ES2705429T3 - Composición de antígenos para detectar la enfermedad de Chagas - Google Patents

Abstract

Una composición de polipéptidos adecuada para detectar anticuerpos contra Trypanosoma cruzi en una muestra biológica aislada, consistiendo dicha composición en tres polipéptidos producidos de forma recombinante o sintética específicos para Trypanosoma cruzi, en la que dichos polipéptidos son 1F8, JL7 y cruzipaína.

Description

DESCRIPCIÓN

Composición de antígenos para detectar la enfermedad de Chagas

La enfermedad de Chagas es una enfermedad parasitaria tropical causada por el protozoo flagelado Trypanosoma cruzi. T. cruzi se transmite frecuentemente a los seres humanos y a otros mamíferos a través de un insecto vector, las chinches o reduvídeos hematófagos de la subfamilia Triatominae (familia Reduviidae; en alemán: "Raubwanzen"). La enfermedad también puede propagarse a través de la transfusión de sangre y el trasplante de órganos, la ingestión de alimentos contaminados con parásitos y de la madre al feto.

Trypanosoma cruzi aparece en diferentes formas y etapas de desarrollo. La forma de reproducción se llama epimastigote, que se adopta justo después de que la chinche haya chupado sangre de un animal infectado, incluidos los seres humanos. Los epimastigotes se trasladan a la pared celular rectal de la chinche. La chinche transfiere el patógeno a través de las heces al siguiente anfitrión en una picadura posterior donde el insecto defeca. La forma infecciosa se llama tripomastigote y penetra en el cuerpo humano a través de la herida de la picadura. Por lo tanto, el tripomastigote puede encontrarse en la sangre humana. Una forma adicional que se encuentra, por ejemplo, en el citoplasma de las células del músculo cardíaco, se llama amastigote o micromastigote. Durante el ciclo de vida de T. cruzi, el amastigote se convierte en tripomastigote, que puede chupar una chinche en la siguiente picadura.

Los síntomas de la enfermedad de Chagas varían en el transcurso de una infección. A menudo hay una fase aguda seguida de una fase crónica. También puede haber una fase latente después de la infección. Cada fase puede ser asintomática o potencialmente mortal. En la etapa temprana y aguda, los síntomas suelen ser leves y generalmente no producen más que una inflamación local en el lugar de la infección. La fase aguda inicial responde a los tratamientos antiparasitarios, con tasas de curación del 60-90 %. Después de 4-8 semanas, las personas con infecciones activas entran en la fase crónica de la enfermedad de Chagas, que es asintomática para el 60-80 % de las personas con infección crónica a lo largo de toda la vida. Durante la fase crónica, algunos pacientes presentan complicaciones cardíacas que ocasionan una cardiomegalia, insuficiencia cardíaca, frecuencia cardíaca alterada y muerte súbita. También son típicas de la etapa crónica las complicaciones intestinales que ocasionan dificultades para comer o para defecar.

Los tratamientos antiparasitarios también parecen retrasar o prevenir la aparición de síntomas de la enfermedad durante la fase crónica, pero según los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades de EE. UU., el riesgo promedio durante toda la vida de presentar una o más de estas complicaciones es de aproximadamente un 30 %, lo que significa que estas personas con infección crónica todavía presentarán finalmente trastornos cardíacos y del aparato digestivo potencialmente mortales. Los tratamientos antiparasitarios disponibles actualmente para la enfermedad de Chagas son el benznidazol y el nifurtimox, que pueden provocar efectos secundarios temporales en muchos pacientes, entre ellos dermatosis, toxicidad cerebral e irritación del aparato digestivo.

La enfermedad de Chagas aparece principalmente en áreas rurales pobres de México, Centroamérica y Sudamérica; muy raramente, la enfermedad se ha encontrado en el sur de Estados Unidos. Sin embargo, se analiza a los donantes de sangre para detectar la infección por Trypanosoma cruzi mediante procedimientos de diagnóstico in vitro en estos países.

Hoy en día existen varios procedimientos de diagnóstico serológico para detectar infecciones por T. cruzi, por ejemplo, detección de anticuerpos contra T. cruzi mediante inmunofluorescencia indirecta, hemaglutinación indirecta, fijación del complemento, técnicas de inmunotransferencia y ELISA. También se aplican procedimientos de biología molecular (p. ej., RCP) y procedimientos complejos de xenodiagnóstico. En el xenodiagnóstico de una infección transmitida por un vector, se permite que un insecto criado en el laboratorio y libre de patógenos (aquí: la chinche) chupe la sangre de un paciente. Se examina después el contenido intestinal del insecto para detectar la presencia del patógeno (aquí: Trypanosoma cruzi).

Cada uno de estos procedimientos muestra sus propias ventajas e inconvenientes en cuanto a su sensibilidad y especificidad y, por lo tanto, no hay un procedimiento de referencia disponible hasta el momento.

Al comienzo del desarrollo de ensayos de Chagas para la detección de anticuerpos se aplicaron Usados de antígenos naturales, y todavía se están utilizando. Sin embargo, con los Usados solo está representada en esta composición de antígenos una de las tres etapas de desarrollo de T. cruzi, de modo que existe una cierta probabilidad de pasar por alto las infecciones de las otras dos etapas. Los ensayos más modernos aplican mezclas de antígenos recombinantes que representan todas las etapas de la infección por T. cruzi.

Cuando se usan Usados de antígenos naturales, el ensayo de diagnóstico se enfrenta a menudo a problemas de especificidad y reactividades cruzadas observadas en muestras de pacientes infectados por Leishmania, otro parásito. Además, la producción de Usados de antígenos ocasiona una variación considerable de un lote a otro debido a la compleja composición de antígenos de T. cruzi. Es más, muy a menudo los reactivos raros basados en Usados naturales muestran una sensibilidad débil, ya que algunos Usados no contienen ningún antígeno o no contienen antígenos suficientes de todas las etapas del ciclo de vida.

Al aplicar antígenos recombinantes se pueden sortear o evitar los desafíos anteriores. Sin embargo, los kits de ensayo disponibles comercialmente para detectar la enfermedad de Chagas, que se basan en composiciones de antígenos recombinantes, muestran diferencias considerables con respecto a la sensibilidad y especificidad, de modo que los clientes, es decir, los laboratorios comerciales o clínicos o las unidades de análisis de sangre, a menudo tienen que usar varios kits en paralelo para obtener resultados fiables. Como consecuencia, la decisión de si la muestra de un paciente es reactiva o no se basa en la mayoría de los resultados positivos o negativos obtenidos para la misma muestra mediante varios kits basados en diferentes composiciones de antígenos. Es obvio que este procedimiento laborioso de aplicar varias pruebas de diagnóstico no tiene sentido económicamente, ya que da lugar a un aumento del equipo y del personal del laboratorio, el tiempo, la carga de trabajo y los costes.

Los ensayos serológicos para detectar anticuerpos contra antígenos de Trypanosoma cruzi se han descrito ampliamente en la bibliografía de la técnica anterior; véase una revisión, por ejemplo, en Silveira et al., Trends in Parasitology 2001, vol. 17 n.° 6. Varios laboratorios han aislado antígenos recombinantes de T. cruzi relevantes para el diagnóstico serológico. Varios de estos genes tienen secuencias repetidas en tándem. Debido al número extremadamente grande de proteínas antigénicas expresadas por Trypanosoma cruzi (aproximadamente 23.000 secuencias de codificación de proteínas y pseudogenes predichos en bases de datos públicas), el número de posibles combinaciones de antígenos para un inmunoanálisis es inmensamente grande. Aunque los procedimientos para la producción recombinante se conocen desde hace décadas, sigue siendo un desafío descubrir qué antígenos se requieren para establecer un ensayo de diagnóstico. Para elegir antígenos adecuados para un ensayo de inmunodiagnóstico, hay que tener en cuenta los antígenos de todas las etapas del ciclo de vida del patógeno y también aplicar antígenos contra los cuales se puedan encontrar anticuerpos para todas las etapas de la infección (fases aguda, latente y crónica). Al mismo tiempo, el número de antígenos no debe superar unos 5 o 10 debido a consideraciones técnicas (por ejemplo, falta de solubilidad y estabilidad, reacciones cruzadas no deseadas que conducen a la inactivación de las señales, evitación de la reactividad cruzada, por ejemplo, a Leishmania) y también consideraciones económicas, ya que además hay que desarrollar completamente, evaluar y producir a gran escala cada antígeno. Según Silveria et al. (más arriba) los ensayos disponibles comercialmente utilizan a menudo una combinación de seis o siete antígenos de T. cruzi diferentes, a veces también en combinación con péptidos sintéticos más cortos derivados de antígenos de longitud completa de T. cruzi.

Otro enfoque para proporcionar una prueba de diagnóstico altamente sensible se basa en un ensayo con varios componentes que aplica un número elevado de diversos tipos de antígenos de T. cruzi con los que se han recubierto individualmente diferentes microesferas. El documento WO 2009/017736 y la patente de Estados Unidos n.° 8.329.411 describen un dispositivo y un procedimiento para detectar una infección por Trypanosoma cruzi en una muestra biológica. Este sistema incluye 16 proteínas diferentes (seleccionadas de 59 proteínas candidatas iniciales, que actúan como antígenos) con las que hay que recubrir individualmente microesferas marcadas, lo que proporciona un instrumento de diagnóstico similar a una matriz. Los anticuerpos, si están presentes en la muestra, se unen a estas proteínas de recubrimiento. En consecuencia, los anticuerpos unidos se detectan mediante la unión de un anticuerpo secundario marcado a los anticuerpos de la muestra. Si bien este procedimiento tiene sentido para un enfoque de investigación, el alto número de antígenos que ocasionan grandes costes de producción es demasiado costoso para utilizarlo como análisis sistemático en un laboratorio comercial o clínico.

Umezawa et al. (Transfusión, vol. 3: 91-97, 2003) y Umezawa et al. (Journal of Clinical Microbiology, vol. 37 (5): 1554-1560, 1999) describen una prueba de serodiagnóstico para la enfermedad de Chagas que emplea la triple combinación de polipéptidos de B13, 1F8 y JL7. En resumen, los inmunoanálisis para detectar anticuerpos contra T. cruzi en muestras de individuos infectados conocidos en la técnica aplican un número elevado de antígenos diferentes para lograr una alta sensibilidad y especificidad. Todavía no se dispone de un verdadero ensayo de referencia económicamente asequible.

Por lo tanto, se puede considerar que el problema es proporcionar una composición y un procedimiento de diagnóstico que supere los inconvenientes con respecto a la reproducibilidad, sensibilidad y especificidad de los ensayos de la técnica anterior para detectar infecciones por Trypanosoma cruzi.

La presente invención, tal como se especifica en las reivindicaciones, resuelve el problema.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a una composición de acuerdo con la reivindicación independiente 1.

En otro modo de realización, los tres polipéptidos específicos de T. cruzi'. 1F8, J17 y cruzipaína, presentes en dicha composición de polipéptidos, consisten en las SEQ ID NO. 1, 2 y 3, respectivamente.

Otro modo de realización se refiere a un procedimiento para producir una composición soluble e inmunorreactiva de los polipéptidos descritos anteriormente, adecuada para detectar anticuerpos contra Trypanosoma cruzi en una muestra aislada. El uso de dicha composición de polipéptidos en un ensayo de diagnóstico in vitro para la detección de anticuerpos específicos contra T. cruzi también forma parte de la invención.

Además, la invención se refiere a un procedimiento para detectar anticuerpos específicos para Trypanosoma cruzi en una muestra aislada en la que se usa una composición de dichos polipéptidos de Trypanosoma cruzi, así como un kit de reactivos que comprende dicha composición de polipéptidos de Trypanosoma cruzi.

Leyenda de las secuencias de aminoácidos descritas:

SEQ ID NO. 1 muestra la proteína 1F8 de T. cruzi (entrada UniProt Q4D1Q2), también llamada FCaBP, Tc24 o Tc28; nombre descriptivo completo: proteína flagelar fijadora de calcio 3. SEQ ID NO. 1 muestra las posiciones de los aminoácidos 1-211. De acuerdo con la invención, se pueden reemplazar residuos de cisteína por alanina (A) o serina (S) para evitar el plegamiento incorrecto debido a la formación de puentes disulfuro intramoleculares. Por lo tanto, todas las posiciones en las que aparece de forma natural una cisteína (C), en este caso cuatro posiciones, están marcadas con una X; X = C, A o S.

MGAXGSKGST SDKGLASDKD GKNAKDRKEA WERIRQAIPR EKTAEAKQRR IELFKKFDKN ETGKLXYDEV HSGXLEVLKL DEPTPRVRDI TKRAFDKARA LGSKLENKGS EDFVEFLEFR LMLXYIYDFF ELTVMFDEID ASGNMLVDEE ELKRAVPKLE AWGAKVEDPA ALFKELDKNG TGSVTFDEFA AWASAVKLDA DGDPDNVPES A

SEQ ID NO. 2 muestra una secuencia parcial de la proteína JL7 de T. cruzi (entrada UniProt Q4CS87), también llamada FRA, Ag1, H49; nombre descriptivo completo: calpaína-cisteína peptidasa, posible. SEQ ID NO. 2 muestra las posiciones de aminoácidos 62-287 de la citada entrada de la base de datos UniProt, que dan lugar a un polipéptido con una longitud de 226 aminoácidos. La proteína de longitud completa comprende los aminoácidos 1 a 1275.

MEQERRQLLE KDPRRNAREI AALEESMNAR AQELAREKKL ADRAFLDQKP EGVPLRELPL DDDSDFVAME QERRQLLEKD PRRNAKEIAA LEESMNARAQ ELAREKKLAD RAFLDQKPEG VPLRELPLDD DSDFVSMEQE RRQLLEKDPR RNVQKIADLE ESMNARAQEL AREKKLADRA FLDQKPEGVS LRELPLDDDS DFVSMEQERR QLLEKDPRKN VQIVAD

SEQ ID NO. 3 muestra una secuencia parcial de la proteína cruzipaína de T. cruzi (entrada UniProt Q9TW51), también llamada cruzaína, gp51/57, Ag 163B6; nombre descriptivo completo: cisteína-proteinasa principal. SEQ ID NO. 3 muestra las posiciones de aminoácidos 6-135 de la entrada de la base de datos UniProt, que dan lugar a un polipéptido con una longitud de 130 aminoácidos, también llamado C-cruzipaína. La proteína de longitud completa comprende los aminoácidos 1 a 135.

GPGPTPEPTT TTTTSAPGPS PSYFVQMSCT DAACIVGCEN VTLPTGQCLL TTSGVSAIVT CGAETLTEEV FLTSTHCSGP SVRSSVPLNK CNRLLRGSVE FFCGSSSSGR LADVDRQRRH QPYHSRHRRL

SEQ ID NO. 4 muestra una secuencia parcial de la proteína KMP-11 de T. cruzi (entrada UniProt Q9U6Z1), nombre descriptivo completo: proteína de la membrana del cinetoplasto 11. Esta proteína comprende las posiciones de aminoácidos 1 a 92.

MATTLEEFSA KLDRLDAEFA KKMEEQNKKF FADKPDESTL SPEMKEHYEK FEKMIQEHTD KFNKKMHEHS EHFKAKFAEL LEQQKNAQFP GK

SEQ ID NO. 5 muestra una secuencia parcial de la proteína PAR2 de T. cruzi (entrada UniProt Q01530), también llamada PFR2; nombre descriptivo completo: proteína de la varilla paraflagelar principal. SEQ ID NO. 5 muestra la parte carboxiterminal (C-PAR2) de PAR2, es decir, las posiciones de aminoácidos 277-600 de la entrada de la base de datos UniProt, que dan lugar a un polipéptido con una longitud de 324 aminoácidos. La proteína de longitud completa comprende los aminoácidos 1 a 600.

FQETSAIKDA KRRLKQRCED DLKNLHDAIQ KADMEDAEAM KRFATQKEKS EKFIQENLDR QDEAWRRIQE LERVLQRLGT ERFEEVKRRI EENDREEKRK VEYQQFLDVC GQHKKLLELS VYNCDLAMRC IGMMEELVAE GCSAIKSRHD KTNEELGDLR LQVHQEYLEA FRRLYKTLGQ LVYKKEKRLE EIDRNIRTTH IQLEFAIETF DPNAKKHSDA KKELYKLRAQ VEEELEMLKD KMAQALEMFG PTEDALNQAG IEFVHPAEEV EDGNLTRRSK MVEYRAHLAK QEEVKIAAER EELKRSKTLQ SQQYRGKTVQ QITQ

SEQ ID NO. 6 representa la secuencia completa de aminoácidos de SlyD de E. coli (196 residuos de aminoácidos), a la que también se puede acceder mediante la ID P0A9K9 en la base de datos UniProt. Cuando se usa SlyD como compañera de fusión por chaperona para los polipéptidos de T. cruzi de acuerdo con la invención, en un modo de realización se usa una versión truncada en el extremo C de SlyD de E. coli que abarca los residuos de aminoácidos 1-165 de la secuencia indicada a continuación. En otro modo de realización (como se aplica en el ejemplo 1), se añade una versión en tándem de dos unidades de SlyD al extremo aminoterminal de los polipéptidos de acuerdo con la invención. Para facilitar la clonación y el nuevo plegamiento después de la expresión de un polipéptido de fusión resultante, estas dos unidades de SlyD pueden estar separadas por una secuencia conectora como se muestra en la SEQ ID NO. 7.

MKVAKDLVVS LAYQVRTEDG VLVDESPVSA PLDYLHGHGS LISGLETALE GHEVGDKFDV AVGANDAYGQ YDENLVQRVP KDVFMGVDEL QVGMRFLAET DQGPVPVEIT AVEDEHVWD GNHMLAGQNL KFNVEVVAIR EATEEELAHG HVHGAHDHHH DHDHDGCCGG HGHDHGHEHG GEGCCGGKGN GGCGCH SEQ ID NO. 7 muestra la secuencia de aminoácidos del espaciador rico en glicina (que comprende unidades triples de glicina separadas por una serina) que se puede usar como espaciador o conector flexible, soluble y resistente a las proteasas entre varios restos de polipéptidos fusionados.

GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS GGG SEQ ID NO. 8 muestra un marcador de hexahistidina que puede añadirse al extremo aminoterminal o en otro modo de realización al extremo carboxiterminal de los polipéptidos de acuerdo con la invención. El marcador se utiliza para facilitar la purificación y el nuevo plegamiento de las proteínas.

GGGSGGGLEH HHHHH

Leyenda a las figuras:

La fia. 1 íaue comprende las figuras 1a v 1bí contiene la tabla 2 en la que se muestran los resultados experimentales para la detección de anticuerpos contra T. cruzi en sueros humanos mediante el uso de variantes de antígenos recombinantes de T. cruzi en comparación con tres ensayos de Chagas disponibles en el mercado (véase también el ejemplo 4). Para el ensayo Architect Chagas, una muestra se considera positiva (es decir, contiene anticuerpos contra T. cruzi) si el valor de señal a umbral (S/U) es >1,0, negativa (sin anticuerpos contra T. cruzi) si el valor de S/U es <0,8 e "ind." si el valor de S/U es >0,8 y <1,0. "ind." significa indeterminado (o intermedio), es decir, los resultados están en la zona gris. En función de las instrucciones del proveedor comercial, estas muestras "ind." deben confirmarse mediante uno o dos análisis adicionales para recibir un resultado final fiable (decisión mayoritaria).

Se muestran valores de S/U correspondientes para Biolisa Chagas y Novalis Chagas IgG ELISA. Para los polipéptidos de acuerdo con la invención se muestran recuentos de medición absolutos (analizador cobas® E601, Roche Diagnostics GmbH, ejemplo 4) y valores umbral individuales para cada antígeno.

La fia. 2 (tabla 3) contiene los resultados de la muestra analizada con tres ensayos de Chagas disponibles comercialmente para la detección de anticuerpos contra T. cruzi en sueros humanos en comparación con los resultados que utilizan variantes individuales de antígenos recombinantes de T. cruzi de acuerdo con la invención (véase también el ejemplo 4).

En la fia. 3 (tabla 5) se muestran los datos experimentales del ejemplo 6 con respecto a la sensibilidad de las mezclas de antígenos recombinantes de T. cruzi en comparación con los ensayos comerciales contra Chagas. En la fia. 4 (tabla 6) se muestra una comparación de la reactividad ¡nmunitaria de antígenos recombinantes de T. cruzi con y sin fusión por chaperona (véase también el ejemplo 7).

En la fia. 5 (tabla 7) se muestran datos experimentales sobre la reactividad de 1F8 dependiente del calcio (ejemplo 8).

Descripción detallada de la invención

Como se explica en la sección de antecedentes, los ¡nmunoanálisis conocidos en la técnica anterior para detectar anticuerpos contra T. cruzi en muestras de individuos infectados utilizan un número elevado de antígenos diferentes para lograr una alta sensibilidad y especificidad. Sobre todo, la decisión sobre si un paciente está infectado o no se basa en la mayoría de los resultados de diferentes ¡nmunoanálisis. Hasta ahora no se dispone de un ensayo de referencia económicamente asequible.

Sorprendentemente, al usar una composición o mezcla de antígenos específicos de Trypanosoma cruzi que comprende 1F8, JL7 y al menos uno de los polipéptidos seleccionados del grupo que consta de cruzipaína, KMP-11 y PAR2, hemos sido capaces de proporcionar una composición y un procedimiento de diagnóstico que superan los inconvenientes de la técnica anterior. La nueva composición es similar o incluso superior en cuanto a su reproducibilidad, sensibilidad y especificidad para detectar anticuerpos contra Trypanosoma cruzi en una muestra de paciente aislada. Además, solo se necesitan tres antígenos específicos de Trypanosoma cruzi para generar una composición o un kit para la detección fiable de anticuerpos específicos de T. cruzi. La composición de la invención es como se define en la reivindicación 1.

Los términos antígeno específico de Trypanosoma cruzi (= T. cruzi), polipéptido específico de T. cruzi, polipéptido de T. cruzi y antígeno de T. cruzi se pueden utilizar como sinónimos y cada uno se refiere a una secuencia polipeptídica que se puede encontrar en cualquier cepa de T. cruzi de origen natural accesible a través de una base de datos internacional de proteínas como UniProt. En la presente invención, las cadenas de aminoácidos de las secuencias de antígenos aplicadas muestran un intervalo de longitudes entre unos 90 aminoácidos (KMP-11) y hasta unos 400 aminoácidos (C-PAR2). En un modo de realización, la longitud de cada antígeno de T. cruzi está dentro de este intervalo.

Como se puede ver en el ejemplo 4, tabla 2 (fig. 1a y 1b), los polipéptidos individuales de T. cruzi que comprenden las secuencias de péptidos 1F8, JL7, cruzipaína, KMP-11 o PAR2 muestran una antigenicidad significativa en un inmunoanálisis cuando se usa cada polipéptido como un único antígeno individual. Sin embargo, este ejemplo también muestra que la reactividad de cada antígeno de T. cruzi depende en gran medida del suero de cada paciente. Siempre hay algunas muestras que no se detectan utilizando un solo antígeno. Este hallazgo se corresponde bien con la comparación con los ensayos comerciales de Chagas. Examinando la tabla 3 (fig. 2), se puede ver que tampoco hay un único ensayo comercial (cada uno de los cuales utiliza al menos de cuatro a diez antígenos específicos recombinantes diferentes de T. cruzi) que detecte todas las muestras reactivas. Para detectar de manera fiable los anticuerpos específicos contra T. cruzi, cada muestra debe analizarse con los tres ensayos comerciales para decidir en un enfoque mayoritario (es decir, dos de los tres ensayos comerciales detectan la infección) qué muestra es reactiva y contiene anticuerpos específicos de T. cruzi.

De acuerdo con la divulgación, la composición de polipéptidos específicos de Trypanosoma cruzi que comprende 1F8, JL7 y al menos uno de los polipéptidos seleccionados del grupo que consta de cruzipaína, KMP-11 y PAR2 muestra una especificidad de alrededor del 99,8 % que es similar y está en línea con los ensayos comerciales (véase la tabla 4, ejemplo 5). Probamos dos variantes de kit, el kit 1 que comprende 1F8, JL7 y cruzipaína y el kit 2 que comprende 1F8, JL7, cruzipaína y KMP-11. Además, ambos kits/composiciones muestran una sensibilidad a la dilución superior cuando se comparan con tres ensayos comerciales contra Chagas como se puede ver en el ejemplo 6 y en la tabla 5/figura 3.

El término composición significa que los polipéptidos separados de T. cruzi aislados se combinan en una mezcla. Este término no incluirá los polipéptidos que se hayan expresado o sintetizado de forma recombinante (producidos químicamente) en una sola cadena de aminoácidos, de modo que todos los polipéptidos se encuentren en una sola cadena polipeptídica como un polipéptido de fusión de varios antígenos. En otras palabras, se excluyen los antígenos de fusión de varios epítopos que no aparecen de forma natural en una sola cadena polipeptídica. Por el contrario, cada uno de los polipéptidos de T. cruzi 1F8, JL7 y al menos uno de los polipéptidos seleccionados del grupo que consta de cruzipaína, KMP-11 y PAR2 se expresan o se sintetizan químicamente como cadenas polipeptídicas separadas. La composición de la invención consta de tres polipéptidos producidos de forma recombinante o sintética específicos para T. cruzi, en donde dichos polipéptidos son 1F8, JL7 y cruzipaína. La composición se crea mezclando los polipéptidos individuales de T. cruzi en un recipiente o tubo que da lugar a una composición.

La composición puede ser líquida, es decir, los polipéptidos de T. cruzi se añaden a una mezcla en forma soluble en agua o tampón. Los ingredientes adecuados del tampón son conocidos por los expertos en la técnica. Dicha composición también puede ser sólida, es decir, comprende los antígenos de T. cruzi en forma liofilizada o secada de otro modo.

En un aspecto divulgado, dicha composición de polipéptidos comprende una secuencia de aminoácidos de 1F8 de acuerdo con la SEQ ID NO. 1, una secuencia de JL7 de acuerdo con SEQ ID NO. 2 y al menos uno de los polipéptidos seleccionados del grupo que consta de cruzipaína, KMP-11 y PAR2 que comprende al menos una secuencia seleccionada del grupo que consta de la SEQ ID NO. 3 (cruzipaína), SEQ ID NO. 4 (KMP-11) y SEQ ID NO. 5 (PAR2).

En un aspecto divulgado, la composición de polipéptidos comprende el polipéptido 1F8, JL7 y cruzipaína. En aún otro aspecto divulgado, dicha composición comprende polipéptidos de acuerdo con las SEQ ID NO. 1 (1F8), 2, (JL7) y 3 (cruzipaína). En un aspecto adicional divulgado, dicha composición consta de tres polipéptidos que comprenden las SEQ ID NO. 1 (1F8), 2, (JL7) y 3 (cruzipaína). En un modo de realización, la parte que es específica para T. cruzi consta de las SEQ NO. 1 (1F8), 2, (JL7) y 3 (cruzipaína). En otro aspecto divulgado, dicha composición consta de polipéptidos que comprenden las SEQ ID NO. 1 (1F8), 2, (JL7), 3 (cruzipaína) y 4 (KMP-11).

La expresión "la parte que es específica para T. cruzi consta de SEQ ID NO. 1 (o 2 o 3, etc.)" significa que, por ejemplo, SEQ ID NO. 1 es la única parte polipeptídica derivada de un antígeno presente en T. cruzi que está presente en esta cadena polipeptídica y que reacciona con anticuerpos específicos contra T. cruzi. Sin embargo, es posible la adición de secuencias de aminoácidos conectaras o de fusión peptídica no procedentes de T. cruzi, ya que estas secuencias no son específicas para T. cruzi y no las reconocería un anticuerpo específico contra T. cruzi. De acuerdo con la divulgación, también están incluidas en la composición variantes de los antígenos 1F8, JL7, cruzipaína, KMP-11 y PAR2 de acuerdo con las SEQ ID NO. 1, 2, 3, 4 o 5. Esto se aplica también a los polipéptidos 1F8, JL7 y cruzipaína presentes en una composición que consta de tres polipéptidos específicos de T. cruzi. El término "variantes" en este contexto se refiere a una proteína o a un fragmento de proteína (es decir, un polipéptido o péptido) sustancialmente similar a dicha proteína. En particular, una variante puede ser una ¡soforma que muestra intercambios, deleciones o inserciones de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de la ¡soforma de la proteína más prevalente. En un modo de realización, dicha proteína sustancialmente similar tiene una similitud de secuencia con la ¡soforma más prevalente de la proteína de al menos el 80 %, en otra alternativa al menos el 85 % o al menos el 90 %, en otro modo de realización más al menos el 95 %. El término "variante" también se refiere a una proteína modificada por vía postraduccional, tal como una proteína glucosilada o fosforilada. Una variante se clasifica como tal mientras se mantenga la inmunorreactividad en un inmunoanálisis de diagnóstico in vitro, es decir, la variante aún puede unirse a anticuerpos contra T. cruzi presentes en una muestra y detectarlos. Una "variante" es también un polipéptido o antígeno que se ha modificado, por ejemplo, mediante la unión covalente al polipéptido o antígeno de una secuencia de aminoácidos conectora, un marcador, una secuencia de aminoácidos marcadora o un resto transportador.

La composición polipeptídica de acuerdo con la invención es soluble en condiciones de tampón fisiológico, como sabe un experto en la técnica. El término "específico para T. cruzi" significa que los polipéptidos son capaces de unirse o ser reconocidos y fijados por anticuerpos específicos para Trypanosoma cruzi que están presentes en una muestra aislada, tal como sueros humanos.

Todos los polipéptidos específicos de T. cruzi de acuerdo con la invención pueden expresarse como proteínas de fusión con secuencias polipeptídicas no procedentes de T. cruzi, tales como moléculas auxiliares de plegamiento como chaperonas. El objetivo de estos compañeros de fusión es facilitar la clonación, expresión y purificación del polipéptido específico del analito. Sin embargo, de acuerdo con la invención, los polipéptidos específicos de T. cruzi pueden producirse igualmente como polipéptidos autónomos sin ninguna compañera de fusión por chaperona. En un modo de realización, los polipéptidos individuales que forman la composición de antígenos específicos de T. cruzi de acuerdo con la invención se producen sin una compañera de fusión por chaperona. En el ejemplo 7 y en la tabla 6 (fig. 4) se muestra que la antigenicidad en un inmunoanálisis para detectar anticuerpos específicos contra T. cruzi es independiente de la presencia de una compañera de fusión por chaperona para cada antígeno.

La invención también se refiere a un procedimiento para producir una composición soluble e inmunorreactiva de polipéptidos adecuados para detectar anticuerpos contra Trypanosoma cruzi. Todos los antígenos específicos individuales de T. cruzi se produjeron de acuerdo con el procedimiento descrito en los ejemplos 1 o 2. En un modo de realización, dicho procedimiento comprende las etapas de

a) cultivar células anfitrionas transformadas con un vector de expresión que comprende, unida de forma operativa, una molécula de ADN recombinante que codifica un primer polipéptido 1F8 de Trypanosoma cruzi,

b) la expresión de dicho polipéptido de Trypanosoma cruzi y

c) la purificación de dicho polipéptido de Trypanosoma cruzi,

d) repetir los pasos a) a d) con un vector de expresión que comprende, unida de forma operativa, una molécula de ADN recombinante que codifica un segundo polipéptido JL7 de T. cruzi,

e) repetir los pasos a) a d) con un vector de expresión que comprende, unida de forma operativa, una molécula de ADN recombinante que codifica un tercer polipéptido cruzipaína de T. cruzi,

f) formar una mezcla de los polipéptidos de T. cruzi obtenidos en las etapas c), d) y e), produciendo así una composición soluble e inmunorreactiva de polipéptidos adecuada para detectar anticuerpos contra Trypanosoma cruzi.

Otro aspecto de la presente invención es un procedimiento para detectar anticuerpos específicos para Trypanosoma cruzi en una muestra aislada en la que la composición de la invención se usa como un reactivo de captura o como un compañero de unión para dichos anticuerpos contra Trypanosoma cruzi.

El procedimiento para detectar anticuerpos específicos para Trypanosoma cruzi en una muestra aislada aplica una composición que consta de tres polipéptidos de Trypanosoma cruzi que son 1F8, JL7 y cruzipaína como se ha descrito en detalle más arriba. En un modo de realización, el polipéptido 1F8 comprende la SEQ ID NO. 1, JL7 comprende la SEQ ID NO. 2 y cruzipaína comprende la SEQ ID NO. 3. En otro modo de realización más, 1F8 consta de la SEQ ID NO. 1, JL7 consta de la SEQ ID NO. 2 y cruzipaína consta de la SEQ ID NO. 3. Dicha composición de polipéptidos de Trypanosoma cruzi para la detección descrita anteriormente de anticuerpos específicos contra T. cruzi también puede obtenerse mediante el procedimiento de producción de polipéptidos del párrafo precedente. En un aspecto adicional, dicho procedimiento es adecuado para detectar anticuerpos contra T. cruzi de todas las subclases de inmunoglobulinas solubles, incluyendo IgG e IgM como las subclases más relevantes para el diagnóstico de Chagas.

Los inmunoanálisis para la detección de anticuerpos son bien conocidos por todos los expertos en la técnica, y también lo son los procedimientos para llevar a cabo dichos ensayos y aplicaciones y procedimientos prácticos. La composición de antígenos específicos de T. cruzi de acuerdo con la invención se puede usar para mejorar los ensayos para la detección de anticuerpos específicos contra T. cruzi independientemente de los marcadores utilizados e independientemente del modo de detección (por ejemplo, ensayo de radioisótopos, inmunoanálisis enzimático, ensayo de electroquimioluminiscencia, etc.) o del principio del ensayo (por ejemplo, ensayo de tiras reactivas, ensayo tipo sándwich, concepto de ensayo indirecto o ensayo homogéneo, etc.). Todos los líquidos biológicos conocidos por el experto se pueden usar como muestras para la detección de anticuerpos contra T cruzi. Las muestras que se utilizan habitualmente son líquidos corporales como sangre, sueros sanguíneos, plasma sanguíneo, orina o saliva.

Un aspecto adicional de la invención es un procedimiento para detectar anticuerpos específicos contra Trypanosoma cruzi en una muestra aislada; dicho procedimiento comprende

a) formar una mezcla de reacción inmunitaria mediante la mezcla de una muestra de líquido corporal con una composición de la invención,

b) mantener dicha mezcla de reacción inmunitaria durante un período suficiente para permitir que los anticuerpos presentes en la muestra de líquido corporal contra dicha composición de muestra de polipéptidos inmunorreaccionen con dicha composición de polipéptidos de Trypanosoma cruzi para formar un producto de reacción inmunitaria; y c) detectar la presencia o la concentración de cualquier cantidad de dicho producto de reacción inmunitaria.

En un modo de realización, dicho procedimiento para detectar anticuerpos específicos contra Trypanosoma cruzi en una muestra aislada se lleva a cabo en un formato en sándwich de doble antígeno (DAGS). En dicho ensayo, se requiere y utiliza la capacidad de un anticuerpo para unirse al menos a dos moléculas diferentes de un antígeno dado con sus dos (IgG, IgA, IgE) o diez (IgM) parátopos. En dicho inmunoanálisis DAGS, las estructuras básicas del "antígeno en fase sólida" y el "antígeno de detección" son esencialmente las mismas, de modo que el anticuerpo de la muestra forma un puente entre dos antígenos específicos. Por lo tanto, ambos antígenos tienen que ser idénticos o tener reactividad cruzada inmunitaria para que un anticuerpo pueda unirse a ambos antígenos. El requisito esencial para realizar dichos ensayos es que el epítopo correspondiente o los epítopos correspondientes estén presentes en ambos antígenos. Uno de los dos antígenos se puede unir a una fase sólida y el otro antígeno lleva un marcador detectable.

El procedimiento de ensayo DAGS comprende los siguientes pasos:

a) añadir a una muestra aislada una primera composición de polipéptidos de Trypanosoma cruzi que pueden unirse directa o indirectamente a una fase sólida, y cada uno de dichos primeros polipéptidos de Trypanosoma cruzi lleva un grupo efector que forma parte de un par de unión bioafín, y una segunda composición de polipéptidos de Trypanosoma cruzi, y cada uno de dichos segundos polipéptidos de Trypanosoma cruzi lleva un marcador detectable, en el que dichos primeros y segundos polipéptidos de Trypanosoma cruzi se unen específicamente a dichos anticuerpos contra Tripanosoma cruzi,

b) formar una mezcla de reacción inmunitaria que comprende los primeros polipéptidos de Trypanosoma cruzi, el anticuerpo de la muestra y los segundos polipéptidos de Trypanosoma cruzi en la que se añade una fase sólida que lleva el grupo efector correspondiente de dicho par de unión bioafín antes, durante o después de la formación de la mezcla de reacción inmunitaria,

c) mantener dicha mezcla de reacción inmunitaria durante un período suficiente para permitir que los anticuerpos de Trypanosoma cruzi contra dichos primer y segundo polipéptidos de Trypanosoma cruzi en la muestra de líquido corporal inmunorreaccionen con dichos primer y segundo polipéptidos de Trypanosoma cruzi para formar un producto de reacción inmunitaria,

d) separar la fase líquida de la fase sólida,

e) detectar la presencia de cualquiera de dichos productos de reacción inmunitaria en la fase sólida o líquida o ambas.

En un modo de realización, dicho primer polipéptido de Trypanosoma cruzi lleva un resto de biotina como parte del par de unión bioafín biotina/estreptavidina, y dicho segundo polipéptido de Trypanosoma cruzi está marcado con un complejo electroquimioluminiscente de rutenio.

Otro modo de realización de la invención es el uso de una composición de la invención en una prueba de diagnóstico in vitro para la detección de anticuerpos contra Trypanosoma cruzi. La composición para uso en una prueba de diagnóstico in vitro para la detección de anticuerpos contra Tripanosoma cruzi consta de los tres polipéptidos de T. cruzi 1F8, JL7 y cruzipaína. Dicha composición de polipéptidos de Trypanosoma cruzi también puede obtenerse por el procedimiento de producción de polipéptidos como se ha descrito en detalle más arriba. Otro aspecto más de la presente invención es un kit de reactivos para la detección de anticuerpos contra Trypanosoma cruzi, que comprende una composición de la invención.

Los polipéptidos presentes en dicho kit de reactivos o en la detección de anticuerpos contra Trypanosoma cruzi, consisten en los polipéptidos 1F8, JL7 y cruzipaína. Dicho kit es útil para una prueba de diagnóstico in vitro para la detección de anticuerpos contra Trypanosoma cruzi y puede contener además controles y soluciones convencionales en viales separados, así como reactivos adicionales en una o más soluciones o en forma liofilizada con los aditivos, tampones, sales, detergentes comunes, etc. e instrucciones de uso conocidos por el experto en la materia. También para el kit, dicha composición de polipéptidos de Trypanosoma cruzi también se puede obtener mediante el procedimiento de producción de polipéptidos como se ha descrito en detalle más arriba.

Los presentes inventores podrían mostrar que la reactividad del antígeno 1F8 de T. cruzi depende de la presencia de iones de calcio. Como se describe en el ejemplo 8/tabla 7 (fig. 8), la adición de iones de calcio ocasiona una clara ganancia en la reactividad inmunitaria cuando 1F8 forma parte de la composición de los antígenos de T. cruzi. Además, la adición de iones de calcio al tampón de ensayo puede reducir los efectos de recuperación del plasma como material de muestra (es decir, los efectos de formación de complejos de Ca2+ de los anticoagulantes, por ejemplo, citrato, EDTA o heparina en tubos de muestreo de plasma) cuando se utiliza el antígeno 1F8, una proteína fijadora de calcio, en la composición de los antígenos de T. cruzi. Por lo tanto, la invención también se refiere a una composición de la invención en la que dicha composición contiene iones de calcio en una concentración de 0,001 a 100 milimoles por litro, en un modo de realización de 0,1 a 10 milimoles por litro, en otro modo de realización de 0,5 a 5 milimoles por litro, en otro modo de realización de 1 a 5 milimoles por litro y en otro modo de realización más, 5 milimoles por litro. El calcio se puede añadir en forma de sal soluble en agua como, por ejemplo, cloruro de calcio. La adición de iones de calcio como se detalla anteriormente se aplica a la composición de tres polipéptidos adecuada para detectar anticuerpos contra Trypanosoma cruzi en una muestra biológica aislada en la que los polipéptidos son 1F8, JL7 y cruzipaína. En un modo de realización, el polipéptido 1F8 comprende la SEQ ID NO. 1, el polipéptido JL7 comprende la SEQ ID NO. 2 y el polipéptido cruzipaína comprende la SEQ ID NO. 3. En otro modo de realización más, dichos polipéptidos 1F8, JL7 y cruzipaína constan de las SEQ ID NO. 1, 2 y 3, respectivamente.

La invención se ilustra adicionalmente en la sección de ejemplos. En particular, los ejemplos ilustran que los presentes inventores han desarrollado y generado variantes de polipéptidos específicos de T. cruzi que, cuando se aplican como una composición novedosa que consta de tres antígenos, muestran resultados superiores en un inmunoanálisis para detectar anticuerpos específicos contra T. cruzi en cuanto a su especificidad y sensibilidad. Los ejemplos en los que la composición consta de más de tres polipéptidos o combinaciones distintas de 1F8, JL7 y cruzipaína son ejemplos comparativos.

Ejemplo 1

Clonación y purificación de los antígenos de Trypanosoma cruzi con fusión por chaperona

Los genes sintéticos que codifican los antígenos de T. cruzi indicados en la tabla 1 con el prefijo "EcSS" se adquirieron de Eurofins MWG Operan (Ebersberg, Alemania). Sobre la base del plásmido de expresión pET24a de Novagen (Madison, Wl, EE. UU.) se realizaron los siguientes pasos de clonación. El vector se digirió con Ndel y Xhol y se insertó un casete semisintético que comprende SlyD en tándem y los respectivos antígenos de T. cruzi. El inserto del plásmido resultante se secuenció y se halló que codificaba la proteína de fusión deseada. Las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos de T. cruzi (SEQ ID NO. 1-5) y el resto chaperón de E. co//'SlyD (SEQ ID NO. 6) que da como resultado proteínas de fusión se muestran en el protocolo de secuencias de la presente invención. Dos unidades SlyD (SlyD en tándem) se fusionaron al extremo aminoterminal del respectivo polipéptido de T. cruzi. Todas las variantes recombinantes de polipéptidos de fusión de T. cruzi contenían un marcador de hexahistidina carboxiterminal (SEQ ID NO. 8) para facilitar la purificación y el nuevo plegamiento asistidos por Ni-NTA. Los SEQ ID NO. se resumen en la tabla 1.

Todos los antígenos de fusión por chaperona de T. cruzi se purificaron y se plegaron de nuevo de acuerdo con un protocolo idéntico, independientemente de la presencia de residuos de cisteína en la cadena polipeptídica concreta. Se cultivaron células de E. coli BL21 (DE3) que albergaban el plásmido de expresión en medio LB más canamicina (30 |jg/ml) con una DCteoo del , y se indujo la sobreexpresión citosólica mediante la adición de ¡sopropil-p-D-tiogalactósido (IPTG) con una concentración final de 1 mM a una temperatura de cultivo de 37 °C. Cuatro horas después de la inducción, las células se recogieron mediante centrifugación (20 min a 5000 xg), se congelaron y se almacenaron a -20 °C. Para la lisis celular, la pastilla congelada se suspendió de nuevo en fosfato de sodio 25 mM, pH 8,5, MgCb 6 mM, 10 U/ml de Benzonase®, 1 comprimido de Complete® y 1 comprimido de Complete® sin EDTA por cada 50 mi de tampón (cóctel inhibidor de proteasas) y la suspensión resultante se Usó mediante homogeneización a alta presión. El Usado crudo se complementó hasta GuHCI (clorhidrato de guanidina) 7 M, fosfato de sodio 50 mM, imidazol 5 mM y se agitó durante una hora. Después de la centrifugación, el sobrenadante se aplicó en una columna de Ni-NTA (nfquel-nitrilotriacetato) previamente equilibrada en tampón A (fosfato de sodio 50 mM, pH 8,5, GuHCI 7,0 M, imidazol 5 mM). Con el fin de prevenir la formación prematura de puentes disulfuro y la mezcla aleatoria de disulfuros, particularmente para SS-C-cruzipaína, se incluyó TCEP 5 mM en el tampón de lavado como agente reductor que es compatible con las columnas de quelato metálico. Después de una etapa de lavado, el tampón caotrópico A se desplazó con fosfato de sodio 50 mM, pH 8,5, cloruro de sodio 100 mM, imidazol 10 mM, TCEP 5 mM, 1 comprimido de Complete® sin EDTA por cada 50 mi de tampón (cóctel inhibidor de proteasas) con el fin de inducir el nuevo plegamiento conformacional de la proteína unida a la matriz. Posteriormente, se indujo el plegamiento oxidativo (es decir, la formación de puentes oxidativos de los residuos de cisterna) lavando con fosfato de sodio 50 mM, pH 8,5, cloruro de sodio 100 mM, imidazol 10 mM, 1 comprimido de Complete® sin EDTA por cada 50 mi de tampón. Debido a la alta concentración efectiva de iones de N¡2+ divalentes, la formación de puentes disulfuro dentro de la proteína de fusión unida a la matriz es un proceso muy rápido. Antes de la elución, la concentración de imidazol se elevó a 40 mM para eliminar las proteínas contaminantes. Las proteínas de fusión naturales se eluyeron después aplicando una concentración de imidazol de 250 mM en fosfato de sodio 50 mM, pH 8,5, cloruro de sodio 100 mM. Las fracciones que contenían proteínas se evaluaron para determinar su pureza mediante SDS-PAGE y se agruparon. Finalmente, las proteínas se sometieron a cromatografía de exclusión por tamaño y las fracciones que contenían proteínas se agruparon y se concentraron.

Ejemplo 2

Clonación y purificación de los antígenos de Trypanosoma cruzi sin fusión por chaperona

Los genes sintéticos que codifican los antígenos de T. cruzi como se enumeran en la tabla 1 se adquirieron de Eurofins MWG Operan (Ebersberg, Alemania). Sobre la base del plásmido de expresión pET24a de Novagen (Madison, Wl, EE. UU.) se realizaron los siguientes pasos de clonación. Para los antígenos de T. cruzi 1F8, JL7, KMP-11 o C-cruzipaína el vector se digirió con Nde I o BamH1, respectivamente, y se insertaron Xho I y un casete que comprende los respectivos antígenos de T. cruzi (SEQ ID NO. 1-4). El inserto del plásmido resultante se secuenció y se halló que codificaba la proteína deseada. Las secuencias de aminoácidos de las proteínas resultantes se muestran en el protocolo de secuencias de la presente invención. Todas las variantes recombinantes de polipéptidos de T. cruzi contenían un marcador de hexahistidina carboxiterminal para facilitar la purificación y el nuevo plegamiento asistidos por Ni-NTA. Los SEQ ID NO. se resumen en la tabla 1.

Todos los antígenos de T. cruzi sin fusión por chaperona se purificaron de acuerdo con el siguiente protocolo. Se cultivaron células de E. coli BL21 (DE3) que albergaban el plásmido de expresión en medio LB más canamicina (30 pg/ml) con una DOeoo del , y se indujo la sobreexpresión citosólica mediante la adición de ¡sopropil-p-D-tiogalactósido (IPTG) con una concentración final de 1 mM a una temperatura de cultivo de 37 °C. Cuatro horas después de la inducción, las células se recogieron mediante centrifugación (20 min a 5000 x g), se congelaron y se almacenaron a -20 °C. Para la lisis celular, la pastilla congelada se suspendió de nuevo en fosfato de sodio 25 mM, pH 8,5, MgCÍ26 mM, 10 U/ml de Benzonase®, 1 comprimido de Complete® y 1 comprimido de Complete® sin EDTA por cada 50 mi de tampón (cóctel inhibidor de proteasas) y la suspensión resultante se Usó mediante homogeneización a alta presión. El Usado crudo se complementó con fosfato sódico hasta 50 mM, imidazol 10 mM. Después de la centrifugación, el sobrenadante se aplicó en una columna de Ni-NTA (níquel-nitrilotriacetato) previamente equilibrada en tampón A (fosfato de sodio 50 mM, pH 8,5, cloruro de sodio 100 mM, imidazol 10 mM). Antes de la elución, la concentración de imidazol se elevó a 40 mM para eliminar las proteínas contaminantes. Las proteínas se eluyeron después aplicando una concentración de imidazol de 250 mM. Finalmente, las proteínas se sometieron a cromatografía de exclusión por tamaño y las fracciones que contenían proteínas se agruparon y se concentraron. - En la tabla 1, EcSS o SS como prefijo denota un resto de SlyD en tándem que se fusiona por el extremo N al polipéptido de T. cruzi.

Tabla 1: Antígenos de T. cruzi obtenidos de acuerdo con los ejemplos 1 y 2

Ejemplo 3

Acoplamiento de restos de biotina y rutenio a antígenos de T. cruzi

Los grupos s-amino de Usina de las proteínas recombinantes se modificaron a concentraciones de proteína de ~10mg/ml con marcadores de biotina y rutenio activados con N-hidroxi-succinimida, respectivamente. La relación molar marcador/proteína osciló de 3:1 a 30:1, en función de la proteína respectiva. El tampón de reacción fue fosfato de potasio 50 mM (pH 8,5), KCI 150 mM, EDTA 0,5 mM. La reacción se llevó a cabo a temperatura ambiente durante 30 minutos y se detuvo añadiendo L-lisina tamponada hasta una concentración final de 10 mM. Después de la reacción de acoplamiento, se eliminó el marcador libre sin reaccionar pasando el conjugado de proteína bruta sobre una columna de filtración en gel (Superdex 200 Hl Load).

Ejemplo 4

Evaluación de la reactividad inmunitaria de los antígenos recombinantes de T. cruzi en una prueba de inmunodiagnóstico; detección de anticuerpos contra T. cruzi en sueros humanos

La reactividad inmunitaria de las diferentes proteínas se evaluó en un analizador automático cobas® e601 (Roche Diagnostics GmbH). Las mediciones se llevaron a cabo en formato en sándwich de doble antígeno. De este modo, el conjugado de biotina (es decir, el antígeno de captura) se inmoviliza en la superficie de una microesfera magnética recubierta de estreptavidina, mientras que el antígeno de detección tiene un catión de rutenio complejado como resto de señalización. La detección de señales en el cobas® e601 se basa en la electroquimioluminiscencia.

En presencia de un analito de inmunoglobulina específico, el complejo cromógeno de rutenio se une mediante un puente a la fase sólida y emite luz a 620 nm después de su excitación en un electrodo de platino. La salida de señal está en unidades de luz arbitrarias. Las mediciones se realizaron con muestras de suero y plasma humano positivas y negativas contra T. cruzi adquiridas de varias fuentes. Todas las muestras se analizaron con tres ensayos de Chagas disponibles comercialmente (Architect Chagas de Abbott Laboratories, bioelisa Chagas de Biokit S.A, NovaLisa Chagas IgG ELISA de NovaTec) de acuerdo con las instrucciones del fabricante respectivo.

El ensayo Architect Chagas utiliza varios polipéptidos de fusión de varios epítopos, cada uno de los cuales comprende varios polipéptidos recombinantes de T. cruzi que contienen los antígenos PEP-2, TcD, TcE, TcLo1.2, TcR27, FCaBP (= 1F8), TcR39, FRA (= JL7), SAPA y MAP, que dan lugar a diez antígenos diferentes. El bioelisa Chagas utiliza antígenos recombinantes PEP-2, TcD, TcE y TcLo1.2. El NovaLisa Chagas IgG ELISA utiliza el polipéptido de fusión de varios epítopos TcF que comprende los antígenos PEP-2, TcD, TcE y TcLo1.2. Téngase en cuenta que en la nomenclatura de antígenos de T. cruzi, los antígenos idénticos o muy similares a menudo tienen varios sinónimos, como por ejemplo, FCaBP = 1F8 o PEP-2 es sinónimo de B13 y Ag2 y TcR39; para una revisión, véase por ejemplo Silveira et al, Trends in Parasitol. 2001, vol. 17 n.° 6 o Marcipar et al., Current Topics in Trop. Med. 16 de marzo de 2012, p.273-398.

Las variantes recombinantes de antígenos de T. cruzi de acuerdo con la invención se evaluaron por parejas en un formato de inmunoanálisis en sándwich de doble antígeno (DAGS). Por ejemplo, se evaluó un conjugado de biotina-SS-1F8 junto con un conjugado de complejo de rutenio-SS-1F8 a una concentración de 800 ng/ml cada uno en un tampón de ensayo que contiene MES 50 mM (pH 6,5), NaCI 150 mM, polidocanol al 0,1 %, albúmina bovina al 0,2%, N-metilisotiazolona al 0,01 %, Oxy-Pyrion al 0,1 %. En todas las mediciones se incluyó en el tampón de reacción EcSIyD-EcSIyD (SS) polimerizado químicamente y no marcado con gran exceso (20 g/ml) como sustancia contra la interferencia para evitar reacciones cruzadas inmunitarias a través de la unidad de fusión por chaperona. Se utilizaron sueros humanos negativos frente a T. cruzi como controles. El volumen de muestra utilizado fue de En la tabla 2 (figuras 1a y 1b) se muestra la actividad inmunitaria de las variantes de fusión por chaperona de antígenos de T. cruzi (véase el listado de secuencias y el resumen de secuencias, más arriba). Las primeras cinco muestras son sueros humanos normales, las muestras a continuación son muestras positivas de anticuerpos contra T. cruzi probadas. El umbral de trabajo para la evaluación de los antígenos de Chagas descritos se eligió arbitrariamente como el promedio de seis veces de los cinco sueros humanos normales, para discriminar suficientemente entre las muestras positivas y negativas para Chagas. Todos los resultados que se consideran positivos aparecen en negrita.

Es obvio que la reactividad de las variantes de antígenos de T. cruzi depende en gran medida del suero de cada paciente. Todas las variantes de antígenos de acuerdo con la invención muestran una antigenicidad significativa. En la tabla 3 (fig. 2) se muestran los resultados de las muestras analizadas con tres ensayos de Chagas disponibles comercialmente (Architect Chagas, bioelisa Chagas y Novalisa Chagas IgG ELISA; ver más arriba los antígenos e ingredientes). Se determina que todas las muestras son positivas para Chagas de acuerdo con un enfoque mayoritario. Esto significa que si dos de los tres ensayos proporcionan un resultado positivo y el tercer análisis es negativo, la muestra se considera positiva porque la mayoría de los resultados del análisis (2:1) son positivos. Todos los resultados individuales que se consideran positivos aparecen en negrita.

Como puede verse en la tabla 3, solo unas pocas muestras reaccionan con todos los antígenos recombinantes descritos en la presente invención. Aunque EcSS-C-cruzipaína fue el único antígeno capaz de reaccionar con todas las muestras positivas para Chagas investigadas en la tabla 3 (fig. 2), una detección fiable de anticuerpos de Chagas en sueros humanos necesita una composición que comprenda más de un antígeno específico.

Ejemplo 5

Especificidad de las mezclas de antígenos recombinantes de T. cruzi

Con el fin de evaluar la especificidad (es decir, la tasa de resultados negativos verdaderos) de los antígenos recombinantes de Chagas mencionados anteriormente, se generaron dos prototipos de kits con diferentes mezclas de antígenos. La variante de kit 1 se creó con EcSS-1F8, EcSS-JL7 y EcSS-C-cruzipaína. La variante de kit 2 incluía además EcSS-KMP-11.

Los conjugados de biotina y rutenio de las variantes polipeptídicas de antígenos de T. cruzi se aplicaron a concentraciones de 100 ng/ml cada una. En todas las mediciones se incluyó en el tampón de reacción el reactivo contra la interferencia EcSIyD-EcSIyD (SS) polimerizado químicamente y no marcado con gran exceso (20 pg/ml). El volumen de muestra utilizado fue de 30 pl.

Tabla 4:

Especificidad de las mezclas de antígenos recombinantes de T. cruzi en comparación con los ensayos comerciales contra Chagas

* >seis veces el promedio de los sueros humanos normales.

** instrucciones de uso.

Se evaluó a 494 donantes de sangre de la Cruz Roja Bávara (muestras normales) con las dos variantes del kit y los resultados se resumen en la tabla 4 anterior.

Solo una de las 494 muestras fue reactiva con las dos variantes del kit de la presente invención. Esta muestra se investigó más a fondo mediante el NovaLisa Chagas IgG ELISA de NovaTec con un hallazgo no reactivo. La especificidad resultante del 99,80 % es similar a la de otros ensayos comerciales contra Chagas.

Ejemplo 6

Sensibilidad de las mezclas de antígenos recombinantes de T. cruzi

La sensibilidad (es decir, la tasa de positivos verdaderos) de las dos variantes de kit descritas en el ejemplo 5 se comparó con dos ensayos de Chagas disponibles en el mercado (bioelisa Chagas de Biokit SA, Ortho T. cruzi ELISA Test System de Ortho-Clinical Diagnostics) mediante mediciones de series lineales de dilución de los dos patrones diferentes de la OMS para anticuerpos de Chagas (Tcl y Tcll, Tcl = genotipo I de T. cruzi; Tcll = genotipo II de T. cruzi) en matriz de suero humano (tabla 5, fig. 3). Todos los resultados que se consideran positivos aparecen en negrita.

No hay diferencia significativa entre las variantes de kit 1 y 2 de la presente invención en experimentos de sensibilidad a la dilución. Sin embargo, ambas variantes del kit son de 4 a 6 pasos de dilución lineal más sensibles que los ensayos de la competencia bioelisa Chagas, el Ortho T. cruzi ELISA o el Architect Chagas. Los antígenos de T. cruzi incluidos en el bioelisa Chagas y el Architect Chagas se describen en el ejemplo 4. El Ortho T. cruzi ELISA se basa en un Usado celular de T. cruzi y no contiene antígenos recombinantes.

Un aumento de la sensibilidad a la dilución como el que se logra con la presente invención significa que también puede detectarse de manera fiable la presencia de los anticuerpos a una concentración muy baja de anticuerpos. Ejemplo 7

Comparación de la reactividad inmunitaria de antígenos recombinantes de T. cruzi con y sin fusión por chaperona

La reactividad inmunitaria de los antígenos recombinantes de T. cruzi con fusión por chaperona se demostró en los ejemplos anteriores. Con el fin de demostrar que la reactividad inmunitaria de los antígenos de T. cruzi de acuerdo con la invención es independiente de la presencia de un compañero de fusión, se evaluaron también en cuanto a su reactividad inmunitaria los antígenos recombinantes de T. cruzi sin fusión por chaperona como se describe en el ejemplo 2. En la tabla 6 (fig. 4) se resumen los resultados de las mediciones.

Los conjugados de biotina y rutenio de las variantes polipeptídicas de antígenos de T. cruzi se aplicaron a concentraciones de 100 ng/ml cada una. En todas las mediciones se incluyó en el tampón de reacción el reactivo contra la interferencia EcSIyD-EcSIyD (SS) polimerizado químicamente y no marcado con gran exceso (20 pg/ml). El volumen de muestra utilizado fue de 30 pl.

Como se puede concluir a partir de los datos de medición de la tabla 6 (fig. 4), las variantes de antígenos de T. cruzi sin una compañera de fusión por chaperona también muestran una antigenicidad significativa. Las diferencias en la señal observada pueden explicarse por diferentes tasas de marcado como consecuencia de diferentes números de residuos de Usina accesibles (con o sin fusión de SlyD). Otro aspecto podrían ser los diferentes sitios de marcado que pueden ocasionar una afectación diferente de los epítopos. Además, las concentraciones molares de los antígenos sin fusión por chaperona son más altas que sus homologas que contienen dicho compañero de fusión. En resumen, la idoneidad de los polipéptidos de T. cruzi para la detección de anticuerpos contra T. cruzi es independiente de una compañera de fusión por chaperona. Solo es necesaria la secuencia del antígeno polipeptídico específico de T. cruzi para detectar los anticuerpos específicos contra T. cruzi.

Ejemplo 8

Influencia de los iones de calcio en la reactividad inmunitaria del antígeno recombinante 1F8 de T. cruzi Para investigar la influencia de los iones de calcio en la reactividad inmunitaria del antígeno recombinante 1F8 de T. cruzi, también llamado Tc24, Tc28 o FCaBP (proteína flagelar fijadora de calcio), una conocida proteína fijadora de calcio de Trypanosoma cruzi, el tampón de ensayo como se describe en el ejemplo 4 se complementó con cloruro de calcio a una concentración de 1 mM. Se añadieron los conjugados de biotina y rutenio de EcSS-1F8 a concentraciones de 200 ng/ml cada uno. En todas las mediciones se incluyó en el tampón de reacción el reactivo contra la interferencia EcSIyD-EcSIyD (SS) polimerizado químicamente y no marcado con gran exceso (20 pg/ml). El volumen de muestra utilizado fue de 30 pl.

La mayoría de los sueros de pacientes infectados por Chagas en la tabla 7 (fig. 5) mostraron un claro aumento de la reactividad inmunitaria del antígeno 1F8 de T. cruzi debido a la adición de iones de calcio al tampón de ensayo. En algunos sueros positivos para Chagas la señal podía duplicarse. Las diferencias en la señal observada pueden explicarse por patrones heterogéneos de las respuestas inmunitarias de cada paciente, como también se muestra en la tabla 2 (fig. 1a y 1 b).

El aumento de la reactividad inmunitaria del antígeno 1F8 de T. cruzi debido a la adición de iones de calcio también se pudo observar cuando se aplicó la composición polipeptídica de acuerdo con la invención que consta de tres polipéptidos 1F8, JL7 y cruzipaína (datos no mostrados).

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Una composición de polipéptidos adecuada para detectar anticuerpos contra Trypanosoma cruzi en una muestra biológica aislada, consistiendo dicha composición en tres polipéptidos producidos de forma recombinante o sintética específicos para Trypanosoma cruzi, en la que dichos polipéptidos son 1F8, JL7 y cruzipaína.

2. Una composición de polipéptidos de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el polipéptido 1F8 comprende la SEQ ID NO. 1, el polipéptido JL7 comprende la SEQ ID NO. 2 y el polipéptido cruzipaína comprende la SEQ ID NO. 3.

3. Una composición de polipéptidos de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en la que dicha composición contiene iones de calcio en una concentración de 0,1 a 10 milimoles por litro.

4. Un procedimiento para producir una composición soluble e inmunorreactiva de polipéptidos adecuada para detectar anticuerpos contra Trypanosoma cruzi que consta de tres polipéptidos producidos de forma recombinante; dicho procedimiento comprende las etapas de

a) cultivar células anfitrionas transformadas con un vector de expresión que comprende, unida de forma operativa, una molécula de ADN recombinante que codifica un primer polipéptido 1F8 de Trypanosoma cruzi, b) la expresión de dicho polipéptido de Trypanosoma cruzi y

c) la purificación de dicho polipéptido de Trypanosoma cruzi,

d) repetir los pasos a) a d) con un vector de expresión que comprende, unida de forma operativa, una molécula de ADN recombinante que codifica un segundo polipéptido JL7 de T. cruzi,

e) repetir los pasos a) a d) con un vector de expresión que comprende, unida de forma operativa, una molécula de ADN recombinante que codifica un tercer polipéptido cruzipaína de T. cruzi,

f) formar una mezcla de los polipéptidos de T. cruzi obtenidos en las etapas c), d) y e), produciendo así una composición soluble e inmunorreactiva de polipéptidos adecuada para detectar anticuerpos contra Trypanosoma cruzi.

5. Un procedimiento para detectar anticuerpos específicos contra Trypanosoma cruzi en una muestra aislada en el que se usa una composición de polipéptidos de Trypanosoma cruzi de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 como reactivo de captura o como compañero de unión para dichos anticuerpos contra Trypanosoma cruzi.

6. Un procedimiento para detectar anticuerpos específicos contra Trypanosoma cruzi en una muestra aislada; dicho procedimiento comprende

a) formar un una mezcla de reacción inmunitaria mezclando una muestra de líquido corporal con una composición de polipéptidos de Trypanosoma cruzi de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, b) mantener dicha mezcla de reacción inmunitaria durante un período suficiente para permitir que los anticuerpos presentes en la muestra de líquido corporal contra dicha composición de muestra de polipéptidos inmunorreaccionen con dicha composición de polipéptidos de Trypanosoma cruzi para formar un producto de reacción inmunitaria; y

c) detectar la presencia o la concentración de cualquier cantidad de dicho producto de reacción inmunitaria.

7. Un procedimiento para detectar anticuerpos específicos contra Trypanosoma cruzi en una muestra aislada de acuerdo con la reivindicación 6, en el que dicha reacción inmunitaria se lleva a cabo en un formato en sándwich de doble antígeno que comprende

a) añadir a dicha muestra una primera composición de polipéptidos de Trypanosoma cruzi de acuerdo con la reivindicación 1, que pueden unirse directa o indirectamente a una fase sólida, y cada uno de dichos primeros polipéptidos de Trypanosoma cruzi lleva un grupo efector que forma parte de un par de unión bioafín, y una segunda composición de polipéptidos de Trypanosoma cruzi de acuerdo con la reivindicación 1, y cada uno de dichos segundos polipéptidos de Trypanosoma cruzi lleva un marcador detectable, en el que dichos primeros y segundos polipéptidos de Trypanosoma cruzi se unen específicamente a dichos anticuerpos contra Trypanosoma cruzi, b) formar una mezcla de reacción inmunitaria que comprende los primeros polipéptidos de Trypanosoma cruzi, el anticuerpo de la muestra y los segundos polipéptidos de Trypanosoma cruzi en la que se añade una fase sólida que lleva el grupo efector correspondiente de dicho par de unión bioafín antes, durante o después de la formación de la mezcla de reacción inmunitaria,

c) mantener dicha mezcla de reacción inmunitaria durante un período suficiente para permitir que los anticuerpos de Trypanosoma cruzi contra dichos primer y segundo polipéptidos de Trypanosoma cruzi en la muestra de líquido corporal inmunorreaccionen con dichos primer y segundo polipéptidos de Trypanosoma cruzi para formar un producto de reacción inmunitaria,

d) separar la fase líquida de la fase sólida,

e) detectar la presencia de cualquiera de dichos productos de reacción inmunitaria en la fase sólida o líquida o ambas.

8. Un procedimiento para detectar anticuerpos específicos contra Trypanosoma cruzi de acuerdo con la reivindicación 7, en el que dicho primer polipéptido de Trypanosoma cruzi lleva un resto de biotina, y dicho segundo polipéptido de Trypanosoma cruzi está marcado con un complejo electroquimioluminiscente de rutenio.

9. Uso de una composición de polipéptidos de Trypanosoma cruzi de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en una prueba de diagnóstico in vitro para la detección de anticuerpos contra Trypanosoma cruzi.

10. Un kit de reactivos para la detección de anticuerpos contra Trypanosoma cruzi, que comprende una composición de polipéptidos de Trypanosoma cruzi de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.