejemplo metodologías de secado por liofilización utilizando materiales encapsulantes.However, the formulation of the invention can be encapsulated using for example lyophilization drying methodologies using encapsulating materials.
En una realización particular, la formulación de la invención es encapsulada, utilizando materiales que se seleccionan entre goma arábiga (GA) o maltodextrina (MD) que posteriormente pueden ser liofilizadas y dotadas de las dimensiones más convenientes.In a particular embodiment, the formulation of the invention is encapsulated, using materials that are selected from gum arabic (GA) or maltodextrin (MD) that can subsequently be lyophilized and provided with the most convenient dimensions.
Adicionalmente, el pienso medicamentoso o el material encapsulado pueden incluir un agente preservante.Additionally, the medicated feed or encapsulated material may include a preservative agent.
La cantidad de formulación en el pienso medicamentoso, preferentemente no superará el 20% en peso del peso total del producto. The amount of formulation in the medicated feed, preferably will not exceed 20% by weight of the total weight of the product.
Alternativamente a la composición farmacéutica veterinaria, la composición de la invención también puede ser una composición nutritiva.Alternatively to the veterinary pharmaceutical composition, the composition of the invention can also be a nutritional composition.
El término “composición nutritiva” de la presente invención se refiere a aquel alimento que, con independencia de aportar nutrientes al sujeto que lo toma, afecta beneficiosamente a una o varias funciones del organismo, de manera que proporciona un mejor estado de salud y bienestar. Como consecuencia, dicha composición nutritiva puede ser destinada a la prevención y/o tratamiento de una enfermedad o del factor causante de una enfermedad. Por tanto, el término “composición nutritiva” de la presente invención se puede emplear como sinónimo de alimento funcional o alimento para fines nutricionales específicos o alimento medicinal.The term "nutritional composition" of the present invention refers to that food that, regardless of providing nutrients to the subject who takes it, beneficially affects one or more functions of the body, in such a way that it provides a better state of health and well-being. As a consequence, said nutritional composition can be used for the prevention and / or treatment of a disease or the factor causing a disease. Therefore, the term "nutritional composition" of the present invention can be used synonymously with functional food or food for specific nutritional purposes or medicinal food.
En un quinto aspecto, la invención se refiere a una composición nutritiva que comprende a la formulación de la invención.In a fifth aspect, the invention relates to a nutritional composition comprising the formulation of the invention.
En una realización particular, la composición nutritiva es un alimento, un suplemento o un nutracéutico.In a particular embodiment, the nutritional composition is a food, a supplement or a nutraceutical.
El término “suplemento”, sinónimo de cualquiera de los términos “suplemento dietético”, “suplemento nutricional”; o “suplemento alimenticio” es un “ingrediente alimenticio” destinado a complementar la alimentación. Algunos ejemplos de suplementos dietéticos son, pero sin limitarse, las vitaminas, los minerales, los productos botánicos, aminoácidos y componentes de los alimentos como las enzimas y los extractos glandulares. No se presentan como sustitutos de un alimento convencional ni como componente único de una comida o de la dieta alimenticia sino como complemento de la dieta.The term "supplement", synonymous with any of the terms "dietary supplement", "nutritional supplement"; or "food supplement" is a "food ingredient" intended to supplement the diet. Some examples of dietary supplements are, but are not limited to, vitamins, minerals, botanicals, amino acids, and food components such as enzymes and glandular extracts. They are not presented as substitutes for a conventional food or as a single component of a meal or diet, but as a supplement to the diet.
El término “nutracéutico” tal como se emplea en la presente invención se refiere a sustancias aisladas de un alimento y utilizadas de forma dosificada que tienen un efecto beneficioso sobre la salud.The term "nutraceutical" as used in the present invention refers to substances isolated from a food and used in a dosage form that have a beneficial effect on health.
En una realización particular, el alimento es el “pienso convencional para la administración a un pez” tal y como se define más arriba.In a particular embodiment, the food is the "conventional feed for administration to a fish" as defined above.
En un sexto aspecto, la invención se refiere a la composición farmacéutica veterinaria para su uso como medicamento veterinario. In a sixth aspect, the invention relates to the veterinary pharmaceutical composition for use as a veterinary medicine.
En un séptimo aspecto, la invención se refiere a la composición farmacéutica veterinaria para su uso como medicamento veterinario en el tratamiento y/o prevención de la septicemia rickettsial salmonídea (SRS) en individuos del género Salmo. In a seventh aspect, the invention relates to the veterinary pharmaceutical composition for use as a veterinary drug in the treatment and / or prevention of salmonid rickettsial septicemia (SRS) in individuals of the genus Salmo.
En el ámbito de esta invención también se incluye el uso del medicamento veterinario como coadyuvante para potenciar el uso de otro medicamento.The use of the veterinary drug as an adjuvant to enhance the use of another drug is also included within the scope of this invention.
En un octavo aspecto, la invención se refiere a la composición farmacéutica veterinaria para su uso como coadyuvante con otros medicamentos en el tratamiento y/o prevención de la septicemia rickettsial salmonídea (SRS) en individuos del género Salmo. In an eighth aspect, the invention relates to the veterinary pharmaceutical composition for use as an adjuvant with other drugs in the treatment and / or prevention of salmonid rickettsial septicemia (SRS) in individuals of the genus Salmo.
En una realización particular, la formulación de la invención se usa como coadyuvante de un antibiótico que se selecciona de entre florfenicol, oxitectraciclina, flumequina, ácido oxolínico, eritromicina, amoxicilina.In a particular embodiment, the formulation of the invention is used as an adjuvant of an antibiotic that is selected from among florfenicol, oxytectracycline, flumequine, oxolinic acid, erythromycin, amoxicillin.
En la presente invención, el término “tratamiento” se refiere a combatir los efectos causados como consecuencia de una enfermedad o condición patológica de interés en un sujeto, preferiblemente un pez, que incluye:In the present invention, the term "treatment" refers to combating the effects caused as a consequence of a disease or pathological condition of interest in a subject, preferably a fish, including:
(i) inhibir la enfermedad o condición patológica, es decir, detener su desarrollo;(i) inhibiting the disease or pathological condition, that is, arresting its development;
(ii) aliviar la enfermedad o la condición patológica, es decir, causar la regresión de la enfermedad o la condición patológica o su sintomatología;(ii) alleviating the disease or pathological condition, that is, causing regression of the disease or pathological condition or its symptoms;
(iii) estabilizar la enfermedad o la condición patológica.(iii) stabilize the disease or pathological condition.
En la presente invención, el término “prevención” se refiere a evitar la aparición de la enfermedad, es decir, evitar que se produzca la enfermedad o la condición patológica en un sujeto, preferiblemente un pez.In the present invention, the term "prevention" refers to preventing the occurrence of the disease, that is, preventing the disease or pathological condition from occurring in a subject, preferably a fish.
En el ámbito de la presente invención, los individuos del género Salmo se seleccionan de entre trucha y salmón.Within the scope of the present invention, individuals of the genus Salmo are selected from trout and salmon.
En la presente invención, por Pisciríckettsia salmonis se entiende el agente bacteriano causante de la piscirickettsiosis o síndrome rickettsial salmonídeo o septicemia rickettsial salmonídea (SRS) y que es uno de los principales patógenos, responsable de más del 50% de mortalidad en mar. In the present invention, by Pisciríckettsia salmonis is understood the bacterial agent that causes piscirickettsiosis or salmonid rickettsial syndrome or salmonid rickettsial septicemia (SRS) and which is one of the main pathogens, responsible for more than 50% of mortality at sea.
La formulación de la invención y la composición de la invención pueden ser usadas de forma efectiva en cualquiera de los estadios de desarrollo de los individuos del género Salmo. The formulation of the invention and the composition of the invention can be used effectively in any of the developmental stages of individuals of the genus Salmo.
En un noveno aspecto, la invención se relaciona con un tratamiento desinfectante para eliminar la presencia de la bacteria Pisciríckettsia salmonis en superficies o dispositivos utilizados normalmente en instalaciones de acuicultura y que comprende aplicar la formulación de la invención en una dosis efectiva para eliminar a la bacteria.In a ninth aspect, the invention relates to a disinfectant treatment to eliminate the presence of the Pisciríckettsia salmonis bacterium on surfaces or devices normally used in aquaculture facilities and which comprises applying the formulation of the invention in an effective dose to eliminate the bacterium. .
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURASBRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
Figura 1. Compuestos fenólicos mayoritarios presentes en el extracto de C. patagua. Figura 2. Compuestos terpénicos mayoritarios presentes en el aceite de S. montana. Figura 3. Microcápsulas de la mezcla extracto etanólico de C. patagua : aceite esencial de S. montana (1:1 en peso) en goma arábiga.Figure 1. Major phenolic compounds present in the extract of C. patagua. Figure 2. Major terpenic compounds present in S. montana oil. Figure 3. Microcapsules of the mixture ethanolic extract of C. patagua : essential oil of S. montana (1: 1 by weight) in gum arabic.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.Throughout the description and claims the word "comprise" and its variants are not intended to exclude other technical characteristics, additives, components or steps. For those skilled in the art, other objects, advantages and characteristics of the invention will emerge in part from the description and in part from the practice of the invention. The following examples and figures are provided by way of illustration, and are not intended to be limiting of the present invention.
EJEMPLOSEXAMPLES
Ejemplo 1: Obtención del material vegetalExample 1: Obtaining plant material
Las plantas de C. patagua (patagua) fueron cultivadas in vitro partiendo de yemas de plantas adultas en un medio Murashige y Skoog (MS) suplementado con las siguientes vitaminas y hormonas: biotina (1 mg/L), cinetina (0,2 mg/L), tiamina (2 mg/L), ácido naftalenacético (0,2 mg/L) y benziladenina (0,3 mg/L). Se almacenaron por 30 días a 23°C ± 2°C, con un fotoperiodo de 16 horas luz y 8 horas oscuridad. Los brotes generados fueron retirados del medio de cultivo para ser secados a 37°C ± 2°C, hasta peso constante. Posteriormente, el tejido de los brotes fue molido y mantenido en desecador hasta su utilización. The C. patagua (patagua) plants were cultivated in vitro starting from the buds of adult plants in a Murashige and Skoog (MS) medium supplemented with the following vitamins and hormones: biotin (1 mg / L), kinetin (0.2 mg / L), thiamine (2 mg / L), naphthaleneacetic acid (0.2 mg / L) and benzyladenine (0.3 mg / L). They were stored for 30 days at 23 ° C ± 2 ° C, with a photoperiod of 16 hours light and 8 hours dark. The sprouts generated were removed from the culture medium to be dried at 37 ° C ± 2 ° C, until constant weight. Subsequently, the shoot tissue was ground and kept in a desiccator until its use.
Para S. montana se usaron partes aéreas de una variedad domesticada, concretamente de la variedad Martin. El material vegetal se secó a 37°C ± 2°C hasta peso constante. Se trata de una variedad domesticada que se aclimató en 2 áreas geográficas diferentes en España: en la provincia de Almería (sureste) y en Ejea de los Caballeros (Zaragoza, noreste) y sobre la que se ha solicitado protección como obtención vegetal con número de solicitud A201804150 ante el Registro de Protección comunitaria de Variedades Vegetales de la Community Plant Variety Office (CPVO) en fecha 19de diciembre de 2018.For S. montana aerial parts of a domesticated variety, specifically the Martin variety, were used. The plant material was dried at 37 ° C ± 2 ° C until constant weight. It is a domesticated variety that has become acclimated in 2 different geographical areas in Spain: in the province of Almería (southeast) and in Ejea de los Caballeros (Zaragoza, northeast) and on which protection has been requested as a plant variety with number of application A201804150 before the Community Plant Variety Office (CPVO) Registry of Community Protection of Plant Varieties on December 19, 2018.
Ejemplo 2: Obtención del extracto etanólico de C. patagua y del aceite esencial de S. montana Example 2: Obtaining the ethanolic extract of C. patagua and the essential oil of S. montana
Para la preparación de los extractos de C. patagua se mezcló 1 gramo del material vegetal desecado tal y como se indica en el Ejemplo 1, con 100 mL de etanol al 85% V/V. La solución fue sonicada a una frecuencia de 50 Hz, a una temperatura de 25 ± 2°C por dos horas (Contreras, R. A., Kóhler, H., Pizarro, M. y Zúñiga, G. E. (2015). In vitro cultivars of Vaccinium corymbosum L. (Ericaceae) are a source of antioxidant phenolics. Antioxidants, 4, 281-292). La solución fue esterilizada a través de filtración, con un filtro con tamaño de poro de 0,22 pm y los extractos fueron almacenados a 4°C hasta su utilización.For the preparation of the C. patagua extracts, 1 gram of the dried plant material was mixed as indicated in Example 1, with 100 mL of ethanol at 85% V / V. The solution was sonicated at a frequency of 50 Hz, at a temperature of 25 ± 2 ° C for two hours (Contreras, RA, Kóhler, H., Pizarro, M. and Zúñiga, GE (2015). In vitro cultivars of Vaccinium corymbosum L. (Ericaceae) are a source of antioxidant phenolics. Antioxidants, 4, 281-292). The solution was sterilized through filtration, with a filter with a pore size of 0.22 pm and the extracts were stored at 4 ° C until their use.
Las plantas secas de S. montana, se extrajeron mediante hidrodestilación a escala de laboratorio (Clevenger, EO) para obtener aceites esenciales de todas las muestras de acuerdo con el método recomendado por la European Pharmacopoeia (6th edition, 2008), obteniéndose, por decantación, el aceite esencial o utilizando una planta a gran escala (semi-industrial, PEO) extracción por arrastre de vapor en la planta piloto de destilado de acero inoxidable equipada con una cámara de destilado de 100 Kg y un vaso de 500 L, utilizando un rango de presión de entre 0.5-1.0 bar, y obteniéndose, por decantación, el aceite esencial (PEO).The dried S. montana plants were extracted by means of hydrodistillation on a laboratory scale (Clevenger, EO) to obtain essential oils from all the samples according to the method recommended by the European Pharmacopoeia ( 6th edition, 2008), obtaining, by decantation , essential oil or using a large-scale plant (semi-industrial, PEO) extraction by steam stripping in the pilot stainless steel distillate plant equipped with a 100 Kg distillate chamber and a 500 L beaker, using a pressure range between 0.5-1.0 bar, and obtaining, by decantation, the essential oil (PEO).
Ejemplo 3. Análisis de compuestos en el extracto etanólico de C. patagua y en el aceite esencial de S. montana. Example 3. Analysis of compounds in the ethanolic extract of C. patagua and in the essential oil of S. montana.
Con el fin de determinar el perfil de compuestos fenólicos presentes en el extracto etanólico, se empleó un equipo LC-MS (Agilent LC-MS/MS 6410, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Los análisis se realizaron inyectando un volumen de 20 pL de extracto, mediante una válvula Reodyne y se utilizó un flujo de elusión de 0,3 mL/min, en gradiente de acetonitrilo y ácido fórmico 0,1% V/V, con una presión de 75 bar al inicio del programa a temperatura ambiente, como fase estacionaria se utilizó una columna empacada de rápida resolución Xorbax RP-C18 (150x4,6mm, 5 pm, XDB-C18, Agilent Technlogies, Santa Clara, USA) con un poro de 1,8 pm y una longitud de 5 cm. El detector de masas de tricuadrupolo se empleó con las siguientes condiciones: ionización por electrospray (ESI) en modo negativo a una temperatura del N2 de 330 0C, el flujo de N2 de 9 L/min, presión de nebulización de 45 psi, el voltaje del capilar de 4000 V, en modo de operación de barrido, ión negativo y el rango de masas entre 50 y 1000.In order to determine the profile of phenolic compounds present in the ethanolic extract, an LC-MS equipment (Agilent LC-MS / MS 6410, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) was used. The analyzes were carried out by injecting a volume of 20 pL of extract, through a Reodyne valve and an elution flow of 0.3 mL / min was used, in a gradient of acetonitrile and 0.1% V / V formic acid, with a pressure from 75 bar at the start of the program to room temperature, a Xorbax RP-C18 fast resolution packed column (150x4.6mm, 5 pm, XDB-C18, Agilent Technlogies, Santa Clara, USA) with a pore of 1.8 pm and a length of 5 cm. The tri-quadrupole mass detector was used under the following conditions: electrospray ionization (ESI) in negative mode at a N2 temperature of 330 ° C, the N2 flow of 9 L / min, a nebulization pressure of 45 psi, the voltage of the 4000 V capillary, in scan operation mode, negative ion and the mass range between 50 and 1000.
Los compuestos mayoritarios presentes en el extracto de C. patagua fueron; quercetina (28%), ácido gálico (8%) y ácido clorogénico (5,5%) (Fig.1).The major compounds present in the extract of C. patagua were; quercetin (28%), gallic acid (8%) and chlorogenic acid (5.5%) (Fig. 1).
Por su parte, el aceite esencial de S. montana se analizó mediante cromatografía de gases en un equipo Agilent 7890 A interconectado con un espectrómetro de masas Agilent 5975C con ionización de impacto electrónico (70 eV). Se utilizó una columna capilar de sílice HP-5MS (30 m 250 mm id), recubierta con fenilmetil silox al 5% (espesor de fase de 0,25 mm). La temperatura del horno se programó de la siguiente manera: 60 °C durante 8 min, aumentando a 180 °C a 3C / min, 180-250 °C a 20C / min, luego a 250 °C durante 10 min. Las temperaturas del inyector y del detector se mantuvieron a 250 °C y 280 °C, respectivamente. Las muestras se inyectaron en modo dividido con una proporción de división de 1:55. Se inyectaron 0,2 mi de cada muestra. El gas portador fue helio con un caudal de 1 mi / min y una temperatura de interfaz de 250 °C. El rango de masa analizado fue entre 40-450 m/z. Los componentes de los índices de retención lineal de los extractos volátiles calculados a partir de sus tiempos de retención y series homologas de n-alcanos C8-C20 (Fluka Analytical) se utilizaron para la identificación en comparación con los de los estándares puros. También se compararon los patrones de fragmentación de los componentes del espectro de masas con los almacenados en la biblioteca GC-MS.For its part, the essential oil of S. montana was analyzed by gas chromatography on an Agilent 7890 A equipment interconnected with an Agilent 5975C mass spectrometer with electron impact ionization (70 eV). A capillary column of HP-5MS silica (30 m 250 mm id), coated with 5% phenylmethyl silox (0.25 mm phase thickness) was used. The oven temperature was programmed as follows: 60 ° C for 8 min, increasing to 180 ° C at 3C / min, 180-250 ° C at 20C / min, then 250 ° C for 10 min. Injector and detector temperatures were maintained at 250 ° C and 280 ° C, respectively. Samples were injected in split mode with a 1:55 split ratio. 0.2 ml of each sample was injected. The carrier gas was helium with a flow rate of 1 ml / min and an interface temperature of 250 ° C. The mass range analyzed was between 40-450 m / z. The components of the linear retention indices of the volatile extracts calculated from their retention times and homologous series of C8-C20 n-alkanes (Fluka Analytical) were used for identification in comparison with those of the pure standards. The fragmentation patterns of the mass spectrum components were also compared with those stored in the GC-MS library.
Los compuestos mayoritarios presentes en el aceite esencial de S. montana, fueron Carvacrol (40%), p-cimeno (16%) y gamma terpineno (15%). (Fig. 2)The major compounds present in the essential oil of S. montana were Carvacrol (40%), p-cymene (16%) and gamma terpinene (15%). (Fig. 2)
Ejemplo 4: Preparación de la formulación de extracto etanólico de C. patagua y aceite esencial de S. montana, y del antibiótico:Example 4: Preparation of the formulation of ethanolic extract of C. patagua and essential oil of S. montana, and of the antibiotic:
Se realizaron mezclas del extracto etanólico de C. patagua y del aceite esencial de S. montana en diferentes proporciones, desde 1:3 a 3:1 (en peso). La mezcla extracto etanólico/aceite esencial fue diluida en etanol 85% para llegar a concentraciones de 10, 8, 6 y 3% de la formulación.Mixtures of the ethanolic extract of C. patagua and the essential oil of S. montana were made in different proportions, from 1: 3 to 3: 1 (by weight). The extract mix Ethanolic / essential oil was diluted in ethanol 85% to reach concentrations of 10, 8, 6 and 3% of the formulation.
Paralelamente se preparó un control del antibiótico florfenicol utilizando como solvente etanol 95% y diluido en agua destilada estéril. Se utilizó como punto de partida una solución stock de 5120 pg/ml, para preparar diluciones seriadas en base 2 hasta la dilución 1/64.At the same time, a control of the antibiotic florfenicol was prepared using 95% ethanol as solvent and diluted in sterile distilled water. A stock solution of 5120 pg / ml was used as a starting point, to prepare serial dilutions in base 2 up to the 1/64 dilution.
Ejemplo 5. Efecto de la formulación que comprende el extracto de C. patagua y el aceite esencial de S. montana en la bacteria Piscirickettsia salmonis Example 5. Effect of the formulation comprising the extract of C. patagua and the essential oil of S. montana on the bacterium Piscirickettsia salmonis
Preparación del inoculo de Piscirickettsia salmonis:Preparation of the inoculum of Piscirickettsia salmonis:
El inoculo de P. salmonis utilizado correspondió a un aislado de terreno obtenido a partir de un brote en Salmo salar. Se ajustó un inoculo a una concentración aproximada a un Macfarlane 0,5, para obtener una concentración bacteriana cercana a 1x108 bacterias/ml. La pureza del inoculo fue evaluada mediante tinción Gram, IFAT y PCR.The inoculum of P. salmonis used corresponded to a ground isolate obtained from an outbreak in Salmo salar. An inoculum was adjusted to an approximate concentration of a Macfarlane 0.5, to obtain a bacterial concentration close to 1x108 bacteria / ml. The purity of the inoculum was evaluated by Gram staining, IFAT and PCR.
Cultivo:Culture:
Tanto en los pasajes de mantenimiento, como en los antibiogramas, P. salmonis fue cultivada en un medio Agar sangre con las siguientes características: Caldo infusión corazón 1,5%, Glucosa 1%, Cisteína 0,1%, Agar 1,5%, Hemoglobina 0,2%, Sangre de Cordero 5%, SFB 3% y a una temperatura de incubación de 18°C.Both in the maintenance passages and in the antibiograms, P. salmonis was cultivated in a blood agar medium with the following characteristics: Heart infusion broth 1.5%, Glucose 1%, Cysteine 0.1%, Agar 1.5% , Hemoglobin 0.2%, Lamb Blood 5%, SFB 3% and at an incubation temperature of 18 ° C.
Prueba de difusión en agar en pocilio:Well agar diffusion test:
0,1 mi de la suspensión bacteriana P. salmonis fue esparcida uniformemente en la superficie de agar sangre, procurando que el agua fuese absorbida completamente por este. Posteriormente se realizaron perforaciones de aproximadamente 5 mm de diámetro en el agar mediante un sacabocados, para depositar 120 pl de cada extracto y sus diluciones en cada pocilio formado. Uno de los pocilios fue llenado sólo con solvente, para evaluar el efecto de éste sobre el crecimiento de la bacteria. Como control positivo se utilizaron pocilios con florfenicol concentrado y diluciones de florfenicol solubilizado en etanol 95% y diluido en agua, así como aceite esencial de S. montana al 100% y extracto etanólico de C. patagua al 100% Posteriormente todas las placas fueron incubadas durante cuatro días a 20°C. 0.1 ml of the P. salmonis bacterial suspension was spread evenly on the blood agar surface, ensuring that the water was completely absorbed by it. Subsequently, perforations of approximately 5 mm in diameter were made in the agar using a punch, to deposit 120 µl of each extract and its dilutions in each well formed. One of the wells was filled only with solvent, to evaluate its effect on the growth of the bacteria. As a positive control, wells with concentrated florfenicol and dilutions of florfenicol solubilized in ethanol 95% and diluted in water were used, as well as essential oil of S. montana at 100% and ethanolic extract of C. patagua at 100% Subsequently, all the plates were incubated for four days at 20 ° C.
Finalmente se midió el diámetro medio del halo de inhibición formado alrededor de cada pocilio.Finally, the mean diameter of the inhibition halo formed around each well was measured.
Los resultados del ensayo se muestran en la Tabla 1.The test results are shown in Table 1.
Tabla 1. Efecto antibiótico de la formulación que comprende extracto etanólico de C. patagua y aceite esencial de S. montana contra la bacteria P. salmonis y de otros compuestos utilizados como controlTable 1. Antibiotic effect of the formulation comprising ethanolic extract of C. patagua and essential oil of S. montana against P. salmonis bacteria and other compounds used as control
*DT:desviacióntípica* DT: standard deviation
Además de la evidente actividad antibiótica de la formulación que comprende la combinación del extracto de C. patagua y del aceite esencial de S. montana, se visualiza también que la combinación del extracto y del aceite esencial provocan un efecto sinérgico que mejora la adición de los efectos de cada uno por separado. Adicionalmente, también se puede comprobar como la combinación de la formulación con extracto y aceite esencial con una pequeña proporción de antibiótico consigue resultados muy similares a los obtenidos con el antibiótico.In addition to the evident antibiotic activity of the formulation that comprises the combination of the extract of C. patagua and the essential oil of S. montana , it is also seen that the combination of the extract and the essential oil cause a synergistic effect that improves the addition of the effects of each one separately. Additionally, it can also be verified how the combination of the formulation with extract and essential oil with a small proportion of antibiotic achieves results that are very similar to those obtained with the antibiotic.
Ejemplo 6: Microencapsulación de la formulación.Example 6: Microencapsulation of the formulation.
Se mezcló el material encapsulante, goma arábiga (GA) o maltodextrina (MD) al 20% P/V con la formulación que comprende la combinación del extracto de C. patagua y del aceite esencial de S. montana en diferentes cantidades y se homogenizó. Las muestras fueron congeladas a -20°C, y posteriormente liofilizadas (Christ, Alpha 1-2). La muestra liofilizada fue molida y tamizada (tamaño de poro 500 micrones). El polvo obtenido fue almacenado en desecador hasta su utilización. La figura 4, muestra un ejemplo de las microcápsulas obtenidas. The encapsulating material, gum arabic (GA) or maltodextrin (MD) at 20% W / V was mixed with the formulation that comprises the combination of the extract of C. patagua and the essential oil of S. montana in different amounts and it was homogenized. The samples were frozen at -20 ° C, and subsequently lyophilized (Christ, Alpha 1-2). The lyophilized sample it was ground and sieved (pore size 500 microns). The powder obtained was stored in a desiccator until its use. Figure 4 shows an example of the microcapsules obtained.
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