ES2548980T3 - Factor de viabilidad neuronal y uso del mismo - Google Patents
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Abstract
Un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID Nº 4.
Description
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puntual discreta o truncamiento.
Los polipéptidos de la invención pueden presentar modificaciones postraduccionales incluyendo, pero sin limitación, glicosilaciones (por ejemplo, N- u O-glicosilaciones), miristilaciones, palmitilaciones, acetilaciones y fosforilaciones (por ejemplo, serina/treonina o tirosina).
Los polipéptidos de la invención pueden producirse por cualquier técnica conocida per se en este campo, tal como, sin limitación, cualquier técnica química, biológica, genética o enzimática, sola o en combinación.
Conociendo la secuencia de aminoácidos de la secuencia deseada, un experto en la materia puede producir fácilmente dichos polipéptidos mediante técnicas convencionales para la producción de polipéptidos. Por ejemplo, pueden sintetizarse usando métodos en fase sólida bien conocidos, preferentemente usando un aparato de síntesis de péptidos disponible en el mercado (tal como el fabricado por Applied Biosystems, Foster City, California) y siguiendo las instrucciones del fabricante.
Como alternativa, los polipéptidos de la invención pueden sintetizarse por técnicas de ADN recombinante como es bien conocido en la técnica. Por ejemplo, estos fragmentos pueden obtenerse como productos de expresión de ADN después de la incorporación de secuencias de ADN que codifican el polipéptido deseado en vectores de expresión y de la introducción de dichos vectores en hospedadores eucariotas o procariotas adecuados que expresarán el polipéptido deseado, a partir del cual pueden aislarse posteriormente usando técnicas bien conocidas.
Los polipéptidos de la invención pueden usarse en una forma aislada (por ejemplo, purificada) o están incluidos en un vector, tal como una vesícula de membrana o de lípidos (por ejemplo, un liposoma).
Moléculas de ácido nucleico de la invención
Un aspecto de la invención se refiere a moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican un polipéptido de la invención, así como a moléculas de ácido nucleico suficientes para usarse como sondas de hibridación para identificar moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido de la invención y a fragmentos de dichas moléculas de ácido nucleico adecuados para usarse como cebadores de PCR para la amplificación o mutación de moléculas de ácido nucleico.
La invención también se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido de la invención.
En una realización particular, la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que tiene la secuencia de nucleótidos indicada en la SEC ID Nº 5.
Una molécula de ácido nucleico de la presente invención puede aislarse usando técnicas de biología molecular convencionales y la información de secuencia proporcionada en el presente documento. Usando todo o una parte de las secuencias de ácido nucleico de la invención como sonda de hibridación, las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden aislarse usando técnicas de hibridación y clonación convencionales (por ejemplo, como se describe en Sambrook et al., eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
Una molécula de ácido nucleico de la invención puede amplificarse usando ADNc, ARNm o ADN genómico como molde y cebadores oligonucleotídicos apropiados de acuerdo con… convencionales
El ácido nucleico amplificado de esta manera puede clonarse en un vector apropiado y caracterizarse por análisis de la secuencia de ADN. Además, pueden prepararse oligonucleótidos correspondientes a todo o a parte de una molécula de ácido nucleico de la invención por técnicas de síntesis convencionales, por ejemplo, usando un sintetizador de ADN automático.
En otra realización preferida, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende una molécula de ácido nucleico que es un complemento de la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 5. Una molécula de ácido nucleico que es complementaria a una secuencia de nucleótidos dada es una que es suficientemente complementaria a la secuencia de nucleótidos dada como para hibridar con la secuencia de nucleótidos dada formando de esta manera un dúplex estable.
Además, la molécula de ácido nucleico de la invención puede comprender únicamente una parte de una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención, por ejemplo, un fragmento que puede usarse como sonda o cebador o un fragmento que codifica una parte biológicamente activa de un polipéptido de la invención. La secuencia de nucleótidos determinada por la clonación de un gen permite la generación de sondas y cebadores diseñados para usarse en la identificación y/o clonación de homólogos en otros tipos celulares, por ejemplo, procedentes de otros tejidos, así como homólogos de otros mamíferos. La sonda/cebador típicamente comprende oligonucleótidos sustancialmente purificados.
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tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales ramificadas en beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Como alternativa, pueden introducirse mutaciones aleatoriamente a lo largo de toda o parte de la secuencia codificante, tal como por mutagénesis de saturación y en los mutantes resultantes pueden explorarse la actividad biológica para identificar mutantes que conserven la actividad.
Después de la mutagénesis, la proteína codificada puede expresarse de forma recombinante y puede determinarse la actividad de la proteína.
En una realización preferida, un polipéptido mutante que es una variante de la invención puede ensayarse con respecto a su capacidad de presentar actividad de rescate de neuronas.
La presente invención incluye moléculas de ácido nucleico antisentido, es decir, moléculas que son complementarias a un ácido nucleico con sentido que codifica un polipéptido de la invención, por ejemplo, complementarias a la cadena codificante de una molécula de ADNc bicatenaria o complementarias a una secuencia de ARNm. El ácido nucleico antisentido puede ser complementario a una cadena codificante entera, o solo a una parte de la misma, por ejemplo, todo o parte de la región codificante de la proteína (o fase de lectura abierta). Una molécula de ácido nucleico puede ser antisentido a todo o parte de una región no codificante de la cadena codificante de una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la invención. Las regiones no codificantes (“regiones 5’ y 3’ no traducidas") son las secuencias 5’ y 3’ que flanquean la región codificante y no se traducen en aminoácidos.
Un oligonucleótido antisentido puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 nucleótidos o más de longitud. Un ácido nucleico antisentido de la invención puede construirse usando reacciones de síntesis química y ligamiento enzimático usando procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, un ácido nucleico antisentido (por ejemplo, un oligonucleótido antisentido) puede sintetizarse químicamente usando nucleótidos naturales o nucleótidos modificados de diversa forma diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o para aumentar la estabilidad física del dúplex formado entre los ácidos nucleicos antisentido y con sentido, por ejemplo, derivados de fosforotioato y nucleótidos sustituidos con acridina. Los ejemplos de nucleótidos modificados que pueden usarse para generar el ácido nucleico antisentido incluyen 5-fluorouracilo, 5bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroxilmetilo)uracilo, 5carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5’-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil5-oxiacético (v), wibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5metiluracilo, metiléster del ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético (v), 5-metil-2-tiouracilo, 3-(3-amino-3-N2-carboxipropil)uracilo, (acp3)w y 2,6-diaminopurina. Como alternativa, el ácido nucleico antisentido puede producirse biológicamente usando un vector de expresión dentro del cual se ha subclonado un ácido nucleico en una orientación antisentido (es decir, el ARN transcrito a partir del ácido nucleico insertado tendrá una orientación antisentido con respecto a un ácido nucleico diana de interés descrito adicionalmente en la siguiente subsección).
Vectores de expresión recombinante y células hospedadoras:
Otro aspecto de la invención se refiere a vectores, preferentemente vectores de expresión que contienen un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención (o una parte del mismo).
Como se usa en el presente documento, el término “vector” se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector es un “plásmido”, que se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular al que pueden ligarse segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, donde pueden ligarse segmentos de ADN adicionales al genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicarse de forma autónoma en una célula hospedadora en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores episomales de mamífero). Otros vectores (por ejemplo, vectores no episomales de mamífero) se integran en el genoma de una célula hospedadora tras la introducción en la célula hospedadora y, por lo tanto, se replican junto con el genoma del hospedador. Además, ciertos vectores, los vectores de expresión, son capaces de dirigir la expresión de genes a los que están unidos operativamente. En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de ADN recombinante con frecuencia están en forma de plásmidos (vectores). Sin embargo, la invención pretende incluir otras formas de vectores de expresión tales como vectores virales (por ejemplo, retrovirus con defectos en la replicación, adenovirus y virus adenoasociados), que tienen funciones equivalentes.
Los vectores de expresión recombinantes de la invención comprenden un ácido nucleico de la invención en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula hospedadora. Esto significa que los vectores de expresión recombinantes incluyen una o más secuencias reguladoras, seleccionadas basándose en las células hospedadoras a usar para la expresión, que están unidas operativamente a la secuencia de ácido nucleico a expresar. Dentro de un vector de expresión recombinante, se entiende que “unido operativamente” significa que la
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forma que esté unido operativamente con y active la expresión de genes endógenos, usando técnicas, tales como recombinación homóloga dirigida, que son bien conocidas por los expertos en la materia, y se describen, por ejemplo en Chappel, Patente de Estados Unidos Nº 5.272.071; publicación PCT Nº WO 91/06667, publicado el 16 de mayo de 1991.
Para producir un polipéptido de la invención puede usarse una célula hospedadora de la invención, tal como una célula hospedadora procariota o eucariota en cultivo. Por consiguiente, la invención proporciona además métodos para producir un polipéptido de la invención usando las células hospedadoras de la invención. En una realización, el método comprende cultivar la célula hospedadora de la invención (en la que se ha introducido un vector de expresión recombinante que codifica un polipéptido de la invención) en un medio adecuado de tal forma que se produzca el polipéptido. En otra realización, el método comprende además aislar el polipéptido del medio o la célula hospedadora.
La presente invención también se refiere a un método para producir una célula hospedadora recombinante que expresa un polipéptido de acuerdo con la invención, comprendiendo dicho método las etapas que consisten en: (i) introducir in vitro o ex vivo un ácido nucleico recombinante o un vector como se ha descrito anteriormente en una célula hospedadora competente, (ii) cultivar in vitro o ex vivo la célula hospedadora recombinante obtenida y (iii), opcionalmente, seleccionar las células que expresan y/o secretan dicho polipéptido. Dichas células hospedadoras recombinantes pueden usarse para la producción de polipéptidos de acuerdo con la presente invención, como se ha descrito previamente.
La invención se refiere además a un método para producir un polipéptido de acuerdo con la invención, comprendiendo dicho método las etapas que consisten en: (i) cultivar una célula hospedadora transformada de acuerdo con la invención en condiciones adecuadas para permitir la expresión de dicho polipéptido; y (ii) recuperar el polipéptido expresado.
Las células hospedadoras de la invención también pueden usarse para producir animales transgénicos no humanos. Por ejemplo, en una realización, una célula hospedadora de la invención es un oocito fertilizado o una célula madre embrionaria en la que se ha introducido una secuencia que codifica un polipéptido de la invención. Después, dichas células hospedadoras pueden usarse para crear animales transgénicos no humanos en los que se han introducido secuencias exógenas que codifican un polipéptido de la invención en su genoma o animales recombinantes homólogos en los que se han alterado secuencias endógenas que codifican un polipéptido de la invención. Dichos animales son útiles para estudiar la función y/o actividad del polipéptido y para identificar y/o evaluar moduladores de la actividad del polipéptido.
Como se usa en el presente documento, un “animal transgénico” es un animal no humano, preferentemente un mamífero, más preferentemente un roedor tal como una rata o ratón, en el que una o más de las células del animal incluye un transgén.
Otros ejemplos de animales transgénicos incluyen primates no humanos, ovejas, perros, vacas, cabras, pollos, anfibios, etc. Un transgén es ADN exógeno que está integrado en el genoma de una célula a partir de la cual se desarrolla un animal transgénico y que permanece en el genoma del animal maduro, dirigiendo de esta manera la expresión de un producto génico codificado en uno o más tipos celulares o tejidos del animal transgénico.
Como se usa en el presente documento, un “animal recombinante homólogo” es un animal no humano, preferentemente un mamífero, más preferentemente un ratón, en el que se ha alterado un gen endógeno por recombinación homóloga entre el gen endógeno y una molécula de ADN exógena introducida en una célula del animal, por ejemplo, una célula embrionaria del animal, antes del desarrollo del animal.
Un animal transgénico de la invención puede crearse introduciendo un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención en el pronúcleo masculino de un oocito fertilizado, por ejemplo, por microinyección, infección retroviral, y dejando que el oocito se desarrolle en un animal de acogida hembra pseudoembarazada. En el transgén también pueden incluirse secuencias intrónicas y señales de poliadenilación para aumentar la eficacia de la expresión del transgén. Al transgén se le pueden unir operativamente una o más secuencias reguladoras específicas de tejido para dirigir la expresión del polipéptido de la invención en células particulares. Se han hecho convencionales en la técnica métodos para generar animales transgénicos mediante manipulación embrionaria y microinyección, particularmente animales tales como ratones, y se describen, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos Nº
4.736.866 y 4.870.009, 4.873.191 y en Hogan, Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986). Se usan métodos similares para la producción de otros animales transgénicos. Un animal de acogida transgénico puede identificarse basándose en la presencia del transgén en su genoma y/o la expresión del ARNm que codifica el transgén en tejidos o células de los animales. Un animal de acogida transgénico después puede usarse para criar animales adicionales que lleven el transgén. Además, los animales transgénicos que llevan el transgén pueden cruzarse adicionalmente con otros animales transgénicos que lleven otros transgenes.
Para crear un animal recombinante homólogo, se prepara un vector que contiene al menos una parte de un gen que
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218; Nishimura et al. (1987) Cane. Res. 47: 999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314: 446-449; y Shaw et al. (1988)
J. Natl. Cancer Inst. 80: 1553-1559); Morrison (1985) Science 229: 1202-1207; Oi et al. (1986) Bio/Techniques 4: 214; Patente de Estados Unidos Nº 5.225.539; Jones et al. (1986) Nature 321: 552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239: 1534; y Beidler et al. (1988) J. Immunol. 141: 4053-4060.
Pueden producirse anticuerpos completamente humanos, por ejemplo, usando ratones transgénicos que son incapaces de expresar genes de cadenas pesada y ligera de inmunoglobulinas endógenas, pero que pueden expresar genes de cadena pesada y ligera humanas. Los ratones transgénicos se inmunizan de la forma normal con un antígeno seleccionado, por ejemplo, todo o parte de un polipéptido de la invención. Pueden obtenerse anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno usando la tecnología de hibridoma convencional. Los transgenes de inmunoglobulina humana portados por el ratón transgénico se transponen durante la diferenciación de células B y posteriormente experimentan un cambio de clase y mutación somática. De esta manera, usando dicha técnica, es posible producir anticuerpos IgG, IgA e IgE terapéuticamente útiles. Como revisión general de esta tecnología para producir anticuerpos humanos, véase Lonberg y Huszar (1995, Int. Rev. Immunol. 13: 65-93). Para una discusión detallada de esta tecnología para producir anticuerpos humanos y anticuerpos monoclonales humanos y protocolos para producir dichos anticuerpos, véanse, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 5.625.126; y las Patentes de Estados Unidos Nº 5.633.425; 5.569.825; 5.661.016; y 5.545.806. Además, es posible contactar con compañías tales como Abgenix, Inc. (Fremont, Calif.) para que proporcionen anticuerpos humanos dirigidos contra un antígeno seleccionado usando una tecnología similar a la descrita anteriormente.
Un anticuerpo dirigido contra un polipéptido de la invención (por ejemplo, anticuerpo monoclonal) puede usarse para aislar el polipéptido por técnicas convencionales, tales como cromatografía de afinidad o inmunoprecipitación. Además, dicho anticuerpo puede usarse para detectar la proteína (por ejemplo, en un lisado celular o sobrenadante celular) para evaluar la abundancia y patrón de expresión del polipéptido. Los anticuerpos también pueden usarse como diagnóstico para supervisar los niveles de proteínas en tejidos como parte de un procedimiento de ensayo clínico, por ejemplo, para determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado. La detección puede facilitarse acoplando el anticuerpo a una sustancia detectable. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes y materiales radiactivos. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, beta galactosidasa o acetilcolinesterasa; los ejemplos de complejos de grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; los ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina y aequorina, y los ejemplos de materiales radiactivos adecuados incluyen 125I, 131I, 35S o 3H.
La presente invención incluye fragmentos de anticuerpo de los anticuerpos de la invención. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen Fv, Fab, F(ab’)2, Fab’, dsFv, scFv, sc(Fv)2, diacuerpos y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo.
El término “Fab” denota un fragmento de anticuerpo que tiene un peso molecular de aproximadamente 50.000 y actividad de unión a antígenos, en el que aproximadamente una mitad del lado N-terminal de la cadena H y la cadena L entera, entre los fragmentos obtenidos por tratamiento de IgG con una proteasa, papaína, están unidos entre sí a través de un enlace disulfuro.
El término “F(ab’)2” se refiere a un fragmento de anticuerpo que tiene un peso molecular de aproximadamente
100.000 y actividad de unión a antígenos, que es ligeramente más grande que el Fab unido a través de un enlace disulfuro de la región de bisagra, entre fragmentos obtenidos por tratamiento de IgG con una proteasa, la pepsina.
El término “Fab” se refiere a un fragmento de anticuerpo que tiene un peso molecular de aproximadamente 50.000 y actividad de unión a antígenos, que se obtiene cortando un enlace disulfuro de la región de bisagra del F(ab’)2.
Un polipéptido Fv monocatenario (“scFv”) es un heterodímero VH::VL unido covalentemente que normalmente se expresa a partir de una fusión génica que incluye genes codificantes de VH y VL ligados por un enlazador que codifica un péptido. El fragmento scFv humano de la invención incluye CDR que se mantienen en la conformación apropiada, preferentemente mediante el uso de técnicas de recombinación génica. “dsFv” es un heterodímero VH::VL estabilizado por un enlace disulfuro. Los fragmentos de anticuerpo divalentes y multivalentes pueden formarse espontáneamente por asociación de scFv monovalentes, o pueden generarse por acoplamiento de scFv monovalentes por un enlazador peptídico, tal como sc(Fv)2 divalente.
El término “diacuerpos” se refiere a fragmentos de anticuerpo pequeños con dos sitios de unión a antígeno, comprendiendo dichos fragmentos un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipeptídica (VH-VL). Mediante el uso de un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios se ven forzados a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a antígeno.
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Aptámeros de la invención:
En otra realización, la invención se refiere a un aptámero dirigido contra un polipéptido de la invención.
Los aptámeros son una clase de molécula que representa una alternativa a los anticuerpos en términos de reconocimiento molecular. Los aptámeros son secuencias oligonucleotídicas u oligopeptídicas con la capacidad de reconocer prácticamente cualquier clase de molécula diana con alta afinidad y especificidad. Dichos ligandos pueden aislarse mediante evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial (SELEX) de una biblioteca de secuencias aleatorias, como se describe en Tuerk C. 1997. La biblioteca de secuencias aleatorias se puede obtener por síntesis de química combinatoria de ADN. En esta biblioteca, cada miembro es una oligómero lineal, eventualmente modificado químicamente, de una sola secuencia. Se han revisado posibles modificaciones, usos y ventajas de esta clase de moléculas en Jayasena S. D., 1999. Los aptámeros peptídicos consisten en regiones variables de anticuerpo conformacionalmente limitadas presentadas por una proteína en plataforma, tal como la Tiorredoxina A de E. coli, que se seleccionan a partir de bibliotecas combinatorias por métodos de dos híbridos (Colas et al., 1996).
Métodos de exploración:
La invención proporciona un método (también denominado en el presente documento “método de exploración”) para identificar moduladores, es decir, compuestos o agentes candidatos o de ensayo (por ejemplo, péptidos, peptidomiméticos, moléculas pequeñas u otros fármacos) que se unen al polipéptido de la invención o tienen una acción estimuladora sobre, por ejemplo, la expresión o actividad de un polipéptido de la invención.
En una realización, la invención proporciona ensayos para explorar compuestos candidatos o de ensayo que aumentan la actividad de un polipéptido de la invención o parte biológicamente activa del mismo. Más particularmente, la invención proporciona ensayos para explorar candidatos o compuestos de ensayo que pueden estimular la expresión de los polipéptidos de la invención.
Los compuestos candidatos o de ensayo pueden ensayarse con respecto a su capacidad de estimular la expresión de los polipéptidos de la invención. Por ejemplo, puede usarse un ensayo de sistema indicador para medir la expresión del polipéptido de la invención. Para este fin puede usarse una célula hospedadora de la invención. En una realización particular, el vector puede codificar una proteína de fusión que comprende un polipéptido de la invención y una proteína fluorescente. Las proteínas fluorescentes, bioluminiscentes o fosforescentes de forma natural incluyen GFP derivada de Aequorea Victoria y un número creciente de variantes de secuencia de GFP con propiedades útiles. La lista también incluye la proteína roja fluorescente (RFP) derivada de Discosoma; y la proteína fluorescente kindling (KFP1) derivada de Anemonia. Estas proteínas son enzimas autocatalíticas que son capaces todas ellas de generar fluoróforos internos que emiten de forma eficaz, altamente visibles, como resultado de la endociclación de restos de aminoácidos centrales. Otra característica común de las proteínas fluorescentes es que la señal es estable, independiente de la especie y no requieren ningún sustrato o cofactor para la generación de una señal. La detección directa de fluorescencia por observación visual (por ejemplo, con luz UV de amplio espectro) puede usarse para cuantificar la cantidad de la proteína de fusión producida en presencia o ausencia del compuesto candidato o de ensayo.
Los compuestos candidatos o de ensayo después pueden ensayarse con respecto a su capacidad de inhibir la degeneración de fotorreceptores de los conos. Para supervisar dichos efectos puede usarse cualquier ensayo adecuado conocido para un experto en la materia (tales como el descrito en el Ejemplo).
Los compuestos de ensayo de la presente invención pueden obtenerse usando cualquiera de varias estrategias en métodos de bibliotecas combinatorias conocidas en la técnica, incluyendo: bibliotecas biológicas; bibliotecas en fase sólida o en fase de solución paralelas dirigibles espacialmente; métodos de bibliotecas sintéticas que requieren desconvolución; el método de biblioteca (una perla - un compuesto); y métodos de bibliotecas sintéticas que usan selección por cromatografía de afinidad. La estrategia de bibliotecas biológicas está limitada a bibliotecas de péptidos, mientras que las otras cuatro estrategias son aplicables a péptidos, oligómeros no peptídicos o bibliotecas de compuestos de molécula pequeña.
Métodos de diagnóstico de la invención:
La presente invención también se refiere a ensayos de diagnóstico, ensayos de pronóstico y ensayos de supervisión.
Por consiguiente, un aspecto de la presente invención se refiere a ensayos de diagnóstico para determinar la expresión de un polipéptido o ácido nucleico de la invención y/o la actividad de un polipéptido de la invención, en el contexto de una muestra biológica (por ejemplo, sangre, suero, células, tejidos) para determinar de esta manera si un individuo padece una enfermedad o trastorno, o tiene riesgo de desarrollar un trastorno, asociado con una expresión o actividad aberrante de un polipéptido de la invención (por ejemplo, trastornos neurodegenerativos).
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