ES2326976T3 - Aparato y procedimiento para ensayar muestras liquidas. - Google Patents
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Abstract
Un artículo (100, 200) adaptado para contener una muestra licuada para la cuantificación de material biológico en la muestra, que comprende un dispositivo (110, 210) que tiene una cámara de reacción (112) que encierra un volumen en la misma, dicha cámara de reacción (112) tiene una abertura superior a través de la cual se puede verter una muestra licuada y una pluralidad de compartimentos discretos no permeables (126, 126a-c, 226), teniendo cada uno de dichos compartimentos (126, 126a-c, 226) un borde superior y estando configurado y dimensionado para contener partes alícuotas separadas de una muestra licuada en el mismo, y una tapa con junta de estanqueidad (122, 124, 222, 224) sujeta de forma que se puede quitar a la parte superior de dicho dispositivo (110, 210), estando configurada y dimensionada dicha tapa con junta de estanqueidad (122, 124, 222, 224) para sellar el borde superior de cada compartimento (126, 126a-c, 226) para evitar la comunicación líquida entre dichos compartimentos (126, 126a-c, 226), caracterizado porque la cámara de reacción (112) define un eje central a través de la misma y la pluralidad de compartimentos discretos no permeables (126, 126a-c, 226) están formados radialmente alrededor de dicho eje central, y por un distribuidor de carga (116) sujeto a la cámara de reacción (112) de modo que dicho distribuidor de carga (116) distribuye una muestra líquida a cada uno de los compartimentos (126, 126a-c, 226) mediante dicho distribuidor de carga (116).
Description
Aparato y procedimiento para ensayar muestras
líquidas.
La presente invención se refiere a
procedimientos para cuantificar material biológico en una muestra
licuada, y a artículos para repartir y contener el material
biológico durante la cuantificación, que comprende un dispositivo
que tiene una cámara de reacción que encierra un volumen en la
misma, dicha cámara de reacción tiene una abertura superior a
través de la cual se puede verter una muestra licuada, y una
pluralidad de compartimentos discretos no permeables, y cada uno de
dichos compartimentos tiene un borde superior y está configurado y
dimensionado para contener partes alícuotas separadas de una
muestra licuada en el mismo, y una tapa con junta de estanqueidad
sujeta de forma que se puede quitar a la parte superior de dicho
dispositivo, y dicha tapa con junta de estanqueidad está
configurada dimensionada para sellar el borde superior de cada
compartimento para evitar la comunicación líquida entre dichos
compartimentos.
La determinación y recuento de la concentración
microbiana es una parte esencial de los análisis microbiológicos en
muchas industrias, incluyendo industrias del agua, alimentarias,
cosméticas y farmacéuticas. Por ejemplo, la determinación de la
concentración bacteriana en el agua es una parte esencial del
ensayo de calidad del agua. En Estados Unidos, las normas de la
USEPA (Agencia de protección medioambiental de EE.UU.) requieren
que no haya presentes bacterias coliformes o Escherichia coli
(E. coli) en una muestra de agua potable de 100 ml. El
formato de "presencia/ausencia" de un medio de ensayo, tal
como las mezclas químicas COLILERT® y/o
COLILERT-18® (disponibles en IDEXX Laboratories,
Westbrook, Maine), cualquiera de las cuales se usa como un medio de
ensayo para detectar E. coli y bacterias coliformes, es muy
útil para hacer esta determinación. La mezcla química Colilert0 se
basa en la Defined Substrate Technology® (Tecnología de sustrato
definido) descrita por Edberg, "Method and Medium for use in
Detecting Target Microbes In Situ in A Specimen Sample of a
Possibly Contaminated Material". Véanse las patentes de EE.UU.
n° 4.925.789, 5.429.933 y 5.780.259.
Sin embargo, hay campos en los que es importante
la cuantificación, no sólo la detección, de la concentración
bacteriana. Los ejemplos de dichos campos incluyen ensayos de aguas
residuales, agua entrante en los sistemas de purificación de agua,
aguas superficiales, agua para uso recreativo y de alimentos.
Los procedimientos clásicos para la
cuantificación de material biológico son la técnica de filtración
por membrana (FM) y la técnica de fermentación en tubos múltiples
(FTM) que usan los procedimientos de número más probable (NMP). En
la filtración por membrana, el volumen de muestra requerido se
filtra a través de una membrana con un tamaño de poro muy pequeño
para atrapar bacterias de forma no específica. Después, la membrana
se pone en un medio, que soporta el crecimiento de las bacterias
objetivo. El medio después se incuba a una temperatura específica
durante un tiempo específico y se cuentan todas las colonias
resultantes. La técnica de FM es muy trabajosa y requiere expertos
en microbiología para realizar el ensayo. Además, una muestra que
pueda contener otras partículas distintas de bacterias (p. ej.,
muestras de aguas residuales o de agua para uso recreativo) pueden
atascar la membrana y dejarla inutilizable.
El procedimiento del NMP para la técnica de FTM
se describe en Recles y col., "Most Probable Number
Techniques" publicado en "Compendium of Methods for the
Microbiological Examination of Foods", 3ª ed. 1992, en las
páginas 105-199, y en Greenberg y col., "Standard
Methods For the Examination of Water and Wastewater" (8ª ed.
1992). En este procedimiento, se dispensa un volumen de muestra de
agua en varios tubos (p. ej., 10x10, 10 tubos que contienen cada
uno 10 ml) y se deja que las bacterias crezcan en todos los tubos.
Después de incubación a una temperatura específica durante un
tiempo específico, se cuenta el número de tubos positivos. Los
dispositivos y procedimientos de cuantificación microbiológica que
usan el procedimiento de NMP están disponibles en el comercio. Se
usan dispositivos y procedimientos tales como
Quanti-Tray® y Quanti-Tray® 2000
(IDEXX Corporation, Westbrook, Maine) para la cuantificación
bacteriana de muestras de agua potable, aguas superficiales, agua
para uso recreativo y aguas residuales. Dan una descripción
detallada de estos procedimientos y dispositivos Naqui y col. en
las patentes de EE.UU. n° 5.518.892; 5.620.895 y 5.753.456. Para
llevar a cabo estos ensayos, se requieren las etapas separadas de
adición de la muestra/reactivo al dispositivo y después sellado del
dispositivo con un aparato de sellado separado, antes del periodo
de incubación. Estos procedimientos y dispositivos ofrecen una
mejora significativa frente a las técnicas de FTM tradicionales en
términos de su facilidad de uso y también permiten la cuantificación
precisa de microorganismos en la muestra. Sin embargo, los
dispositivos de este tipo pueden requerir el uso de un instrumento
para distribuir la mezcla de muestra/medio en cada compartimento
individual.
Además de lo anterior, también se describen
dispositivos conocidos de la técnica anterior en los documentos EP
1192995 y EP 1046912. El documento EP 1192995 desvela una cubierta
y montaje de placa de pocillos múltiples que comprende una tapa y
una junta de estanqueidad. La tapa tiene un medio de muelle
integral para aplicar fuerza uniformemente sobre la superficie de
una junta de estanqueidad para sellar una placa de pocillos
múltiples. La tapa tiene componentes para la manipulación mecánica
y para la unión a una placa de pocillos múltiples.
El documento EP 1046912 describe un dispositivo
de ensayo para detectar la presencia o cantidad de material
biológico, analito(s) o microorganismo(s) en una
muestra. El dispositivo puede comprender una placa de incubación,
un dispositivo de tira reactiva u otros dispositivos. Los
dispositivos tienen una superficie en general horizontal y plana
que está dividida en una pluralidad de pocillos rebajados. Cada
pocillo o isla de reactivo está adaptado para contener una parte
alícuota de líquido. Los pocillos o islas de reactivo tienen un
tamaño y forma y están formados de un material adecuado, para
contener la parte alícuota en el interior del pocillo o isla de
reactivo por tensión superficial. Cualquier exceso de líquido de
la muestra licuada se drena desde la superficie del
dispositivo.
La presente invención se caracteriza porque la
cámara de reacción define un eje central a través de la misma y la
pluralidad de compartimentos discretos no permeables está formada
radialmente alrededor de dicho eje central, y por un distribuidor
de carga sujeto a la cámara de reacción de modo que dicho
distribuidor de carga distribuye la muestra de líquido a cada uno
de los compartimentos por dicha abertura superior.
La presente invención proporciona un
procedimiento mejorado y sencillo para repartir y contener las
muestras licuadas y para la cuantificación de microorganismos en
una muestra licuada sin la necesidad de usar un instrumento para
ayudar a la distribución de muestra. La invención en general usa un
artículo nuevo, que está diseñado para contener una muestra licuada
a la que se proporcionan reactivos químicos y/o microbiológicos. Por
ejemplo, dichos reactivos químicos pueden ser un medio de
crecimiento específico para detectar la presencia de bacterias
coliformes y E. coli, tal como la mezcla química Colilert®
descrita anteriormente u otros reactivos químicos/microbiológicos
que no se basan en la Defined Substrate Technology®. También puede
ser un medio de crecimiento específico para enterococos, tal como
la mezcla química Enterolert^{TM} (IDEXX Laboratories, Inc.). El
dispositivo está diseñado para aceptar la muestra licuada que se va
a ensayar y permitir que la muestra licuada se distribuya por todo
su volumen interno, y poner partes alícuotas en compartimentos
separados dentro del dispositivo. En general, dichos compartimentos
permitirán que se produzcan reacciones químicas o bioquímicas
separadas en una pluralidad de partes alícuotas de la muestra
licuada que se va a ensayar. Dichos compartimentos también evitarán
que una parte alícuota del líquido afecte a las reacciones en otra
parte alícuota. En una realización sencilla, la invención se
caracteriza por un artículo que tiene una tapa con junta de
estanqueidad puesta en la parte superior del dispositivo y una
cámara de reacción en la parte inferior del dispositivo, dicha
cámara de reacción contiene al menos dos compartimentos separados,
en los que se introduce una muestra licuada y la muestra licuada se
distribuye en los compartimentos individuales cerrando la tapa con
junta de estanqueidad del dispositivo. Cada compartimento contiene
entonces una parte alícuota de la muestra licuada original. En otra
realización, la invención se caracteriza por un artículo que tiene
una tapa con junta de estanqueidad puesta en la parte superior del
dispositivo, una cámara de rebose de líquido y una cámara de
reacción en la parte inferior del dispositivo, dicha cámara de
reacción contiene al menos dos compartimentos separados, conteniendo
cada compartimento una cantidad predeterminada de mezcla química,
lo que permite la detección de la presencia de material biológico,
en los que se introduce una muestra licuada, y porque la muestra
licuada queda distribuida en los compartimentos individuales
simplemente cerrando la tapa con junta de estanqueidad del
dispositivo. Cada compartimento contiene entonces una parte
alícuota de la muestra licuada original.
En general, el dispositivo tiene una forma
circular con una tapa con junta de estanqueidad puesta en la parte
superior y en una parte final más ancha del dispositivo. Tras el
cierre del dispositivo, la fuerza de compresión hacia abajo permite
que la muestra licuada se reparta en cada compartimento y que la
junta de estanqueidad se acople en una acción de sellado con el
borde superior de cada compartimento, aislando de esta forma la
muestra licuada en cada compartimento. Esta junta de estanqueidad
sola o combinada con otras características del dispositivo debe
resistir cualquier presión interna, que es generada por la
actividad del material biológico, durante hasta 5 días después de
que se haya sellado el dispositivo. En una realización preferida,
la tapa con junta de estanqueidad tiene cierres de tipo bayoneta
tanto internos como externos, que se acoplan con un giro rotacional
de 1/32 a 1/2; preferiblemente 1/16 a 1/8 de la tapa; esto crea la
fuerza de compresión hacia abajo de la junta de estanqueidad en el
borde superior de cada compartimento, sellándolo y aislándolo así
de todos los demás compartimentos de ensayo. La cámara de rebose de
líquido en el dispositivo está adaptada para acomodar cualquier
exceso de volumen de muestra licuada; preferiblemente esta cámara
de rebose permitirá retener de 0 a 50% del volumen total de
muestra.
muestra.
En una realización preferida, la cámara de
rebose es una zona de recolección de tipo foso o de tipo anillo
anual que rodea el dispositivo. En otra realización, la cámara de
rebose puede estar situada en el centro del dispositivo. En otra
realización más, puede estar presente en el dispositivo tanto la
cámara de rebose situada centralmente como la de tipo foso. Hay al
menos dos compartimentos en la cámara de reacción. El número de
compartimentos está configurado de forma que se alcance un
intervalo de recuento del NMP conveniente. Normalmente, el número
de compartimentos es entre 5 y 60 ambos incluidos, preferiblemente
en el intervalo entre 12 y 36. En general, los compartimentos son
de tamaño sustancialmente igual, para contener una parte alícuota
de aproximadamente 0,1 a 100 ml, preferiblemente en el intervalo de
1,5 a 20 ml de parte alícuota; incluso más preferiblemente en el
intervalo de 2,5 ml a 5,5 ml. Los compartimentos pueden tener
cualquier forma tal como circular, triangular, rectangular, elíptica
o trapezoidal, preferiblemente, forma trapezoidal. La forma
trapezoidal puede promover la entrada de muestra licuada en el
diámetro interior truncado menor, mientras que el extremo abierto
mayor del trapezoide permite la salida sin restricción del aire
desplazado de dentro de cada compartimento. Los compartimentos
pueden estar dispuestos en cualquier formato en el dispositivo,
preferiblemente en una forma circular.
En otras realizaciones adicionales, una primera
pluralidad de compartimentos tiene un tamaño (p. ej., 3 ml) y se
proporciona una segunda pluralidad y/o una tercera pluralidad de
compartimentos de diferentes tamaños, p. ej., de tamaño menor (p.
ej., 0,03 y 0,3 ml) que el de la primera pluralidad. Estas
realizaciones tienen aplicación para uso cuando la concentración
del material biológico que se va a cuantificar en la muestra es
alta. Los diferentes tamaños de los compartimentos eliminan la
necesidad de diluir la muestra, ahorrando así tiempo y posibles
errores debidos a la dilución, y aumenta la precisión total de la
cuantificación.
En un aspecto relacionado, la invención presenta
un kit de ensayo para usar en la cuantificación de un material
biológico en una muestra licuada. El kit de ensayo incluye un
artículo como se ha descrito anteriormente y una mezcla química de
detección biológica específica para detectar bacterias coliformes y
E. coli u otra mezcla química para detectar enterococos. En
otra realización más, el kit de ensayo incluye un artículo como se
ha citado antes y una cantidad predeterminada adecuada de mezcla
química de detección biológica específica en los compartimentos
separados.
En un aspecto relacionado, la invención presenta
un procedimiento para cuantificar un material biológico en una
muestra licuada. El procedimiento incluye las etapas de
proporcionar un artículo como se ha descrito antes y añadir un
medio de ensayo a la muestra licuada, que después se añade al
dispositivo. El procedimiento incluye además distribuir la mezcla
en compartimentos individuales dentro del dispositivo de modo que
la mezcla del medio de ensayo y la muestra licuada esté bien
asegurada en una pluralidad de partes alícuotas separadas dentro de
los compartimentos. Después, el procedimiento finalmente implica la
detección de la presencia o ausencia de material biológico en cada
compartimento por cualquiera de una serie de medios estándar, por
ejemplo como se describe a continuación. En un aspecto adicional
relacionado, la invención presenta un procedimiento para
cuantificar un material biológico en una muestra licuada. El
procedimiento incluye las etapas de proporcionar un artículo con la
cantidad predeterminada de mezclas químicas en los compartimentos
como se ha descrito antes, y añadir una muestra licuada en el
dispositivo. El procedimiento incluye además distribuir la muestra
licuada en cada compartimento individual dentro del dispositivo, de
modo que la mezcla de medio de ensayo y la muestra licuada se
cierre bien en una pluralidad de partes alícuotas separadas dentro
de los compartimentos. Después, el procedimiento finalmente implica
la detección de la presencia o ausencia de material biológico en
cada compartimento por cualquiera de una serie de medios estándar.
Los procedimientos de esta invención incluyen además incubar el
dispositivo a la temperatura deseada durante un periodo de tiempo
deseado para permitir el crecimiento y la detección de bacterias, o
la reacción de cualquier entidad química, dentro de la muestra
licuada y el medio de ensayo.
En realizaciones preferidas, el material
biológico que se va a cuantificar es E. coli y bacterias
coliformes. Sin embargo, estos aspectos de la invención se pueden
aplicar a cualquier material biológico que se va a cuantificar, p.
ej., enterococos, estafilococos, listerias, bacteriófagos (o
virus), o proteína que está presente a cualquier nivel en la
muestra, con la condición de que se pueda detectar una o una
pluralidad de unidades del material. La elección de un medio de
ensayo dependerá del material biológico que se vaya a detectar. El
medio de ensayo preferiblemente es un medio que detectará la
presencia del material biológico que se busca cuantificar, y no
detecta sustancialmente la presencia de otro material biológico que
pueda estar en la muestra. También podría ser un material que
causara algún cambio visible o perceptible de otra forma, tal como
cambios de color y/o fluorescencia, si el material biológico que se
va a detectar y cuantificar está presente en la muestra.
Por lo tanto, la presente invención es un
procedimiento nuevo para cuantificar material biológico en una
muestra licuada. Este procedimiento es mucho más fácil de usar
comparado con los procedimientos de transición de FM y otros
procedimientos basados en el NMP. Además, este procedimiento no
requiere el uso de un instrumento para distribuir y aislar la
muestra licuada en el dispositivo. Debido a que la presente
invención es fácil de usar, esta invención tiene aplicación para
servir simultáneamente como dispositivo de toma de muestra y
cuantificación. Los dispositivos y procedimientos de esta invención
no requieren personal de laboratorio formado para realizar el
ensayo en el ámbito del laboratorio. En cambio, se puede usar como
un dispositivo de toma de muestra directo y permite la
cuantificación de material biológico, procedimiento que tiene lugar
en el mismo sitio en el terreno. El procedimiento en general
incluye las siguientes etapas: añadir la muestra licuada en un
artículo diseñado para retener la muestra, permitir formar partes
alícuotas en una serie de compartimentos separados, sellar el
recipiente cerrando la tapa superior del recipiente y por lo tanto
distribuir la muestra de forma sustancialmente igual entre una
pluralidad de compartimentos discretos no permeables en el
artículo, de modo que la mezcla del medio de ensayo y la muestra
están bien cerradas dentro de los compartimentos sin el riesgo de
contaminación cruzada; incubar el artículo; y recoger y analizar
los resultados.
La presente invención también presenta un
artículo nuevo para contener la muestra licuada durante el
procedimiento de cuantificación. El artículo incluye una abertura
por la cual se puede verter una muestra licuada en el artículo; una
pluralidad de compartimentos impermeables al líquido configurados y
dispuestos para separar la muestra licuada; y un paso que permite
que la muestra licuada se distribuya de forma sustancialmente
uniforme por los compartimentos individuales del artículo. El
compartimento individual está formado de manera que la mezcla
licuada quede repartida y asegurada en estos compartimentos
discretos impermeables.
El artículo y su uso dependen de la presencia de
una pluralidad de compartimentos, que pueden estar formados de
modo que sean esencialmente impermeables a la muestra y el medio de
ensayo usado y a cualquier producto(s)
de reacción resultante(s). El número de compartimentos puede variar, pero debe ser suficiente para que cualquier muestra pueda ser analizada con la precisión requerida. En realizaciones preferidas, la pluralidad de compartimentos se crea por la técnica de moldeo por inyección o la técnica de extrusión. Como se ha indicado antes, el artículo de esta invención puede estar hecho de cualquier material, que se pueda moldear en compartimentos impermeables a líquidos, tales como, por ejemplo, PVC, polipropileno o poliestireno. El material elegido puede variar dependiendo del sustrato o el producto de cualquier reacción química. Por ejemplo, si se indica la presencia de bacterias específicas por la producción de orto-nitrofenol (ONP), no debe poder pasar por el material del artículo o difundirse de un compartimento a los demás una cantidad significativa de este producto, durante el procedimiento de
cuantificación.
de reacción resultante(s). El número de compartimentos puede variar, pero debe ser suficiente para que cualquier muestra pueda ser analizada con la precisión requerida. En realizaciones preferidas, la pluralidad de compartimentos se crea por la técnica de moldeo por inyección o la técnica de extrusión. Como se ha indicado antes, el artículo de esta invención puede estar hecho de cualquier material, que se pueda moldear en compartimentos impermeables a líquidos, tales como, por ejemplo, PVC, polipropileno o poliestireno. El material elegido puede variar dependiendo del sustrato o el producto de cualquier reacción química. Por ejemplo, si se indica la presencia de bacterias específicas por la producción de orto-nitrofenol (ONP), no debe poder pasar por el material del artículo o difundirse de un compartimento a los demás una cantidad significativa de este producto, durante el procedimiento de
cuantificación.
En realizaciones en las que se proporcionan
compartimentos de diferentes tamaños, los artículos permiten la
cuantificación más precisa sin dilución de la muestra licuada. Por
lo tanto, las ventajas de dicho artículo son que elimina las etapas
de dilución ahorrando tiempo y evitando cualquier potencial error
debido a la dilución.
Otras características y ventajas de la invención
serán evidentes a partir de la siguiente descripción de sus
realizaciones preferidas y a partir de las reivindicaciones.
Las ventajas y características anteriores del
aparato y los procedimientos que se están describiendo para el
ensayo de una muestra licuada se harán evidentes más fácilmente y
se entenderán en relación con la siguiente descripción detallada de
realizaciones ilustrativas, tomadas en conjunto con los dibujos que
acompañan, en los que:
la fig. 1 es una vista en perspectiva lateral de
una realización ilustrativa de un aparato de ensayo de muestra
líquida construido de acuerdo con la presente descripción;
la fig. 2 es vista de la sección transversal de
la fig. 1, que muestra la orientación relativa de las diferentes
características internas de la realización de la fig. 1;
la fig. 3 es una vista de la sección transversal
con los componentes separados;
la fig. 4 es una vista en perspectiva con los
componentes separados, desde una perspectiva orientada ligeramente
en ángulo y hacia abajo de la realización de la fig. 1;
la fig. 5 es otra vista en perspectiva con los
componentes separados, desde una perspectiva orientada ligeramente
en ángulo y hacia arriba de la realización de la fig. 1;
la fig. 6 es una vista plana superior de un
recipiente del aparato de ensayo de muestra líquida;
la fig. 7 es una vista plana superior que
ilustra esquemáticamente una disposición alternada de
compartimentos objetivo;
la fig. 8 es una vista plana superior que
ilustra esquemáticamente una disposición alternada de los
compartimentos objetivo con diferentes tamaños; y
la fig. 9 es una vista en perspectiva con los
componentes separados desde una perspectiva orientada ligeramente
en ángulo y desde arriba de un diseño alternativo de una pieza, que
incorpora las características de componentes múltiples en una sola
unidad; e incorpora las funciones de la realización de la fig.
1.
En relación ahora en detalle específico con los
dibujos, en los que números de referencia iguales identifican
elementos similares o idénticos a lo largo de las diversas vistas,
la siguiente descripción detallada se centrará en las realizaciones
de ejemplo específicas de aparato y procedimientos de ensayos de
muestras de agua. Sin embargo, debe entenderse que el aparato y los
procedimientos descritos en el presente documento se pueden
adaptar para usar en el ensayo de la presencia/ausencia y la
cuantificación de material biológico en diferentes tipos de
muestras licuadas, según se desee o sea necesario para una
aplicación dada. Por consiguiente, el aparato y los procedimientos
ahora descritos se pueden aplicar a cualquier material biológico
que esté presente con cualquier nivel en una muestra licuada (con
la condición de que una o más unidades del material se puedan
detectar), y a cualquier medio de ensayo aplicable.
En relación ahora con las figuras
1-5, se muestra de forma general una realización
ilustrativa de un aparato de ensayo de agua configurado y adaptado
específicamente para lograr la indicación de la presencia/ausencia
de un microorganismo objetivo, por ejemplo, E. coli y
bacterias coliformes, como el dispositivo de ensayo 100 en forma de
una unidad independiente. Sin embargo, se contempla que el aparato
y procedimiento de ensayo de líquido ahora descritos pueden
adaptarse a ensayos para la cuantificación basada en procedimientos
de NMP.
Algunos de los componentes del dispositivo de
ensayo 100 pueden montarse como un submontaje antes del montaje de
la unidad completa. Por ejemplo, un submontaje 110 del dispositivo
de ensayo 100 puede consistir en un miembro de contención de
múltiples compartimentos tal como el recipiente 112 sellado en un
extremo inferior por un cierre sustancialmente transparente o
translúcido, tal como una ventana transparente 114, un distribuidor
de carga 116, un sellado adherente 118 y un anillo de carga 120.
Alternativamente, un submontaje de la cámara de múltiples
compartimentos 110 del dispositivo de ensayo 100 puede estar
diseñado para incorporar las características de componentes
múltiples en una sola unidad (como se muestra en la cámara 210 en
la fig. 9); e incorpora las funciones de la realización de la fig.
1.
El recipiente 112 se forma con cualquier
material impermeable a líquidos adecuado, por ejemplo PVC,
polipropileno o poliestireno, por técnicas adecuadas tales como
moldeo por inyección. Como se muestra en las figuras
3-6, el recipiente 112 tiene configuración
cilíndrica con un conjunto circular de 36 compartimentos objetivo
126 individualmente aislados en forma radial alrededor de un hueco
cilíndrico central definido por la pared interior 128. El extremo
inferior del recipiente 112 puede estar sellado mediante un
componente plano transparente tal como una ventana 114, que se
sella en el extremo del recipiente 112 mediante técnicas adecuadas,
por ejemplo, soldado con ultrasonidos, adhesivos u otras técnicas
conocidas. Está previsto que la ventana 114 pueda proporcionar
características de potenciación de la legibilidad, por ejemplo
aumentos para proporcionar al usuario una vista aumentada del
extremo de cada compartimento de ensayo 126. Alternativamente, el
recipiente 112 puede formarse mediante una técnica de modelo por
inyección (como se muestra por la cámara 210 en la fig. 9) con un
extremo inferior cerrado transparente.
Cada uno de los compartimentos objetivo 126 se
termina en un extremo en la pared interior 128, se extiende
radialmente hacia el exterior y termina cerca de la periferia del
recipiente 112. Los compartimentos objetivo 126 están configurados
y dimensionados para contener una cantidad predeterminada de
muestra para que se corresponda con una cantidad medida
predeterminada de medio que se va a mezclar con la muestra e
incubar en cada compartimento respectivo. Por ejemplo, el
dispositivo de ensayo 100 puede estar configurado y dimensionado
para recibir un volumen de muestra de aproximadamente 100 ml, que
cuando se divide en cada uno de los 36 compartimentos dará como
resultado 2,78 ml que están potencialmente disponibles para cada
compartimento objetivo 126.
Como se muestra en las figuras
3-5, el distribuidor de carga 116 está sujeto al
extremo superior abierto de la pared circular interior 128 mediante
técnicas de unión adecuadas tales como ajustado por fricción,
adhesivos, soldado con ultrasonidos o similares. El distribuidor de
carga 116 está sujeto al recipiente 112 de modo que una superficie
convexa del distribuidor 116 esté orientada hacia la parte superior
del recipiente 112. La superficie convexa del distribuidor de carga
116 se puede seleccionar de diferentes configuraciones de
superficie, tales como en forma cónica, troncocónica o de cúpula.
Alternativamente, los distribuidores de carga 116, 116a y 116b
(Figuras 7 y 8) pueden ir provistos de canales formados en los
mismos para descargar, dividir y dirigir la muestra licuada y/o
mezcla de muestra/medio hacia los compartimentos objetivo 126, 126a,
126b y/o 126c.
Opcionalmente, un sellado que se puede quitar
tal como un sellado de lámina desprendible 118, se puede
configurar y determinar las dimensiones para sellar los extremos
superiores abiertos de los compartimentos objetivo 126 para
asegurar la integridad de cada uno de los compartimentos objetivo
individuales. Si es necesario, el sellado 118 preferiblemente se
asegura al extremo abierto del recipiente 112 después de haber
añadido las cantidades medidas de medio para proporcionar una
barrera de fluido que evite la contaminación de los compartimentos
y la pérdida de medio. El sellado 118 puede formarse como un
sellado de lámina sensible a la presión con una parte de pestaña
extendida 118a, que el usuario agarra fácilmente para quitar el
sellado justo antes de introducir la muestra. Como se muestra en
las figuras 3-5, el sellado 118 está configurado y
dimensionado para ajustar encima del distribuidor de carga 116 y
los compartimentos objetivo 126. Está previsto que el sellado 118
puede estar formado con una configuración de tipo arandela con una
abertura en el medio para ajustar alrededor del perímetro del
distribuidor de carga 116.
Los compartimentos objetivo 126 se muestran como
de volumen uniforme y que tienen una forma de sección transversal
trapezoidal, que es más estrecha más cerca del centro del
recipiente 112 y más ancha hacia su periferia exterior. De esta
forma, una muestra de fluido vertida en el dispositivo de ensayo
100 se dispensa de forma eficaz en cada uno de los compartimentos
objetivo 126, como se describe con mayor detalle en el presente
documento. También se contempla que los compartimentos objetivo 126
pueden estar formados con secciones transversales de otras
geometrías, tener volúmenes diferentes entre sí, tal como 126b y
126c (mostrado en la fig. 8) o incluir varios grupos de
compartimentos que tienen el mismo volumen, por ejemplo para
realizar múltiples ensayos simultáneamente (ensayo multiplexado)
cuando ensayos diferentes requieren volúmenes diferentes del
compartimento objetivo.
Adicionalmente, está previsto que los
compartimentos objetivo 126 pueden disponerse con diferentes
patrones limitados sólo por los límites espaciales de la
superficie transversal lateral del recipiente 112. Por ejemplo,
como se muestra en la fig. 7, los compartimentos objetivo 126a que
tienen una abertura con sección transversal lateral uniforme pueden
formarse en un conjunto a lo largo de la superficie del recipiente
112 representado esquemáticamente mediante círculos que tienen
centros indicados por un "+". Los compartimentos objetivo 126a
pueden formarse en cualquier configuración geométrica deseada. Se
contemplan diferentes configuraciones de recipiente en los que los
compartimentos objetivo pueden formarse en diferente número y los
diferentes tamaños que puedan desearse o sean necesarios para
lograr los objetivos del ensayo particular especificado.
Preferiblemente se pone un medio para facilitar
el crecimiento del microorganismo objetivo en cada uno de los
compartimentos objetivo 126 antes del montaje final del dispositivo
de ensayo 100. Dependiendo del ensayo que se va a realizar, se
pueden usar diferentes medios para detectar diferentes
microorganismos. También está previsto que el dispositivo de esta
invención se puede usar o configurar para detectar cualquier
analito detectable, por ejemplo analitos químicos, tales como
cloro total, cloro libre, nitrato, fluoruro, fósforo, en la muestra
licuada para el análisis químico de agua. Los reactivos químicos en
polvo pueden dispensarse en cantidades medidas, directamente en
cada uno de los compartimentos objetivo 126 de modo que el medio se
disuelva inmediatamente en la muestra cuando la muestra se vierte
en el dispositivo de ensayo 100. En algunos casos, puede ser
conveniente realizar ensayos paralelos en diferentes compartimentos
o grupos de compartimentos. Este procedimiento también se denomina
ensayo multiplexado.
La elección del medio de ensayo dependerá del
material biológico que se va a detectar. El medio de ensayo
preferiblemente detecta la presencia/ausencia del material
biológico y preferiblemente no detecta la presencia de otro
material biológico que es probable que esté en el medio. Podría ser
un material que causara algún cambio visible o perceptible de otra
forma, tal como cambio de color o fluorescencia, si el material
biológico que se va a detectar está presente en la muestra. En una
realización, el medio está en una forma en polvo para simplificar
el procedimiento de fabricación general. Además, el uso de un medio
en polvo potencia mucho la estabilidad del medio y proporciona una
mayor vida en anaquel para los dispositivos de ensayo montados
100. El polvo puede dispensarse en cantidades medidas directamente
en cada uno de los compartimentos objetivo 126, de modo que el
medio se disuelva inmediatamente en la muestra cuando la muestra se
vierte en el dispositivo de ensayo 100. En una realización
preferida, se añaden perlas tales como perlas de vidrio, perlas de
gel de sílice, o perlas metálicas junto con el medio en polvo a
los compartimentos objetivo 126, permitiendo la disolución rápida
del polvo mediante agitación del dispositivo de ensayo montado 100
tras la introducción de la muestra en el dispositivo.
En realizaciones alternativas, se pueden usar
otros procedimientos de dispersión del medio rápidos, por ejemplo,
se puede usar un material de contención de sólido poroso para formar
el medio de retención y bolsas de dispersión (no se muestra) que se
pueden insertar individualmente en tantos compartimentos objetivo
126 como se desee. También está contemplado que se pueden poner
las bolsas de dispersión que contienen diferentes medios para
realizar diferentes ensayos en el mismo dispositivo de ensayo 100
en diferente compartimentos de ensayo 126, para facilitar el ensayo
multiplexado. Las bolsas de dispersión de medio funcionan de una
forma análoga a la de una bolsa de té, en las que el material de
la bolsa es poroso para permitir el paso de flujo de fluidos a
través del mismo. Sin embargo, el tamaño de los poros formados en
el material que componen las bolsas preferiblemente se hace para
retener el medio hasta que la muestra fluida lo disuelva. También
están previstos otros dispositivos y técnicas más de dispersión del
medio rápidos, por ejemplo, comprimidos de disolución rápida,
sellados permutables con agua, etc. En cada una de las
realizaciones de colocación de medio indicadas antes, el medio
forma una parte integrada del dispositivo como se envía, eliminando
por lo tanto la necesidad de un paquete de medio separado y la
etapa separada de preparar el medio. Sin embargo, dicho
empaquetamiento separado es una opción contemplada en el presente
documento.
Se proporcionan una tapa sellable tal como la
tapa con rosca 124 y junta de estanqueidad 122 para formar un
sellado en el extremo abierto de cada cámara objetivo 126 con
respecto al entorno exterior y con respecto a cada una de las otras
cámaras objetivo 126. La junta de estanqueidad 122 preferiblemente
es un material hidrófobo, tal como un material de junta de
estanqueidad de espuma de células cerradas no absorbente. De esta
forma, se proporciona un entorno de ensayo sellado. Además, se
evita la contaminación cruzada (interferencia) entre los
compartimentos objetivo 126 individuales. Alternativamente, si solo
se desea la ventilación de gas, tal como descargar la presión
acumulada de una reacción exotérmica, entonces se pueden configurar
agujeros de ventilación como aberturas de válvulas de purga que
permiten que la presión de gas acumulada escape, mientras que
evitan la introducción del aire ambiente en las cámaras objetivo
126.
Se sujeta un collar anular de carga 200 opcional
en el extremo superior del recipiente 112 mediante técnicas de
unión adecuadas, por ejemplo, ajuste por fricción, soldado por
ultrasonidos, pegado, adhesivos, etc. El collar anular de carga 120
incluye un canal de rebose formado alrededor de su periferia para
recibir y contener el exceso de muestra que pueda desbordarse
después de haberse llenado las cámaras objetivo 126.
En un procedimiento ilustrativo que usa el
dispositivo 100, la tapa 124 y la junta de estanqueidad 122
retenidos en el mismo se quitan. El sellado 118 se desprende y se
vierten 100 ml de muestra y se distribuyen a cada una de las
cámaras mediante el distribuidor de carga 116. No se requiere
tratamiento previo de la muestra para la realización en la que el
medio activo se dispensa previamente y se seca dentro de las
cámaras objetivo. La muestra llena, con medidas iguales, cada uno
de los pocillos, donde rehidrata el medio y se mezcla con el mismo
para lograr una mezcla de muestra/medio adecuada. Alternativamente,
la muestra se puede mezclar con el medio de ensayo que forma una
mezcla de muestra/medio antes de su introducción en el
dispositivo.
La tapa roscada 124, que contiene una junta de
estanqueidad 122 de espuma de células cerradas no absorbente,
después se devuelve al recipiente exterior. La junta de
estanqueidad 122 se comprime así para ponerse en contacto con la
parte superior del recipiente 112. Esta acción sella cada cámara
objetivo 126 del resto de los compartimentos y el entorno exterior.
Durante esta acción, la junta de estanqueidad 122 también dirige
cualquier exceso de muestra al canal de rebose 122a, que está
diseñado y puesto de una forma para aislar el exceso de volumen del
conjunto de los compartimentos de ensayo 126. Esta acción de
aislamiento interior evita que cualquiera de las reacciones de
ensayo individuales experimente contaminación cruzada debido a una
muestra en cualquiera de los otros compartimentos de ensayo
126.
Después, el dispositivo de ensayo 100 se incuba
o se deja a temperatura ambiente durante la duración requerida
indicada por el protocolo de ensayo particular para desarrollar el
resultado (preferiblemente un cambio colorimétrico, que se puede
ver a simple vista). Después, se cuentan estas indicaciones
positivas. El dispositivo se puede incubar hacia arriba o al revés.
Además, el dispositivo se puede volver a abrir, mediante la tapa
roscada, permitiendo el subcultivo adicional de aislados
individuales, que se puedan desarrollar durante el periodo de
ensayo.
Tras completarse el ensayo, el dispositivo puede
desecharse por procedimientos adecuados. La plataforma del
dispositivo permite el ensayo "multiplexado" de diferentes
tipos de medio, es decir, permite que se lleven a cabo una serie de
ensayos simultáneamente.
También está previsto un procedimiento
alternativo en el que no se requiere junta de estanqueidad. En esta
realización, se puede proporcionar una tapa (no se muestra) para
facilitar la distribución de la muestra y sellar individualmente
cada uno de los compartimentos de ensayo de las cámaras
adyacentes.
En relación con la fig. 9, se muestra una
realización alternativa adicional del presente aparato de ensayo de
muestra líquida descrito como dispositivo de ensayo 200. En lugar
de los múltiples componentes que forman el submontaje de la cámara
de múltiples compartimentos 110 del dispositivo de ensayo 100 como
se muestra en la fig. 3, el dispositivo de ensayo 200 incluye una
cámara unitaria 210 que incorpora las características de múltiples
componentes en una sola unidad, por ejemplo, por medio de moldeo
por inyección.
Se proporcionan una tapa sellable tal como la
tapa 224 y la junta de estanqueidad 222, para formar un sellado en
el extremo abierto de cada cámara objetivo 226 con respecto al
entorno exterior y con respecto a cada una de las otras cámaras
objetivo 226. La junta de estanqueidad 222 preferiblemente es de un
material hidrófobo, tal como un material de junta de estanqueidad
de espuma de células cerradas no absorbente, para proporcionar un
entorno de ensayo sellado y evitar la contaminación cruzada entre
las cámaras objetivo 226. La tapa 224 está sujeta de forma que se
puede quitar a la cámara 210, por ejemplo, mediante sujetadores de
tipo bayoneta 210a y 210b formados alrededor de la periferia del
collar anular de carga 220 y el distribuidor de carga 216,
respectivamente. También están previstos procedimientos de sujeción
que se pueden quitar alternativos, tales como acoplamiento
enroscado.
Claims (26)
1. Un artículo (100, 200) adaptado para contener
una muestra licuada para la cuantificación de material biológico
en la muestra, que comprende un dispositivo (110, 210) que tiene
una cámara de reacción (112) que encierra un volumen en la misma,
dicha cámara de reacción (112) tiene una abertura superior a través
de la cual se puede verter una muestra licuada y una pluralidad de
compartimentos discretos no permeables (126, 126a-c,
226), teniendo cada uno de dichos compartimentos (126,
126a-c, 226) un borde superior y estando
configurado y dimensionado para contener partes alícuotas separadas
de una muestra licuada en el mismo, y una tapa con junta de
estanqueidad (122, 124, 222, 224) sujeta de forma que se puede
quitar a la parte superior de dicho dispositivo (110, 210), estando
configurada y dimensionada dicha tapa con junta de estanqueidad
(122, 124, 222, 224) para sellar el borde superior de cada
compartimento (126, 126a-c, 226) para evitar la
comunicación líquida entre dichos compartimentos (126,
126a-c, 226), caracterizado porque la cámara
de reacción (112) define un eje central a través de la misma y la
pluralidad de compartimentos discretos no permeables (126,
126a-c, 226) están formados radialmente alrededor
de dicho eje central, y por un distribuidor de carga (116) sujeto a
la cámara de reacción (112) de modo que dicho distribuidor de carga
(116) distribuye una muestra líquida a cada uno de los
compartimentos (126, 126a-c, 226) mediante dicho
distribuidor de carga (116).
2. El artículo (100, 200) de la reivindicación 1
que además comprende un medio de ensayo previamente dispensado en
cada compartimento (126, 126a-c, 226).
3. El artículo (100, 200) de la reivindicación 1
o la reivindicación 2, en el que los compartimentos (126,
126a-c, 226) tienen una forma con sección
transversal trapezoidal.
4. El artículo (100, 200) de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que el número de compartimentos (126,
126a-c, 226) es entre 12 y 36.
5. El artículo (100, 200) de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que los compartimentos (126,
126a-c, 226) son sustancialmente del mismo
tamaño.
6. El artículo (100, 200) de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que los compartimentos (126,
126a-c, 226) están configurados y dimensionados para
contener aproximadamente 4 mililitros de líquido.
7. El artículo (100) de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que una primera pluralidad de los
compartimentos (126b) tienen un primer tamaño y una segunda
pluralidad de los compartimentos (126c) tienen un segundo tamaño
que es un tamaño menor que el primer tamaño.
8. El artículo (100) de la reivindicación 7, que
además comprende una tercera pluralidad de los compartimentos que
tienen un tercer tamaño diferente de dicha primera pluralidad y
dicha segunda pluralidad de compartimentos (126b, 126c).
9. El artículo (100) de la reivindicación 7 o
reivindicación 8, en el que el número de la primera pluralidad de
compartimentos (126b) es entre 12 y 36, y el número de la segunda
pluralidad de compartimentos (126c) es entre 12 y 36.
10. El artículo (100) de cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 9, en el que la primera pluralidad de
compartimentos (126b) están configurados y dimensionados para
contener aproximadamente 3 mililitros de líquido y la segunda
pluralidad de compartimentos (126c) están configurados y
dimensionados para contener aproximadamente 0,3 mililitros de
líquido.
11. El artículo (100, 200) de cualquier
reivindicación precedente en el que el dispositivo está formado al
menos parcialmente de poliestireno.
12. El artículo (200) de cualquier
reivindicación precedente en el que la tapa con junta de
estanqueidad (222, 224) tiene cierres de tipo bayoneta tanto
internos como externos (210b, 210a).
13. Un kit (100, 200) para usar en la
cuantificación de material biológico en una muestra licuada que
comprende un dispositivo (110, 210) que tiene una cámara de
reacción (112) que encierra un volumen en la misma, y dicha cámara
de reacción tiene una abertura superior a través de la cual se
puede verter una muestra licuada y una pluralidad de compartimentos
discretos no permeables (126, 126a-c, 226),
teniendo cada uno de dichos compartimentos (126,
126a-c, 226) un borde superior y estando configurado
y dimensionado para contener partes alícuotas separadas de una
muestra licuada en el mismo, y una tapa con junta de estanqueidad
(122, 124, 222, 224) sujeta de forma que se puede quitar a la parte
superior de dicho dispositivo (110, 210), estando configurada y
dimensionada dicha tapa con junta de estanqueidad (122, 124, 222,
224) para sellar el borde superior de cada compartimento para
evitar la comunicación líquida entre dichos compartimentos, y un
medio de detección biológico específico, caracterizado porque
la cámara de reacción (112) define un eje central a través de la
misma y la pluralidad de compartimentos discretos no permeables
(126, 126a-c, 226) están formados radialmente
alrededor de dicho eje central, y por un distribuidor de carga
(116) sujeto a la cámara de reacción (112) de modo que dicho
distribuidor de carga (116) distribuye una muestra líquida a cada
uno de los compartimentos (126, 126a-c, 226) por
dicha abertura superior mediante dicho distribuidor de carga
(116).
14. El kit (100, 200) de acuerdo con la
reivindicación 13, en el que el medio de detección biológico
específico es un medio para detectar bacterias coliformes y E.
coli en una muestra.
15. El kit (100, 200) de acuerdo con la
reivindicación 13, en el que el medio de detección biológico
específico es un medio para detectar bacterias enterocócicas en una
muestra.
16. Un procedimiento para cuantificar material
biológico en una muestra licuada que comprende las etapas de:
a) proporcionar un dispositivo (110, 210) que
tiene una cámara de reacción (112) que encierra un volumen en la
misma, dicha cámara de reacción (112) tiene una abertura superior
por la que se puede verter una muestra licuada y una pluralidad de
compartimentos discretos no permeables (126,
126a-c, 226), teniendo cada uno de dichos
compartimentos (126, 126a-c, 226) un borde superior
y estando configurado y dimensionado para contener partes
alícuotas separadas de una muestra licuada en el mismo, y una tapa
con junta de estanqueidad (122, 124, 222, 224) sujeta de forma que
se puede quitar a la parte superior de dicho dispositivo (110,
210), estando configurada y dimensionada dicha tapa con junta de
estanqueidad (122, 124, 222, 224) para sellar el borde superior de
cada compartimento (126, 126a-c, 226) para evitar
la comunicación líquida entre dichos compartimentos;
b) añadir una muestra licuada a dicho
dispositivo (110, 210);
c) distribuir la muestra licuada en dichos
compartimentos del dispositivo (126, 126a-c, 226)
vertiendo dicha muestra licuada en un distribuidor de carga (116)
sujeto a la cámara de reacción (112);
d) sujetar la tapa con junta de estanqueidad
(122, 124, 222, 224) a la parte superior de dicho dispositivo
(110, 210) sellando de esta forma dichos compartimentos (126,
126a-c, 226; y
e) detectar la presencia o ausencia de dicho
material biológico en cada uno de dichos compartimentos (126,
126a-c, 226);
caracterizado porque la cámara de
reacción (112) del dispositivo proporcionado en la etapa a) define
un eje central a través de la misma y la pluralidad de
compartimentos discretos no permeables (126, 126a-c,
226) están formados radialmente alrededor del eje central.
17. El procedimiento de la reivindicación 16, en
el que los microorganismos que se van a cuantificar se seleccionan
de una o más especies bacterianas y el medio de ensayo es un medio
de detección biológico específico.
18. El procedimiento de la reivindicación 16 o
reivindicación 17, en el que el medio biológico específico se
dispensa previamente en los compartimentos (126,
126a-c, 226).
19. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 18, en el que el número de compartimentos
(126, 126a-c, 226) es entre 12 y 36.
20. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 19, en el que los compartimentos (126,
126a-c, 226) son sustancialmente del mismo
tamaño.
21. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 19, en el que los compartimentos comprenden
una primera pluralidad de compartimentos (126b) de un tamaño y una
segunda pluralidad de compartimentos (126c) de un tamaño diferente
que el primer tamaño.
22. El procedimiento de la reivindicación 21, en
el que los compartimentos comprenden una tercera pluralidad de
compartimentos de un tamaño diferente de dichas primera y segunda
pluralidad de compartimentos (126b, 126c).
23. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 22 cuando dependen de la reivindicación 17,
en el que dichas una o más especies bacterianas son bacterias
Escherichia coli y coliformes.
24. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 23, en el que la muestra licuada es agua.
25. El procedimiento de la reivindicación 17, en
el que el medio de detección biológico específico se mezcla con la
muestra licuada antes de la distribución en el dispositivo (110,
210).
26. El procedimiento de la reivindicación 17, en
el que el medio de detección biológico específico comprende dos o
más medios distintos que se distribuyen individualmente en
diferentes compartimentos (126, 126a-c, 226)
proporcionando así detección multiplexada.
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