ES2370215B1

ES2370215B1 - MEANS OF FUNGI CULTURE OBTAINED FROM DRY AND EXTRACTED ALPEORUJO

Info

Publication number: ES2370215B1
Application number: ES201030719A
Authority: ES
Inventors: Inmaculada Sampedro Quesada; Elisabeth Aranda Ballesteros; Inmaculada Garcia Romera; Juan Antonio Ocampo Bote
Original assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Current assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Priority date: 2010-05-14
Filing date: 2010-05-14
Publication date: 2012-10-19
Anticipated expiration: 2030-05-14
Also published as: ES2370215A1

Abstract

Medio de cultivo de hongos obtenido a partir de alpeorujo seco y extractado.#La presente invención se refiere a un procedimiento de obtención de un extracto líquido de alpeorujo seco y extractado, al extracto obtenible mediante dicho procedimiento y al uso del mismo para el cultivo de microorganismos, preferiblemente hongos. El empleo del extracto líquido de alpeorujo seco y extractado de la invención como medio de cultivo de hongos es económico y permite la obtención de una abundante masa fúngica, superior a la obtenible mediante otros medios convencionalmente empleados para el cultivo de estos microorganismos.Mushroom culture medium obtained from dried and extracted alpeorujo. # The present invention relates to a method of obtaining a liquid extract of dry and extracted alpeorujo, to the extract obtainable by said method and to the use thereof for the cultivation of microorganisms, preferably fungi. The use of the liquid extract of dried and extracted alpeorujo of the invention as a fungal culture medium is economical and allows obtaining an abundant fungal mass, superior to that obtainable by other means conventionally used for the cultivation of these microorganisms.

Description

Medio de cultivo de hongos obtenido a partir de alpeorujo seco y extractado. Mushroom culture medium obtained from dried and extracted alpeorujo.

La presente invención se encuadra en el campo de la microbiología y especíﬁcamente se reﬁere a un procedimiento de obtención de un extracto líquido de alpeorujo seco y extractado, al extracto obtenible mediante dicho método y al uso del mismo para el cultivo de microorganismos, preferiblemente de hongos. El empleo del extracto líquido de alpeorujo seco y extractado de la invención como medio de cultivo de hongos es económico y permite la obtención de una abundante masa fúngica. The present invention falls within the field of microbiology and specifically refers to a procedure for obtaining a dried and extracted liquid extract of alpeorujo, the extract obtainable by said method and the use thereof for the cultivation of microorganisms, preferably fungi . The use of the liquid extract of dried and extracted alpeorujo of the invention as a fungal culture medium is economical and allows to obtain an abundant fungal mass.

Estado de la técnica anterior Prior art

El cultivo del olivar y la extracción del aceite de oliva tienen una extraordinaria importancia económica y social. Los sistemas de extracción del aceite de oliva se han ido modiﬁcando en las últimas décadas cambiando con ello la producción, la composición y el aprovechamiento de los subproductos generados. Así, a inicios de los 90 se introdujo un sistema de extracción continuo de dos fases de aceite de oliva que consiguió una reducción en el consumo de agua y de energía, principal inconveniente del sistema de tres fases, y la consecuente eliminación de la producción de alpechines, pero trajo consigo el problema de que tras la centrifugación de la pasta de aceituna se produce, además de aceite, un nuevo subproducto consistente en un residuo sólido, de elevada humedad y rico en grasas y azúcares, denominado alpeorujo. The cultivation of the olive grove and the extraction of olive oil have an extraordinary economic and social importance. Olive oil extraction systems have been changing in recent decades, thereby changing the production, composition and use of the generated by-products. Thus, at the beginning of the 90s a system of continuous extraction of two phases of olive oil was introduced that achieved a reduction in the consumption of water and energy, the main drawback of the three-phase system, and the consequent elimination of the production of alpechines, but brought with it the problem that after the centrifugation of the olive paste, in addition to oil, a new by-product is produced consisting of a solid residue, of high humidity and rich in fats and sugars, called alpeorujo.

Los alpeorujos húmedos, tras un procesado posterior, se destinan a la obtención del aceite de orujo por medio de extracción con n-hexano, generando un residuo ﬁnal denominado “alpeorujo seco y extractado” que, en su mayor parte, se emplea como combustible o se incinera para obtener energía mediante la cogeneración de energía eléctrica y térmica en las propias almazaras, dado su elevado poder caloríﬁco (Caputo A. C., et al., 2003, Applied Thermal Engineering, 23:197-214). Sin embargo, debido a la gran cantidad de residuo que se genera en cada una de las campañas oleícolas, es necesaria la búsqueda de vías alternativas para el tratamiento de estos subproductos. Por ello, se están intentando utilizar también como pienso para rumiantes, producción de compost (ES2103206 B1) y para la obtención de productos de interés para la industria farmacéutica, cosmética y alimentaria. The wet alpeorujos, after a subsequent processing, are destined to obtain the pomace oil by means of extraction with n-hexane, generating a final residue called “dry and extracted alpeorujo” that, for the most part, is used as fuel or it is incinerated to obtain energy through the cogeneration of electrical and thermal energy in the mills themselves, given its high calorific value (Caputo AC, et al., 2003, Applied Thermal Engineering, 23: 197-214). However, due to the large amount of waste generated in each of the olive oil campaigns, the search for alternative ways to treat these by-products is necessary. Therefore, they are also trying to use as feed for ruminants, compost production (ES2103206 B1) and to obtain products of interest to the pharmaceutical, cosmetic and food industry.

El alpeorujo seco y extractado está compuesto por los restos de pulpa y piel de las aceitunas y es un residuo muy rico en compuestos fenólicos como son el hidroxitirosol, salidrósido, glucósido de luteolina, rutina, tirasol y oleuropeína, por lo que cuando es usado como fertilizante no puede aplicarse directamente al suelo debido a los efectos ﬁtotóxicos de estos fenoles que además repercuten perjudicialmente en la población microbiana. Por ello, se ha propuesto la biotransformación este subproducto para que pueda ser empleado como fertilizante orgánico. En este sentido, el alpeorujo seco y extractado se ha sometido a procesos de fraccionamiento y se han obtenido así extractos del mismo en los que se han cultivado hongos saprobios capaces de llevar a cabo una detoxiﬁcación, de manera que así disminuye la ﬁtotoxicidad de este residuo y puede ser ﬁnalmente empleado como fertilizante. En este caso los hongos crecen utilizando un extracto acuoso de alpeorujo seco y extractado como fuente de nutrientes, sin embargo, este extracto ha de encontrarse diluido un 50% para evitar que las condiciones de toxicidad del mismo sean limitantes para el crecimiento microbiano (Aranda Ballesteros, E., 2006). The dried and extracted alpeorujo is composed of the remains of pulp and skin of the olives and is a very rich residue in phenolic compounds such as hydroxytyrosol, salidrósido, luteolin glycoside, rutin, tirasol and oleuropein, so when used as Fertilizer cannot be applied directly to the soil due to the toxic effects of these phenols that also have a detrimental effect on the microbial population. Therefore, the biotransformation of this by-product has been proposed so that it can be used as an organic fertilizer. In this sense, the dried and extracted alpeorujo has undergone fractionation processes and thus extracts thereof have been obtained in which saprobic fungi capable of carrying out a detoxification have been cultivated, so that the toxicity of this residue decreases and can finally be used as a fertilizer. In this case the fungi grow using an aqueous extract of dried alpeorujo and extracted as a source of nutrients, however, this extract has to be diluted 50% to avoid that the toxicity conditions of the same are limiting for microbial growth (Aranda Ballesteros , E., 2006).

El hidroxitirosol, el tirasol y la oleuropeína son potentes antioxidantes que se pueden extraer del alpeorujo seco y extractado por medio de tratamiento térmico al vapor. Este residuo se puede utilizar también para la producción de pectina, compuesto de gran interés en la industria alimentaria ya que es usada como agente geliﬁcante, estabilizante y emulsionante (Cardoso S. M., et al., 2003, Carbohydrate Polymers, 52:125-133). Además también se ha estudiado la mezcla del alpeorujo seco y extractado con polímeros termoplásticos para la fabricación de contenedores (Siracusa G., et al., 2001, Journal of Polymers and the Environment, 9:157-161). Hydroxytyrosol, tirasol and oleuropein are potent antioxidants that can be extracted from dry alpeorujo and extracted by steam heat treatment. This residue can also be used for the production of pectin, a compound of great interest in the food industry since it is used as a gelling agent, stabilizer and emulsifier (Cardoso SM, et al., 2003, Carbohydrate Polymers, 52: 125-133) . In addition, the mixture of dried alpeorujo and extracted with thermoplastic polymers for the manufacture of containers has also been studied (Siracusa G., et al., 2001, Journal of Polymers and the Environment, 9: 157-161).

Por otro lado, las almazaras están empezando a separar los huesos presentes en el alpeorujo seco y extractado debido al aumento de su valor en el mercado, no sólo como combustible sino también por su uso como abrasivo, como materia prima para la obtención de carbón activo e incluso como inductor del compostaje de otros materiales orgánicos. On the other hand, oil mills are beginning to separate the bones present in the dry and extracted alpeorujo due to the increase in their market value, not only as fuel but also for their use as an abrasive, as raw material for obtaining active carbon and even as a composting inducer of other organic materials.

Por otra parte, desde antiguo y en la actualidad se emplean microorganismos para producir industrialmente productos con ﬁnes comerciales, como antibióticos, antioxidantes, ﬁtohormonas, vitaminas, grasas insaturadas, proteínas, aminoácidos, fertilizantes, productos ﬁtosanitarios, etc. Sin embargo, es necesario disponer de nutrientes minerales y carbohidratos como materia prima carbonada en el caldo de cultivo de estos microorganismos. Pero los carbohidratos son relativamente caros y, en muchos casos, de más alto precio que los productos generados mediante el proceso de fermentación. En el caso de los hongos, existen para su crecimiento diversos medios de cultivo, siendo los comúnmente empleados, por ejemplo, el extracto de malta, caldo patata-dextrosa (PDB) o Czapeck. On the other hand, since ancient times and nowadays, microorganisms are used to industrially produce products with commercial purposes, such as antibiotics, antioxidants, phytohormones, vitamins, unsaturated fats, proteins, amino acids, fertilizers, phytosanitary products, etc. However, it is necessary to have mineral nutrients and carbohydrates as carbonated raw material in the breeding ground of these microorganisms. But carbohydrates are relatively expensive and, in many cases, of a higher price than products generated through the fermentation process. In the case of fungi, there are various culture media for their growth, being commonly used, for example, malt extract, potato dextrose broth (PDB) or Czapeck.

En resumen, existe por una lado la necesidad de encontrar nuevas aplicaciones industriales para la gran cantidad de alpeorujo seco y extractado que se obtiene como residuo en la industria oleícola, y por otro, la necesidad disponer de medios de cultivo mejorados que aporten nutrientes minerales y carbohidratos como materia prima carbonada para el crecimiento in vitro de microorganismos, que sean más económicos y que permitan obtener una mayor masa fúngica que los existentes actualmente. In summary, there is the need to find new industrial applications for the large amount of dry and extracted alpeorujo obtained as waste in the olive industry, and on the other, the need to have improved culture media that provide mineral nutrients and Carbohydrates as carbonated raw material for the in vitro growth of microorganisms, which are cheaper and that allow to obtain a greater fungal mass than those currently existing.

Descripción de la invención Description of the invention

La presente invención proporciona un procedimiento de obtención de un extracto líquido de alpeorujo seco y extractado así como el extracto obtenible mediante dicho método, y propone el uso del mismo para el cultivo de microorganismos, preferiblemente de hongos. El empleo del extracto líquido de alpeorujo seco y extractado de la invención como medio de cultivo de hongos es económico y permite la obtención de una abundante masa fúngica. The present invention provides a method of obtaining a dry and extracted liquid extract of alpeorujo as well as the extract obtainable by said method, and proposes the use thereof for the cultivation of microorganisms, preferably fungi. The use of the liquid extract of dried and extracted alpeorujo of the invention as a fungal culture medium is economical and allows to obtain an abundant fungal mass.

Mediante extracciones acuosas del alpeorujo seco y extractado y posterior concentración del producto obtenido, en la presente invención se obtiene un extracto líquido óptimo para el cultivo de microorganismos de interés industrial, preferiblemente de hongos, más preferiblemente de hongos saprobios productores de metabolitos primarios y/o secundarios susceptibles de aplicación comercial. Así, se propone el extracto líquido de alpeorujo seco y extractado de la invención como una fuente de nutrientes barata para el cultivo de microorganismos, ya que permite obtener una masa microbiana abundante aplicable tanto a nivel agrícola como industrial. By aqueous extractions of the dried and extracted alpeorujo and subsequent concentration of the product obtained, in the present invention an optimum liquid extract is obtained for the cultivation of microorganisms of industrial interest, preferably of fungi, more preferably of saprobic fungi producing primary metabolites and / or secondary susceptible of commercial application. Thus, the liquid extract of dried and extracted alpeorujo of the invention is proposed as a source of cheap nutrients for the cultivation of microorganisms, since it allows to obtain an abundant microbial mass applicable both at agricultural and industrial level.

El procedimiento de la invención conduce a la obtención de un extracto líquido de alpeorujo seco y extracto cuyas características físico-químicas diﬁeren de las de otros extractos líquidos de alpeorujo seco y extractados obtenibles mediante otros métodos conocidos en el estado de la técnica, por ejemplo, en el grado de concentración de sus componentes. Por tanto, como muestran los ejemplos de la presente invención, cuando se utiliza como medio de cultivo el extracto líquido de alpeorujo seco y extractado de la invención la masa microbiana obtenible es superior (más del triple) a la que se obtiene cuando se emplea como medio de cultivo cualquier otro extracto líquido de alpeorujo sin concentrar obtenible mediante otros procedimientos, lo que demuestra que, al contrario de lo que se suponía hasta la fecha en relación a los efectos tóxicos de los fenoles presentes en este residuo sobre el crecimiento microbiano, los microorganismos son capaces de proliferar óptimamente en un extracto líquido de alpeorujo seco y extractado cuyos elementos constitutivos se encuentran doblemente concentrados. The process of the invention leads to the obtaining of a liquid extract of dry alpeorujo and extract whose physical-chemical characteristics differ from those of other liquid extracts of dry alpeorujo and extracted obtainable by other methods known in the state of the art, for example, in the degree of concentration of its components. Therefore, as the examples of the present invention show, when the dried and extracted liquid extract of the invention is used as a culture medium, the obtainable microbial mass is greater (more than triple) than that obtained when used as culture medium any other non-concentrated liquid extract of alpeorujo obtainable by other procedures, which demonstrates that, contrary to what was supposed to date in relation to the toxic effects of the phenols present in this residue on microbial growth, Microorganisms are able to proliferate optimally in a liquid extract of dried and extracted alpeorujo whose constituent elements are doubly concentrated.

Además, en la presente invención se muestran, a modo de ejemplo, pruebas comparativas de crecimiento de diversos hongos cultivados en el extracto líquido de alpeorujo seco y extractado de la invención y en medios convencionalmente empleados para el cultivo de hongos, como el extracto de malta, caldo patata-dextrosa (PDB) y Czapeck. Los resultados permiten apreciar un incremento del 200-300% en la masa fúngica cuando el cultivo se realiza en el extracto líquido de alpeorujo seco y extractado de la invención respecto a cuando se realiza en cualquiera de los otros medios. Furthermore, in the present invention, comparative tests of growth of various fungi grown in the dry extract liquid extract extracted from the invention and in media conventionally used for the cultivation of fungi, such as malt extract, are shown by way of example , potato-dextrose broth (PDB) and Czapeck. The results show an increase of 200-300% in the fungal mass when the culture is carried out in the liquid extract of dried alpeorujo and extracted from the invention compared to when it is carried out in any of the other media.

De esta manera, la presente invención resuelve dos graves problemas, a saber, uno de naturaleza económica, en cuanto a que el extracto líquido de alpeorujo seco y extractado descrito aquí y propuesto como medio de cultivo es más rentable que los medios de cultivo convencionales; y otro de tipo ecológico, ya que la presente invención propone una nueva aplicación industrial de un residuo contaminante procedente de la industria oleícola como es el alpeorujo seco y extractado. Thus, the present invention solves two serious problems, namely one of an economic nature, in that the liquid extract of dried and extracted alpeorujo described herein and proposed as a culture medium is more cost effective than conventional culture media; and another of ecological type, since the present invention proposes a new industrial application of a contaminating residue from the oil industry such as dried and extracted alpeorujo.

Por tanto, un aspecto de la invención se reﬁere a un procedimiento de obtención de un extracto líquido de alpeorujo seco y extractado, de ahora en adelante “procedimiento de la invención”, que comprende: Therefore, one aspect of the invention refers to a process for obtaining a dried and extracted liquid extract of alpeorujo, hereafter referred to as the "process of the invention", which comprises:

a. to.: realizar una extracción sólido-líquido de alpeorujo seco y extractado mediante una disolución acuosa, perform a solid-liquid extraction of dried alpeorujo and extracted by an aqueous solution,

b. b.: ﬁltrar el extracto obtenido en el paso (a), ﬁ ltrate the extract obtained in step (a),

c. C.: centrifugar el ﬁltrado obtenido en el paso (b), centrifuge the filtrate obtained in step (b),

d. d.: ﬁltrar el sobrenadante obtenido en la centrifugación del paso (c), y ﬁ ltrate the supernatant obtained in the centrifugation of step (c), and

e. and.: concentrar un 40-60% el ﬁltrado obtenido en el paso (d). concentrate the filtrate obtained in step (d) by 40-60%.

El término “alpeorujo seco y extractado” o “DOR” se reﬁere al residuo que se obtiene en el proceso de generación del aceite de orujo tras la extracción del alpeorujo con n-hexano, que posee un bajo porcentaje de aceite, preferiblemente de entre el 0,2 y el 0,5%, una humedad de entre el 10% y el 13%, un elevado poder caloríﬁco, de aproximadamente 4.000 kcal/g, está compuesto por lignina, celulosa, sustancias pécticas, hemicelulosas, lípidos, materia orgánica, compuestos fenólicos, etc., y presenta un pH ligeramente ácido, preferiblemente de entre 5 y The term "dry and extracted alpeorujo" or "DOR" refers to the residue that is obtained in the process of generation of pomace oil after extraction of the alpeorujo with n-hexane, which has a low percentage of oil, preferably from 0.2 and 0.5%, a humidity of between 10% and 13%, a high calorific value of approximately 4,000 kcal / g, is composed of lignin, cellulose, pectic substances, hemicelluloses, lipids, organic matter , phenolic compounds, etc., and has a slightly acidic pH, preferably between 5 and

6. 6.

La extracción sólido-líquido de alpeorujo seco y extractado del paso (a) del procedimiento de la invención se podría realizar, por ejemplo, aunque sin limitarnos, mediante extractor rotativo orbital o mediante Soxhlet. En una realización preferida de este aspecto de la invención, la extracción sólido-líquido del paso (a) se realiza mediante un extractor rotativo orbital. La extracción sólido-líquido mediante extractor rotativo orbital es una técnica conocida en el estado de la técnica en la que se obtiene una fracción sólida y un extracto líquido, el cual se obtiene mezclando un solvente, por ejemplo aunque sin limitarnos, agua, metanol o acetato de etilo, con el alpeorujo seco y extractado. Se entiende por “disolución acuosa” cualquier disolución en la que el disolvente (o el disolvente mayoritario, en el caso de una mezcla de disolventes) sea agua. Esta disolución acuosa puede comprender, además de agua, otras sustancias tales como solutos, etc. En otra realización preferida, la disolución acuosa del paso (a) del procedimiento de la invención es agua. En otra realización preferida, en la extracción sólido-líquido del paso (a) del procedimiento de la invención la proporción de alpeorujo seco y extractado y de disolución acuosa, preferiblemente agua, es 1:2 peso:volumen. En otra realización preferida, la extracción sólido-líquido del paso (a) del procedimiento de la invención se realiza durante entre 6 y 10 horas. En una realización más preferida, la extracción sólido-líquido del paso (a) del procedimiento de la invención se realiza durante 8 horas. Es decir, el alpeorujo seco y extractado se mezcla con una disolución acuosa, preferiblemente agua, durante, preferiblemente, entre 6 y 10 horas, más preferiblemente durante 8 horas, en una proporción de, preferiblemente, 1:2 peso:volumen. The solid-liquid extraction of dried alpeorujo and extracted from step (a) of the process of the invention could be carried out, for example, but not limited to, by orbital rotary extractor or by Soxhlet. In a preferred embodiment of this aspect of the invention, solid-liquid extraction from step (a) is performed by an orbital rotary extractor. Solid-liquid extraction by means of an orbital rotary extractor is a technique known in the state of the art in which a solid fraction and a liquid extract are obtained, which is obtained by mixing a solvent, for example, but not limited to water, methanol or ethyl acetate, with dried and extracted alpeorujo. By "aqueous solution" is meant any solution in which the solvent (or the majority solvent, in the case of a solvent mixture) is water. This aqueous solution may comprise, in addition to water, other substances such as solutes, etc. In another preferred embodiment, the aqueous solution of step (a) of the process of the invention is water. In another preferred embodiment, in the solid-liquid extraction of step (a) of the process of the invention the proportion of dried and extracted alpeorujo and aqueous solution, preferably water, is 1: 2 weight: volume. In another preferred embodiment, the solid-liquid extraction of step (a) of the process of the invention is carried out for between 6 and 10 hours. In a more preferred embodiment, the solid-liquid extraction of step (a) of the process of the invention is carried out for 8 hours. That is, the dried and extracted alpeorujo is mixed with an aqueous solution, preferably water, for, preferably, between 6 and 10 hours, more preferably for 8 hours, in a proportion of, preferably, 1: 2 weight: volume.

Transcurridas entre 6 y 10 horas, preferiblemente 8 horas, el extracto obtenido en el paso (a) se somete a un proceso de ﬁltrado, en el que dicho extracto se hace pasar a través de un material poroso como, por ejemplo, aunque sin limitarnos, tela, tamiz, malla o gasa. En otra realización preferida, la ﬁltración del paso (b) del procedimiento de la invención se realiza a través de una gasa. En una realización más preferida, la gasa comprende un tamaño de poro de entre 100 y 150 μ. After 6 to 10 hours, preferably 8 hours, the extract obtained in step (a) is subjected to a filtering process, in which said extract is passed through a porous material, for example, but not limited to , cloth, sieve, mesh or gauze. In another preferred embodiment, the filtration of step (b) of the process of the invention is carried out through gauze. In a more preferred embodiment, the gauze comprises a pore size between 100 and 150 μ.

A continuación, el material ﬁltrado obtenido en el paso (b) se centrifuga. En una realización preferida, la centrifugación del paso (c) del procedimiento de la invención se realiza a entre 8.000 y 12.000 xg. En una realización más preferida, la centrifugación del paso (c) del procedimiento de la invención se realiza a 10.000 xg. En otra realización preferida, la centrifugación del paso (c) del procedimiento de la invención se realiza durante entre 8 y 12 minutos. En una realización más preferida, la centrifugación del paso (c) del procedimiento de la invención se realiza durante 10 minutos. Then, the ﬁ ltered material obtained in step (b) is centrifuged. In a preferred embodiment, the centrifugation of step (c) of the process of the invention is performed at between 8,000 and 12,000 xg. In a more preferred embodiment, the centrifugation of step (c) of the process of the invention is performed at 10,000 xg. In another preferred embodiment, the centrifugation of step (c) of the process of the invention is carried out for between 8 and 12 minutes. In a more preferred embodiment, the centrifugation of step (c) of the process of the invention is performed for 10 minutes.

El sobrenadante obtenido en esta centrifugación se somete a un proceso de ﬁltrado. En otra realización preferida, la ﬁltración del paso (d) del procedimiento de la invención se realiza a través de un papel de ﬁltro. Posteriormente, el material ﬁltrado obtenido en el paso (d) se concentra entre un 40 y un 60%, preferiblemente un 50%, mediante, por ejemplo, aunque sin limitarnos, evaporación, lioﬁlización o rotavapor. En una realización preferida, la concentración del paso (e) del procedimiento de la invención se realiza mediante un rotavapor. Esta concentración mediante rotavapor se realiza, preferiblemente, durante entre4y8 horas. Se entiende por “rotavapor” el dispositivo consistente en un motor eléctrico que produce el giro de un tubo al que se acopla un recipiente de fondo preferiblemente redondo que contiene la solución. Dicho recipiente se sumerge parcialmente en un baño de agua, mientras se mantiene el giro. Preferiblemente, la temperatura del baño no debe exceder de 35-40ºC. Acoplado al sistema se encuentra un refrigerante por el que circula un líquido, preferiblemente agua, que produce la condensación del solvente que se recoge en un colector. El conjunto constituye un sistema cerrado conectado a una bomba de vacío, preferiblemente una trompa de agua o un circuito de vacío. The supernatant obtained in this centrifugation is subjected to a filtration process. In another preferred embodiment, the ﬁ ltration of step (d) of the process of the invention is carried out through a filter paper. Subsequently, the ﬁ ltered material obtained in step (d) is concentrated between 40 and 60%, preferably 50%, by, for example, but not limited to evaporation, lyophilization or rotary evaporation. In a preferred embodiment, the concentration of step (e) of the process of the invention is carried out by a rotary evaporator. This concentration by rotary evaporator is preferably carried out for 4-8 hours. By "rotary evaporator" is meant the device consisting of an electric motor that produces the rotation of a tube to which a preferably round bottom container containing the solution is coupled. Said container is partially submerged in a water bath, while maintaining the rotation. Preferably, the bath temperature should not exceed 35-40 ° C. Attached to the system is a refrigerant through which a liquid, preferably water, circulates, which produces the condensation of the solvent that is collected in a collector. The assembly constitutes a closed system connected to a vacuum pump, preferably a water tube or a vacuum circuit.

El procedimiento de la invención puede comprender otros pasos adicionales relacionados, por ejemplo, aunque sin limitarnos, con la extracción sólido-líquido del paso (a) o con la conservación y/o tratamiento posterior del extracto líquido de alpeorujo seco y extractado obtenible. The process of the invention may comprise other additional steps related, for example, but not limited to, with the solid-liquid extraction of step (a) or with the preservation and / or subsequent treatment of the liquid extract of dried and extracted alpeorujo obtainable.

Otro aspecto de la invención se reﬁere a un extracto líquido de alpeorujo seco y extractado, de ahora en adelante “extracto de la invención”, obtenible mediante el procedimiento de la invención. En el extracto de la invención los fenoles y otros elementos constituyentes de los extractos líquidos de alpeorujo seco y extractado se encuentran el doble de concentrados de lo que lo están los extractos obtenibles mediante otros métodos de extracción-sólido líquido de este residuo. Este extracto de la invención se puede almacenar a una temperatura de, por ejemplo, aunque sin limitarnos, entre -20ºC y -80ºC hasta su posterior utilización. Another aspect of the invention refers to a dry and extracted liquid extract of alpeorujo, hereinafter "extract of the invention", obtainable by the process of the invention. In the extract of the invention the phenols and other constituent elements of the liquid extracts of dried and extracted alpeorujo are twice as concentrated as the extracts obtainable by other methods of extracting-solid liquid from this residue. This extract of the invention can be stored at a temperature of, for example, but not limited to, between -20 ° C and -80 ° C until later use.

En una realización preferida, el extracto de la invención comprende: In a preferred embodiment, the extract of the invention comprises:

a. to.: entre 45 y 65 g/l de carbono orgánico total, preferiblemente 55,7 g/l, between 45 and 65 g / l of total organic carbon, preferably 55.7 g / l,

b. b.: entre 0,2 y 0,5 g/l de P, preferiblemente 0,39 g/l, between 0.2 and 0.5 g / l of P, preferably 0.39 g / l,

c. C.: entre 0,5 y 1 g/l de Ca, preferiblemente 0,87 g/l, between 0.5 and 1 g / l of Ca, preferably 0.87 g / l,

d. d.: entre 6 y 8,5 g/l de K, preferiblemente 7,7 g/l, between 6 and 8.5 g / l of K, preferably 7.7 g / l,

e. and.: entre 0,1 y 0,5 g/l de Mg, preferiblemente 0,22 g/l, between 0.1 and 0.5 g / l of Mg, preferably 0.22 g / l,

f. F.: entre 0,03 y 0,05 g/l de Na, preferiblemente 0,043 g/l, between 0.03 and 0.05 g / l of Na, preferably 0.043 g / l,

g. g.: entre 0,05 y 0,2 g/l de S, preferiblemente 0,16 g/l, between 0.05 and 0.2 g / l of S, preferably 0.16 g / l,

h. h.: entre 0,006 y 0,01 g/l de B, preferiblemente 0,0083 g/l, between 0.006 and 0.01 g / l of B, preferably 0.0083 g / l,

i. i.: entre 0,0008 y 0,002 g/l de Cu, preferiblemente 0,0015 g/l, between 0.0008 and 0.002 g / l of Cu, preferably 0.0015 g / l,

j. j.: entre 0,01 y 0,03 g/l de Fe, preferiblemente 0,025 g/l, between 0.01 and 0.03 g / l Fe, preferably 0.025 g / l,

k. k.: entre 0,002 y 0,004 g/l de Mn, preferiblemente 0,0034 g/l y between 0.002 and 0.004 g / l of Mn, preferably 0.0034 g / l and

l. l.: entre 0,003 y 0,005 g/l de Zn, preferiblemente 0,0046 g/l, between 0.003 and 0.005 g / l of Zn, preferably 0.0046 g / l,

y se encuentra a un pH de entre 4.5 y 6, preferiblemente de 5.3. No obstante, el extracto de la invención presenta una composición variable, en cuanto a elementos químicos, proteínas, como por ejemplo, aunque sin limitarnos, enzimas, etc., que vendrá determinada por ciertos factores del procedimiento de la invención, como por ejemplo, aunque sin limitarnos, el tipo de solvente empleado, la composición del material de partida, es decir, del alpeorujo seco y extractado, etc. and is at a pH between 4.5 and 6, preferably 5.3. However, the extract of the invention has a variable composition, in terms of chemical elements, proteins, such as, but not limited to, enzymes, etc., which will be determined by certain factors of the process of the invention, for example, although without limitation, the type of solvent used, the composition of the starting material, that is, the dried and extracted alpeorujo, etc.

El extracto de la invención supone una fuente importante de nutrientes para el crecimiento de microorganismos, preferiblemente de hongos, como demuestra el hecho de que al ser empleado como medio de cultivo permite la obtención de una abundante masa fúngica. Por ello, otro aspecto de la invención se reﬁere al uso del extracto de la invención para el cultivo de microorganismos. Los microorganismos que pueden ser cultivados en el extracto de la invención son, por ejemplo, aunque sin limitarnos, bacterias, hongos, levaduras, protozoos o algas, y en general, cualquier microorganismo de interés biotecnologico, industrial o agrícola, como por ejemplo, aunque sin limitarnos, aquellos microorganismos capaces de producir antibióticos, antioxidantes, ﬁtohormonas, hormonas, vitaminas, grasas insaturadas o saturadas, proteínas, aminoácidos, compuestos fertilizantes o productos ﬁtosanitarios. En una realización preferida de este aspecto de la invención, el microorganismo es un hongo. El término “hongo” se reﬁere a cualquier microorganismo perteneciente al reino Fungi, ya sea ﬁlamentoso o levaduriforme, caracterizado por poseer, entre otros componentes, una pared celular compuesta por quitina. Preferiblemente, los hongos que pueden ser cultivados en el extracto de la invención son hongos saprobios, más preferiblemente, hongos saprobios productores de metabolitos primarios y/o secundarios. Los “hongos saprobios” son todos aquellos hongos capaces de descomponer materiales orgánicos, vegetales o animales, para alimentarse. The extract of the invention is an important source of nutrients for the growth of microorganisms, preferably fungi, as evidenced by the fact that being used as a culture medium allows obtaining an abundant fungal mass. Therefore, another aspect of the invention refers to the use of the extract of the invention for the cultivation of microorganisms. The microorganisms that can be cultured in the extract of the invention are, for example, but not limited to, bacteria, fungi, yeasts, protozoa or algae, and in general, any microorganism of biotechnological, industrial or agricultural interest, for example, although without limiting ourselves, those microorganisms capable of producing antibiotics, antioxidants, phytohormones, hormones, vitamins, unsaturated or saturated fats, proteins, amino acids, fertilizer compounds or phytosanitary products. In a preferred embodiment of this aspect of the invention, the microorganism is a fungus. The term "fungus" refers to any microorganism belonging to the Fungi kingdom, either ﬁ lament or levaduriform, characterized by having, among other components, a cell wall composed of chitin. Preferably, the fungi that can be grown in the extract of the invention are saprobic fungi, more preferably, saprobic fungi producing primary and / or secondary metabolites. "Saprobial fungi" are all those fungi capable of breaking down organic, vegetable or animal materials, to feed themselves.

En una realización más preferida, el hongo pertenece a un género seleccionado de la lista que comprende: Fusarium, Penicillium, Aspergillus, Talaromyces, Chaetomium, Wardomyces, Gliocladium, Paecilomyces, Trichoderma, Pleurotus, Cladosporium, Mucor, Phanerochaete, Coriolopsis, Trametes, Pycnoporus, Phlebia, Fomes, Panus o Mortierella. En una realización más preferida, el hongo pertenece al género Trichoderma. Se entiende por “Trichoderma” el género de hongos presente en los suelos, cuyas colonias son blancas cuando crecen en medio PDA (agar patatadextrosa) y presentan una estructura reproductora típica en forma de botella, denominada phialide. Su temperatura óptima de crecimiento se encuentra, preferiblemente, entre 20 y 28ºC, aunque crece bien entre 6 y 32ºC. El contenido mínimo de humedad para su crecimiento vegetativo es, preferiblemente, del 92% y para su esporulación es de, preferiblemente, entre el 93% y el 95%. Ejemplos de hongos pertenecientes a este género son, aunque sin limitarnos, T. harzianum, T. koningii, T. atroviride, T. viride, T. polysporum, T. hamatum, T. longibrachiatum, T. virens, T. ﬂavofuscum, T. stromaticum o T. reesei. In a more preferred embodiment, the fungus belongs to a genus selected from the list comprising: Fusarium, Penicillium, Aspergillus, Talaromyces, Chaetomium, Wardomyces, Gliocladium, Paecilomyces, Trichoderma, Pleurotus, Cladosporium, Mucor, Phanerochaete, Coriolopsis, Trametes, Pycno , Phlebia, Fomes, Panus or Mortierella. In a more preferred embodiment, the fungus belongs to the genus Trichoderma. "Trichoderma" means the genus of fungi present in soils, whose colonies are white when they grow in PDA medium (patatadextrose agar) and have a typical bottle-shaped reproductive structure, called phialide. Its optimum growth temperature is preferably between 20 and 28 ° C, although it grows well between 6 and 32 ° C. The minimum moisture content for vegetative growth is preferably 92% and for sporulation it is preferably between 93% and 95%. Examples of fungi belonging to this genus are, but not limited to, T. harzianum, T. koningii, T. atroviride, T. viride, T. polysporum, T. hamatum, T. longibrachiatum, T. virens, T. ﬂ avofuscum, T Stromaticum or T. reesei.

En una realización aun más preferida, el hongo pertenece a la especie Trichoderma harzianum, la cual se puede encontrar en diferentes materiales orgánicos y suelos, produce toxinas y antibióticos, comprende las cuatro formas biológicas Th1, Th2, Th3 y Th4 y se caracteriza porque en su estadio temprano el color del micelio es blanco y eventualmente desarrolla un color verde oscuro después de la esporulación. Las colonias de T. harzianum crecen y maduran rápidamente, preferiblemente, a 25ºC. Las especies de este género preﬁeren un pH ácido de, preferiblemente, entre 4.5 y 5, aunque son capaces de crecer a un pH de entre2y9.El tamaño de los conidióforos es de, preferiblemente, entre 62,5 y 69 μm por entre 3 y 4,7 μm. Los conidióforos son de color verde, presentan diversas ramiﬁcaciones perpendiculares, en algunos casos se observa la formación de ramas laterales en grupos de dos a tres, ubicadas en un ángulo amplio. El sistema de ramiﬁcación tiene una apariencia piramidal. Las ﬁálides son largas y delgadas, solitarias a lo largo del eje, asimétricas, con un tamaño de, preferiblemente, entre 6,3 y 15,6 μm por entre 2,7 y 3,4 μm. In an even more preferred embodiment, the fungus belongs to the species Trichoderma harzianum, which can be found in different organic materials and soils, produces toxins and antibiotics, comprises the four biological forms Th1, Th2, Th3 and Th4 and is characterized in that in its early stage the color of the mycelium is white and eventually develops a dark green color after sporulation. T. harzianum colonies grow and mature rapidly, preferably, at 25 ° C. The species of this genus prefer an acidic pH of, preferably, between 4.5 and 5, although they are capable of growing at a pH between 2 and 9. The size of the conidiophores is, preferably, between 62.5 and 69 μm for between 3 and 4.7 μm. The conidiophores are green, have different perpendicular branches, in some cases the formation of lateral branches is observed in groups of two to three, located at a wide angle. The branching system has a pyramidal appearance. The ﬁ lids are long and thin, lonely along the axis, asymmetric, with a size of preferably between 6.3 and 15.6 μm by between 2.7 and 3.4 μm.

En otra realización preferida, el hongo pertenece a la especie Trichoderma koningii, la cual se caracteriza porque sus colonias inicialmente se ven como una superﬁcie lisa, pero la formación de esporas aéreas a través del tiempo permite observarlas ligeramente algodonosas. El color de sus colonias cambia gradualmente de blanco a blanco verdoso y ﬁnalmente se tornan a un color verde oscuro. No produce pigmentos en el medio de cultivo, por lo que el reverso de la colonia es incoloro. Su temperatura de crecimiento oscila, preferiblemente, entre 20 y 25ºC, con una temperatura óptima de 25ºC. Su pH de crecimiento óptimo se encuentra, preferiblemente, entre 3.7 y 6. El contenido de humedad que favorece su crecimiento se encuentra, preferiblemente, entre el 70% y el 80%. Sus clamidosporas son intercalares o terminales, cilíndricas o globosas. Posee hifas hialinas septadas y ramiﬁcadas a ambos lados sin ser paralelas, conidióforos, ﬁálides y conidios aunque también pueden producir clamidosporas. In another preferred embodiment, the fungus belongs to the Trichoderma koningii species, which is characterized in that its colonies are initially seen as a smooth surface, but the formation of aerial spores over time makes it possible to observe them slightly cottony. The color of their colonies gradually changes from white to greenish white and they finally turn to a dark green color. It does not produce pigments in the culture medium, so the back of the colony is colorless. Its growth temperature ranges, preferably, between 20 and 25 ° C, with an optimum temperature of 25 ° C. Its optimum growth pH is preferably between 3.7 and 6. The moisture content that favors its growth is preferably between 70% and 80%. Its clamidospores are intercalar or terminal, cylindrical or globose. It has septal and branched hyaline hyphae on both sides without being parallel, conidiophores, phyllides and conidia although they can also produce clamidospores.

En otra realización preferida, el hongo pertenece a la especie Trichoderma viride, la cual se caracteriza por presentar colonias de color verde y unos conidióforos hialinos ramiﬁcados, pero no en verticilos, que nacen en racimos terminales de ﬁálides individuales o en grupo y presentan una forma globosa, subglobosa o elíptica. Este hongo es capaz de crecer a temperaturas moderadas, preferiblemente de entre 15 y 25ºC, y en presencia de un pH preferiblemente ácido. In another preferred embodiment, the fungus belongs to the species Trichoderma viride, which is characterized by presenting green colonies and branched hyaline conidiophores, but not in whorls, which are born in terminal clusters of individual or group de ﬁ nides and have a shape globose, subglobose or elliptical. This fungus is capable of growing at moderate temperatures, preferably between 15 and 25 ° C, and in the presence of a preferably acidic pH.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra “comprende” y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Throughout the description and the claims the word "comprises" and its variants are not intended to exclude other technical characteristics, additives, components or steps. For those skilled in the art, other objects, advantages and characteristics of the invention will be derived partly from the description and partly from the practice of the invention.

Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. The following examples are provided by way of illustration, and are not intended to be limiting of the present invention.

Ejemplos Examples

A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de maniﬁesto la efectividad del procedimiento de la invención en la obtención de un extracto líquido de alpeorujo seco y extractado así como del uso de éste en el cultivo de microorganismos, preferiblemente hongos. Estos ejemplos especíﬁcos que se proporcionan sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención y se incluyen solamente con ﬁnes ilustrativos, por lo que no han de ser interpretados como limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma. The invention will now be illustrated by tests carried out by the inventors, which demonstrate the effectiveness of the process of the invention in obtaining a liquid extract of dried and extracted alpeorujo as well as its use in the cultivation of microorganisms, preferably mushrooms. These specific examples provided serve to illustrate the nature of the present invention and are included for illustrative purposes only, and therefore should not be construed as limitations on the invention claimed herein. Therefore, the examples described below illustrate the invention without limiting its scope of application.

Ejemplo 1 Example 1

Procedimiento de obtención de un extracto líquido de alpeorujo seco y extractado. Procedure for obtaining a liquid extract of dried and extracted alpeorujo.

Se utilizó alpeorujo seco y extractado derivado de la tecnología de extracción en dos fases del aceite de oliva de las empresas oleícolas Colgra y Sierra Sur S.A. (Granada). El alpeorujo se autoclavó a 120ºC durante 20 minutos y se conservó en recipientes herméticos a 4ºC hasta su uso. Dry and extracted alpeorujo derived from the two-phase extraction technology of olive oil from the oil companies Colgra y Sierra Sur S.A. was used. (Pomegranate). The alpeorujo was autoclaved at 120 ° C for 20 minutes and kept in airtight containers at 4 ° C until use.

Se realizó la extracción sólido-líquido de alpeorujo seco y extractado mediante un extractor rotativo orbital con agua, durante 8 horas en la proporción 1:2 (peso:volumen). Transcurrido este tiempo la mezcla resultante se ﬁltró a través de una gasa, se centrifugó a 10.000 xg durante 10 minutos y el sobrenadante se ﬁltró con papel de ﬁltro. Posteriormente se concentró, mediante rotavapor, el volumen de extracto líquido un 50%. El extracto líquido se almacenó a -20ºC hasta su posterior utilización. Solid-liquid extraction of dried alpeorujo and extracted by means of an orbital rotary extractor with water was carried out for 8 hours in the 1: 2 ratio (weight: volume). After this time the resulting mixture was filtered through a gauze, centrifuged at 10,000 xg for 10 minutes and the supernatant was filtered with ﬁ lter paper. Subsequently, the volume of liquid extract was concentrated by rotary evaporator by 50%. The liquid extract was stored at -20 ° C until later use.

El extracto líquido obtenido por el procedimiento aquí descrito y empleado como medio de cultivo presentó la siguiente composición (tabla 1): The liquid extract obtained by the procedure described here and used as a culture medium had the following composition (table 1):

TABLA 1 TABLE 1

Composición del extracto líquido de alpeorujo seco y extractado Composition of liquid extract of dried and extracted alpeorujo

Ejemplo 2 Example 2

Cultivo de hongos en el extracto líquido de alpeorujo seco y extractado Cultivation of fungi in the liquid extract of dried and extracted alpeorujo

Se comprobó el crecimiento de hongos pertenecientes a los géneros: Fusarium, Penicillium, Aspergillus, Talaromyces, Chaetomium, Wardomyces, Gliocladium, Paecilomyces, Trichoderma, Pleurotus, Cladosporium, Mucor, Phanerochaete, Coriolopsis, Trametes, Pycnoporus, Phlebia, Fomes, Panus y Mortierella, en el medio de extracto líquido de alpeorujo seco y extractado obtenido en el ejemplo anterior. The growth of fungi belonging to the genera was checked: Fusarium, Penicillium, Aspergillus, Talaromyces, Chaetomium, Wardomyces, Gliocladium, Paecilomyces, Trichoderma, Pleurotus, Cladosporium, Mucor, Phanerochaete, Coriolopsis, Trametes, Pycnoporieomes, Phciaporieomes, Phcnoporusomes , in the medium of liquid extract of dried and extracted alpeorujo obtained in the previous example.

Ejemplo 2.1 Example 2.1

Cultivo de Trichoderma harzianum (BAFC Cult. No LC-23) en el extracto líquido de alpeorujo seco y extractado Cultivation of Trichoderma harzianum (BAFC Cult. No LC-23) in the liquid extract of dried and extracted alpeorujo

El hongo Trichoderma harzianum se cultivó en 2% de medio de cultivo agar-extracto de malta (MEA) (tabla 2) y se incubó en estufa a 28ºC, tras su crecimiento se almacenó a 4ºC hasta su uso. Trichoderma harzianum fungus was grown in 2% agar-malt extract (MEA) culture medium (table 2) and incubated in an oven at 28 ° C, after growth it was stored at 4 ° C until use.

TABLA 2 TABLE 2

Composición medio MEA (g/l) MEA medium composition (g / l)

El hongo se cultivó, posteriormente, en matraces de 250 ml con 70 ml de los medios de cultivo siguientes: The fungus was subsequently grown in 250 ml flasks with 70 ml of the following culture media:

1. one.: Extracto líquido de alpeorujo seco y extractado de la invención, Liquid extract of dried and extracted alpeorujo of the invention,

2. 2.: Extracto líquido de alpeorujo sin concentrar, Liquid extract of non-concentrated alpeorujo,

3. 3.: Extracto de malta, Malt extract,

4. Four.: Medio caldo patata-dextrosa (Potato dextrose broth o PDB), Half potato-dextrose broth (Potato dextrose broth or PDB),

5. 5.: Medio Czapeck. Tras la esterilización a 120ºC durante 20 minutos, estos medios se inocularon con 2 cuadrados 0,5 x 0,5 cm de Half Czapeck After sterilization at 120 ° C for 20 minutes, these media were inoculated with 2 squares 0.5 x 0.5 cm of

medio MEA con el hongo, y se dejaron crecer durante 15 días en agitación en una cámara de cultivo a 28ºC. La composición de cada uno de los medios de cultivo fue la que se muestra a continuación: MEA medium with the fungus, and allowed to grow for 15 days under stirring in a culture chamber at 28 ° C. The composition of each culture medium was as shown below:

TABLA 3 TABLE 3

Composición del medio extracto de malta (g/l) Composition of malt extract medium (g / l)

TABLA 4 TABLE 4

Composición del medio caldo patata-dextrosa (g/l) Composition of half potato-dextrose broth (g / l)

TABLA 5 TABLE 5

Composición del medio CZAPEK (g/l) Composition of CZAPEK medium (g / l)

Transcurrido el período de incubación, los medios se centrifugaron a 10.000 xg durante 10 minutos y se ﬁltraron con ﬁltros estériles para recoger el micelio. El micelio del hongo se lavó y tras su secado a 100ºC se determinó el peso seco. Se obtuvieron los siguientes gramos de masa seca (tabla 6): After the incubation period, the media were centrifuged at 10,000 xg for 10 minutes and sterile ﬁ lters were ﬁ ltered to collect the mycelium. The mycelium of the fungus was washed and after drying at 100 ° C the dry weight was determined. The following grams of dry mass were obtained (table 6):

TABLA 6 TABLE 6

Gramos de masa seca de micelio fúngico de Trichoderma harzianum obtenidos en cada medio de cultivo Grams of dry fungal mycelium mass of Trichoderma harzianum obtained in each culture medium

Ejemplo 2.2 Example 2.2

Cultivo de Trichoderma koningii (BAFC Cult. No B-51) en el extracto líquido de alpeorujo seco y extractado Culture of Trichoderma koningii (BAFC Cult. No B-51) in the liquid extract of dried and extracted alpeorujo

Se utilizó el mismo medio de cultivo que en el ejemplo 2.1. y el inoculo de Trichoderma koningii se fabricó también de manera similar. The same culture medium as in example 2.1 was used. and the Trichoderma koningii inoculum was also manufactured in a similar manner.

3. 3.: Extracto de malta, Malt extract,

5. 5.: Medio Czapeck. Half Czapeck

El cultivo se realizó durante 15 días en agitación en una cámara de cultivo a 28ºC. Después de lavar y secar el micelio del hongo de la misma forma que la descrita en el ejemplo 2.1. se determinó el peso seco. Se obtuvieron los siguientes gramos de masa seca (tabla 7): The culture was carried out for 15 days with stirring in a culture chamber at 28 ° C. After washing and drying the mycelium of the fungus in the same manner as described in example 2.1. dry weight was determined. The following grams of dry mass were obtained (table 7):

TABLA 7 TABLE 7

Gramos de masa seca de micelio fúngico de Trichoderma koningii obtenidos en cada medio de cultivo Grams of dry fungal mycelium mass of Trichoderma koningii obtained in each culture medium

Ejemplo 2.3 Example 2.3

Cultivo de Trichoderma viride (EEZ. No 12) en el extracto líquido de alpeorujo seco y extractado Cultivation of Trichoderma viride (EEZ. No. 12) in the liquid extract of dried and extracted alpeorujo

Se utilizaron los mismos medios de cultivo y procedimientos que los descritos en los ejemplos 2.1. y 2.2. Se obtuvieron los siguientes gramos de materia seca (tabla 8): The same culture media and procedures as described in examples 2.1 were used. and 2.2. The following grams of dry matter were obtained (table 8):

TABLA 8 TABLE 8

Gramos de masa seca de micelio fúngico de Trichoderma viride obtenidos en cada medio de cultivo Grams of dry fungal mycelium mass of Trichoderma viride obtained in each culture medium

Claims

1. Procedure for obtaining a liquid extract of dried and extracted alpeorujo comprising:

2. 2.: Procedimiento según la reivindicación 1 donde la extracción sólido-líquido del paso (a) se realiza mediante un extractor rotativo orbital. Method according to claim 1 wherein the solid-liquid extraction from step (a) is performed by an orbital rotary extractor.

3. 3.: Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones1ó2 donde en la extracción sólido-líquido del paso (a) la proporción de alpeorujo seco y extractado y de disolución acuosa es 1:2 peso:volumen. Process according to any one of claims 1 or 2 wherein in the solid-liquid extraction of step (a) the proportion of dry and extracted alpeorujo and aqueous solution is 1: 2 weight: volume.

4. Process according to any of claims 1 to 3 wherein the aqueous solution of step (a) is water.

5. 5.: Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones1a4 donde la extracción sólido-líquido del paso (a) se realiza durante entre6y10horas. Method according to any of claims 1-4 wherein the solid-liquid extraction of step (a) is carried out for between 6 and 10 hours.

6. 6.: Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 donde la ﬁltración del paso (b) se realiza a través de una gasa. Method according to any one of claims 1 to 5 wherein the ﬁ ltration of step (b) is carried out through gauze.

7. 7.: Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 donde la centrifugación del paso (c) se realiza a entre 8.000 y 12.000 xg. Method according to any one of claims 1 to 6 wherein the centrifugation of step (c) is performed at between 8,000 and 12,000 xg.

8. 8.: Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones1a7 donde la centrifugación del paso (c) se realiza durante entre8y12 minutos. Method according to any of claims 1 to 7 wherein the centrifugation of step (c) is carried out for 8-12 minutes.

9. 9.: Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 donde la ﬁltración del paso (d) se realiza a través de un papel de ﬁltro. Method according to any one of claims 1 to 8 wherein the ﬁ ltration of step (d) is performed through a ﬁ lter paper.

10. 10.: Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones1a9 donde la concentración del paso (e) se realiza mediante un rotavapor. Method according to any of claims 1-9 wherein the concentration of step (e) is carried out by a rotary evaporator.

11. eleven.: Extracto líquido de alpeorujo seco y extractado obtenible mediante el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones1a10. Liquid extract of dried and extracted alpeorujo obtainable by the method according to any of claims 1 to 10.

12. 12.: Uso del extracto líquido de alpeorujo seco y extractado según la reivindicación 11 para el cultivo de microorganismos. Use of the dried extract extract liquid extract according to claim 11 for the cultivation of microorganisms.

13. 13.: Uso del extracto líquido de alpeorujo seco y extractado según la reivindicación 12 donde el microorganismo es un hongo. Use of the liquid extract of dried and extracted alpeorujo according to claim 12 wherein the microorganism is a fungus.

14. 14.: Uso del extracto líquido de alpeorujo seco y extractado según la reivindicación 13 donde el hongo pertenece a un género seleccionado de la lista que comprende: Fusarium, Penicillium, Aspergillus, Talaromyces, Chaetomium, Wardomyces, Gliocladium, Paecilomyces, Trichoderma, Pleurotus, Cladosporium, Mucor, Phanerochaete, Coriolopsis, Trametes, Pycnoporus, Phlebia, Fomes, Panus o Mortierella. Use of the liquid extract of dried and extracted alpeorujo according to claim 13 wherein the fungus belongs to a genus selected from the list comprising: Fusarium, Penicillium, Aspergillus, Talaromyces, Chaetomium, Wardomyces, Gliocladium, Paecilomyces, Trichoderma, Pleurotus, Cladosporium, Mucor , Phanerochaete, Coriolopsis, Trametes, Pycnoporus, Phlebia, Fomes, Panus or Mortierella.

15. fifteen.: Uso del extracto líquido de alpeorujo seco y extractado según la reivindicación 14 donde el hongo pertenece al género Trichoderma. Use of the liquid extract of dried and extracted alpeorujo according to claim 14 wherein the fungus belongs to the genus Trichoderma.

16. 16.: Uso del extracto líquido de alpeorujo seco y extractado según la reivindicación 15 donde el hongo pertenece a la especie Trichoderma harzianum. Use of the liquid extract of dried and extracted alpeorujo according to claim 15 wherein the fungus belongs to the species Trichoderma harzianum.

17. 17.: Uso del extracto líquido de alpeorujo seco y extractado según la reivindicación 15 donde el hongo pertenece a la especie Trichoderma koningii. Use of the liquid extract of dried and extracted alpeorujo according to claim 15 wherein the fungus belongs to the species Trichoderma koningii.

18. 18.: Uso del extracto líquido de alpeorujo seco y extractado según la reivindicación 15 donde el hongo pertenece a la especie Trichoderma viride. Use of the liquid extract of dried and extracted alpeorujo according to claim 15 wherein the fungus belongs to the species Trichoderma viride.

SPANISH OFFICE OF THE PATENTS AND BRAND

Application no .: 201030719

SPAIN

Date of submission of the application: 14.05.2010

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REPORT ON THE STATE OF THE TECHNIQUE

51 Int. Cl.: See Additional Sheet

RELEVANT DOCUMENTS

Categoría Category: Documentos citados Reivindicaciones afectadas Documents cited Claims Affected

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A TO: SAMPEDRO, I. et al. Bioconversion of olive-mill dry residue by Fusarium lateritium and subsequent impact on its phytotoxicity. Chemosphere, 2005.Vol. 60, páginas 1393-1400. ISSN 0045-6535. Doi:10.1016/j.chemosphere.2005.01.093 1-4 SAMPEDRO, I. et al. Bioconversion of olive-mill dry residue by Fusarium lateritium and subsequent impact on its phytotoxicity. Chemosphere, 2005. Vol. 60, pages 1393-1400. ISSN 0045-6535. Doi: 10.1016 / j.chemosphere.2005.01.093 1-4

A TO: ARANDA, E. et al. Reusing ethyl acetate and aqueous exhausted fractions of dry olive mill residue by saprobe fungi. Chemosphere, 2007. Vol. 66, páginas 67-74. ISSN: 0045-6535. Doi:10.1016/j.chemosphere.2006.05.021 ARANDA, E. et al. Reusing ethyl acetate and aqueous exhausted fractions of dry olive mill residue by saprobe fungi. Chemosphere, 2007. Vol. 66, pages 67-74. ISSN: 0045-6535. Doi: 10.1016 / j.chemosphere. 2006.05.021

Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud Category of the documents cited X: of particular relevance Y: of particular relevance combined with other / s of the same category A: reflects the state of the art O: refers to unwritten disclosure P: published between the priority date and the date of priority submission of the application E: previous document, but published after the date of submission of the application

El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones • para las reivindicaciones nº: This report has been prepared • for all claims • for claims no:

Fecha de realización del informe 12.07.2011 Date of realization of the report 12.07.2011: Examinador A. Sukhwani Página 1/4 Examiner A. Sukhwani Page 1/4

REPORT OF THE STATE OF THE TECHNIQUE

Application number: 201030719

CLASSIFICATION OBJECT OF THE APPLICATION C12N1 / 14 (2006.01)

A61K36 / 63 (2006.01) A01N65 / 00 (2009.01) Minimum documentation sought (classification system followed by classification symbols)

C12N, A61K, A01N Electronic databases consulted during the search (name of the database and, if possible, search terms used) INVENES, EPODOC, WPI, X-FULL, NPL, CAPLUS, FSTA, AGRICOLA, CABA , CROPU, PASCAL SCISEARCH, INTERNET

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WRITTEN OPINION

Application number: 201030719

Date of Written Opinion: 12.07.2011

Statement

Novelty (Art. 6.1 LP 11/1986) Claims 7-18 YES Claims 1-6 NO

Inventive activity (Art. 8.1 LP11 / 1986) Claims YES Claims 1-18 NO

The application is considered to comply with the industrial application requirement. This requirement was evaluated during the formal and technical examination phase of the application (Article 31.2 Law 11/1986).

Opinion Base.-

This opinion has been made on the basis of the patent application as published.

Considerations:

The present application has as its object a method of obtaining a dried and extracted liquid extract of alpeorujo comprising (claim 1):

a) Perform a solid-liquid extraction of dried alpeorujo and extracted by an aqueous solution.

b) Filter the extract obtained in a).

c) Centrifuge the filtrate obtained in b).

d) Filter the supernatant obtained in the centrifugation, and

e) Concentrate the filtrate obtained in d) 40-60%.

The solid-liquid extraction of a) is carried out by means of an orbital rotary extractor (reiv. 2), the proportion of alpeorujo being dry and extracted against the aqueous solution of 1: 2 weight: volume (reiv. 3), where the aqueous solution It is water (reiv. 4). The extraction takes place between 6 and 10 hours (reiv. 5).

Filtration of b) is done through gauze (reiv. 6) and centrifugation of c) between 8,000 and 12,000 xg (reiv. 7), for 8 and 12 minutes (reiv. 8).

The filtration of d) is carried out through a filter paper (reiv. 9) and the concentration of e) by means of a rotary evaporator (reiv. 19).

Also protected is a liquid extract of dried and extracted alpeorujo obtainable by the procedure of 1-10 (reiv. 11) and the use of the liquid extract for the cultivation of microorganisms (reiv. 12), where the microorganism is a fungus ( reiv. 13), selected from Fusarium, Penicillium, Aspergillum, Talaromyces, Trichoderma, etc. (reiv. 14).

The fungus belongs to the genus Trichoderma, and can be of the species Trichoderma harzianum, T. koningii or T. viride (reivs. 15-18).

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WRITTEN OPINION

Application number: 201030719

1. Documents considered.-

The documents belonging to the state of the art taken into consideration for the realization of this opinion are listed below.

Documento Document: Número Publicación o Identificación Fecha Publicación Publication or Identification Number publication date

D01 D01: ARANDA, E. et al. Reducción de la fitotoxicidad del extracto acuoso de alpeorujo en plantas de tomate mediante el uso de Fusarium lateritium. páginas 1-3. [en línea] [recuperado el 11.07.2011] 16.11.2004 ARANDA, E. et al. Reduction of the phytotoxicity of the aqueous extract of alpeorujo in tomato plants through the use of Fusarium lateritium. pages 1-3. [online] [retrieved on 11.07.2011] 11/16/2004

D02 D02: ARANDA, E. et al. OLI-09, Decrease of plant toxicity caused by water-soluble substances of olive mill dry residue using saprobe fungi. Páginas 1-4 [en línea] [Recuperado el 11.07.2011] 24.04.2003 ARANDA, E. et al. OLI-09, Decrease of plant toxicity caused by water-soluble substances of olive mill dry residue using saprobe fungi. Pages 1-4 [online] [Retrieved on 11.07.2011] 04/24/2003

D03 D03: SAMPEDRO QUESADA, Mª I. Disminución de la fitotoxicidad del alpeorujo seco y extractado por hongos saprobios y arbusculares. Universidad de Granada, Facultad de Ciencias, Tesis Doctoral, 2005. [en línea] [recuperado el 11.07.2011] 2005 SAMPEDRO QUESADA, Mª I. Reduction of the phytotoxicity of dry alpeorujo and extracted by saprobic and arbuscular fungi. University of Granada, Faculty of Science, Doctoral Thesis, 2005. [online] [retrieved on 11.07.2011] 2005

D04 D04: SAMPEDRO, I. et al. Bioconversion of olive-mill dry residue by Fusarium lateritium and subsequent impact on its phytotoxicity. Chemosphere, 2005. Vol. 60, páginas 1393-1400. 2005 SAMPEDRO, I. et al. Bioconversion of olive-mill dry residue by Fusarium lateritium and subsequent impact on its phytotoxicity. Chemosphere, 2005. Vol. 60, pages 1393-1400. 2005

D05 D05: ARANDA, E. et al. Reusing ethyl acetate and aqueous exhausted fractions of dry olive mill residue by saprobe fungi. Chemosphere, 2007. Vol. 66, páginas 67-74 ARANDA, E. et al. Reusing ethyl acetate and aqueous exhausted fractions of dry olive mill residue by saprobe fungi. Chemosphere, 2007. Vol. 66, pages 67-74

2. Statement motivated according to articles 29.6 and 29.7 of the Regulations for the execution of Law 11/1986, of March 20, on Patents on novelty and inventive activity; quotes and explanations in support of this statement

NOVELTY

The documents cited D01 to D05 refer to the treatment of the alpeorujo, the most relevant being D01. Indeed,

* D01 refers to the reduction of the phytotoxicity of the aqueous extract of alpeorujo in tomato plants through the use of Fusarium lateritium and discloses the aqueous extraction of the alpeorujo by orbital agitation with an alpeorujo / water ratio 1: 2 for 8 hours. The suspension is passed through gauze, obtaining a solid phase (washed out) and a liquid phase (aqueous extract) that can be concentrated up to 40% v / v (page 1, Work methodology used, fourth paragraph), anticipating the technical characteristics of claims 1-6.

Therefore, in view of document D01, it can be concluded that claims 1-6 are novel in accordance with Article 6 LP 11/86.

INVENTIVE ACTIVITY

The object of obtaining a liquid extract of dried and extracted alpeorujo and its use for the cultivation of microorganisms such as fungi is obvious to those skilled in the art in view of documents D01 to D03.

* *: D01 afecta no solo a la novedad sino también a la actividad inventiva de las reivindicaciones afectadas pero, además, los documentos D02 y D03 son relevantes para el estudio de la actividad inventiva de todas las reivindicaciones. Así, D01 affects not only the novelty but also the inventive activity of the affected claims but, in addition, documents D02 and D03 are relevant for the study of the inventive activity of all claims. So,

* *: D02 se refiere a la disminución de la toxicidad de las plantas causada por sustancias solubles en agua de residuos de alpeorujo (olive mill dry) usando hongos saprobios. El extracto acuoso de alpeorujo se obtuvo de un orbital agitando durante 8 horas con agua destilada en la proporción 1:2, la suspensión se filtró y se utilizó como medio de cultivo para hongos (página 2, líneas 3-10). La concentración llegó hasta el 15% (página 2) para el experto en la técnica sería evidente probar con otras concentraciones. Además, a la vista del documento D03 que se refiere a la disminución de la fitotoxicidad del alpeorujo seco y extractado por hongos saprobios y arbusculares con extracto acuoso de alpeorujo seco y extractado (páginas 75, 76, 107) en cuyo medio todo los hongos ensayados (página 48) fueron capaces de crecer en ausencia de suplementos nutritivos externos (página 179). D02 refers to the decrease in plant toxicity caused by water-soluble substances from alpeorujo residues (olive mill dry) using saprobic fungi. The aqueous extract of alpeorujo was obtained from an orbital by stirring for 8 hours with distilled water in the 1: 2 ratio, the suspension was filtered and used as a culture medium for fungi (page 2, lines 3-10). The concentration reached up to 15% (page 2) for those skilled in the art it would be obvious to try other concentrations. In addition, in view of document D03 which refers to the decrease in the phytotoxicity of dried alpeorujo and extracted by saprobic and arbuscular fungi with aqueous extract of dry and extracted alpeorujo (pages 75, 76, 107) in which medium all the fungi tested (page 48) were able to grow in the absence of external nutritional supplements (page 179).

In view of the procedure for obtaining aqueous extract of alpeorujo starting from dried and extracted alpeorujo, filtering and centrifuging disclosed in D02 as a fungal culture medium disclosed in D03, for the person skilled in the art it would not involve any inventive effort to reach all conditions of the procedure and its use in culture of the microorganisms claimed in the application under study.

Therefore, in view of documents D01 to D03, it can be concluded that claims 1-18 lack inventive activity according to Article 8 LP 11/86.

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