ES2374365A1 - Method and device for rapid diagnosis of hepatitis in stool samples. - Google Patents

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ES2374365A1
ES2374365A1 ES201031230A ES201031230A ES2374365A1 ES 2374365 A1 ES2374365 A1 ES 2374365A1 ES 201031230 A ES201031230 A ES 201031230A ES 201031230 A ES201031230 A ES 201031230A ES 2374365 A1 ES2374365 A1 ES 2374365A1
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ES201031230A
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Carlos Gustavo Genzor Asín
Óscar Landeta Elorz
Beatriz Velasco Michelena
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CERTEST BIOTEC SL
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Abstract

Método y dispositivo para el diagnóstico rápido de la Hepatitis A en muestras de heces. Method and device for rapid diagnosis of Hepatitis A in stool samples.
Método de diagnóstico de la Hepatitis A que comprende la toma de una porción representativa de una muestra de heces, su dispersión en un diluyente específico, la aplicación de esta dispersión de la muestra en un dispositivo inmunocromatográfico específico (1E), la formación de un complejo entre los anticuerpos del dispositivo y los antígenos de la muestra y la visualización de este complejo en la membrana del dispositivo. A method of diagnosing hepatitis A comprising taking a representative portion of a stool sample, dispersion in a specific diluent, applying this dispersion of the sample in a specific immunochromatographic device (1E), the formation of a complex device between antibodies and antigens of the sample and visualization of this complex in the membrane device. Este dispositivo inmunocromatográfico permite la identificación de las partículas, fragmentos o proteínas virales mediante el uso de un anticuerpo monoclonal específico conjugado con micropartículas coloreadas y su captura inmunológica en una membrana porosa. This immunochromatographic device allows identification of particles, fragments or viral proteins using a specific monoclonal antibody conjugated with colored microparticles and immunological capture in a porous membrane.

Description

Método y dispositivo para el diagnóstico rápido de la Hepatitis A en muestras de heces. Method and device for rapid diagnosis of Hepatitis A in stool samples.

Campo de la invención Field of the Invention

La presente invención se encuadra dentro del área de la biotecnología y en concreto en el diagnóstico de enfermedades causadas por virus. The present invention fits in the area of ​​biotechnology, and specifically in the diagnosis of diseases caused by viruses. El objeto de la invención es un procedimiento rápido y sencillo de detección del virus de la Hepatitis A o sus fragmentos en muestras de heces. The object of the invention is a quick and simple procedure for detecting Hepatitis A or its fragments in stool samples.

Estado de la técnica State of the art

La Hepatitis A es un enfermedad del hígado causada por el Virus de la Hepatitis A (HAV). Hepatitis A is a liver disease caused by the Hepatitis A virus (HAV). Como otras hepatitis (B, C, D, E) un síntoma muy característico es la ictericia. As other hepatitis (B, C, D, E) a characteristic symptom is jaundice. Las infecciones por Hepatitis A son mucho más frecuentes en países muy poblados con bajos niveles higiénico-sanitarios. Hepatitis A infections are much more common in populous countries with low hygiene and health standards. Afecta principalmente a niños de menos de 5 años de países en vías de desarrollo donde la seroprevalencia puede llegar al 100%. It mainly affects children under 5 years of developing country where seroprevalence may reach 100%.

El virus de la hepatitis A es transmitido entre las personas por la ruta oral-fecal. The hepatitis A virus is transmitted among people by the fecal-oral route. El virus se excreta abundantemente en las heces de las personas infectadas y es estable en el medioambiente durante largos períodos de tiempo. The virus is excreted abundantly in the feces of infected persons and is stable in the environment for long periods of time. La adquisición típica es por ingestión de comida o agua contaminada con heces (Lemon SM. Type A viral hepatitis: epidemiology, diagnosis, and prevention. Clinical Chemistry, 1997, 43(8(B)):1494-1499). The typical acquisition is by ingestion of contaminated food or water with feces (SM Lemon Type A viral hepatitis. Epidemiology, diagnosis, and prevention Clinical Chemistry, 1997, 43 (8 (B)):. 1494-1499).

El transcurso de la enfermedad es muy variable. The course of the disease is highly variable. Hay pacientes, especialmente niños, que no desarrollan síntomas, ni siquiera ictericia. Some patients, especially children, who do not develop symptoms, even jaundice. La intensidad de los síntomas entre los pacientes que los manifiestan es también variable. The intensity of symptoms among patients who manifest is also variable. El transcurso de la Hepatitis A (aguda) se puede dividir en 4 fases (Hepatitis A (WHO/CDS/CSR/EDC/2000.7) World Health Organization, 2000): During Hepatitis A (acute) can be divided into 4 phases (Hepatitis A (WHO / CDS / CSR / EDC / 2000.7) World Health Organization, 2000):

Incubación . Incubation. Aproximadamente 30 días. Approximately 30 days. No hay síntomas, pero si replicación activa del virus y gran transmisibilidad de la enfermedad. No symptoms, but if active virus replication and high transmissibility of the disease.

Preictericia . Preictericia. 4-10 días. 4-10 days. Aparecen síntomas como: pérdida de apetito, fatiga, dolor abdominal, nauseas, vómitos, fiebre, diarrea, orina oscura y heces pálidas. loss of appetite, fatigue, abdominal pain, nausea, vomiting, fever, diarrhea, dark urine and pale stools: symptoms as they appear.

Ictericia . Jaundice. Se presentan los síntomas de ictericia característicos de las hepatitis. jaundice characteristic symptoms of hepatitis are presented. Suelen remitir el resto de los síntomas. Usually they subside the other symptoms. Desaparece la viremia pero las heces son infectivas una o dos semanas más desde la aparición de la de la ictericia. Viremia but disappears feces are infective one or two weeks from the onset of jaundice.

Convalescencia . Convalescence. El período de recuperación de la enfermedad es de duración variable 3-6 meses. The recovery period of the disease is variable 3-6 months duration.

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La expulsión de virus en las heces al igual que la viremia tiene lugar durante las fases de incubación y preictericia y cesa al alcanzar la fase de ictericia. The expulsion of virus in stool as viremia occurs during incubation steps and preictericia and ceases to reach the stage of jaundice. Es precisamente entonces cuando empiezan a aparecer los anticuerpos en la sangre, primero los del tipo IgM y luego IgA e IgG (Stapleton JT and Lemon SM, Hepatitis A and Hepatitis E . In Infectious Diseases 5^{th} ed . Philadelphia, Lippincott Co, 1994; 790-797). Is then that the antibodies first begin to appear in the blood, IgM and then IgA and IgG (Stapleton JT and Lemon SM, Hepatitis A and Hepatitis E. In Infectious Diseases 5 ^ {th} ed. Philadelphia, Lippincott Co. , 1994; 790-797).

Actualmente el diagnóstico se realiza detectando la presencia de anticuerpos anti-HAV en el suero sanguíneo. diagnosis is currently performed by detecting the presence of anti-HAV antibodies in the serum. De esta forma se distingue la hepatitis A de otras hepatitis. Thus hepatitis A differs from other hepatitis. Más concretamente, el diagnóstico se basa en la identificación de anticuerpos tipo IgM anti-HAV en el suero de los pacientes durante la fase aguda de la enfermedad. More specifically, the diagnosis is based on the identification of IgM anti-HAV antibodies in the serum of patients during the acute phase of the disease. Estos anticuerpos persisten en el suero entre 3 y 6 meses. These antibodies persist in the serum between 3 and 6 months. Anticuerpos del tipo IgG anti-HAV también están presentes durante el transcurso de la enfermedad y persisten durante décadas después de una infección aguda (Hepatitis A (WHO/CDS/CSR/EDC/2000.7) World Health Organization, 2000). IgG antibodies anti-HAV are also present during the course of the disease and persist for decades after acute infection (Hepatitis A (WHO / CDS / CSR / EDC / 2000.7) World Health Organization, 2000).

También se puede diagnosticar la enfermedad identificando dichos anticuerpos anti-HAV en muestras de saliva (Patente WO 97/02490). can also diagnose the disease by identifying said anti-HAV antibodies in saliva samples (WO 97/02490 Patent).

El diagnostico de la enfermedad en base a la medida de los anticuerpos anti-HAV en el suero (o saliva) presenta algunos inconvenientes: The diagnosis of disease based on the measurement of anti-HAV antibodies in the serum (or saliva) presents some drawbacks:

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Requiere extracción de sangre y preparación del suero. It requires blood collection and serum preparation.

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Requiere hacerse por personal especializado en laboratorios convenientemente equipados. It needs to be done by trained personnel in suitably equipped laboratories.

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No indica si el paciente tiene una enfermedad activa, sólo que en algún momento el sistema inmunitario ha estado en contacto con el virus. It does not indicate whether the patient has active disease, only that at some point the immune system has been in contact with the virus.

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Las personas vacunadas tienen anticuerpos y por lo tanto dan positivo en la prueba a pesar de no haber contraído la enfermedad. Vaccinated individuals have antibodies and therefore give positive test despite not having contracted the disease.

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La aparición de anticuerpos anti-HAV tiene lugar aproximadamente 4 semanas después de la infección (18, 21-23, 40) por lo que hay un período ventana de 4 semanas en las que la enfermedad no es detectable por anticuerpos y el paciente además de estar incubando la enfermedad está excretando gran cantidad de virus en sus heces y puede ser el origen de un brote epidémico. The appearance of anti-HAV takes place approximately 4 weeks after infection (18, 21-23, 40) so there is a window period of 4 weeks in which the disease is not detectable by antibodies and patient well be incubating the disease is excreting large amounts of virus in their feces and can be the source of an outbreak.

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Hay individuos portadores asintomáticos a los que no se les va a hacer la prueba de anticuerpos en el suero por no presentar síntomas pero que contribuyen a la propagación de la enfermedad. There are individuals asymptomatic carriers that are not going to be tested for antibodies in serum by no symptoms but contribute to the spread of the disease.

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Para solucionar todos estos problemas hemos desarrollado la presente invención consistente en un test rápido para detección de partículas virales o fragmentos del virus de la Hepatitis A en muestras fecales. To solve all these problems we have developed the present invention consisting of a quick detection of viral particles or fragments of hepatitis A virus in stool test. Presenta las siguientes ventajas: It has the following advantages:

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No es necesaria la extracción de sangre y preparación del suero, basta con una muestra de deposiciones fecales. No blood collection and serum preparation is necessary, just a sample of bowel movements.

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No se necesita equipamiento complejo de laboratorio ni personal especializado. No complex laboratory equipment or specialized personnel is needed.

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Indica presencia de virus y por lo tanto enfermedad activa. It indicates the presence of viruses and therefore active disease.

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Se puede realizar en personas vacunadas. It can be performed in vaccinated individuals.

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El período ventana se reduce de 4 semanas a solo unos días (ver figura 1). The window period is reduced from 4 weeks to a few days (see Figure 1).

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El virus puede ser identificado en las heces de pacientes asintomáticos. The virus can be found in the feces of asymptomatic patients.

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Es rápido (10 minutos) y fácil de llevar a cabo. It's fast (10 minutes) and easy to carry out.

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La identificación de partículas virales o fragmentos del HAV se puede llevar a cabo mediante técnicas ELISA o PCR. Identification of viral particles or fragments HAV can be carried out by ELISA or PCR techniques. El HAV-Antigen EIA de Mediagnost (Reutlingen, Alemania) es un inmunoensayo tipo ELISA para la identificación de HAV en diversos tipos de muestra con cultivos celulares y heces. The HAV-Antigen EIA Mediagnost (Reutlingen, Germany) is an immunoassay ELISA for identification of HAV in various sample types with cell cultures and feces. También se ha descrito la detección del HAV por identificación de secuencias de RNA mediante la utilización de una transcriptasa reversa (RT) y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Patente WO 2008145196). It has also been described for the detection of HAV RNA sequence identification using a reverse transcriptase (RT) and polymerase chain reaction (PCR) (WO 2008145196 Patent). Sin embargo este tipo de pruebas presenta algunos inconvenientes que han hecho que su utilización sea muy limitada: However these tests has some drawbacks that have made their use is very limited:

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Tiempo: el ELISA requiere entre 2 y 3 horas y la PCR unas 8-10 horas. Time: ELISA requires 2 to 3 hours and the PCR about 8-10 hours.

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Ambos necesitan complejos equipos de laboratorio disponibles únicamente en laboratorios especializados y personal experto en las dichas técnicas. Both require complex laboratory equipment available only in specialized laboratories and expert staff in these techniques.

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El ELISA presenta una limitada sensibilidad puesto que es necesario diluir mucho la muestra. ELISA has limited sensitivity since it is necessary to dilute the sample much.

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Presentan un elevado número de falsos positivos. They have a high number of false positives. En el caso del ELISA todo resultado positivo tiene que ser reevaluado después de haber sido incubado con una solución neutralizante asegurando el efecto bloqueante de la misma. In the case of all ELISA positive result it must be reevaluated after being incubated with a neutralizing solution ensuring the blocking effect thereof.
Descripción breve brief description

El método de diagnóstico de la Hepatitis A de la presente invención consiste en: la toma de una porción representativa de la muestra de heces, su dispersión en un diluyente específico, la aplicación de de esta dispersión de la muestra en un dispositivo inmunocromatográfico específico, la formación de un complejo entre los anticuerpos del dispositivo y los antígenos de la muestra y la visualización de este complejo en la membrana del dispositivo. The diagnostic method Hepatitis A of the present invention comprises: taking a representative portion of the stool sample dispersion in a specific diluent, applying this dispersion of the sample in a specific immunochromatographic device, the formation of a complex between the antibodies and antigens device sample and visualization of this complex in the membrane device.

El dispositivo inmunocromatográfico utilizado es de un solo uso. The immunochromatographic device used is a single use. No se requiere ningún tipo de instrumentación para llevar a cabo el método o interpretar el resultado. Not any kind of instrumentation is required to carry out the method or interpret the result. Como muestra se utilizan heces. As shown feces are used.

El tiempo de preparación de la muestra es de unos dos minutos y el tiempo de desarrollo de la prueba es de 5 a 10 minutos, lo que significa entre 10 y 20 veces menos que los ensayos EIA (ELISA), mucho más complejos de llevar a cabo y necesitan de instrumentación de laboratorio. The preparation time of the sample is about two minutes and the development time of the test is 5 to 10 minutes, which means between 10 and 20 times less than the EIA assays (ELISA), much more complex to carry out and they require laboratory instrumentation.

Por su sencillez la prueba se puede llevar a cabo en la consulta del médico incluso en guarderías o lugares donde se sospeche un brote epidémico. For simplicity the test can be performed in the doctor even in nursery schools or places where an outbreak is suspected.

La prueba se puede realizar antes de que aparezcan los síntomas de la enfermedad en individuos sospechosos o susceptibles de haber sido infectados por el HAV por estar cerca de un foco de la enfermedad o por pertenecer a grupos de riesgo. The test can be performed before symptoms of the disease appear suspicious or susceptible individuals have been infected with HAV to be near a focus of disease or belonging to risk groups.

La prueba también se puede realizar en cuanto aparezcan los primeros síntomas: especialmente diarrea, pero también pérdida de apetito, fatiga, dolor abdominal, nauseas, vómitos, orina oscura o heces pálidas (sin color). The test can also be performed as soon as the first symptoms appear: especially diarrhea, but also loss of appetite, fatigue, abdominal pain, nausea, vomiting, dark urine or pale stools (colorless).

La prueba funciona mejor antes de que aparezcan los síntomas de hepatitis, típicamente ictericia ó también altos niveles de bilirrubina en sangre y alta actividad aminotransferasa en el suero sanguíneo. The test works best before symptoms of hepatitis, jaundice or also typically high levels of bilirubin in blood and high aminotransferase activity in serum displayed.

El método de diagnóstico de la Hepatitis A de la invención es útil durante el período de incubación de la enfermedad en el que la concentración del virus en las heces puede ser elevada. The diagnostic method Hepatitis A of the invention is useful during the incubation period of the disease in which the concentration of virus in stool can be high.

Puesto que el virus se puede detectar en las heces antes de la aparición de los síntomas, el método es especialmente útil para la prevención de la enfermedad y la gestión de los brotes epidémicos para conocer con prontitud y con antelación a la aparición de los síntomas el origen y la magnitud del foco epidémico. Since the virus can be detected in stool before the onset of symptoms, the method is especially useful for disease prevention and management of outbreaks to know promptly and in advance of the onset of symptoms the origin and extent of the epidemic focus.

De igual manera, la prueba de la invención es adecuada para establecer procedimientos de vigilancia precoz de aparición de la enfermedad especialmente en áreas de alta prevalencia del virus. Similarly, the test of the invention is suitable for establishing monitoring procedures early onset of the disease especially in areas of high prevalence of the virus.

Descripción de la figuras DESCRIPTION OF THE FIGURES

Figura 1: Esquema de las etapas del método de diagnóstico. Figure 1: Schematic of the method steps of diagnosis. El dispositivo o vial específico para la toma de muestras fecales (Figura 1A) es un vial de plástico de unos 3-4 mL de capacidad, en el que previamente se ha dispensado 1 ml de diluyente para la dispersión, con un tapón a rosca que dispone de un vástago cuyo extremo, diseñado al efecto, permite la recolección de una porción de heces (Figura 1B) sólidas o semisólidas y su introducción en el vial. The specific device or vial for taking fecal samples (Figure 1A) is a plastic vial 3-4 mL capacity, which previously has been dispensed 1 ml of diluent for dispersion with a screw cap that It has a rod whose end is designed for the purpose, allows collection of a portion of feces (Figure 1B) solid or semisolid and into the vial. Tras esto, se cierra y se agita vigorosamente (Figura 1C) hasta la completa dispersión de la muestra. After that, it is closed and is stirred vigorously (Figure 1C) until complete dispersion of the sample. Por último, se rompe la parte superior del dispositivo (Figura 1D) y se añaden unas gotas sobre el lugar de aplicación de la muestra del dispositivo inmunocromatográfico (Figura 1E). Finally, the top of the device (Figure 1D) is broken and a few drops on the application site of the sample of the immunochromatographic device (Figure 1E) are added.

Figura 2: Vistas del dispositivo inmunocromatográfico. Figure 2: View of the immunochromatographic device.

Figura 2A: Vista superior del dispositivo inmunocromatográfico en formato tira. Figure 2A: Top view of the immunochromatographic strip format device. Dicha tira incluye los siguientes elementos: un material absorbente (1), membrana porosa (2) con una línea de test (3) y otra de control (4), un lugar de aplicación de la muestra (5) y un lugar para el conjugado anticuerpo-marcador (6). Said strip includes the following elements: an absorbent material (1), porous membrane (2) with a test line (3) and a control (4), an application site of the sample (5) and a place for antibody-marker (6).

Figura 2B: Vista de la sección del dispositivo inmunocromatográfico en formato tira en la que se distinguen además de los elementos descritos en la Figura 2A, el soporte plástico (7). Figure 2B: section view of the immunochromatographic strip format device in which also differ from the elements described in Figure 2A, the plastic support (7).

Figura 2C: Vista proyectada del dispositivo inmunocromatográfico, en la que se distinguen los elementos descritos en la Figuras 2A y 2B. Figure 2C: Vista projected immunochromatographic device in which the elements described are distinguished in Figures 2A and 2B.

Descripción detallada Detailed description

Para la realización del ensayo se dispersa una porción la muestra de heces en el diluyente en una proporción aproximada 1/10. To perform the test a portion disperses the stool sample in the diluent in a ratio 01/10. Si la muestra es líquida 100 microL de muestra se mezclan con 1 mL del diluyente. If the sample is liquid 100 microL sample is mixed with 1 mL of diluent. Si la muestra es sólida se separan unos 100 mg de muestra con la ayuda de una espátula y se dispersan en 1 mL de diluyente. If the sample is solid separated about 100 mg of sample with a spatula and dispersed in 1 mL of diluent.

Resulta muy conveniente la utilización de un dispositivo o vial específico para la toma de muestras fecales. It is very convenient to use a specific device or vial for taking fecal samples. Este dispositivo es un vial de plástico de unos 3-4 mL de capacidad, en el que previamente se ha dispensado 1 ml de diluyente para la dispersión, con un tapón a rosca que dispone de un vástago cuyo extremo, diseñado al efecto, permite la recolección de una porción de heces sólidas o semisólidas y su introducción en el vial. This device is a plastic vial 3-4 mL capacity, which previously has been dispensed 1 mL of diluent to the dispersion, with a screw cap which has a rod whose end is designed for the purpose, allows collecting a portion of solid stool or semisolid and into the vial. En el documento de la patente US 5543115 se puede observar una descripción más detallada de un dispositivo similar. In the document US 5543115 patent can observe a more detailed description of a similar device.

Una vez introducida la muestra en el vial se cierra con el tapón a rosca y se agita vigorosamente. Once the sample is introduced into the vial is closed with the screw cap and shake vigorously. Tras esto se rompe la parte superior del tapón y por la apretura creada se añaden 3-4 gotas de la dispersión de heces sobre la zona de aplicación de la muestra del dispositivo inmunocromatográfico. After this the top of the plug breaks and the tightness created 3-4 drops of the dispersion of faeces on the application site of the sample are added immunochromatographic device.

Después de la aplicación de la muestra se esperan 10 minutos y se interpreta el resultado. After application of the sample expected 10 minutes and the result is interpreted. El test se considera negativo sí solo aparece una sola línea (por ejemplo, azul) en la ventana de resultados y positivo si aparecen dos líneas (por ejemplo, una roja y otra azul). The test is considered negative if only one line appears (eg blue) in the result window and positive if two lines (one red and one blue for example) appear.

Los dispositivos inmunocromatográficos para la detección tanto de antígenos como de anticuerpos han sido descritos anteriormente (por ejemplo, en la patente EP 1248112). Immunochromatographic detection devices both antigen and antibody have been previously described (for example, in EP 1,248,112). Para la detección del virus HAV o sus fragmentos se pueden utilizar anticuerpos monoclonales o policlonales o una combinación de ambos. For detection of HAV virus or fragments thereof can be used monoclonal or polyclonal antibodies or a combination of both. En una realización preferente se utiliza un único anticuerpo monoclonal anti-HAV. In a preferred embodiment a single monoclonal anti-HAV antibody is used. Este anticuerpo monoclonal (HA1) se ha desarrollado utilizando extractos semipurificados de cultivos in vitro del virus de la Hepatitis A. El anticuerpo monoclonal obtenido presenta una elevada afinidad y especificidad frente a una porción de la proteína estructural del virus VP1. This monoclonal antibody (HA1) was developed using semipurified extracts in vitro virus Hepatitis A. cultures The monoclonal antibody obtained had a high affinity and specificity to a portion of the structural protein VP1 virus.

En una realización preferente, este anticuerpo monoclonal (HA1) es utilizado tanto en la membrana como en el conjugado. In a preferred embodiment, this monoclonal antibody (HA1) is used in both the membrane and the conjugate. El conjugado se prepara con micropartículas coloreadas y es depositado en uno de los materiales del dispositivo inmunocromatográfico aguas abajo del lugar de aplicación de la muestra y actúa como fase móvil. The conjugate is prepared with colored microparticles and is deposited in one of the materials of the immunochromatographic device downstream of the application site of the sample and acts as a mobile phase. El mismo anticuerpo se inmoviliza sobre la membrana porosa y actúa como fase fija, en que se produce la captura inmunológica de las partículas virales o fragmentos del virus. The same antibody is immobilized on the porous membrane and acts as a fixed phase, in which the immunological capture of viral particles or fragments of the virus occurs. La membrana y el material con el conjugado son montados junto con otros materiales absorbentes o adhesivos sobre un soporte plástico que se es cortado en forma tira. The membrane and the conjugate material are mounted together with other absorbent materials or adhesives on a plastic support which is cut into strip.

Todos los elementos descritos para llevara cabo la prueba (el dispositivo inmucromatográfico, el vial para la toma de muestras fecales, el diluyente de dispersión de la muestra,...) junto con las instrucciones de uso pueden ser incluidas en un conjunto o kit para la realización fácil de la prueba. All elements described carry out the test (the inmucromatográfico device, the vial for taking fecal samples, diluent sample dispersion, ...) together with instructions they can be included in a set or kit easy test performance.

Ejemplos de realización EXEMPLARY EMBODIMENTS Ejemplo 1 Example 1 Preparación y purificación de anticuerpos monoclonales anti-HAV Preparation and purification of monoclonal anti-HAV

El anticuerpo monoclonal HA1 se obtuvo a partir del hibridoma del mismo nombre. HA1 monoclonal antibody was obtained from the hybridoma of the same name. La obtención del hibridoma productor del anticuerpo monoclonal HA1 se realizo mediante protocolos conocidos según el método de fusión celular y fusión de los clones obtenidos que fue inicialmente descrito por Köhler y Milstein en 1975 (Köhler G, Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity . Nature. 1975 Aug 7; 256 (5517):495-7). Obtaining hybridoma producing monoclonal antibody HA1 was performed by known protocols according to the method of cell fusion and fusion of the clones obtained which was first described by Köhler and Milstein in 1975 (Köhler G, Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity Nature 1975 Aug 7; 256 (5517):.. 495-7).

Ratones del tipo BALB/c fueron inmunizados con la dosis proporcional la vacuna Havrix (GlaxoSmithKline). Mice BALB / c were immunized with type proportional dose Havrix (GlaxoSmithKline) vaccine. Los linfocitos de los ratones inmunizados fueron fusionados con células mielómicas de la línea SP20 y los hibridomas obtenidos fueron seleccionados mediante técnicas ELISA. Lymphocytes from immunized mice were fused with cells mielómicas line SP20 and the obtained hybridomas were screened by ELISA techniques. Los pocillos de una placa microtiter de 96 pocillos fueron tapizados con anticuerpo policlonal de conejo anti-HAV en tampón carbonato 100 mM de pH 9 a 37 grados durante 2 h. Microtiter wells of a 96 well plate were coated with polyclonal rabbit anti-HAV in carbonate buffer 100mM pH 9 at 37 degrees for 2 h. A estos pocillos el extracto viral semipurificado que se describe posteriormente. To these wells viral semipurified extract described later. Tras su lavado se añaden las distintas muestras de cultivo de hibridomas y la presencia del anticuerpo anti-HAV se revela utilizando un conjugado anti-mIgG con peroxidada (Sigma) y el sustrato correspondiente. After washing the different samples of hybridoma culture and the presence of antibody are added anti-HAV it is revealed using an anti-mIgG conjugated peroxidase (Sigma) and the corresponding substrate.

Se seleccionaron los hibridomas que mayor afinidad y que mejor especificidad presentaron. hybridomas were selected higher affinity and specificity better presented. Entre estos se seleccionaron los más productores y los que mejores prestaciones ofrecieron en los test de estrés térmico y velocidad de reacción frente al antígeno. Among these the most producers and those offered better performance on tests of thermal stress and reaction against the antigen were selected.

El extracto semipurificado de HAV se obtuvo a partir de un cultivo de células MRC-5 en medio mínimo esencial (Eagle) suplementado con suero bovino fetal al 10%, que fueron inoculadas con el virus de la Hepatitis A. Se incubó durante varios días a 37 grados con 5% de CO_{2}. The semipurified extract of HAV was obtained from a culture of MRC-5 cells in minimal essential medium (Eagle) supplemented with fetal bovine serum 10%, which were inoculated with Hepatitis A. was incubated for several days to 37 degrees with 5% CO 2 {}. Las fueron tratadas con proteasas y el virus fue parcialmente purificado por centrifugación. The proteases were treated and the virus was partially purified by centrifugation.

El hibridoma seleccionado HA1 fue cultivado en medio RPMI-HT durante varios días a 37 grados con 5% de CO_{2}. The selected hybridoma was cultured HA1 in RPMI-HT for several days at 37 degrees with 5% CO 2 {}. A partir del medio de cultivo fue purificado el anticuerpo por cromatografía de afinidad a proteína A según las instrucciones del fabricante de la columna (GE Healthcare) tras lo que fue dializado en PBS de pH 7,4. From the culture medium was purified by antibody affinity chromatography Protein A according the manufacturer of the column (GE Healthcare) after which was dialyzed in PBS pH 7.4.

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Ejemplo 2 example 2 Preparación del conjugado Preparation of Conjugate

Se preparó un conjugado del anticuerpo HA1 con micropartículas de poliestireno. conjugated antibody was prepared HA1 polystyrene microparticles. Se utilizaron partículas coloreadas con grupos carboxilo en su superficie de 300 nm de diámetro nominal. colored with carboxyl groups on the surface of 300 nm nominal diameter particles were used. 1 mL de partículas al 10% es lavado por centrifugación y resuspensión en tampón MES (ácido 2-( N -morfolino)etanosulfónico) 10 mM de pH 6 y se le añadió EDC (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida) hasta una concentración de 5 mM. 1 mL of 10% particles is washed by centrifugation and resuspended in MES buffer (2- (N - morpholino) ethanesulfonic acid) 10 mM pH 6 and was added EDC (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) - carbodiimide) to a concentration of 5 mM. Se incuba 1 ha 37 grados y se retira el exceso de reactivo por centrifugación. 1 has incubated 37 degrees and the excess reagent is removed by centrifugation. Las partículas activadas se resuspenden en MES 10 mM de pH 6 y se les añade anticuerpo monoclonal hasta una concentración superficial de 2 mg/m^{2} tras lo que se incuban 4 hy se lavan en Tween 20 al 0,1%. The activated particles were resuspended in 10 mM MES pH 6 and is added monoclonal antibody to a surface concentration of 2 mg / m {2} after which 4 h and washed incubated in 0.1% Tween 20. Las partículas así obtenidas se diluyen en una solución que contiene sacarosa 10%, albúmina bovina 2%, PEG-6000 1% y Tween-20 2% en tampón TRIS (tris(hidroximetil)aminometano) de pH 8, hasta una concentración de 0,05%. The particles thus obtained are diluted in a solution containing 10% sucrose, bovine albumin 2% PEG-6000 1% Tween-20 2% in TRIS (tris (hydroxymethyl) aminomethane) pH 8 to a concentration of 0 05%.

Esta solución se deposita a razón de 15 uL/cm en un material bobinado de fibras de poliéster no entretejidas de 29 mm de ancho que se seca durante 24 h en una cámara a 30 grados y 20% de humedad relativa. This solution is deposited at a rate of 15 uL / ​​cm in a winding material of polyester fibers is not interwoven 29 mm wide dried for 24 h in a chamber at 30 degrees and 20% relative humidity.

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 
Ejemplo 3 example 3 Preparación de las líneas de test y control Preparation of test and control lines

El anticuerpo HA1 dializado en tampón fosfato salino (PBS) se lleva hasta una concentración de 1 mg/mL y se deposita linealmente en una membrana de nitrocelulosa laminada de 25 mm de ancho y de tamaño de poro entre 10 y 30 micrómetros a razón de 1 microL/cm tras lo cual se seca durante 24 h en una cámara a 30 grados y 20% de humedad relativa. The HA1 antibody dialyzed in phosphate buffered saline (PBS) is brought to a concentration of 1 mg / mL and deposited linearly on a nitrocellulose membrane laminated 25mm wide and pore size between 10 and 30 micrometers at 1 microL / cm after which is dried for 24 h in a chamber at 30 degrees and 20% relative humidity.

Paralelamente se deposita y en las mismas condiciones se deposita anticuerpo policlonal de conejo anti-mIgG que servirá como línea de control. It is deposited parallel and in the same conditions polyclonal rabbit anti-mIgG that serve as control line is deposited.

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Ejemplo 4 example 4 Montaje del test inmunocromatográfico Immunochromatographic test assembly

El material con el conjugado, la membrana y el material absorbente se montan conforme indican las figuras 2 y 3 sobre un soporte plástico con una lámina adhesiva y las tiras son cortadas transversalmente a su montaje a una anchura de 4 mm. The material with the conjugate, the membrane and the absorbent material are assembled as shown in Figures 2 and 3 on a plastic support with an adhesive seal and strips are cut transversely to its mounting to a width of 4 mm. Opcionalmente la tira puede colocarse en el interior de un dispositivo de plástico a modo de carcasa que la protege y facilita su utilización. Optionally the strip can be placed inside a plastic device as a housing that protects and facilitates its use.

Se prepara una solución para la dispersión de las muestras de heces consistente en una disolución acuosa de cloruro de sodio 300 mM, Tritón X-100 al 1% y anticuerpos IgG inespecíficos de ratón 100 microgr/mL en un tampón TRIS 200 mM a un pH de 9. Esta preparación se dispensa en viales para la toma de muestra a razón de 1 mL/vial. a solution for dispersion of samples consisting feces in an aqueous solution of sodium chloride 300 mM, Triton X-100 1% and unspecific mouse IgG antibodies 100 microg / mL in TRIS buffer 200 mM is prepared at a pH 9. This preparation is dispensed in vials for sampling at 1 mL / vial.

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 
Ejemplo 5 example 5 Detección de HAV Detection of HAV

Se preparara diluciones seriadas 1/2 de HAV en el diluyente de dispersión de muestras descrito en el apartado anterior. 1/2 serial dilutions of HAV be prepared in the diluent dispersion samples described in the preceding paragraph. 100 uL de estas diluciones se aplican a los dispositivos inmunocromatográficos de la invención y se deja progresar el ensayo durante 10 minutos a temperatura ambiente (25ºC) tras lo cual se procede a interpretar el resultado mediante apreciación visual de aparición de la línea de test. 100 uL of these dilutions are applied to the immunochromatographic devices of the invention and the assay is allowed to proceed for 10 minutes at room temperature (25) after which proceeds to interpret the result by visual assessment of appearance of the test line. Se realiza la misma operación pero diluyendo el HAV en un pool de muestras de heces dispersadas aprox. the same operation is performed but diluting the HAV in pooled fecal samples dispersed approx. 1/10 en el mismo tampón. 1/10 in the same buffer. Los resultados se muestran en la tabla 1. The results are shown in Table 1.

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TABLA 1 TABLE 1

1 1

Claims (8)

  1. 1. Método de diagnóstico de la Hepatitis A mediante la detección de partículas virales o fragmentos del virus de la Hepatitis A utilizando anticuerpos específicos que comprende las siguientes etapas: 1. A method of diagnosing hepatitis A by detecting viral particles or fragments of hepatitis A virus using specific antibodies comprising the following steps:
    a. to.
    la toma de una porción de muestra de heces, making a portion of a stool sample,
    b. b.
    la dispersión de una porción de muestra de heces en un diluyente, dispersing a portion of a stool sample in a diluent,
    c. c.
    la aplicación de esta dispersión de la muestra de heces en un dispositivo inmunocromatográfico, applying the dispersion of the stool sample in an immunochromatographic device,
    d. d.
    la formación de un complejo anticuerpo-fragmento viral, the formation of an antibody-fragment viral,
    e. and.
    la visualización del complejo en la membrana del dispositivo inmunocromatográfico. visualization of the complex in the membrane of the immunochromatographic device.
      \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 
  2. 2. Método de diagnóstico de la Hepatitis A de acuerdo con la reivindicación 1 caracterizado porque los anticuerpos específicos usados son policlonales o monoclonales. 2. A method of diagnosing hepatitis A according to claim 1 wherein the used specific antibodies are polyclonal or monoclonal.
  3. 3. Método de diagnóstico de la Hepatitis A de acuerdo con la reivindicación 2 caracterizado porque se usa un único anticuerpo monoclonal. 3. A method of diagnosing hepatitis A according to claim 2 wherein a single monoclonal antibody is used.
  4. 4. Método de diagnóstico de la Hepatitis A de acuerdo con la reivindicación 3 caracterizado porque el antígeno detectado es una proteína estructural de virus de la hepatitis A. 4. A method of diagnosing hepatitis A according to claim 3 characterized in that the detected antigen is a structural protein of hepatitis A.
  5. 5. Método de diagnóstico de la Hepatitis A de acuerdo con la reivindicación 1 caracterizado porque la toma de muestra y su dispersión se realiza con la ayuda de un vial específico para muestras fecales. 5. A method of diagnosing hepatitis A according to claim 1 wherein the sampling and dispersion is performed with the help of a specific vial fecal samples.
  6. 6. Un dispositivo inmunocromatográfico para el diagnóstico de la hepatitis A en forma de tira con un sitio de aplicación de la muestra, una membrana porosa en la que se visualiza el resultado y un absorbente caracterizado porque: 6. An immunochromatographic device for the diagnosis of hepatitis A in strip form with an application site of the sample, a porous membrane in which the result is displayed and an absorbent characterized in that:
    a. to.
    se han inmovilizado anticuerpos específicos contra el virus de la Hepatitis A en la línea de test de la membrana porosa, have been immobilized specific antibodies Hepatitis A in the test line of the porous membrane,
    b. b.
    se ha impregnado un conjugado preparado con anticuerpos contra el virus de la Hepatitis A y una partícula marcadora corriente abajo del lugar de aplicación de la muestra, has been impregnated with a conjugate made antibodies against Hepatitis A virus particle and a marker downstream of the application site of the sample,
    c. c.
    se han utilizado materiales cuyas características y tamaño de poro permiten el flujo de la materia particulada de las heces. They have been used materials whose characteristics and pore size allow for the flow of particulate matter of the feces.
      \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 
  7. 7. Un dispositivo inmunocromatográfico de acuerdo con las reivindicación 6 caracterizado porque la tira puede ir en el interior de una carcasa de plástico que la protege. 7. An immunochromatographic device according to claim 6 characterized in that the strip can go inside a plastic housing that protects it .
  8. 8. Un kit de diagnóstico de la Hepatitis A que comprende el dispositivo inmunocromatográfico de la reivindicación 7 y un diluyente para dispersión de la muestra fecal que, puede ir o no, en un vial específico para la toma de muestras fecales. 8. A diagnostic kit comprising Hepatitis A immunochromatographic device of claim 7 and a diluent for scattering fecal specimen may go or not, in a specific vial for taking fecal samples.
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