ES2587795T3

ES2587795T3 - Método y composición de medición de la cantidad de derivados de vitamina D

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Publication number: ES2587795T3
Application number: ES10740698.5T
Authority: ES
Inventors: P. Martin Petkovich; Christian F. Helvig
Original assignee: Opko Ireland Global Holdings Ltd
Current assignee: Opko Ireland Global Holdings Ltd
Priority date: 2009-05-06
Filing date: 2010-05-03
Publication date: 2016-10-26
Anticipated expiration: 2030-05-03
Also published as: US9382307B2; EP2427484A1; US20120094396A1; US8574862B2; WO2010128393A1; EP2427484B1; US20140039157A1

Abstract

Un método de medición de la cantidad o de la concentración de un derivado de vitamina D en una muestra, en el que el derivado de vitamina D es 25-hidroxi-vitamina D, método que comprende: a) poner en contacto una muestra con un polipéptido que comprende un dominio de unión al ligando de VDR modificado (LBD de BDR) y un par donante-aceptor de fluoróforos; y b) medir la cantidad de fluorescencia, en el que dicha cantidad de fluorescencia es detectablemente superior o inferior en presencia del derivado de vitamina D en comparación con la cantidad de fluorescencia en ausencia del derivado de vitamina D; en el que el dominio de unión al ligando de VDR corresponde a los aminoácidos 118-427 de SEQ ID NO: 1, y en el que el VDR modificado es una versión mutada del dominio de unión al ligando de VDR, en el que la mutación puede implicar la inserción, deleción y/o sustitución, y comprende al menos una mutación causante de que dicha VDR modificada tenga una afinidad de unión por 25-hidroxi-vitamina D superior en comparación con el calcitriol, comprendiendo dicha al menos una mutación una sustitución en una posición de aminoácido seleccionada entre 274, 147, 150, 227, 230, 233, 234, 271, 275, 286, 288, 300, 309, 313, 418, 237, 143, 278, 305 y 397, y en el que el VDR modificado es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos superior al 80 % con, en una región de más de 300 aminoácidos, el dominio de unión al ligando de VDR que corresponde a los aminoácidos 118-427 de SEQ ID NO: 1.

Description

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A modo de ejemplo, Tyr-147, Phe-150, Leu-227, Leu-230, Leu-233, Val-234, Ile-271, Ser-275, Trp-286, Cys-288, Val-300, Leu-309, Leu-313 y Val-418. Val-418, Ser-237, Arg-274, Tyr-143, Ser-278, His-305 e His-397 se podrían modificar para generar nuevas propiedades al VDR.

La invención proporciona fragmentos de VDR que comprenden el dominio de unión al ligando (LBD de VDR), o análogos o variantes del mismo, y usos de los mismos en los métodos de detección de la invención. Como se usa en el presente documento, la expresión "LBD de VDR modificado" se refiere a fragmentos del LBD de VDR, o análogos o variantes de los mismos que presentan afinidad de unión alterada (superior o inferior) por un derivado de vitamina D con respecto a un derivado de la vitamina D diferente, y a los usos de los mismos en los métodos de detección de la invención. Por ejemplo, normalmente el VDR presenta una mayor afinidad de unión por 1,25-hidroxivitamina D que por 25-hidroxi-vitamina D. De acuerdo con una realización de la invención, se proporciona un LBD de VDR modificada que favorece la unión de 25-hidroxi-vitamina D frente al calcitriol. Dicho LBD de VDR modificada (por ejemplo, LBD de VDRm), se puede usar de acuerdo con los métodos de la invención para detectar la presencia de 25-hidroxi-vitamina D. En algunas realizaciones, el LBD de VDR modificada tiene al menos una de entre aproximadamente 10 veces, 25 veces, 50 veces, 75 veces, 100 veces, 200 veces, 300 veces, 400 veces, 500 veces

o más afinidad de unión por 25-hidroxi-vitamina D que por 1,25-hidroxi-vitamina D. En algunas realizaciones, el LBD de VDR modificada tiene una mayor afinidad de unión por 25-hidroxi-vitamina D2 que por 1,25-hidroxi-vitamina D2, mientras que, en otras realizaciones, el LBD de VDR modificada tiene una mayor afinidad de unión por 25-hidroxivitamina D3 que por 1,25-hidroxi-vitamina D3.

El grupo hidroxilo de C1 del calcitriol se coordina en el bolsillo de unión del LBD de VDR mediante la formación de enlaces de hidrógeno con Ser-237 y Arg-274. Presumiblemente, esto estabiliza la unión del calcitriol frente a la de la 25-hidroxi-vitamina D. Se sabe que una mutación natural en Arg-274 (Arg274Leu) da lugar a raquitismo resistente a la vitamina D. La afinidad de unión de un VDR con esta mutación en particular es aproximadamente 1.000 veces inferior a la del VDR de tipo silvestre (Kristjansson, K., Rut, A. R., Hewison, M., O'Riordan J. L. y Hughes, M. R. “Two mutations in the hormone binding domain of the vitamin D receptor cause tissue resistance to 1,25 dihydroxy vitamin D3” (1993) J. Clin. Invest., 92, 12-16. Dado que la cadena lateral hidrófoba voluminosa de leucina situada en la Arg274Leu interferiría con el posicionamiento del grupo hidroxilo de C1, dicha mutación favorecerá la unión de la 25hidroxi-vitamina D. Se han introducido mutaciones en Ser-237, incluyendo un Ser237Ala mutante que muestra una unión aproximadamente 27 veces más débil hacia la 1,25-hidroxi-vitamina D3, debido a la pérdida de un enlace de hidrógeno estabilizador (Yamada, S, Yamamoto, K., Masuno, H. y Choi, M. “Three-dimensional structure-function relationship of vitamin D and vitamin D receptor model”. (2001) Steroids 66, 177-187). Se puede prever que la mutación de Ser-237 a una cadena lateral hidrófoba más voluminosa producirá tanto una pérdida de un enlace de hidrógeno estabilizador como el aumento de conflictos estéricos con el grupo 1-hidroxilo, favoreciendo de este modo la unión de 25-hidroxi-vitamina D frente a la de la 1-25-dihidroxi-vitamina D. Además, se pueden construir LBD de VDR sintéticos que modifiquen uno o ambos de Ser-237 y Arg-274 con varios grupos de cadena lateral de aminoácidos que interferirán con la unión del calcitriol, pero que favorecerán la de la 25-hidroxi-vitamina D. Los ejemplos de dichas mutaciones incluyen, pero sin limitación, Ser237Val, Ser237Ile, Ser237Leu, Ser237Ala, Arg274Leu, Arg274Val y Arg274Ile. Se puede contemplar una serie de construcciones de LBD de VDR que pueden favorecer la unión de la 25-dihidroxi-vitamina D frente a la del calcitriol y, por lo tanto, que se podrían usar en la construcción basada en FRET para el análisis de la presencia de 25-dihidroxi-vitamina D.

Los LBD de VDR modificado proporcionados por la invención incluyen, por ejemplo y sin limitación, polipéptidos que comprenden los dominios de unión al ligando descritos anteriormente en el presente documento, o análogos o variantes de los mismos, polipéptidos codificados por un ácido nucleico descrito en el presente documento y/o polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene identidad de secuencia de aminoácidos superior al aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 91 %, aproximadamente 92 %, aproximadamente 93 %, aproximadamente 94 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 % o aproximadamente 99 % o superior en una región de al menos 300, aproximadamente 400 o más aminoácidos del dominio de unión al ligando de la proteína nativa, incluyendo sus sustituciones conservadoras o no conservadoras. En algunas realizaciones, un LBD de VDR modificado comprende una secuencia de aminoácidos que está unida específicamente por un anticuerpo, por ejemplo, anticuerpos policlonales o monoclonales, generado contra cualquiera de los dominios de unión al ligando descritos en el presente documento. Dicho LBD de VDR modificado conservará la afinidad de unión por el derivado de vitamina D mostrado por SEQ ID NO: 1, o un homólogo de especie del mismo. Como alternativa, dicho LBD de VDR modificado presentará una afinidad de unión alterada por los derivados de vitamina D descritos en el presente documento, incluyendo, pero sin limitación, una afinidad de unión relativamente más alta por 25-hidroxivitamina D que por 1,25-hidroxi-vitamina D. En algunas realizaciones, dicho LBD de VDR modificado con afinidad de unión relativamente más alta por 25-hidroxi-vitamina D puede comprender una mutación de aminoácido (inserción, deleción o sustitución) en una cualquiera o más de la posición 237, 274, etc. de SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la mutación de la posición 274 comprende una sustitución de un resto de aminoácido básico con un resto de aminoácido alifático. En algunas realizaciones, la mutación es una sustitución de Arg274Leu. En algunas realizaciones, el LBD de VDR modificado eliminará ciertas secuencias de aminoácidos que incluyen secuencias que se consideran estructuralmente variables, por ejemplo, los aminoácidos 165-215 se pueden eliminar para producir un dominio de unión al ligando que consista en los aminoácidos 118 a 164 seguidos directamente por los aminoácidos 216 a 427.

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Los polinucleótidos que codifican un LBD de VDR modificado de la invención incluyen, sin limitación, los que (1) se hibridan específicamente en condiciones de hibridación rigurosas con un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de referencia como se describe en el presente documento y sus variantes modificadas de manera conservadora; (2) tienen una secuencia de ácido nucleico que tiene identidad de secuencia de nucleótidos superior al aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 99 % o superior en una región de al menos aproximadamente 25, aproximadamente 50, aproximadamente 100, aproximadamente 150, aproximadamente 200, aproximadamente 250, aproximadamente 500, aproximadamente 1.000 o más nucleótidos (hasta la secuencia de longitud completa de 1.281 nucleótidos de la proteína madura) con una secuencia de ácido nucleico de referencia como la descrita en el presente documento.

Los polinucleótidos que codifican fragmentos, variantes y análogos pueden ser generados fácilmente por un experto para codificar fragmentos, variantes o análogos biológicamente activos de la molécula de origen natural que posean la misma o similar actividad biológica de la molécula de origen natural. Estos polinucleótidos se pueden preparar usando técnicas de PCR, digestión/ligación de molécula codificante de ADN y similares. Por lo tanto, un experto en la materia será capaz de generar cambios de una sola base en la cadena de ADN para dar lugar a un codón alterado y una mutación de sentido erróneo, usando cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, pero sin limitación, mutagénesis específica del sitio. Como se usa en el presente documento, la expresión "condiciones de hibridación moderadamente rigurosas" significa, por ejemplo, hibridación a 42 ºC en formamida al 50 % y lavado a 60 ºC en 0,1 x SSC, SDS al 0,1 %. Los expertos en la materia entienden que la variación en estas condiciones se produce basándose en la longitud y el contenido de bases de nucleótidos GC de las secuencias que se van a hibridar. Las fórmulas convencionales en la técnica son apropiadas para determinar las condiciones de hibridación exactas. Véase Sambrook et al., 9.47-9.51 en “Molecular Cloning”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989).

Los análogos pueden ser esencialmente homólogos o esencialmente idénticos al VDR recombinante o al LBD de VDR de los que se obtienen.

Los análogos por sustitución normalmente intercambian un aminoácido del tipo silvestre por otro de uno o más sitios dentro de la proteína, y pueden diseñarse para modular una o más propiedades del polipéptido sin la pérdida de otras funciones o propiedades. En un aspecto, las sustituciones son sustituciones conservadoras. Se contempla además que un polipéptido de la invención puede ser una proteína de fusión con un segundo agente que sea un polipéptido. En una realización, el segundo agente que es un polipéptido, sin limitación, es un fluoróforo útil en la FRET, una enzima, un factor de crecimiento, un anticuerpo, una citoquina, una quimiocina, un receptor de superficie celular, el dominio extracelular de un receptor de la superficie celular, una molécula de adhesión celular, un marcador de purificación, una proteína de unión al ligando, o un fragmento o dominio activo de una proteína descrita anteriormente. Los dos polipéptidos que comprenden la proteína de fusión pueden estar separados por un tercer segmento de polipéptido conocido como enlazador, que puede consistir en cualquier número de aminoácidos superior o igual a uno. La proteína de fusión contemplada se crea mediante técnicas químicas o recombinantes bien conocidas en la técnica.

CLONACIÓN, EXPRESIÓN Y PURIFICACIÓN DEL RECEPTOR DE VITAMINA D

El receptor de la vitamina D recombinante de la presente invención se puede producir mediante cualquier método conocido en la técnica. Por lo tanto, en la técnica, se conocen métodos para (i) la producción de ADN recombinante mediante ingeniería genética, por ejemplo, a través de la transcripción inversa del ARN y/o amplificación del ADN;

(ii) la introducción de ADN recombinante en células procariotas o eucariotas por transfección, por ejemplo, a través de electroporación, transformación o microinyección; (iii) el cultivo de dichas células transformadas, por ejemplo, de manera continua o de manera discontinua; (iv) la expresión del receptor de vitamina D recombinante, por ejemplo, constitutivamente o tras la inducción; y (v) el aislamiento de dicho receptor de vitamina D recombinante, por ejemplo, del medio de cultivo o mediante la recogida de las células transformadas para (vi) obtener receptor de vitamina D recombinante purificado, por ejemplo, a través de cromatografía de intercambio aniónico o cromatografía de afinidad. Se puede fabricar un receptor de vitamina D recombinante en células hospedadoras transformadas usando técnicas de ADN recombinante bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, las secuencias de codificación del polipéptido se podrían escindir del ADN usando enzimas de restricción adecuadas.

Como alternativa, la molécula de ADN se podría sintetizar usando técnicas de síntesis química tales como el método de fosforamidato. Además, se podría usar una combinación de estas técnicas. Los polipéptidos de la invención se pueden fabricar mediante métodos sintéticos. Por ejemplo, se pueden usar técnicas de síntesis en fase sólida. Las técnicas adecuadas son bien conocidas en la materia, e incluyen las descritas en Merrifield (1973), Chem. Polypeptides, pág. 335-61 (Katsoyannis y Panayotis eds.); Merrifield (1963), J. Am. Chem. Soc. 85: 2149; Davis et al. (1985), Biochem. Intl. 10: 394-414; Stewart y Young (1969), “Solid Phase Peptide Synthesis”; patente de EE.UU. n.º 3.941.763; Finn et al. (1976), “The Proteins” (3ª ed.) 2: 105-253; y Erickson et al. (1976), “The Proteins” (3ª ed.) 2: 257-527. La síntesis en fase sólida es la técnica preferida de la fabricación de péptidos individuales, ya que es el método más rentable de fabricación de péptidos pequeños.

Los métodos de preparación de fragmentos de polipéptidos, variantes o análogos son bien conocidos en la técnica.

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Los fragmentos de un polipéptido se preparan usando, sin limitación, escisión enzimática (por ejemplo, tripsina, quimotripsina) y también usando medios recombinantes para generar fragmentos de polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos específica. Se pueden generar fragmentos de polipéptido que comprendan una región de la proteína que tenga una determinada actividad, tal como un dominio de unión al ligando o cualquier otro dominio VDR identificable conocido en la materia.

También se conocen métodos de fabricación de análogos de polipéptidos. La invención también proporciona vectores que codifican los polipéptidos de la invención en un hospedador apropiado. El vector comprende el polinucleótido que codifica el polipéptido unido operativamente a secuencias de control de la expresión apropiadas. Se conocen bien los métodos para efectuar dicha unión operativa, bien antes o después de la inserción del polinucleótido en el vector. Las secuencias de control de la expresión incluyen promotores, activadores, potenciadores, operadores, sitios de unión a ribosomas, señales de inicio, señales de parada, señales de protección con capuchón, señales de poliadenilación y otras señales que intervienen en el control de la transcripción o de la traducción. El vector resultante que tiene el polinucleótido en el mismo se usa para transformar un hospedador apropiado. Esta transformación se puede realizar usando métodos bien conocidos en la técnica.

En otros aspectos más, se usa una amplia variedad de vectores para la preparación del VDR o del LBD del VDR, y se seleccionan entre vectores de expresión eucariotas y procariotas. Los ejemplos de vectores para la expresión procariota incluyen plásmidos tales como, y sin limitación, pRSET, pET y pBAD, en los que los promotores usados en vectores de expresión procariotas incluyen uno o más de, y sin limitación, lac, trc, trp, recA o araBAD . Los ejemplos de vectores para la expresión eucariota incluyen: (i) para la expresión en levadura, vectores tales como, y sin limitación, pAO, pPIC, pYES o pMET, usando promotores tales como, y sin limitación, AOX1, GAP, GAL1 o AUG1 ; (ii) para la expresión en células de insectos, vectores tales como, y sin limitación, pMT, pAc5, pIB, pMIB o pBAC, usando promotores tales como, y sin limitación, PH, p10, MT, Ac5, OpIE2, gp64 o polh, e (iii) para la expresión en células de mamíferos, vectores tales como, y sin limitación pSVL, pCMV, pRc/RSV, pcDNA3 o pBPV, y vectores derivados de, en un aspecto, sistemas virales tales como, y sin limitación, virus vaccinia, virus adenoasociados, virus del herpes o retrovirus, usando promotores tales como, y sin limitación, CMV, SV40, EF-1, UbC, RSV, ADV, BPV y β-actina.

Se puede usar cualquiera de un gran número de células hospedadoras disponibles y bien conocidas en la práctica de la presente invención. La selección de un determinado hospedador depende de una serie de factores reconocidos por la técnica, incluyendo, por ejemplo, la compatibilidad con el vector de expresión elegido, la toxicidad de los péptidos codificados por la molécula de ADN, la tasa de transformación, la facilidad de recuperación de los péptidos , características de expresión, la bioseguridad y los costes. Se ha de alcanzar un equilibrio entre estos factores, entendiendo que no todas las células hospedadoras son igualmente eficaces para la expresión de una secuencia de ADN en particular. Dentro de estas directrices generales, las células hospedadoras microbianas útiles incluyen células de bacterias, de levaduras y de otros hongos, de insectos, de plantas y de mamíferos (incluyendo seres humanos) en cultivo, u otros hospedadores conocidos en la técnica. Los ejemplos de células eucariotas son células de mamífero, tales como CHO, COS, HEK 293, BHK, SK-Hep y HepG2.

A continuación, el hospedador transformado se cultiva y se purifica. Las células hospedadoras pueden cultivarse en condiciones de fermentación convencionales de forma que se expresen los compuestos deseados. Dichas condiciones de fermentación son bien conocidas en la técnica. Por último, los polipéptidos se aíslan y, opcionalmente, se purifican a partir del cultivo, o bien de medios de cultivo o de las células hospedadoras, mediante métodos bien conocidos en la técnica.

MÉTODOS DE DETECCIÓN

Los métodos de la invención monitorizan los cambios conformacionales inducidos por la unión del derivado de vitamina D al VDR, polipéptido que comprende un LBD de VDR modificado. La unión del derivado de vitamina D produce cambios conformacionales detectables que corresponden cuantitativamente a la cantidad de derivado de vitamina D presente en una muestra. Se puede analizar una variedad de muestras de acuerdo con los métodos de la presente invención, incluyendo muestras analíticas, producto de fármaco a granel, producto farmacéutico terminado

o relleno, o muestras de pacientes y animales, tales como sangre, plasma, suero, orina, saliva y tejido.

Hay numerosos métodos disponibles para monitorizar los cambios conformacionales inducidos por las interacciones proteína-proteína (por ejemplo, unión de ligando-receptor) (“Protein-Ligand Interactions: Methods and Applications”. (2005) Methods in Molecular Biology, Vol 305. G. Ulrich Nienhaus, Editor); véase también (“Protein-Protein Interactions: Methods and Applications”. (2004) Methods in Molecular Biology, Vol 261. Haian Fu, Editor)). Estas técnicas se pueden adaptar a los métodos de la presente invención. Un ejemplo de una técnica adecuada es la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia o FRET, que detecta la transferencia no radiante de la energía fotónica de un fluoróforo excitado (el donante) a otro fluoróforo (el aceptor) cuando ambos se encuentran muy cerca (por ejemplo, 1-10 nm). Así pues, la FRET es capaz de resolver la proximidad relativa de un par de moléculas más allá del límite óptico de un microscopio óptico. La aplicación convencional de la tecnología FRET ha sido la de monitorizar las interacciones moleculares entre dos proteínas, por ejemplo, cuando cada miembro de un par proteína-proteína se marca con los fluoróforos donante y aceptor correspondientes. En algunas circunstancias,

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Se entiende que cualquier valor numérico indicado en el presente documento incluye todos los valores desde el valor inferior al valor superior, es decir, todas las combinaciones posibles de valores numéricos entre el valor más bajo y el valor más alto enumerados se consideran indicadas expresamente en la presente solicitud. Por ejemplo, si se indica un intervalo de concentraciones o un intervalo de efectos beneficiosos tal como de 1 a 50, se pretende que los valores tales como de 2 a 40, de 10 a 30 o de 1 a 3, etc., estén expresamente enumerados en la presente memoria descriptiva. Estos son solo ejemplos de lo que se pretende en concreto.

Las composiciones, los métodos y los kits de la invención son útiles para la evaluación de muestras de fluidos corporales o de tejidos corporales, por ejemplo, muestras de sangre, plasma, suero, CSF, orina o tejido, de cualquier sujeto. Los sujetos adecuados incluyen sujetos sanos, sujetos que necesitan la administración de suplementos de vitamina D, sujetos en riesgo de insuficiencia o deficiencia de vitamina D o de derivados de vitamina D, sujetos que padecen insuficiencia o deficiencia de vitamina D o de derivados de vitamina D, sujetos que están siendo tratados con vitamina D o derivados de vitamina D, y sujetos con enfermedades sensibles a la vitamina D.

En algunas realizaciones, los métodos de la invención se aplican para detectar derivado de vitamina D en muestras de pacientes que necesitan la administración de suplementos de vitamina D, incluyendo, pero sin limitación, sujetos sanos y sujetos con riesgo de insuficiencia o deficiencia de vitamina D, por ejemplo, sujetos con enfermedad renal crónica (ERC) en fase 1, 2, 3, 4 o 5; sujetos con osteodistrofia renal (incluyendo osteomalacia y osteítis fibrosa quística); bebés, niños y adultos que no beben leche enriquecida con vitamina D (por ejemplo, los sujetos intolerantes a la lactosa, los sujetos con alergia a la leche, los vegetarianos que no consumen leche y los bebés alimentados con leche materna); sujetos con raquitismo; sujetos de piel oscura (por ejemplo, en EE.UU., el 42 % de las mujeres afroamericanas de entre 15 y 49 años de edad resultaron tener deficiencia de vitamina D frente al 4 % de las mujeres blancas); ancianos (que tienen una capacidad reducida para sintetizar la vitamina D en la piel durante la exposición a la luz solar y también son más propensos a no salir al exterior); adultos ingresados en centros (que son propensos a no salir al exterior, incluyendo los sujetos con enfermedad de Alzheimer o enfermedades mentales); sujetos que cubren toda la piel expuesta (por ejemplo, miembros de ciertas religiones o culturas); sujetos que siempre usan protector solar (por ejemplo, la aplicación de protector solar con un factor de protección solar (SPF) de 8 reduce la producción de vitamina D en un 95 %, y los FPS más altos pueden reducir aún más la producción cutánea de vitamina D); sujetos con síndromes de mala absorción de grasas (incluyendo, pero sin limitación, fibrosis quística, enfermedad hepática colestásica, otras enfermedades hepáticas, enfermedad de la vesícula, deficiencia de enzima pancreática, enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad esprue o celíaca, o en la extirpación quirúrgica de parte o la totalidad de la estómago y/o de los intestinos); sujetos con enfermedad inflamatoria intestinal; sujetos con enfermedad de Crohn; sujetos que han tenido resecciones del intestino delgado; sujetos con enfermedad de las encías; sujetos que toman medicamentos que aumentan el catabolismo de la vitamina D, incluyendo fenitoína, fosfenitoína, fenobarbital, carbamazepina y rifampicina; sujetos que toman medicamentos que reducen la absorción de la vitamina D, incluyendo colestiramina, colestipol, orlistat, aceite mineral y sustitutos de la grasa; sujetos que toman medicamentos que inhiben la activación de la vitamina D, incluyendo ketoconazol; sujetos que toman medicamentos que disminuyen la absorción del calcio, incluyendo los corticosteroides; sujetos con obesidad (la vitamina D depositada en depósitos de grasa corporal es menos biodisponible); sujetos con osteoporosis y/o mujeres posmenopáusicas.

En algunas realizaciones, los métodos de la invención se aplican para detectar derivado de vitamina D en muestras de pacientes con enfermedades sensibles a la vitamina D, es decir, enfermedades en las que la vitamina D, 25(OH)D o la vitamina D activa (por ejemplo, 1,25(OH)2D) impide la aparición o la progresión de la enfermedad, o reduce los signos o síntomas de la enfermedad. Dichas enfermedades sensibles a la vitamina D incluyen el cáncer (por ejemplo, cáncer de mama, de pulmón, de piel, melanoma, de colon, colorrectal, rectal, de próstata y de hueso). Se ha observado que 1,25(OH)2D induce la diferenciación celular y/o inhibe la proliferación celular in vitro para una serie de células. Las enfermedades sensibles a la vitamina D también incluyen enfermedades autoinmunes, por ejemplo, diabetes de tipo I, esclerosis múltiple, artritis reumatoide, polimiositis, dermatomiositis, esclerodermia, fibrosis, enfermedad de Grave, enfermedad de Hashimoto, rechazo agudo o crónico de trasplante, enfermedad aguda o crónica del injerto contra el hospedador, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn, lupus eritematoso sistémico, síndrome de Sjogren, eczema y psoriasis, dermatitis, incluyendo la dermatitis atópica, dermatitis de contacto, dermatitis alérgica y/o dermatitis crónica. Las enfermedades sensibles a la vitamina D también incluyen otras enfermedades inflamatorias, por ejemplo, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, enfermedad renal poliquística (PKD), síndrome del ovario poliquístico, pancreatitis, nefritis, hepatitis y/o infección. También se ha informado que las enfermedades sensibles a la vitamina D incluyen hipertensión y enfermedades cardiovasculares. Por lo tanto, los métodos de la invención incluyen muestras de ensayo de sujetos en riesgo de padecer o que padecen enfermedades cardiovasculares, por ejemplo, sujetos con aterosclerosis, arteriosclerosis, enfermedad de la arteria coronaria, enfermedad cerebrovascular, enfermedad vascular periférica, infarto de miocardio, isquemia miocárdica, isquemia cerebral, apoplejía, insuficiencia cardiaca congestiva, cardiomiopatía, obesidad o otros trastornos del peso, trastornos lipídicos (por ejemplo, hiperlipidemia, dislipidemia incluyendo dislipidemia diabética asociada e hipoalfalipoproteinemia de dislipidemia mixta, hipertrigliceridemia, hipercolesterolemia, y bajo HDL (lipoproteína de alta densidad)), trastornos metabólicos (por ejemplo, síndrome metabólico, diabetes mellitus de tipo II, diabetes mellitus de tipo I, hiperinsulinemia, intolerancia a la glucosa, resistencia a la insulina, complicaciones diabéticas incluyendo neuropatía, nefropatía, retinopatía, úlcera del pie diabético y cataratas) y/o trombosis.

Claims

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