ES2349691T3 - PROCEDIMIENTO PARA DETECTAR O MONITORIZAR LA SEPTICEMIA ANALIZANDO NIVELES DE EXPRESIÓN DE ARNm DE CITOCINAS. - Google Patents
PROCEDIMIENTO PARA DETECTAR O MONITORIZAR LA SEPTICEMIA ANALIZANDO NIVELES DE EXPRESIÓN DE ARNm DE CITOCINAS. Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento para predecir una respuesta en pacientes humanos a una infección, comprendiendo el procedimiento determinar un valor de ARNm de IL-23 en una muestra del paciente, y correlacionar el valor con una probabilidad de que el paciente desarrolle septicemia en respuesta a la infección, en el que un valor de ARNm de IL-23 bajo se correlaciona con una probabilidad de que el paciente desarrolle septicemia en respuesta a la infección, y un valor de ARNm de IL-23 alto se correlaciona con una probabilidad de que el paciente no desarrolle septicemia en respuesta a la infección.
Description
Procedimiento para detectar o monitorizar la
septicemia analizando niveles de expresión de ARNm de citocinas.
La infección masiva con insuficiencia
multiorgánica resultante, que se ha denominado "síndrome
septicémico" [1], es una enfermedad devastadora, y es un
diagnóstico de admisión común en la Unidad de Cuidados Intensivos
(UCI), con una incidencia de 3 por 1000 en la población al año [2].
El síndrome septicémico se ha caracterizado como una desregulación
de la inflamación en respuesta a la infección, con insuficiencia
orgánica potencialmente mortal que puede atribuirse a una
combinación de excesiva inflamación mediada por citocinas,
coagulopatía diseminada y alteración de la integridad del endotelio
microvascular [3].
De particular importancia para la respuesta del
huésped a un patógeno invasor es la inducción de diferentes
elementos de la población de células T cooperadoras CD4^{+}. La
respuesta de citocinas distales a la infección se regula
principalmente mediante la población de células T CD4^{+}
inducidas, que a su vez se determina mediante la interacción
antagonista de las citocinas interleucina 12 (IL-12)
e interleucina 4 (IL-4). Estas citocinas inducen
que las células T CD4^{+} vírgenes se diferencien fenotípicamente
en células T cooperadoras 1 (Th1) o Th2 respectivamente [4, 5]. La
interleucina-6 (IL-6) también
desempeña un papel en la diferenciación de Th1/Th2 promoviendo la
diferenciación de Th2 principalmente induciendo la producción de
IL-4, mientras que inhibe la diferenciación de Th1
mediante un mecanismo independiente de IL-4 [6].
La respuesta celular Th1 generalmente se induce
mediante, y particularmente es eficaz frente a, patógenos
intracelulares y aquellos que activan macrófagos y células
citolíticas naturales (NK). Una respuesta Th1 está asociada con
inmunidad mediada por células potenciada y es por tanto la respuesta
apropiada esperada frente a los ataques septicémicos más comunes.
Los linfocitos que demuestran un patrón de respuesta Th1 producen
de manera característica interferón-gamma
(IFN\gamma), una citocina pleiotrópica que funciona principalmente
en la optimización de la actividad bactericida de los
fagocitos.
Por el contrario, las respuestas sesgadas hacia
Th2 son responsables clásicamente de la defensa frente a infecciones
helmínticas y por artrópodos y son un componente esencial de las
reacciones de tipo alérgico. Las células Th2 maduras secretan
preferentemente varias citocinas, incluyendo interleucina 10
(IL-10). Sin embargo, los anticuerpos estimulados
mediante esta respuesta no promueven la fagocitosis ni activan el
complemento de manera eficaz.
El documento WO 2004/108957 da a conocer un
procedimiento para el diagnóstico y/o pronóstico de un síndrome
septicémico en un paciente humano determinando los niveles de ARNm
respectivos para una pluralidad de marcadores biológicos de
citocinas, entre ellos TGF-alfa,
IL-10, TGF-beta,
IL-1beta, en una muestra de sangre periférica de un
paciente humano.
Existe una necesidad de determinar más
claramente la respuesta celular a una infección y los factores que
afectan a la respuesta.
Según la invención, se proporciona un
procedimiento para predecir una respuesta en pacientes humanos a una
infección, comprendiendo el procedimiento determinar un valor de
ARNm de IL-23 en una muestra del paciente, y
correlacionar el valor con una probabilidad de que el paciente
desarrolle septicemia en respuesta a la infección, en el que un
valor de ARNm de IL-23 bajo se correlaciona con una
probabilidad de que el paciente desarrolle septicemia en respuesta
a la infección, y un valor de ARNm de IL-23 alto se
correlaciona con una probabilidad de que el paciente no desarrolle
septicemia en respuesta a la infección.
De manera adecuada, la muestra son células
mononucleares de sangre periférica, en la que un valor de ARNm de
IL-23 bajo se correlaciona con menos de 1824 copias
de ARNm de IL-23 por 10 millones de copias de
\beta-actina, y un valor de ARNm de
IL-23 alto se correlaciona con 1824 o más copias de
IL-23 por 10 millones de copias de
beta-actina.
En un aspecto, la invención incluye una etapa de
predecir además el desenlace de la septicemia en un paciente,
comprendiendo el procedimiento las etapas de determinar una razón de
los valores de ARNm de IL-27:IL-23
en una muestra del paciente, en el que una razón mayor de 1,45 se
correlaciona con muerte y una razón menor de 1,45 se correlaciona
con supervivencia.
Normalmente, la etapa de predecir el desenlace
incluye además determinar una razón de los valores de ARNm de
IL-10:IFN-\gamma en una muestra
del paciente, en la que una razón mayor de 2,85 se correlaciona con
muerte y una razón menor de 2,85 se correlaciona con
supervivencia.
De manera adecuada, el procedimiento de predecir
el desenlace comprende un sistema de puntuación en el que se asigna
a un paciente una puntuación de 1 ó 0 dependiendo de si la razón de
los valores de ARNm de IL-27:IL-23
está por encima o por debajo de 1,45, respectivamente, y una
puntuación de 1 ó 0 dependiendo de si la razón de los valores de
ARNm de IL-10:IFN-\gamma está por
encima o por debajo de 2,85, respectivamente, en el que una suma de
2 se correlaciona con alto riesgo de mortalidad debida a septicemia,
una suma de 0 se correlaciona con un bajo riesgo de mortalidad
debida a septicemia y 1 se correlaciona con un riesgo intermedio de
muerte debida a septicemia.
En otro aspecto, la invención proporciona un
procedimiento para estratificar un paciente en un grupo con
septicemia/sin septicemia, comprendiendo el procedimiento las
etapas de determinar una razón de los valores de ARNm de
IL-27:IL-23 en una muestra del
paciente, en el que una razón mayor de 1,45 se correlaciona con el
grupo con septicemia, y una razón menor de 1,45 se correlaciona con
el grupo sin septicemia.
En los procedimientos de la invención, los
valores de ARNm de IL-27, IL-23,
IL-10 e IFN-\gamma se representan
de manera adecuada mediante los números de copias de ARNm de
IL-27, IL-23, IL-10
e IFN-\gamma, respectivamente, y en los que los
números de copias se normalizan frente a un gen de mantenimiento. En
una realización, el gen de mantenimiento es
\beta-actina.
En una forma de realización preferida de la
invención, las muestras del paciente humano son células
mononucleares de una muestra de sangre periférica, o glóbulos
blancos aislados de la capa leucocitaria de una muestra de sangre
periférica.
En el procedimiento de la invención,
preferiblemente se amplifica el ADN para IL-27,
IL-23, IL-10 e
IFN-\gamma y se cuantifica como un sustituto para
el número de copias de ARNm de IL-27,
IL-23, IL-10 e
IFN-\gamma, respectiva-
mente.
mente.
Normalmente, se mide el número de copias de ARNm
de IL-27, IL-23,
IL-10 e IFN-\gamma en términos
absolutos haciendo referencia a una curva de calibración construida
a partir de muestra patrón de DIVA y normalizada con respecto a un
gen de mantenimiento.
El ensayo de la presente invención puede
utilizarse en el diseño de estudios farmacéuticos de pacientes con
infección y/o septicemia, con el fin de estratificar los pacientes
según la gravedad de la enfermedad, predecir el desenlace más
probable y utilizar esta información en el diseño del estudio y el
análisis posterior.
La predicción de la probabilidad de desarrollar
septicemia grave, o choque septicémico o enfermedad crítica en
respuesta a la infección, puede basarse en un análisis de regresión
logística del ARNm de citocinas, con una estratificación del riesgo
basada en las probabilidades relativas de desarrollar y no
desarrollar enfermedad crítica (o septicemia, o septicemia grave o
choque septicémico) en respuesta a la infección.
El riesgo de choque septicémico persistente
frente al riesgo de resolución del choque septicémico puede basarse
en un análisis de conglomerados.
Pueden utilizarse los niveles de ARNm para las
citocinas enumeradas en la presente invención y/o las razones entre
los diversos niveles de ARNm de citocinas, tal como se miden
mediante PCR en tiempo real y se normalizan frente a un gen de
mantenimiento y se calibran además frente a una curva de referencia
derivada de un patrón de PCR de citocinas, distinto de los ya
mencionados, en la predicción del desenlace en respuesta a la
infección y el desenlace en pacientes con septicemia.
La capacidad de precisión y/o predicción de esta
invención puede mejorarse adicionalmente mediante el aislamiento de
subgrupos específicos de glóbulos blancos de muestras de sangre
periférica y la utilización de estos subgrupos de células en
ensayos de PCR en tiempo real. Estos grupos de células incluyen
aislados purificados de células mononucleares de sangre periférica,
células T CD4^{+}, células citolíticas naturales y células T
citolíticas
naturales.
naturales.
La invención se entenderá más claramente a
partir de la siguiente descripción de dos formas de realización de
la misma, proporcionada a título de ejemplo haciendo referencia sólo
a los dibujos adjuntos en los que:
la figura 1 es un gráfica que muestra los
resultados del ajuste logístico para un grupo de pacientes frente
al riesgo relativo. Los pacientes que es probable que desarrollen
septicemia se indican mediante el punto a la izquierda de la curva
mientras que aquellos que no es probable que desarrollen septicemia
se muestran mediante el asterisco a la derecha de la curva (el
apéndice 1 y 2 proporcionan el análisis estadístico);
la figura 2 es un diagrama que muestra que el
riesgo de desarrollar septicemia en respuesta a la infección
aumenta desde el 16% hasta el 100% a medida que la puntuación
empírica aumenta desde 0 hasta 3;
la figura 3 es un diagrama que muestra la
caracterización de los niveles de ARNm de
interleucina-10 como altos o bajos en casos con
septicemia y sin septicemia (el apéndice 3 proporciona el análisis
estadístico);
la figura 4 es un gráfico que muestra los
límites de corte para caracterizar interleucina-10
como alta o baja (el apéndice 4 proporciona el análisis
estadístico);
la figura 5 es un gráfico que muestra los
límites de corte para caracterizar los niveles de ARNm de interferón
gamma como altos y bajos (el apéndice 5 proporciona el análisis
estadístico);
la figura 6 es un diagrama que muestra la
caracterización de los niveles de ARNm de interferón gamma como
altos o bajos en casos con septicemia y sin septicemia (el apéndice
6 proporciona el análisis estadístico);
la figura 7 es un gráfico que muestra el
análisis de una vía del ARNm de IL-23 en casos con
septicemia y sin septicemia (el apéndice 7 proporciona el análisis
estadístico);
la figura 8 es un gráfico de mosaico del
análisis de contingencia de IL-23 baja frente a alta
por con septicemia y sin septicemia (el apéndice 8 proporciona el
análisis estadístico);
la figura 9 es un gráfico que muestra el
análisis de una vía del ARNm de IL-23 por
IL-23 baja frente a alta (el apéndice 9 proporciona
el análisis estadístico);
la figura 10 es un gráfico que muestra el
análisis del ARNm de IL-27 por grupo (el apéndice 10
proporciona el análisis estadístico);
la figura 11 es un gráfico que muestra el
análisis del ARNm de IL-27 por IL-27
baja frente alta (el apéndice 11 proporciona el análisis
estadístico);
la figura 12 es un gráfico de mosaico del
análisis de contingencia de IL-27 baja frente a alta
por con septicemia y sin septicemia (el apéndice 12 proporciona el
análisis estadístico)
la figura 13 es un gráfico de mosaico del
análisis de contingencia de la puntuación por con septicemia frente
a sin septicemia (el apéndice 13 proporciona el análisis
estadístico);
la figura 14 es un gráfico de mosaico del
análisis de contingencia de la puntuación de IL-10,
23 e interferón gamma por con septicemia frente a sin septicemia
(el apéndice 14 proporciona el análisis estadístico);
la figura 15 es un gráfico que muestra el
análisis de la razón de IL-10 con respecto a
interferón gamma basado en el desenlace de los pacientes (el
apéndice 15 proporciona el análisis estadístico);
la figura 16 es un gráfico que muestra el
análisis de la razón de IL-27 con respecto a
IL-23 basado en el desenlace de los pacientes (el
apéndice 16 proporciona el análisis estadístico);
la figura 17 es un gráfico de mosaico del
desenlace del análisis de contingencia por riesgo de mortalidad (el
apéndice 17 proporciona el análisis estadístico);
la figura 18 es un gráfico que muestra el patrón
temporal de supervivencia en pacientes con septicemia (el apéndice
18 proporciona el análisis estadístico);
la figura 19 es un diagrama que muestra el
análisis del desenlace por riesgo de mortalidad (el apéndice 19
proporciona el análisis estadístico);
la figura 20 es un gráfico que muestra el patrón
temporal de supervivencia en pacientes con septicemia (el apéndice
20 proporciona el análisis estadístico);
la figura 21 es un diagrama que muestra el mapa
de restricción y el sitio de clonación múltiple para el vector
pDNR-LIB;
la figura 22 es un diagrama del MCS, el sitio de
clonación múltiple de la figura 21. Se sustituye el fragmento de
relleno por el inserto de ADNc de IL-27. Se muestran
los sitios de restricción únicos en negrita o en gris;
la figura 23a muestra un gel de ARN con marcador
de tamaño molecular de 1 kb y el plásmido obtenido tras la
minipreparación; y
la figura 23b muestra un gel de ARN con marcador
de tamaño molecular de 1 kb y la preparación del plásmido
digerido.
\vskip1.000000\baselineskip
Utilizando la reacción en cadena de la
polimerasa en tiempo real cuantitativa (QRT-PCR), se
ha encontrado un patrón de expresión génica de citocinas asociado
tanto con septicemia grave como con infección en ausencia de
enfermedad crítica. También se ha podido determinar si hubo un
patrón de respuesta de citocinas característico ligado a la
aparición y resolución del choque septicémico.
\newpage
Se encontró que la respuesta del paciente a la
infección estaba asociada con distintos patrones de producción de
ARNm de citocinas. Mientras que el ARNm de interferón gamma
(IFN\gamma), la citocina distintiva para la respuesta Th1, era
mayor en pacientes que toleraron la infección con relativa
impunidad, estaban asociados menores niveles de ARNm de IFN\gamma
tanto con la aparición de septicemia grave en respuesta a la
infección como también con un mal desenlace, es decir, mortalidad
en exceso y persistencia del choque septicémico, en estos pacientes
de UCI. Por tanto, pueden utilizarse los niveles de ARNm de
IFN\gamma para predecir la aparición de septicemia, o la no
aparición de septicemia, en respuesta a la infección. También pueden
utilizarse los niveles de ARNm de IFN\gamma para predecir el
desenlace en pacientes que desarrollan septicemia, puesto que
menores niveles de ARNm de IFN\gamma se relacionan con tasas de
mortalidad en exceso y choque persistente.
Por el contrario, se vincularon mayores niveles
de ARNm de IL-10 con la aparición de septicemia
grave en respuesta a la infección. Puesto que IL-10
es una citocina Th2, esto indica que puede vincularse la aparición
de septicemia grave con un desequilibrio en la producción de
citocinas secundaria a la infección, con una respuesta Th1
dominante que proporciona la defensa óptima frente a la
infección.
La maduración de células T CD4^{+} vírgenes en
el fenotipo Th1 o Th2 apropiado es esencial para lanzar una
respuesta eficaz del huésped a una infección bacteriana. Por tanto,
es plausible que la variación interindividual en la expresión
génica de las citocinas que inducen Th1, IL-12 e
IFN\gamma, las citocinas que inducen Th2, IL-10 e
IL-6, y la citocina proinflamatoria prototípica,
TNF\alpha, puede vincularse tanto a la presentación clínica como
al desenlace posterior de los pacientes con infecciones.
Los niveles de ARNm de IL-12 no
estaban relacionados con la aparición de septicemia grave, o con el
desenlace en estos pacientes de UCI. Esto es algo sorprendente que
cuando se considera la importancia de IL-12 en la
diferenciación de células T. La IL-12 se secreta
predominantemente mediante células presentadoras de antígeno y
actúa en células CD4^{+} vírgenes, a través del factor de
transcripción STAT 4, para promover la diferenciación en una célula
tipo, productora de IFN\gamma, Th1 [7]. En modelos animales este
efecto es bastante marcado, presentando ratones deficientes en STAT
4 un déficit en el aclaramiento bacteriano, que se revierte
parcialmente con IFN\gamma exógeno [8]. Curiosamente, la
respuesta inmunitaria alterada observada en este modelo con
deficiencia en STAT 4 parece ser cualitativa en vez de cuantitativa,
puesto que los ratones pueden montar una respuesta leucocitaria
adecuada a la infección, pero con un aclaramiento bacteriano
inadecuado.
Además, la terapia con IL-12
aumenta la supervivencia en modelos animales de septicemia [9]. Se
ha observado un fenómeno similar en seres humanos con septicemia,
con menor producción de IL-12, específicamente en
respuesta a endotoxinas, predictivo de muerte por septicemia grave
tras cirugía mayor.
Sin embargo, sorprendentemente, se encontró una
falta de variabilidad en los niveles de IL-12 entre
los grupos indicando que, dentro de la cascada de citocinas, la
base para una respuesta Th1 inadecuada se encuentra en alguna parte
entre IL-12 e IFN\gamma. Sin embargo, a partir de
los datos proporcionados más adelante, el ARNm de
IL-12 puede demostrar ser un marcador útil en la
distinción de la respuesta del paciente a la infección en grupos de
pacientes más grandes, puesto que el ARNm de IL-12
era mayor en pacientes con infección que no desarrollaron
septicemia que en pacientes que desarrollaron septicemia en
respuesta a la infección.
Aunque el grupo de UCI presentó niveles de ARNm
de TNF\alpha elevados en comparación con los controles, estos
niveles fueron menores que el observado en el grupo bacteriémico. La
respuesta de TNF\alpha exagerada observada en los pacientes con
infección, a diferencia de los voluntarios control, puede
representar una respuesta apropiada y protectora. Este concepto de
que las citocinas proinflamatorias son beneficiosas para pacientes
con infección, puede en parte explicar el desenlace adverso
observado en estudios anteriores de los antagonistas de TNF\alpha
en pacientes con choque septicémico [10]. Los patrones discordantes
de la producción de ARNm de TNF\alpha e IFN\gamma observados
entre los grupos de UCI y bacteriémicos pueden explicarse por los
diferentes orígenes celulares de estas citocinas. Se produce
TNF\alpha mediante una gran variedad de tipos de células,
principalmente macrófagos, mientras que se produce IFN\gamma
principalmente mediante células Th1 y células NK. Alternativamente,
es plausible que la reducción en la producción de IFN\gamma pueda
ser una consecuencia directa del aumento de los niveles de
IL-6 observado en estos pacientes, puesto que la
IL-6 es un inhibidor reconocido de la
diferenciación Th1 [6].
Recientemente, se ha utilizado
QRT-PCR para estudiar la expresión génica de
citocinas en el choque septicémico en un estudio en seres humanos
[11, 12]. Se afirmó que la expresión de los genes de MHC de clase II
se regulaba por disminución en pacientes con septicemia y que los
no supervivientes del choque septicémico presentaban mayores
razones de expresión génica de
IL-10:IL-1. El estudio se centró en
el desenlace de pacientes con choque septicémico, y no examinó la
relación entre el ARNm de IL-10 y la aparición de
septicemia en respuesta a la infección. Además, este estudio no
cuantificó ni analizó los niveles de ARNm de IFN\gamma. Se han
cuantificado los niveles de ADNc como un sustituto para el ARNm
específico mediante QRT-PCR proporcionando de ese
modo datos para los niveles de ARNm en una muestra dada.
Se encontró un aumento en los niveles de ARNm de
IL-10 en pacientes septicémicos en comparación con
los controles. Sin embargo, se encontró que los pacientes que son
tolerantes a la infección no producen ARNm de IL-10
en exceso. Sin embargo, en contraposición a estudios anteriores, no
pudo observarse un vínculo entre el aumento en la mortalidad y los
niveles de ARNm en exceso [11]. Puesto que los niveles de ARNm de
IL-10 son mayores en pacientes que desarrollan
septicemia en respuesta a la infección, y puesto que los niveles de
ARNm de IL-10 no aumentan en pacientes con
infección, entonces pueden utilizarse los niveles de ARNm de
IL-10 para predecir la respuesta a la infección en
cuanto a la aparición o la no aparición de septicemia en respuesta a
la infección. Además, puede utilizarse una combinación de niveles
de IFN\gamma e IL-10 para predecir de manera
precisa la aparición o la no concurrencia de septicemia en
respuesta a la infección. Además, en pacientes con infección y con
niveles de ARNm de IL-10 elevados, entonces en estos
pacientes estaría indicada la administración terapéutica de una
medicación antagonista de IL-10 para la prevención
de la posterior aparición de septicemia.
Se encontró que estaban asociados mayores
niveles de IL-6 con menores niveles de ARNm de
TNF\alpha e IFN\gamma en un grupo de pacientes con mal
desenlace. La IL-6 es una citocina Th2; activa la
respuesta de fase aguda y controla el cambio de subclases de
inmunoglobulinas. A pesar de estas acciones proinflamatorias, la
IL-6 puede no poseer actividad bactericida
significativa, tal como se observó con ratones deficientes en
IL-6 que no experimentaron mortalidad en exceso en
modelos animales de peritonitis [13]. A pesar de todo, la producción
de IL-6 indudablemente es de importancia en
pacientes con septicemia, puesto que altos niveles de
IL-6 son predictivos de mortalidad en exceso, con
determinados haplotipos de IL-6 vinculados a una
mayor producción de IL-6 y una mayor gravedad de la
insuficiencia orgánica en pacientes con septicemia grave [14].
Sin embargo, la IL-6 también
actúa modulando el equilibrio entre la respuesta Th1 y Th2 a la
infección, promoviendo la respuesta Th2 a través de mecanismos
tanto dependientes como independientes de IL-4, e
inhibiendo la respuesta Th1 [6]. Puesto que IFN\gamma es la
citocina Th1 prototípica, con un papel central en la generación de
actividad bactericida mediada por células, la IL-6
realmente puede alterar la actividad bactericida fagocítica
inhibiendo la producción de IFN\gamma. Este fenómeno particular
es evidente específicamente en el contexto de la enfermedad
micobacteriana en la que se ha demostrado que IL-6
inhibe la producción de IFN-\gamma y la actividad
bactericida asociada [15]. Además, este fenómeno puede representar
la base para la vinculación de mayores niveles de proteína
IL-6 con menores niveles de ARNm de TNF\alpha e
IFN\gamma observados en los pacientes con choque persistente y
mayor mortalidad.
Por tanto, la IL-6 puede generar
inflamación en exceso mientras que altera simultáneamente la
actividad bactericida. Por tanto, una intervención terapéutica en
pacientes con septicemia, septicemia grave y o choque septicémico,
que se dirija a antagonizar los efectos de la interleucina 6, parece
indicada en cualquier población general de pacientes con
septicemia, septicemia grave o choque septicémico, pero estaría
específicamente indicada en cualquier subgrupo de estos pacientes
con menor expresión génica de IFN\gamma tal como se somete a
ensayo mediante los niveles de ARNm y se especifica en esta
invención.
La interleucina 12 es de particular interés en
la elaboración de una respuesta inflamatoria mediada por citocinas
a la septicemia, puesto que esta citocina regula la producción de
interferón gama mediante células de los sistemas inmunitarios tanto
innato como adaptativo, y experimentos de deleción del gen de
IL-12 indican que la IL-12 presenta
un papel importante en el aclaramiento de bacterias patógenas.
Además, la IL-12 es un heterodímero, que comparte
una subunidad p40 común con una familia de las interleucinas 18, 23
y 27, que también participan en la mediación por citocinas de la
respuesta inmunitaria a la septicemia.
La IL-18 actúa como un cofactor,
conjuntamente con IL-12, para inducir el desarrollo
Th1. Mientras que no es esencial para la diferenciación Th1, la
IL-18 optimiza la producción de IFN\gamma,
presentando un papel sinérgico en presencia de
IL-12. Sin embargo, el papel preciso de la
IL-18 en la septicemia humana sigue siendo poco
claro puesto que también puede actuar como citocina de polarización
Th2 en determinadas circunstancias. El descubrimiento de que los
ratones deficientes en IL-18/IL-12
conservaban la capacidad de producir células Th1 indicó rutas
alternativas de desarrollo Th1. Esto anunció el descubrimiento de la
IL-23, un heterodímero de la subunidad p40 de
IL-12 y una subunidad p19, que funciona de manera
similar a IL-12 e induce la actividad de
IFN\gamma. Sin embargo, a diferencia de IL-12, que
actúa principalmente en células T vírgenes, la IL-23
induce la proliferación de células T de memoria y por tanto
promueve la inflamación en estadio final. La IL-27
es una citocina relacionada estructuralmente con la familia de
IL-12, a la que se atribuyó originalmente
propiedades proinflamatorias con actividad inductora de Th1.
Finalmente, algunos miembros de esta familia de citocinas son
pleiotrópicos, actuando la IL-23 e
IL-27 respectivamente para aumentar o reprimir la
producción de citocinas por células CD4 con un fenotipo Th17.
Se planteó la hipótesis de que las alteraciones
en reguladores de interferón gamma distintos de
IL-12 pueden demostrar ser importantes en la
respuesta humana a la infección. En la presente memoria se demuestra
que la aparición de septicemia y el desenlace de la septicemia
estaban vinculados con distintos patrones de producción de ARNm
para IL-23 e IL-27.
Existen implicaciones terapéuticas obvias para
la hipótesis de que tanto la septicemia grave como el choque
septicémico tardío están relacionados con una deficiencia de
citocinas proinflamatorias relativa. IFN\gamma e
IL-12 están comercialmente disponibles y pueden ser
de beneficio para pacientes que desarrollan septicemia grave en
respuesta a un ataque infeccioso. Los beneficios pueden ser más
obvios en aquellos pacientes que desarrollan choque persistente a
partir de infección grave, particularmente si está disponible
insuficiencia documentada en la expresión génica de IFN\gamma.
Muchas series de casos documentan la utilización beneficiosa de
IFN\gamma exógeno en leishmaniasis, lepra y tuberculosis
resistente a múltiples fármacos. La utilización terapéutica de
IFN\gamma en pacientes con septicemia se ha notificado de manera
menos extensa. Dos estudios, uno que recluta pacientes consecutivos
tras lesión traumática y otro que recluta pacientes tras lesión
térmica no pudieron demostrar ningún beneficio de supervivencia de
la terapia con IFN\gamma subcutáneo [16, 17]. Sin embargo, una
serie de casos de pacientes con septicemia grave acoplada con
supresión de monocitos documentada parecía beneficiarse del
IFN\gamma subcutáneo diario [18]. De manera similar, pacientes con
traumatismos con receptividad inmunitaria disminuida, que se midió
según el estado del receptor de MHC de clase II de monocitos, era
menos probable que desarrollaran neumonía hospitalaria cuando se
trataron con IFN\gamma inhalado [19].
Tal como puede observarse a partir de esta breve
revisión de la bibliografía, los resultados de ensayos en los que
se utilizó interferón gamma como terapia en pacientes con septicemia
son mixtos. Esto puede basarse en la diferencia entre individuos en
la expresión génica de interferón gamma tal como se documenta en
este manuscrito, con mortalidad en exceso observada en pacientes
septicémicos con expresión génica de interferón gamma deficiente.
Puesto que la administración exógena de interferón gama es poco
probable que presente algún efecto terapéutico en pacientes
septicémicos con expresión génica de interferón gamma apropiada, un
ensayo, tal como se documenta en este manuscrito, que mida el grado
de expresión génica de interferón gamma, puede indicar subgrupos de
pacientes con septicemia que es más probable que se beneficien de la
administración exógena de interferón gamma en un régimen
terapéutico.
En la presente invención, se utiliza la
sensibilidad de la QRT-PCR como procedimiento para
evaluar la expresión génica de citocinas. El ensayo de ARNm basado
en QRT-PCR de la invención proporciona información
in vivo única, que puede utilizarse como índice de la
adecuación de la respuesta de citocinas a la infección, y puede
utilizarse para predecir el desenlace en la respuesta a la
infección. Además, puede utilizarse la cuantificación de la
expresión génica de citocinas específicas midiendo el ARNm mediante
la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real como
indicación del antagonismo terapéutico de IL-6 e
IL-10, y la administración de IFN\gamma exógeno
en una intervención terapéutica.
Se ha encontrado que la medición del ARNm
mediante QRT-PCR en pacientes con infección es una
herramienta de diagnóstico muy útil. Se encontró una asociación
marcada entre el patrón de la expresión génica de citocinas y la
aparición de septicemia grave, choque persistente y supervivencia.
Estos resultados plantean la fascinante posibilidad de tratar
pacientes con choque persistente e inhibición documentada de la
expresión génica de IFN\gamma con IFN\gamma exógeno. De manera
similar, pacientes con septicemia y ARNm de IL-6 y/o
IL-10 en exceso podrían tratarse con un antagonista
terapéutico de estas citocinas. Esta intervención específica podría
utilizarse aislada o como una terapia de combinación.
Se encontró que pueden utilizarse los niveles de
ARNm de citocinas para diferenciar entre los pacientes que toleran
la infección con impunidad, sin desarrollar el síndrome septicémico
y los que es probable que desarrollen el síndrome septicémico en
respuesta a la infección. Esta predicción se basa en el patrón de
ARNm para TNF\alpha, IFN\gamma, IL-10,
IL-23 e IL27, con el ARNm medido mediante
QRT-PCR y normalizado con respecto a un gen de
mantenimiento.
Cuando se utilizan los valores absolutos para
los números de copias de ARNm para estas citocinas en un modelo
para predecir si los pacientes desarrollan septicemia grave o
toleran la infección, utilizando un análisis de regresión
logística, el valor de R^{2} del modelo es de 0,78, y la curva de
operador receptor es de 0,98. Este modelo puede utilizarse para
generar las probabilidades respectivas de desarrollar septicemia
grave y de tolerar la infección, y la razón de estas
probabilidades. Esta última razón representa un sistema de
puntuación para el riesgo de desarrollar septicemia grave en
respuesta a la infección.
En un análisis de regresión logística de esta
puntuación de riesgo frente al desenlace, siendo el resultado o
bien septicemia grave o bien tolerancia a la infección, la curva de
regresión logística presenta el 100% de los puntos de corte (figura
1). Por tanto, es posible seleccionar una puntuación que pueda
identificar pacientes que tolerarán la infección sin desarrollar
septicemia grave con el 100% de especificidad y con el 70% de
sensibilidad. A la inversa, pueden identificarse pacientes que no
desarrollan septicemia grave en respuesta a la infección con el
100% de especificidad y con el 60% de sensibilidad.
Puede utilizarse el sistema de puntuación
descrito en la presente memoria para estratificar el riesgo en
pacientes que presentan infección, para identificar pacientes que
pueden o bien tratarse con antibióticos durante un corto periodo de
tiempo o bien pueden recibir terapia como pacientes externos.
Alternativamente, los pacientes que es muy probable que desarrollen
septicemia grave pueden identificarse antes de la aparición de una
enfermedad potencialmente mortal. Estos pacientes podrían recibir
una intervención apropiada con antibióticos o drenaje quirúrgico
del tejido infectado.
En pacientes que ya han desarrollado enfermedad
crítica en respuesta a la infección, puede utilizarse el patrón de
ARNm para las citocinas TNF\alpha e IFN\gamma para identificar a
los pacientes que están en mayor riesgo de desarrollar un choque
persistente. Esta estratificación del riesgo se basa en un análisis
de conglomerados jerárquico, utilizando el método de Wards con
datos normalizados, e identifica un grupo de pacientes que
experimentan choque septicémico persistente y mayor gravedad de la
insuficiencia orgánica. Este grupo de alto riesgo presenta un
riesgo aumentado 10 veces de choque septicémico persistente, y cabe
la posibilidad de que puedan beneficiarse de la administración de
IFN\gamma exógeno, para mejorar la gravedad o acortar la duración
del choque septicémico.
En la tabla 1, se muestra un sistema de
puntuación adicional que proporciona los resultados de un programa
estadístico utilizado para proporcionar valores patrón para
TNF\alpha, IFN\gamma e IL-10. Cuando se aplican
los valores a la población y los individuos clasificados, o
puntuados, sobre una base de 0 ó 1 dependiendo de si se encuentran
en la categoría de riesgo, entonces puede idearse un sistema de
puntuación sencillo, que oscila desde 0 hasta 3.
La figura 2 es un diagrama correspondiente que
muestra que el riesgo de desarrollar septicemia en respuesta a la
infección aumenta desde el 16 hasta el 100% a medida que aumenta la
puntuación empírica desde 0 hasta 3. Los valores umbral, en cuanto
a cruzar los valores umbral como parte de una reacción en cadena de
la polimerasa en tiempo real, están normalizados frente a un gen de
mantenimiento y referidos a una cantidad patrón conocida de ARNm
para cada citocina respectiva, tal como se enumera a
continuación:
Los valores puntuales están en términos de
números de copias de ARNm por 10 millones de copias de
\beta-actina
- TNF\alpha
- 0 si está por encima de 21380; 1 si está por debajo de 21380
- IL-10
- 1 si está por encima de 660; 0 si está por debajo de 660
- IFN\gamma
- 0 si está por encima de 188; 1 si está por debajo de 188
Puede utilizarse ARNm de IL-10
para diferenciar entre pacientes que desarrollan septicemia y otros
pacientes caracterizando los niveles de IL-10 o
bien como altos o bien como bajos (figura 3). Por tanto, pueden
caracterizarse los niveles de ARNm de IL-10 como
IL-10 alta o baja utilizando los intervalos mostrado
en la figura 3.
Las categorías alta y baja de
IL-10 presentan los límites tal como se muestran en
la figura 4. Por tanto, hay un punto de corte a 426 copias de ARNm
de IL-10 y el intervalo de confianza del 95% de este
corte es +/- 2 EEM de la diferencia entre este valor de corte y
otros valores de ARNm de IL-10 que es de desde 175
hasta 676 copias de ARNm de IL-10. (Con todos los
valores de ARNm expresados por 10 millones de copias de
\beta-actina)
Pueden utilizarse los niveles de ARNm de
IFN\gamma para distinguir entre pacientes con septicemia y otros
pacientes caracterizando los niveles de ARNm de IFN\gamma como
altos o bajos utilizando el análisis de regresión logística
anterior. Estas categorías de ARNm de IFN\gamma presentan los
límites tal como se exponen en la figura 5. Por tanto, hay un punto
de corte a 240 copias de ARNm de IFN\gamma por 10 millones de
copias de \beta-actina y el intervalo de
confianza del 95% de este corte es de desde 100 copias hasta 380
copias. Pueden utilizarse estas categorías de ARNm de IFN\gamma
para distinguir entre pacientes con septicemia y otros pacientes,
observándose IFN\gamma bajo con mayor frecuencia en pacientes con
septicemia (figura 6).
Cuando se comparan pacientes con septicemia con
un grupo combinado de voluntarios sanos y pacientes con infección
pero sin septicemia, entonces la IL-23 es menor en
pacientes con septicemia. Por tanto, la IL-23 puede
ser de utilidad en la predicción de la respuesta a la infección. El
gráfico de la figura 7 muestra estos datos. Cuando se dividen estos
datos en pacientes con IL-23 alta o baja, siendo
baja pacientes con menos de 1823,259 copias de ARNm de
IL-23, entonces todos los pacientes con menos
IL-23 que este valor estaban en el grupo con
septicemia (tal como se muestra en la figura 8). Los intervalos de
confianza de esta caracterización de IL-23 se
muestran en la figura 9, puede observarse que hay un punto de corte
a 1824 copias de ARNm de IL-23 por 10 millones de
copias de \beta-actina y el intervalo de confianza
del 95% de este corte es de desde 4874 hasta 774 copias de ARNm por
millón de copias de \beta-actina. Por tanto,
pueden ser de utilidad los niveles de IL-23 en la
predicción del desenlace en la respuesta a la infección.
Haciendo referencia a la figura 10, el nivel de
ARNm de IL-27 era mayor en pacientes con septicemia
en comparación con otros pacientes. Los niveles de
IL-27 pueden dicotomizarse mediante división
recursiva en categorías alta y baja tal como se muestra en la
figura 11. Existe un punto de corte a 200 copias de ARNm de
IL-27 por 10 millones de copias de
\beta-actina y el intervalo de confianza del 95%
de este corte es de desde 50 hasta 500 copias de ARNm por 10
millones de copias de \beta-actina. Esta
categorización de IL-27 en grupos alto y bajo puede
utilizarse para distinguir entre pacientes con septicemia y otros
pacientes, tal como se muestra en la figura 12.
Por tanto, la IL-23 e
IL-27 pueden ser de utilidad en la predicción de la
respuesta a la infección. Sin embargo, puesto que ambas citocinas
regulan la línea celular Th17 CD4, entonces otras citocinas que
regulan este grupo de células CD4 tales como IL-17
y el factor de crecimiento transformante beta-1
pueden ser de utilidad en la predicción de la respuesta a la
infección.
Haciendo referencia a las figuras 4, 5, 7, 9,
10, 11, 15 y 16, todos los valores de ARNm se citan como números de
copias absolutos de ARNm haciendo referencia a un gen de
mantenimiento, que en este caso es \beta-actina,
pero pueden utilizarse otros genes de mantenimiento.
Se deriva una puntuación compuesta de los
valores categóricos de IFN\gamma, IL-10, 23 y
27:
IFN\gamma bajo presenta un valor atribuido de
1 frente a 0 para la categoría alta;
IL-10 alta presenta un valor
atribuido de 1 frente a 0 para la categoría baja;
IL-23 baja presenta un valor
atribuido de 1 frente a 0 para la categoría alta; e
IL-27 alta presenta un valor
atribuido de 1 frente a 0 para la categoría baja.
La suma de estas puntuaciones genera un valor
acumulativo para el riesgo de septicemia. En un sistema de
puntuación basado en valores categóricos acumulativos para
IFN\gamma e IL-10, la puntuación resultante, que
oscila desde 0 hasta 2, puede utilizarse para distinguir entre
pacientes con septicemia y otros pacientes tal como se muestra en
la figura 13.
En el sistema de puntuación basado en
interleucina 10, 23 e IFN\gamma, la puntuación oscila desde 0
hasta 3 y puede utilizarse para distinguir pacientes con septicemia
de otros pacientes tal como se muestra en la figura 14.
\newpage
\global\parskip0.900000\baselineskip
Este mismo sistema de modelado tal como se
describió anteriormente puede utilizarse para predecir el desenlace
en pacientes que desarrollan septicemia grave. Este modelo se basa
en niveles de ARNm de citocinas en una muestra de sangre extraída
el primer día de admisión en cuidados intensivos.
Este sistema de puntuación se basa en ensayos de
ARNm para las citocinas IL-10, 23 y 27 e
IFN\gamma, en la admisión en cuidados intensivos, o en las fases
iniciales de un episodio de septicemia. En particular, puede
utilizarse la combinación de estas moléculas para estratificar
pacientes. Por ejemplo, en pacientes con muerte por septicemia, la
septicemia está relacionada con una razón mayor de ARNm de
IL-10:IFN\gamma, y también con una razón mayor de
IL-27:IL-23, tal como se muestra en
las figuras 15 y 16, respectivamente.
Estas razones pueden dicotomizarse en las
categorías de alta y baja mediante división recursiva tal como se
muestra en las tablas 2 y 3 a continuación.
Por tanto, hay una razón de corte de 2,85 y el
intervalo de confianza del 95% de esta razón oscilaba desde 4,52
hasta 1,8.
Por tanto hay una razón de corte de 1,45 y el
intervalo de confianza del 95% de esta razón oscilaba desde 2,6
hasta 0,13.
Estas categorías (razón de corte para
IL-10:IFN\gamma o
IL-27:IL-23) pueden atribuirse
(dividirse) en grupos "alto" o "bajo" dependiendo de si
la razón de corte está por encima de o por debajo de la razón
deseada (tal como por encima o por debajo de aproximadamente 1,45
para la razón de IL-27:IL-23 o por
encima o por debajo de aproximadamente 2,85 para la razón de
IL-10:IFN\gamma). Se atribuyó una puntuación de 1
para un valor alto y se atribuyó una puntuación de 0 para un valor
bajo. Cuando se combinan las dos razones de corte para
IL-10:IFN\gamma e
IL-27:IL-23, puede generarse un
sistema de puntuación que oscila desde 0 hasta 2 tal como
sigue:
Puede utilizarse este sistema de puntuación para
predecir el riesgo de mortalidad, con una puntuación total de 0
como riesgo bajo, 2 como riesgo alto y 1 como riesgo intermedio, tal
como se muestra en la figura 17. Además, puede utilizarse este
sistema de puntuación para predecir el patrón temporal de
supervivencia en pacientes con septicemia (véase la figura 18). A
estas razones, IL-10:IFN\gamma e
IL-27:IL-23, se les ha dado la misma
ponderación en el sistema de puntuación, con una puntuación de o
bien 0 o bien 1 atribuida a estas razones (citocina). Sin embargo,
la importancia relativa de estas razones puede no ser igual. Por
tanto, la importancia relativa de estas razones puede variar, y la
ponderación o importancia relativa de estas razones puede no ser
igual, presentando una razón una ponderación de hasta 10 veces mayor
que la ponderación de otras razones.
En la tabla 4, puede observarse la aparición de
la septicemia por categoría de ARNm de IL-10 e
IFN\gamma. Por tanto, la utilización de la razón de
IL-10:IFN\gamma y/o la razón de
IL-23:IL-27 puede ser útil en la
estratificación de pacientes en grupos con septicemia/sin
septicemia.
Cuando se añaden a este modelo los niveles
plasmáticos de proteína IL-6, y se dicotomizan como
altos, es decir, mayores de 746 pg/ml y se atribuye una puntuación
de riesgo de 1, o bajos, es decir, menores de 746 pg/mL y se
atribuye una puntuación de riesgo de 0, entonces puede añadirse esta
puntuación como una capa adicional a la puntuación preexistente.
Esto genera una puntuación, con un intervalo de 0 a 3, que está
vinculada con un aumento del riesgo de muerte por septicemia. La
figura 19 ilustra este aumento del riesgo. Además, puede utilizarse
esta puntuación de riesgo más compleja para predecir el patrón
temporal de supervivencia en pacientes con septicemia, tal como se
muestra en la figura 20. Aunque los datos para IL-6
presentados en la presente memoria se refieren a la concentración
de proteína IL-6, resultará evidente para un experto
en la materia que la presente invención también abarca la
utilización de datos de ARNm de IL-6.
Los datos presentados en el texto anterior
explican resumidamente una metodología para predecir la respuesta a
la infección y o el desenlace en pacientes con septicemia grave.
Esta metodología puede utilizarse como herramienta para facilitar
el diseño del estudio en una investigación de nuevas intervenciones
terapéuticas en pacientes con septicemia. Puesto que los pacientes
pueden clasificarse según el riesgo de mortalidad, pueden
identificarse grupos de pacientes específicos, que es lo más
probable que se beneficien de una terapia específica. Sobre esta
base, los pacientes con septicemia grave, pero con bajo riesgo de
mortalidad, pueden excluirse del estudio de una nueva terapia, que
puede presentar una toxicidad potencial.
En pacientes con septicemia, la información
proporcionada mediante esta invención, junto con el beneficio
potencial de una terapia, en cuanto a la reducción relativa en la
tasa de mortalidad, puede utilizarse para diseñar un estudio de
tamaño suficiente de modo que presente una potencia suficiente como
para alcanzar un resultado estadísticamente significativo. Por
tanto, en vez de estudiar un cohorte general de pacientes con
septicemia, los pacientes se clasificarían según el riesgo de
mortalidad tras su reclutamiento, se asignarían a un subgrupo
específico, proporcionando a cada subgrupo el tamaño adecuado para
lograr la significación estadística, y se analizaría por separado
el desenlace para estos subgrupos. Sobre esta base, puede utilizarse
esta invención como herramienta para facilitar el reclutamiento
lógico de pacientes y el diseño del estudio.
Además, el procedimiento de estratificación del
riesgo para pacientes con septicemia explicado resumidamente en la
presente memoria sería de utilidad en la identificación de qué
grupos de pacientes sería lo más probable que se beneficiasen de
cualquier nueva terapia futura, podría utilizarse para monitorizar
la respuesta a la terapia, y podría utilizarse para identificar
pacientes que es más probable que experimenten toxicidad nociva
relacionada con la terapia que obtengan un beneficio relacionado con
la terapia. Este procedimiento también puede aplicarse a la
investigación de terapias para la infección con nuevos medicamentos
antimicrobianos. Esta invención propone un algoritmo, basado en
ARNm de citocinas, que predice la aparición de septicemia en
pacientes con infección, y que puede actuar como una covariable en
la predicción del probable fracaso o éxito terapéutico.
La clasificación de los pacientes según la
probabilidad de respuesta a una nueva terapia puede ser importante
por ejemplo para compañías farmacéuticas puesto que en la actualidad
las compañías farmacéuticas que sacan al mercado nuevas terapias
para la septicemia carecen de un índice objetivo que pueda
diferenciar entre posibles pacientes que responden al tratamiento y
que no responden. Un índice o marcador de este tipo presentaría un
gran impacto en la realización de ensayos clínicos de nuevas
terapias en septicemia, y sobre la aplicación posterior de una
nueva terapia en la práctica clínica.
La invención se pondrá más claramente de
manifiesto a partir de los siguientes ejemplos de la misma.
Este estudio se realizó en el Hospital de St.
James, Dublín, Irlanda, y fue aprobado por el comité de ética
institucional. Se obtuvo consentimiento informado por escrito de
cada paciente o un familiar. Se incluyó un total de 62 pacientes
consecutivos de descendencia irlandesa con septicemia grave o choque
septicémico, tal como define la American College of Chest
Physicians/Society of Critical Care Medicine Consensus Conference
[1] a lo largo del transcurso de 12 meses. Todos los pacientes de
UCI recibieron similares cuidados normalizados.
Se caracterizó la gravedad de la enfermedad en
la admisión en la UCI utilizando los sistemas de puntuación de
puntuación de fisiología aguda simplificada (SAPS2), puntuación de
disfunción multiorgánica (MODS) y evaluación de fallo orgánico
secuencial (SOFA) y de nuevo el día 7 con las puntuaciones de MODS y
SOFA.
Se recogieron variables de laboratorio y
clínicas individuales el día 1 y el día 7 de permanencia en la UCI.
Las variables registradas representaban las alteraciones más
significativas respecto a los valores normales registrados por el
personal de enfermería a lo largo de cada periodo de 24 horas. Se
registró la duración de la diálisis, la dependencia de agentes
inotrópicos, la ventilación y la permanencia en la UCI para cada
paciente. Se indicaron la fuente de la infección que requirió la
admisión en la UCI, las infecciones posteriores a lo largo del
transcurso de la permanencia en la UCI y los organismos patógenos
\hbox{respectivos. Se registró la muerte en la UCI o la
supervivencia hasta el alta de la UCI.}
Se reclutaron diez pacientes consecutivos con
una bacteriemia gram negativa, confirmada en hemocultivo, y sin
insuficiencia orgánica o crisis septicémica inminente de las salas
del hospital. Trece miembros sanos del personal sirvieron como
grupo control.
Los criterios de exclusión incluían: 1)
infección con el virus de inmunodeficiencia humana; 2) pacientes con
neutropenia como resultado de quimioterapia; 3) pacientes que
recibieron tratamiento a largo plazo con corticosteroides; 4)
pacientes que recibieron terapia inmunosupresora tras trasplante de
órganos; 5) antecedentes étnicos no caucásicos.
Se llevó a cabo la toma de muestras de sangre en
el plazo de las primeras 24 horas de admisión en la UCI y de nuevo
7 días después a través de una vía venosa central permanente o
mediante venopunción. En pacientes bacteriémicos, se llevó a cabo
la toma de muestras de sangre en el plazo de las 24 horas de haberse
notificado el hemocultivo positivo. Se extrajeron las muestras de
sangre de los controles sanos en un punto de tiempo.
Se purificaron las células mononucleares de
sangre periférica (PBMC) inmediatamente mediante centrifugación en
gradiente de densidad de la sangre anticuagulada con EDTA utilizando
Lymphoprep (Nycomed Pharma, Oslo, Noruega). Tras la centrifugación,
puede distinguirse la capa leucocitaria, la fracción de una muestra
de sangre centrifugada que contiene la mayoría de los glóbulos
blancos sanguíneos. La capa leucocitaria es la capa entre la capa
de líquido transparente (el plasma) y la capa de líquido de color
rojo que contiene la mayoría de los glóbulos rojos sanguíneos. Esta
capa delgada entremedias, la capa leucocitaria, contiene la mayoría
de los glóbulos blancos sanguíneos y las plaquetas.
Se obtuvo el suero a partir de sangre completa
coagulada durante 30 minutos a temperatura ambiente y centrifugada
a 2500 rpm durante 10 minutos.
Se aisló el ARN total de PBMC lisadas utilizando
un kit comercialmente disponible (kit RNeasy de Qiagen) siguiendo
las instrucciones del fabricante. Con el fin de evitar la
amplificación del ADN genómico contaminante, se trataron todas las
muestras con ADNasa libre de ARNasa (Qiagen) durante 15 minutos. Se
midió la cantidad y la pureza del ARN extraído con un
espectrofotómetro (Eppendorf BioPhotometer, Eppendorf AG, Hamburg,
Alemania). Se verificó la calidad del ARNm extraído en un
bioanalizador Agilent 2100 utilizando el kit Nano LabChip de ARN
(Agilent Technologies, Palto Alto, CA, EE.UU.).
A continuación, se sometió a transcripción
inversa el ARN total tal como sigue: en primer lugar se incubaron
11,15 \mul de agua que contenía 500 ng de ARN total a 65ºC durante
10 minutos. Se añadieron 18,85 \mul de mezcla de transcripción
inversa que contenía los siguientes componentes: (1) 3 \mul de DTT
0,1 M; (2) 4,5 \mul de dimetilsulfóxido: (3) 2 \mul de
cebadores aleatorios 100 \muM (Invitrogen Corp, Carlsbad, CA, EE.
UU.); (4) 1,25 \mul de transcriptasa inversa del virus de la
leucemia murina de Moloney (Invitrogen Corp); (5) 6 \mul de
tampón 5X First Strand (Invitrogen Corp); (6) 1,5 \mul de mezcla
de desoxinucleótidos trifosfato 4 mM (Promega Corp, Madison MI,
EE.UU.); (7) 0,6 \mul de RNasin (Promega Corp) 10 U/\mul.
Entonces se incubaron las muestras a 37ºC durante 1 hora.
Se sintetizaron todos los cebadores y las sondas
utilizadas en este estudio en Applied Biosystems (Foster City, CA,
EE.UU.). Se obtuvieron los cebadores y las sondas para TNF\alpha e
IL10 como una mezcla preadaptada (la ID de ensayo para TNF\alpha
es Hs00174128_m1 y para IL10 es Hs00174086_m1). Se diseñaron y
adaptaron los cebadores y las sondas para
\beta-actina, IL12p35 e IFN\gamma según Stordeur
et al. [11]. En la tabla A se enumeran los oligonucleótidos
para la PCR en tiempo real.
\newpage
\global\parskip1.000000\baselineskip
La IL-12 es una proteína
heterodimérica compuesta por dos subunidades, p40 y p35, codificada
por genes no relacionados. La subunidad tampoco presenta actividad
biológica sola, aunque un homodímero de p40 puede actuar como
antagonista de IL-12 [12]. Además, la producción de
IL-12 por monocitos da como resultado un exceso de
500 veces de p40 en relación con el heterodímero activo [13].
Aproximadamente el 20-40% de la p40 en el suero de
ratones normales y ratones tratados con endotoxina está en forma de
homodímero [14]. Como consecuencia de esto, se elige medir la
subunidad p35 como índice de la actividad del heterodímero de
IL-12.
Se llevaron a cabo las reacciones de PCR en un
aparato ABI Prism 7000 (Applied Biosytems). Se realizaron todas las
reacciones o bien por triplicado o bien por duplicado, Se llevó a
cabo el termociclado en un volumen final de 20 \mul que contenía:
(1) agua hasta 20 \mul; (2) 10 \mul de Mastermix (Applied
Biosystems); (3) 1, 2 ó 3 \mul de cebadores directo e inverso 6
pmol/\mul (concentración final 300, 600 ó 900 nM, véase la tabla
1); (5) 1 \mul de sonda Taqman 4 pmol/\mul (concentración final
200 nM) o 1 \mul de mezcla cebador/sonda preadaptada con
concentraciones de cebador y sonda por defecto (tabla 1); (6) 0,8
\mul de la dilución patrón o 2,4 \mul de ADNc. Tras una etapa
de desnaturalización inicial a 95ºC durante 10 minutos, se
iniciaron los ciclos de temperatura. Cada ciclo consistió en 95ºC
durante 15 segundos y 60ºC durante 60 segundos, leyéndose la
fluorescencia al final de esta segunda etapa. En total, se
realizaron 40 ciclos.
Los patrones de ADN para TNF\alpha,
IL-10, \beta-actina, IL12p35 e
IFN\gamma consistieron en un producto de PCR clonado que incluía
el amplicón cuantificado preparado mediante PCR de una población de
ADNc que contenía el ARNm diana. En la tabla B se proporciona
información sobre estos patrones de oligonucleótido.
Con el fin de cuantificar los niveles de
transcritos, se construyó una curva patrón para cada ronda de PCR,
para cada diana de ARNm seleccionada a partir de diluciones en serie
del patrón pertinente. Todas las curvas patrón mostraron
coeficientes de correlación >0,99, lo que indica una relación
lineal logarítmica precisa.
La eficacia media de las curvas patrón para
todos los ADNc diana fue del 98,75% +/- 4,4%. Entonces se calcularon
los números de copia de ARNm para cada muestra de paciente
utilizando la curva patrón para convertir el valor umbral de cruce
(Ct) obtenido en números de copias de ARNm. Entonces se expresaron
los resultados en números de copias absolutos tras la normalización
frente a ARNm de \beta-actina (números de copias
de ARNm de ARNm de citocinas por 10 millones de números de copias
de ARNm de \beta-actina).
Se midieron las concentraciones de TNF\alpha,
IL10, IL6 e IFN\gamma en suero mediante ELISA (R+D systems,
Minneapolis, MN, EE.UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante.
El límite inferior de detección para TNF\alpha fue de 15,625
pg/ml, para IL10 fue de 46,875 pg/ml, para IL6 fue de 9,375 pg/ml y
para IFN\gamma fue de 15,625 pg/ml. Se sometieron a prueba todas
las muestras por duplicado.
Se utilizó la prueba de la suma de rangos de
Wilcoxon para analizar las diferencias entre grupos para variables
continuas. Se analizó el cambio en una variable continua a lo largo
del tiempo mediante ANOVA para mediciones repetidas. Se analizaron
las variables categóricas mediante la prueba de Chi cuadrado y la
prueba exacta de Fisher según fuese apropiado. Se utilizó el
coeficiente de correlación de rangos de Spearman para analizar la
relación entre variables continuas. Se realizó análisis de
conglomerados jerárquico con datos normalizados utilizando el
método de Ward cuyos resultados se analizaron utilizando el paquete
de software estadístico JMP (SAS Institute, Cary Carolina del
Norte, EE.UU.).
Se midió el ARNm de citocinas como un valor
absoluto de las copias de ARNm para citocinas respectivas, y a
partir de una única muestra de sangre. Se logró esta medición
utilizando patrones de ADN, que contenían cantidades conocidas de
ADN, y construyendo una curva de RT PCR de calibración de referencia
mediante la utilización de diluciones secuenciales de estos
patrones.
Se construyeron curvas de referencia de manera
similar para un gen de mantenimiento, en este caso
\beta-actina, de modo que la medida del ARNm de
citocinas pudo normalizarse frente a este gen de mantenimiento.
La curva de PCR de referencia se utilizó como
herramienta de calibración y permitió la medición del ARNm de
citocinas en términos absolutos como números de copias por millón de
números de copias de un gen de mantenimiento.
Los patrones de ADN para TNF\alpha, IL10,
\beta-actina, IL12p35, IFN\gamma, IL18, IL4 e
IL23p19 consistieron en un producto de PCR clonado que incluía el
amplicón cuantificado que se preparó mediante PCR de una población
de ADNc que contenía el ARNm diana. En la tabla C se proporcionan
las secuencias y las condiciones de reacción.
Se separaron en alícuotas disoluciones madre de
los patrones, que contenían 10^{9} (IFN\gamma,
B-actina, TNF\alpha, IL23p35 e IL4) o 10^{10}
(IL12p35 e IL10) números de copias por \mul, y se almacenaron a
-20ºC. Se preparó una serie de diluciones de desde 10^{9} hasta
10^{2} números de copias por \mul en cada caso y se almacenaron
a 4ºC. Se diluyeron los patrones en tampón TE
(Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0) que contenía
ADN de arenque bicatenario (Sigma) a 10 \mug/ml.
\newpage
\global\parskip0.920000\baselineskip
Se fabricó un patrón de IL 27 de novo,
que ilustra la metodología de construcción de estos patrones.
Se adquirió el plásmido IL27p28 de Open
Biosystems. Consistía en un clon de ADNc de 1,9 kb insertado en un
vector de 4,2 kb transformado en E. coli resistente a
cloranfenicol. El vector era pDNR-LIB tal como se
muestra en la figura 21. La figura 22 muestra el MCS, el sitio de
clonación múltiple. Se sustituyó el fragmento de relleno por el
inserto de ADNc de IL27. Los sitios de restricción únicos se
muestran en negrita y en gris.
Se cultivó el ADN de plásmido mediante siembra
en estrías dobles en una placa de agar LB con cloranfenicol.
Entonces se colocó una muestra de éste en un cultivo líquido durante
la noche. Se realizó el aislamiento del ADN de plásmido a pequeña y
gran escala utilizando los kits Mini y Midi de Qiagen,
respectivamente. Se realizaron los procedimientos de digestión por
restricción según los métodos de Sambrook et al. Tras la
separación electroforética, se purificaron los fragmentos de ADN a
partir de los geles utilizando el kit de extracción de gel QIAquick
(Qiagen).
Se construyeron todos los geles de ARN
disolviendo agarosa en tampón
Tris-Borato-EDTA (TBE) (Sigma). Esto
se logró calentando la mezcla en un microondas para crear una
disolución de agarosa al 1%. Se añadió bromuro de etidio al gel a
una concentración final de 0,5 \mug/ml para facilitar la
visualización del ADN. Entonces se vierte el gen en un recipiente
de colada que contenía un peine para muestra y se deja enfriar hasta
temperatura ambiente. Tras solidificarse el, se retira el peine. Se
inserta el gel, todavía en su bandeja de plástico, horizontalmente
en la cámara de electroforesis y se cubre justo con el tampón. A
continuación, se aplica un voltaje de 135 V a través del gel
durante 35 minutos. A continuación, se utilizó una cabina de luz
ultravioleta para visualizar el ADN teñido con bromuro de etidio en
los geles.
Se extrajo el fragmento de IL27 del gel de
agarosa utilizando un kit de extracción de gel QIAquick (Qiagen)
siguiendo las instrucciones del fabricante. Se extrajo
cuidadosamente la banda de interés del gel utilizando un escalpelo.
Entonces, se coloca ésta en una columna de centrifugación que
contiene una membrana de gel de sílice que se une al ADN. El ADN se
adsorbe a esta membrana en presencia de un tampón con alta
concentración de sales mientras que los contaminantes pasan a
través de la columna a medida que las impurezas se eliminan
mediante lavado. Se añade el tampón de elución Tris al centro de la
membrana de QIAquick y se deja que la columna repose durante 1
minuto antes de que se eluya el ADN con el tampón de elución. Esto
aumenta el rendimiento de ADN hasta en 1,7 veces. Entonces tuvo
lugar la cuantificación del ácido nucleico utilizando el sistema
Nanodrop.
En primer lugar, se calcula la masa de una única
molécula de plásmido. Insertar el valor del tamaño del plásmido en
la fórmula a continuación:
m = (n)(1.096\ X\ 10^{-21}\
g/pb);
en la que m=masa y n= tamaño del
plásmido (pb), en la que se utiliza el tamaño de todo el plásmido
(plásmido + inserto) en este
cálculo.
En el caso de IL27:
m = 5277\ pb\ (1.096\ X\
10^{-21})\ g/pb = 5.78\ X\ 10^{-18}\ g = masa\ de\ 1\ molécula\ de\
plásmido
A continuación, se calcula la masa del plásmido
que contiene el CN de interés, en este ejemplo 10^{-11}
copias:
10^{-11}\ copias\ X\ 5.78\ X\
10^{-18}\ g/copia 5.78\ X\ 10^{-7}\
g
A continuación, se calculan las concentraciones
de ADN de plásmido necesarias para lograr los CN de interés. Se
divide la masa necesaria entre el volumen que va a pipetearse en
cada reacción. Para este ejemplo, se pipetean 5 \mul de
disolución de ADN de plásmido en cada reacción de PCR. Para
10^{-11} copias;
5.78\ X\ 10^{-7}\ g/5\ \mu l =
1.16\ X\ 10^{-7}\ g/\mu
l.
Entonces se prepara una dilución en serie del
ADN de plásmido. Se utiliza la siguiente fórmula para calcular el
volumen necesario para preparar la dilución patrón de 10^{-11}
copias. Para este ejemplo, se estableció que la disolución madre de
ADN de plásmido presentaba una concentración de 1,5 \mug/\mul
tal como se determinó mediante análisis espectrofotométrico.
- \quad
- C_{1}V_{1} = C_{2}V_{2}
\newpage
\global\parskip1.000000\baselineskip
- \quad
- (1.5\ \mu g/\mu l)(V_{1}) = (1.16\ X\ 10^{-7}\ g/\mu l)(100\ \mu l)
- \quad
- V_{1} = 7.73\ \mu l
Para 10^{11} CN de IL27/\mul, añadir 7,73
\mul a 92,27 \mul de diluyente y desde este punto preparar una
dilución en serie del ADN de plásmido.
La figura 23a muestra un gel de ARN con un
marcador de tamaño molecular de 1 kb y el plásmido obtenido tras la
minipreparación y la figura 23b muestra un gel de ARN con un
marcador de tamaño molecular de 1 kb y la preparación del plásmido
digerido.
Se adquirió ADNc de IKBL humano de Invitrogen
(clon de Invitrogen H-X77909-M). Se
amplificó la secuencia codificante completa utilizando los
siguientes cebadores que insertaron los sitios de restricción Nde1 y
Xho 1:
- -
- Cebador directo: ACTCAGATCATATGAGTAACCCCTC
- -
- Cebador Inverso: TGGATCCTCGAGTCACGGTACCTTGAG
Las condiciones de reacción para la PCR fueron
95ºC durante 15 min.; 95ºC durante 30 s; 58ºC durante 1 min.; 72ºC
durante 1 min. para 35 ciclos.
Se purificaron en gel los productos amplificados
utilizando un kit de purificación de gel de Qiagen, se confirmaron
mediante secuenciación (Departamento de Bioquímica, Universidad de
Cambridge, RU) y se cuantificaron utilizando Pico green (Cambridge
Biosciences, RU).
Sesenta y dos pacientes de UCI, 10 pacientes de
sala bacteriémicos y 12 controles sanos dieron su consentimiento y
se reclutaron en el estudio. Estaban disponibles muestras de sangre
para el análisis de PCR de 52 de estos pacientes de UCI el primer
día de enfermedad crítica y de 49 pacientes de UCI el séptimo día de
enfermedad crítica. Un total de 39 de los pacientes de UCI pusieron
a disposición muestras de sangre para el análisis de PCR a ambos
puntos de tiempo. Se recogió el suero para el ELISA en 37 pacientes
de UCI el día 1 y 36 pacientes de UCI el día 7. En la tabla 5 se
enumeran las puntuaciones de gravedad de la enfermedad y los sitios
de infección para el grupo de UCI.
Se presentan ambos resultados para la cohorte
completa de pacientes de UCI. La edad y la gravedad de la puntuación
de la enfermedad se presentan como medias con el intervalo entre
paréntesis.
La tabla 6 muestra la cuantificación del ARNm de
citocinas en pacientes de cuidados intensivos con septicemia el día
1 en comparación con los controles y los pacientes con bacteriemia.
El primer día de enfermedad crítica, el grupo de UCI mostró mayores
niveles de ARNm de TNF\alpha e IL-10 y menores
niveles de ARNm de IFN\gamma que el grupo control. El grupo de
UCI presentó menores niveles de ARNm de TNF\alpha e INF\gamma y
mayores niveles de ARNm de IL-10 en comparación con
el grupo con bacteriemia (tabla 6). No hubo diferencia en los
niveles de ARNm de IL-12 entre los grupos.
\newpage
\global\parskip0.900000\baselineskip
La tabla 7 muestra la relación entre los niveles
de ARNm de citocinas y los requisitos para infusiones inotrópicas
el día 7 en pacientes de cuidados intensivos con septicemia. En el
grupo de UCI, no hubo asociación entre los niveles de ARNm de
citocinas y la presencia o ausencia de choque el día 1 de enfermedad
crítica. Sin embargo, el séptimo día, los pacientes con choque
presentaron niveles de ARNm de TNF\alpha e IFN\gamma
significativamente inferiores que los pacientes sin choque.
Los resultados se expresan como log de los
números de copias de ARNm por 10^{7} copias de ARNm de
\beta-actina. Todas las comparaciones son
mediante la prueba de la suma de rangos de Wilcoxon. Todos los
valores se establecen como mediana con intervalos
intercuartílicos.
\newpage
\global\parskip1.000000\baselineskip
Diecisiete de los 62 pacientes de UCI (27%)
murieron durante el transcurso de su permanencia en la UCI. De los
52 pacientes que se analizaron para determinar la producción de ARNm
el primer día de enfermedad crítica, 13 murieron antes del alta de
la UCI. No se produjo una tendencia significativa hacia mayores
niveles de ARNm de IL-10 (mediana de 3,10,
intervalo intercuartílico de 2,86 - 3, frente a mediana de 2,89,
intervalo intercuartílico de 2,73 - 3,13; p = 0,1) y menores
niveles de ARNm de IFN\gamma (mediana de 2,05, intervalo
intercuartílico de 1,82 - 2,15 frente a mediana de 2,26, intervalo
intercuartílico de 1,88 - 2,61; p = 0,07, todos los valores
expresados como números de copias de ARNm por 10 millones de números
de copias de \beta-actina) en no supervivientes
en comparación con los supervivientes. Sin embargo, cuando se
dicotomizaron los pacientes de UCI entre los del cuartil más alto
de producción de ARNm de IFN\gamma el día 1 y el resto, no se
produjeron muertes en el grupo del cuartil más alto, mientras que
13 de los otros 39 pacientes murieron (p = 0,02).
La tabla 8 muestra la relación entre los niveles
de ARNm de citocinas en pacientes de cuidados intensivos el día 7
de enfermedad crítica y el desenlace posterior. Ocho de los 49
pacientes de UCI cuyas muestras de sangre se analizaron para
determinar la producción de ARNm tras 7 días de enfermedad crítica
murieron antes del alta de la UCI. Estos 8 no supervivientes
presentaban menores niveles de ARNm de TNF\alpha y una tendencia
hacia menores niveles de ARNm de IL-12 y
IL-10 en comparación con los supervivientes.
Los resultados se expresan como números de
copias de ARNm por 10 millones de copias de ARNm de
\beta-actina. Todos los valores son mediana e
intervalo intercuartílico. Todas las comparaciones mediante la
prueba de la suma de rangos de Wilcoxon con valores de p
establecidos como valores sin corregir.
Los resultados se expresan como log de los
números de copias de ARN por 10^{7} copias de ARNm de
\beta-actina. Todos los valores son mediana e
intervalo intercuartílico. Todas las comparaciones con control
mediante la prueba de la suma de rangos de Wilcoxon con valores de
p establecidos como valores sin corregir.
Se realizó un análisis de conglomerados, que
incluyó datos de UCI para los niveles de ARNm de TNF\alpha e
IFN\gamma del día 7, y se caracterizó un grupo de pacientes de UCI
con niveles de ARNm de TNF\alpha e IFN\gamma reducidos. Los
pacientes en este grupo era más probable que requiriesen agentes
inotrópicos el día 7 de enfermedad crítica, presentaban mayores
puntuaciones SOFA y presentaban una mortalidad significativamente
superior (tabla 9).
Los resultados se expresan como log de los
números de copias de ARNm por 10^{7} copias de ARNm de
\beta-actina (TNF\alpha e IFN\gamma) o como
pg/ml (IL-6). Todos los valores continuos se indican
como mediana con intervalos intercuartílicos. Todas las
comparaciones son con la prueba de la suma de rangos de
Wilcoxon.
La mayoría de los pacientes de UCI no
presentaban proteína TNF\alpha, IL-10 o
IFN\gamma detectable. Sin embargo, IL-6 estaba
presente en cantidades medibles el día 1 (mediana de 306, intervalo
intercuartílico de 131 a 731) y el día 7 (mediana de 63, intervalo
intercuartílico de 3,6 a 174, todos los valores expresados como
pg/ml). El primer día de enfermedad crítica, hubo una correlación
negativa entre los niveles de IL-6 y los niveles de
ARNm de IFN\gamma (Rho de Spearman = -0,52, p=0,0009). El día 7,
hubo una correlación negativa entre los niveles de
IL-6 y los niveles de ARNm de IFN\gamma (Rho de
Spearman = -0,43, p=0,006). Además, el día 7, los niveles de
proteína IL-6 fueron mayores en pacientes de UCI en
el grupo con menor producción de ARNm de TNF\alpha e
IFN\gamma.
Los datos indican que IL-6 actúa
de manera diferente a otras citocinas proinflamatorias y puede
antagonizar una respuesta beneficiosa dando como resultado un
desenlace adverso. Basándose en los resultados, se prevé que un
anticuerpo anti-IL-6 puede presentar
posiblemente utilidad conjuntamente con IFN\gamma en la
preparación de un medicamento para el tratamiento de pacientes con
septicemia grave.
La invención no se limita a las formas de
realización descritas anteriormente en la presente memoria que
pueden variarse en detalle.
\vskip1.000000\baselineskip
Apéndice
1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Apéndice
2
\vskip1.000000\baselineskip
Para probabilidades logarítmicas de sin
septicemia/con septicemia
(figura) receiver operating characteritics =
características operativas del receptor
- True positive = verdadero positivo
- Sensibility = sensibilidad
- 1-specificity = 1-especificidad
- False positive = falso positivo
- Área bajo la curva =
Apéndice
3
\vskip1.000000\baselineskip
Apéndice
4
Existe un punto de corte a 426 copias de ARNm de
IL-10 y el intervalo de confianza del 95% de este
corte es +/- 2 EEM de la diferencia entre este valor de corte y
otros valores de ARNm de IL-10 que es de desde 175
hasta 676 copias de ARNm de IL-10. (Con todos los
valores de ARNm expresados por 10 millones de copias de
\beta-
actina).
actina).
\vskip1.000000\baselineskip
Apéndice
5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Existe un punto de corte en 240 copias de ARNm
de IFN\gamma por 10 millones de copias de la \beta actina y el
intervalo de confianza del 95% de este corte es de desde 100 copias
hasta 380 copias.
\vskip1.000000\baselineskip
Apéndice
6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Apéndice
7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Apéndice
8
Apéndice
9
Existe un punto de corte a 1824 copias de ARNm
de IL-23 por 10 millones de copias de
\beta-actina y el intervalo de confianza del 95%
de este corte es de desde 4874 hasta 774 copias de ARNm por millón
de copias de \beta-actina.
Apéndice
10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Apéndice
11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Existe un punto de corte a 200 copias de ARNm de
IL-27 por 10 millones de copias de
\beta-actina y el intervalo de confianza del 95%
de este corte es de desde 50 hasta 500 copias de ARNm por 10
millones de copias de \beta-
actina.
actina.
\newpage
Apéndice
12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Apéndice
13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Apéndice
14
Apéndice
15
Apéndice
16
Apéndice
17
Apéndice
18
Apéndice
19
Apéndice
20
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Claims (11)
1. Procedimiento para predecir una respuesta en
pacientes humanos a una infección, comprendiendo el procedimiento
determinar un valor de ARNm de IL-23 en una muestra
del paciente, y correlacionar el valor con una probabilidad de que
el paciente desarrolle septicemia en respuesta a la infección,
- en el que un valor de ARNm de IL-23 bajo se correlaciona con una probabilidad de que el paciente desarrolle septicemia en respuesta a la infección, y un valor de ARNm de IL-23 alto se correlaciona con una probabilidad de que el paciente no desarrolle septicemia en respuesta a la infección.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la muestra son células mononucleares de sangre periférica,
en el que un valor de ARNm de IL-23 bajo se
correlaciona con menos de 1824 copias de ARNm de
IL-23 por 10 millones de copias de
\beta-actina, y un valor de ARNm de
IL-23 alto se correlaciona con 1824 o más copias de
IL-23 por 10 millones de copias de
beta-actina.
3. Procedimiento según la reivindicación 1, y
que predice además el resultado de la septicemia en un paciente,
comprendiendo el procedimiento las etapas de determinar una razón de
valores de ARNm de IL-27:IL-23 en
una muestra del paciente, en el que una razón superior a 1,45 se
correlaciona con la muerte y una razón inferior a 1,45 se
correlaciona con la supervivencia.
4. Procedimiento según la reivindicación 3, que
incluye además determinar una razón de valores de ARNm de
IL-10:IFN-\gamma en una muestra
del paciente, en el que una razón superior a 2,85 se correlaciona
con la muerte y una razón inferior a 2,85 se correlaciona con la
supervivencia.
5. Procedimiento según la reivindicación 4, que
comprende un sistema de puntuación en el que se asigna a un
paciente una puntuación de 1 ó 0 dependiendo de si la razón de
valores de ARNm de IL-27:IL-23 está
por encima o por debajo de 1,45, respectivamente, y una puntuación
de 1 ó 0 dependiendo de si la razón de valores de ARNm de
IL-10:IFN-\gamma está por encima o
por debajo de 2,85, respectivamente, en el que una suma de 2 se
correlaciona con un alto riesgo de mortalidad debida a septicemia,
una suma de 0 se correlaciona con un bajo riesgo de mortalidad
debida a septicemia y 1 se correlaciona con un riesgo intermedio de
muerte debida a septicemia.
6. Procedimiento para estratificar un paciente
en un grupo con septicemia/sin septicemia, comprendiendo el
procedimiento las etapas de determinar una razón de valores de ARNm
de IL-27:IL-23 en una muestra del
paciente, en el que una razón superior a 1,45 se correlaciona con
el grupo con septicemia, y una razón inferior a 1,45 se
correlaciona con el grupo sin septicemia.
7. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 6, en el que los valores de ARNm de
IL-27, IL-23, IL-10
e IFN-\gamma se representan mediante los números
de copias de ARNm de IL-27, IL-23,
IL-10 e IFN-\gamma,
respectivamente, y en el que los números de copias se normalizan
frente a un gen de mantenimiento.
8. Procedimiento según la reivindicación 7, en
el que el gen de mantenimiento es
\beta-actina.
9. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la muestra son células
mononucleares de una muestra de sangre periférica, o glóbulos
blancos aislados en la capa leucocitaria de una muestra de sangre
periférica.
10. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que se amplifica el ADNc para
IL-27, IL-23, IL-10
e IFN-\gamma y se cuantifica como un sustituto
para el número de copias de ARNm de IL-27,
IL-23, IL-10 e
IFN-\gamma, respectivamente.
11. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que se mide el número de copias
de ARNm de IL-27, IL-23,
IL-10 e IFN-\gamma en términos
absolutos haciendo referencia a una curva de calibración construida
a partir de una muestra patrón de ADN y normalizada con respecto a
un gen de mantenimiento.
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