ES2342637T3 - Compuestos profarmacos y procedimiento para su preparacion. - Google Patents
Compuestos profarmacos y procedimiento para su preparacion. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2342637T3 ES2342637T3 ES99967462T ES99967462T ES2342637T3 ES 2342637 T3 ES2342637 T3 ES 2342637T3 ES 99967462 T ES99967462 T ES 99967462T ES 99967462 T ES99967462 T ES 99967462T ES 2342637 T3 ES2342637 T3 ES 2342637T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- seq
- baselineskip
- oligopeptide
- acid
- leu
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/65—Peptidic linkers, binders or spacers, e.g. peptidic enzyme-labile linkers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Cephalosporin Compounds (AREA)
Abstract
Un compuesto que comprende: (1) un agente terapéutico capaz de entrar en una célula diana, (2) un oligopéptido que tiene una fórmula (AA)n-AA4-AA3-AA2-AA1, en donde: cada AA independientemente representa cualquier aminoácido genéticamente modificado; n es un número entero de 0 a 12; AA4 representa un aminoácido no genéticamente codificado; AA3 representa cualquier aminoácido; AA2 representa cualquier aminoácido; y AA1 representa cualquier aminoácido, en donde el oligopéptido se selecciona de: DAlaThiβAlaβAlaLeuAlaLeu (SEQ ID NO: 1), ThiβAlaβAlaLeuAlaLeu (SEQ ID NO: 2), βAlaβAlaLeuAlaLeu (SEQ ID NO: 3), βAlaAlaAlaIle (SEQ ID NO: 4), βAlaAlaAlaLeu (SEQ ID NO: 5), βAlaPheTyrLeu (SEQ ID NO: 6), βAlaPheThrPhe (SEQ ID NO: 7), βAlaPheGlyIle (SEQ ID NO: 8), βAlaPheGlyLeu (SEQ ID NO: 9), βAlaPhePhePhe (SEQ ID NO: 10), βAlaPhePheIle (SEQ ID NO: 11), βAlaPhePheLeu (SEQ ID NO: 12), βAlaPheAlaIle (SEQ ID NO: 13), βAlaPheAlaLeu (SEQ ID NO: 14), ThiGlyAlaLeu (SEQ ID NO: 15), NalGlyAlaLeu (SEQ ID NO: 16), βAlaLeuTyrLeu (SEQ ID NO: 17), βAlaLeuThiLeu (SEQ ID NO: 18), βAlaLeuThrPhe (SEQ ID NO: 19), βAlaLeuThrIle (SEQ ID NO: 20), βAlaLeu ThrLeu (SEQ ID NO: 21), βAlaLeuSerLeu (SEQ ID NO: 22), βAlaLeuPyrLeu (SEQ ID NO: 23), βAlaLeuLeuLeu (SEQ ID NO: 24), βAlaLeuGlyPhe (SEQ ID NO: 25), βAlaLeuGlyIle (SEQ ID NO: 26), ThiLeuGlyLeu (SEQ ID NO: 27), βAlaLeuGlyLeu (SEQ ID NO: 28), AibLeuGlyLeu (SEQ ID NO: 29), βAlaLeuPheIle (SEQ ID NO: 30), βAlaLeuPheLeu (SEQ ID NO: 31), βAlaLeuAibLeu (SEQ ID NO: 32), βAlaLeuAlaAla (SEQ ID NO: 33), βAlaLeuAlaβAla (SEQ ID NO: 34), βAlaLeuAlaPhe (SEQ ID NO: 35), βAlaLeuAlaGly (SEQ ID NO: 36), βAlaLeu AlaIle (SEQ ID NO: 37), βAlaLeuAlaLeu (SEQ ID NO: 38), TicLeuAlaLeu (SEQ ID NO: 39), ThzLeuAlaLeu (SEQ ID NO: 40), ThiLeuAlaLeu (SEQ ID NO: 41), NaIleuAlaLeu (SEQ ID NO: 42), NAALeuAlaLeu (SEQ ID NO: 43), D-LeuLeuAlaLeu (SEQ ID NO: 44), D-AlaLeuAlaLeu (SEQ ID NO: 45), D-MetLeuAlaLeu (SEQ ID NO: 46), APP LeuAlaLeu (SEQ ID NO: 47), AmbLeuAlaLeu (SEQ ID NO: 48), βAlaLeuAlaNal (SEQ ID NO: 49), βAlaLeuAlaSer (SEQ ID NO: 50), βAlaLeuAlaTyr (SEQ ID NO: 51), βAlaMetTyrPhe (SEQ ID NO: 52), βAlaMetTyrLeu (SEQ ID NO: 53), βAlaMetGlyIle (SEQ ID NO: 54), ThiMetGlyLeu (SEQ ID NO: 55), βAlaMetPhePhe (SEQ ID NO: 56), βAlaMetPheIle (SEQ ID NO: 57), TicMetAlaLeu (SEQ ID NO: 58), NaIMetAlaLeu (SEQ ID NO: 59), NAA MetAlaLeu (SEQ ID NO: 60), βAlaMetAlaLeu (SEQ ID NO: 61), APPMetAlaLeu (SEQ ID NO: 62), βAlaNleTyrIle (SEQ ID NO: 63), βAlaNleTyrLeu (SEQ ID NO: 64), βAlaNleThrIle (SEQ ID NO: 65), βAlaNleThrLeu (SEQ ID NO: 66), βAlaNleGlyPhe (SEQ ID NO: 67), βAlaNleGlyIle (SEQ ID NO: 68), βAlaNleGlyLeu (SEQ ID NO: 69), βAlaNlePheIle (SEQ ID NO: 70), βAlaNleAlaIle (SEQ ID NO: 71), βAlaNleAlaLeu (SEQ ID NO: 72), βAlaNleAla Phe (SEQ ID NO: 73), βAlaNvaAlaLeu (SEQ ID NO: 74), βAlaPheTyrIle (SEQ ID NO: 75), ThiProGlyLeu (SEQ ID NO: 76), ThiProAlaLeu (SEQ ID NO: 77), NalProAlaLeu (SEQ ID NO: 78), βAlaProAlaLeu (SEQ ID NO: 79), βAlaPhe(CI)AlaLeu (SEQ ID NO: 80), βAlaPhe(NO2)AlaIle (SEQ ID NO: 81), βAlaPhe(NO2)AlaLeu (SEQ ID NO: 82), βAlaPhgAlaLeu (SEQ ID NO: 83), βAlaPyrAlaLeu (SEQ ID NO: 84), TicThrGlyLeu (SEQ ID NO: 85), βAlaThiGlyIle (SEQ ID NO: 86), βAlaThiAlaLeu (SEQ ID NO: 87), βAlaTicAlaIle (SEQ ID NO: 88), βAlaTicAlaLeu (SEQ ID NO: 89), βAlaValAlaLeu (SEQ ID NO: 90), βAlaTrpAlaLeu (SEQ ID NO: 91), βAlaTyrTyrPhe (SEQ ID NO: 92), βAlaTyrTyrIle (SEQ ID NO: 93), βAlaTyrTyrLeu (SEQ ID NO: 94), βAlaTyrThrLeu (SEQ ID NO: 95), βAlaTyrPheLeu (SEQ ID NO: 96), βAlaTyrGlyIle (SEQ ID NO: 97), ThiTyrGlyLeu (SEQ ID NO: 98), βAlaTyrGlyLeu (SEQ ID NO: 99), βAlaTyrPheIle (SEQ ID NO: 100), βAlaTyrAlaIle (SEQ ID NO: 101), ThiTyrAlaLeu (SEQ ID NO: 102), y βAlaTyrAlaLeu (SEQ ID NO: 103). (3) opcionalmente, un grupo enlazador, y (4) un grupo estabilizante cargado negativamente que impide la escisión de dicho oligopéptido por las enzimas presentes en la sangre completa, en donde el oligopéptido está unido directamente al grupo estabilizante en el extremo amino del oligopéptido y AA1 del oligopéptido está unido directamente al agente terapéutico o unido indirectamente a través del grupo enlazador al agente terapéutico en un segundo sitio de unión del oligopéptido, y en donde el compuesto se escinde selectivamente por una enzima asociada con la célula diana, en donde el grupo estabilizante se selecciona de: ácido succínico, ácido diglicólico, ácido maleico, ácido piroglutámico, y ácido glutárico.
Description
Compuestos profármacos y procedimiento para su
preparación.
La presente invención se refiere a nuevos
compuestos y a métodos para prepararlos. Los compuestos actúan
generalmente como profármacos y en la mayoría de los casos son
versiones modificadas de compuestos existentes, especialmente
agentes citotóxicos. Estos profármacos tienen mayor especificidad
para las dianas a las que van destinados y especificidad reducida
para las dianas a las que no van destinados.
Muchos agentes terapéuticos, tales como
antraciclinas y alcaloides de vinca son especialmente eficaces para
el tratamiento de cánceres. Sin embargo, estas moléculas se
caracterizan frecuentemente in vivo por una toxicidad aguda,
especialmente toxicidad para la médula ósea y para las mucosas, así
como una cardiotoxicidad crónica en el caso de las antraciclinas y
toxicidad neurológica crónica en el caso de los alcaloides de vinca.
Similarmente, el metotrexato se puede usar para el tratamiento de
reacciones inflamatorias, tales como enfermedades reumáticas, pero
su alta toxicidad limita sus aplicaciones. Es deseable el desarrollo
de más agentes antitumorales específicos para una mayor eficacia
contra las células tumorales y una disminución en el número y
gravedad de los efectos secundarios de estos productos (toxicidad,
destrucción de células no tumorales, etc.). También es deseable el
desarrollo de agentes anti-inflamatorios más
específicos.
Para minimizar los problemas de toxicidad, los
agentes terapéuticos se presentan ventajosamente a los pacientes en
la forma de profármacos. Los profármacos son moléculas capaces de
ser convertidas en fármacos (compuestos terapéuticos activos)
in vivo por ciertas modificaciones químicas o enzimáticas de
su estructura. Para los fines de reducir la toxicidad, esta
conversión debe estar confinada al sitio de acción o tejido diana
en lugar del sistema circulatorio o tejido no diana. Sin embargo,
los profármacos se caracterizan frecuentemente por una baja
estabilidad en la sangre y el suero, puesto que la sangre y el suero
contienen enzimas que degradan los profármacos.
Una clase deseable de profármacos que supera
dichos problemas se ha descrito en la Publicación del Tratado de
Cooperación de Patentes (PCT) Nº WO 96/05863 y en la Patente de
EE.UU. Nº 5.962.216. Son deseables otros compuestos profármacos
útiles y métodos de preparar dichos profármacos, sin embargo como lo
son los métodos de preparar los profármacos.
Un objeto particular de la invención es un
profármaco que presenta una alta especificidad de acción, una
toxicidad reducida, y una estabilidad mejorada en la sangre con
respecto a los profármacos de estructura similar (especialmente los
de estructura más próxima) que han existido en el dominio
público.
Los compuestos de la invención como se definen
en las reivindicaciones son una forma de profármacos de un agente
terapéutico unido directamente o indirectamente a un oligopéptido,
que a su vez está unido a un grupo estabilizante.
Más generalmente, la presente invención se
puede describir como nuevos compuestos profármacos de un agente
terapéutico, especialmente profármacos que comprenden un agente
terapéutico antitumoral, que presenta propiedades terapéuticas
mejoradas con respecto a los producto de la técnica anterior,
especialmente propiedades terapéuticas mejoradas en el tratamiento
de tumores cancerosos y/o en el tratamiento de reacciones
inflamatorias, tales como enfermedades reumáticas. Las propiedades
terapéuticas incluyen menor toxicidad y mayor eficacia. Se desean
particularmente profármacos que presenten una alta especificidad de
acción, una toxicidad reducida y una mejor estabilidad en suero y
sangre, y que no se desplacen hasta las células dianas hasta que no
sean activados por una enzima asociada a las células dianas.
También se consideran los compuestos profármacos de un marcador que
permite caracterizar los tumores (diagnosis, progresión del tumor,
análisis de los factores segregados por las células tumorales,
etc.).
La presente invención también se refiere a una
composición farmacéutica que comprende el compuesto de acuerdo con
la invención y opcionalmente un adyuvante o vehículo
farmacéuticamente aceptable.
Se describe además un método de disminuir la
toxicidad modificando un agente terapéutico para crear un
profármaco.
Se describen varios procesos para crear un
profármaco de la invención.
Las Figuras 1A-1D son una tabla
de abreviaturas, nombres y estructuras.
La Figura 2 es un esquema ilustrativo de la
escisión de un profármaco de la invención en la vecindad
extracelular de la célula diana.
La Figura 3 ilustra una síntesis de
Fmoc-\betaAla-Leu-Ala-Leu,
un compuesto intermedio típico de la invención.
La Figura 4 ilustra una síntesis por la "ruta
Fmoc" de
metil-succinil-\betaAla-Leu-Ala-Leu,
un compuesto intermedio típico de la invención.
La Figura 5 ilustra una síntesis por la "ruta
Fmoc" de la forma sal de
suc-\betaAla-Leu-Ala-Leu-DOX,
un compuesto intermedio típico de la invención.
La Figura 6 ilustra una síntesis por la ruta del
"éster succinílico" de la forma sal de
Suc-\betaAla-Leu-Ala-Leu-DOX,
un compuesto típico de la invención.
La Figura 7 ilustra una síntesis de un
\betaAla-Leu-Ala
Leu-DOX protegido en el grupo amino, un compuesto
intermedio típico de la invención.
La Figura 8 ilustra una síntesis por la "ruta
del éster alílico" la forma sal de
Suc-\betaAla-Leu-Ala-Leu-DOX,
un compuesto intermedio típico de la invención.
La Figura 9 ilustra una síntesis por la "ruta
de resina" de
suc-\betaAla-Leu-Ala-Leu-DOX,
un compuesto intermedio típico de la invención.
Las Figuras 10A-10C son una
tabla de oligopéptidos útiles en el profármaco de la invención.
La Figura 11 es una gráfica de supervivencia de
un modelo de xenoinjerto en ratones para animales a los que se ha
administrado vehículo con o sin fármaco.
La Figura 12 es una gráfica de supervivencia de
un modelo de xenoinjerto en ratones que compara un profármaco de
doxorubicina y otro de doxorubicina.
Aca = Ácido 6-aminocaproico
ACN = Acetonitrilo
Aib = Ácido aminoisobutírico
All= Alilo
Aloc = Aliloxicarbonilo
Amb = Ácido 4-(aminometil)benzoico
APP = Ácido
3-amino-3-fenilpropiónico
DCC =
N,N'-Diciclohexilcarbodiimida
Boc = t-Butiloxicarbonilo
Cap = Ácido caproico
DBN =
1,5-Diazabiciclo[4.3.0]non-5-eno
DBO =
1,4-Diazabiciclo[2.2.2]octano
DBU =
1,8-Diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno
DCM = Diclorometano
DIC =
N,N'-Di-isopropilcarbodiimida
DIEA = Di-isopropiletilamina
Dg = Ácido diglicólico
DMF = Dimetilformamida
Dnr = Daunorubicina
Dox = Doxorubicina
Et_{2}O = Éter dietílico
Fmoc =
9-Fluorenilmetiloxicarbonilo
Gl= Ácido glutárico
HATU = Hexafluorofosfato de
O-(7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio
HBTU = Hexafluorofosfato de
2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio
HEPES = Hidroxietilpiperidina
HOBt = N-Hidroxibenzotriazol
HPLC = Cromatografía de líquidos a alta
presión
MeOH = Metanol
NAA = Ácido
3-amino-4,4-difenilbutírico
Nal = 2-Naftilalanina
Naph = Ácido
1,8-naftalen-dicarboxílico
Nle = Norleucina
NMP = N-metilpirrolidina
Nva = Norvalina
Resina de PAM =
4-Hidroximetilfenilacetamidometilo
Phg = Fenilglicina
Pyg = Ácido piroglutámico
Pyr = 3-Piridilalanina
RT, rt = Temperatura ambiente
Suc = Ácido succínico
TCE = Tricloroetilo
TFA = Ácido trifluroacético
THF = Tetrahidrofurano
Thi = 2-Tienilalanina
Thz = Ácido
tiazolidin-4-carboxílico
Tic = Ácido
tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico.
El compuesto de la invención como se define en
las reivindicaciones es una forma profármaco de un agente
terapéutico unido directamente o indirectamente a un oligopéptido,
que a su vez está unido a un grupo estabilizante.
Más generalmente, la presente invención se puede
describir como nuevos compuestos profármacos de un agente
terapéutico, especialmente profármacos que comprenden un agente
terapéutico antitumoral, que presenta mejores propiedades
terapéuticas con respecto al producto de la técnica anterior,
especialmente mejores propiedades terapéuticas en el tratamiento de
tumores cancerosos y/o en el tratamiento de reacciones
inflamatorias, tales como enfermedades reumáticas. Las mejores
propiedades terapéuticas incluyen menor toxicidad y mayor eficacia.
Se desean particularmente profármacos que presenten una alta
especificidad de acción, una toxicidad reducida, una mejor
estabilidad en suero y sangre, y que no se desplacen a las células
dianas hasta que sean activados por una enzima asociada a la célula
diana. También se consideran compuestos profármacos de un marcador
que facilita la caracterización de tumores (diagnosis, progresión
del tumor, análisis de los factores segregados por las células
tumorales, etc.).
La presente invención se refiere también a la
composición farmacéutica que comprende el compuesto de acuerdo con
invención y opcionalmente un adyuvante o vehículo farmacéuticamente
aceptable.
Además se describe un método de disminuir la
toxicidad modificando un agente terapéutico para crear un
profármaco.
Se describen varios procesos para crear un
profármaco de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
El profármaco de la invención reivindicada es
una forma modificada de un agente terapéutico y comprende varias
porciones, que incluyen:
- (1)
- un agente terapéutico,
- (2)
- un oligopéptido, y
- (3)
- un grupo estabilizante, y
- (4)
- opcionalmente, un grupo enlazador.
Cada una de las porciones del profármaco se
analiza con mayor detalle más adelante. La orientación típica de
estas porciones del profármaco es como sigue:
(grupo
estabilizante)-(oligopéptido)-(grupo enlazador opcional)-(agente
terapéutico).
El grupo estabilizante está unido directamente
al oligopéptido en un primer sitio de unión del oligopéptido. El
oligopéptido está directamente o indirectamente unido al agente
terapéutico en un segundo sitio de unión del oligopéptido. Si el
oligopéptido y el agente terapéutico están unidos indirectamente
entonces hay presente un grupo enlazador.
La unión directa de dos porciones del profármaco
significa unión covalente entre las dos porciones. El grupo
estabilizante y el oligopéptido están por tanto unidos directamente
mediante una unión covalente en el primer sitio de unión del
oligopéptido que es el término o extremo N del oligopéptido. Cuando
el oligopéptido y el agente terapéutico están unidos directamente
entonces están unidos covalentemente entre sí en el segundo sitio
de unión del oligopéptido. El segundo sitio de unión del
oligopéptido es típicamente el término o extremo C de oligopéptido,
pero puede estar en cualquier otra parte del oligopéptido.
La unión indirecta de las dos porciones del
profármaco significa que cada una de las dos porciones está unida
covalentemente a un grupo enlazador. En una realización alternativa,
el profármaco tiene la unión indirecta del oligopéptido al agente
terapéutico. Por tanto, típicamente, el oligopéptido está unido
covalentemente al grupo enlazador que, a su vez, está unido
covalentemente al agente terapéutico.
El profármaco de la invención es escindible
dentro del oligopéptido directamente o indirectamente unido al
agente terapéutico. Para que el profármaco sea eficaz el
oligopéptido unido al agente terapéutico es la porción activa del
profármaco propiamente dicho o es fácilmente convertible en la
porción activa del profármaco usualmente por una o más
exopeptidasas. La porción activa del profármaco es la parte del
profármaco que por liberación desde la porción restante del
compuesto profármaco entra en la célula diana y ejerce su efecto
terapéutico directamente o frecuentemente tras más conversión
dentro de la célula diana.
Las estructuras del grupo estabilizante y el
oligopéptido se seleccionan además para limitar la liberación del
oligopéptido por enzimas distintas de las que pueden estar presentes
en la sangre o en las células no dianas. El grupo estabilizante
bloquea la degradación del profármaco y puede actuar proporcionando
una carga preferible u otras características físicas del profármaco
por exopeptidasas. La secuencia de aminoácidos del oligopéptido se
diseña para asegurar más la especificidad para la trouasa.
Es deseable convertir un agente terapéutico,
especialmente un agente terapéutico antitumoral y/o
anti-inflamatorio, en inactivo por modificación del
agente terapéutico a la forma de profármaco. De acuerdo con la
invención, las células dianas son usualmente células tumorales o
células que participan en las reacciones
anti-inflamatorias, especialmente las asociadas a
enfermedades reumáticas, tales como macrófagos y monocitos. La
modificación del agente terapéutico a una forma profármaco también
tiende a reducir algunos de los efectos secundarios de los agentes
terapéuticos.
En la célula diana, el agente terapéutico
(opcionalmente unido a uno o dos aminoácidos y posiblemente también
al grupo enlazador) actúa o directamente sobre su sitio de acción
intracelular específico o tras una modificación bajo la acción de
proteasas intracelulares, mata a la célula diana o bloquea su
proliferación. Puesto que las células normales liberan poca o
ninguna trouasa in vivo, el compuesto de acuerdo con la
invención se mantiene inactivo y no entra en las células normales o
lo hace en una cantidad relativamente pequeña.
El profármaco se administra al paciente,
transportado a través del torrente sanguíneo en una forma estable,
y cuando está en la vecindad de una célula diana, es activado por la
trouasa. Puesto que la enzima está sólo mínimamente presente dentro
de la vecindad extracelular de las células normales, el profármaco
se mantiene y su porción activa (incluyendo el agente terapéutico)
y entra en las células normales sólo mínimamente, en el mejor de
los casos. En la vecindad del tumor u otras células dianas, sin
embargo, la presencia de la enzima relevante en el ambiente local
causa la escisión del profármaco. El ejemplo mostrado en la Figura 2
representa un profármaco tetrapeptídico protegido en el extremo N
que se escinde del resto del profármaco extracelularmente y entra
en la célula diana. Una vez dentro de la célula diana, puede ser
modificado adicionalmente para proporcionar el efecto terapéutico.
Aunque la porción active del profármaco pueda entrar en las células
normales en alguna extensión, la porción activa se libera del
resto del profármaco principalmente en la vecindad de las células
dianas. Por tanto, se minimiza la toxicidad para las células
normales.
La liberación de la porción activa del
profármaco incluyendo el agente terapéutico ocurre preferiblemente
en el ambiente inmediato de la célula diana. En la célula diana, el
agente terapéutico actúa o directamente sobre su sito de acción
intracelular específico o después de modificación bajo la acción de
proteasas intracelulares u otras enzimas, puede ser modificado a
otra forma que mata la célula diana o bloquea su proliferación. Un
diagrama esquemático de esta acción para un profármaco ilustrativo
de la invención se muestra en la Figura 2.
Este proceso es particularmente útil para, y
está diseñado para, la destrucción de las células dianas cuando el
tejido diana excreta una enzima u otro factor que no es secretado
por células normales. En la presente descripción "células
normales" significa células no dianas que podrían ser
encontradas por el profármaco tras la administración del
profármaco del modo apropiado para su uso destinado. Puesto que las
células normales (es decir, las que no son dianas) liberan poco o
nada de la(s) enzima(s) de las células diana que son
responsables de la escisión del enlace que une la porción activa
(incluyendo el agente terapéutico) del profármaco del resto del
profármaco in vivo, el compuesto de la invención se mantiene
inactivo y no entra en las células normales.
En una realización alternativa, la orientación
del profármaco se puede invertir de modo que un bloque del extremo
C está unido al oligopéptido y el agente terapéutico está unido
directamente o indirectamente al extremo N del oligopéptido.
\vskip1.000000\baselineskip
La trouasa es la enzima que se cree es crítica
para la activación especifica del profármaco en el tejido diana. La
trouasa es una endopeptidasa que muestra un grado notable de
discriminación entre leucina e isoleucina en el lado carboxilo del
sito de escisión del oligopéptido. Una característica definitoria
es que en condiciones de ensayo apropiados, la trouasa fácilmente
escinde la
succinil-(\betaAlaLeuAlaLeu-daunorubicina aunque
es al menos veinte veces menos activa con la
succinil-PAlaIleAlaLeu-daunorubicina.
Se cree que la trouasa está asociada con células
dianas. Muy probablemente se general directamente por las células
dianas o por las células normales que están asociadas con las
células dianas, tales como el tejido estromal o los macrófagos.
Así por ejemplo, la trouasa puede ser secretada o estar presente de
algún otro modo en la vecindad extracelular de la célula diana. En
muchos casos, el profármaco de la invención incluye un agente
terapéutico para el tratamiento de cáncer y la célula diana es una
célula tumoral. Así, la trouasa puede ser secretada
extracelularmente por la célula diana o puede estar presente
extracelularmente porque generalmente hay bastante cantidad de
lisis celular asociada con los tumores. La lisis celular también
está asociada con el tejido inflamatorio que es otro sitio
diana.
Sin embargo la actividad de trouasa es baja en
plasma humano. La actividad de trouasa se ha observado en extractos
de células de carcinoma y en medios acondicionados procedentes de
células de carcinoma, glóbulos rojos y diversos tejidos humanos,
especialmente el riñón. La trouasa de células de carcinoma tiene un
pI aparente de \sim 5,1, un peso molecular por filtración a
través de gel de aproximadamente 68 kD y un óptimo de actividad a pH
neutro. Es inhibida por inhibidores de metaloproteinasas, EDTA y
1,10-fenantrolina pero no por inhibidores de
serina, tiol, o proteinasas ácidas, tales como
aminoetilbenceno-sufonato, E64, pepstatina,
leupeptina, aprotinina, CA074, o fumagilina. Además la trouasa
inactivada por EDTA puede ser reactivada por cationes de cobalto
(50-100 \muM) y manganeso (50-1000
\muM) pero no por cationes de zinc o cúpricos.
Un esquema de purificación parcial de trouasa a
partir de sobrenadante por ultracentrifugación (145.000 x g 30
minutos) de homogeneizado de células HeLa (carcinoma cervical)
consiste en cuatro etapas como sigue:
1. Cromatografía de cambio aniónico usando una
columna 15Q (Pharmacia) eluida con un gradiente lineal de NaCl 0 a
0,5 M en cloruro de trietilamina 20 mM, pH 7,2, Triton
X-100 al 0,01%.
2. Cromatografía de afinidad usando una columna
Chelating Sepharose Fast Flow (Pharmacia)
pre-cargada con CoCl_{2} y eluida con un
gradiente lineal de imidazol 0 a 100 mM en fosfato de sodio 10 mM,
NaCl 0,5 M, pH 7,2, Triton X-100 al 0,01%,
NaN_{3} al 0,02%.
3. Electroforesis natural preparativa
4. Cromatografía de líquidos de alta rendimiento
con filtración por gel usando una columna de 7,8 mm X 60 cm de TSK
Gel G-3000SWXL (TosoHaas) eluida con 0,3 mL/min
fosfato de potasio 50 mM, sulfato de potasio 200 mM, pH 7.2.
La posterior escisión de la porción activa del
profármaco liberado después de la escisión por la trouasa puede
ocurrir intracelularmente o extracelularmente y se cree que es
catalizada por aminoexopeptidasas. Experimentos in vitro
indican que las aminoexopeptidasas de amplias especificidades están
presentes en sangre humana, así como en ambientes de células de
carcinoma.
Una porción importante del profármaco es el
grupo estabilizante, que sirve para proteger al compuesto profármaco
de la degradación en la sangre circulante cuando se administra al
paciente y permite que el profármaco alcance la vecindad de la
célula diana relativamente intacto. El grupo estabilizante protege
al profármaco de la degradación por proteinasas y peptidasas
presentes en la sangre, suero sanguíneo, y tejido normal.
Particularmente, puesto que el grupo estabilizante protege el
extremo terminal N del oligopéptido, y por tanto es denominado un
protector de N o bloqueador de N, sirve para proteger contra las
exopeptidasas a las que el profármaco de otro modo puede ser
susceptible.
El compuesto es menos tóxico in vivo que
el agente terapéutico de partida porque el profármaco no se escinde
en la sangre, el corazón, el cerebro, la médula ósea, la mucosa y
similares. Esta disminución de la toxicidad se aplica en
particular a los efectos agudos, tales como tales como la toxicidad
para la médula ósea y la mucosa, así la posible cardiotoxicidad o
neurotoxicidad.
Idealmente, el grupo estabilizante es útil en el
profármaco de la invención si sirve para proteger al profármaco de
la degradación, especialmente por hidrólisis, cuando se ensaya por
conservación del compuesto profármaco en sangre humana 37ºC durante
2 horas y da como resultado una escisión menor de 20%,
preferiblemente menor del 2%, del profármaco por las enzimas
presentes en la sangre humana en las condiciones de ensayo
dadas.
Los grupos estabilizantes de la invención son
ácido succínico, ácido diglicólico, ácido maleico, ácido
piroglutámico y ácido glutárico.
Adicionalmente, la administración intravascular
de un profármaco cargado positivamente agregante a ratones dio como
resultado una toxicidad aguda. Sin embargo, no se observó dicha
toxicidad cuando la carga de este profármaco se revirtió por
derivatización con un grupo estabilizante cargado negativamente.
Este efecto se analiza con más detalle más adelante.
Por tanto, cuando la agregación del agente
terapéutico es un problema se prefiere que el grupo estabilizante
unido esté cargado negativamente o sea neutro.
Muchos compuestos citotóxicos tienen
inherentemente baja solubilidad. Las antraciclinas cargadas
positivamente por ejemplo forman agregados a alta concentración y
estos agregados inducen coagulación intravenosa cuando dichos
agregados se administran intravenosamente. Los autores de la
presente invención hemos descubierto que la trouasa reconoce un
conjunto específico de secuencias peptídicas hidrófobas. Cuando una
de estas secuencias hidrófobas (por ejemplo,
\beta-Ala-Leu-Ala-Leu)
está conjugada con un compuesto citotóxico (por ejemplo:
doxorubicina), da como resultado un compuesto menos soluble que
forma grandes agregados cuando se encuentra en formulaciones
acuosas para inyección IV (el método preferido de administrar
fármacos anti-cancerosos). Puesto que la mayoría de
los péptidos tienen extremos amino cargados positivamente a pH
fisiológico, estos agregados forman una superficie cargada
poli-positivamente in vivo. Estos agregados
administrados intravenosamente inducían una cascada de coagulación
y la muerte en ratones en pocos minutos (usualmente en menos de 30
minutos) desde la administración. Esto hace inadecuados para uso
terapéutico cualesquiera profármacos cargados positivamente que
estén formulados con suspensión de agregados.
Diversos experimentos apoyan la hipótesis que
los agregados se forman con doxorubicinas conjugadas con péptidos.
El examen de soluciones similarmente formuladas por dispersión con
luz láser y ultrafiltración con exclusión de tamaños demostró que
sólo una pequeña cantidad del material tenía un peso molecular
inferior a 10 kD. La magnitud del peso molecular de los agregados
se encontró que era inferior a alrededor de 70 kD. Cuando a los
animales se les administró concomitantemente (véase el ejemplo 6)
heparina con la dosis IV la toxicidad aguda se redujo grandemente o
se eliminó. Cuando a los animales se les administraron diluciones
diluidas del mismo fármaco (misma dosis total) no se produjo
toxicidad aguda. Estos resultados, considerados juntos con los
informes de la bibliografía, apoyan la conclusión de que los
profármacos peptídicos de compuestos que forman agregados debido a
la insuficiente solubilidad no tienen efectos terapéuticos óptimos.
Una solución a este problema de los agregados hace a los
profármacos peptídicos más prácticos. Cuando estos profármacos
peptídicos forman agregados debido a una insuficiente solubilidad a
las concentraciones formuladas deseadas, el grupo estabilizante en
la cadena peptídica debe terminar en una funcionalidad cargada
negativamente o neutra. El uso de succinilo como grupo
estabilizante en el profármaco peptídico hace al profármaco no
agudamente tóxico (véase el ejemplo 6). Esto resuelve un problema
importante en el uso de profármacos peptídicos como terapias
prácticas para seres humanos.
Puesto que los radicales químicos que tiene más
de dos ácidos carboxílicos también son aceptables como parte del
profármaco, el grupo del extremo que tiene ácidos dicarboxílicos (o
ácidos carboxílicos de orden superior) se define más generalmente
como protegido en el extremo N. El grupo protegido en el extremo N
como se usa en la presente memoria es un derivado de monoamida de
un radical químico que contiene dos o más ácidos carboxílicos en
donde la amida esta unida al extremo amino del péptido y los
restantes ácidos carboxílicos están libres y no acoplados. Para
este fin, el protector en el extremo N es preferiblemente ácido
succínico o ácido glutárico, siendo ácido succínico el más
preferido. Otros ejemplos de protectores en el extremo N útiles en
el compuesto profármaco de la invención incluyen ácido diglicólico
y ácido maleico.
\vskip1.000000\baselineskip
Los oligopéptidos se definen generalmente como
polipéptidos de corta longitud, típicamente de veinte aminoácidos o
menos. Sin embargo un oligopéptido útil en el profármaco de la
invención es de una longitud de al menos cuatro aminoácidos. En el
extremo superior los oligopéptidos de menos de, o igual a, doce
aminoácidos son más útiles, aunque un oligopéptido puede tener una
longitud de cadena mayor que doce aminoácidos y entrar dentro ambos
de la definición del término como es generalmente reconocido en el
campo técnico. Por tanto, la porción de oligopéptido del
profármaco de la invención tiene cuatro a doce aminoácidos
inclusive.
\vskip1.000000\baselineskip
El oligopéptido tiene una fórmula o secuencia
(AA)_{n}-AA^{4}-AA^{3}-AA^{2}-AA^{1},
en donde:
- cada AA independientemente representa cualquier aminoácido genéticamente modificado;
- n es un número entero de 0 a 12;
- AA^{4} representa un aminoácido no genéticamente codificado;
- AA^{3} representa cualquier aminoácido;
- AA^{2} representa cualquier aminoácido; y
- AA^{1} representa cualquier aminoácido.
Esto corresponde a una secuencia de posición
P(n+2)...P2-P1-P1'-P2'.
Se cree que la trouasa escinde entre las
posiciones P1 y P1'.
A menos que se indique otra cosa, todos los
aminoácidos son de la configuración L.
Los aminoácidos preferidos en el oligopéptido
son como sigue:
En la posición P2, uno de los siguientes:
\beta-Alanina, ácido
tiazolidin-4-carboxíco,
2-tienilalanina, 2-naftilalanina,
D-alanina, D-leucina,
D-metionina, D-fenilalanina, ácido
3-amino-3-fenilpropionico,
ácido \gamma-aminobutírico, ácido
3-amino-4,4-difenilbutírico.
También son posibles ácido
tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico,
ácido 4-aminometilbenzoico o ácido
aminoisobutírico en la posición P2.
En la posición P1, uno de los siguientes:
leucina, tirosina, fenilalanina,
p-Cl-fenilalanina,
p-nitrofenilalanina, valina, norleucina, norvalina,
fenilglicina, triptófano, ácido
tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico,
3-piridilalanina, alanina, glicina o
tienilalanina.
También son posibles metionina, valina o
prolina en la posición P1.
En la posición P1', uno de los siguientes:
alanina, leucina, tirosina, glicina, serina,
3-piridilalanina o
2-tienilalanina.
Son también posibles ácido aminoisobutírico,
treonina o fenilalanina.
En la posición P2', uno de los siguientes:
leucina, fenilalanina, isoleucina, alanina, glicina, tirosina,
2-naftilalanina o serina.
También es posible
\beta-alanina en la posición P2'.
Los oligopéptidos usados en el profármaco de la
invención son: DAlaThi\betaAla\betaAlaLeuAlaLeu (SEQ ID NO:
1), Thi\betaAla\betaAlaLeuAlaLeu (SEQ ID NO: 2),
\betaAla\betaAlaLeuAlaLeu (SEQ ID NO: 3), \betaAlaAlaAlaIle
(SEQ ID NO: 4), \betaAlaAlaAlaLeu (SEQ ID NO: 5),
\betaAlaPheTyrLeu (SEQ ID NO: 6), \betaAlaPheThrPhe (SEQ ID
NO: 7), \betaAlaPheGlyIle (SEQ ID NO: 8), \betaAlaPheGlyLeu
(SEQ ID NO: 9), \betaAlaPhePhePhe (SEQ ID NO: 10),
\betaAlaPhePheIle (SEQ ID NO: 11), \betaAlaPhePheLeu (SEQ ID
NO: 12), \betaAlaPheAlaIle (SEQ ID NO: 13), \betaAlaPheAlaLeu
(SEQ ID NO: 14), Thi
GlyAlaLeu (SEQ ID NO: 15), NalGlyAlaLeu (SEQ ID NO: 16), \betaAlaLeuTyrLeu (SEQ ID NO: 17), \betaAlaLeuThiLeu (SEQ ID NO: 18), \betaAlaLeuThrPhe (SEQ ID NO: 19), \betaAlaLeuThrIle (SEQ ID NO: 20), \betaAlaLeuThrLeu (SEQ ID NO: 21), \betaAlaLeuSerLeu (SEQ ID NO: 22), \betaAlaLeuPyrLeu (SEQ ID NO: 23), \betaAlaLeuLeuLeu (SEQ ID NO: 24), \betaAlaLeuGlyPhe (SEQ ID NO: 25), \betaAlaLeuGlyIle (SEQ ID NO: 26), ThiLeuGlyLeu (SEQ ID NO: 27), \betaAlaLeuGly
Leu (SEQ ID NO: 28), AibLeuGlyLeu (SEQ ID NO: 29), \betaAlaLeuPheIle (SEQ ID NO: 30), \betaAlaLeuPheLeu (SEQ ID NO: 31), \betaAlaLeuAibLeu (SEQ ID NO: 32), \betaAlaLeuAlaAla (SEQ ID NO: 33), \betaAlaLeuAla\betaAla (SEQ ID NO: 34), \betaAlaLeuAlaPhe (SEQ ID NO: 35), \betaAlaLeuAlaGly (SEQ ID NO: 36), \betaAlaLeuAlaIle (SEQ ID NO: 37), \betaAlaLeuAlaLeu (SEQ ID NO: 38), TicLeuAlaLeu (SEQ ID NO: 39), ThzLeuAlaLeu (SEQ ID NO: 40), Thi
LeuAlaLeu (SEQ ID NO: 41), NaIleuAlaLeu (SEQ ID NO: 42), NAALeuAlaLeu (SEQ ID NO: 43), D-LeuLeu
AlaLeu (SEQ ID NO: 44), D-AlaLeuAlaLeu (SEQ ID NO: 45), D-MetLeuAlaLeu (SEQ ID NO: 46), APPLeu
AlaLeu (SEQ ID NO: 47), AmbLeuAlaLeu (SEQ ID NO: 48), \betaAlaLeuAlaNal (SEQ ID NO: 49), \betaAlaLeuAlaSer (SEQ ID NO: 50), \betaAlaLeuAlaTyr (SEQ ID NO: 51), \betaAlaMetTyrPhe (SEQ ID NO: 52), \betaAlaMetTyrLeu (SEQ ID NO: 53), \betaAlaMetGlyIle (SEQ ID NO: 54), ThiMetGlyLeu (SEQ ID NO: 55), \betaAlaMetPhePhe (SEQ ID NO: 56), \betaAlaMetPheIle (SEQ ID NO: 57), TicMetAlaLeu (SEQ ID NO: 58), NaIMetAlaLeu (SEQ ID NO: 59), NAA
MetAlaLeu (SEQ ID NO: 60), \betaAlaMetAlaLeu (SEQ ID NO: 61), APPMetAlaLeu (SEQ ID NO: 62), \betaAlaNleTyrIle (SEQ ID NO: 63), \betaAlaNleTyrLeu (SEQ ID NO: 64), \betaAlaNleThrIle (SEQ ID NO: 65), \betaAlaNleThrLeu (SEQ ID NO: 66), \betaAlaNleGlyPhe (SEQ ID NO: 67), \betaAlaNleGlyIle (SEQ ID NO: 68), \betaAlaNleGlyLeu (SEQ ID NO: 69), \betaAlaNlePheIle (SEQ ID NO: 70), \betaAlaNleAlaIle (SEQ ID NO: 71), \betaAlaNleAlaLeu (SEQ ID NO: 72), \betaAlaNleAla
Phe (SEQ ID NO: 73), \betaAlaNvaAlaLeu (SEQ ID NO: 74), \betaAlaPheTyrIle (SEQ ID NO: 75), ThiProGlyLeu (SEQ ID NO: 76), ThiProAlaLeu (SEQ ID NO: 77), NalProAlaLeu (SEQ ID NO: 78), \betaAlaProAlaLeu (SEQ ID NO: 79), \betaAlaPhe(CI)AlaLeu (SEQ ID NO: 80), \betaAlaPhe(NO_{2})AlaIle (SEQ ID NO: 81), \betaAlaPhe(NO_{2})AlaLeu (SEQ ID NO: 82), \betaAlaPhgAlaLeu (SEQ ID NO: 83), \betaAlaPyrAlaLeu (SEQ ID NO: 84), TicThrGlyLeu (SEQ ID NO: 85), \betaAlaThiGlyIle (SEQ ID NO: 86), \betaAlaThiAlaLeu (SEQ ID NO: 87), \betaAlaTicAlaIle (SEQ ID NO: 88), \betaAlaTicAlaLeu (SEQ ID NO: 89), \betaAlaValAlaLeu (SEQ ID NO: 90), \betaAlaTrpAlaLeu (SEQ ID NO: 91), \betaAlaTyrTyrPhe (SEQ ID NO: 92), \betaAlaTyrTyrIle (SEQ ID NO: 93), \betaAlaTyrTyrLeu (SEQ ID NO: 94), \betaAlaTyrThrLeu (SEQ ID NO: 95), \betaAlaTyrPheLeu (SEQ ID NO: 96), \betaAlaTyrGlyIle (SEQ ID NO: 97), ThiTyrGlyLeu (SEQ ID NO: 98), \betaAlaTyrGlyLeu (SEQ ID NO: 99), \betaAlaTyrPheIle (SEQ ID NO: 100), \betaAlaTyrAlaIle (SEQ ID NO: 101), ThiTyrAlaLeu (SEQ ID NO: 102), y \betaAlaTyrAlaLeu (SEQ ID NO: 103).
GlyAlaLeu (SEQ ID NO: 15), NalGlyAlaLeu (SEQ ID NO: 16), \betaAlaLeuTyrLeu (SEQ ID NO: 17), \betaAlaLeuThiLeu (SEQ ID NO: 18), \betaAlaLeuThrPhe (SEQ ID NO: 19), \betaAlaLeuThrIle (SEQ ID NO: 20), \betaAlaLeuThrLeu (SEQ ID NO: 21), \betaAlaLeuSerLeu (SEQ ID NO: 22), \betaAlaLeuPyrLeu (SEQ ID NO: 23), \betaAlaLeuLeuLeu (SEQ ID NO: 24), \betaAlaLeuGlyPhe (SEQ ID NO: 25), \betaAlaLeuGlyIle (SEQ ID NO: 26), ThiLeuGlyLeu (SEQ ID NO: 27), \betaAlaLeuGly
Leu (SEQ ID NO: 28), AibLeuGlyLeu (SEQ ID NO: 29), \betaAlaLeuPheIle (SEQ ID NO: 30), \betaAlaLeuPheLeu (SEQ ID NO: 31), \betaAlaLeuAibLeu (SEQ ID NO: 32), \betaAlaLeuAlaAla (SEQ ID NO: 33), \betaAlaLeuAla\betaAla (SEQ ID NO: 34), \betaAlaLeuAlaPhe (SEQ ID NO: 35), \betaAlaLeuAlaGly (SEQ ID NO: 36), \betaAlaLeuAlaIle (SEQ ID NO: 37), \betaAlaLeuAlaLeu (SEQ ID NO: 38), TicLeuAlaLeu (SEQ ID NO: 39), ThzLeuAlaLeu (SEQ ID NO: 40), Thi
LeuAlaLeu (SEQ ID NO: 41), NaIleuAlaLeu (SEQ ID NO: 42), NAALeuAlaLeu (SEQ ID NO: 43), D-LeuLeu
AlaLeu (SEQ ID NO: 44), D-AlaLeuAlaLeu (SEQ ID NO: 45), D-MetLeuAlaLeu (SEQ ID NO: 46), APPLeu
AlaLeu (SEQ ID NO: 47), AmbLeuAlaLeu (SEQ ID NO: 48), \betaAlaLeuAlaNal (SEQ ID NO: 49), \betaAlaLeuAlaSer (SEQ ID NO: 50), \betaAlaLeuAlaTyr (SEQ ID NO: 51), \betaAlaMetTyrPhe (SEQ ID NO: 52), \betaAlaMetTyrLeu (SEQ ID NO: 53), \betaAlaMetGlyIle (SEQ ID NO: 54), ThiMetGlyLeu (SEQ ID NO: 55), \betaAlaMetPhePhe (SEQ ID NO: 56), \betaAlaMetPheIle (SEQ ID NO: 57), TicMetAlaLeu (SEQ ID NO: 58), NaIMetAlaLeu (SEQ ID NO: 59), NAA
MetAlaLeu (SEQ ID NO: 60), \betaAlaMetAlaLeu (SEQ ID NO: 61), APPMetAlaLeu (SEQ ID NO: 62), \betaAlaNleTyrIle (SEQ ID NO: 63), \betaAlaNleTyrLeu (SEQ ID NO: 64), \betaAlaNleThrIle (SEQ ID NO: 65), \betaAlaNleThrLeu (SEQ ID NO: 66), \betaAlaNleGlyPhe (SEQ ID NO: 67), \betaAlaNleGlyIle (SEQ ID NO: 68), \betaAlaNleGlyLeu (SEQ ID NO: 69), \betaAlaNlePheIle (SEQ ID NO: 70), \betaAlaNleAlaIle (SEQ ID NO: 71), \betaAlaNleAlaLeu (SEQ ID NO: 72), \betaAlaNleAla
Phe (SEQ ID NO: 73), \betaAlaNvaAlaLeu (SEQ ID NO: 74), \betaAlaPheTyrIle (SEQ ID NO: 75), ThiProGlyLeu (SEQ ID NO: 76), ThiProAlaLeu (SEQ ID NO: 77), NalProAlaLeu (SEQ ID NO: 78), \betaAlaProAlaLeu (SEQ ID NO: 79), \betaAlaPhe(CI)AlaLeu (SEQ ID NO: 80), \betaAlaPhe(NO_{2})AlaIle (SEQ ID NO: 81), \betaAlaPhe(NO_{2})AlaLeu (SEQ ID NO: 82), \betaAlaPhgAlaLeu (SEQ ID NO: 83), \betaAlaPyrAlaLeu (SEQ ID NO: 84), TicThrGlyLeu (SEQ ID NO: 85), \betaAlaThiGlyIle (SEQ ID NO: 86), \betaAlaThiAlaLeu (SEQ ID NO: 87), \betaAlaTicAlaIle (SEQ ID NO: 88), \betaAlaTicAlaLeu (SEQ ID NO: 89), \betaAlaValAlaLeu (SEQ ID NO: 90), \betaAlaTrpAlaLeu (SEQ ID NO: 91), \betaAlaTyrTyrPhe (SEQ ID NO: 92), \betaAlaTyrTyrIle (SEQ ID NO: 93), \betaAlaTyrTyrLeu (SEQ ID NO: 94), \betaAlaTyrThrLeu (SEQ ID NO: 95), \betaAlaTyrPheLeu (SEQ ID NO: 96), \betaAlaTyrGlyIle (SEQ ID NO: 97), ThiTyrGlyLeu (SEQ ID NO: 98), \betaAlaTyrGlyLeu (SEQ ID NO: 99), \betaAlaTyrPheIle (SEQ ID NO: 100), \betaAlaTyrAlaIle (SEQ ID NO: 101), ThiTyrAlaLeu (SEQ ID NO: 102), y \betaAlaTyrAlaLeu (SEQ ID NO: 103).
\vskip1.000000\baselineskip
La porción del oligopéptido del profármaco
incluye un aminoácido de bloqueo como AA^{4} de la secuencia de
oligopéptido, es decir en la posición P2 de la secuencia de
posiciones, de acuerdo con el esquema de numeración descrito
anteriormente. El aminoácido de bloqueo es un aminoácido no
codificado genéticamente.
La función del aminoácido de bloqueo en la
posición P2 es mantener la selectividad para la escisión del
profármaco por trouasa e inhibir la escisión del oligopéptido por
otras enzimas en esa porción del oligopéptido más estrechamente
unida (unida directamente o indirectamente) a la porción del agente
terapéutico del compuesto profármaco. Más particularmente
colocando un aminoácido de bloqueo en la posición P2, se reduce la
escisión indeseable dentro de los enlaces peptídicos de los cuatro
aminoácidos de la secuencia del oligopéptido
AA^{4}-AA^{3}-AA^{2}-AA^{1}
y la secuencia de posiciones
P2-P1-P1'-P2'. Se
cree que la trouasa escinde entre las posiciones P1 y P1' posiciones
del oligopéptido. Puesto que se sabe que la sangre y las células
normales están asociadas con una variedad de peptidasas, colocar un
aminoácido de bloqueo en la posición P2 sirve para proteger la
porción del oligopéptido del profármaco in vivo hasta que el
profármaco esté en la vecindad de la célula diana. Específicamente
al colocar un aminoácido de bloqueo en la posición P2, se cree que
se protege al oligopéptido de escisión indeseable entre P2 y P1.
Sin el aminoácido de bloqueo el profármaco podría ser vulnerable
tanto a las exopeptidasas como a las endopeptidasas presentes en
la sangre y en tejido normal, pudiendo ambas clases de enzimas
degradar por otra parte el profármaco antes de que alcanzara su
diana. El Ejemplo 2 que se facilita más adelante ilustra este
importante aspecto del profármaco.
\vskip1.000000\baselineskip
Los agentes terapéuticos que son particularmente
útiles para la modificación con el fin de obtener una forma
profármaco de acuerdo con invención son los que poseen una estrecha
ventana terapéutica. Un fármaco o agente terapéutico con una
estrecha ventana terapéutica es uno en el cual la dosis en la que es
evidente la toxicidad, por técnicas médicas estándares, es
demasiado próxima a la dosis en la que es evidente la eficacia.
El agente terapéutico conjugado con el grupo
estabilizante y el oligopéptido y, opcionalmente el grupo enlazador
para formar el profármaco de la invención puede ser útil para el
tratamiento de cánceres, enfermedades inflamatorias o algún otra
estado médico. Preferiblemente, el agente terapéutico se selecciona
de la siguiente clase de compuestos: agentes alquilantes, agentes
anti-proliferantes, agentes de unión a tubulina,
alcaloides de vinca, enediinas, podofilotoxinas o derivados de
podofilotoxinas, la familia de fármacos de pteridina, taxanos,
antraciclinas, dolastatinas, inhibidores de topoiosomerasa y
cis-platinos.
Particularmente, el agente terapéutico se
selecciona ventajosamente de los siguientes compuestos:
doxorubicina, daunorubicina, vinblastina, vincristina,
caliqueaamicina, etopósido, fosfato de etopósido,
CC-1065, duocarmicina, KW-2189,
metotrexato, metopterina, aminopterina, diclorometotrexato,
docetaxel, paclitaxel, epitiolono, combretastatina, fosfato de
combretastatina A_{4}, dolastatina 10, dolastatina 11, dolastatina
15, topotecan, camptotecina, mitomicina C, porfiromicina,
5-fluoracilo, 6-mercaptopurina,
fludarabina, tamoxifeno, arabinósido de citosina, arabinósido de
adenosina, colchicina, carboplatino, mitomicina C, bleomicina,
melfalan o uno de sus derivados o análogos.
Un grupo enlazador entre el oligopéptido y el
agente terapéutico puede ser ventajoso por razones tales como las
siguientes:
- 1.
- Como un espaciador por consideraciones estéricas para facilitar la liberación enzimática de los aminoácidos AA^{1}.
- 2.
- Para proporcionar una química de unión apropiada entre el agente terapéutico y el oligopéptido.
- 3.
- Para mejorar el proceso sintético de preparar el conjugado del profármaco (por ejemplo, pre-derivatizando el agente terapéutico o el oligopéptido con el grupo enlazador antes de la conjugación para mejorar el rendimiento o la especificidad).
- 4.
- Para mejorar las propiedades físicas del profármaco.
- 5.
- Para proporcionar un mecanismo adicional para la liberación intracelular del fármaco.
Las estructuras del agente enlazador están
dictadas por la funcionalidad requerida. Ejemplos de productos
químicos enlazadores potenciales son hidrazida, éster, éter y
sulfhidrilo. El ácido aminocaproico es un ejemplo de grupo
enlazador bifuncional. Cuando se usa el ácido aminocaproico en el
grupo enlazador, no es contado como un aminoácido en el esquema de
numeración del oligopéptido.
La invención también incluye una composición
farmacéutica que comprende un compuesto, particularmente un
compuesto profármaco, de acuerdo con invención y, un adyuvante o
vehículo farmacéuticamente aceptable.
La invención se refiere también al uso de la
composición farmacéutica para la preparación de un producto
medicinal destinado al tratamiento de un estado médico.
La composición farmacéutica puede ser
administrada al paciente, por ejemplo, parenteralmente,
especialmente intravenosamente, intramuscularmente o
intraperitonealmente. Las composiciones farmacéuticas de la
invención para administración parenteral comprenden soluciones,
suspensiones o emulsiones acuosas o no acuosas estériles. Como
disolvente o vehículo farmacéuticamente aceptable se pueden emplear
propilenglicol, polietilenglicol, ésteres orgánicos inyectables,
por ejemplo oleato de etilo o ciclodextrinas. Estas composiciones
también pueden comprender agentes humectantes, emulsionantes y/o
dispersantes.
La esterilización se puede realizar de varios
modos, por ejemplo usando un filtro bacteriológico, por
incorporación de agentes esterilizantes en la composición o por
irradiación. Las composiciones también pueden prepararse en la
forma de composiciones sólidas estériles que se pueden disolver en
el momento de su uso en agua estéril o cualquier otro medio
inyectable estéril.
La composición farmacéutica también puede
comprender adyuvantes que son bien conocidos en la técnica (por
ejemplo, vitamina C, agentes antioxidantes, etc.) y capaces de ser
usados en combinación con el compuesto de la invención para mejorar
y prolongar el tratamiento del estado médico para el cual se
administran.
Las dosis para la administración a un paciente
de los compuestos de acuerdo con la invención son generalmente al
menos las dosis usuales del agente terapéutico conocidas en la
técnica, descritas en Bruce A. Chabner y Jerry M. Collins,
Cancer Chemotherapy, Lippincott Ed., ISBN
0-397-50900-6 (1990)
o pueden ser ajustadas, dentro del criterio del médico encargado
del tratamiento, para acomodarla a la superior eficacia de las
formulaciones del profármaco o a las circunstancias particulares
del paciente que se trata. Las dosis administradas varían por
tanto de acuerdo con el agente terapéutico usado para la
preparación del compuesto de acuerdo con la invención.
Se describe también un método para el
tratamiento terapéutico de un estado médico que comprende
administrar, especialmente parenteralmente o intravenosamente, a
un paciente una dosis terapéuticamente eficaz de la composición
farmacéutica.
El compuesto profármaco es útil para el
tratamiento de muchos estados médicos incluyendo cáncer,
enfermedades neoplásicas, tumores, enfermedades inflamatorias y
enfermedades infecciosas. Ejemplos de enfermedades preferidas son
cáncer de mama, cáncer colo-rectal, cáncer de
hígado, cáncer de pulmón, cáncer de próstata, cáncer de ovarios,
cáncer de cerebro, y cáncer de páncreas. El compuesto profármaco
formulado en vehículos farmacéuticamente aceptables (tales como
solución salina isotónica), puede ser administrado a animales o
seres humanos en dosis intravenosas que varían desde 0,05
mg/kg/dosis/día a 300 mg/kg/dosis/día. También se puede administrar
en forma de un goteo intravenoso u otro método de infusión
lenta.
Los receptores usuales del profármaco de la
invención son pacientes humanos, aunque también se considera el uso
veterinario.
Las secuencias de péptidos u oligopéptidos de
los conjugados de profármaco de esta invención pueden ser
sintetizadas por métodos de síntesis de péptidos en fase sólida
(usando la química Boc o Fmoc) o por síntesis en fase de solución.
Los métodos generales Boc y Fmoc se usan ampliamente y están
descritos en las siguientes referencias: Merrifield, J. A. Chem.
Soc., 88:2149 (1963); Bodanszky y Bodanszky, The Practice of
Peptide Synthesis, Springer-Verlag,
Berlin, 7-161 (1994); Stewart, Solid Phase
Peptide Synthesis, Pierce Chemical, Rockford, (1984).
Usando el método de síntesis en fase sólida
preferido automatizado o manual, se sintetiza un péptido de longitud
y secuencia deseadas a través de la adición por etapas de
aminoácidos a una cadena en crecimiento que está unida a una fase
sólida. Ejemplos de resinas compatibles con Fmoc útiles incluyen,
pero sin limitación, resina Wang, resina HMPA-PEGA,
resina ácida de Rink, o una resina de
hidroxietil-fotoenlazador. El extremo C de la
cadena peptídica se une covalentemente a una resina polímera y se
añaden de un modo por etapas los
\alpha-aminoácidos protegidos con un reactivo de
acoplamiento. Un grupo protector de \alpha-amino
preferido es el grupo Fmoc, que es estable en condiciones de
acoplamiento y puede eliminarse fácilmente en condiciones alcalinas
suaves. Los disolventes de reacción son preferiblemente, pero sin
limitación, DMF, NMP, DCM, MeOH y EtOH. Ejemplos de agentes de
acoplamiento son: DCC, DIC, HATU y HBTU. La escisión del grupo
protector del extremo N se consigue en piperidina al 10 - 100% en
DMF a 0 - 40ºC, siendo preferida la temperatura ambiente. Al final
de la síntesis el grupo protector Fmoc final se separa usando el
método de escisión en el extremo N. El péptido restante sobre la
resina se escinde la resina junto con cualesquiera grupos
protectores de cadenas laterales sensibles a los ácidos tratando
la resina en condiciones ácidas. Por ejemplo un agente de escisión
ácido es una mezcla de ácido trifluoroacético (TFA) en
diclorometano. Si se usa la resina de
hidroxietil-fotoenlazador, la longitud de onda
apropiada para inducir la escisión es luz ultravioleta de longitud
de onda \lambda = 365 nm. Una representación esquemática de este
proceso se da en la Figura 3.
La preparación de péptidos derivatizados en el
extremo N se consigue convenientemente en fase sólida. Cuando la
síntesis del péptido es completa se separa el Fmoc terminal mientras
el péptido está todavía en el soporte sólido. El protector del
extremo N de elección se acopla a continuación usando condiciones
estándares de acoplamiento de péptidos en el extremo N del péptido.
Una vez completado el acoplamiento del protector del extremo N, el
péptido se escinde la resina usando el método descrito
anteriormente.
Para el método en fase sólida usando el química
con Boc, es útil la resina de Merrifield o la resina de PAM. Los
aminoácidos se acoplan a la cadena en crecimiento en fase sólida por
adiciones sucesivas de aminoácidos protegidos con Boc con un agente
de acoplamiento activado. Ejemplos de agentes de acoplamiento son:
DCC, DIC, HATO y HBTU. Los disolventes de reacción pueden ser DMF,
DCM, MeOH, y NMP. La escisión del grupo protector Boc se consigue
en TFA al 10 - 100% en DCM a 0 - 40ºC, prefiriéndose la temperatura
ambiente. Tras completarse el ensamblamiento conjunto de la cadena
peptídica se separa el grupo protector del extremo N (usualmente
Boc) como se ha descrito antes. El péptido se separa de la resina
usando HF líquido o ácido trifluorometano-sulfónico
en diclorometano.
Alternativamente, el compuesto intermedio
profármaco-péptido puede ser preparado mediante una
síntesis en fase de solución, utilizando química de Boc o Fmoc. En
la presentación esquemática de los métodos (Figura 4), el
tetrapéptido con Leu en el extremo C se usa generalmente como
ejemplo, pero ha de entenderse que pueden realizarse también
reacciones similares con otros tetrapéptidos
C-terminales. El péptido puede ser acumulado en el
ensamblaje por etapas de modo análogo al del método en fase sólida
(en la dirección N-terminal o en la dirección
C-terminal) o a través del acoplamiento de dos
dipéptidos adecuadamente protegidos o un tripéptido con un solo
aminoácido.
Un método de síntesis en fase de solución es una
acumulación etapa a etapa del compuesto intermedio
profármaco-péptido usando química Fmoc, se muestra
en la Figura 4. El extremo C debe ser protegido para reducir la
formación de productos secundarios. El grupo R en el extremo C en
la Figura 4 es Me, tBu, bencilo o TCE. (Adviértase cuando que
cuando el protector de N es metil-succinilo el
grupo R en el extremo C no puede ser metilo). Aunque se da como
disolvente DMF, pueden usarse en su lugar otros disolventes tales
como DMSO, CH_{3}CN o NMP (o sus mezclas). La piridina, Et_{3}N
u otras bases pueden usarse en lugar de piperidina en desproteger el
extremo amino protegido de la cadena peptídica en crecimiento.
Similarmente, aunque se da HBTU en el diagrama anterior como agente
activante, se pueden usar otros agentes activantes tales como DCC,
DIC, DCC + HOBt, OSu, ésteres activados, azida o
trifenil-fosforil-azida.
Adicionalmente, se puede usar el péptido protegido con cloruro de
ácido o bromuro de ácido para acoplar directamente al aminoácido o
fragmento peptídico. Al completarse el ensamblamiento se desprotege
el extremo N del oligopéptido y el péptido protegido en el extremo C
está listo para aceptar la protección de extremo N.
Cuando se construye el oligopéptido protegido en
el extremo N mediante síntesis en fase de solución, el extremo
protegido en el extremo N necesita ser sintetizado por un método
ligeramente modificado (Figura 4). Primeramente el extremo C del
Fmoc-oligopéptido necesita ser protegido con un
grupo protector lábil a los ácidos o sensible a la hidrogenación
compatible con la desprotección selectiva del extremo C sobre el
extremo N. Luego el grupo protector Fmoc necesita ser separado del
oligopéptido para revelar el extremo N. Con el extremo N
desprotegido y el extremo C protegido, el oligopéptido se hace
reaccionar con el hemiéster activado del protector de N deseado. El
protector de N se puede activar usando métodos para activar
aminoácidos tales como DCC o HATU en base y un disolvente
apropiado. Alternativamente, cuando se usa hemisuccinato de metilo,
el acoplamiento también se puede hacer vía cloruro de
hemisuccinato de metilo (u otro haluro de ácido) (Figura 4) usando
un disolvente inerte en presencia de una base orgánica o inorgánica,
tales como DIEA, trietilamina o Cs_{2}CO_{3}. Un ejemplo de
dicha síntesis puede ser haciendo reaccionar hemisuccinato de metilo
y éster bencílico del oligopéptido 38 (véase la Figura 10A). El
método de acoplamiento puede ser uno cualquiera de los métodos
generalmente usados en la técnica (véanse por ejemplo: Bodanszky,
M., The Practice of Peptide Synthesis, Springer Verlag, 185
(1984); Bodanszky, M., Principies of Peptide Synthesis, Springer
Verlag, 159 (1984). Luego se puede separar el grupo bencilo por
hidrogenación catalítica proporcionando la forma de
metil-succinilo protegida en el extremo N del
oligopéptido 38. Otros ejemplos de grupos protectores del C terminal
selectivamente separables adecuados, pueden ser, pero sin
limitación, tBu, alcoxi-metilo y TCE. Otros métodos
de conseguir esta etapa se describen en la literatura técnica.
Cualquier combinación del método anterior puede
considerarse, tal como "condensación de fragmentos" de
di-, o tri-péptidos. Las condiciones de reacción
son bien conocidas en la técnica y están detalladas en las citas
dadas. La ventaja de los métodos antes descritos es la fácil
purificación del producto producido por síntesis en fase de
solución.
La forma protegida en el extremo N del
oligopéptido-agente terapéutico (conjugados del
profármaco) descrita en esta invención se puede sintetizar
acoplando una forma Fmoc (que significa que Fmoc está unido al
extremo N del oligopéptido) del oligopéptido con daunorubicina o
cualquier agente terapéutico apropiado usando los reactivos
activantes estándares usados en la síntesis de péptidos. El
disolvente puede ser tolueno, acetato de etilo, DMF, DMSO,
CH_{3}CN, NMP, THF, DCM o cualquier otro disolvente inerte
adecuado como es conocido en la técnica y los reactivos son
solubles en él. Los disolventes preferidos son DMF y NMP. El
intervalo de temperatura apropiado es -25 a +25ºC, prefiriéndose la
temperatura ambiente. El agente activante se puede seleccionar de
uno de los siguientes: de PyBOP, HBTU, HATU, EDC, DIC, DCC,
DCC+HOBT, OSu, ésteres activados, azida o trifenilfosforilazida. El
agente activante preferido es HBTU o HATU. Alternativamente, se
puede usar también para esta reacción de acoplamiento el cloruro de
ácido o el bromuro de ácido del péptido protegido. Para la reacción
de acoplamiento se requieren 2-4 equivalentes,
ventajosamente 2-2,5 equivalentes de una base. La
base se puede seleccionar de bases inorgánicas tales como
CsCO_{3}, Na o K_{2}CO_{3}, o bases orgánicas, tales como
TEA, DIEA, DBU, DBN, DBO, piridina, piridinas sustituidas,
N-metil-morfolina etc.,
preferiblemente TEA o DIEA. La reacción se puede llevar a cabo a
temperaturas entre -15ºC y 50ºC, ventajosamente entre -10ºC y 10ºC.
El tiempo de reacción está entre 5-90 minutos y
ventajosamente es 20-40 minutos. El producto se
aísla vertiendo la mezcla de reacción en agua y filtrando el
precipitado formado. El producto bruto se puede purificar
adicionalmente por recristalización en DCM, THF, acetato de etilo o
acetonitrilo, preferiblemente en diclorometano o acetonitrilo. La
forma Fmoc aislada del conjugado
oligopéptido-agente terapéutico se desprotege luego
durante 2-90 minutos, preferiblemente
3-8 minutos, usando un exceso de diez a cien veces
de base a una temperatura entre -10ºC y 50ºC. Idealmente se
prefieren 5-60 equivalentes de la base. La
piperidina es la base preferida para desproteger los grupos Fmoc.
El extremo amino desprotegido del conjugado
oligopéptido-agente terapéutico se acila con un
anhídrido de diácido como hemi-éster activado para dar la forma
protegida en el extremo N final del
oligopéptido-agente terapéutico (profármaco).
Alternativamente, el profármaco final se puede
preparar similarmente a partir de la forma protegida en el extremo
N del oligopéptido, tal como una forma de hemiéster metílico de
oligopéptido protegido en el extremo N con succinilo y conjugado a
un agente terapéutico. Este método se ilustra en la Figura 6. El
oligopéptido-agente terapéutico protegido en el
extremo N se desprotege ahora por métodos compatibles para la
estabilidad del agente terapéutico. Por ejemplo, para las
antraciclinas los autores del invento protegimos con un grupo metilo
y desprotegimos con una esterasa. Para otros agentes terapéuticos
para desproteger podríamos seleccionar grupos protectores bencilo e
hidrogenación catalítica.
La forma sal del oligopéptido protegido en el
extremo N-agente terapéutico se prepara con un
disolvente seleccionado del grupo siguiente: alcohol (incluyendo
metanol, etanol o isopropanol), agua, acetonitrilo,
tetrahidrofurano, diglima u otros disolventes polares. La fuente de
sodio es un equivalente molar de NaHCO_{3}, NaOH,
Na_{2}CO_{3}, NaOAc, NaOCH_{3} (en general alcóxido de sodio)
o NaH. Una columna de cambio aniónico cargada con Na^{+} (tal
como cambiadores iónicos fuertes o débiles) también es útil para
esta última etapa de preparar la forma sal de oligopéptido
protegido en el extremo N- agente terapéutico cuando sea apropiado.
El sodio se describe en esta aplicación solo como un ejemplo.
Cualquier sal farmacéuticamente aceptable se puede usar para
protectores de N cargados negativamente.
Generalmente, el profármaco se puede convertir
en una forma de sal farmacéuticamente aceptable para mejorar la
solubilidad de dicho profármaco. El oligopéptido protegido en el
extremo N-agente terapéutico se neutraliza con una
sal farmacéuticamente aceptable por ejemplo, NaHCO_{3},
Na_{2}CO_{3}, NaOH tris(hidroximetil)aminometano,
KHCO_{3}, K_{2}CO_{3}, CaCO_{3}, NH_{4}OH,
CH_{3}NH_{2}, (CH_{3})_{2}NH,
(CH_{3})_{3}N, acetiltrietilamonio. La forma sal
preferida del profármaco es la de sodio y la sal neutralizante
preferida es NaHCO_{3}.
Está bien documentado que las moléculas de tipo
antraciclinas, incluyendo doxorubicina y daunorubicina forman sales
en disolventes orgánicos en concentraciones muy bajas (Matzanke, B.
F., et al., Eur. J. Biochem.,
207:747-55 (1992); Chales, J. B., et al.,
Biochemistry, 21:3927-32 (1982); Hayakawa,
E., et al.; Chem. Pharm. Bull.
39:1282-6 (1991). Los autores de la presente
invención hemos encontrado que esto es un obstáculo considerable
para conseguir altos rendimientos de producto puro cuando se
preparan conjugados de péptido-antraciclina. La
formación de gel contribuye a la formación de reacciones secundarias
indeseables. Un modo de minimizar este problema es usar soluciones
muy diluidas (1-2%) para la reacción de
acoplamiento, sin embargo, esto no es práctico en un ambiente de
proceso (grandes cantidades de residuos, aislamiento complicado).
Para superar este problema hemos inventado un método en donde se
usan urea y otros agentes caotrópicos para romper las fuertes
fuerzas de unión hidrófobas y por puentes de hidrógeno que forman el
gel. Por tanto, si la reacción de acoplamiento se realiza en un
disolvente que contiene urea, ventajosamente 20% hasta solución
saturada de urea en DMF o NMP, las reacciones secundarias pueden
mantenerse por debajo del 2% incluso si la concentración de
reaccionantes excede del 10%. Este invención hace que sea práctica
la etapa de conjugación a altas concentraciones y produce buenos
rendimientos y pureza mejorada sobre los métodos que no usan urea ni
otros agentes caotrópicos.
\vskip1.000000\baselineskip
La hidrólisis de oligopéptido protegido en el
extremo N-agente terapéutico hasta el compuesto
totalmente protegido en el extremo N catalizada por ácidos o bases
conduce a una mezcla de reacción compleja debido a la labilidad de
muchos agentes terapéuticos incluso en condiciones moderadamente
ácidas o básicas. Los inventores hemos encontrado que las enzimas
pueden promover la hidrólisis sin destruir el sustrato o el
producto. Las enzimas adecuadas para esta reacción se pueden
seleccionar de esterasas, lipasas y pueden estar en sus formas
naturales, solubles en agua o inmovilizadas por acoplamiento
cruzado, o unión a materiales de soporte sólidos comercialmente
disponibles De las enzimas solubles evaluadas es especialmente útil
la lipasa de Candida Antarctica "B" (Altus
Biologics). Ejemplos de enzimas inmovilizadas por acoplamiento
cruzado es ChiroCLEC-PC^{TM} (Altus Biologics).
La lipasa de Candida Antarctica "B" Altus
Biologics) se puede inmovilizar por reacción con
Sepharose^{TM} 4 Fast Flow (American Pharmacia Biotech)
activada con NHS. El pH de la mezcla de reacción durante la
hidrólisis se controla cuidadosamente y se mantiene pH fijo entre
5,5 y 7,5, ventajosamente entre 5,7 y 6,5, mediante la adición
controlada de solución de NaHCO_{3}. Cuando se completa la
reacción el producto se aísla por liofilización de la mezcla de
reacción filtrada. Las enzimas inmovilizadas permanecen sobre la
torta de filtración y, si se desea, se pueden reutilizar.
\vskip1.000000\baselineskip
El profármaco también puede prepararse mediante
acoplamiento de la forma hemi-ésteres de alilo de oligopéptido
protegido en el extremo N con un agente terapéutico y luego
liberando el ácido libre del conjugado. La Figura 8 ilustra este
proceso con
Sucinil-\betaAla-Leu-Ala-Leu
y doxorubicina.
El acoplamiento de
alil-sucinil-\betaAla-Leu-Ala-Leu
con doxorubicina se puede llevar a cabo mediante uno de los métodos
de conjugación de oligopéptidos.
La
alil-sucinil-\betaAla-Leu-Ala-Leu-doxorubicina
también puede ser sintetizada haciendo reaccionar hemisuccinato de
alilo, que se preparó por métodos conocidos (Casimir, J. R., et.
al., Tet. Lett. 36/19 3409 (1995)), con
\beta-Ala-Leu-Ala-Leu-doxorubicina
similarmente como se describió el acoplamiento de los precursores
del tetrapéptido protegido con la doxorubicina en los métodos
previos. Los disolventes inertes adecuados son THF, diclorometano,
acetato de etilo, tolueno, preferiblemente THF a partir del cual
precipita la forma ácido del producto a medida que progresa la
reacción. El ácido aislado se convierte en su sal sódica como se ha
descrito antes. Los tiempos de reacción varían entre
10-180 minutos, ventajosamente 10-60
minutos, a temperaturas entre 0-60ºC,
preferiblemente 15-30ºC.
La separación del grupo alilo puede realizarse
con Pd (0), o Ni(0), ventajosamente el Pd(0) promovió
la transferencia del grupo alilo a las moléculas aceptoras, como es
bien conocido en la técnica y documentado en la literatura
profesional (Genet, J-P, et al., Tet.
Lett., 50, 497, 1994; Bricout, H., et. al Tet.
Lett., 54:1073 (1998), Genet, J-P. et.
al. Synlett, 680 (1993); Waldmann, H., et. al.,
Bioorg. Med. Chem., 7:749 (1998); Shaphiro, G., Buechler,
D., Tet. Lett., 35:5421 (1994)). La cantidad de catalizador
puede ser 0,5-25% en moles respecto al
sustrato.
El profármaco también se puede sintetizar
mediante el método mostrado en la Figura 7. Este enfoque utiliza un
R'-tetrapéptido, en donde R' es tritilo o tritilo
sustituido. El acoplamiento del R'-tetrapéptido con
un agente terapéutico se puede realizar mediante uno de los métodos
descritos antes para conjugación de un oligopéptido protegido con
un agente terapéutico a 30-120 minutos a
0-20ºC.
La separación del grupo tritilo o tritilo
sustituido se puede conseguir en condiciones ácidas para dar el
profármaco cargado positivamente. Este profármaco cargado
positivamente está protegido en N como se ilustra en la Figura 4 y
se describe anteriormente. La desprotección del tritilo se puede
conseguir con ácido acético, ácido fórmico y ácido clorhídrico
diluido.
El profármaco se puede convertir en el agente
terapéutico succinil- o glutaril-oligopéptido 38
haciéndolo reaccionar con anhídrido succínico. El agente
terapéutico succinil- o glutaril-oligopéptido 38 se
puede convertir en cualquier sal farmacéuticamente aceptable. El
disolvente para la etapa de acoplamiento DMF, DMSO, CH_{3}CN,
NMP, o cualquier otro disolvente adecuado es conocido en la
técnica.
El compuesto profármaco de la presente invención
se puede sintetizar usando química de fase sólida mediante métodos
de dirección "por etapas" inverso (a partir del
N-terminal hasta el C-terminal).
Un modo es usar resinas para inmovilizar
hemiéster succinílico, por ejemplo éster
succinil-mono-bencílico o éster
alílico. Ejemplos de resinas que podrían ser seleccionadas son
"Resina de Wang" (Wang, S. S., J. Am. Chem. Soc.,
95:1328 (1973); Zhang, C, Mjaili, A. M. M., Tet. Lett,.
37:5457(1996)), "Resinas de Rink" (Rink, H., Tet.
Let., 28:3787 (1987)), "Resina de tritilo o tritilo
sustituido", (Chen, C., et. al., J. Am. Chem.
Soc., 116:2661 (1994); Bartos, K. et. al., Peptides.
Proc. 22^{nd} European Peptide Symposium (1992); Schneider,
C. H.; Eberle, A. N. (Eds.), ESCOM. Leiden, pp. 281 (1993).
El éster inmovilizado se desprotege luego y se hace reaccionar con
\beta-alanina similarmente protegida en el C
terminal. Estas etapas se repiten luego con leucina, alanina, y
finalmente ésteres de leucina seguido por el acoplamiento de
doxorubicina al succinil-tetrapéptido inmovilizado.
La molécula se libera luego de la resina usando condiciones ácidas
suaves para formar Suc-oligopéptido
38-doxorubicina libre. Esta metodología se
representa en el esquema de la Figura 9. Otra versión de la
síntesis en fase sólida sería cuando el éster
succinil-tetrapéptido está inmovilizado. Luego se
desprotege C-terminalmente, seguido por la etapa de
acoplamiento a la doxorubicina y finalmente se libera de la resina
como se representa en el esquema de la Figura 9. La forma ácida de
la molécula de profármaco se convierte finalmente en su sal de
sodio como se ha descrito antes.
Compuestos de la invención incluyen los
profármacos,
Suc-\betaAla-Leu-Ala-Leu-Dox,
Suc-\betaAla-Leu-Ala-Leu-Dnr,
y
Glutaril-\betaAla-Leu-Ala-Leu-Dox.Dox,
Adicionalmente, son importantes para el proceso
de preparación de los profármacos de la invención los siguientes
compuestos intermedios:
\betaAla-Leu-Ala-Leu-Dox
Trityl-\betaAla-Leu-Ala-Leu-Dox
Difenilmetil-\betaAla-Leu-Ala-Leu-Dox
Benciloxicarbonil-\betaAla-Leu-Ala-Leu-Dox
Fmoc-\betaAla-Leu-Ala-Leu-OBn
\betaAla-Leu-Ala-Leu-OBn
Metil-sucinil-\betaAla-Leu-Ala-Leu-OBn,
Metil-sucinil-\betaAla-Leu-Ala-Leu,
Fmoc-\betaAla-Leu-Ala-Leu,
Fmoc-Thi-Tyr-Gly-Leu,
Fmoc-\betaAla-Leu-Ala-Leu-Dnr,
Fmoc-Thi-Tyr-Gly-Leu-Dnr
Suc-Thi-Tyr-Gly-Leu-Dnr
Gl-\betaAla-Leu-Ala-Leu-Dox
Lactato de
\betaAla-Leu-Ala-Leu-Dox
Alil-sucinil-\betaAla-Leu-Ala-Leu-Dox
Suc-\betaAla-Leu-Ala-Leu
Ésteres metílicos de
Suc-\betaAla-Leu-Ala-Leu
Fmoc-\betaAla-Leu-Ala-Leu-Dox
Metil-sucinil-\betaAla-Leu-Ala-Leu-Dox,
y
Hemi-sucinato de alilo.
Ejemplo
1
Basándose en los análisis por HPLC de los
productos de digestión, la activación de
peptidil-toxina a toxina libre tiene lugar por
medio de una serie de reacciones de escisión catalizadas por
enzimas. Por ejemplo, la tetrapeptidil protegido en el extremo
N-toxina,
succinil-\beta-alanil-leucil-alanil-leucil-doxorubicina,
se convierte en leucil-doxorubicina en extractos de
células de carcinoma o medios acondicionados de células de
carcinoma en dos etapas catalizadas por al menos dos enzimas. La
escisión inicial por endopeptidasa tiene lugar entre los
aminoácidos AA^{3} (P1) y AA^{2} (P1') proporcionando la
alanil-leucil-doxorubicina.
Posteriormente, la exopeptidasa separa la alanina dando
leucil-doxorubicina que se sabe que es absorbida por
las células en las que se libera la toxina activa,
doxorubicina.
Un buen candidato para el profármaco peptidil
protegido en el extremo N-toxina de mayor índice
terapéutico debe ser activado por las células cancerígenas pero ser
relativamente estable en la sangre humana completa. Se utilizaron
tres preparaciones diferentes de carcinoma para escrutar las
diversas peptidil protegido en el extremo
N-toxinas. Estas tres preparaciones fueron las
siguientes:
- (a)
- homogeneizado de células MCF 7/6 (carcinoma de mama)
- (b)
- medios acondicionados de MCF 7/6 (carcinoma de mama), y
- (c)
- mezcla de fracciones de intercambio aniónico de extracto de células HeLa (carcinoma cervical).
Los compuestos que podían ser hidrolizados dando
un conjugado de toxina y un solo aminoácido se volvieron a analizar
para determinar la estabilidad en la sangre humana completa.
Las muestras de ensayo se incubaron a 37ºC
durante 2 horas con las tres preparaciones diferentes de la enzima
de carcinoma y con la sangre completa, extraída con acetonitrilo, y
analizada por HPLC, utilizando detección por fluorescencia. Con
pocas excepciones, los resultados de la escisión catalizada por
enzimas de carcinoma fueron los mismos para una fracción
parcialmente purificada a partir de células HeLa, homogeneizado de
células MFC 7/6 o medios acondicionados de MCF 7/6.
Las células MCF 7/6 se cultivaron hasta
confluencia en un medio exento de suero que contenía DMEM:F 12
(1:1), 50 mg/L de seroalbúmina bovina, ITS-X y
concentrado lipídico. Se recogieron 100 mL de células por
centrifugación a 4ºC y 10.000 x g, durante 20 minutos y se decantó
el líquido sobrenadante. El sedimento se volvió a poner en
suspensión en 2 mL de solución salina tamponada con fosfato
(Gibco) y se volvió a centrifugar a 18.000 x g durante 10
minutos. Después de decantar el líquido sobrenadante, se
homogeneizaron las células (aproximadamente 300 \muL en húmedo)
triturándolas en 1,7 mL de tampón HEPES 10 mM a pH 7,2 (sal sódica).
El homogeneizado se centrifugó a 18.000 x g a 4ºC durante 5 minutos
y el líquido sobrenadante se dividió en partes alícuotas y se
conservó a \leq -20ºC para un uso posterior en el escrutinio del
compuesto.
Las células MCF 7/6 se cultivaron hasta
confluencia en medio DMEM/F 12 (1:1) que contenía suero bovino fetal
al 10%, L-glutamina al 0,05% (p/v), 250 UI/mL de
penicilina y 100 \mug/mL de estreptomicina. A continuación las
células se lavaron dos veces con solución salina tamponada con
fosfato y se incubaron 24 hora en CO_{2} al 5%, a 37ºC, en
DMEMIF12 (1:1), BSA al 0,02% e ITSX. A continuación se decantaron
los medios acondicionados y utilizando una aparato de células
agitadas provisto de una membrana de ultrafiltración YM10 (límite de
exclusión de peso molecular 10.000) (Millipore), se
intercambiaron una vez con tampón HEPES 10 mM, a pH 7,2 y se
concentraron veinte veces. Esta solución se conservó en partes
alícuotas a -20ºC para utilizar en el escrutinio del compuesto.
Treinta mil millones de células HeLa producidas
comercialmente (carcinoma cervical humano, Computer Cell Culture
Center, Seneffe, Bélgica) se homogeneizaron en un equipo de
ultrasonidos y con un homogeneizador Dounce en 108 mL de solución
acuosa de lisis. La solución de lisis contenía Triton
X-100 al 0,02% p/v, azida de sodio al 0,04% p/v y
un cóctel de inhibidores de proteasa (2 comprimidos/50 mL de
Complete^{TM}, comprimidos exentos de EDTA, Roche Molecular
Biochemicals). El homogeneizado celular se centrifugó 30 minutos
a 4ºC a 5000 x g y el sedimento se homogeneizó en otros 108 mL de
solución de lisis utilizando un homogeneizador Dounce y se
centrifugó como anteriormente. Se reunieron los líquidos
sobrenadantes y se centrifugaron durante 90 minutos a 60.000 x g a
4ºC.
Una porción del líquido sobrenadante de la
ultracentrifugación se diluyó dos veces con un tampón de
trietanolamina.HCl 20 mM a pH 7,2 que contenía Triton
X-100 al 0,01% (p/v) y azida de sodio al 0,02% (p/v)
(tampón de equilibrado). 30 mL de la solución resultante,
correspondiente a aproximadamente 180 mg de proteína, se cargaron (1
ml/minuto) a 4ºC en una columna cromatográfica de intercambio
aniónico a baja presión Source^{TM} 15Q (Amersham Pharmacia
Biotech) de 2,6 x 9,4 cm. A continuación se lavó la columna con
250 ml del tampón de equilibrado y un caudal de 1 mL/minuto. Las
proteínas se eluyeron en un gradiente de concentración lineal de
NaCl (0-0,5 M en el tampón de equilibrado, el
volumen total del gradiente fue 1000 ml) a un caudal de 3 mL/minuto.
Se recogieron fracciones cada dos minutos y se utilizaron para la
determinación de la actividad enzimática usando como sustrato
\beta-alanil-leucil-alanil-leucil-doxorubicina.
Su transformación en
L-alanil-L-leucil-doxorubicina
se cuantificó por cromatografía de líquidos de alta resolución en
fase inversa utilizando la detección por fluorescencia del resto de
antraciclina. Se mezclaron las fracciones que contenían los mayores
niveles de actividad (fracciones nº 43-46; NaCl
\sim0,13 M), complementadas con inhibidores de proteasa
(Complete^{TM}, comprimidos exentos de EDTA, Roche Molecular
Biochemicals) y se conservaron en partes alícuotas a -80ºC.
La sangre humana se recogió usando tubos
comerciales para la recogida de la sangre completa con citrato
tamponado con ácidos.
Los compuestos de ensayo se incubaron durante 2
horas a 37ºC a una concentración de 12,5 \mug/mL con las
siguientes soluciones enzimáticas:
- a)
- homogeneizado de células MFC 7/6 diluido 1:27 en HEPES 10 mM, CoCl_{2} 1 mM, a pH 7,2
- b)
- medios acondicionados de MFC 7/6
- c)
- mezcla 1 de fracciones del intercambio aniónico de células HeLa diluida 1:57 en HEPES 10 mM, CoCl_{2} 1 mM a pH 7,2.
- d)
- sangre humana completa que contenía CoCl_{2} 1 mM
Después de la incubación, se añadieron tres
volúmenes de acetonitrilo para detener la reacción y separar la
proteína de la mezcla. La muestra se centrifugó a 18.000 g durante 5
minutos y se mezclaron 100 \muL del líquido sobrenadante con 300
\muL de agua antes del análisis por HPLC.
Para el análisis por HPLC se inyectaron 50
\muL de la muestra en una columna cromatográfica TSK
Super-ODS de 2 \mum, 4,6 x 50 mm a 40ºC y se
eluyó 3 minutos con un gradiente lineal desde 26% a 68% de
acetonitrilo en tampón de acetato de amonio acuoso 20 mM a pH 4,5 y
a 2 mL/min. La detección se realizó por fluorescencia usando una
longitud de onda de excitación de 235 nm y una longitud de onda de
emisión de 560 nm.
Los oligopéptidos que fueron escindidos por la
trouasa en las condiciones dadas y eran estables en la sangre
humana se muestran en las Figuras 10A-10C.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
La especificidad se consigue por incorporación
de un aminoácido no codificado genéticamente en lugar de un
aminoácido codificado genéticamente en la posición P2.
Específicamente, la (protección en el extremo N con
succinilo)-(oligopéptido 38)-daunorubicina, que
contenía el aminoácido no codificado genéticamente
\beta-alanina en la posición P2, se incubó
durante 2 horas a 37ºC con cada una de las preparaciones enzimáticas
preparadas como se ha descrito en el Ejemplo 1. A continuación se
estimó el grado de escisión analizando por HPLC las mezclas
resultantes. Estos resultados se compararon con los resultados
obtenidos con las mismas incubaciones realizadas con el mismo
compuesto excepto que en la posición P2 se encontraba el aminoácido
genéticamente codificado L-alanina. El grado
(índice) de escisión por el homogenizado celular era 1,3 veces mayor
con el compuesto con L-alanina en la posición P2
que con el compuesto con \beta-alanina en la
posición P2. El grado de escisión por el medio acondicionado era
aproximadamente igual en los dos compuestos. Sin embargo, con la
preparación de trouasa parcialmente purificada, el grado de escisión
del compuesto con L-alanina en la posición P2 era
sólo 0,6 veces el del compuesto con \beta-alanina
en la posición P2. Estos resultados sugieren que la presencia de
L-alanina en la posición P2 puede haber
proporcionado un segundo sitio de escisión para las mezclas de
enzimas más en bruto; reduciendo así la probabilidad de que, in
vivo, la liberación del fármaco activo estaría localizada en el
tejido tumoral.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
El conjugado (protección en el extremo N con
succinilo)-(oligopéptido 38)-agente terapéutico Dox
ha demostrado ser eficaz en la inhibición del desarrollo de
tumores humanos en diversos modelos de xenoinjerto en ratones
atímicos, incluyendo el tumor de mama MCF-7/6
dependiente de estrógenos y los carcinomas
colo-rectales resistentes a adriamicina CXF280/10 y
LS-174T. Por ejemplo, cuando grupos de 10 ratones
con tumores LS 174T implantados por vía subcutánea se trataron
semanalmente con cinco dosis intravenosas del conjugado (protección
en el extremo N con succinilo)-(oligopéptido
38)-agente terapéutico Dox, se observó una
significativa extensión replicable dependiente de la dosis en los
valores medios de los días de supervivencia (VMDS), así como una
disminución del tamaño del tumor (volumen del tumor) en comparación
con los controles tratados con vehículos (Grupo 1) a las dosis de
57 (Grupo 2), 64 (Grupo 3) y 71 (Grupo 4) mg/kg del conjugado
(protección en el extremo N con succinilo)-(oligopéptido
38)-agente terapéutico Dox, siendo la mayor dosis
equivalente a 40 mg/kg de doxorubicina (véase la Figura 11). El
fármaco era inocuo y bien tolerado a niveles de dosis repetidas y
frecuencias de dosificación que demostraron eficacia
anti-tumoral. Se observó alguna pérdida de peso
corporal dependiente de la dosis. En estudios de apoyo, no se
observaron toxicidad en el riñón ni mielosupresión a dosis de hasta
106,8 mg/kg del conjugado (protección en el extremo N con
succinilo)-(oligopéptido 38)-agente terapéutico
Dox.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Se pudieron administrar dosis significativamente
mayores del conjugado (protección en el extremo N con
succini-
lo)-(oligopéptido 38)-agente terapéutico Dox, en comparación con la doxorubicina, consiguiendo una eficacia sin toxicidad significativa en el modelo de xenoinjerto de carcinoma colo-rectal humano LS-174T. El conjugado (protegido en el extremo N con succinilo (Grupo 5))-(oligopéptido 38)-agente terapéutico Dox, a dosis eficaces de 49 (Grupo 3), 57 (Grupo 4) y 64 mg/kg (Grupo 5) mostró una eficacia superior en comparación con la de doxorubicina a 3,0 mg/kg (Grupo 2) y solución salina (Grupo 1), en inhibir el tumor LS-174T de crecimiento rápido, resistente a adriamicina (Figura 12). Se observó la toxicidad limitante de la dosis (cardiotoxicidad y mielosupresión) administrando repetidamente doxorubicina a 3 mg/kg o superior (Grupo 2). Así los autores de la presente invención demostramos que pueden administrarse mayores dosis del conjugado (protección en el extremo N con succinilo)-(oligopéptido 38)-agente terapéutico Dox, que de doxorubicina, favoreciendo la inhibición del tumor sobre la toxicidad sistémica.
lo)-(oligopéptido 38)-agente terapéutico Dox, en comparación con la doxorubicina, consiguiendo una eficacia sin toxicidad significativa en el modelo de xenoinjerto de carcinoma colo-rectal humano LS-174T. El conjugado (protegido en el extremo N con succinilo (Grupo 5))-(oligopéptido 38)-agente terapéutico Dox, a dosis eficaces de 49 (Grupo 3), 57 (Grupo 4) y 64 mg/kg (Grupo 5) mostró una eficacia superior en comparación con la de doxorubicina a 3,0 mg/kg (Grupo 2) y solución salina (Grupo 1), en inhibir el tumor LS-174T de crecimiento rápido, resistente a adriamicina (Figura 12). Se observó la toxicidad limitante de la dosis (cardiotoxicidad y mielosupresión) administrando repetidamente doxorubicina a 3 mg/kg o superior (Grupo 2). Así los autores de la presente invención demostramos que pueden administrarse mayores dosis del conjugado (protección en el extremo N con succinilo)-(oligopéptido 38)-agente terapéutico Dox, que de doxorubicina, favoreciendo la inhibición del tumor sobre la toxicidad sistémica.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Se ha demostrado que los fármacos de
antraciclina poco solubles forman agregados cuando se preparan en
tampones acuosos. Menozzi, et al.,
Self-association of doxorubicin and related
compounds in aqueous solutions, J. Pharmaceut. Sci.,
73(6):766-770 (1984). Confalonieri, C. et
al., The use of new laser particle sizer and shape analyser
to detect and evaluate gelatinous microparticles suspended in
reconstituted anthracycline infusion solutions, J. Pharmaceut.
Biomed. Anal., 9(1):1-8 (1991). Se
realizó una estimación del tamaño del agregado
\betaAlaLeuAlaLeu-Dox en una solución acuosa de
17,4 \mumol/ml intentando filtrar estas soluciones a través de
unidades de filtración Amicon Centricon^{TM}. Se disolvieron por
separado doxorubicina (17,4 \mumol/ml) y
\betaAlaLeuAlaLeu-Dox (17,4 \mumol/ml) en agua
destilada y se colocaron en filtros Centricon con un límite de
exclusión de peso molecular (abreviadamente MWCO por la expresión
inglesa molecular weight cutoff) de 3.000, 10.000, 30.000 y
50.000. Cada unidad filtrante se centrifugó durante 2 horas a 1500
g. La cantidad de fármaco retenida y la que pasaba a través del
filtró se cuantificó a \lambda 475 nm y se convirtió en
porcentaje. La Tabla 1 siguiente muestra que el 81% de la
doxorubicina pasaba el filtro de 3.000 MWCO mientras que sólo el 5%
del conjugado, \betaAlaLeuAlaLeu-Dox pasaba a
través del filtro de 3.000 de MWCO. Los datos también muestran que
la unidad de 50.000 MWCO retiene más del 40% del
\betaAlaLeuAlaLeu-Dox. Estos datos demuestran que
un porcentaje significativo de agregados de
\betaAlaLeuAlaLeu-Dox tenían un tamaño mayor que
50 kD (>50 moléculas/agregado).
Esto demuestra que a la dosis especificada en el
Ejemplo 6, siguiente, el conjugado estaba en estado agregado. Por
consiguiente, estos datos apoyan la hipótesis de que los agregados
del conjugado oligopéptido 38-agente terapéutico
doxorubicina, contribuyen a la toxicidad aguda observada en estos
agregados moleculares cargados positivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Se sabe que se produce probablemente una
toxicidad aguda por la interacción de polímeros cargados
positivamente, tales como protaminas, polilisina o sus agregados, y
la superficie luminal de los vasos sanguíneos. DeLucia III, A.,
et al., Efficacy and toxicity of differently charged
polycationic protamine-like peptides for heparin
anticoagulation reversal, J. Vasc. Surg.
18:49-60 (1993). Ekrami, H. M. and Shen, W. C.,
Carbamylation decreases the cytotoxicity but not the
drug-carrier properties of polylysines, J. Drug
Targ., 2:469-475 (1995). Se ha demostrado
además que la heparina reduce los efectos tóxicos del sulfato de
protamina en el miocardio de conejo. Wakefield, T. W., et
al., Heparin-mediated reductions of the toxic
effects of protamine sulfate on rabbit myocardium, J. Vasc.
Surg., 16:47-53 (1992). Para demostrar la
hipótesis de que la toxicidad aguda observada en la presente
invención era debida a los agregados de los profármacos cargados
positivamente, se administró
\betaAlaLeuAlaLeu-Dox (174 \mumol/mL) a ratones
después de un tratamiento previo de 1 hora con 4.000 U.I. de
heparina por vía intravenosa (IV) en comparación con el control
(IV). La Tabla 2 muestra que después de la heparina, una dosis
anteriormente agudamente letal de
\betaAlaLeuAlaLeu-Dox era significativamente
menos tóxica.
Estos datos apoyan la hipótesis de que la
toxicidad aguda es debida a un agregado cargado positivamente que
provoca un efecto similar al observado con las protaminas o
polilisina. Los profármacos cargados negativamente y con carga
neutra de la invención no presentan este efecto secundario
indeseable.
\vskip1.000000\baselineskip
De acuerdo con la hipótesis antes mencionada, la
protección del grupo amino terminal de
\betaAlaLeuAlaLeu-Dox con un resto cargado
negativamente dio como resultado la desaparición completa del efecto
de toxicidad aguda a niveles de dosis tan elevadas como 250 mg de
doxorubicina. HCl eq./Kg.
Como prueba de esto, en un experimento
relacionado, todos los animales sobrevivieron hasta 8 días cuando se
trataron por vía intravenosa de tres a cinco ratones por grupo con
un bolo por vía IV de 250 mg/kg (Dox.HCl eq.) de
succinil-\betaAlaLeuAlaLeu-Dox y
glutaril-\betaAlaLeuAlaLeu-Dox.
Las secuencias peptídicas, sintetizadas por
métodos en fase sólida o en solución, se utilizaron sin más
purificación si la HPLC analítica (métodos A, B y D) mostró que el
producto en bruto tenía una pureza superior al 80%. Si no era así,
el material se purificó por el Método C de HPLC preparativa.
Los análisis por HPLC analítica se realizaron en
un sistema Waters 2690 utilizando una columna C-18
(4 \mum, DI 3,9 x 150 mm, caudal 1 mL/min) eluyendo con un
gradiente de disolvente A (TFA al 0,1%/H_{2}O) y disolvente B
(TFA al 0,1%/ACN) y los datos se procesaron a \lambda 254 nm
usando el sistema Waters Millennium. El gradiente de la HPLC
analítica comenzó con 90% de disolvente A y terminó con 100% de
disolvente B durante un periodo de 14 minutos (lineal). La pureza
de los compuestos para este método y los siguientes se determinó
como el área en porcentaje relativo bajo la curva de los picos.
Los análisis por HPLC analítica se realizaron en
un sistema Waters 2690 utilizando una columna C-8
(3,5 \mum, DI 4,6 x 150 mm, caudal 1 mL/min) eluyendo con un
gradiente de disolvente A (80% de formiato de amonio 20 mM y 20% de
acetonitrilo) y disolvente B (20% de formiato de amonio 20 mM y 80%
de acetonitrilo) y los datos se trataron a \lambda 254 nm usando
el sistema Waters Millennium. El gradiente de la HPLC analítica
comenzó con 100% de disolvente A hasta 100% de disolvente B durante
un periodo de 30 minutos (lineal).
La purificación preparativa de los productos en
bruto se realizó utilizando un sistema Waters Delta Prep 4000 con
una columna C-4 (15 \mum, DI 40 x 100 mm, caudal
30 mL/min) eluyendo con un gradiente de disolvente A (H_{2}O) y
disolvente B (MeOH). El gradiente de la HPLC preparatoria comenzó
con 80% de disolvente A y llegó hasta 100% de disolvente B durante
un periodo de 70 minutos (lineal). Los datos se trataron a \lambda
254 nm usando el sistema Waters Millennium.
La HPLC analítica se realizó en un instrumento
Hewlett Packard utilizando una columna TSK superODS (TosoHaas);
disolvente A (0,1% de TFA en agua); disolvente B (0,1% de TFA en
acetonitrilo); gradiente: 30 a 36% de B en 2 minutos, 36 a 41% de B
en 10 minutos, 41 a 90% de B en 3 minutos, 5 minutos con 90% de B,
longitud de onda de la detección \lambda 254 nm.
Se realizaron determinaciones estructurales
adicionales por técnicas de RMN y EM y los resultados apoyaban los
compuestos reivindicados.
Los análisis por CCF se realizaron en placas de
gel de sílice 60F-254 nm-0,25 mm
(Merck) con una solución al 88% de DCM/MeOH/H_{2}O/ácido fórmico
85/15/1/2 para elución.
Se introdujeron unos cuantos miligramos de
producto en un tubo de ensayo y se añadieron dos gotas de Solución
A (50 mg/mL de ninhidrina en etanol), dos gotas de Solución B (4
mg/mL de fenol en etanol) y a continuación dos gotas de Solución C
(2 mL de KSCN 0,01 M, acuoso en 100 mL de piridina). La mezcla se
dejó en un baño de agua hirviendo durante cinco minutos. En
presencia de una amina libre la solución se volvió púrpura.
La doxorubicina y la daunorubicina fueron
suministradas por Meiji (Japón), el
Pd(PPh_{3})_{4} por Strem Chem (Newburyport, MA),
el PEG por Shearwater (Huntsville, Alabama), los disolventes, HATU
por Aldrich (Milwaukee, WI); todas las resinas y aminoácidos fueron
suministrados por ABI (Foster City, CA), Novabiochem (San Diego,
CA), Advanced ChemTech (Louisville, KY), Peptide International
(Louisville, KY) o SynPep (Dublin, CA).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
La forma Fmoc del oligopéptido 38 (24,34 g, 0,04
mol) se añadió a un matraz de fondo redondo con DMF (350 mL) y un
agitador magnético. Después que se disolvió el tetrapéptido, se
añadió a la solución con agitación bromuro de bencilo (4,76 mL,
0,04 mol), seguido de carbonato de cesio (13,04 g, 0,04 mol). La
mezcla de reacción se agitó a la temperatura ambiente durante 1,5
horas. A continuación, la mezcla de reacción se vertió lentamente
en un matraz con 450 mL de agua con hielo. Se separó por
precipitación una gran cantidad de sólido blanco que se recogió por
filtración con succión. El producto se lavó con agua (2 x 200 mL) y
se colocó en un desecador a vacío. El producto (24,2 g, 87%) se
identificó por HPLC (Pureza: 95%). EM m/z calculado para
C_{40}H_{50}N_{4}O_{7} 698,4, encontrado 699,5.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
8
En un matraz de fondo redondo (25 mL), se
disolvió la forma Fmoc del éster bencílico del oligopéptido 38 (0,7
g, 1,0 mmol) en 5 mL de DMF anhidra. Se añadió piperidina (1,2 mL,
12,1 mmol) a la solución y la mezcla se agitó a la temperatura
ambiente durante 25 minutos. La reacción se detuvo bruscamente con
agua (6 mL) y se extrajo con acetato de etilo (2x10 mL). Las capas
orgánicas reunidas se lavaron otra vez con agua (2 x 5 mL),
salmuera (5 mL) y se secó sobre sulfato de sodio. Después de
eliminar el disolvente se obtuvo un sólido blanco (0,8 g). La
pureza del producto era sólo del 67%. EM m/z calculado para
C_{25}H_{40}N_{4}O_{5} 476,3, encontrado 477,2.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
9
En un matraz de fondo redondo (250 mL), se
disolvió hemisuccinato de metilo (3,19 g, 24,2 mmol) en DMF anhidra
(50 mL). Se añadieron a la solución DIEA (4,22 mL, 24,2 mmol)
seguido por HBTU (9,17 g, 24,2 mmol). La mezcla se agitó a la
temperatura ambiente durante 45 minutos. A esta mezcla se añadió una
solución de éster bencílico del oligopéptido 38 (en bruto, que
contenía 10,14 g, 21,3 mmol) en DMF anhidra (150 mL). La mezcla se
agitó continuamente a la temperatura ambiente durante 2,5 horas. A
continuación, la mezcla de reacción se vertió lentamente con
agitación en un matraz con 200 mL de agua con hielo. Se separó por
precipitación una gran cantidad de sólido blanco que se extrajo con
acetato de etilo (3 x 200 mL). Las capas orgánicas reunidas se
lavaron otra vez con agua (2 x 200 mL), salmuera (200 mL) y se secó
sobre sulfato de sodio. Después de eliminar el disolvente se obtuvo
un sólido blanco. La recristalización de este producto en bruto en
acetato de etilo proporcionó 7,53 g del producto (60%) con una
pureza del 80%. EM m/z calculado para
C_{30}H_{46}N_{4}O_{8} 591,4, encontrado 590,33.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
10
Se introdujo la forma protegida en el extremo N
con metil-succinilo del éster bencílico del
oligopéptido 38 (1,0 g, pureza del 86%; 1,46 mmol) en un matraz
Erlenmeyer con 100 mL de metanol. La solución se enturbió después
de ser agitada durante algunos minutos. Se añadieron 50 mL de
metanol, pero la solución todavía no era transparente. La solución
se transfirió a un recipiente para reacción de hidrogenación. A este
recipiente se añadió Pd-C (90 mg, humedad 10%, agua
50%; 0,042 mmol). Después de hidrogenación durante 2 horas a la
temperatura ambiente, se detuvo la reacción y se filtró el
catalizador. Después de eliminación del disolvente se obtuvo un
sólido blanco (0,77 g, 78%). EM m/z calculado para
C_{23}H_{40}N_{4}O_{8} 501,2, encontrado 500,3.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
11
Esta molécula se preparó según el procedimiento
de Casimir, J. R., et. al. Tet. Lett.
36(19):3409, (1995). Se llevaron a reflujo 10,07 g (0,1 mol)
de anhídrido succínico y 5,808 g (0,1 mol) de alcohol alílico en 100
mL de tolueno durante 6 horas. La mezcla de reacción se concentró a
presión reducida. 15,5 g; 98%. El material resultante era
suficientemente puro para ser usado en las reacciones posteriores.
La pureza e identidad del producto semi-sólido se
confirmó por ^{1}H RMN y ^{13}C RMN y por CL/EM.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
12
En un matraz de fondo redondo (50 ml) se
disolvieron la forma protegida en el extremo N con alilhemisuccinilo
del oligopéptido 38 (1 g, 1,9 mmol) y doxorubicina (1,1 g, 1,9
mmol) en DMF anhidra (50 ml). Después de agitar la mezcla durante 5
minutos, se añadió a la solución DIEA (0,66 ml, 3,8 mmol) seguido de
HATU (0,76 g, 1,9 mmol) y la mezcla se agitó a la temperatura
ambiente durante 2 horas. Se separó la DMF con un evaporador
rotatorio y el residuo se recogió en 4,0 ml de DCM:MeOH 1:1. A esta
solución se añadió lentamente con agitación 100 mL de éter. Se
formó un precipitado rojo que se recogió por filtración con succión.
El sólido se lavó con éter (2 x 2 ml) y se secó en un desecador a
vacío dando el conjugado
alil-succinil-oligopéptido
38-agente terapéutico Dox, con una pureza del 90%
por el Método B de HPLC.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
13
A una solución agitada de 0,1 g (0,095 mmol) de
alil-succinil-\beta-Ala-Leu-Ala-Leu-doxorubicina
en 2 mL de THF, bajo atmósfera de nitrógeno, se añadió 0,05 g
(0,095 mmol) de tetrakis(trifenilfosfina)paladio en
forma sólida. Después de 10 minutos se separó por filtración el
precipitado formado durante la reacción y se lavó con THF. Peso
seco: 0,1 g. Los sólidos fueron identificados por HPLC, ^{1}H RMN,
CL/EM como
succinil-\beta-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
14
La forma Fmoc del oligopéptido 38 se sintetizó
aplicando el método en fase sólida con la química Fmoc estándar.
Una síntesis típica usa la resina alcoxídica de Wang (carga de 0,60
mmol/g). Se usaron aminoácidos protegidos por Fmoc para la síntesis
de péptidos en fase sólida. Para una escala de péptido 1 mM sobre
resina, se pre-activaron 3 equivalentes de
aminoácido con HBTU como agente de activación durante 5 minutos
antes de ser añadidos a la resina junto con 2 equivalentes de DIEA.
La reacción de acoplamiento se realizó durante 2 horas y a
continuación se lavó con DMF (25 mL x 3) y DCM (25 mL x 3). Se
repitió la reacción de acoplamiento usando 2 equivalentes de
aminoácido en condiciones similares. El progreso de la reacción se
controló con el ensayo con ninhidrina y si este ensayo con
ninhidrina indicaba una reacción incompleta después de 2 horas se
repetía por tercera vez la etapa de acoplamiento. Se realizó la
desprotección utilizando piperidina al 20% en DMF durante
15-20 minutos. Se repitió la etapa de acoplamiento
con el siguiente aminoácido hasta que el péptido deseado se ensambló
en la resina. La escisión final del péptido de la resina se realizó
tratando la resina con una solución de TFA al 95% y agua al 5%.
Después de agitar la mezcla de reacción durante 2 horas a la
temperatura ambiente, la resina se filtró a presión reducida y se
lavó dos veces con TFA. Se reunieron los filtrados y el péptido
precipitó añadiendo 400 mL de éter frío. El péptido se filtró a
presión reducida y se secó obteniéndose la forma Fmoc del
oligopéptido 38 (94% de pureza por el método A de HPLC). El péptido
en bruto se usó en la siguiente etapa sin más purificación.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
15
La forma Fmoc del oligopéptido 98 se sintetizó
por un método en fase sólida aplicando la química Fmoc estándar y
resina alcoxídica de Wang (carga de 0,60 mmol/g). Para la síntesis
de péptidos en fase sólida se utilizaron aminoácidos protegidos con
Fmoc y Fmoc-Thi-OH. Para una escala
de péptido 1 mM sobre resina, se preactivaron 3 equivalentes de
aminoácidos con HBTU como agente de activación durante 5 minutos
antes de ser añadidos a la resina junto con 2 equivalentes de DIEA.
La reacción de acoplamiento se realizó durante 2 horas y a
continuación se lavó con DMF (25 mL x 3) y DCM (25 mL x 3). Esta
reacción de acoplamiento se repitió utilizando 2 equivalentes de
aminoácidos en condiciones similares. El progreso de la reacción se
controló utilizando el ensayo con ninhidrina y si este ensayo
indicaba una reacción incompleta después de 2 horas se repetía por
tercera vez la etapa de acoplamiento. Se realizó la desprotección
utilizando piperidina al 20% en DMF durante 15-20
minutos. Se repitió la etapa de acoplamiento con el siguiente
aminoácido hasta que el péptido deseado se ensambló en la resina.
La escisión final del péptido de la resina se realizó tratando la
resina con una solución de TFA al 95% y agua al 5%. Después de
agitar la mezcla de reacción durante 2 horas a la temperatura
ambiente, la resina se filtró a presión reducida y se lavó dos
veces con TFA. Se reunieron los filtrados y el péptido precipitó
añadiendo 400 mL de éter frío. El péptido se filtró a presión
reducida y se secó obteniéndose la forma Fmoc del oligopéptido 38
(88% de pureza por el método A de HPLC). La forma Fmoc en bruto del
oligopéptido 98 se usó en la siguiente etapa sin más
purificación.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
16
Daunorubicina.HCl (185 mg, 0,329 mmol) y la
forma Fmoc del oligopéptido 38 (200 mg, 0,329 mmol) se disolvieron
a la temperatura ambiente en DMF anhidra (15 mL). A esta solución se
añadió agitando rápidamente DIEA (0,115 mL, 0,658 mmol) en una
porción y la mezcla de reacción se agitó durante 15 minutos a la
temperatura ambiente. La mezcla de reacción se enfrió hasta 0ºC en
un baño de hielo y se añadieron lentamente 138 mg (0,362 mmol) de
HATU durante 10 minutos. La mezcla de reacción se agitó durante
otros 90 minutos a la temperatura ambiente. A esta mezcla de
reacción se añadió agua enfriada con hielo (200 mL) que dio como
resultado la formación de un precipitado rojo. El precipitado se
recogió sobre una frita gruesa, se lavó con 3 x 50 mL de agua y 3 x
50 mL de éter dietílico y se secó a presión reducida obteniéndose el
conjugado forma Fmoc del oligopéptido 38-agente
terapéutico Dnr (rendimiento del 94%, pureza del 95% por el método A
de HPLC). Este producto se usó en la siguiente etapa sin más
purificación.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
17
Daunorubicina.HCl (90 mg, 0,16 mmol) y la forma
Fmoc del oligopéptido 98 (120 mg, 0,16 mmol) se disolvieron a la
temperatura ambiente en DMF anhidra (15 mL). A esta solución se
añadió agitando rápidamente DIEA (0,56 mL, 0,16 mmol) en una
porción y la mezcla de reacción se agitó durante 15 minutos a la
temperatura ambiente. La mezcla de reacción se enfrió hasta 0ºC en
un baño de hielo y se añadieron lentamente 61 mg (0,16 mmol) de
HATU durante 10 minutos. La mezcla de reacción se agitó durante
otros 90 minutos a la temperatura ambiente. A esta mezcla de
reacción se añadió agua enfriada con hielo (150 mL) que dio como
resultado la formación de un precipitado rojo. El precipitado se
recogió sobre una frita gruesa, se lavó con 3 x 50 mL de agua y 3 x
50 mL de éter dietílico y se secó a presión reducida obteniéndose el
conjugado forma Fmoc del oligopéptido 38-agente
terapéutico daunorubicina (rendimiento del 94%, pureza del 91% por
el método A de HPLC). Este producto se usó en la siguiente etapa
sin más purificación.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
18
3,0 g (5,17 mmol) de hidrocloruro de
doxorubicina y 3,15 g (5,17 mmol) de
Fmoc-\beta-Ala-Leu-Ala-Leu
se disolvieron a la temperatura ambiente en 230 mL de DMF anhidra
bajo nitrógeno. A esta solución se añadió agitando rápidamente
1,798 mL (10,34 mmol) de DIEA en una porción y la mezcla de reacción
se agitó a la temperatura ambiente durante 15 minutos. La mezcla de
reacción se enfrió hasta \sim -2ºC en un baño de hielo/salmuera y
se añadieron gota a gota agitando rápidamente 2,56 g (6,73 mmol) de
HATU en 58 mL de DMF durante 12 minutos. La mezcla de reacción se
agitó otros 30 minutos a -2ºC y a continuación se añadieron en una
porción 0,285 mL (1,64 mmol) de DIEA. Se añadieron inmediatamente
580 mL de agua a 0ºC dando como resultado la formación de un
precipitado rojo floculento. El precipitado se recogió sobre una
frita de vidrio de porosidad gruesa, se lavó con 3 X 50 mL de agua
y 3 x 50 mL de éter dietílico en agua y se secó al aire 16 horas
obteniéndose 5,21 g de
Fmoc-\beta-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox,
rendimiento físico del 89,7%, pureza del 90,23% por el método B de
HPLC.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
19
A una solución de 5,0 g (4,41 mmol) de
Fmoc-\beta-Ala-Leu-Ala-Leu
en 230 mL de DMF anhidra bajo nitrógeno a la temperatura ambiente,
se añadieron en una porción 21,8 mL (220 mmol) de piperidina dando
como resultado un cambio de color del rojo al morado. La mezcla de
reacción se agitó 5 minutos a la temperatura ambiente y a
continuación se enfrió hasta aproximadamente -20ºC en un baño de
nieve carbónica/acetona. A continuación se añadieron en una porción
22,5 g (0,225 mol) de anhídrido succínico manteniendo la temperatura
ambiente por debajo de -5ºC. Después de agitar durante
aproximadamente 2 minutos de -10ºC a -5ºC, el color cambió del
morado al rojo/anaranjado. Se retiró el baño de enfriamiento y la
mezcla de reacción se agitó durante 10 minutos. A continuación se
redujo el volumen de la mezcla de reacción hasta aproximadamente 100
mL por evaporación rotatoria y a continuación se diluyó con 125 mL
de cloroformo. A esta solución, se añadieron rápidamente 1400 mL de
éter dietílico dando como resultado la formación de un precipitado
rojo. Este precipitado se aisló en una frita de vidrio de porosidad
media y se trituró con 5 X 200 mL de éter dietílico obteniéndose un
material con una pureza del 89,13% por HPLC. El precipitado se lavó
de nuevo con 1 x 20 mL de éter dietílico y se secó al aire
obteniéndose 3,62 g de
succinil-\beta-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox
(rendimiento físico del 81%, pureza del 88,2% por HPLC). Este
material se agitó en 30 mL de agua a 0ºC y se añadieron 33,98 mL
(0,95 eq.) de solución acuosa de NaHCO_{3} 0,1 M y se agitó la
suspensión resultante hasta que se disolvieron todos los sólidos.
Esta solución se liofilizó obteniéndose 3,77 g de
succinil-\beta-Ala-Leu-Ala-Leu-Dox,
(rendimiento físico del 99%, pureza del 89,06% por el método B de
HPLC).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
20
Se añadió piperidina (0,442 mL, 4,48 mmol) a una
solución de la forma Fmoc del oligopéptido 38-agente
terapéutico Dnr (100 mg, 0,089 mmol) en 5 mL de DMF anhidra. La
mezcla de reacción se agitó durante 5 minutos a la temperatura
ambiente y a continuación se enfrió hasta -20ºC en un baño de nieve
carbónica/acetona. A continuación se añadió a la mezcla de reacción
en una porción anhídrido succínico (458 mg, 4,54 mmol). Se agitó
rápidamente la mezcla de reacción a -5ºC durante 5 minutos y a
continuación a la temperatura ambiente durante otros 90 minutos. A
la mezcla de reacción se añadió éter dietílico anhidro, 250 mL, y el
precipitado rojo resultante se aisló en una frita de vidrio de
porosidad media. La torta de filtración se lavó con dos porciones
sucesivas de 50 mL de éter dietílico y se secó a presión reducida
obteniéndose la forma protegida en el extremo N con succinilo del
conjugado del oligopéptido 38- agente terapéutico Dnr (rendimiento
del 80%, pureza del 88% por el método B de HPLC). La CL/EM dio un
peso molecular de 995 (peso molecular esperado 996).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
21
A una solución la forma Fmoc del oligopéptido
98-agente terapéutico daunorubicina, (100 mg, 0,079
mmol) en 5 mL de DMF anhidra, se añadió en una porción piperidina
(0,391 mL, 3,95 mmol) dando como resultado un cambio de color del
rojo al morado. La mezcla de reacción se agitó durante 5 minutos a
la temperatura ambiente y a continuación se enfrió hasta -20ºC en
un baño de nieve carbónica/acetona. A continuación se añadieron a
la mezcla de reacción enfriada en una porción 407 mg (4,02 mmol) de
anhídrido succínico. La mezcla de reacción se agitó rápidamente a
-5ºC durante 5 minutos y a continuación a la temperatura ambiente
durante otros 90 minutos. A la mezcla de reacción se añadió éter
dietílico anhidro, 200 mL, que dio como resultado la formación de
un precipitado rojo. Este precipitado se aisló en una frita de
vidrio de porosidad media, se lavó con 3 x 50 mL de éter dietílico
y se secó a presión reducida obteniéndose la forma protegida en el
extremo N con succinilo del conjugado oligopéptido
98-agente terapéutico Dnr (rendimiento del 80%,
pureza del 81% por el método A de HPLC). La CL/EM dio un peso
molecular de 1141 (peso molecular esperado 1142).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
22
Se añadió piperidina (436 \muL, 4,413 mmol) a
una solución de la forma Fmoc del oligopéptido
38-agente terapéutico Dox (100 mg, 0,088 mmol) en
DMF (4,5 mL). Después de agitar durante 5 minutos a la temperatura
ambiente, la mezcla de reacción se enfrió hasta -5ºC y se añadió
rápidamente anhídrido glutárico (624 mg, 5,472 mmol). Se retiró el
baño frío tan pronto como cambió el color y la mezcla se agitó a la
temperatura ambiente durante otros 10 minutos. Se separó la DMF por
evaporación rotatoria y el residuo se disolvió en cloroformo (2,5
mL). Se añadió éter dietílico (14 mL) y el precipitado resultante
se filtró. La torta de filtración se lavó con éter dietílico, se
secó al aire y a continuación se volvió a poner en suspensión en
agua (14 mL). La sal sódica se formó por adición gota a gota a la
suspensión de NaOH 0,025 M (4 mL, 0,10 mmol) hasta la disolución
completa del sólido. A continuación se liofilizó esta solución
obteniéndose la sal sódica de la forma protegida en el extremo N
con glutarilo del oligopéptido 38-agente terapéutico
Dox, con un rendimiento del 97% y con una pureza del 87% por el
método D de HPLC.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
23
Bajo atmósfera de nitrógeno anhidro se pusieron
en suspensión/disolvieron 26,04 g (52,0 mmol) de la forma protegida
en el extremo N con metil-succinilo del oligopéptido
38 y 23,26 g (40,2 mmol) de hidrocloruro de doxorubicina en 800 mL
de DMF saturada con urea, anhidra (-30% p/v) y 14,8 19,948 mL.
114,16 mmol DIEA. Esta mezcla se enfrió hasta 0-3ºC
durante \sim 25 minutos. En este momento se añadieron 21,2 g (56,0
mmol) de HATU como una solución en \sim100 mL de DMF saturada con
urea durante 10 minutos (el volumen de esta solución debe
mantenerse al mínimo). La mezcla de reacción se agitó durante 10
minutos de -2 a 2ºC y verterse en 4000 mL de salmuera enfriada con
hielo, que contenía 2% v/v de ácido acético durante aproximadamente
cinco minutos con agitación enérgica. El producto se separó por
filtración por un filtro de vidrio sinterizado de porosidad media,
se lavó abundantemente con agua y se secó a presión reducida;
rendimiento físico 43 g: 104,47%, pureza del 93,45% por el método B
de
HPLC.
HPLC.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
24
En un matraz de fondo redondo (50 mL), se
disolvieron la forma protegida en el extremo N con
metil-hemisuccinilo del oligopéptido 38 (0,25 g,
0,5 mmol) y doxorubicina (0,29 g, 0,5 mmol) en DMF anhidra (20 mL).
Después se agitó la mezcla durante 5 minutos y a la solución se
añadió DIEA (0,17 mL, 1,0 mmol) seguido de HBTU (0,19 g, 0,5 mmol).
La mezcla se agitó a la temperatura ambiente durante 4 h. Se separó
la DMF por un evaporador rotatorio y el residuo se recogió en 4,0
mL de cloruro de metileno:metanol 1:1. A esta solución se añadieron
lentamente y con agitación 40 ml de éter. Se formó un precipitado
rojo que se recogió por filtración con succión. El sólido se lavó
con éter (2 x 10 mL) y se secó en un desecador a vacío. Se
obtuvieron 0,50 g de producto (98%) con una pureza
del 96%.
del 96%.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
25
La forma protegida en el extremo N con
metil-succinilo del oligopéptido
38-agente terapéutico Dox (1,0 g, 0,975 mmol) y 100
mL de DMF se introdujeron en un matraz de 500 mL. La suspensión se
agitó enérgicamente con un agitador magnético. Cuando se hubo
disuelto completamente la forma protegida en el extremo N con
metil-succinilo del oligopéptido
38-agente terapéutico Dox se añadieron 400 mL de
agua desionizada y la solución resultante se agitó a 35ºC. Una
suspensión de 1 g de la enzima inmovilizada CLEC-PC
lavada (Altus Biologics) se lavó en tres partes alícuotas de agua
desionizada y a continuación se volvió a poner en suspensión en 10
mL de DMF acuosa al 20% antes de su uso y la suspensión resultante
se agitó a 35ºC con un control periódico por HPLC. Cuando se hubo
consumido toda la forma protegida en el extremo N con
metil-succinilo del oligopéptido
38-agente terapéutico Dox (\sim18 horas), la
mezcla de reacción se filtró por una membrana filtrante de nailon
de 0,45 \muM para separar la enzima CLEC-PC. La
torta de CLEC-PC se lavó con 3 X 10 mL de metanol y
los líquidos de lavado del metanol se reunieron con la mezcla de
reacción filtrada. La mezcla de reacción filtrada más los líquidos
de lavado de metanol se concentraron a continuación hasta obtener
una goma roja en un evaporador rotatorio equipado con una bomba de
alto vacío y un baño de agua a 30ºC. A continuación se puso en
suspensión la goma roja en 50 mL de agua desionizada a la
temperatura ambiente y se agitó rápidamente con un agitador
mecánico. A esta suspensión se añadió durante 2 minutos una solución
de 77,8 mg de bicarbonato de sodio (0,926 mmol, 0,95 eq.) en 100 mL
de agua desionizada. La suspensión se agitó a la temperatura
ambiente durante 20 minutos. La mezcla de reacción se filtró por
una membrana filtrante de nailon de 0,45 \muM y se liofilizó. Se
aislaron 0,936 g de la sal sódica de la forma protegida en el
extremo N con succinilo del oligopéptido 38-agente
terapéutico Dox, rendimiento aproximadamente 100%, pureza del 84%
por el método B de HPLC. Se registraron espectros de ^{1}H y
^{13}CRMN en espectrómetros de 600 y 150 MHz respectivamente y se
realizó una EM por electropulverización, confirmando ambos la
estructura deseada.
\newpage
Ejemplo
26
11,0 g (10,72 mmol) la forma protegida en el
extremo N con metil-succinilo del conjugado
oligopéptido 38-agente terapéutico Dox se pusieron
en suspensión en 800 mL de agua calidad HPLC y se homogeneizó
durante 60 minutos con un homogeneizador Ultraturrax T8
obteniéndose una suspensión finamente dividida. Esta suspensión se
agitó (500 rpm) a 35ºC y se ajustó a pH = 6,05 con NaHCO_{3}
acuoso 76 mM. A continuación se añadió 1,0 g de lipasa de C.
antarctica "B" (Altus Biologics) y la mezcla de reacción se
agitó a 35ºC durante 48 horas. Durante el tiempo de reacción de 48
horas, el pH se mantuvo entre 5,3 y 6,2 por adición periódica de
NaHCO_{3} 76 mM y la reacción se controló periódicamente por
HPLC. Después de 48 horas, la reacción se completó en
aproximadamente 98% confirmado por HPLC. A continuación se ajustó
la mezcla de reacción a pH=7 con NaHCO_{3} acuoso 76 mM y se
filtró a través de una almohadilla de Celite 521. La mezcla de
reacción clarificada se acidificó a continuación hasta
aproximadamente pH 3 con 5 mL de ácido acético glacial dando como
resultado la formación de un precipitado rojo gomoso. El
precipitado se aisló por filtración a través de Celite 521, lavado
posterior de la almohadilla de Celite con metanol, filtración de la
solución de metanol por un filtro de vidrio sinterizado de
10-20 \muM y evaporación rotatoria de la solución
filtrada obteniéndose 7,31 g de producto rojo gomoso. Este producto
se convirtió en la sal sódica por disolución en 70 mL de NaHCO_{3}
76 mM (0,95 eq.) y se liofilizó obteniéndose 7,30 g, rendimiento
físico de la sal sódica de la forma protegida en el extremo N con
succinilo del conjugado oligopéptido 38-agente
terapéutico Dox 66,1%, pureza del 84,5% por HPLC.
El producto era idéntico al del ejemplo
anterior.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
27
Se disolvieron 30,0 g de lipasa de Candida
antarctica "B" (Altus Biologics) en 300 mL de agua y se
dializaron frente a 3 x 4 L de NaHCO_{3} acuoso 50 mM (pH = 6,4).
Después de diálisis, el volumen de la solución dializada era
\sim300 mL. 360 mL de Sepharose 4 Fast Flow activada con
NHS de Pharmacia se introdujeron en un embudo de vidrio sinterizado
de porosidad gruesa y se lavaron con 5 x 450 mL de HCl acuoso 1 mM
enfriado con hielo. A continuación se reunieron la Sepharose
activada por NHS con la solución de enzima dializada. La suspensión
resultante se agitó a la temperatura ambiente (aproximadamente 22ºC)
durante 2,0 horas. A continuación se aisló el conjugado
Sepharose/enzima sobre un filtro de vidrio sinterizado de porosidad
gruesa y a continuación se agitó en 1000 mL de TRIS acuoso 100 mM
(pH = 7,45) durante 15 minutos. Esta suspensión se filtró y se
incubó con otros 1000 mL de tampón TRIS acuoso 100 mM (pH = 7,45) a
4ºC, durante una noche. La enzima inmovilizada por la mañana se
separó por filtración y después de lavado con agua se introdujo en
un matraz de fondo redondo, de tres bocas de 2000 mL. Se añadieron
43 g de la forma protegida en el extremo N con
metil-succinilo del oligopéptido
38-agente terapéutico Dox y los sólidos se pusieron
en suspensión en 800 mL de agua desionizada. El matraz estaba
provisto de un agitador elevado y un dispositivo estabilizador del
pH para mantener el pH de la mezcla de reacción entre
5,9-6,2 por control con una bomba de jeringa. La
bomba de jeringa se cargó de NaHCO_{3} 0,1 M. El progreso de la
reacción se siguió por HPLC. Después de 6 días la enzima
inmovilizada se separó por filtración y se liofilizó la fase
líquida. A continuación se pusieron en suspensión los sólidos
anhidros en \sim11 mL de THF anhidra y se separaron por
filtración. 42,66 g, rendimiento físico 98,34%, pureza 93,43% (254
nm), 94,43% (480 nm) por el método B de HPLC.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
28
Se añadió piperidina (26 mL, 264 mmol) a una
solución de la forma Fmoc del oligopéptido 38-agente
terapéutico Dox, (6,00 g, 5,3 mmol) en DMF (265 mL). Después de
agitar durante 5 minutos a la temperatura ambiente, la mezcla de
reacción se introdujo en un baño de hielo con sal y se añadió
inmediatamente tampón de lactato previamente enfriado (4ºC) al 10%
a pH 3 (600 mL). La solución acuosa se extrajo con DCM (3 x 500 mL)
y las sales en exceso se separaron por extracción en fase sólida.
Se acondicionó gel de sílice en una columna C18
ODS-A (120 g) (500 mL de en metanol, 2 x 500 mL de
agua) en una frita de vidrio y se cargó con la solución acuosa del
producto en bruto, sal lactato. Después de lavar con agua (2 x 500
mL) y secar, la torta de filtración se disolvió en metanol. Se
evaporó el metanol y el residuo se disolvió en agua. La solución
resultante se liofilizó obteniéndose 3,54 g del conjugado sal
lactato del oligopéptido 38-agente terapéutico Dox
(rendimiento 67%, pureza por el método B de HPLC: 89%).
\newpage
Ejemplo
29
Se añadió DIEA (417 \muL, 2,40 mmol) a una
solución de la sal lactato del oligopéptido
38-agente terapéutico Dox (1,200 g, 1,20 mmol) en
DMF (35 mL). Después de agitar durante 15 minutos a la temperatura
ambiente, se añadió anhídrido succínico al 97% (2) (0,144 g, 1,44
mmol). La mezcla se agitó durante 2 horas y se separó la DMF por
evaporación rotatoria. El residuo se disolvió en una mezcla de
CHCl_{3}/CH_{3}OH 4/1 (6 mL) y se añadieron 200 mL de una
mezcla de Et_{2}O/hexano 1/1. Después que la mezcla se agitó
durante 30 minutos, el precipitado se filtró sobre papel
cuantitativo (Whatman 42), se lavó (Et_{2}O/hexano: 1/1) y se secó
al aire. La torta de filtración se puso en suspensión en agua (150
mL) y se añadió gota a gota NaOH 1M (\pm 1,2 eq., 1,5 mL) hasta
su disolución completa (pH = 7,2). La solución se liofilizó
obteniéndose 1,218 g de la forma protegida en el extremo N con
succinilo del oligopéptido 38-agente terapéutico Dox
(rendimiento 97%; pureza por el método B de HPLC: 80,2%.
Se añadió piperidina (2180 \muL, 22,06 mmol) a
una solución de la forma Fmoc del conjugado del oligopéptido
38-agente terapéutico Dox (0,50 g, 0,44 mmol) en DMF
(21,5 mL). Después de agitar durante 5 minutos a la temperatura
ambiente, la mezcla de reacción se enfrió bruscamente hasta -5ºC y
se añadió inmediatamente anhídrido succínico (2,25 g, 22,51 mmol).
Se retiró el baño frío tan pronto como cambió el color y la mezcla
se agitó a la temperatura ambiente durante 10 minutos. Se separó la
DMF por evaporación rotatoria y el residuo se disolvió en cloroformo
(12,5 mL). Se añadió rápidamente éter dietílico (360 mL).
Inmediatamente apareció un precipitado. El precipitado se filtró
por papel Whatman 42 y se lavó con Et_{2}O. El sólido se puso en
suspensión en agua (120 mL; pH = 4,1) y se añadió gota a gota NaOH
0,025M (20 mL, 0,53 mmol) hasta su disolución completa (pH = 7,4). A
continuación se liofilizó esta solución obteniéndose la forma
protegida en el extremo N con succinilo del oligopéptido 38- gente
terapéutico Dox, con un rendimiento del 89% y una pureza del 91% por
el método D de HPLC.
La invención según las reivindicaciones se
refiere por consiguiente a un compuesto profármaco, comprendiendo
dicho compuesto:
- (1)
- un agente terapéutico capaz de entrar en una célula diana,
- (2)
- un oligopéptido de fórmula (AA)_{n}-AA^{4}-AA^{3}-AA^{2}-AA^{1}, en la que:
- cada AA representa independientemente cualquier aminoácido codificado genéticamente,
- n es un número entero de 0 a 12,
- AA^{4} representa un aminoácido no codificado genéticamente,
- AA^{3} representa cualquier aminoácido,
- AA^{2} representa cualquier aminoácido, y
- AA^{1} representa cualquier aminoácido,
- (3)
- un grupo estabilizante que impide la escisión de dicho oligopéptido por las enzimas presentes en la sangre completa, y
- (4)
- opcionalmente, un grupo enlazador no escindible por trouasa,
en el que el oligopéptido está unido
directamente al grupo estabilizador en un primer sitio de unión del
oligopéptido y AA^{1} del oligopéptido está unido directamente al
agente terapéutico en un segundo sitio de unión del
oligopéptido;
siendo el compuesto escindido selectivamente por
una enzima asociada a la célula diana.
La invención según las reivindicaciones se
refiere además a un método para disminuir la toxicidad de un agente
terapéutico, en el que dicho agente terapéutico está destinado a la
administración a un paciente, comprendiendo dicho método:
formar covalentemente un profármaco uniendo un
oligopéptido escindible por trouasa a un grupo estabilizante en un
primer sitio de unión del oligopéptido y uniendo directa o
indirectamente el agente terapéutico a un segundo sitio de unión
del oligopéptido, siendo el profármaco escindido selectivamente por
trouasa, con lo que el profármaco proporciona al agente terapéutico
una menor toxicidad cuando se administra al paciente.
La descripción incluye un método para formar un
compuesto profármaco que comprende las siguientes etapas:
- (1)
- activar un oligopéptido protegido con Fmoc con un agente de activación en presencia de un agente terapéutico para formar un conjugado oligopéptido protegido con Fmoc-agente terapéutico,
- (2)
- desproteger el conjugado oligopéptido protegido con Fmoc-agente terapéutico poniéndolo en contacto con una base,
- (3)
- hacer reaccionar el conjugado oligopéptido-agente terapéutico con un grupo estabilizador,
- (4)
- neutralizar el conjugado grupo estabilizador-oligopéptido-agente terapéutico con una sal farmacéuticamente aceptable.
La descripción incluye también preparar un
compuesto profármaco que comprende las siguientes etapas:
- (1)
- activar un grupo estabilizante protegido con un éster alquílico-oligopéptido con un agente de activación en presencia de un agente terapéutico formando un conjugado grupo estabilizante protegido con éster alquílico-oligopéptido-agente terapéutico,
- (2)
- desproteger el conjugado grupo estabilizante protegido con éster alquílico-oligopéptido-agente terapéutico, y
- (3)
- neutralizar el conjugado grupo estabilizante-oligopéptido-agente terapéutico con una sal farmacéuticamente aceptable.
Otro aspecto de la descripción es un método para
preparar un compuesto profármaco que comprende las siguientes
etapas:
- (1)
- activar un oligopéptido protegido con tritilo con un agente de activación en presencia de un agente terapéutico formando un conjugado oligopéptido protegido con tritilo-agente terapéutico,
- (2)
- desproteger el conjugado oligopéptido protegido con tritilo-agente terapéutico en condiciones ácidas durante 30-120 minutos de 0 a 25ºC,
- (3)
- hacer reaccionar el conjugado oligopéptido-agente terapéutico con un grupo estabilizante, y
- (4)
- neutralizar el grupo estabilizante-oligopéptido-agente terapéutico con una sal farmacéuticamente aceptable.
Las composiciones de la invención incluyen
profármacos preparados por todos los métodos anteriores.
Estando ahora completamente descrita la
invención, será evidente para los expertos en la técnica que pueden
realizarse muchos cambios y modificaciones en ella sin separarse del
alcance de las reivindicaciones que se acompañan.
<110> Coulter Pharmaceutical, Inc.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> COMPUESTOS PROFÁRMACOS Y
PROCEDIMIENTO PARA SU PREPARACIÓN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> COUL-007/01WO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> aún no disponible
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
10-12-1999
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/119,312
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
08-02-1999
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/111,793
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
11-12-1998
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 103
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> D-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 2-Tienilalanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 2-Tienilalanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 2-Tienilalanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 2-Naftilalanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 2-Tienilalanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 3-Piridilalanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 2-Tienilalanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ácido aminoisobutírico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ácido aminoisobutírico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ácido
tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ácido
tiazolidin-4-carboxílico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 2-Tienilalanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 2-Naftilalanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ácido
3-amino-4,4-difenilbutírico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> D-Leucina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> D-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> D-Metionina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ácido
3-amino-3-fenilpropiónico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ácido
4-(aminometil)benzoico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 2-Naftilalanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 2-Tienilalanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ácido
tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 2-Naftilalanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ácido
3-amino-4,4-difenilbutírico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ácido
3-amino-3-fenilpropiónico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 62
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 63
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Norleucina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 63
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Norleucina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Norleucina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 65
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Norleucina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Norleucina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 67
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Norleucina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Norleucina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 69
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Norleucina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 70
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Norleucina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 71
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Norleucina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 72
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Norleucina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 73
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Norvalina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 74
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 75
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 2-Tienilalanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 76
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 77
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 2-Tienilalanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 77
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 2-Naftilalanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 78
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 79
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Phe(Cl)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 80
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Phe(NO2)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 81
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 82
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Phe(NO2)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 82
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 83
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fenilglicina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 83
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 84
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 3-Piridilalanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 84
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 85
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ácido
tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 85
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 86
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 2-Tienilalanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 86
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 87
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 2-Tienilalanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 87
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 88
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Ácido
tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 88
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 89
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Tetrahidroisoquinolina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 89
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 90
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 91
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 91
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 92
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 92
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 93
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 93
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 94
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 94
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 95
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 95
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 96
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 96
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 97
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 97
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 98
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 2-Tienilalanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 98
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 99
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 99
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 100
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 100
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 101
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 101
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 102
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SIMILAR
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 2-Tienilalanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 102
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 103
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Sintética
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITIO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Beta-Alanina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 103
\hskip1cm
Claims (17)
1. Un compuesto que comprende:
(1) un agente terapéutico capaz de entrar en una
célula diana,
(2) un oligopéptido que tiene una fórmula
(AA)_{n}-AA^{4}-AA^{3}-AA^{2}-AA^{1},
en donde:
cada AA independientemente representa cualquier
aminoácido genéticamente modificado;
n es un número entero de 0 a 12;
AA^{4} representa un aminoácido no
genéticamente codificado;
AA^{3} representa cualquier aminoácido;
AA^{2} representa cualquier aminoácido; y
AA^{1} representa cualquier aminoácido, en
donde el oligopéptido se selecciona de:
DAlaThi\betaAla\betaAlaLeuAlaLeu (SEQ ID NO: 1),
Thi\betaAla\betaAlaLeuAlaLeu (SEQ ID NO: 2),
\betaAla\betaAlaLeuAlaLeu (SEQ ID NO: 3), \betaAlaAlaAlaIle
(SEQ ID NO: 4), \betaAlaAlaAlaLeu (SEQ ID NO: 5),
\betaAlaPheTyrLeu (SEQ ID NO: 6), \betaAlaPheThrPhe (SEQ ID
NO: 7), \betaAlaPheGlyIle (SEQ ID NO: 8), \betaAlaPheGlyLeu
(SEQ ID NO: 9), \betaAlaPhePhePhe (SEQ ID NO: 10),
\betaAlaPhePheIle (SEQ ID NO: 11), \betaAlaPhePheLeu (SEQ ID
NO: 12), \betaAlaPheAlaIle (SEQ ID NO: 13), \betaAlaPheAlaLeu
(SEQ ID NO: 14), ThiGlyAlaLeu (SEQ ID NO: 15), NalGlyAlaLeu (SEQ
ID NO: 16), \betaAlaLeuTyrLeu (SEQ ID NO: 17),
\betaAlaLeuThiLeu (SEQ ID NO: 18), \betaAlaLeuThrPhe (SEQ ID
NO: 19), \betaAlaLeuThrIle (SEQ ID NO: 20), \betaAlaLeu
ThrLeu (SEQ ID NO: 21), \betaAlaLeuSerLeu (SEQ ID NO: 22), \betaAlaLeuPyrLeu (SEQ ID NO: 23), \betaAlaLeuLeuLeu (SEQ ID NO: 24), \betaAlaLeuGlyPhe (SEQ ID NO: 25), \betaAlaLeuGlyIle (SEQ ID NO: 26), ThiLeuGlyLeu (SEQ ID NO: 27), \betaAlaLeuGlyLeu (SEQ ID NO: 28), AibLeuGlyLeu (SEQ ID NO: 29), \betaAlaLeuPheIle (SEQ ID NO: 30), \betaAlaLeuPheLeu (SEQ ID NO: 31), \betaAlaLeuAibLeu (SEQ ID NO: 32), \betaAlaLeuAlaAla (SEQ ID NO: 33), \betaAlaLeuAla\betaAla (SEQ ID NO: 34), \betaAlaLeuAlaPhe (SEQ ID NO: 35), \betaAlaLeuAlaGly (SEQ ID NO: 36), \betaAlaLeu
AlaIle (SEQ ID NO: 37), \betaAlaLeuAlaLeu (SEQ ID NO: 38), TicLeuAlaLeu (SEQ ID NO: 39), ThzLeuAlaLeu (SEQ ID NO: 40), ThiLeuAlaLeu (SEQ ID NO: 41), NaIleuAlaLeu (SEQ ID NO: 42), NAALeuAlaLeu (SEQ ID NO: 43), D-LeuLeuAlaLeu (SEQ ID NO: 44), D-AlaLeuAlaLeu (SEQ ID NO: 45), D-MetLeuAlaLeu (SEQ ID NO: 46), APP
LeuAlaLeu (SEQ ID NO: 47), AmbLeuAlaLeu (SEQ ID NO: 48), \betaAlaLeuAlaNal (SEQ ID NO: 49), \betaAlaLeuAlaSer (SEQ ID NO: 50), \betaAlaLeuAlaTyr (SEQ ID NO: 51), \betaAlaMetTyrPhe (SEQ ID NO: 52), \betaAlaMetTyrLeu (SEQ ID NO: 53), \betaAlaMetGlyIle (SEQ ID NO: 54), ThiMetGlyLeu (SEQ ID NO: 55), \betaAlaMetPhePhe (SEQ ID NO: 56), \betaAlaMetPheIle (SEQ ID NO: 57), TicMetAlaLeu (SEQ ID NO: 58), NaIMetAlaLeu (SEQ ID NO: 59), NAA
MetAlaLeu (SEQ ID NO: 60), \betaAlaMetAlaLeu (SEQ ID NO: 61), APPMetAlaLeu (SEQ ID NO: 62), \betaAlaNleTyrIle (SEQ ID NO: 63), \betaAlaNleTyrLeu (SEQ ID NO: 64), \betaAlaNleThrIle (SEQ ID NO: 65), \betaAlaNleThrLeu (SEQ ID NO: 66), \betaAlaNleGlyPhe (SEQ ID NO: 67), \betaAlaNleGlyIle (SEQ ID NO: 68), \betaAlaNleGlyLeu (SEQ ID NO: 69), \betaAlaNlePheIle (SEQ ID NO: 70), \betaAlaNleAlaIle (SEQ ID NO: 71), \betaAlaNleAlaLeu (SEQ ID NO: 72), \betaAlaNleAla
Phe (SEQ ID NO: 73), \betaAlaNvaAlaLeu (SEQ ID NO: 74), \betaAlaPheTyrIle (SEQ ID NO: 75), ThiProGlyLeu (SEQ ID NO: 76), ThiProAlaLeu (SEQ ID NO: 77), NalProAlaLeu (SEQ ID NO: 78), \betaAlaProAlaLeu (SEQ ID NO: 79), \betaAlaPhe(CI)AlaLeu (SEQ ID NO: 80), \betaAlaPhe(NO_{2})AlaIle (SEQ ID NO: 81), \betaAlaPhe(NO_{2})AlaLeu (SEQ ID NO: 82), \betaAlaPhgAlaLeu (SEQ ID NO: 83), \betaAlaPyrAlaLeu (SEQ ID NO: 84), TicThrGlyLeu (SEQ ID NO: 85), \betaAlaThiGlyIle (SEQ ID NO: 86), \betaAlaThiAlaLeu (SEQ ID NO: 87), \betaAlaTicAlaIle (SEQ ID NO: 88), \betaAlaTicAlaLeu (SEQ ID NO: 89), \betaAlaValAlaLeu (SEQ ID NO: 90), \betaAlaTrpAlaLeu (SEQ ID NO: 91), \betaAlaTyrTyrPhe (SEQ ID NO: 92), \betaAlaTyrTyrIle (SEQ ID NO: 93), \betaAlaTyrTyrLeu (SEQ ID NO: 94), \betaAlaTyrThrLeu (SEQ ID NO: 95), \betaAlaTyrPheLeu (SEQ ID NO: 96), \betaAlaTyrGlyIle (SEQ ID NO: 97), ThiTyrGlyLeu (SEQ ID NO: 98), \betaAlaTyrGlyLeu (SEQ ID NO: 99), \betaAlaTyrPheIle (SEQ ID NO: 100), \betaAlaTyrAlaIle (SEQ ID NO: 101), ThiTyrAlaLeu (SEQ ID NO: 102), y \betaAlaTyrAlaLeu (SEQ ID NO: 103).
ThrLeu (SEQ ID NO: 21), \betaAlaLeuSerLeu (SEQ ID NO: 22), \betaAlaLeuPyrLeu (SEQ ID NO: 23), \betaAlaLeuLeuLeu (SEQ ID NO: 24), \betaAlaLeuGlyPhe (SEQ ID NO: 25), \betaAlaLeuGlyIle (SEQ ID NO: 26), ThiLeuGlyLeu (SEQ ID NO: 27), \betaAlaLeuGlyLeu (SEQ ID NO: 28), AibLeuGlyLeu (SEQ ID NO: 29), \betaAlaLeuPheIle (SEQ ID NO: 30), \betaAlaLeuPheLeu (SEQ ID NO: 31), \betaAlaLeuAibLeu (SEQ ID NO: 32), \betaAlaLeuAlaAla (SEQ ID NO: 33), \betaAlaLeuAla\betaAla (SEQ ID NO: 34), \betaAlaLeuAlaPhe (SEQ ID NO: 35), \betaAlaLeuAlaGly (SEQ ID NO: 36), \betaAlaLeu
AlaIle (SEQ ID NO: 37), \betaAlaLeuAlaLeu (SEQ ID NO: 38), TicLeuAlaLeu (SEQ ID NO: 39), ThzLeuAlaLeu (SEQ ID NO: 40), ThiLeuAlaLeu (SEQ ID NO: 41), NaIleuAlaLeu (SEQ ID NO: 42), NAALeuAlaLeu (SEQ ID NO: 43), D-LeuLeuAlaLeu (SEQ ID NO: 44), D-AlaLeuAlaLeu (SEQ ID NO: 45), D-MetLeuAlaLeu (SEQ ID NO: 46), APP
LeuAlaLeu (SEQ ID NO: 47), AmbLeuAlaLeu (SEQ ID NO: 48), \betaAlaLeuAlaNal (SEQ ID NO: 49), \betaAlaLeuAlaSer (SEQ ID NO: 50), \betaAlaLeuAlaTyr (SEQ ID NO: 51), \betaAlaMetTyrPhe (SEQ ID NO: 52), \betaAlaMetTyrLeu (SEQ ID NO: 53), \betaAlaMetGlyIle (SEQ ID NO: 54), ThiMetGlyLeu (SEQ ID NO: 55), \betaAlaMetPhePhe (SEQ ID NO: 56), \betaAlaMetPheIle (SEQ ID NO: 57), TicMetAlaLeu (SEQ ID NO: 58), NaIMetAlaLeu (SEQ ID NO: 59), NAA
MetAlaLeu (SEQ ID NO: 60), \betaAlaMetAlaLeu (SEQ ID NO: 61), APPMetAlaLeu (SEQ ID NO: 62), \betaAlaNleTyrIle (SEQ ID NO: 63), \betaAlaNleTyrLeu (SEQ ID NO: 64), \betaAlaNleThrIle (SEQ ID NO: 65), \betaAlaNleThrLeu (SEQ ID NO: 66), \betaAlaNleGlyPhe (SEQ ID NO: 67), \betaAlaNleGlyIle (SEQ ID NO: 68), \betaAlaNleGlyLeu (SEQ ID NO: 69), \betaAlaNlePheIle (SEQ ID NO: 70), \betaAlaNleAlaIle (SEQ ID NO: 71), \betaAlaNleAlaLeu (SEQ ID NO: 72), \betaAlaNleAla
Phe (SEQ ID NO: 73), \betaAlaNvaAlaLeu (SEQ ID NO: 74), \betaAlaPheTyrIle (SEQ ID NO: 75), ThiProGlyLeu (SEQ ID NO: 76), ThiProAlaLeu (SEQ ID NO: 77), NalProAlaLeu (SEQ ID NO: 78), \betaAlaProAlaLeu (SEQ ID NO: 79), \betaAlaPhe(CI)AlaLeu (SEQ ID NO: 80), \betaAlaPhe(NO_{2})AlaIle (SEQ ID NO: 81), \betaAlaPhe(NO_{2})AlaLeu (SEQ ID NO: 82), \betaAlaPhgAlaLeu (SEQ ID NO: 83), \betaAlaPyrAlaLeu (SEQ ID NO: 84), TicThrGlyLeu (SEQ ID NO: 85), \betaAlaThiGlyIle (SEQ ID NO: 86), \betaAlaThiAlaLeu (SEQ ID NO: 87), \betaAlaTicAlaIle (SEQ ID NO: 88), \betaAlaTicAlaLeu (SEQ ID NO: 89), \betaAlaValAlaLeu (SEQ ID NO: 90), \betaAlaTrpAlaLeu (SEQ ID NO: 91), \betaAlaTyrTyrPhe (SEQ ID NO: 92), \betaAlaTyrTyrIle (SEQ ID NO: 93), \betaAlaTyrTyrLeu (SEQ ID NO: 94), \betaAlaTyrThrLeu (SEQ ID NO: 95), \betaAlaTyrPheLeu (SEQ ID NO: 96), \betaAlaTyrGlyIle (SEQ ID NO: 97), ThiTyrGlyLeu (SEQ ID NO: 98), \betaAlaTyrGlyLeu (SEQ ID NO: 99), \betaAlaTyrPheIle (SEQ ID NO: 100), \betaAlaTyrAlaIle (SEQ ID NO: 101), ThiTyrAlaLeu (SEQ ID NO: 102), y \betaAlaTyrAlaLeu (SEQ ID NO: 103).
(3) opcionalmente, un grupo enlazador, y
(4) un grupo estabilizante cargado negativamente
que impide la escisión de dicho oligopéptido por las enzimas
presentes en la sangre completa,
en donde el oligopéptido está unido
directamente al grupo estabilizante en el extremo amino del
oligopéptido y AA^{1} del oligopéptido está unido directamente al
agente terapéutico o unido indirectamente a través del grupo
enlazador al agente terapéutico en un segundo sitio de unión del
oligopéptido, y en donde el compuesto se escinde selectivamente por
una enzima asociada con la célula diana, en donde el grupo
estabilizante se selecciona de: ácido succínico, ácido diglicólico,
ácido maleico, ácido piroglutámico, y ácido glutárico.
2. El compuesto de la reivindicación 1, en donde
n es un número entero de 0 a 8.
3. El compuesto de la reivindicación 1, en donde
la célula diana es un tumor o una célula inflamatoria.
4. El compuesto de la reivindicación 1, en donde
AA^{1} del oligopéptido se selecciona de fenilalanina, isoleucina,
alanina, glicina, tirosina, 2-naftilalanina, serina
y \beta-alanina.
5. El compuesto de la reivindicación 1, en donde
AA^{2} del oligopéptido se selecciona de leucina, tirosina,
alanina, glicina, serina, 3-piridilalanina,
2-tienilalanina, aminoisobutírico, treonina y
fenilalanina.
6. El compuesto de la reivindicación 1, en
donde AA^{3} del oligopéptido se selecciona de leucina, tirosina,
fenilalanina, p-Cl-fenilalanina,
p-Nitrofenilalanina, valina, norleucina, norvalina,
fenilglicina, triptófano, ácido
tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico,
3-piridilalanina, alanina, glicina, tienilalanina,
metionina, valina y prolina.
7. El compuesto de la reivindicación 1, en donde
AA^{4} se selecciona de \beta-alanina, ácido
tiazolidin-4-carboxílico,
2-tienilalanina, 2-naftilalanina,
D-alanina, D-leucina,
D-metionina, D-fenilalanina, ácido
3-amino-3-fenilpropiónico,
ácido \gamma-aminobutírico, ácido
3-amino-4,4-difenilbutírico,
ácido
tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico,
ácido 4-aminometilbenzoico y ácido
aminoisobutírico.
8. El compuesto de la reivindicación 1, en donde
el grupo estabilizante reduce la interacción entre el compuesto y
las células endoteliales que revisten los vasos sanguíneos cuando se
administran al paciente.
9. El compuesto de la reivindicación 1, en donde
el agente terapéutico se selecciona de agentes alquilantes, agentes
anti-proliferantes, agentes de unión a tubulina,
alcaloides de vinca, enediinas, podofilotoxinas o derivados de
podofilotoxinas, la familia de fármacos de pteridina, taxanos,
antraciclinas, dolastatinas, inhibidores de topoiosomerasa y
cis-platinos.
10. El compuesto de la reivindicación 1, en
donde el agente terapéutico se selecciona de doxorubicina,
daunorubicina, vinblastina, vincristina, caliqueamicina, etopósido,
fosfato de etopósido, CC-1065, duocarmicina,
KW-2189, metotrexato, metopterina, aminopterina,
diclorometotrexato, docetaxel, paclitaxel, epitiolono,
combretastatina, fosfato de combretastatina A_{4}, dolastatina
10, dolastatina 11, dolastatina 15, topotecan, camptotecina,
mitomicina C, porfiromicina, 5-fluoracilo,
6-mercaptopurina, fludarabina, tamoxifeno,
arabinósido de citosina, arabinósido de adenosina, colchicina,
Carboplatino, mitomicina C, bleomicina, melfalan o uno de sus
derivados y análogos.
11. El compuesto de la reivindicación 1, en
donde el agente terapéutico tiene un sitio activo intracelular.
12. El compuesto de la reivindicación 1, en
donde AA^{1} del oligopéptido está unido directamente al agente
terapéutico.
13. El compuesto de la reivindicación 1, en
donde AA^{1} de la secuencia del oligopéptido está unido
indirectamente al agente terapéutico en el segundo sitio de unión
del oligopéptido mediante un grupo enlazador, seleccionándose dicho
grupo enlazador de ácido aminocaproico, grupo hidrazida, un grupo
éster, un grupo éter y un grupo sulfhidrilo.
14. Una composición farmacéutica que
comprende:
- (1)
- un compuesto de acuerdo con las reivindicaciones precedentes
- (2)
- un vehículo farmacéuticamente aceptable.
15. Un método in vitro para disminuir la
toxicidad de un agente terapéutico en donde el agente terapéutico
está destinado a la administración a un paciente, comprendiendo el
método:
formar covalentemente un profármaco uniendo un
oligopéptido, que tiene una fórmula
(AA)_{n}-AA^{4}-AA^{3}-AA^{2}-AA^{1},
en donde:
- cada AA independientemente representa cualquier aminoácido genéticamente modificado,
- n es un número entero de 0 a 12,
- AA^{4} representa un aminoácido no genéticamente codificado,
- y cada uno de AA^{1}, AA^{2}, y AA^{3} representa cualquier aminoácido,
en donde el oligopéptido se selecciona de:
DAlaThi\betaAla\betaAlaLeuAlaLeu (SEQ ID NO: 1),
Thi\betaAla\betaAlaLeuAlaLeu (SEQ ID NO: 2),
\betaAla\betaAlaLeuAlaLeu (SEQ ID NO: 3), \betaAlaAlaAlaIle
(SEQ ID NO: 4), \betaAlaAlaAlaLeu (SEQ ID NO: 5),
\betaAlaPheTyrLeu (SEQ ID NO: 6), \betaAlaPheThrPhe (SEQ ID
NO: 7), \betaAlaPheGlyIle (SEQ ID NO: 8), \betaAlaPheGlyLeu
(SEQ ID NO: 9), \betaAlaPhePhePhe (SEQ ID NO: 10),
\betaAlaPhePheIle (SEQ ID NO: 11), \betaAlaPhePhe
Leu (SEQ ID NO: 12), \betaAlaPheAlaIle (SEQ ID NO: 13), \betaAlaPheAlaLeu (SEQ ID NO: 14), ThiGlyAlaLeu (SEQ ID NO: 15), NalGlyAlaLeu (SEQ ID NO: 16), \betaAlaLeuTyrLeu (SEQ ID NO: 17), \betaAlaLeuThiLeu (SEQ ID NO: 18), \betaAlaLeuThrPhe (SEQ ID NO: 19), \betaAlaLeuThrIle (SEQ ID NO: 20), \betaAlaLeuThrLeu (SEQ ID NO: 21), \betaAlaLeuSer
Leu (SEQ ID NO: 22), \betaAlaLeuPyrLeu (SEQ ID NO: 23), \betaAlaLeuLeuLeu (SEQ ID NO: 24), \betaAlaLeuGlyPhe (SEQ ID NO: 25), \betaAlaLeuGlyIle (SEQ ID NO: 26), ThiLeuGlyLeu (SEQ ID NO: 27), \betaAlaLeuGlyLeu (SEQ ID NO: 28), AibLeuGlyLeu (SEQ ID NO: 29), \betaAlaLeuPheIle (SEQ ID NO: 30), \betaAlaLeuPheLeu (SEQ ID NO: 31), \betaAlaLeuAibLeu (SEQ ID NO: 32), \betaAlaLeuAlaAla (SEQ ID NO: 33), \betaAlaLeuAla\betaAla (SEQ ID NO: 34), \betaAlaLeuAlaPhe (SEQ ID NO: 35), \betaAlaLeuAlaGly (SEQ ID NO: 36), \betaAlaLeuAlaIle (SEQ ID NO: 37), \betaAlaLeuAla
Leu (SEQ ID NO: 38), TicLeuAlaLeu (SEQ ID NO: 39), ThzLeuAlaLeu (SEQ ID NO: 40), ThiLeuAlaLeu (SEQ ID NO: 41), NaIleuAlaLeu (SEQ ID NO: 42), NAALeuAlaLeu (SEQ ID NO: 43), D-LeuLeuAlaLeu (SEQ ID NO: 44), D-AlaLeuAlaLeu (SEQ ID NO: 45), D-MetLeuAlaLeu (SEQ ID NO: 46), APPLeuAlaLeu (SEQ ID NO: 47), Amb
LeuAlaLeu (SEQ ID NO: 48), \betaAlaLeuAlaNal (SEQ ID NO: 49), \betaAlaLeuAlaSer (SEQ ID NO: 50), \betaAlaLeuAlaTyr (SEQ ID NO: 51), \betaAlaMetTyrPhe (SEQ ID NO: 52), \betaAlaMetTyrLeu (SEQ ID NO: 53), \betaAlaMetGlyIle (SEQ ID NO: 54), ThiMetGlyLeu (SEQ ID NO: 55), \betaAlaMetPhePhe (SEQ ID NO: 56), \betaAlaMetPheIle (SEQ ID NO: 57), Tic
MetAlaLeu (SEQ ID NO: 58), NaIMetAlaLeu (SEQ ID NO: 59), NAAMetAlaLeu (SEQ ID NO: 60), \betaAlaMetAlaLeu (SEQ ID NO: 61), APPMetAlaLeu (SEQ ID NO: 62), \betaAlaNleTyrIle (SEQ ID NO: 63), \betaAlaNleTyrLeu (SEQ ID NO: 64), \betaAlaNleThrIle (SEQ ID NO: 65), \betaAlaNleThrLeu (SEQ ID NO: 66), \betaAlaNleGlyPhe (SEQ ID NO: 67), \betaAlaNleGlyIle (SEQ ID NO: 68), \betaAlaNleGlyLeu (SEQ ID NO: 69), \betaAlaNlePheIle (SEQ ID NO: 70), \betaAlaNleAlaIle (SEQ ID NO: 71), \betaAlaNleAlaLeu (SEQ ID NO: 72), \betaAlaNleAlaPhe (SEQ ID NO: 73), \betaAlaNvaAlaLeu (SEQ ID NO: 74), \betaAlaPheTyrIle (SEQ ID NO: 75), ThiProGlyLeu (SEQ ID NO: 76), ThiProAlaLeu (SEQ ID NO: 77), NalProAlaLeu (SEQ ID NO: 78), \betaAlaProAlaLeu (SEQ ID NO: 79), \betaAlaPhe(CI)AlaLeu (SEQ ID NO: 80), \betaAlaPhe(NO_{2})AlaIle (SEQ ID NO: 81), \betaAlaPhe(NO_{2})AlaLeu (SEQ ID NO: 82), \betaAlaPhgAlaLeu (SEQ ID NO: 83), \betaAlaPyrAlaLeu (SEQ ID NO: 84), TicThrGlyLeu (SEQ ID NO: 85), \betaAlaThiGlyIle (SEQ ID NO: 86), \betaAlaThiAlaLeu (SEQ ID NO: 87), \betaAlaTicAlaIle (SEQ ID NO: 88), \betaAlaTicAlaLeu (SEQ ID NO: 89), \betaAlaValAlaLeu (SEQ ID NO: 90), \betaAlaTrpAlaLeu (SEQ ID NO: 91), \betaAlaTyrTyrPhe (SEQ ID NO: 92), \betaAlaTyrTyrIle (SEQ ID NO: 93), \betaAlaTyrTyrLeu (SEQ ID NO: 94), \betaAlaTyrThrLeu (SEQ ID NO: 95), \betaAlaTyrPheLeu (SEQ ID NO: 96), \betaAlaTyrGly
Ile (SEQ ID NO: 97), ThiTyrGlyLeu (SEQ ID NO: 98), \betaAlaTyrGlyLeu (SEQ ID NO: 99), \betaAlaTyrPheIle (SEQ ID NO: 100), \betaAlaTyrAlaIle (SEQ ID NO: 101), ThiTyrAlaLeu (SEQ ID NO: 102), y \betaAlaTyrAlaLeu (SEQ ID NO: 103),
Leu (SEQ ID NO: 12), \betaAlaPheAlaIle (SEQ ID NO: 13), \betaAlaPheAlaLeu (SEQ ID NO: 14), ThiGlyAlaLeu (SEQ ID NO: 15), NalGlyAlaLeu (SEQ ID NO: 16), \betaAlaLeuTyrLeu (SEQ ID NO: 17), \betaAlaLeuThiLeu (SEQ ID NO: 18), \betaAlaLeuThrPhe (SEQ ID NO: 19), \betaAlaLeuThrIle (SEQ ID NO: 20), \betaAlaLeuThrLeu (SEQ ID NO: 21), \betaAlaLeuSer
Leu (SEQ ID NO: 22), \betaAlaLeuPyrLeu (SEQ ID NO: 23), \betaAlaLeuLeuLeu (SEQ ID NO: 24), \betaAlaLeuGlyPhe (SEQ ID NO: 25), \betaAlaLeuGlyIle (SEQ ID NO: 26), ThiLeuGlyLeu (SEQ ID NO: 27), \betaAlaLeuGlyLeu (SEQ ID NO: 28), AibLeuGlyLeu (SEQ ID NO: 29), \betaAlaLeuPheIle (SEQ ID NO: 30), \betaAlaLeuPheLeu (SEQ ID NO: 31), \betaAlaLeuAibLeu (SEQ ID NO: 32), \betaAlaLeuAlaAla (SEQ ID NO: 33), \betaAlaLeuAla\betaAla (SEQ ID NO: 34), \betaAlaLeuAlaPhe (SEQ ID NO: 35), \betaAlaLeuAlaGly (SEQ ID NO: 36), \betaAlaLeuAlaIle (SEQ ID NO: 37), \betaAlaLeuAla
Leu (SEQ ID NO: 38), TicLeuAlaLeu (SEQ ID NO: 39), ThzLeuAlaLeu (SEQ ID NO: 40), ThiLeuAlaLeu (SEQ ID NO: 41), NaIleuAlaLeu (SEQ ID NO: 42), NAALeuAlaLeu (SEQ ID NO: 43), D-LeuLeuAlaLeu (SEQ ID NO: 44), D-AlaLeuAlaLeu (SEQ ID NO: 45), D-MetLeuAlaLeu (SEQ ID NO: 46), APPLeuAlaLeu (SEQ ID NO: 47), Amb
LeuAlaLeu (SEQ ID NO: 48), \betaAlaLeuAlaNal (SEQ ID NO: 49), \betaAlaLeuAlaSer (SEQ ID NO: 50), \betaAlaLeuAlaTyr (SEQ ID NO: 51), \betaAlaMetTyrPhe (SEQ ID NO: 52), \betaAlaMetTyrLeu (SEQ ID NO: 53), \betaAlaMetGlyIle (SEQ ID NO: 54), ThiMetGlyLeu (SEQ ID NO: 55), \betaAlaMetPhePhe (SEQ ID NO: 56), \betaAlaMetPheIle (SEQ ID NO: 57), Tic
MetAlaLeu (SEQ ID NO: 58), NaIMetAlaLeu (SEQ ID NO: 59), NAAMetAlaLeu (SEQ ID NO: 60), \betaAlaMetAlaLeu (SEQ ID NO: 61), APPMetAlaLeu (SEQ ID NO: 62), \betaAlaNleTyrIle (SEQ ID NO: 63), \betaAlaNleTyrLeu (SEQ ID NO: 64), \betaAlaNleThrIle (SEQ ID NO: 65), \betaAlaNleThrLeu (SEQ ID NO: 66), \betaAlaNleGlyPhe (SEQ ID NO: 67), \betaAlaNleGlyIle (SEQ ID NO: 68), \betaAlaNleGlyLeu (SEQ ID NO: 69), \betaAlaNlePheIle (SEQ ID NO: 70), \betaAlaNleAlaIle (SEQ ID NO: 71), \betaAlaNleAlaLeu (SEQ ID NO: 72), \betaAlaNleAlaPhe (SEQ ID NO: 73), \betaAlaNvaAlaLeu (SEQ ID NO: 74), \betaAlaPheTyrIle (SEQ ID NO: 75), ThiProGlyLeu (SEQ ID NO: 76), ThiProAlaLeu (SEQ ID NO: 77), NalProAlaLeu (SEQ ID NO: 78), \betaAlaProAlaLeu (SEQ ID NO: 79), \betaAlaPhe(CI)AlaLeu (SEQ ID NO: 80), \betaAlaPhe(NO_{2})AlaIle (SEQ ID NO: 81), \betaAlaPhe(NO_{2})AlaLeu (SEQ ID NO: 82), \betaAlaPhgAlaLeu (SEQ ID NO: 83), \betaAlaPyrAlaLeu (SEQ ID NO: 84), TicThrGlyLeu (SEQ ID NO: 85), \betaAlaThiGlyIle (SEQ ID NO: 86), \betaAlaThiAlaLeu (SEQ ID NO: 87), \betaAlaTicAlaIle (SEQ ID NO: 88), \betaAlaTicAlaLeu (SEQ ID NO: 89), \betaAlaValAlaLeu (SEQ ID NO: 90), \betaAlaTrpAlaLeu (SEQ ID NO: 91), \betaAlaTyrTyrPhe (SEQ ID NO: 92), \betaAlaTyrTyrIle (SEQ ID NO: 93), \betaAlaTyrTyrLeu (SEQ ID NO: 94), \betaAlaTyrThrLeu (SEQ ID NO: 95), \betaAlaTyrPheLeu (SEQ ID NO: 96), \betaAlaTyrGly
Ile (SEQ ID NO: 97), ThiTyrGlyLeu (SEQ ID NO: 98), \betaAlaTyrGlyLeu (SEQ ID NO: 99), \betaAlaTyrPheIle (SEQ ID NO: 100), \betaAlaTyrAlaIle (SEQ ID NO: 101), ThiTyrAlaLeu (SEQ ID NO: 102), y \betaAlaTyrAlaLeu (SEQ ID NO: 103),
a un grupo estabilizante cargado negativamente
en un primer sitio de unión del oligopéptido y unir directamente o
indirectamente el agente terapéutico en un segundo sitio de unión
del oligopéptido,
en donde el grupo estabilizante se selecciona
de: ácido succínico, ácido diglicólico, ácido maleico, ácido
piroglutámico y ácido glutárico,
con lo cual el profármaco proporciona una
toxicidad disminuida al agente terapéutico cuando se administra al
paciente.
16. El método de la reivindicación 15, en donde
el profármaco permite la administración al paciente de una dosis
mayor del agente terapéutico con relación a la dosis del agente
terapéutico sin unión al profármaco.
17. Un profármaco formado por el método de la
reivindicación 15.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US11179398P | 1998-12-11 | 1998-12-11 | |
| US111793P | 1998-12-11 | ||
| US11931299P | 1999-02-08 | 1999-02-08 | |
| US119312P | 1999-02-08 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2342637T3 true ES2342637T3 (es) | 2010-07-09 |
Family
ID=26809248
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES99967462T Expired - Lifetime ES2342637T3 (es) | 1998-12-11 | 1999-12-10 | Compuestos profarmacos y procedimiento para su preparacion. |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1144011B1 (es) |
| JP (1) | JP2003518000A (es) |
| AT (1) | ATE460180T1 (es) |
| AU (1) | AU773420B2 (es) |
| CA (1) | CA2354766A1 (es) |
| CY (1) | CY1111094T1 (es) |
| DE (1) | DE69942128D1 (es) |
| DK (1) | DK1144011T3 (es) |
| ES (1) | ES2342637T3 (es) |
| HK (1) | HK1039272A1 (es) |
| IL (2) | IL143666A0 (es) |
| NZ (1) | NZ512171A (es) |
| PT (1) | PT1144011E (es) |
| WO (1) | WO2000033888A2 (es) |
Families Citing this family (50)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7462605B2 (en) | 1998-01-23 | 2008-12-09 | Celmed Oncology (Usa), Inc. | Phosphoramidate compounds and methods of use |
| US6245750B1 (en) | 1998-01-23 | 2001-06-12 | Newbiotics, Inc. | Enzyme catalyzed therapeutic agents |
| US6818213B1 (en) | 1998-07-13 | 2004-11-16 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Cancer treatment compositions comprising therapeutic conjugates that bind to aminophospholipids |
| CA2331789C (en) | 1998-07-13 | 2013-09-10 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Cancer treatment methods using therapeutic conjugates that bind to aminophospholipids |
| US7425541B2 (en) | 1998-12-11 | 2008-09-16 | Medarex, Inc. | Enzyme-cleavable prodrug compounds |
| EP1181055A2 (en) | 1999-05-14 | 2002-02-27 | Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals Inc. | Enzyme-activated anti-tumor prodrug compounds |
| US6613879B1 (en) | 1999-05-14 | 2003-09-02 | Boehringer Ingelheim Pharma Kg | FAP-activated anti-tumour compounds |
| US6683061B1 (en) | 1999-07-22 | 2004-01-27 | Newbiotics, Inc. | Enzyme catalyzed therapeutic activation |
| MXPA02000761A (es) * | 1999-07-22 | 2002-08-12 | Newbiotics Inc | Agentes terapeuticos anti-infecciosos catalizados por enzima. |
| IL147749A0 (en) | 1999-07-22 | 2002-08-14 | Newbiotics Inc | Methods for treating therapy-resistant tumors |
| DE10018617A1 (de) * | 2000-01-13 | 2001-10-31 | Joerg G Moser | Cyclodextrin-Dimere mit Peptid-Spacerstrukturen zur Entgiftung von pharmazeutischen Wirkstoffen hohen Nebenwirkungspotentials |
| AU2001245836A1 (en) | 2000-03-15 | 2002-07-16 | Bristol-Myers Squibb Company | Peptidase-cleavable, targeted antineoplastic drugs and their therapeutic use |
| AU2001266853B2 (en) | 2000-06-14 | 2005-02-17 | Medarex, Inc. | Prodrug compounds with an oligopeptide having an isoleucine residue |
| CA2411545A1 (en) | 2000-06-14 | 2002-01-03 | Medarex, Inc. | Tripeptide prodrug compounds |
| CA2411660C (en) * | 2000-06-14 | 2011-03-01 | Medarex, Inc. | Enzyme-cleavable prodrug compounds |
| AU2001286727A1 (en) | 2000-08-24 | 2002-03-04 | Coulter Pharmaceutical, Inc. | Prodrugs activated by plasmin and their use in cancer chemotherapy |
| AU1602902A (en) * | 2000-10-27 | 2002-05-06 | Aventis Pharma Sa | A combination comprising camptothecin and a stilbene derivative for the treatment of cancer |
| CA2428971A1 (en) * | 2000-11-14 | 2003-05-01 | New River Pharmaceuticals Inc. | Conjugates of a therapeutic agent and a peptide carrier |
| WO2002060488A1 (en) * | 2001-01-30 | 2002-08-08 | Universite Catholique De Louvain | Anti-tumor compounds |
| CN101671335A (zh) | 2001-05-31 | 2010-03-17 | 梅达莱克斯公司 | 细胞毒素、其有用的前体药物、连接基团和稳定剂 |
| AU2002316539C1 (en) * | 2001-06-11 | 2008-10-30 | Medarex, Inc. | CD10-activated prodrug compounds |
| FR2825928B1 (fr) * | 2001-06-18 | 2004-04-02 | Ecole Norm Superieure Cachan | Composition pharmaceutique pour le diagnostic, la prevention ou le traitement d'une pathologie tumorale, comprenant un agent modulateur de l'etat polymerisation de l'actine |
| WO2003094972A2 (en) * | 2002-05-10 | 2003-11-20 | Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co Kg | Fap-activated anti-tumor prodrugs |
| US7378386B2 (en) | 2002-07-15 | 2008-05-27 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Anti-viral treatment methods using phosphatidylethanolamine-binding peptide derivatives |
| US7384909B2 (en) | 2002-07-15 | 2008-06-10 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Anti-viral treatment methods using phosphatidylethanolamine-binding peptides linked to anti-viral agents |
| US7511124B2 (en) | 2002-07-15 | 2009-03-31 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Compositions comprising phosphatidylethanolamine-binding peptides linked to anti-viral agents |
| US7879801B2 (en) * | 2002-07-15 | 2011-02-01 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Compositions comprising cell-impermeant duramycin derivatives |
| US7678386B2 (en) | 2002-07-15 | 2010-03-16 | Board Of Regents The University Of Texas | Liposomes coated with selected antibodies that bind to aminophospholipids |
| WO2005042043A2 (en) | 2003-10-28 | 2005-05-12 | Medtronic, Inc. | Methods of preparing crosslinked materials and bioprosthetic devices |
| WO2005072061A2 (en) | 2004-02-02 | 2005-08-11 | Biosight Ltd. | Conjugates for cancer therapy and diagnosis |
| EP1855723B1 (en) | 2005-03-08 | 2013-05-22 | Ramot at Tel-Aviv University Ltd. | Targeted drug-carrying bacteriophages |
| EP1993608A1 (en) * | 2006-03-10 | 2008-11-26 | Diatos | Anticancer drugs conjugated to antibody via an enzyme cleavable linker |
| KR101552735B1 (ko) | 2006-12-01 | 2015-09-14 | 메다렉스, 엘.엘.시. | 씨디22에 결합하는 인간 항체 및 이의 용도 |
| CL2007003622A1 (es) | 2006-12-13 | 2009-08-07 | Medarex Inc | Anticuerpo monoclonal humano anti-cd19; composicion que lo comprende; y metodo de inhibicion del crecimiento de celulas tumorales. |
| CA2672468A1 (en) | 2006-12-14 | 2008-06-19 | Medarex, Inc. | Human antibodies that bind cd70 and uses thereof |
| TWI412367B (zh) | 2006-12-28 | 2013-10-21 | Medarex Llc | 化學鏈接劑與可裂解基質以及其之綴合物 |
| US8664407B2 (en) | 2007-02-21 | 2014-03-04 | Medarex, LLC | Chemical linkers with single amino acids and conjugates thereof |
| EP1977765A1 (en) * | 2007-04-03 | 2008-10-08 | Diatos | Peptide prodrugs |
| EA031986B1 (ru) | 2012-04-04 | 2019-03-29 | Галозим, Инк. | Способ и комбинация для лечения солидной раковой опухоли и набор, содержащий комбинацию |
| CN113476616A (zh) * | 2012-12-28 | 2021-10-08 | 科比欧尔斯公司 | 最低毒性的药物前体 |
| CA2907521C (en) | 2013-03-21 | 2021-04-13 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Synthesis of cyclic imide containing peptide products |
| CN105189465B (zh) | 2013-03-21 | 2019-02-26 | 赛诺菲-安万特德国有限公司 | 合成含有乙内酰脲的肽产物 |
| WO2014197816A1 (en) * | 2013-06-06 | 2014-12-11 | Massachusetts Institute Of Technology | Stimulus responsive nanocomplexes and methods of use thereof |
| US12071450B2 (en) | 2015-12-03 | 2024-08-27 | Biosight Ltd. | Salts of conjugates for cancer therapy |
| EP3383883A4 (en) | 2015-12-03 | 2019-07-24 | BioSight Ltd. | SALTS OF CONJUGATES TO CANCER THERAPY |
| US12064445B2 (en) | 2015-12-03 | 2024-08-20 | Biosight Ltd. | Cytarabine conjugates for cancer therapy |
| AU2016362830B2 (en) | 2015-12-03 | 2022-07-14 | Biosight Ltd. | Cytarabine conjugates for cancer therapy |
| CN109021065B (zh) * | 2017-06-08 | 2021-10-01 | 复旦大学 | 一种制备海兔毒素Dolastatin10的方法 |
| CA3203072A1 (en) | 2020-12-22 | 2022-06-30 | Andrea CASAZZA | Compounds comprising a tetrapeptidic moiety |
| WO2022167664A1 (en) | 2021-02-07 | 2022-08-11 | Cobiores Nv | Compounds comprising a tetrapeptidic moiety |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0037388B1 (fr) * | 1980-03-31 | 1984-12-12 | Institut International De Pathologie Cellulaire Et Moleculaire | Formes pharmaceutiques, leur préparation et les compositions qui les contiennent |
| US5155210A (en) * | 1990-09-11 | 1992-10-13 | Brunswick Corporation | Methods of conjugating actinomycin d |
| EP0640622B1 (en) * | 1993-02-26 | 2000-08-09 | Drug Delivery System Institute, Ltd. | Polysaccharide derivative and drug carrier |
| US5962216A (en) | 1994-08-19 | 1999-10-05 | La Region Wallonne | Tumor-activated prodrug compounds and treatment |
| JP2001501601A (ja) * | 1996-09-12 | 2001-02-06 | メルク エンド カンパニー インコーポレーテッド | 前立腺ガンの治療において有用な共役体 |
| HRP970566A2 (en) * | 1996-10-30 | 1998-08-31 | Jones Deborah Defeo | Conjugates useful in the treatment of prostate canser |
| WO1998052966A1 (en) * | 1997-05-19 | 1998-11-26 | The Johns Hopkins University School Of Medecine | Tissue specific prodrug |
| JP2002510325A (ja) * | 1997-07-10 | 2002-04-02 | メルク エンド カンパニー インコーポレーテッド | 前立腺癌の治療に有用なコンジュゲート |
| EP1036093A1 (en) * | 1997-12-02 | 2000-09-20 | Merck & Co., Inc. | Conjugates useful in the treatment of prostate cancer |
-
1999
- 1999-12-10 EP EP99967462A patent/EP1144011B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-12-10 IL IL14366699A patent/IL143666A0/xx active IP Right Grant
- 1999-12-10 AT AT99967462T patent/ATE460180T1/de active
- 1999-12-10 AU AU23733/00A patent/AU773420B2/en not_active Ceased
- 1999-12-10 NZ NZ512171A patent/NZ512171A/en not_active IP Right Cessation
- 1999-12-10 JP JP2000586378A patent/JP2003518000A/ja active Pending
- 1999-12-10 WO PCT/US1999/030393 patent/WO2000033888A2/en active IP Right Grant
- 1999-12-10 CA CA002354766A patent/CA2354766A1/en not_active Abandoned
- 1999-12-10 DK DK99967462.5T patent/DK1144011T3/da active
- 1999-12-10 ES ES99967462T patent/ES2342637T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-12-10 DE DE69942128T patent/DE69942128D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-12-10 PT PT99967462T patent/PT1144011E/pt unknown
-
2001
- 2001-06-10 IL IL143666A patent/IL143666A/en not_active IP Right Cessation
- 2001-12-06 HK HK01108566.6A patent/HK1039272A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2010
- 2010-06-10 CY CY20101100510T patent/CY1111094T1/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2000033888A2 (en) | 2000-06-15 |
| DE69942128D1 (de) | 2010-04-22 |
| AU773420B2 (en) | 2004-05-27 |
| IL143666A0 (en) | 2002-04-21 |
| JP2003518000A (ja) | 2003-06-03 |
| PT1144011E (pt) | 2010-06-16 |
| EP1144011B1 (en) | 2010-03-10 |
| WO2000033888A3 (en) | 2001-11-08 |
| AU2373300A (en) | 2000-06-26 |
| WO2000033888A9 (en) | 2001-05-10 |
| NZ512171A (en) | 2004-07-30 |
| HK1039272A1 (en) | 2002-04-19 |
| DK1144011T3 (da) | 2010-07-05 |
| EP1144011A2 (en) | 2001-10-17 |
| IL143666A (en) | 2009-02-11 |
| CY1111094T1 (el) | 2015-10-07 |
| CA2354766A1 (en) | 2000-06-15 |
| ATE460180T1 (de) | 2010-03-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2342637T3 (es) | Compuestos profarmacos y procedimiento para su preparacion. | |
| AU2001266853B2 (en) | Prodrug compounds with an oligopeptide having an isoleucine residue | |
| AU2001275525B2 (en) | Tripeptide prodrug compounds | |
| US8034787B2 (en) | Enzyme-cleavable prodrug compounds | |
| ES2364452T3 (es) | Método para diseñar compuestos profármacos activados por cd10. | |
| KR101823526B1 (ko) | 유도형질로 활성화되는 다기능성 항암제 전구체, 이의 제조방법 및 이의 용도 | |
| AU2001266853A1 (en) | Prodrug compounds with an oligopeptide having an isoleucine residue | |
| AU2001275525A1 (en) | Tripeptide prodrug compounds | |
| CN111655294A (zh) | 作为通过组织蛋白酶b的肽链端解酶活性进行选择性裂解的底物的配体-药物-偶联物 | |
| CA2411660C (en) | Enzyme-cleavable prodrug compounds | |
| AU2001271301A1 (en) | Prodrug compounds cleavable by thimet oligopeptidase |