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Inmunoensayos, métodos para llevar a cabo inmunoensayos, kits de inmunoensayo y método para fabricar kits de inmunoensayo
ES2620233T3
Spain
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English - Inventor
Alexander Daniel Edwards Nuno Miguel Fernandes Reis Malcolm Robert Mackley Nigel Kenneth Harry Slater - Current Assignee
- Cambridge Enterprise Ltd
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Application ES11711614.5T events
2017-06-28
Application granted
2017-06-28
Status
Active
2031-03-23
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Description
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DESCRIPCION
Inmunoensayos, metodos para llevar a cabo inmunoensayos, kits de inmunoensayo y metodo para fabricar kits de inmunoensayo
Antecedentes de la invencion Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a inmunoensayos, metodos para llevar a cabo inmunoensayos, kits de inmunoensayo y metodos para fabricar kits de inmunoensayo. En particular, la invencion tiene relevancia para la tecnologia de inmunoensayo capilar (especialmente microcapilar).
Tecnica relacionada
Los inmunoensayos (IE) son herramientas bioquimicas poderosas que permiten la medida de la concentration de una sustancia en una muestra medica, biotecnologica o ambiental. Los IE normalmente utilizan la interaction especifica entre los anticuerpos y sus antigenos, y, se usan para medir las biomoleculas y las pequenas moleculas en diversas aplicaciones que incluyen la detection de patogenos, infection, farmacos, biomarcadores de enfermedades, contaminantes ambientales, agentes biologicos y toxinas en productos alimenticios. Los IE heterogeneos actuan inmovilizando un antigeno o capturando un anticuerpo en, por ejemplo, una superficie plastica. La presencia de un antigeno o anticuerpo en una muestra se puede determinar despues mediante varios metodos, siendo el mas comun el marcado tanto del antigeno como del anticuerpo. Los marcadores comunes incluyen enzimas, tal y como se usan en el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Otros marcadores incluyen oro coloidal (tal como se usa en los ensayos de flujo lateral), radioisotopos tales como I-125, tal como se usan en el radioinmunoensayo (RIA), marcadores magneticos tal como se usan en inmunoensayos magneticos (MIA) y marcadores fluorescentes.
La plataforma mas comun para los IE en los laboratorios de ciencias de la vida son las placas de microtitulacion. El procedimiento experimental para un IE de placa de microtitulacion normalmente comienza por recubrir las superficies de los micropocillos (durante un periodo de tiempo prolongado, por ejemplo, durante una noche) con el antigeno o el anticuerpo de captura, seguido de un lavado vigoroso. Las muestras despues se anaden a los pocillos y se incuban durante un tiempo definido, normalmente 2-8 horas para una sensibilidad maxima. Los anticuerpos de deteccion se anaden despues a los pocillos tras otro lavado exhaustivo y se incuban durante mas de 1 hora. Esto da como resultado un proceso largo y tedioso y un alto consumo de reactivos caros (los volumenes operacionales minimos para una placa de microtitulacion de 96 pocillos son de 50-100 |jl). Tambien se requiere un equipamiento especial para la deteccion de la senal (por ejemplo, un lector de microplaca), lo que supone un coste de la inversion de hasta 23.073 €.
Para abordar los problemas de tiempos prolongados de incubation y alto consumo de reactivos caros tipicos de ensayos basados en placas de microtitulacion, se han desarrollado tecnicas de IE alternativas que utilizan superficies de plastico que tienen una gran area superficial especifica respecto al volumen, tales como el tipo mostrado mediante dispositivos de microperlas o microfluidicos en lugar de placas de microtitulacion.
Las microperlas fluorescentes o magneticas ofrecen un area superficial de especificidad muy alta para la inmovilizacion del antigeno o el anticuerpo de captura y puede multiplexarse o automatizarse por medio de un sistema robotico y un citometro de flujo para la deteccion de la senal. Sin embargo, para instalar un IE basado en microperlas normalmente se requiere una inversion de 57.682-115.364 €.
Los IE de microperlas ofrecen un area superficial de especificidad muy alta para la inmovilizacion del antigeno o del anticuerpo de captura. El IE de microperlas ofrece ventajas sobre el IE de placa de microtitulacion, siendo mas adecuado para la automatization por medio de un sistema robotico. Una ventaja adicional es la posibilidad de medicion de analito multiplex en donde una muestra se analiza por multiples analitos de manera simultanea. Se requiere un equipo especializado para detectar la senal generada mediante IE de microperlas, tal como un citometro de flujo o un analizador de microperlas para la deteccion de la senal. Por lo tanto, el equipo requerido para instalar un IE basado en microperlas requiere una inversion de 30.000-100.000 £.
Ademas, algunas tecnologias microfluidicas recientes ofrecen la posibilidad de procesar multiples muestras a traves de la automatizacion, requiriendo volumenes minimos de la muestra. Varios tipos de tecnologias de IE microfluidico se revisan en Bange et al. 2005.
Yacoub-George et al. 2007 desvelan un aparato microfluidico para llevar a cabo inmunoensayos. Su aparato incluye 10 capilares de silice condensada contenidos en un cartucho especialmente disenado. El cartucho esta acoplado a bombas microfluidicas para el control individual del fluido tipo y el flujo de fluido proporcionado para cada capilar. Diferentes elementos capilares tienen diferentes anticuerpos inmovilizados en la superficie interna del agujero. El aparato tambien incluye un modulo detector de luz especialmente disenado para medir los resultados del inmunoensayo de los capilares.
Sin embargo, para muchas aplicaciones, el coste de production de dispositivos microfluidicos, por ejemplo, mediante
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litografia con detectores de senal integrados sigue siendo muy alto para ser rentable para la realizacion de IE en muchos laboratorios de ciencias de la vida, laboratorios de diagnostico clmico u otros laboratorios.
Otros tipos de IE conocidos emplean elementos capilares, vease, por ejemplo, el documento US-A-5.624.850. En estos ensayos, el orificio del capilar proporciona un conducto de fluido para una muestra y las proteinas antigenicas o los anticuerpos se inmovilizan en la superficie interna del orificio. Los IE basados en capilares proporcionan una ventaja en terminos del area superficial disponible del orificio capilar en comparacion con el volumen de muestra requerido para los IE basados en placas de microtitulacion. Ademas, las elevadas relaciones de superficie con respecto al volumen de los capilares en comparacion con las placas de microtitulacion significan que la longitud de los tiempos de incubacion requeridos, por ejemplo, para la union antigeno-anticuerpo, se acortan.
Se han descrito varios aparatos para la realizacion de IE basados en capilares. Por ejemplo, el documento US-A-4.116.638 desvela un dispositivo para llevar a cabo IE que usan multiples capilares de manera simultanea. El dispositivo comprende un vial con un disco circular insertado en el vial y aberturas en el disco en el que se pueden insertar los capilares. Ademas, el disco tiene una abertura mayor en su centro en la que se puede insertar un tubo. Este tubo se puede usar para anadir, por ejemplo, mezclas al vial que luego se recogen en los capilares.
Otro aparato para inmunoensayos basados en capilares se describe en el documento US-A-4.883.760. En un ejemplo, se mantienen uno o mas capilares en una estructura de soporte flexible y se suspenden inicialmente con sus extremos inferiores libres. Las muestras, etc. se introducen en los capilares a traves de una apertura en el soporte. Los capilares se pueden drenar despues desviando la parte superior del soporte hacia abajo hasta que los extremos inferiores de los capilares tocan un material absorbente situado debajo de ellos.
Los documentos US-A-5.976.896 y US-A-6.517.778 tambien describen un aparato para inmunoensayos basados en capilares. En un ejemplo, un cartucho que comprende cuatro tubos capilares se usa para examinar diferentes analitos en una muestra de leche. Tres de los cuatro capilares en el cartucho estaban cubiertos con un reactivo diferente permitiendo por lo tanto la detection de diferentes analitos en un inmunoensayo competitivo. El cuarto capilar se dejaba en blanco y actuaba como un control.
El documento US-A-4.590.157 desvela, en una realizacion, un dispositivo formado mediante la conexion de varios elementos capilares en serie. Cada elemento capilar esta formado por un material transparente. Los ejemplos adecuados dados son cristal, cloruro de polivinilo o poliestireno. Cada elemento capilar tiene una longitud de aproximadamente 2 cm, un diametro de orificio interno de aproximadamente 1 mm y un diametro externo de aproximadamente 2 mm. Cada elemento capilar tiene diferentes anticuerpos, antigenos o sustancias haptenicas adsorbidas o unidas de manera covalente a la superficie del orificio. En uso, se extrae una muestra de fluido a traves de la serie de elementos capilares. El tipo de inmunoensayo realizado es normalmente un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). En una realizacion alternativa, se disponen en paralelo tres elementos capilares, siendo cada tubo capilar capaz de indicar la presencia de un analito (digoxina) en diferentes intervalos de concentration predeterminados. De este modo, se proporciona un ensayo cuantitativo. La muestra desconocida se extrae de los elementos capilares paralelos por aspiration mediante tres embolos correspondientes. En cada realizacion, los resultados del ensayo se determinan mediante una evaluation del cambio de color asociada con cada elemento capilar. Una divulgation similar se proporciona en Healey et al., 1983.
Tambien se han descrito los diferentes metodos para detectar senales producidas en IE basados en capilares. Por ejemplo, el documento US-A-4.716.121 describe un inmunoensayo fluorescente basado en capilares en el que se inserta una fibra optica en el capilar. La iluminacion de la fibra da lugar a una onda evanescente que se produce en la muestra dentro del capilar que a su vez excita complejos marcados con fluorescencia. La fluorescencia resultante entonces entra en la fibra y se recolecta por un fluorimetro.
Los capilares tambien se han usado como dispositivos de medida en inmunoensayos. Por ejemplo, el documento US-A-4.454.235 describe un aparato para desarrollar inmunoensayos en los que se usa un capilar para transferir una cantidad precisa de un primer recipiente que contiene una mezcla de la muestra y agente fluorogenico a un segundo recipiente que contiene un segundo reactivo. En este caso, el tubo capilar se mantiene en un soporte de manera que al menos un extremo del capilar es accesible al fluido. Una vez que se ha transferido la mezcla al segundo recipiente, la fluorescencia se mide colocando el segundo recipiente en un fluorometro.
Otro sistema para llevar a cabo IE se describe en el documento US-A-6.340.598. En este sistema, un biosensor que comprende una guia de onda planar se usa para detectar la presencia de un analito en una muestra. La guia de onda en este caso forma al menos una pared del reservorio de la muestra y se posiciona una fuente de luz para enfocar la luz en la guia de onda, en la que la reflexion interna en la guia de onda lleva a la production de una luz evanescente. El aparato ademas tiene un detector para detectar la fluorescencia emitida mediante moleculas traza en una solution de ensayo en respuesta a la estimulacion con luz evanescente.
El documento JP 2002-040028 describe un dispositivo de inmunoensayo capilar que incluye un material base que lleva un material funcional y una fase movil compuesta de particulas de fase solida que incluyen el material diana. El documento WO 2008/063406 describe una plataforma para ensayos de union con capacidad de multiplexacion dual.
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Sumario de la invencion
Los presentes inventores observan que hay desventajas asociadas a las tecnologias de inmunoensayo disponibles en la practica.
En particular, las tecnologias de IE conocidas requieren el uso de volumenes relativamente grandes de reactivo y/o requieren lectores complejos dedicados a llevar a cabo las medidas del IE y/o no son susceptibles de la produccion en masa.
Por consiguiente, los presentes inventores han ideado la presente invencion con el fin de abordar una o mas de estas desventajas.
Tal como se ha discutido anteriormente, muchos tipos de inmunoensayo dependen de la interrogacion optica para determinar el progreso y/o el resultado del inmunoensayo. Los presentes inventores han comprendido que una barrera para tratar una o mas de las desventajas esbozadas anteriormente utilizando dispositivos de inmunoensayo a base de capilares es que puede ser dificilmente confiable interrogar los orificios capilares, en particular cuando se requiere un resultado cuantitativo del inmunoensayo. Este es particularmente el caso en el que se busca llevar a cabo inmunoensayos en multiples orificios capilares de manera sustancial simultaneamente, por ejemplo, para proporcionar redundancia en los resultados o para proporcionar diferentes inmunoensayos en diferentes orificios capilares.
Por consiguiente, en un primer aspecto preferido de la invencion, se ha proporcionado un dispositivo para llevar a cabo un inmunoensayo, el dispositivo tiene:
un cuerpo unitario con una superficie exterior y al menos dos orificios capilares que se extienden internamente a lo largo del cuerpo unitario,
en el que para cada orificio capilar una poblacion de primeros miembros de un respectivo par de union especifica se inmoviliza al menos en una porcion de la superficie del orificio capilar, siendo cada primer miembro capaz de unirse especificamente a un segundo miembro del respectivo par de union especifica,
en el que el cuerpo unitario es sustancialmente transparente a luz visible para permitir la interrogacion optica de los orificios capilares y en el que el dispositivo esta formado por un material que tiene un indice de refraccion que esta en el intervalo de 1,26 a 1,40 y esta dentro de mas o menos 0,07 del indice de refraccion de la muestra de fluido, midiendose el indice de refraccion a 20 °C con una luz de longitud de onda de 589 nm.
Los presentes inventores han comprendido que puede ser dificilmente fiable interrogar orificios capilares conocidos para su uso en tecnicas de inmunoensayo, en particular cuando se requiere un resultado cuantitativo del inmunoensayo. Los inventores han comprendido que esto se debe principalmente a los efectos opticos adversos. Por ejemplo, cuando se ve un orificio capilar desde una direccion, la luz de cerca de los lados laterales del orificio tiende a estar sujeta a un mayor grado de refraccion que la luz desde el centro del orificio.
La senal optica que se va a interrogar opticamente se genera durante el IE para determinar el nivel de analito en la muestra y esto casi siempre tiene lugar en una solucion/suspension acuosa. Los inventores, por tanto, han comprendido que formar un dispositivo de inmunoensayo capilar a partir de un material que tiene un indice de refraccion cercano al del agua permite evitar los efectos opticos adversos mencionados anteriormente hasta el punto de permitir una mejora significativa en la interrogacion optica del orificio capilar. El indice de refraccion del agua es 1,33 (cuando se mide a 20 °C con una luz de longitud de onda de 589 nm, correspondiente a la linea D del doblete de sodio amarillo). Como referencia, es de interes proporcionar en el presente documento el indice de refraccion de otros materiales en las mismas condiciones: silice condensada 1,46; poli (eter uretano) 1,49; poli (metil metacrilato) 1,49; poli (alcohol vimlico) 1,50; polietileno 1,51; polietileno de baja densidad 1,51; tereftalato de polietileno 1,57-1,58; poliestireno 1,59; poli (cloruro de vinilo) 1,54.
Por consiguiente, el dispositivo de inmunoensayo esta formado de un material que tiene un indice de refraccion que esta dentro de mas o menos 0,07 del indice de refraccion de la muestra de fluido. El indice de refraccion se mide a 20 °C con luz de longitud de onda de 589 nm.
El cuerpo unitario esta formado por un material que tiene un indice de refraccion en el intervalo de 1,26 a 1,40, midiendose el indice de refraccion a 20 °C con una luz de longitud de onda de 589 nm. Esto es adecuado, por ejemplo, cuando la muestra de fluido es diluida y acuosa.
En otro aspecto, la presente invencion proporciona un metodo para realizar un inmunoensayo para detectar la presencia o ausencia del segundo miembro de union en una muestra de fluido usando un dispositivo de acuerdo con el primer aspecto, el metodo incluye las etapas:
proporcionar una muestra de fluido en los orificios capilares del dispositivo; e interrogar opticamente los orificios capilares.
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Preferentemente, el metodo comprende incubar la muestra de fluido con la poblacion de los primeros miembros del par de union espedfica durante 20 minutos o menos, mas preferentemente durante 15 minutos o menos, lo mas preferentemente durante 10 minutos o menos. Por ejemplo, la muestra de fluido puede incubarse con la poblacion de los primeros miembros durante 10 a 20 minutos, mas preferentemente durante 10 a 15 minutos, lo mas preferentemente durante aproximadamente 10 minutos.
Los presentes inventores tambien han comprendido que la fabrication de un dispositivo de inmunoensayo basado en capilares puede ser dificil de llevar a cabo en una escala relativamente grande. Por consiguiente, los inventores han contemplado un metodo de fabricacion que permite la production de dispositivos de inmunoensayo capilar pre-cargados con poblaciones de los primeros miembros del respectivo par de union especifica para la union especifica con segundos miembros de los respectivos pares de union especifica. Los inventores han comprendido que es posible cargar los primeros miembros de un par de union especifica en una larga longitud de un cuerpo capilar (por ejemplo, 20 cm o mas larga), cortando posteriormente el cuerpo capilar en la longitud deseada para un dispositivo de inmunoensayo. En terminos generales, el cuerpo puede incluir un orificio capilar, pero esto no es preferido.
Generalmente lo que se describe en el presente documento es un metodo para fabricar un dispositivo de acuerdo con el primer aspecto, el metodo incluye:
proporcionar un cuerpo extruido que tiene al menos dos orificios capilares que se extienden internamente a lo largo del cuerpo; e insertar una respectiva carga de fluido en cada orificio capilar del cuerpo extruido, cada carga de fluido comprende dichos primeros miembros del respectivo par de union especifica, para inmovilizar los primeros miembros al menos a una portion de la
superficie del orificio capilar y formar un cuerpo extruido cargado.
Preferentemente, el metodo ademas incluye la etapa de cortar el cuerpo extruido cargado para formar el dispositivo para un inmunoensayo de una longitud requerida, en el que el cuerpo extruido cargado, antes de cortarlo, opcionalmente tiene una longitud de al menos 20 cm.
Como alternativa, el metodo puede ser un metodo para fabricar un conjunto de n dispositivos, el metodo ademas incluye cortar el cuerpo extruido cargado para formar el conjunto de n dispositivos, teniendo cada dispositivo una longitud de al menos X, en el que el cuerpo extruido cargado, antes de cortarlo, tiene una longitud de al menos nX, o una longitud de al menos 20 cm.
En otro aspecto, la presente invention proporciona un sistema de inmunoensayo para llevar a cabo inmunoensayos, teniendo el sistema una pluralidad de dispositivos de ensayo de acuerdo con el primer aspecto y un soporte para mantener la pluralidad de dispositivos de inmunoensayo.
Generalmente, en el presente documento se describe un kit de inmunoensayo que incluye un cuerpo extruido que tiene al menos dos orificios capilares que se extienden internamente a lo largo del cuerpo, el cuerpo extruido tiene una longitud de al menos 20 cm, una poblacion de primeros miembros de un respectivo par de union especifica que se inmoviliza en la superficie de cada orificio capilar, siendo cada primer miembro capaz de unirse especificamente a un segundo miembro del respectivo par de union especifica, siendo el cuerpo extruido capaz de cortarse en una longitud requerida para un inmunoensayo.
El kit se puede proporcionar en forma de bobina del cuerpo extruido cargado.
Las caracteristicas preferentes (o al menos opcionales) se establecen a continuation. A menos que el contexto indique lo contrario, estas se pueden combinar tanto individualmente como en cualquier combination con cualquier aspecto de la invencion. De manera similar, cualquier aspecto de la invencion se puede combinar con cualquier otro aspecto de la invencion.
El orificio capilar puede tener un diametro interno de al menos 10 |jm. Preferentemente, el diametro interno es al menos de 50 jm. El diametro interno puede ser de hasta 1 mm. Mas preferentemente, el diametro interno es de aproximadamente 200 jm. La forma de la section transversal del orificio capilar puede ser circular. Sin embargo, mas preferentemente es ovalada, en vista de la tecnica de fabricacion preferida para el dispositivo. En este caso, el "diametro interno" debe tomarse como el ancho maximo del orificio capilar en seccion transversal.
El dispositivo puede tener mas de dos orificios capilares formados en el cuerpo unitario. Por ejemplo, el dispositivo puede tener 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas orificios capilares. Es posible fabricar un dispositivo adecuado con 20 orificios capilares, o mas.
Preferentemente, los orificios capilares estan formados de manera sustancial paralelos entre si.
Preferentemente, un orificio capilar en el dispositivo tiene una superficie tratada de forma diferente de al menos otro orificio capilar en el dispositivo. Esto puede proporcionar una diferencia medible en la realization del inmunoensayo
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entre los orificios. Por ejemplo, un orificio puede tener una concentracion diferente de los primeros miembros adsorbidos en su superficie que otro orificio. Adicionalmente o como alternativa, un orificio puede tratarse con primeros miembros de un par de union especifico en comparacion con otro orificio. En algunas realizaciones, se puede proporcionar al menos un orificio capilar de referencia sin dichos primeros miembros adsorbidos en la superficie del orificio capilar. Ademas, es posible que dos o mas orificios capilares reciban un tratamiento identico, con el fin de proporcionar una redundancia de mediciones en el dispositivo. Ademas, es posible que dos o mas orificios capilares reciban un tratamiento identico y que uno o varios otros orificios en el mismo dispositivo reciban diferente tratamiento, para proporcionar combinaciones de estas ventajas.
Cuando el dispositivo comprende dos o mas orificios capilares, uno o mas de los orificios capilares pueden separarse de uno o ambos de sus orificios capilares vecinos en un extremo del dispositivo. Por ejemplo, cada orificio capilar del dispositivo puede separarse uno si y otro no en un extremo del dispositivo. Como alternativa, los orificios capilares pueden dividirse en conjuntos de orificios capilares y cada conjunto de orificios capilares puede separarse uno si y otro no en un extremo del dispositivo. Cada conjunto puede comprender dos o mas, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 orificios capilares. "Separarse" en este contexto significa que en un extremo del dispositivo, el orificio capilar o conjunto de orificios capilares no esta unido a uno o ambos de sus orificios capilares vecinos o conjuntos de orificios capilares.
Un metodo para fabricar un dispositivo de acuerdo con la presente invencion puede, por lo tanto, comprender una etapa de separar o desprender los orificios capilares o conjuntos de orificios capilares entre si en un extremo del dispositivo, por ejemplo, cortando el dispositivo entre los orificios capilares. La separacion de los orificios capilares o conjuntos de orificios capilares en un extremo del dispositivo facilita el contacto de cada orificio capilar o conjunto de orificios capilares con diferentes muestras de fluido cuando se usa el dispositivo para realizar un inmunoensayo.
Los orificios capilares o conjuntos de orificios capilares puede tener superficies tratadas de manera identica. Como alternativa, un orificio capilar en cada conjunto de orificios capilares en el dispositivo puede tener una superficie tratada de manera diferente de al menos otro orificio capilar en el mismo conjunto de orificios capilares. Esto puede proporcionar una diferencia medible en la realization del inmunoensayo entre los orificios del conjunto. Por ejemplo, un orificio puede tener una concentracion diferente de primeros miembros adsorbida en su superficie que otro orificio en el mismo conjunto de orificios. Adicionalmente o como alternativa, un orificio puede tratarse con primeros miembros de un par de union especifica en comparacion con otro orificio en el mismo conjunto de orificios. En algunas realizaciones, se debe proporcionar al menos un orificio capilar de referencia sin dichos primeros miembros adsorbidos a la superficie del orificio capilar en cada conjunto de orificios capilares. Ademas, es posible que dos o mas orificios capilares en cada conjunto de orificios capilares reciban el mismo tratamiento, con el fin de proporcionar una redundancia de mediciones en el dispositivo. Ademas, es posible que dos o mas orificios capilares en cada conjunto de orificios capilares reciban el mismo tratamiento y que uno o varios otros orificios en el mismo conjunto reciban un tratamiento diferente, para proporcionar combinaciones de estas ventajas. Preferentemente, los conjuntos de orificios capilares en el dispositivo son duplicados de cada uno, es decir, los orificios en un conjunto de orificios capilares se tratan con el mismo primer miembro o miembros que los orificios de otros conjuntos en el mismo dispositivo. Esto permite realizar el mismo inmunoensayo en varias muestras de fluido de manera simultanea.
Preferentemente, la superficie exterior del cuerpo incluye una primera superficie de medicion y una segunda superficie de medicion. En uso, se pretende que la luz se transmita a traves del dispositivo desde la primera superficie de medicion a la segunda superficie de medicion. Estas superficies pueden, por ejemplo, ser superficies superiores e inferiores del cuerpo. Preferentemente una o tanto la primera superficie de medicion como la segunda superficie de medicion se extienden de manera sustancial paralelamente con los ejes principales de los capilares. Una o tanto la primera superficie de medicion como la segunda superficie de medicion se pueden extender de manera sustancial paralelamente con la direction de disposition de los capilares.
Una o tanto la primera superficie de medicion como la segunda superficie de medicion puede ser sustancialmente planar. La ventaja de esto es que se pueden reducir o evitar las distorsiones opticas debidas a la refraction en las superficies de medicion. A su vez, esto puede mejorar la relation de senal con respecto al ruido de una medicion tomada mediante interrogation optica del orificio capilar. Tengase en cuenta que normalmente el cuerpo tambien incluye superficies laterales. La forma de las superficies laterales no se considera critica, ya que preferiblemente la interrogacion optica de los taladros capilares no tiene en cuenta la luz desde o cerca de las superficies laterales.
Preferentemente, el cuerpo del dispositivo esta formado por un material que tiene un indice de refraccion en el intervalo de mas o menos 0,05 del indice de refraccion de la muestra de fluido. Por ejemplo, en el caso en el que la muestra de fluido es acuosa, un limite inferior preferido para el indice de refraccion del material del cuerpo del dispositivo es 1,28. Un limite superior del indice de refraccion del material del cuerpo del dispositivo es 1,38. El indice de refraccion se mide a 20 °C con luz de longitud de onda de 589 nm. Mas preferentemente, el indice de refraccion del material del cuerpo del dispositivo es sustancialmente identico al indice de refraccion de la muestra de fluido.
Ademas de ser sustancialmente transparente a la luz visible, el material del cuerpo del dispositivo tambien puede ser sustancialmente transparente a la radiation electromagnetica en el espectro invisible, por ejemplo, luz ultravioleta (UV).
Preferentemente, la longitud del cuerpo extruido, antes de cortarlo, es al menos 50 cm. La longitud puede ser mayor,
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por ejemplo al menos 1 m, preferentemente al menos 2 m, 3 m, 4 m, o 5 m. Mas preferentemente la longitud del cuerpo extruido, antes de cortarlo, es de al menos 5 m.
El inmunoensayo se puede realizar incluyendo una etapa de interrogacion optica. Preferentemente, esto se realiza para proporcionar una imagen pixelada de uno o mas, o todos los capilares. Por ejemplo, se puede usar una camara digital. Sin embargo, mas preferiblemente, se usa un escaner de cama plana. Posteriormente, la imagen se puede procesar para determinar un valor numericamente promediado de la intensidad del pixel correspondiente al (o a cada) capilar. Este valor se puede usar para atribuir los valores de medida al inmunoensayo en el (o cada respectivo) capilar.
Preferentemente, en el sistema de inmunoensayo, el soporte mantiene los dispositivos de ensayos en una matriz sustancialmente planar. Ademas, preferentemente el soporte proporciona medios de observacion (tales como una ventana de observacion) para permitir que se observe al menos una parte de cada dispositivo de inmunoensayo. Los medios de observacion tambien pueden permitir que se interrogue opticamente cada dispositivo de inmunoensayo por medicion.
El soporte preferentemente tambien permite que el inmunoensayo continue mientras los dispositivos de inmunoensayo se mantienen en el soporte.
El sistema ademas puede incluir una bandeja que tiene una direccion de los pocillos adaptada para recibir reactivos, muestras de fluido u otros liquidos requeridos para el inmunoensayo. La bandeja ademas esta preferentemente adaptada para recibir al menos un extremo de cada dispositivo de inmunoensayo cuando los dispositivos de inmunoensayo se mantienen en el soporte. Esto permite que un extremo de cada orificio capilar este en comunicacion fluida con un liquido retenido en el respectivo pocillo.
Preferentemente, el soporte proporciona medios para aspirar el fluido a traves de los orificios capilares del dispositivo de inmunoensayo. Normalmente, el soporte permite que esta aspiracion tenga lugar al mismo tiempo, por ejemplo, usando un unico dispositivo de aspiracion tal como un pipeteador.
Se puede aspirar una secuencia de fluidos a traves de cada capilar moviendo el soporte a lo largo de la bandeja para estar en registro con una secuencia correspondiente de pocillos que contienen los respectivos fluidos.
Un IE, tal como se refiere en el presente documento, es un ensayo para determinar la presencia (o medir la concentracion) de un miembro de un par de union especifica en una muestra, que hace uso de la union especifica entre dicho miembro y un segundo miembro del par de union especifica. La expresion par de union se refiere a un primer miembro y a un segundo miembro que son capaces de unirse especificamente entre si. Los ejemplos de pares de union son antigeno-anticuerpo, biotina-avidina, hormona-receptor de hormona, receptor-ligando y enzima-sustrato. La presente invencion se refiere a pares de union de tipo antigeno-anticuerpo.
Cuando se realiza un IE en un dispositivo de acuerdo con el primer o segundo aspecto, el tiempo de incubacion requerido para varios reactivos es reducido en comparacion con los IE realizados, por ejemplo, en placas de 96 micropocillos que usan las mismas concentraciones de reactivos.
Por ejemplo, cuando se mide la presencia (o concentracion) de un segundo miembro de un par de union especifica, se puede incubar la muestra con la poblacion de los primeros miembros durante 20 minutos o menos, durante 15 minutos o menos, o durante 10 minutos o menos. Por ejemplo, la muestra de fluido puede incubarse con la poblacion de los primeros miembros durante 10 a 20 minutos, durante 10 a 15 minutos, durante aproximadamente 10 minutos.
Se conocen muchos tipos diferentes de IE en la materia, incluyendo IE no competitivos y competitivos. Algunos ejemplos se describen brevemente a continuacion.
Los IE no competitivos pueden implicar, por ejemplo, inmovilizar un anticuerpo capaz de unirse especificamente a un antigeno en un soporte solido. El anticuerpo inmovilizado puede poner despues en contacto con una muestra de interes. Si la muestra contiene el antigeno en cuestion, se unira al anticuerpo. Un segundo anticuerpo, que tambien es capaz de unirse al antigeno pero que se une a un epitopo diferente en el antigeno al del primer anticuerpo, se anade despues y se permite su union. Para permitir la deteccion, se puede marcar el segundo anticuerpo con un marcador detectable. Como alternativa, se puede anadir un tercer anticuerpo conocido por ser capaz de unirse especificamente al segundo anticuerpo y marcado con un marcador detectable y se permite su union con el segundo anticuerpo. La cantidad de anticuerpo marcado unido al soporte solido se mide despues, en donde la cantidad de anticuerpo marcado detectado es directamente proporcional a la cantidad de antigeno presente en la muestra. Las Figuras 8, 9 y 10 muestran ejemplos esquematicos de IE no competitivos.
Como se ha descrito anteriormente en relacion con la muestra de fluido, los tiempos de incubacion para el segundo (y tercer anticuerpo, si esta presente) estan reducidos de manera similar en los IE realizados en dispositivos de acuerdo con el primer o segundo aspecto en comparacion con los IE realizados en, por ejemplo, placas de 96 micropocillos que usan las mismas concentraciones de anticuerpos. Especificamente, el segundo y/o tercer anticuerpo se puede incubar en los orificios capilares durante 20 minutos o menos, durante 15 minutos o menos, o durante 10 minutos o menos. Por
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ejemplo, el segundo y/o tercer anticuerpo se puede incubar en los orificios capilares durante 10 a 20 minutos, durante 10 a 15 minutos, o durante aproximadamente 10 minutos.
Los IE competitivos pueden implicar la inmovilizacion, por ejemplo, de un anticuerpo o un antigeno en un soporte solido dependiendo de si se pretende que el ensayo determine la presencia de un antigeno o un anticuerpo en una muestra de interes. Por ejemplo, cuando se pretende ensayar la presencia de un antigeno en una muestra, se puede inmovilizar un anticuerpo que es capaz de unirse especificamente a dicho antigeno en un soporte solido. El antigeno marcado se anade despues y se permite su union al anticuerpo inmovilizado, seguido de la adicion de la muestra. Si la muestra contiene el antigeno en cuestion, competira con el antigeno marcado por la union al anticuerpo inmovilizado. Despues se mide la cantidad de antigeno marcado unido al soporte solido. En este caso, la cantidad de antigeno marcado detectado es inversamente proporcional a la cantidad de antigeno presente en la muestra.
Un primer miembro de un par de union especifica es capaz de unirse especificamente a un segundo miembro de un par de union especifica. Un primer miembro de un par de union especifica puede, por ejemplo, ser una proteina (por ejemplo, un anticuerpo), un polisacarido, un peptido, un acido nucleico, o una molecula pequena (por ejemplo, un hapteno). Un segundo miembro de un par de union especifica puede ser de manera similar una proteina (por ejemplo, un anticuerpo), un peptido, un acido nucleico, o una molecula pequena (por ejemplo, un hapteno). Un segundo miembro de union puede estar comprendido en un analito.
Cuando el par de union especifica es un par de union antigeno-anticuerpo, el primer miembro de union puede, por ejemplo, ser un anticuerpo y el segundo miembro de union puede ser un antigeno, en el que el anticuerpo es capaz de unirse especificamente con el antigeno. Como alternativa, el primer miembro de union puede ser un antigeno y el segundo miembro de union puede ser un anticuerpo, en el que el antigeno es capaz de unirse especificamente con el anticuerpo.
El primer miembro del par de union especifica se puede inmovilizar en el soporte solido de varias maneras conocidas en la materia. Por ejemplo, el primer miembro de un par de union especifica puede adsorberse directamente al soporte solido, por ejemplo, a traves de interacciones electrostaticas y/o hidrofobas, tales como en el caso de soportes solidos plasticos. Como alternativa, el primer miembro del par de union especifica puede unirse de manera covalente al soporte solido. En este caso, el soporte solido puede modificarse quimicamente para introducir o activar grupos quimicos funcionales en la superficie del soporte, tales como grupos hidroxilo o amino y el soporte reticulado usando agentes reticulantes tales como gluteraldehido, para facilitar la union covalente del primer miembro al soporte solido. En una alternativa adicional, el primer miembro del par de union especifica se puede unir indirectamente al soporte solido mediante una interaccion de union especifica, por ejemplo, mediante una interaccion entre biotina y avidina, o inmovilizando la proteina A o la proteina G en el soporte solido seguido de una union especifica a las moleculas de anticuerpo.
El termino "anticuerpo" describe una inmunoglobulina tanto natural o producida parcial o totalmente de manera sintetica. El termino tambien abarca cualquier polipeptido o proteina que comprende un sitio de union al antigeno del anticuerpo. Asi pues, este termino abarca fragmentos de anticuerpo, derivados y moleculas quimericas que comprenden un sitio de union a antigeno del anticuerpo, o equivalente, fusionado con otro polipeptido (por ejemplo, derivado de otra especie o perteneciente a cualquier clase o subclase de anticuerpo).
Los fragmentos de anticuerpo que comprenden un sitio de union a antigeno del anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, moleculas de anticuerpo tales como Fab, Fd, Fv, dAb, regiones CDR, F(ab')2, Fab', Fab'-SH, scFv, dimeros Fv de cadena sencilla biespecificos; y diacuerpos. Tales fragmentos de anticuerpos son bien conocidos en la materia.
Un sitio de union a antigeno, tal como se refiere en el presente documento, es la parte de una molecula que se une a, y es complementaria con todas o parte del antigeno diana. En una molecula de anticuerpo se refiere como el sitio de union a antigeno del anticuerpo y comprende la parte del anticuerpo que se une a y es complementaria con todo o parte del antigeno diana. En los casos donde el antigeno es grande, un anticuerpo se puede unir solamente a una parte particular del antigeno, cuya parte se denomina epitopo. Un sitio de union a antigenos de anticuerpos puede proporcionarse mediante uno o mas dominios variables de anticuerpo. Un sitio de union a antigeno del anticuerpo puede comprender una region variable de cadena ligera del anticuerpo (VL) y una region variable de cadena pesada del anticuerpo (VH).
Un antigeno tal como se refiere en el presente documento es cualquier sustancia que se puede unir de manera especifica a un anticuerpo. Tales sustancias incluyen: proteinas, peptidos, polisacaridos, acidos nucleicos y pequenas moleculas (por ejemplo, haptenos).
Las expresiones "espedfica" y "de forma especifica" tal como se usan en el presente documento se pueden referir a la situacion en la cual un miembro de un par de union especifica no mostrara cualquier union significativa a otra molecula que no sea su(s) companero(s) de union, por ejemplo, el otro miembro del par de union especifica. Estas expresiones tambien se aplican cuando, por ejemplo, un dominio de union a antigeno es especifico para un epitopo particular que lo llevan varios antigenos, en cuyo caso el miembro de union especifica que lleva el dominio de union a antigeno sera capaz de unirse a varios antigenos que lleven el epitopo.
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La union de un primer miembro de union a un segundo miembro de union se puede detectar de forma directa o indirecta.
Cuando se detecta de forma directa la union de un primer miembro de union a un segundo miembro de union, el segundo miembro de union se puede marcar con un marcador detectable. Si se anade despues una muestra que comprende segundos miembros de union, estos segundos miembros de union no marcados competiran con los segundos miembros de union marcados por la union con el primer miembro de union. En este caso, la cantidad de marcador detectado es inversamente proporcional a la cantidad de segundo miembro de union presente en la muestra.
Cuando se detecta de forma indirecta la union del primer miembro de union al segundo miembro de union, la union se puede detectar usando un tercer miembro de union, por ejemplo, un anticuerpo, capaz de unirse especificamente al segundo miembro de union y marcado con un marcador detectable. Como alternativa, la union de un primer miembro de union a un segundo miembro de union se puede detectar usando un tercer miembro de union, por ejemplo, un anticuerpo, capaz de unirse especificamente al segundo miembro de union un cuarto miembro de union capaz de unirse especificamente al tercer miembro de union y marcado con un marcador detectable.
Un marcador detectable tal como se refiere en el presente documento puede ser cualquier marcador que produce o puede inducirse para producir una senal, incluyendo, pero sin limitarse a fluorescentes, quimioluminiscentes (por ejemplo, peroxidasa de rabano picante), marcadores de color (por ejemplo, latex [azul] u oro coloidal [rojo]), radiomarcadores, enzimas y marcadores magneticos. La cantidad de marcador unido a una superficie, por ejemplo, a una superficie de un orificio capilar, puede, por lo tanto, detectarse y/o medirse mediante deteccion por fluorescencia o luminiscencia, color, radioactividad, actividad enzimatica, o cambios en el campo magnetico. Los marcadores detectables pueden unirse a miembros de union usando la quimica convencional. Preferentemente, un marcador detectable es un marcador detectable mediante interrogacion optica, por ejemplo, con una camara digital o con un escaner de cama plana. Los marcadores que se pueden detectar mediante interrogacion optica incluyen marcadores fluorescentes, quimioluminiscentes y de color. El mecanismo mediante el cual se puede generar una senal para la deteccion optica incluye (pero no se limita necesariamente a): absorcion de luz, dispersion de luz, difraccion de luz, reflexion de luz, fluorescencia o luminiscencia.
El termino "comprende" se usa de forma general en el sentido de incluir, es decir, permitir la presencia de una o mas caracteristicas o componentes adicionales.
"Y/o", en los casos donde se use en el presente documento, debe entenderse como la divulgacion especifica de cada una de las dos caracteristicas o componentes especificados con o sin el otro. Por ejemplo, "A y/o B" debe entenderse como la divulgacion especifica de cada uno de (i) A, (ii) B y (iii) A y B, justo como si se expusiese cada uno individualmente en el presente documento.
A menos que el contexto dicte lo contrario, las descripciones y definiciones de las caracteristicas expuestas anteriormente no estan limitadas a cualquier aspecto o realizacion particular de la invencion y se aplican igualmente a todos los aspectos y realizaciones que se describen.
A continuacion se ilustraran ciertos aspectos y realizaciones de la invencion a modo de ejemplo y con referencia a las figuras descritas a continuacion.
Breve descripcion de los dibujos
La Figura 1 es un diagrama esquematico de un aparato de extrusion para su uso en la fabricacion de dispositivos d inmunoensayo de acuerdo con una realizacion preferente de la invencion.
La Figura 2 es una seccion transversal esquematica a traves del troquel mostrado en la Figura 1.
La Figura 3 es una vista esquematica desde abajo del troquel mostrado en la Figura 1.
Las Figuras 4-7 ilustran el efecto del volumen y area superficial para un inmunoensayo en un pocillo de microtitulacion (Figura 4) y un orificio capilar (Figura 5).
Las Figuras 6 y 7 muestran el impacto directo en la distancia de difusion proporcionada mediante longitudes practicas de capilares (en el intervalo 5-50 mm), en comparacion con los pocillos de una placa de microtitulacion estandar.
La Figura 8 muestra el proceso de un ELISA de forma esquematica.
La Figura 9 ilustra las diferentes etapas de un ELISA en mas detalle.
La Figura 10 ilustra las etapas de un inmunoensayo llevado a cabo en un orificio capilar.
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Las Figuras 11A-D ilustran el efecto del mdice de refraccion del cuerpo del dispositivo de inmunoensayo capilar en las distorsiones opticas durante la interrogacion optica.
Las Figuras 12-14 ilustran un metodo para fabricar un dispositivo de inmunoensayo de acuerdo con una realizacion de la presente invencion. Otro metodo de fabricacion que comprende una etapa adicional de separar los capilares del dispositivo de inmunoensayo en un extremo del dispositivo se muestra en las Figuras 39-40.
Las Figuras 15-17 muestran vistas mas detalladas de partes del dispositivo de inmunoensayo de pelicula microcapilar cargada de acuerdo con una realizacion preferente de la presente invencion.
La Figura 18 muestra el ensamblaje de un sistema de inmunoensayo para multiples muestras de acuerdo con una realizacion preferente de la presente invencion.
La Figura 19 muestra una vista en planta del casete del sistema de inmunoensayo de la Figura 18.
La Figura 20 muestra una vista lateral del casete de un sistema de inmunoensayo de la Figura 18.
La Figura 21 muestra el casete de la Figura 18 siendo escaneado en un escaner de cama plana.
La Figura 22 muestra una vista ampliada de una porcion de un dispositivo de inmunoensayo de MCF, tal como se ve a traves de una ventana del casete.
Las Figuras 23A y 23B muestran graficas esquematicas de la intensidad de pixel a traves de diferentes dispositivos de inmunoensayo en el mismo casete.
Las Figuras 24A-C muestran la evaluation de la adsorcion de anticuerpos y la detection de la senal en una MCF-FEP.
La Figura 24A muestra una representation esquematica de la adsorcion de anticuerpos y deteccion en la MCF-FEP.
La Figura 24B muestra una grafica de una intensidad fluorescente media a traves de la matriz capilar. Las concentraciones de IgG de raton (|jg/ml) en cada capilar se indican debajo de la grafica.
La Figura 24C muestra una grafica de la altura, h, de intensidad fluorescente gris medida a la entrada y salida de una bobina de MCF de 5 metros.
Las Figuras 25A y 25B demuestran la deteccion multi-analito usando una matriz extruida de capilares.
La Figura 26 muestra una vista esquematica de una section transversal del formato de un dispositivo de inmunoensayo usado para obtener los resultados mostrados en la Figura 27.
La Figura 27 muestra imagenes obtenidas de escanear un dispositivo de inmunoensayo de acuerdo con la presente invencion usando un escaner de cama plana despues de un inmunoensayo.
La Figura 28 muestra la deteccion de la senal en las MCF extruidas usando otros materiales termoplasticos en un escaner de cama plana.
La Figura 29 muestra los resultados obtenidos usando cuerpos capilares FEP circulares de un solo orificio.
Las Figuras 30A, 30B, 31 y 32 demuestran la sensibilidad de la realizacion preferente de la presente invencion en comparacion con una placa de microtitulacion para un ensayo de deteccion de hepatitis B.
La Figura 30A muestra una representacion esquematica del ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima realizado en MCF-FEP.
La Figura 30B muestra la intensidad luminica promedio medida escaneando 8 tiras individuales de MCF-FEP en las que se realizo un inmunoensayo para detectar anticuerpos contra la hepatitis B para ensayar 8 concentraciones diferentes de anticuerpo anti-antigeno del nucleo de la hepatitis B. La intensidad luminica promedio se represento con respecto a la distancia entre las tiras de MCF-FEP, con la concentration de anticuerpo en cada muestra indicada encima de las graficas. La intensidad luminica promedio se calculo para una longitud de aproximadamente 1 mm medida paralela al eje de los capilares.
La Figura 31 muestra un grafico de la intensidad media de pico para todas las muestras con respecto a la concentracion de anti-HB-CAg.
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La Figura 32A muestra un grafico de la intensidad pico media del escaner para las muestras seleccionadas trazadas en la Figura 31 en un intervalo de concentraciones de anti-HB-CAg que muestran una relacion lineal entre la intensidad del escaner y la concentracion de anti-HB-CAg.
La Figura 32B muestra una grafica de densidad optica y absorbancia con respecto a la concentracion para un ELISA que se llevo a cabo en un inmunoensayo con placa de microtitulacion de 96 pocillos sobre el mismo intervalo de concentraciones medidas en la Figura 31 y representadas en la Figura 32A.
La Figura 33 ilustra el efecto del indice de refraccion del fluido en el grafico del perfil para una MCF-FEP (descrito en la Tabla 1).
La Figura 34 ilustra el efecto del indice de refraccion del fluido en el grafico del perfil para una MCF-EVA (descrito en la Tabla 1).
La Figura 35A resume la variacion de la senal y ruido con el indice de refraccion para MCF-FEP y MCF-EVA (como se describe en la Tabla 1).
La Figura 35B resume la variacion de la relacion de senal con respecto al ruido en MCF-FEP y MCF-EVA (como se describe en la Tabla 1).
La Figura 36 muestra una comparacion en general de la realizacion de in IE tipo sandwich realizado en MCF-FEP con un IE tipo sandwich realizado en una placa de 96 micropocillos. Abs/cm indica Absorbancia por cm.
La concentracion del analito (biomarcador de cancer PSA) en ng/ml se indica en el eje x.
La Figura 37 muestra una comparacion de los principales tiempos de incubacion para un IE de tipo sandwich realizado en una placa de 96 pocillos y un IE de tipo sandwich realizado en MCF-FEP.
Las Figuras 38-40 ilustran un metodo para fabricar un dispositivo de inmunoensayo de acuerdo con una realizacion de la presente invencion.
En este caso, los capilares del dispositivo de inmunoensayo estan separados en un extremo del dispositivo para facilitar la captation de diferentes muestras en cada uno de los capilares. En la Figura 39 los capilares estan individualizados, permitiendo que cada capilar se ponga en contacto con una bandeja de muestra diferente. Como alternativa, los capilares se pueden separar en pares de dos capilares cada uno, tal como se muestra en la Figura 40. Los dos capilares pueden recibir despues un tratamiento identico para proporcionar redundancia de mediciones en el dispositivo. Tambien esta previsto separar los capilares en otras disposiciones, por ejemplo, conjuntos de tres o mas capilares. La separation puede variar dependiendo del numero de muestras a analizar, del numero de controles requeridos y de si se va a proporcionar redundancia de medicion en el dispositivo.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA REALIZACION PREFERENTE Y CARACTERISTICAS PREFERENTES ADICIONALES DE LA INVENCION
En una realizacion preferida de la presente invencion, se proporciona una plataforma para inmunoensayos (IE) cuantitativos multiplexados. Los presentes inventores han demostrado que las proteinas antigenicas y los anticuerpos se pueden inmovilizar con exito en la superficie interna super-hidrofoba de una matriz de 10 microcapilares que tienen un diametro interno de aproximadamente 200 |jm y estan embebidos en una unica pelicula plastica sustancialmente plana extruida de un material fluoropolimero. Las secciones cortas de la pelicula plastica (de hasta 5 cm de largo) se han interconectado con un micropipeteador estandar que permite la detection de multiples analitos con un unico puerto de alimentation de muestra y usando volumenes minimos de reactivos. La geometria plana y las excelentes propiedades opticas de la pelicula plastica permiten la interrogation cruzada directa de los capilares para la deteccion y cuantificacion de la senal usando sistemas opticos convencionales, tales como una camara CCD o un escaner de cama plana. El pequeno volumen interno y el diametro de los capilares permiten reducciones significativas en los costes de los reactivos y en el tiempo de ensayo en comparacion con los IE en placas de microtitulacion. Ademas, los costes de inversion relacionados con la adquisicion de un equipo de deteccion especializado se pueden minimizar sin afectar a la sensibilidad del IE. Esta nueva plataforma de IE multiplexado encuentra una principal aplicacion por ejemplo como una herramienta de diagnostico clinico para la deteccion de enfermedades del corazon y de cancer en paises desarrollados o la deteccion de patogenos en paises del tercer mundo.
En una realizacion preferente, la presente invencion utiliza un cuerpo capilar fabricado de acuerdo con la divulgation del documento WO 2005/056272.
El documento WO 2005/056272 desvela aparatos para producir un producto de material extruido, el producto de material extruido que incluye una pluralidad de canales capilares a traves del mismo, el aparato que comprende un producto extruido que tiene una entrada, un troquel que incluye un orificio que tiene una forma externa
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predeterminada, una pluralidad de agujas, cada una de las cuales tiene un cuerpo que incluye un conducto interno para el flujo del fluido, cada aguja ademas comprende una salida del conducto interno a un extremo de salida, el extremo de salida de cada aguja se dispone en un patron predeterminado, sustancialmente dentro del orificio del troquel, estando el conducto de cada aguja conectado de manera fluida a una fuente de fluido, en el que, en uso:
a) Se introduce material extruible en la extrusora a traves de la entrada;
b) la extrusora fuerza el material extruible alrededor de los cuerpos de las agujas hacia el troquel y a traves del
orificio en el troquel para producir un producto extruido que tiene sustancialmente la forma externa predeterminada;
c) las agujas permiten que el fluido se extraiga de la fuente de fluido a traves del conducto para entrar en el
producto extruido para formar capilares de forma que el producto extruido incluye capilares a lo largo del patron
predeterminado.
Se ha descubierto que el problema del hinchamiento del troquel en los capilares se reduce de manera sustancial o se niega cuando se permite al fluido entrar en el capilar. Esto permite que el orificio de los capilares se controle de forma precisa, de manera que se puedan producir de manera fiable orificios capilares pequenos. Esta previsto que los capilares que tiene un orificio entre aproximadamente 2 mm hasta 10 micrometros se produzcan en una unica etapa de procesamiento en estado fundido. Sin embargo, esta previsto que una etapa adicional de procesamiento pueda producir capilares que tenga un orificio por debajo de 1 micrometro. Podria entenderse que los orificios capilares tambien se denominan como microcapilares.
Es preferible que las salidas de aguja se distribuyan de manera sustancialmente uniforme en el orificio del troquel, ya que esto ayuda a prevenir la mala distribucion del material extruido. Es preferible que cada salida de la aguja este a una distancia sustancialmente igual de otras salidas y desde el orificio del troquel. Por ejemplo, si el orificio del troquel es sustancialmente rectangular y el patron predeterminado de las salidas de aguja es una simple linea de salidas dentro del orificio, es preferible que la linea este dispuesta sustancialmente de forma centrada en el lado corto del rectangulo y que las distancias entre las salidas de las agujas sean sustancialmente identicas a la distancia entre las salidas exteriores de las agujas y los bordes cortos del orificio y la linea de salidas y los bordes largos del orificio. La salida de aguja puede ser de cualquier tamano adecuado, pero esta preferentemente entre 2 mm y 0,1 mm y mas preferentemente entre 0,6 mm 0,2 m. Por ejemplo, con un tamano de salida de la aguja de 0,3 mm, los orificios capilares de entre 200 micrometros y 20 micrometros se pueden producir facilmente dependiendo de las condiciones de procesamiento.
Es preferible que la presion del fluido que entra en los capilares a traves de las agujas sea sustancialmente igual a la presion del medio en el que el producto extruido se extrude, ya que se ha descubierto que esto produce un producto extruido mas estable. Es preferible que el flujo del material extruible arrastre el fluido en el capilar, pero debe entenderse que el fluido puede entrar en los capilares a una presion por encima o por debajo de la presion del medio en el que se ha extruido el producto extruido, pero que se puede necesitar un mayor control. El fluido al que se le permite entrar en los capilares sera normalmente aire a presion y temperatura ambiente, pero la extrusion puede ser en un bano liquido u otro medio infrecuente. La fuente de fluido puede ser aire a temperatura ambiente y presion si el producto extruido se extrude en tal ambiente y puede extraerse directamente de la atmosfera local. Sin embargo, debe entenderse que la fuente de fluido puede ser un gas inerte o un liquido, o una muestra gaseosa o liquida que ha de atraparse dentro de los capilares en el producto extruido.
Es preferible que se use una bomba de engranajes para estabilizar el flujo de material extruible entre la extrusora y el troquel. Esto ayuda a reducir cualquier anormalidad de flujo que pueda resultar de variaciones en el funcionamiento de la extrusora.
El troquel se usa para tomar la alimentacion de producto de la extrusora y cambiar la forma del flujo de material hasta que tenga la forma externa deseada y pueda salir a traves del orificio del troquel que tiene sustancialmente la misma forma externa predeterminada. Debe entenderse que, debido a la dilatacion del troquel, la forma externa del producto extruido podria no corresponderse exactamente con la forma predeterminada del orificio. Se prefiere que el troquel sea un troquel convergente. El troquel esta preferentemente conformado para garantizar que el flujo sobre las agujas sea sustancialmente uniforme, ya que esto ayuda a crear un producto extruido regular y bien formado
Se prefiere que el orificio del troquel sea sustancialmente rectangular para que la forma externa resultante del producto extruido sea sustancialmente rectangular. Las dimensiones del orificio rectangular son preferentemente tales que el producto extruido sea una lamina o pelicula. Preferentemente el orificio rectangular tiene un lado largo que tiene una longitud que es al menos varias veces mas largo que el lado mas corto. Preferentemente la relacion es mayor de 10 ya que esto permitiria que la pelicula se doblara mas facilmente. Debe entenderse que el orificio podria adoptar cualquier otra forma adecuada, incluyendo un anillo, cuadrado o circulo. Se ha constatado que con un troquel no circular, por ejemplo un troquel rectangular puede tener efectos perifericos que alteren la forma de los capilares en o cerca de un borde de la pelicula. Tal efecto periferico puede anularse mediante el uso de un troquel anular que es, en efecto, una pelicula continua que no tiene bordes. Un troquel anular podria permitir la produccion de un producto extruido que tenga mayor consistencia del tamano y con la forma de los capilares.
Por razones de simplicidad el aparato se describira a continuacion con referencia a una realizacion preferente en la
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que el troquel tiene un orificio sustancialmente rectangular en el que se dispone una matriz de salidas de aguja en una lmea sustancialmente paralela con el lado largo del rectangulo y sustancialmente en el centro de los lados cortos del orificio. Esto produce una pelicula extruida que tiene una pluralidad de capilares a lo largo de la misma. Debe entenderse que podrian emplearse diferentes matrices y formas de orificio.
Se prefiere que las salidas de aguja tenga una forma sustancialmente circular. Esta forma de salida es facil de formar, pero podrian usarse otras formas si asi se desea. Tambien se prefiere que el cuerpo de cada aguja sea sustancialmente cilindrico y alargado a lo largo de un primer eje. Los cuerpos se disponen preferentemente de manera que el primer eje del cuerpo cilindrico sea sustancialmente paralelo al flujo de material, ya que esto proporciona una baja resistencia al flujo de material y es facil de fabricar.
Debe entenderse que la pluralidad de agujas puede formarse individualmente, integralmente, o en grupos de dos o mas agujas. Por ejemplo podria usarse un monolito solido de metal para formar una pluralidad de agujas. El monolito podria incluir agujeros a traves del mismo para formar las agujas que requiere la invencion. Las agujas pueden incluir una entrada comun que se divida luego entonces en una pluralidad de conductos que lleven a una pluralidad de salidas. Las salidas de las agujas desde el monolito pueden sobresalir del monolito permitiendo que el producto extruido fluya alrededor de la protrusion antes de se extraiga el gas de la salida, o pueden no sobresalir en absoluto. El producto extruido fluira alrededor del monolito y extraera gas a traves de las salidas como se ha descrito anteriormente.
Aunque se ha mencionado antes que se reduce o anula sustancialmente la dilatacion del troquel dentro de los capilares, se sigue produciendo una dilatacion en la salida del troquel. La forma externa del producto extruido se dilatara a medida que sale por el orificio. En el caso de la pelicula, se ha descubierto que la dilatacion es mayor a lo largo del eje corto del orificio rectangular que a lo largo del eje largo. El resultado es que los capilares sustancialmente circulares dentro del producto extruido, antes de dilatarse, se distorsionan en una forma eliptica con el eje largo sustancialmente paralelo al eje corto de la seccion transversal rectangular de la pelicula. Debe entenderse que con variaciones en la forma externa y el procesado, puede variarse la seccion transversal de los capilares.
El producto extruido preferentemente se extrae por el orificio a una tasa mayor que la tasa a la que se produce el producto. La relacion de extraccion es la relacion de la tasa de production de extruido sobre la tasa a la que se extrae el producto extruido. En algunas relaciones de extraccion (entre 16 y 20) parece que el efecto de dilatacion del troquel domina y los capilares son sustancialmente elipticos.
A relaciones de extraccion mas elevadas (por encima de 30) el cambio en geometria debido a la extraccion del producto extruido domina. Como se ha mostrado en la literatura, durante la extraccion de un producto extruido que tiene una seccion transversal rectangular, la longitud del eje corto decrece a una tasa mayor que la longitud del eje largo del producto extruido y de ese modo los capilares se distorsionan para formar capilares sustancialmente elipticos que tienen su eje largo sustancialmente paralelo al eje largo de la seccion transversal rectangular. El proceso de extraccion normalmente reduce las dimensiones totales en seccion transversal del producto extruido y por lo tanto reduce las dimensiones de los capilares dentro del producto.
Tambien se ha descubierto que puede ser posible procesar adicionalmente el producto extruido despues de la extraccion. Este proceso adicional puede ser bien extraccion en frio o extraccion en caliente a una temperatura elevada. Se ha descubierto que la extraccion en frio puede reducir las dimensiones del producto entre dos y tres veces y se ha de esperar una mayor reduction cuando se usa la extraccion en caliente.
El aparato y un proceso que usa el aparato es capaz de producir un producto extruido de seccion rectangular con multiples capilares que discurren a lo largo de la longitud del producto.
El documento WO 2005/056272 divulga la produccion de productos extruidos con multiples capilares elipticos con una longitud del eje mayor de aproximadamente 65 |jm y una longitud del eje menor de aproximadamente 35 |jm. Cabe destacar que la relacion de aspecto y el diametro medio del capilar pueden variarse mediante cambios en las condiciones del proceso. El producto extruido normalmente adopta la forma de peliculas. Cada pelicula normalmente tiene una longitud y una seccion transversal sustancialmente rectangular, perpendicular a dicha longitud, incluyendo dicha seccion transversal dos lados largos y dos lados cortos, incluyendo la pelicula una pluralidad de orificios capilares sustancialmente paralelos a la longitud de la pelicula.
El documento WO 2005/056272 ademas divulga que la produccion de una longitud de producto extruido de aproximadamente 20 m de largo permitia una investigation de las dimensiones de los capilares en cinco secciones a lo largo del extruido mediante microscopia electronica de barrido. Esto revelo que la variation en las dimensiones de los capilares no era mayor que aproximadamente 10 % a lo largo de la longitud del producto.
El documento WO 2005/056272 ademas tambien divulga la formation de productos extruidos usando, por ejemplo LLDPE. Se ha encontrado que tales polimeros tienen una buena transparencia optica, a pesar de cualquier contenido cristalino presente dentro del polimero.
El documento WO 2005/056272 sugiere que podria obtenerse transparencia optica total o al menos un nivel
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significativamente aumentado de transparencia optica usando un poKmero amorfo tal como un poliestireno. Sin embargo, cabe destacar que estos materiales no son necesariamente los materiales preferentes para su uso con las realizaciones de la presente invencion.
La Figura 1 muestra un aparato de extrusion 1 para crear un producto extruido 2 que tenga orificios capilares a lo largo del mismo. El aparato de extrusion comprende una extrusora de tornillo 4 accionada por un motor 6. Se alimenta la extrusora de tornillo 4 de material extruible 8 mediante una tolva 10. A medida que el material extruible pasa a traves de la extrusora de tornillo 4, el material se funde para formar un material fundido (no mostrado). La extrusora de tornillo 4 alimenta de material fundido a una bomba de engranajes 12 que mantiene un flujo sustancialmente constante de material fundido hacia un troquel 14. La bomba de engranajes 12 esta conectada a la extrusora de tornillo 4 por una brida 16 que incluye un filtro de pantalla para retirar impurezas del flujo de material fundido. El motor 6 se controla usando un enlace 18 de retroalimentacion de presion entre la entrada de la bomba de engranajes y el motor 6.
El material fundido pasa al troquel 14 a traves de un cilindro 20 de extrusion que esta conectado a la bomba de engranajes por una brida 22. En esta realizacion el cilindro de extrusion incluye una curva 24 de 90°. Los calentadores de banda 26 se usan para controlar la temperatura en diferentes estadios en el aparato de extrusion 1. Los calentadores de banda 26 pueden estar situados dentro de la extrusora, sobre las bridas 16, 22, en la bomba de engranajes 12, en el cilindro 5 20 de extrusion y tambien en el troquel 14.
El detalle de la disposicion del troquel 14 se mostrara en mayor detalle en las siguientes figuras.
El material fundido pasa a traves del troquel 14 y se conforma con la forma y seccion transversal deseadas. A medida que el material fundido sale del troquel se convierte en un extruido 28. El extruido 28 se extrae hacia abajo sobre y entre los rodillos 30. El proceso de extraccion, como se ha descrito antes, altera la seccion transversal del extruido 28 para formar el producto extruido 2. Una longitud extraida (L) 29 se define entre el orificio y el primer rodillo 30. Se ha descubierto que L tiene un gran efecto en el producto extruido 2 formado por este aparato.
La Figura 2 muestra una seccion transversal esquematica a traves del troquel 14 de la Figura 1. El troquel incluye una parte de introduccion 32, una parte convergente 34 y un orificio 36 que tiene una forma externa predeterminada. El producto fundido entra en la parte de introduccion 32 del troquel 14, la parte convergente 34 lo conforma gradualmente hasta que el material fundido sale por el orificio 36.
El troquel 14 ademas incluye agujas 38 (de las cuales solo se muestra una en esta figura) posicionadas en el mismo. La aguja 38, una parte de cuerpo 40 que tiene un conducto 42 en el mismo que esta conectado de manera fluida a una fuente de fluido 44 por medio de un segundo conducto 43 que pasa a traves de una pared del troquel 14 alrededor del cual el material fundido debe fluir para pasar al orificio 36. La aguja 38 ademas incluye una salida 46 en un extremo 48 de la aguja 38. La aguja 38 esta dispuesta de manera que la salida 46 este situada dentro del orificio 36.
La Figura 3 muestra una vista esquematica del troquel 14 desde abajo. Este dibujo muestra que el orificio 36 tiene una forma externa rectangular. El orificio tiene un lado corto 50 sustancialmente paralelo a un eje corto 51 y un lado largo 52 sustancialmente paralelo a un eje largo 53.
En este ejemplo, el troquel incluye diez agujas 38 con las salidas 46 distribuidas de manera sustancialmente uniforme a lo largo del eje largo 53 dentro del orificio y sustancialmente de manera centrada en el orificio a lo largo del eje corto 51. En este ejemplo, el orificio del troquel tiene una dimension de 1,5 mm en el lado corto, una dimension de 18 mm en el lado largo y las agujas tienen 0,5 mm de diametro externo y 0,3 mm de agujero interno.
En un ejemplo de proceso, se produce un polimero fundido en una extrusora de tornillo 4 y la tasa de flujo resultante se estabiliza por medio de una bomba de engranajes 12. Con este material fundido se alimenta entonces un troquel 14, en cuyo orificio se dispone una pluralidad de salidas de agujas 38 en un patron predeterminado. Se alimenta un conducto 42 a traves de cada aguja 38, desde un conducto 43 de alimentacion orientado horizontalmente, cuya boca esta abierta a la atmosfera fuera del troquel que es la fuente de fluido 44. El producto extruido resultante se hace pasar luego sobre una serie de rodillos 30 en un dispositivo de traccion (no mostrado). La velocidad del dispositivo de traccion puede alterarse de manera que puedan producirse productos extruidos 2 con diferentes relaciones de extraccion.
El troquel 14 esta disenado de manera que el flujo entrante desde la extrusora, que esta contenido en una tuberia circular, se altere de manera que pueda pasar a traves del orificio 36 del troquel 14. El troquel 14 debe efectuar este cambio de geometria y esto se consigue actualmente usando un troquel 14 convergente.
El troquel 14 tambien esta disenado de modo que el flujo sobre la matriz de agujas 38 sea sustancialmente uniforme. Un flujo uniforme de material fundido alrededor de las agujas 38 facilita la creacion de un extruido 28 bien formado. Si, sin embargo, hubiera un flujo no uniforme, el material fundido preferentemente se canalizaria a lo largo de la trayectoria de menor resistencia. Esto tendria como resultado un extruido 28 distorsionado.
En el documento WO 2005/056272, el proceso se opera a aproximadamente 165 °C usando polietileno lineal de baja
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densidad (LLDPE). El motor 6 se controla usando un bucle de retroalimentacion de presion que se establece en 2,07 MPa (300 PSI) y esto, a su vez, provoca una presion de aproximadamente un cuantos bares en el troquel 14. Se arrastra aire como resultado del flujo de polimero sobre la matriz de agujas 38 y la alimentacion a esta matriz de agujas 38 se deja abierta a la atmosfera. La velocidad del polimero fundido en el orificio 36 del troquel es del orden de un centimetro por segundo, la velocidad del dispositivo de traccion puede establecerse en cualquier punto entre cero y 9 metros por minuto.
Se descubrio que el parametro que tiene una influencia sustancial en el producto final era la distancia L 29, mostrada en la Fig. 1 y que se ha definido que es la distancia entre la salida del troquel y el primer rodillo 30. De hecho, en este caso el primer rodillo es una varilla fija de acero inoxidable pulido, sumergida en un bano de agua.
El efecto de la variacion de L se explica con mas detalle en el documento WO 2005/056272.
Las Figuras 4-7 ilustran algunas consideraciones generales relacionadas con inmunoensayos llevados a cabo en pocillos de una placa de microtitulacion en comparacion con los orificios capilares. Es posible demostrar que la geometria de un capilar permite ahorros sustanciales en reactivos y en tiempo para llevar a cabo un inmunoensayo.
Se calculo el volumen de liquido de trabajo y el area superficial de plastico en contacto con el liquido de trabajo. (a) Un micropocillo de las dimensiones indicadas relleno con un intervalo de volumenes de trabajo de 50 |jl a 300 |jl y (b) un capilar de diametro interno de 50 jm a 400 jm con una longitud de 5 mm a 50 mm. El area superficial y el volumen para estos se representaron en (c) y la maxima distancia de difusion se represento en (d).
En las Figuras 4-7, se considera la relevancia del volumen y el area superficial para un inmunoensayo. La Figura 4 ilustra de manera esquematica un IE llevado a cabo en una placa de microtitulacion de pocillos. La altura del pocillo es 11,3 mm y el diametro es 6,5 mm. La profundidad del volumen de trabajo Vw es variable h y Vw varia entre 50 jl y 300 jl. Por el contrario, la Figura 5 muestra esquematicamente el orificio de un capilar. La longitud es L y el diametro es Dc. xmax es la maxima distancia a la que deben difundir las especies para alcanzar la superficie interna del orificio capilar. Para el capilar, el diametro interno va desde 50 jm a 400 jm con una longitud desde 5 mm hasta 50 mm.
Las Figuras 6 y 7 muestran el impacto directo en la distancia de difusion proporcionada mediante longitudes practicas de capilares (en el intervalo 5-50 mm), en comparacion con los pocillos de una placa de microtitulacion estandar. Se pueden extraer varias conclusiones importantes de estas figuras:
• En un microcapilar de 200 jm de d.i. (diametro interno), la maxima distancia de difusion es cinco veces mas pequena para una microtitulacion de 50 jl en una placa de micropocillos, (notese que el volumen de muestra estandar para un ELISA en placas de micropocillos es de 100 jl). Siguiendo la ley de Einstein para la distancia de difusion, x = V(2Dt), donde x es la distancia de difusion y D es el coeficiente de difusion molecular de la proteina, se puede obtener una reduccion en los tiempos de incubacion de 25 a 100 veces para un proceso de inmovilizacion controlada por difusion usando un microcapilar. Para un ELISA sensible, donde todos los analitos disponibles se deben dar lo suficientemente largos como para difundir a una superficie con un anticuerpo de captura inmovilizado, el intervalo en los tiempos de duracion se puede reducir desde 2-16 horas hasta 1-40 minutos.
• El volumen de los capilares es mucho mas bajo para un area superficial dada. Esto significa que se requiere menos reactivo y muestra para llevar a cabo el mismo IE.
• En un microcapilar, la relacion de superficie sobre volumen es mucho mayor que para un pocillo de placa de microtitulacion, por lo tanto, la sensibilidad del IE no se reduce.
La Figura 8 muestra el proceso de un ELISA de forma esquematica. Se captura (inmoviliza) un anticuerpo 100 en la superficie 102. El analito 104 presente en una muestra se une al anticuerpo 100. Un anticuerpo de deteccion 106 se une al analito y un anticuerpo secundario ligado a enzima 108 se une al anticuerpo de deteccion 106. El sustrato 110 interactua con el anticuerpo secundario ligado a enzima 108 para proporcionar una senal detectable 112
La Figura 9 ilustra las diferentes etapas de un ELISA en mas detalle. Normalmente, el tiempo total tomado para un ELISA esta en el intervalo de 3-48 horas.
La Figura 10 ilustra las etapas de un inmunoensayo llevado a cabo en un orificio capilar.
Los inventores han comprendido que un inconveniente para usar inmunoensayos conocidos basados en capilares se relaciona con la interrogacion optica del orificio capilar. Esto se ilustra en la Figura 11A-D. Las Figuras 11A y 11B muestran un dispositivo capilar tipico formado a partir de silice condensada. Una muestra de fluido acuoso (agua en este caso) esta situada en el orificio capilar. Tal como se muestra en la Figura 11A, la refraccion de la luz que transita por el dispositivo se produce en la interfaz entre el aire y el cuerpo del dispositivo y tambien en la interfaz entre el cuerpo del dispositivo y la muestra de fluido en el orificio. Esto es debido a cambios en el indice de refraccion en estas interfaces. El indice de refraccion del aire es de 1,0, el indice de refraccion del agua es 1,33 y el indice de refraccion de silice condensada es 1,46.
Sin embargo, como se muestra en las Figuras 11C y 11D, El efecto de la refraccion en la interfaz entre el cuerpo del
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dispositivo y el orificio puede reducirse o incluso evitarse formando el cuerpo del dispositivo usando un material que tenga un indice de refraccion cercano o igual al de la muestra de fluido (en este caso agua). Losmateriales adecuados incluyen Etileno-polipropileno fluorado (FEP) con un indice de refraccion de 1,34; Tetrafluoroetileno/hexafluoro-propileno/fluoruro de vinilideno (THV) con un indice de refraccion de 1,35; Perfluoroalcoxi (PFA) con un indice de refraccion de 1,34; Etileno-Tetrafluoroetileno (ETFE) con un indice de refraccion de 1,40; y Poli(clorotrifluoroetileno) (PCTFE) con un indice de refraccion de 1,39.
El Etileno-propileno fluorado (FEP) se considera particularmente adecuado para aplicaciones de inmunoensayos porque es hidrofobo. Es, por tanto, eficaz para adsorber proteinas en las paredes de los capilares. Sin embargo, no es esencial que el material sea hidrofobo. Como el experto en la materia entendera, pueden hacerse muchos tipos diferentes de modificaciones superficiales para inmovilizar anticuerpos.
Ademas, los presentes inventores se han dado cuenta que se puede llevar a cabo un inmunoensayo en uno o mas orificios capilares de una pelicula microcapilar extruida (MCF). El inmunoensayo puede multiplexarse, usando los distintos orificios capilares disponibles en las MCF.
Puede usarse una MCF para formar la base de una nueva plataforma (en el presente documento se denomina InmunoEnsayo de Matriz Extruida, IEME) para IE, proporcionando un metodo simple y rentable para IE multiplexados usando una unica conexion de muestra. Los aspectos clave de las realizaciones preferentes de esta invencion implican:
1. Recubrir cada microcapilar individual con un antigeno especifico o anticuerpo de captura. Esto puede hacerse pasando soluciones apropiadas hacia abajo a canales respectivos de una MCF que pueden tener una longitud de varios metros. De este modo, donde la mCf tiene 20 orificios capilares, 20 recubrimientos diferentes se aplican a una MCF de 20 canales.
2. La MCF puede entonces cortarse a longitudes de, por ejemplo, 1 cm. Cada longitud puede entonces encajarse en un tubo de succion simple. Esto representa una ruta de fabricacion muy efectiva para cada comprobador de lote.
3. La operacion se efectua extruyendo el fluido de muestra al interior de los canales de la MCF y luego siguiendo el contraste de color para cada canal individual de MCF.
4. La detection puede ser visual o automatica con el fin de hacer una medicion cuantitativa.
El FEP MCF Extruido esta disponible en Lamina Dielectrics, Ltd., Daux Road, Billingshurst, West Sussex RH14 9SJ, Reino Unido.
Las Figuras 12-14 ilustran un metodo para fabricar un dispositivo de inmunoensayo de acuerdo con una realization de la presente invencion.
En la Fig. 12, se proporciona una longitud de la pelicula microcapilar 200 sobre una bobina 202. La pelicula se fabrica a partir de FEP, como se ha expuesto anteriormente. La longitud total de la pelicula microcapilar puede ser, por ejemplo, de al menos 1 m. Tambien pueden fabricarse longitudes mas largas, por ejemplo, de hasta 10 m, 20 m o mas largas mediante el proceso de extrusion expuesto anteriormente.
Posteriormente, es posible cargar cada microcapilar con un antigeno o anticuerpo de captura. Esto puede efectuarse, por ejemplo, usando una jeringa y una aguja. Esta es la ruta preferente cuando se ha de cargar cada microcapilar con un antigeno o anticuerpo de captura diferente o con una concentration diferente de tales especies. Como se explica con mas detalle a continuation, los presentes inventores han descubierto que, sorprendentemente, la uniformidad de la adsorcion del antigeno o anticuerpo de captura a lo largo de la longitud de los microcapilares es muy alta. De manera conveniente, la etapa de carga puede llevarse a cabo mientras la MCF permanece en una bobina. Cuando se quiere cargar cada microcapilar de manera identica, esto puede efectuarse mojando un extremo de la MCF en una unica solution de carga, aspirandose esta solution de carga en cada orificio microcapilar usando un unico aspirador (no mostrado) en el extremo opuesto de la MCF. Cuando se quiere cargar uno o mas microcapilares de manera diferente, los microcapilares pueden separarse en un extremo de la MCF, bien en microcapilares individuales o en conjuntos de microcapilares. La separation puede obtenerse cortando la pelicula entre los capilares. El separar los microcapilares de esta forma, facilita el contacto con cada microcapilar o conjunto de microcapilares, con una solucion de carga diferente. Esto resulta util cuando cada microcapilar o conjunto de microcapilares se ha de cargar de manera diferente. La solucion de carga puede aspirarse en cada orificio microcapilar o conjunto de orificios microcapilares, usando un unico aspirador. Como alternativa, puede usarse un aspirador separado para cada capilar o conjunto de capilares. El aspirador puede, por ejemplo, ser una pipeta o una jeringa.
Como se muestra en la Figura 12, a cada capilar se le designa con una letra A-J. En este caso, se cargan diferentes orificios microcapilares con diferentes antigenos o anticuerpos de captura.
Posteriormente, el microcapilar cargado se corta a la longitud deseada (por ejemplo, 5-50 mm), como se muestra en la Figura 13, para formar un dispositivo 204 de inmunoensayo. Como se entendera, la larga bobina de MCF puede usarse para formar muchos dispositivos de inmunoensayo. Por lo tanto, solo se requiere una unica etapa de carga, aunque se producen muchos dispositivos de inmunoensayo.
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A continuacion, como se muestra en la Figura 14, el dispositivo 204 de inmunoensayo puede usarse para llevar a cabo un inmunoensayo. Un extremo del dispositivo esta conectado a un adaptador 206. En este ejemplo, el adaptador 206 tiene una estructura simple, sellandose al dispositivo por un extremo y proporcionando un orificio 208 en su extremo opuesto. El orificio 208 permite sellarse con un aspirador, mostrado en este caso como un pipeteador 210 convencional de laboratorio. Cuando el extremo libre del dispositivo 204 se moja en una muestra de fluido, el accionamiento del pipeteador aspira el fluido a lo largo de los orificios. Las etapas posteriores (por ejemplo, las indicadas en las Figuras 9 y 10) pueden llevarse a cabo de manera similar.
Otro metodo de fabricacion de un dispositivo de inmunoensayo de acuerdo con una realizacion de la presente invention, se muestra en las Figuras 38-40. La Figura 38 es identica a la Figura 12 que ya se ha descrito anteriormente. Como antes, la pelicula microcapilar cargada se corta a la longitud deseada (por ejemplo, 5-50 mm), para formar un dispositivo 204 de inmunoensayo (Fig. 39). En la Fig. 39, los microcapilares se separan ademas en un extremo. La separation puede obtenerse cortando la pelicula entre los capilares. Esto facilita, por ejemplo, la carga de los microcapilares con diferentes muestras. La carga de muestras puede, por ejemplo, hacerse poniendo en contacto cada microcapilar o conjunto de microcapilares con una bandeja de muestras diferente (Figura 40). Esto resulta util cuando cada microcapilar o conjunto de microcapilares se ha de usar para analizar diferentes muestras o la misma muestra pero a diferentes niveles de dilucion. La muestra de fluido puede aspirarse en cada orificio de microcapilar usando un unico aspirador. Como alternativa, puede usarse un aspirador separado para cada capilar o conjunto de capilares. El aspirador puede, por ejemplo, ser una pipeta o una jeringa. En la Fig. 40, el dispositivo 204 de inmunoensayo esta conectado a un adaptador 206. En este ejemplo, el adaptador 206 sella el dispositivo por un extremo y proporciona un orificio 208 en su extremo opuesto. El orificio 208 permite sellarse con un aspirador, mostrado en este caso como un pipeteador 210 convencional de laboratorio. Cuando los extremos libres del dispositivo 204 se mojan en las muestras de fluido provistas en diferentes bandejas, el accionamiento del pipeteador aspira el fluido a lo largo de los orificios. Las etapas posteriores se llevan a cabo como se ha descrito anteriormente.
La Figura 15 muestra una vista mas detallada de parte del dispositivo 204 de inmunoensayo en la pelicula microcapilar cargada. La Figura 16 muestra una vista a lo largo de la section A-A y la Figura 17 muestra una vista a lo largo de la section B-B en la Figura 15. Como puede observarse en estos dibujos, el dispositivo 204 tiene una superficie inferior plana y una superficie superior plana. Estas superficies se corresponden con la medicion de la primera superficie y la medicion de la segunda superficie, ya que durante la interrogation optica, la luz se transmite hacia y desde los orificios capilares a traves de estas superficies.
Como se muestra en la Figura 15, los orificios microcapilares 220 individuales tienen una forma general oval. La matriz 222 de plastico del dispositivo se forma de FEP y es transparente a la luz visible.
La anchura del dispositivo esta en el intervalo de 5-20 mm. El espesor del dispositivo (incluyendo los orificios microcapilares 220) esta en el intervalo de 0,2-2 mm.
La Figura 16 ilustra que cada orificio capilar puede tener una carga diferente de antigeno o anticuerpo de captura. Como se muestra, en la Figura 16, se prefiere formar un capilar de referencia que no tenga carga.
Se prefiere que las superficies superior 224 e inferior 226 de la MCF (vease la Figura 17) sean sustancialmente planas. La razon de esto es que una superficie plana, normal a la direction de luz transmitida durante la interrogacion del dispositivo de inmunoensayo, normalmente producira minimos efectos opticos desventajosos (o incluso cero).
La Figura 18 muestra el ensamblaje de un sistema de inmunoensayo de acuerdo con una realizacion preferente de la presente invencion. El sistema tiene tres componentes principales: un casete 250, una bandeja de muestras 252 y un soporte del casete 254. El casete 250 y la bandeja de muestras 252 se muestran con mas detalle en las Figuras 19 y 20.
Como se muestra en la Figura 19, hay varios (ocho, en este ejemplo) dispositivos 204 de inmunoensayo de MCF contenidos en el casete 250. Los extremos libres de los dispositivos de inmunoensayo se extienden desde la parte inferior del casete para mojarse en pocillos 256 de la bandeja de muestras. Los extremos superiores de los dispositivos de inmunoensayo estan contenidos en el casete de manera que los orificios capilares esten en comunicacion sellada con un colector 258 de flujo de fluido, llevando el colector 258 a un orificio de conexion 260 en la parte superior del casete, para su conexion con un dispositivo aspirador. Como se muestra en la Figura 20, el sellado entre los dispositivos de inmunoensayo y el colector esta provisto mediante un sellador 264.
Para efectuar un IEME, por ejemplo, el usuario final procesa cada casete secuencialmente a lo largo de las diferentes filas de ranuras del soporte del casete, correspondiendose las filas a una serie de etapas de lavado (position 1), carga de muestras (posicion 2) e incubation (posicion 2b) (Figura 18). Cabe destacar que para la etapa de incubation, los extremos del dispositivo de inmunoensayo de MCF no se mojan en ningun pocillo de muestra. Las soluciones de muestras y anticuerpos pueden precargarse en la bandeja de muestras desechable para evitar una contamination cruzada. Tras mojar los extremos del dispositivo de inmunoensayo de MCF en un conjunto dado de pocillos, se aspira el fluido de los pocillos a los orificios capilares usando un colector de flujo de fluido. No es necesario vaciar los orificios
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capilares entre las diferentes etapas del ensayo, ya que el nuevo fluido que se aspira a los orificios capilares sustituye cualquier fluido ya presente.
El casete 250 incluye unas orejetas de guia 262 en el soporte para permitir situar el casete en cada una de las posiciones deseadas en el soporte del casete. El casete tambien tiene una ventana 266 para permitirle al usuario observar el progreso de cualquier cambio visual disponible en los dispositivos de inmunoensayo. Ademas, la ventana proporciona acceso optico a los dispositivos de inmunoensayo durante la interrogacion optica, por ejemplo, usando una camara digital o (mas preferentemente) usando un escaner de cama plana. Esto se muestra en la Figura 21, escaneandose el casete 250 sobre un escaner de cama plana 270.
Al usar el escaner 270, la luz transmitida a traves de cada dispositivo de inmunoensayo de MCF puede determinarse basandose en un analisis de pixeles de la imagen escaneada. El experto en la materia entendera como esto puede hacerse usando un software estandar de tratamiento de imagenes.
La Figura 22 muestra una vista ampliada de una porcion de un dispositivo 204 de inmunoensayo de MCF, tal como se ve a traves de la ventana 266 del casete. En el proceso de escaneado, se toma la imagen de cada uno de los orificios capilares sustancialmente en las mismas condiciones. Ademas, las superficies planas superior e inferior del dispositivo de inmunoensayo y la pequena diferencia (o nula) en el indice de refraccion entre el material del dispositivo de inmunoensayo y el fluido contenido en el orificio garantiza que se pueda hacer una medicion util de la intensidad de pixel a traves de toda (o al menos la mayor parte de) la anchura de cada orificio capilar.
Las Figuras 23A y 23B muestran graficas esquematicas de la intensidad de pixel a traves de diferentes dispositivos de inmunoensayo en el mismo casete. Asi pues, mediante esta simple tecnica es posible hacer mediciones cuantitativas del inmunoensayo.
Las Figuras 24A-C muestran la evaluacion de la inmovilizacion de proteinas y la deteccion de senal en una MCF-FEP. Los capilares de la bobina de 5 m de MCF-FEP se cubrieron d forma individual con las concentraciones indicadas de IgG o tampon control, seguido de un bloqueo y un lavado. Despues, se cortaron piezas de 50 mm de largo, se unieron a un adaptador y se incubaron con HRp-anti-raton (HRP, del ingles horseradish peroxidase, peroxidasa de rabano picante), seguido de un lavado y una captation del sustrato FDP. Despues de 60 minutos, se crearon imagenes del FDP convertido a fluorescente usando microscopia confocal de barrido laser.
La Figura 24A muestra una representacion esquematica del ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima en la MCF-FEP. La Figura 24B muestra una grafica de una intensidad fluorescente media a traves de la matriz capilar. La concentration de IgG de raton presente en cada capilar se indica debajo del grafico.
La Figura 24C muestra una grafica de la altura, h, de la intensidad fluorescente gris medida en la entrada y salida de una bobina de 5 metros de MCF, indicando la no elimination del IgG despues de pasarlos a traves del capilar. Este resultado ilustra la sorprendente uniformidad de carga posible en el dispositivo de inmunoensayo, incluso cuando la carga se lleva a cabo en una sola etapa en una bobina de la pelicula microcapilar extruida.
Las Figuras 24A-c muestran que las proteinas antigenicas o los anticuerpos pueden inmovilizarse de manera efectiva en la superficie interna de la matriz extruida de microcapilares. Estas figuras resumen la eficacia de la inmovilizacion de anticuerpos en la superficie interna de una FEP-MCF de 10 capilares. Se demuestran varios puntos para el uso de un sustrato fluorescente y microscopia confocal:
• La cantidad de proteina unida a la entrada y salida de una bobina de 5 m de longitud es la misma a lo largo del intervalo de aportacion de concentraciones de proteina; esto demuestra la posibilidad de recubrimiento en una tira larga, seguido del corte de multiples piezas para diferentes muestras.
• Las diferentes concentraciones de proteina de recubrimiento en capilares individuales lleva claramente a diferentes senales de respuesta, validando por lo tanto la plataforma para IE cuantitativos.
Las Figuras 25A y 25B muestran que la deteccion multi-analito es posible usando la matriz de capilares extruida.
Se recubrieron los capilares en una bobina de MCF-FEP con 4 antigenos diferentes (A-D), a saber, tampon control (A), control positivo de IgG de raton (B) o los antigenos peptido FLAG (C) o antigeno del nucleo de hepatitis B (D). El orden de estos recubrimientos se indica mediante la relevante letra A-D cerca del respectivo orificio capilar, mostrado en el lado izquierdo de la Figura 25A. Despues del bloqueo y lavado, se cortaron piezas de 50 mm de largo, se unieron a un adaptador y se incubaron con 3 diferentes muestras de ensayo (1-3) que contienen los anticuerpos anti-HB/CAg o anti-FLAG o tampon control. Despues de lavar, se incubaron las piezas anti-IgG de raton-HRP seguido de un lavado exhaustivo y de la adicion del sustrato FDP. Despues de 5 minutos se crearon imagenes del sustrato convertido a fluorescente usando microscopia confocal de barrido laser. Se puntuo la presencia o ausencia de una senal fuerte como + para una senal positiva, - para una senal negativa, y +/- para un capilar con una senal intermedia; estas puntuaciones se indican junto a la clave que muestra que antigenos se recubrieron en el capilar.
Asi pues, se demuestra la capacidad para detectar mas de un anticuerpo usando una unica etapa de suministro de
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muestra de fluido. Se inmovilizaron tres antigenos diferentes (mas un control negativo) en diferentes capilares en un patron definido. Cuando se ensayaron diferentes muestras que conteman diferentes antisueros en piezas MCF separadas, se obtuvo el patron esperado de positivos y negativos.
La matriz de capilares extruida tambien se puede usar para realizar IE de tipo sandwich. Muchos IE se basan en un proceso de tipo sandwich. Por ejemplo, el biomarcador de cancer antigeno espedfico de prostata (PSA) se mide frecuentemente en muestras biologicas tales como orina o sangre usando dos anticuerpos (un anticuerpo 'de captura' y un anticuerpo 'de deteccion') que se unen a dos epitopos distintos en la molecula de PSA. Para detectar el PSA usando un IE de tipo sandwich, el anticuerpo 'de captura' se inmoviliza en la superficie de ensayo. El anticuerpo de captura se une a la proteina PSA presente en una muestra. El PSA capturado por el anticuerpo de captura se detecta usando un anticuerpo 'de deteccion', que esta marcado con biotina. La cantidad de anticuerpo de deteccion unido se detecta despues mediante incubacion con una enzima conjugada con una molecula de union a biotina tal como estreptavidina.
Se llevo a cabo un IE de tipo sandwich con PSA en MCF-FEP usando reactivos suministrados en forma de kit de R&D Systems (Minneapolis, MN, Estados Unidos, n.° de catalogo DY1344). Se realizaron una serie de experimentos de optimization para determinar las concentraciones de reactivo y los tiempos de incubacion mas apropiados para realizar un IE de tipo "sandwich" para detectar el PSA en MCF-FEp. Estos experimentos demostraron lo siguiente:
1) Se descubrio que la concentration optima de anticuerpo de captura para recubrir el interior de los capilares en MCF-FEP era l0 |jg/ml, en contraste con la concentracion optima de 1 |jg/ml para los ELISA de placa de microtitulacion. Esto fue lo esperado debido a la diferencia en la relation de area superficial sobre volumen en capilares de MCF-FEP en comparacion con las placas de microtitulacion.
2) La concentracion optima d los anticuerpos de deteccion no fue significativamente diferente entre los capilares de MCF-FEP con respecto a las placas de microtitulacion. Esto tambien fue lo esperado, ya que los anticuerpos de deteccion se usan a menudo en excesos significativos y por tanto la reduction de la concentracion a menudo tiene poco efecto sobre la sensibilidad del ensayo.
3) La concentracion optima de sustrato de orto-fenilendiamina (OPD) fue mas alta en MCF-FEP en comparacion con las placas de microtitulacion. De nuevo, esto fue lo esperado debido a la diferencia en la relacion de area superficial sobre volumen en capilares de MCF-FEP en comparacion con las placas de microtitulacion.
4) Para una sensibilidad optima, los tiempos de incubacion de una muestra y de anticuerpos de deteccion se redujeron significativamente para IE llevados a cabo en MCF-FEP, en comparacion con los tiempos de incubacion minimos requeridos por los ensayos de placa de microtitulacion.
5) El reactivo y los volumenes de lavado requeridos para ensayos realizados en MCF-FEP fueron de 2 a 4 veces mas bajos que para el ensayo de placa de microtitulacion.
Habiendo optimizado este protocolo de IE para MCF-FEP, se hizo una comparacion entre el IE MCF-FEP optimizado con un IE en placa de microtitulacion realizado de acuerdo con las instrucciones suministradas por el fabricante del kit. Para permitir la comparacion directa de la senal de ensayo, se convirtio la senal de deteccion optica del escaner de cama plana en una lectura de absorbancia y se normalizo a unidades de absorbancia por centimetro de longitud del camino usando las ecuaciones 1 y 2:
Abs — £t[C] (2)
Para el ensayo de placa de microtitulacion, la longitud del camino es 0,3 cm, mientras que para la MCF es 0,02 cm.
La Figura 36 muestra la sensibilidad de los IE de tipo sandwich realizados en MC-FEP y las placas de microtitulacion son comparables.
Una principal ventaja de los IE de tipo sandwich realizados en la matriz capilar extruida es el tiempo requerido para realizar el ensayo. Esto se representa en la Figura 37, que muestra los reducidos tiempos de incubacion requeridos cuando se llevan a cabo inmunoensayos de tipo sandwich en MCF-FEP en contraste con los largos tiempos de incubacion para los ensayos realizados en placas de microtitulacion. Se espera que el requisito de tiempos de incubacion reducidos se aplique a todos los tipos de IE realizados en la matriz capilar extruida en comparacion con los IE realizados en placas de microtitulacion. Las matrices capilares extruidas descritas en el presente documento son,
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por lo tanto, adecuadas para realizar ensayos de alto rendimiento.
La Figura 26 muestra una vista esquematica de una seccion transversal del formato de un dispositivo de inmunoensayo usado para obtener los resultados mostrados en la Figura 27.
La Figura 27 muestra imagenes obtenidas de un escaner de cama plana. Dos piezas cortas de MCF-FEP se lavaron en una solucion de PBS- Tween y luego se llenaron todos los capilares con una solucion de PBS-T o un sustrato totalmente convertido de diclorhidrato de orto-fenilendiamina (OPD) y despues se escanearon a 3.200 dpi usando un modo de luz transmitida en un escaner fotografico HP ScanJet 4050. Se muestran graficos promediados de la intensidad de pixel a traves de la pelicula o del capilar, junto con una barra de escala. El canal azul tambien se muestra por separado para ilustrar la elevada absorbancia de luz azul por el OPD convertido; de nuevo, se muestra la intensidad de pixel promediada.
Asi pues, se puede hacer individualmente una interrogacion cruzada de los capilares usando detectores opticos economicos.
Cabe estacar que al obtener los resultados mostrados en la Figura 27, se succionaron dos soluciones a traves de los 10 capilares en dos piezas de MCF y luego se adquirio una imagen RGB y se grabo en formato TIF. La imagen se dividio posteriormente en los tres canales RGB (es decir, Rojo, Verde y Azul) y se represento la intensidad de gris para obtener la distancia y de la pelicula, usando ImageJ. Las imagenes se escanearon usando un simple escaner de cama plana en modo de transmitancia. Este es un metodo sencillo y barato de deteccion optica y formacion de imagenes, sin embargo, se puede esperar la misma deteccion de senal para cualquier otra tecnica optica. Este medio de deteccion y cuantificacion de senal es factible debido a la superficie plana de la MCF y a las excelentes propiedades opticas del material de fluoropolimero usado para la extrusion de la MCF (que tiene un indice de refraccion similar al del agua, por lo tanto los capilares de MCF rellenos de agua son "invisibles"). Esto queda ademas avalado por las siguientes Figuras 28 y 29.
Las excelentes propiedades opticas de la MCF-FEP rellena con liquidos acuosos y los beneficios de la misma para una simple deteccion de senal quedan demostradas por el amplio intervalo de diferentes dispositivos de formacion de imagenes que pueden usarse para interrogar la MCF- FEP. Ademas del microscopio confocal usado para detectar un sustrato fluorescente (por ejemplo, figuras 24 y 25) y del escaner de cama plana HP Scanjet G4050 que se uso en modo de transmitancia utilizando una luz fluorescente de catodo frio y un dispositivo de acoplamiento de carga (CCD) de adquisicion de imagenes para medir un sustrato ELISA y colorante azul dentro de la FEP MCF (por ejemplo, figuras 26-34), se descubrio que tambien los siguientes dispositivos de formacion de imagenes eran eficaces para formar imagenes de MCF-FEP y medir senales opticas:
1) Un escaner de cama plana que opera en modo de reflectancia (en oposicion al de transmitancia). La absorbancia del substrato de OPD convertido se midio en modo de reflectancia y transmitancia en un escaner de cama plana HP Scanjet G4050 y se observo una absorbancia similar en cualquiera de los modos. La expresion "interrogacion optica" tal y como se usa en el presente documento, engloba cualquier tipo de interrogacion optica, ya se haya llevado a cabo en modo de transmitancia o en reflectancia.
2) Un escaner de cama plana compacto y portatil. Un escaner de cama plana (Canon LiDE modelo 700F) compacto y portatil, alimentado por USB, iluminado por un Diodo Emisor de Luz (LED) con detector de sensor de imagen por contacto (CIS), que opera en modo de transmitancia fue igualmente sensible que el HP Scanjet G4050 en la medicion del sustrato de OPD.
3) Una camara digital compacta. Se uso una camara digital compacta de 12 megapixeles, Konica Minolta, para tomar fotografias del agua comparada con una solucion acuosa naranja de yodo. Mientras que la MCF-FEP rellena con agua no mostro cambio alguno en intensidad de pixel a traves de la pelicula, la solucion naranja de yodo mostro una alta absorbancia en el canal azul. Sin personalizar una camara digital compacta para optimizar una deteccion, un anti antigeno del nucleo de la hepatitis B, tan minusculo como 2 ng/ml, pudo detectarse simplemente fotografiando la MCF-FEP despues de la incubacion del sustrato, usando una protocolo de ELISA estandar directo; la sensibilidad usando una camara digital compacta no optimizada fue tan solo 5 veces menor que cuando se uso un escaner de cama plana en modo de transmitancia.
4) Se descubrio que un LED de un unico color era una fuente de luz eficaz para medir la absorbancia de sustancias coloreadas en soluciones acuosas. Se observo una senal optica mas fuerte usando una camara digital compacta para tomar imagenes de una MCF-FEP rellena con una solucion coloreada de naranja con respecto a agua, cuando la MCF-FEP estaba iluminada con una fuente de luz que comprendia un LED azul que emitia una estrecha banda de longitudes de onda de luz azul.
5) Una camara integrada en un telefono inteligente (telefono movil manual con camara y ordenador integrados). Se pudieron detectar anticuerpos contra antigenos del nucleo de la hepatitis B y cuantificarse simplemente fotografiando las tiras de analisis de MCF-FEP con una camara digital integrada en un movil inteligente despues de la incubacion del sustrato usando un protocolo de ELISA estandar directo.
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6) Un dispositivo portatil que comprende un LED mas una matriz fotodetectora.
La Figura 28 muestra la deteccion de la senal en las MCF extruidas usando otros materiales termoplasticos. Se ensayaron las propiedades opticas de MCF extruidas a partir de materiales termoplasticos alternativos, usando el mismo procedimiento que se ha indicado antes. Como se muestra en la Figura 28, se muestras distorsiones opticas en las imagenes y estas afectan en gran medida a la senal obtenida mediante el tratamiento de imagenes. Se considera que esto es debido a la diferencia relativamente grande en el indice de refraccion de estos materiales alternativos comparados con agua. Asi pues, estas distorsiones opticas limitan el uso de estos materiales para cuantificar la senal de color generada. Los materiales ensayados fueron (Figuras 28(a)-(e): (a) MCF-EVA, (b) MCF-EVOH, (c) MCF-LV-LLDPE, (d) (c) MCF-COC, (e) MCF-HV-LLDPE. La tabla 1 muestra la geometria de MCF testadas.
Tabla 1. Ensayo de MCF extruidas ^ a partir de diferentes materiales^ termoplasticos
- Referencia MCF
- Material de la realizacion Diametro interno promedio del capilar (pm) N.° de capilares Indice de refraccion
- MCF-FEP
- Etileno-propileno fluorado (FEP) 206 10 1,34
- MCF-EVA
- Acetato de etilenvinilo (EVA), 142 19 1,48
- MCF-EVOH
- Etilen-vinil-alcohol (EVOH), 109 19 1,51-1,52
- MCF-LV-LLDPE
- Polietileno lineal de baja densidad (LLDPE), 167 19 1,51
- MCF-COC
- Copolimero de olefina ciclica (COC) 119 19 1,53
- MCF-HV-LLDPE
- Polietileno lineal de baja densidad (LLDPE), 200 17 1,51
Como se muestra en la Figura 28, se observaron MCF extruidas de diferentes materiales termoplasticos con un indice de refraccion significativamente diferente al del agua, una elevada distorsion y ruido de fondo, lo que por lo tanto impedia el uso de las MCF para IE cuantitativos.
La Figura 29 muestra los resultados obtenidos usando cuerpos capilares FEP circulares de un solo orificio. Esto muestra que el uso de cuerpos con una geometria plana proporciona una mejor deteccion de senales debido a que se evitan las distorsiones opticas. Este es particularmente el caso si se desea proporcionar una interrogacion cruzada directa de diferentes capilares.
La geometria de los capilares FEP ensayados en la Figura 29 se muestra en la Tabla 2.
Tabla 2. Geometria de los capilares FEP ensayados en la Figura 29
- Capilar Material D.O. (mm) D.I. (mm)
- FEP1-32x0,016 FEP 0,794 0,406
- FEP1-16x0,008 FEP 1,59 0,203
La deteccion de senales en estos capilares FEP circulares se ensayo usando el mismo procedimiento mencionado anteriormente para la Figura 27. Se ensayaron capilares de dos D.O./D.I. diferentes. Las elevadas relaciones de ruido sobre senal significan que la geometria circular de los capilares no es adecuada para la deteccion de senales de una interrogacion cruzada directa del capilar, soportando por lo tanto, el uso extensivo en la literatura de laseres de gran potencia para medir luz evanescente en inmunoensayos capilares.
Cuando se escanean capilares FEP circulares individuales, se producen dos problemas. Para un capilar fino con una pared fina la difraccion que se produce en los lados del capilar da un ruido alto, que enmascara la senal debido al color de la solucion en el capilar. Por otra parte, para un capilar de paredes gruesas, la difraccion en los lados del cuerpo del capilar supone un menor problema, sin embargo, la absorbancia del plastico da un elevado ruido de fondo que enmascara la senal.
Asi pues, la realizacion preferente de la presente invencion (pelicula microcapilar extruida formada a partir de FEP) produce unas relaciones muy superiores de senal sobre ruido que los capilares FEP circulares por dos motivos:
(a) Aunque hay difraccion y distorsion optica que da un elevado ruido de fondo en el borde de la pelicula (relacionado con los bordes redondeados de la MCF), los 8 capilares del medio no estan afectados por esta senal
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de borde.
(b) Las finas paredes plasticas no ofrecen una absorbancia de fondo que permita la deteccion de bajas concentraciones de colorante de absorcion.
Las Figuras 30A, 30B, 31 y 32 demuestran la sensibilidad de la realizacion preferente de la presente invencion en comparacion con una placa de microtitulacion para un ensayo de deteccion de Hepatitis B.
Todos los capilares dentro de una longitud de 2 m de MCF-FEP se revistieron con antigeno del Nucleo de la Hepatitis B, seguido de un bloqueo, lavado y cortado en piezas de 50 mm. Cada pieza se fijo a un conector individual y luego se aspiraron concentraciones crecientes de monoclonal anti-HB-CAg a traves de los 10 capilares en cada pieza diferente, seguido de la deteccion con anti-IgG de raton-HRP, un lavado exhaustivo y rellenar con sustrato OPD. Despues de 40 minutos, las piezas de pelicula se escanearon con un Foto escaner HP ScanJet 4050 en modo de transmitancia.
La Figura 30A muestra una representacion esquematica del ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima realizado en la MCF-FEP.
La Figura 30B muestra los resultados obtenidos por las secciones escaneadas de MCF-FEP para cada muestra analizada. Las imagenes en bruto RGB se dividieron entre los canales rojo, verde y azul. Se observo una fuerte absorcion de luz para el OPD convertido en el canal azul. Para el canal azul, se muestra un grafico de intensidad de pixel para una unica linea a traves de la pelicula, para su comparacion con el grafico promediado (panel inferior). Por cada RGB o canal de color se muestra tambien un grafico de la intensidad de pixel promediada a traves de la pelicula, tal y como se ha determinado con ImageJ.
Se midieron las intensidades de los picos de absorbancia azul individuales para los 8 capilares del medio que se ven en parte en la Figura 30B. La Figura 31 muestra un grafico de la intensidad media de pico para todas las muestras con respecto a la concentracion de anti-HB-CAg. Se muestran todas las barras de error e indican una desviacion tipica +/- 1.
Usando el mismo antigeno, anticuerpos y sustrato, se llevo a cabo un ELISA en una placa de inmunoensayo de microtitulacion de 96 pocillos. La densidad optica (D.O., solo para la Figura 32) o la absorbancia obtenida del ensayo de micropocillos con un lector de microtitulacion se represento con respecto a la concentracion y estos valores se compararon con la respuesta del escaner para el mismo intervalo de concentraciones de anti-HB-CAg medidas en la Figura 31.
Estos resultados muestran que la sensibilidad de un inmunoensayo en una MCF-FEP es identica a un ELISA convencional en placa de microtitulacion, a pesar de los diferentes volumenes, areas superficiales, metodos de procesamiento, material plastico y metodo de deteccion.
La Figura 33 muestra que el escaneado de secciones de MCF-FEP rellenas de diferentes soluciones de agua-glicerol da un indice de refraccion diferente para el fluido en el intervalo de 1,33 a 1,47. El indice de refraccion de MCF-FEP es 1,34 como se resume en la Tabla 1. Los pares de imagenes se corresponden a mezclas de agua-glicerol sin colorante (izquierda) y coloreadas de azul (derecha). Cada una de las soluciones coloreadas de azul incluye concentraciones identicas de colorante azul. Los graficos de los perfiles muestran la variation de la intensidad de pixel promediada a traves de las secciones de MCF-FEP.
La Figura 34 muestra secciones escaneadas de MCF-EVA rellenas con 0 % en peso y 100 % en peso de agua-glicerol que da un indice de refraccion de 1,33 y 1,47, respectivamente, para el fluido. El indice de refraccion de MCF-EVA es 1,48 como se resume en la Tabla 1. Los pares de la imagen se corresponden a mezclas de agua-glicerol sin colorante y coloreadas de azul. Los graficos de los perfiles muestran la variacion de la intensidad de pixel promediada a traves de las secciones de MCF-FEP. Cabe destacar en este caso, que el EVA tiene propiedades de transmision de luz relativamente pobres en comparacion con el FEP. Por este motivo, las imagenes de la Figura 34 no muestran un fuerte contraste entre el EVA y el fluido coloreado de azul.
La Figura 35A resume la variacion de la altura de pico media tal y como se ha determinado a partir de los graficos de los perfiles de las Figuras 33 y 34 para las mezclas de agua-glicerol sin colorante (ruido) y las coloreadas de azul (senal) en MCF-FEP y MCF-EVa a un indice de refraccion creciente del fluido.
La Figura 35B resume la variacion de la relation de senal media sobre ruido en MCF-FEP y MCF-EVA a un creciente indice de refraccion de mezclas de agua y glicerol.
Se considera que la elevada relacion de superficie sobre volumen (A/V) que presentan capilares individuales en una MCF (hasta 2 ordenes mayores de magnitud en comparacion con la de un micropocillo) permite obtener los resultados divulgados anteriormente para IE heterogeneos. La elevada relacion A/V de los capilares permite un ahorro significativo en reactivos y en tiempo para llevar a cabo un IE, debido a las menores escalas de volumen y longitud para difusion molecular en los capilares.
Los IEME, tal como se describen en el presente documento, son utiles para muchas aplicaciones diferentes,
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incluyendo el cuidado de la salud, el procesado de alimentos, el control qmmico y ambiental y los laboratorios de investigacion. En particular, la principal aplicacion para los IEME es como herramientas para su uso en el diagnostico de enfermedades, por ejemplo en la deteccion de marcadores de enfermedad, tales como biomarcadores de cardiopatias o cancer y patogenos. La simplicidad de los sistemas desvelados en el presente documento y el requerimiento de solo volumenes bajos de reactivos y muestra de fluido, los hace particularmente utiles para los diagnosticos en los paises del tercer mundo y para su uso en laboratorios de investigacion.
Las realizaciones preferentes de la invencion se han descrito a modo de ejemplo. Las modificaciones de estas realizaciones, las realizaciones adicionales y las modificaciones de las mismas seran evidentes para el experto en la materia al leer esta divulgacion y, como tales, estan dentro del alcanza de la presente invencion.
Referencias
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- 5101520253035404550556065REIVINDICACIONES1. Un dispositivo para llevar a cabo un inmunoensayo, teniendo el dispositivo:un cuerpo unitario con una superficie exterior, yal menos dos orificios capilares que se extienden internamente a lo largo del cuerpo unitario, en donde para cada orificio capilar una poblacion de primeros miembros de un respectivo par de union espedfica esta inmovilizada al menos en una porcion de la superficie del orificio capilar, siendo cada primer miembro capaz de unirse especificamente a un segundo miembro del respectivo par de union espedfica,en el que el cuerpo unitario es sustancialmente transparente a luz visible para permitir la interrogacion optica de los orificios capilares, y en donde el dispositivo esta formado por un material que tiene un indice de refraccion que esta en el intervalo de 1,26 a 1,40 y esta dentro de mas o menos 0,07 del indice de refraccion de la muestra de fluido, midiendose el indice de refraccion a 20 °C con una luz de longitud de onda de 589 nm.
- 2. Un dispositivo de acuerdo con la reivindicacion 1 en el que el orificio capilar tiene un diametro interno de al menos 10 |jm y como maximo de 1 mm.
- 3. Un dispositivo de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2 en el que un orificio capilar en el dispositivo tiene una superficie tratada de forma diferente de al menos otro orificio capilar en el dispositivo, proporcionando la diferencia en el tratamiento de la superficie una diferencia medible en la realizacion del inmunoensayo entre los orificios.
- 4. Un dispositivo de acuerdo con la reivindicacion 3,en el que dicho un orificio tiene una concentracion diferente de primeros miembros adsorbidos a su superficie en comparacion con dicho al menos un otro orificio; oen el que dicho un orificio tiene unos primeros miembros de un diferente par de union espedfica adsorbidos a su superficie en comparacion con dicho al menos un otro orificio.
- 5. Un dispositivo de acuerdo con la reivindicacion 1,en el que dos o mas orificios capilares tienen superficies tratadas de manera identica, con el fin de proporcionar redundancia de medicion en el dispositivo; oen el que dos o mas orificios capilares tienen superficies tratadas de manera identica y uno u otros orificios mas en el mismo dispositivo tienen una superficie tratada de manera diferente.
- 6. Un dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en donde la superficie exterior del cuerpo incluye una primera superficie de medicion y una segunda superficie de medicion, de manera que, en uso, la luz se transmite a traves del dispositivo desde la primera superficie de medicion a la segunda superficie de medicion, al menos una (y preferentemente ambas) de la primera superficie de medicion y la segunda superficie de medicion se extiende sustancialmente paralela a los ejes principales de los dos o mas orificios capilares.
- 7. Un dispositivo de acuerdo con la reivindicacion 6 en el que la primera superficie de medicion y la segunda superficie de medicion son sustancialmente planares.
- 8. Un sistema de inmunoensayo para llevar a cabo inmunoensayos, teniendo el sistema una pluralidad de dispositivos de inmunoensayo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y un soporte para mantener la pluralidad de dispositivos de inmunoensayo.
- 9. Un sistema de inmunoensayo de acuerdo con la reivindicacion 8 en el que el soporte esta adaptado para mantener los dispositivos de inmunoensayo en una matriz sustancialmente planar.
- 10. Un sistema de inmunoensayo de acuerdo con la reivindicacion 8 o la reivindicacion 9 en el que el soporte proporciona medios de observacion para permitir la observacion de al menos una parte de cada dispositivo de inmunoensayo.
- 11. Un sistema de inmunoensayo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 en el que el soporte proporciona medios para aspirar el fluido a traves de los orificios capilares de los dispositivos de inmunoensayo, y en el que el sistema de inmunoensayo ademas incluye de manera opcional una bandeja que tiene una disposicion de los pocillos adaptada para recibir reactivos, muestras de fluido u otros liquidos requeridos para el inmunoensayo, estando la bandeja adaptada para recibir al menos un extremo de cada dispositivo de inmunoensayo cuando los dispositivos de inmunoensayo se mantienen en el soporte.
- 12. Un metodo para realizar un inmunoensayo para detectar la presencia o la ausencia del segundo miembro de union en una muestra de fluido usando un dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, incluyendo el metodo las etapas:proporcionar una muestra de fluido en los orificios capilares del dispositivo; einterrogar opticamente los orificios capilares.
- 13. Un metodo para fabricar un dispositivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, incluyendo el metodo:5proporcionar un cuerpo extruido que tiene al menos dos orificios capilares que se extienden internamente a lo largo del cuerpo, en donde el cuerpo esta formado de un material que tiene un indice de refraccion en el intervalo de 1,26 a 1,40, midiendose el mdice de refraccion a 20 °C con una luz de longitud de onda de 589 nm; e insertar una respectiva carga de fluido en cada orificio capilar del cuerpo extruido, comprendiendo cada carga de 10 fluido dichos primeros miembros del respectivo par de union especifica, para inmovilizar los primeros miembros de al menos una porcion de la superficie del orificio capilar y formar un cuerpo extruido cargado.
- 14. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 13,en donde el metodo ademas incluye la etapa de cortar el cuerpo extruido cargado para formar el dispositivo para un 15 inmunoensayo de una longitud requerida, en donde el cuerpo extruido cargado, antes de cortarlo, opcionalmente tiene una longitud de al menos 20 cm; oen donde el metodo es un metodo para fabricar un conjunto de n dispositivos, incluyendo el metodo ademas cortar el cuerpo extruido cargado para formar el conjunto de n dispositivos, teniendo cada dispositivo una longitud de al menos X, en donde el cuerpo extruido cargado, antes de cortarlo, tiene una longitud de al menos nX, o una longitud de al 20 menos 20 cm.