Composición y su uso para preparar medicamentos para la mejora de la artrosis.

La invención se refiere al campo de los medicamentos para el tratamiento de la artrosis. Más concretamente, la invención se refiere a una composición para la mejora de la biomecánica de la articulación en la artrosis y al uso de la misma para la preparación de medicamentos para el tratamiento de la artrosis, de aplicación preferiblemente por vía intraarticular.

La artrosis es una enfermedad reumática muy extendida entre la población, especialmente la de edad avanzada. Aparece por desgaste del cartílago, un tejido compuesto, en un 5%, por unas células características, los condrocitos, y, en el 95% restante, por una matriz extracelular, compuesta por proteoglucanos (moléculas agregantes compuestas por regiones ricas en queratina sulfato y regiones ricas en condroitín sulfato) unidos a un esqueleto de ácido hialurónico entrelazado con fibrillas de colágeno. El desgaste del colágeno da lugar a que los huesos de las articulaciones se muevan uno contra el otro, provocando dolor, hinchazón y pérdida de movilidad, así como desgaste de los propios huesos, con lo que la articulación acaba perdiendo también su forma natural. Además, puede producirse desprendimiento de trozos de hueso o cartílago, que provocan aún más dolor. La artrosis puede afectar a cualquier articulación del cuerpo, siendo muy frecuente la artrosis de cadera y rodilla, así como también la de manos y pies y la de columna, que afecta particularmente al cuello y a la zona lumbar.

El origen de la artrosis no está totalmente claro, aunque parece que los condrocitos (que suponen el 5% del volumen del cartílago articular normal) cumplen un papel esencial en la patogénesis de la enfermedad, mediante la producción de interleuquina-1 (IL-1), que activa una cascada de citocinas (como el TNF-\alpha) y varios derivados de las prostaglandinas, que inducen la liberación de enzimas líticas por parte de los condrocitos, que degradan componentes importantes de la matriz celular (el elemento que supone el 95% restante del cartílago) como son el colágeno II y proteoglicanos, al tiempo que la síntesis normal de la matriz por los condrocitos es inhibida. Para algunas fuentes, las citocinas (IL-1B) y el factor de necrosis tumoral (TNF-\alpha), representan los sistemas catabólieos más importantes que constituyen la fuente de degradación del tejido articular. Para otras, la presencia y acción de metaloproteasas de la matriz es particularmente significativa. En cualquier caso, a nivel molecular, se observa reducción en la cantidad de glucoaminoglucanos en la matriz, disminución de la unión entre glucosamina y colágeno II e incremento de la proporción de agua, cambios biomecánicos de la matriz que disminuyen su resistencia y elasticidad, impidiendo su funcionamiento normal en la transmisión de fuerzas, sustento de condrocitos y protección del hueso.

En cuanto al tratamiento de la artrosis que se lleva a cabo en la actualidad, los objetivos terapéuticos comprenden la reducción de los síntomas y el control de la progresión del proceso patológico. Las terapias convencionales son paliativas y se centran en la reducción del dolor y disminución de la inflamación, mediante modificación del estilo de vida y terapias farmacológicas, y también supresión de la inflamación mediante cirugía. Así, en el tratamiento farmacológico de la artrosis se incluyen:

I) Fármacos que modifican la sintomatología: SMOADS (Symptom Modifying OsteoArthritis DrugS )

- Fármacos de acción rápida (Analgésicos, Antiinflamatorios no esteroideos (AINE), Glucocorticoides intraarticulares)

- Fármacos de acción lenta: Symptomatic Slow Acting Drugs for OsteoArthritis (SYSADOA): agentes o suplementos condroprotectores (condroitín sulfato, sulfato de glucosamina, y diacereína), que se administran habitualmente por vía oral, y agentes de viscosuplementación de administración de inyección intraarticular (Acido Hialurónico: AH) que, entre otros efectos, intentan reemplazar la acción lubricante y amortiguadora del líquido sinovial que ha perdido sus propiedades viscoelásticas.

II) Fármacos modificadores de la enfermedad artrósica: Disease Modifying OsteoArthritis DrugS (DMOADS). Recientemente se han publicado resultados de un ensayo clínico realizado con AH que parecen situarle como candidato para ser incluido en este grupo.

Los agentes condroprotectores retrasan el proceso degenerativo y fomentan la normalización del líquido sino vial de la matriz del cartílago. Pueden definirse como compuestos que estimulan la síntesis de colágeno y proteoglucanos y la producción de ácido hialurónico, que inhiben la degradación del cartílago y evitan la formación de fibrina en la circulación subcondral y sinovial. Generalmente, se engloba bajo esta denominación a compuestos que se administran habitualmente por vía oral, tales como el sulfato de glucosamina, el condroitín sulfato y la diacereína, aunque algunos de sus efectos son compartidos también por el ácido hialurónico, que se administra habitualmente por vía
intraarticular.

Es bien conocido que el tratamiento intraarticular con ácido hialurónico (AH) e hylanos (de pesos moleculares muy distintos) (Prieto y cols., 2005) es cada vez mas aceptado como terapia en la artrosis. Se trata en ambos casos de moléculas poliméricas del tipo glucosaminoglucanos, con enlaces \beta, de textura viscosa. El ácido hialurónico en concreto es una molécula endógena del cartílago, presente en el líquido sinovial, constituido por cadenas lineales, de longitud variable, formadas por repeticiones del disacárido resultante de la unión de N-acetil glucosamina y ácido glucorónico, y es un compuesto soluble en agua y capaz de retener grandes cantidades de la misma. Los compuestos denominados hylanos o hilanos, por su parte, resultan del entrecruzamiento de cadenas de ácido hialurónico en las que los restos carboxílicos y N-acetilo no se ven afectadas y, en general, son insolubles en agua, dando lugar a geles (hylano B) o presentándose unidos a la membrana. Existen también otras formas del ácido hialurónico que presentan entrecruzamiento entre las cadenas para facilitar su estabilización, como el NASHA (ácido hialurónico estabilizado de origen no animal), que se utilizan también para el tratamiento de la artrosis. En general, tanto el ácido hialurónico como tal (sea cual sea su peso molecular, origen o estructura) como los derivados del mismo que presentan distintos grados de entrecruzamiento, se engloban a menudo bajo la denominación general "ácido hialurónico" y se consideran válidos para el tratamiento de la artrosis.

Se ha demostrado que el ácido hialurónico reduce el dolor en la enfermedad artrósica por disminución de la nocicepción y la respuesta sensorial en los receptores articulares del dolor (Aihara y cols., 1992; Pozo y cols., 1997). Asimismo, estudios in vitro (Yoshioka y cols., 1997; Shimizu y cols., 1998) han demostrado los efectos protectores sobre el cartílago del ácido hialurónico en modelos experimentales de artrosis. Otros estudios in vitro han demostrado también que el ácido hialurónico tiene efectos beneficiosos sobre la matriz extracelular (Frean y cols., 1999), las células del sistema inmune (Balazs y cols., 1981) y los mediadores de la inflamación (Takahashi y cols.,
1999).

En cuanto a los agentes condroprotectores, el Sulfato de Glucosamina (SG) es un aminomonosacárido natural que interviene como sustrato en la biosíntesis de los proteoglicanos del cartílago. Su mecanismo de acción no está totalmente clarificado. No existen datos clínicos que confirmen que el sulfato de glucosamina administrada por vía oral (la vía que se utiliza habitualmente para su administración) alcance las articulaciones, ni que las concentraciones en el cartílago sean suficientes para estimular su formación.

Los mecanismos de acción propuestos para el condroitín sulfato (CS) (también una molécula endógena del cartílago articular) en artrosis son: estimulación de la síntesis de proteoglicanos y colágeno endógenos por los condrocitos, disminución de la actividad catabólica de los condrocitos inhibiendo algunas enzimas proteolíticas, y actividad antiinflamatoria a nivel de los componentes celulares de la inflamación.

La diacereína, por su parte, es un compuesto purificado con estructura antraquinónica, que ha probado inhibir in vivo e in vitro la producción y actividad de la IL-1 y la secreción de metaloproteasas sin alterar la síntesis de prostaglandinas, ejerciendo un mecanismo remodelador del cartílago articular (Humberto Mendoza y García Armenia, 2005).

Ninguno de estos compuestos, administrados de forma independiente, es capaz de parar o revertir la degradación de las articulaciones que se produce durante la artrosis. El alivio que producen en la sintomatología es sólo parcial.

Dada la gran extensión de la artrosis entre la población, especialmente entre las personas de edad superior a 50 años, y teniendo en cuenta que el aumento de la esperanza de vida está dando lugar a un sensible incremento de la proporción de individuos en edad avanzada presentes en los países industrializados, sería conveniente encontrar nuevos compuestos, composiciones o formas de administración que dieran mejores resultados que los tratamientos actuales destinados a la mejora de la artrosis. La presente invención proporciona una solución a este problema.

Aihara S, Mukakami N, Ishii R, Kariya K, Azuma Y, Hamada K, Umemoto J, Maeda S. "Effects of sodium hyaluronate on the nociceptive response of rats with experimentally induced arthritis". Nippon Yakurigaku Zasshi Folia Pharmacol Japan. 100(4): 359-65; 1992.

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Frean S P, Abraham L A, Lees P. "In vitro stimulation of equine articular cartilage proteoglycan síntesis by hyaluronan and carprofen". Res Vet Sci. 67: 183-190; 1999.

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Sánchez Lázaro Jaime A, Pilar Coronel Granado, Mercedes Gimeno del Sol, Ana González Medina, Luis Díaz Gállego, Daniel González-Arabio Sandoval and Julio Gabriel Prieto Fernández; "The Role of Different Hyaluronic Acids in the Articular Cartilage of Rabbit"; The Open Orthopaedics Journal 4: 44-47; 2010.

Scotto d'Abusco A, Corsi A, Grillo M G, Cicione C, Calamia V, Panzini G, Sansone A, Giordano C, Politi L, Scandurra R. "Effects of intraárticular administration of glucosamine and a peptidyl-glucosamine derivate in a rabbit model of experimental osteoarthritis: a pilot study"; Rheumatol Int. 28(5): 437-43; 2008.

Shimizu C; Yoshioka M; Coutts Rd; Harwood Fl; Kubo T; Hirasawa Y; Amiel D. "Long-term effects of hyaluronan on experimental osteoarthritis in the rabbit knee"; Osteoarthritis Cartilage 6(1): 1-9; 1998.

Takahashi K, Goomer R S, Harwood F, Kubo T, Hirasawa Y, Amiel D. "The effects of hyaluronan on matrix etalloproteinase-3 (MMP-3), interleukin-1beta (IL-1beta), and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 (TIMP-1) gene expression during the development of osteoarthritis"; Osteoarthritis Cartillage 7: 182-90; 1999.

Yoshioka M, Shimizu C, Harwood F L, Coutts R D, Amiel D. "The effects of hyaluronan during the development of osteoarthritis"; Osteoarthritis Cartilage 5(4):257-60; 1997.

La presente invención se basa en el descubrimiento de que la inyección intraarticular de ácido hialurónico, en el que se han disuelto distintas cantidades de un agente condroprotector (concretamente, sulfato de glucosamina) da lugar a una acción sinérgica positiva en cuanto a la mejora de parámetros relacionados con la patología artrósica, frente a la aplicación de muestras de Acido Hialurónico por la misma vía sin presencia de dicho condroprotector. Dada la semejanza en la estructura química y la acción entre el ácido hialurónico, en sus distintos pesos moleculares y orígenes, con los hylanos y otras formas del ácido hialurónico con distinto grado de entrecruzamiento en las moléculas, el efecto observado puede extenderse a los mismos.

Por ello, la invención se refiere, en un primer aspecto, a una composición, la composición de la invención, que comprende ácido hialurónico, o un hylano, y al menos un agente condroprotector, entre los cuales se incluyen sulfato de glucosamina, condroitín sulfato y diacereína. En una realización preferida de este aspecto de la invención, la composición es una disolución que comprende sulfato de glucosamina en ácido hialurónico.

La invención se refiere también al uso de la composición de la invención (que comprende un agente condroprotector y ácido hialurónico o un hylano) para el tratamiento de la artrosis. Por tanto, la invención, en un segundo aspecto, hace referencia a la composición de la invención para el tratamiento de la artrosis. Así, la invención se refiere también al uso de la composición de la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la artrosis. La artrosis a tratar puede ser artrosis de cualquier articulación, como puede ser artrosis de rodilla, tobillo, mano, pie, cadera o columna. En cualquier caso, se prefiere que la vía de administración del medicamento sea la vía intraarticular. De nuevo, en una realización particularmente preferida de este aspecto de la invención, la composición es una disolución que comprende sulfato de glucosamina en ácido hialurónico. En otra realización preferida de la invención, compatible con la anterior, la inyección intraarticular se produce en la rodilla, pues la artrosis a tratar es artrosis de rodilla. Se prefiere muy especialmente que, cuando la artrosis a tratar sea artrosis de rodilla, la composición a inyectar por vía intraarticular sea una disolución que comprenda sulfato de glucosamina y ácido hialurónico.

Fig. 1: Gráfica en la que se representan los grados (%) de Necrosis y Apoptosis de los distintos grupos experimentales: Tratamiento con H_{2}O, exclusivamente con Acido Hialurónico (barras con la leyenda AH) y/o con Acido Hialurónico + Sulfato de Glucosamina (barras con la leyenda "AH+SG"; en este último caso, los números junto a la abreviatura SG indican la concentración de sulfato de glucosamina: 2; 4; 6 y 8 mg/ml).

Fig. 2: Fotografías tomadas durante el estudio macroscópico del cartílago en los animales sometidos a tratamiento con H_{2}O (panel D), ácido hialurónico (AH) (panel C) y ácido hialurónico con sulfato de glucosamina en concentración de 8 mg/ml (AH + SG(8 mg/ml)) (panel B), complementadas con una fotografía de una rodilla normal en la que se han rotulado los componentes más relevantes (panel A). El tratamiento con AH hace que el grado del estudio de "Gross Morphology" pase de ser de grado III (cuando el tratamiento fue con agua) a un grado II (menor grado de artrosis), en tanto que el tratamiento con AH+SG (8 mg/ml) da lugar a un grado I (mínimo grado de artrosis)

Fig. 3: Representación de un fragmento de membrana plasmática de una célula viva (parte izquierda) y una célula en apoptosis temprana (parte derecha). Se indica la situación de la fosfatidilserina (PS) en el interior (parte derecha) o en el exterior de la membrana (parte izquierda), en este último caso, unida a Anexina V ("Anexina"). En el panel derecho se indica también la situación del yoduro de propidio (IP), fuera de la membrana, por no tratarse de una célula apoptótica en la que haya podido penetrar al interior.

Fig. 4: Diagramas correspondientes al proceso de calibrado y ajuste previo al estudio de citometría:

- Panel A: Determinación de la especificidad de la Anexina V-FITC. Las gráficas corresponden a la aproximación para determinar qué eventos del citómetro son las células a estudio, para lo cual se enfrenta el tamaño frente a la complejidad celular (gráfica situada a la izquierda), y la fluorescencia de la anexina frente a la fluorescencia del yoduro de propidio captada por células (gráfica situada a la derecha). Ambas imágenes son las obtenidas del método de comprobación con Anexina V recombinante, que hace que haya una gran positividad (zona rodeada por una elipse en la gráfica de la derecha) a las células incubadas con dicha anexina.

- Panel B: Autoinmuno fluorescencia en una muestra de cartílago obtenida de conejos sin y con patología: identificación del cuadrante que sirve como referencia (cero o background) para calcular la positividad de Anexina V y Yoduro de Propidio. En el cuadrante inferior izquierdo es donde se encuentran todos los eventos citométricos (en este caso condrocitos de conejo); aparecen en este cuadrante porque se encuentran vivos, es decir no teñidos con anexina ni yoduro de propidio, que tiñen células con alteraciones de la membrana (dañadas o muertas). En los cuadrantes UR (Upper Right) y LR (Lower Right) prácticamente no hay eventos, ya que estos son los correspondientes a las tinciones de anexina (LR) y de yoduro de propidio y anexina (UR).

- Panel C: Determinación de la región útil de eventos citométricos. Se indica la región seleccionada de eventos grandes y complejos, de la que quedan exentos los detritus celulares de baja complejidad y tamaño.

Fig. 5: Ejemplo de cromatograma de determinación de nitritos y nitratos por HPLC contenidos en el primer sobrenadante obtenido en la preparación de muestras para el estudio en el citómetro. En dicho cromatograma (en cuyo eje de abscisas se representa el tiempo de retención), se observa un primer pico (tiempo de retención de aproximadamente 3 minutos, concretamente 2,981 minutos, según se indica sobre el pico) correspondiente al nitrito y un segundo pico cromatográfico (tiempo de retención superior a 4 minutos, concretamente de 4,435 minutos, según se indica sobre el pico) correspondiente al nitrato. El eje de ordenadas muestras las unidades de absorbancia (AU), a 230 nm, correspondientes a la muestra inyectada. La muestra analizada es una muestra patrón de 100 \mug/ml de cada uno de ellos y la respuesta (el área de cada pico cromatográfico) es entre 3 y 4 veces superior para el nitrito.

Tal como se ha comentado previamente, en la presente solicitud se aportan resultados relevantes sobre mejoría en una artrosis experimental como consecuencia de la utilización de inyecciones intraarticulares de Sulfato de Glucosamina (SG) disuelto en muestras de Ácido Hialurónico (AH), por lo que la invención puede considerarse un importante avance en la utilización de la "condroprotección".

El diseño experimental consistió en la producción de "osteoartrosis experimental" (Díaz-Gallego y cols., 2005; Sánchez-Lázaro y cols., 2010) y la inyección intraarticular de agua, ácido hialurónico y/o ácido hialurónico en el que se habían disuelto distintas cantidades de sulfato de glucosamina, determinándose que existía un efecto positivo de aumento en la mejora de parámetros relacionados con dicha patología artrósica en el caso de los animales a los que se les suministró la composición que contenía el agente condroprotector, frente a la aplicación de muestras de ácido hialurónico sin presencia de sulfato de glucosamina.

El desarrollo de artrosis se realizó a lo largo de 2 meses, realizando tres tratamientos semanales sucesivos de Acido Hialurónico sólo y/o Acido Hialurónico + Sulfato de Glucosamina. Dos semanas después de finalizado el tratamiento, se obtuvieron las muestras correspondientes del cóndilo femoral interno y externo y de tibial, para ser sometidas a Citometría por el Test de apoptosis con Anexina V FITC (Isocianato de Fluoresceína) en el que las células apoptóticas serán positivas para Anexina y negativas para IP (Yoduro de Propidio) y las células necróticas o en apoptosis tardía serán positivas para ambos y las células vivas negativas a ambas (Darzynkiewicz y cols.,
2001).

El grado de artrosis en las distintas rodillas a estudio se observó y cuantificó inicialmente a través de un estudio macroscópico del cartílago (Gross Morphology) realizado sobre los cóndilos femorales, la tróclea femoral y la tibia, el estudio fue realizado previo a la realización de la toma del cartílago, de acuerdo al método y graduación realizada por Yoshiaka y cols., 1996. Dicho estudio de "Gross Morphology" fue corroborado después con los estudios de apoptosis/necrosis por citometría, manifestando un menor grado de lesión aquellas articulaciones tratadas con Acido Hialurónico + Sulfato de Glucosamina.

Los resultados obtenidos en los ensayos de citometría, representados gráficamente en la Fig. 1, muestran una clara disminución del porcentaje de células necróticas identificadas en los tejidos cuando se incluye sulfato de glucosamina en la composición de inyección intraarticular, con respecto al ensayo en el que se inyectó ácido hialurónico en ausencia de sulfato de glucosamina o exclusivamente agua. Las células necróticas representan un estadio tardío, irreversible, en el proceso de muerte celular, por lo que su presencia es muestra de un peor pronóstico con respecto al estado del tejido, mientras que su disminución es una muestra clara de mejoría en el estado del tejido. En cuanto a las células apoptóticas, se observa también una disminución en su porcentaje en el caso de la composición en la que el sulfato de glucosamina estaba presente con respecto al tratamiento con ácido hialurónico solo, aunque su disminución no es tan significativa, pues se trata de células que han iniciado el proceso de muerte celular, pero representan un estadio temprano, aún reversible, en este proceso. Las observaciones del estudio macroscópico del cartílago realizado previamente a los estudios de citometría, del cual se muestra un ejemplo en la Fig. 2, fueron coherentes con estos resultados.

Ello demuestra que las composiciones para el tratamiento de la artrosis que presentan, además de ácido hialurónico, un condroprotector como el sulfato de glucosamina (condroprotector que habitualmente se administra por vía oral), presentan una importante aplicación, especialmente en la inyección por vía intraarticular, por mejorar los resultados obtenidos al inyectar ácido hialurónico solo. Por tanto, son especialmente interesantes para los laboratorios farmacéuticos que poseen formulaciones comerciales de ácido hialurónico de pesos moleculares, orígenes y características de viscosuplementación muy variables (Prieto y cols., 2005). Según el caso, la proporción más adecuada de sulfato de glucosamina (u otro condroprotector) en la mezcla puede ser distinta, pudiendo considerarse compatible con la invención cualquier proporción que no supere el límite de solubilidad del condroprotector en ácido hialurónico, siendo recomendables ensayos complementarios para determinar la proporción más conveniente según el caso, aunque puede considerarse que el intervalo de concentraciones apropiadas de sulfato de glucosamina oscila entre 1 y 50 mg/ml, pudiendo estar en el intervalo de 2 a 8 mg/ml.

Es de esperar que el efecto positivo observado al inyectar por vía intraarticular composiciones de ácido hialurónico en las que está presente sulfato de glucosamina se observe igualmente si el sulfato de glucosamina se sustituye por alguno de los otros agentes condroprotectores que se administran habitualmente por vía oral, el condroitín sulfato o la diacereína, por lo que el agente condroprotector presente en la composición para tratamiento de la artrosis por inyección intraarticular puede ser también condroitín sulfato o diacerína. En el caso de ser uno de estos dos el agente condroprotector presente, puede considerarse adecuado un rango equivalente, es decir, que puede considerarse que las concentraciones comprendidas en el intervalo de 1 a 50 mg/ml serían concentraciones adecuadas de estos agentes condroprotectores para las composiciones de la invención y las composiciones para la aplicación terapéutica de las mismas.

La invención se explicará ahora con más detalle mediante los Ejemplos y Figuras que se presentan a continuación.

- Ejemplo 1

En este ejemplo, se indujo artrosis experimental en conejos, se sometió a los mismos a tratamiento con agua, ácido hialurónico solo o con composiciones en las que se habían disuelto distintas cantidades de sulfato de glucosamina en ácido hialurónico, y se analizó el grado de artrosis en ambas rodillas, tanto por observación macroscópica de muestras de tejido como por evaluación del grado de apoptosis y necrosis mediante citometría de las mismas. Los detalles metodológicos del ensayo fueron los siguientes:

La experiencia del grupo de los autores de la invención en inducción de artrosis experimental en conejo se había dirigido previamente en distintas direcciones, con la utilización de inyecciones de LPS, de Vitamina A y por sección del Ligamento Cruzado Anterior, resultando este último método (Modelo Pond-Nuki, 1973) el método más reproducible.

En este estudio experimental se indujo artrosis en conejos blancos de la raza Nueva Zelanda, a los que se realizó la inducción de artrosis de ambas rodillas por aplicación de Vitamina A. Los conejos fueron infiltrados en ambas rodillas con 1 ml de Vitamina A (Roche) y dicha infiltración se repitió tras una semana. Este protocolo es capaz de inducir artrosis tras 2 meses (Lapadula y cols., 1995; Scotto d'Abusco y cols., 2008). Tras ese desarrollo de artrosis, se realiza el tratamiento con AH y/o AH + SG (a las concentraciones de estudio) (0,3 ml/rodilla, en conejos de un peso medio de 3 Kg.) a lo largo de 3 semanas consecutivas, según una distribución aleatorizada previamente desarrollada. Dos semanas después de finalizado el tratamiento, se obtuvieron las muestras correspondientes, tras la eutanasia de los animales con solución para eutanasia T61® (inyección intravenosa, 0,3 ml/kg. de peso).

La inducción de artrosis de ambas rodillas (por aplicación de Vitamina A, según el procedimiento reseñado), ha resultado ser menos eficaz que la sección de LCA ó Modelo Pond-Nuki, 1973, utilizado en anteriores experimentos del grupo (Díaz Gallego y cols., 2005; Sánchez Lázaro y cols., 2010).

Las distintas disoluciones de cantidades diferentes de Sulfato de Glucosamina (SG) (genérico "Glucosamino MABO", polvo para solución oral, suminstrado por Tedec-Meiji Farma S.A.) en muestras comerciales de un Ácido Hialurónico (Adant®, suminstrado por Tedec-Meiji Farma S.A.), fueron preparadas y agitadas suficientemente para garantizar la oportuna homogeneización de las mismas, obteniéndose siempre una muestra no identificable por su aspecto macroscópico ni diferenciable de las muestras de Ácido Hialurónico sin la adición de cantidades distintas de SG. Las cantidades de sulfato de glucosamina incluidas en cada una de las disoluciones preparadas fueron de 2, 4, 6 y 8 mg/ml de SG.

Ello permitió la realización de una administración aleatoria de los tratamientos del agua, AH sólo y/o de las distintas formulaciones de AH + cantidades diferentes de Sulfato de Glucosamina en las rodillas izquierda y/o derecha de los animales de experimentación.

En la fase de tratamiento se realizó la administración intraarticular de 0,3 ml por rodilla de las composiciones descritas en el apartado 1.2. La administración de Ácido Hialurónico (AH) solo y/o ácido hialurónico (AH) + sulfato de glucosamina (SG) fue siguiendo la pauta indicada por el Laboratorio Fabricante, consistente en 1 dosis/semana durante 3 semanas sucesivas y la obtención de las muestras sólo dos semanas después del tratamiento.

Dos semanas después de finalizado el tratamiento, se obtuvieron las muestras correspondientes al cóndilo femoral interno y externo, la tróclea femoral y la tibia. Previamente a la realización de la toma del cartílago, se evaluó el grado de artrosis en los mismos mediante un estudio macroscópico del cartílago (Gross Morphology), de acuerdo al método y graduación descrito por Yoshiaka y cols. (1996), en el que el grado de degradación alcanzado en el desarrollo de artrosis experimental se determina evaluando el grado de lesión en los distintos componentes de la articulación mediante un estudio macroscópico que permite su clasificación en 4 distintas categorías:

Una fotografía de las observaciones realizadas en dicho estudio se muestra en la Fig. 2.

La citometría de flujo es una técnica que permite la valoración cuantitativa de la apoptosis y de la necrosis. Para ello, una biopsia de cartílago es sometida a digestión (Jakob M y cols, 2003; Takahashi T y cols, 2003) y las células individuales obtenidas se someten a citometría de flujo.

El proceso de digestión se realizó en estufa estéril a 37º durante 6 horas en un medio DMEM transparente que contiene hialuronidasa (Sigma H-3884; 0,1 mg/ml) y colagenasa tipo IIS (C-1764; 2 mg/ml) añadiéndose 1 ml por muestra.

Tras la digestión, las células son filtradas con filtro de seda, lavadas con PBS y procesadas posteriormente para su estudio mediante citometría de flujo.

La citometría de flujo es un sistema de medición de ciertas características físicas y químicas de las células o partículas celulares las cuales circulan en suspensión una a una a través de un sensor.

El Citómetro de flujo utilizado en este estudio, propiedad de la Unidad de Investigación del Hospital de León, es el modelo FACSCAN, de la casa Beckton-Dickinson.

Está equipado con un láser de Argón de 15 mW que emite a 488 nm. Puede medir 3 canales de fluorescencia. Está también equipado con un módulo de discriminación que permite el estudio del ciclo celular, y con un ordenador Power Macintosh G4 (Sistema 9.1) y programa específico de análisis CellQuest 3.3.

El método utilizado analiza dos tipos de fluorescencia: la correspondiente a la Anexina V FITC (Isocianato de Fluoresceína), que puede detectar la apoptosis aún en estados más precoces a la exteriorización de la PS, y la del yoduro de Propidio (IP), que se basa en cambios como la fragmentación del ADN y la pérdida de integridad de la membrana plasmática, que posibilita el acceso del IP a dicho ADN.

La Anexina-V es una proteína de 35-36 KDa dependiente del Ca^{++} con alta afinidad por los fosfolípidos, y que, en especial, se une específicamente al fosfolípido fosfatidilserina (PS), el cual se encuentra en la cara interna de la membrana plasmática de los condrocitos y es expuesto en la cara externa de dicha membrana cuando comienza el proceso de apoptosis, tal como se muestra en la Fig. 3. La exposición en la cara externa de la membrana permitirá la unión de la Anexina V. Para la unión de la proteína con el fosfolípido es requerida la presencia de calcio, por lo que es necesaria la preparación de un tampón de unión con calcio donde se mantiene la suspensión celular.

Las células necróticas, por su parte, presentan también PS en la cara exterior de la membrana, pero en ellas ya la integridad de la membrana plasmática está muy comprometida, por lo que el yoduro de propidio podrá acceder al interior de la célula y unirse al ADN, detectándose señal de fluorescencia correspondiente al yoduro de propidio.

Las células apoptóticas serán positivas para Anexina y negativas para IP, las células necróticas o en apoptosis tardía serán positivas para ambos y las células vivas negativas a ambas (Darzynkiewicz Z y cols., 2001). La Anexina tiene gran afinidad por la fosfatidilserina, más que el IP, por lo que se fija en estadios más precoces (Asada y cols., 1999; Takahashi y cols., 2000; Asada y cols., 2001; Darzynkiewicz y cols., 2001; Kim, 2002; Matsushita y cols., 2004; Chen y cols., 2005).

La preparación de las células para el estudio de citometría descrito precisa la siguiente metodología:

Antes de empezar a procesar las muestras se procedió a calibrar el citómetro para el correcto estudio de la muestra. Para ello se utilizaron diversas muestras celulares en diversos estadios conocidos de apoptosis y necrosis. Se realizó la calibración del citómetro según los parámetros establecidos por el fabricante con el kit facilitado a tal efecto, (Color Lyse/Wash FACSComp, BD Bioscience) y el software propio (FACSComp 4.1, BD Bioscience).

Se comprobó la funcionalidad del método con anexina recombinante, consistente en la preincubación de las células con anexina V recombinante (Cat Nº 51-65871ª DB Sciencies), determinando la especificidad de la Anexina V-FITC según recomienda el fabricante (BD Pharmingen Data Sheet). Los resultados obtenidos se muestran en el panel A de la Fig. 4. Como se puede ver en la parte derecha de la Fig. 4, los eventos citométricos se aglutinan en la zona de fluorescencia de la anexina en el eje de ordenadas (región en el círculo); esto sirve para determinar las zonas donde se encontrarán los condrocitos.

Una vez calibrado el citómetro el siguiente paso fue calcular por autoinmunofluorescencia en una muestra de cartílago obtenida de conejos sin y con patología. El proceso puede observarse en el panel B de la Fig. 4. El cuadrante que sirve como referencia (cero o background) para calcular la positividad de Anexina V y Ioduro de Propidio es el cuadrante inferior izquierdo, que es donde se deben encontrar las células vivas, es decir que no captan ni anexina ni ioduro de propidio. En los cuadrantes UR (Upper Right) y LR (Lower Right) prácticamente no hay eventos, ya que estos son los correspondientes a las tinciones de anexina (LR) y de ioduro de propidio y anexina
(UR).

Posteriormente se calculó la región útil de eventos citométricos enfrentando el tamaño (F-SCH) frente a la complejidad (S-SCH) celular. De esta manera se diferencian los eventos citométricos en función de estas dos cualidades. Tal como se puede observar en el panel C de la Fig. 4, se seleccionó una región de eventos grandes y complejos, eliminando así detritus celulares de baja complejidad y tamaño.

Una vez hemos delimitado dónde se encontrarán los condrocitos sanos en la gráfica del citómetro, tanto cuando se estudian en función de su tamaño o complejidad como cuando se estudia su fluorescencia, se estudió la fluorescencia de la región donde se encuentran los condrocitos (R1), y sobre esta zona se aplicó el estudio de la fluorescencia, determinando el porcentaje de células apoptóticas (si sólo captan anexina), necróticas (si captan anexina y ioduro de propidio) o vivas (si no captan ninguno de los dos).

El análisis de las muestras permitió obtener el gráfico de porcentaje de necrosis y/o apoptosis que se presenta en la Fig. 1.

Como puede verse, existe clara evidencia el efecto protector en la necrosis y/o apoptosis de condrocitos por la administración intraarticular de AH+ SG frente a AH solo o de agua.

- Ejemplo 2

Los estudios de "Gross Morphology" y de "Apoptosis/Necrosis" que han servido de base para el planteamiento de la presente invención, se complementan con:

Los trozos de cartílago de los cóndilos femorales de todas las rodillas, obtenidos para los estudios de apoptosis por citometría y digeridos durante 6 horas a 37ºC en un medio DMEM transparente que contenía hialuronidasa y colagenasa tipo II (añadiéndose 1 ml por muestra), tras la digestión fueron lavados con DMEM y PBS y centrifugados 5 minutos a 3000 rpm. En ese primer sobrenadante a obtener en la preparación de muestras para el estudio en el citómetro, se determina el óxido nítrico mediante HPLC (Archer, 1993; Everett y cols., 1995; Jobgen y cols., 2006; Tsikas y cols., 2006).

Las condiciones cromatográficas utilizadas se determinan siguiendo resultados de estudios previos: IC-Pak^{TM} Anión HC (4,6x150 mm) Column Waters (WAT 026770); 230 nm; fase móvil "Lithium borate/gluconate eluent" (34 g ácido bórico + 23,5 ml ácido d-glucónico + 8,6 g hidróxido de litio monohidrato), con un flujo de 1,2 ml/min, con tiempos de retención (Tr) de 3,00\pm0,3 minutos para el nitrito y 4,20\pm0,5 min para el nitrato. La Fig. 5 muestra un ejemplo de cromatograma obtenido mediante HPLC de una mezcla de nitrato y nitrito.

Con la construcción de una "Recta de Calibración" para concentraciones crecientes de 1,0 a 100 \mug/ml de nitrato y nitrito (Sigma-Aldrich) se obtiene una relación lineal, que luego permitirá calcular las concentraciones presentes en las distintas muestras.

Se realiza la toma de muestra de líquido sinovial en todas las rodillas en que sea posible para cuantificación de ácido hialurónico por HPLC.

La concentración y el peso molecular (M_{w}) del Acido Hialurónico (AH) de dichas muestras se determina usando Cromatografía de Exclusión siguiendo inicialmente lo indicado en la Bibliografía (Tulamo y cols., 1996; Coleman y cols., 1997 y 1999; Díaz Gállego y cols., 2005).

Para la cromatografía de exclusión se emplea una columna del tipo TSK-G6000 PW_{XL} con una resolución entre 0,04 y 8 x 10^{6} Da, lo cual requiere la construcción de una curva de calibración entre 0,1 y 1,0 mg/ml de Hialuronato sódico procedente de cresta de gallo (Sigma H-5388) y una Curva de calibración de pesos moleculares entre 0,9x10^{6} y 3x10^{6} Da (con la utilización de distintos Hialuronatos sódicos).

La determinación del Peso Molecular se realiza utilizando una técnica de HPLC puesta a punto con el empleo de una columna de exclusión molecular que permite determinar el T_{R} (Tiempo de retención cromatográfica) característico para muestras de Hialuronato sódico de distintos y conocidos pesos moleculares, (Saari y cols., 1989; Tulamo, 1991; Tulamo y cols., 1994, 1996; Coleman y cols., 1997, 1999).

Para ello se usan Hialuronatos Sódicos (suministrados por Lifecore Biomedical, Chaska, MN, USA) de distintos pesos moleculares:

Se utiliza una Columna Cromatográfica de Exclusión molecular (TSK-G6000 PW_{XL}), como fase móvil se emplea tampón de fosfatos 50 mM (ajustando a pH = 5,5), a 0,8 ml/min, temperatura de 40ºC y detector de luz UV ajustado a 200 nm.

Los correspondientes Tiempos de Retención (T_{R}) obtenidos son sometidos al ajuste de una regresión lineal realizado en Microsoft-EXCEL de dichos T_{R} y el logaritmo neperiano del peso molecular del Hialuronato sódico utilizado.

La concentración del Acido Hialurónico (AH) en las distintas muestras de líquido sinovial (obtenido tras esa inyección inicial de 500 \mul de salino), se determina usando Cromatografía de Exclusión, siguiendo lo indicado por Coleman y cols., (1997), con la construcción de una "Recta de Calibración" para concentraciones de ácido hialurónico a partir de Hialuronato sódico de cresta de gallo (Sigma). La relación es (según estudios previos) lineal en el rango de 0,1 a 1,0 mg/ml.

Con la ayuda de dicha "Recta de Calibración", se calcula la concentración de AH existente en las distintas muestras de líquido sinovial estudiadas.