ES2322583T3 - Oligonucleotidos anti-androgenos utilizables en el tratamiento de trastornos dermatologicos relacionados con el metabolismo de los androgenos, sus composiciones farmaceuticas, sus usos y metodo de tratamiento. - Google Patents
Oligonucleotidos anti-androgenos utilizables en el tratamiento de trastornos dermatologicos relacionados con el metabolismo de los androgenos, sus composiciones farmaceuticas, sus usos y metodo de tratamiento. Download PDFInfo
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Abstract
Un oligonucleótido anti-andrógeno seleccionado del grupo que consiste en las secuencias SEC ID Nº1 y SEC ID Nº5.
Description
Oligonucleótidos anti-andrógenos
utilizables en el tratamiento de trastornos dermatológicos
relacionados con el metabolismo de los andrógenos, sus
composiciones farmacéuticas, sus usos y método de tratamiento.
La presente invención está relacionada con
nuevos oligonucleótidos anti-andrógenos adecuados
para el tratamiento de la caída del cabello y trastornos de la piel
relacionados con el metabolismo de los andrógenos, así como también
sobre las correspondientes composiciones farmacéuticas y/o
cosméticas administrables en forma tópica que contienen dichos
oligonucleótidos. Según la presente invención, los oligonucleótidos
se caracterizan por las siguientes secuencias:
INN-18.1 (SEC ID Nº 1): | 5' | CATTGGTGAAGGATCGCC | 3' |
INN-18.2 (SEC ID Nº 5): | 5' | GGCGAAGTAGAGCATCCT | 3' |
Como consecuencia de su composición molecular,
estos principios activos antiandrogénicos son muy específicos para
alcanzar su diana molecular, que se encuentra especialmente
circunscrita al sitio de aplicación, principalmente al receptor de
andrógenos en la piel y cuero cabelludo humanos tratados. Los
oligonucleótidos según la presente invención inhiben la expresión
del receptor de andrógenos (RA) a concentraciones muy bajas en
cultivos celulares primarios de la piel y el folículo piloso a
través de un mecanismo de acción que implica alcanzar e hibridar
con regiones específicas del ARNm del RA, de ese modo activar la
digestión con ARNasa H de dicho ARNm del RA y en consecuencia
inhibir la traducción de este último.
La estructura química de las dos moléculas
INN-18.1 y INN-18.2 puede ser:
ADN (Ácido desoxirribonucleico; enlaces de
fosfodiéster)
S-ADN (enlaces de fósforotioato,
{PTO}),
Estructura mixta de ADN y
S-ADN.
Estructuras químicas derivadas alquiladas o
metiladas como sustituyentes en la base nitrogenada.
Los andrógenos son mediadores de diversas
respuestas metabólicas a través del receptor de andrógenos (RA), un
receptor nuclear de 110 kD activado por ligandos específicos. La
expresión del receptor de andrógenos, que se observa en una
diversidad de tejidos puede activarse a través de dos ligandos, la
testosterona y la dihidrotestosterona, las que se ligan al mismo
según diferentes afinidades. El análisis estructural del RA indicó
que éste es miembro de la superfamilia de receptores esteroides,
entre los que se incluyen el receptor de las hormonas tiroideas, el
de la vitamina D y el retinoide. ^{1} ^{2}
\;
El receptor de andrógenos es una proteína
soluble. Es el producto de un gen único ubicado en el cromosoma X
que ha sido clonado ^{3} ^{4} ^{5} ^{6}. Este gen es el responsable de la
expresión de al menos dos isoformas. El producto génico es una
proteína que incluye alrededor de 910 a 919 aminoácidos, con un
dominio N-terminal más variable que otras regiones
más conservadas (dominio de unión al ADN, región de localización
nuclear, dominio de unión del ligando) ^{7} con una región de secuencias
poli CAG (región de poliglutamil) de longitud variable y según
parece involucrada en la aparición de distintas patologías
conectadas al cromosoma X. ^{8}
\;
\newpage
A, B, C: región de activación transcripcional
(B: región de poliglutamil)
D: región de unión al ADN
E: región de unión del ligando
La expresión del RA va modificándose a través
del desarrollo y del envejecimiento así como durante la
transformación maligna en el transcurso de diversos procesos
oncogénicos. El receptor de andrógenos actúa como un modificador
transcripcional sobre la actividad transcripcional de una variedad
de genes por medio de la unión a un elemento que responde a
andrógenos (ERA) así como también a través de la interacción con
otros factores transcripcionales específicos de células y ciertos
elementos del ADN que actúan en "cis" junto al ERA. La
actividad biológica que desencadena el receptor de andrógenos varía
en distintas dianas celulares e inclusive dentro de un solo tipo de
tejido.
El receptor de andrógenos se expresa en altos
niveles en varios tipos de células reproductoras desempeñando un
papel importante en el desarrollo y mantenimiento de las funciones
sexuales, también se expresa en tejidos no reproductores, regulando
varias enzimas y proteínas. Sin embargo, se cree que la regulación
anómala del gen del receptor de andrógenos es una causa
significativa de trastornos hormonodependientes.
Basándose en las observaciones acerca del papel
que desempeñan los andrógenos en el desarrollo de los trastornos
hormonodependientes, se han investigado las acciones de ciertos
anti-andrógenos esteroideos y no esteroideos para
su tratamiento.
Entre las enfermedades con impacto social, cabe
destacar el cáncer de próstata, trastornos de la piel de tipo
androgenodependiente, y otras patologías hormonodependientes tales
como la hiperplasia prostática benigna (HPB). La HPB es un tumor
benigno común que se desarrolla en ancianos. Este aumento de tamaño
no canceroso de la glándula prostática generalmente causa síntomas
en las vías urinarias bajas. Es una enfermedad progresiva que, si
no se trata durante un periodo de tiempo razonable puede originar
una reducción de la calidad de vida del paciente.
En el hombre, el receptor de andrógenos dentro
del folículo piloso capilar puede ser responsable de la interrupción
del crecimiento y en consecuencia conducir a calvicie, así como,
paradójicamente dicho receptor puede inducir el crecimiento piloso
en otro tipo de folículos.
La biología del crecimiento capilar ofrece
entonces un ejemplo de los distintos efectos que los andrógenos
pueden ejercer sobre la proliferación de poblaciones similares de
células epiteliales. Específicamente, la testosterona y su
metabolito, la dihidrotestosterona (DHT) pueden estimular por un
lado el crecimiento del vello facial aunque por otro ocasionen la
regresión del folículo capilar en individuos a partir de cierta
edad.^{9}
El folículo piloso se encuentra íntimamente relacionado con la
papila dérmica que deriva de células mesenquimatosas, la que se
cree que ejercería una influencia considerable sobre la
proliferación folicular.
Distintas líneas de evidencia respaldan el papel
de los andrógenos en el control del crecimiento del folículo piloso
a través de la modulación de la actividad de la papila dérmica:
1) El RA ha sido identificado en la papila
dérmica ^{10} ^{11}.
2) Las papilas dérmicas que surgen de folículos
pilosos androgenodependientes parecen contener un mayor número de
RA que aquellas presentes en áreas no predispuestas a ocasionar la
calvicie ^{12}.
\newpage
3) El nivel de la
5\alpha-reductasa, enzima responsable de
transformar la testosterona en dihidrotestosterona, varía en los
folículos pilosos existentes dentro de las zonas frontal y occipital
^{13};
4) La papila dérmica puede hacer surgir
componentes de la matriz extracelular y factores
mitógenos^{7}.
La papila dérmica (PD) es la encargada de
dirigir la generación embrionaria del folículo piloso y mantiene
esta capacidad instructiva durante toda la vida del folícula. La PD
está formada por un pequeño grupo de células fibroblásticas que
derivan del mesodermo. Estas células se mantienen cerca de la base
de células epidérmicas productoras de fibra capilar y vainas de la
raíz. Se presenta con la forma de una "pera" perfecta en
folículos pilosos normales. Sus células, conformando un grupo
sumamente activo, demuestran ser capaces de inducir el desarrollo
folicular desde la epidermis y producir fibras capilares.
^{14}
^{15} ^{16}
\;
Todos estos hallazgos sugieren que los
andrógenos, por medio del RA, pueden mediar de forma indirecta un
efecto sobre la proliferación del folículo piloso a través de la
modulación de la actividad de las papilas dérmicas. El efecto de
los andrógenos sobre la proliferación celular en folículos pilosos
puede controlarse mediante la regulación de la expresión de
factores de crecimiento.
Los andrógenos pueden disminuir de forma gradual
el tamaño de los folículos pilosos del cuero cabelludo hasta causar
calvicie. Aunque aún no se conoce el mecanismo exacto por el cual se
produce la calvicie, está probado que existe una correlación
directa entre los niveles de andrógenos y la caída del cabello. Una
disminución del contenido de andrógenos debería conducir a una
disminución de la calvicie y a un relanzamiento del crecimiento
capilar.
La alopecia androgenética es una forma muy común
de caída del cabello y puede describirse como parte de un fenotipo
genético general. La alopecia está mediada por andrógenos sistémicos
y factores genéticos. Se caracteriza por una caída del cabello
progresiva especialmente en regiones establecidas del cuero
cabelludo. Se desarrolla como una reducción gradual del tamaño del
folículo piloso del cuero cabelludo, y acorta el tiempo en la fase
de crecimiento activo (anágena), conduciendo esto a un mayor número
de folículos pilosos en la etapa de reposo (telógena) del ciclo
folicular. En el hombre, la caída del cabello se produce en la
coronilla y puede producir debilitamiento del pelo y la formación
de entradas.
La alopecia androgenética es un tipo específico
de caída del cabello caracterizada por una caída del cabello
progresiva, según un patrón, mediada por andrógenos sistémicos y
factores genéticos. La alopecia androgenética es una consecuencia
de una predisposición genética y de suficientes andrógenos
circulantes.
Todo hombre blanco posee la predisposición
hereditaria autosómica. Recientes avances en la comprensión de la
biología del folículo piloso arrojaron luz sobre la patogénesis de
la alopecia androgenética. La alopecia androgenética afecta a entre
un 50% y un 80% de la población masculina de raza blanca. Por regla
general, afecta a aproximadamente un 30% de los hombres a los 30
años. A los 40, la alopecia se presenta en un 40% y así, en forma
progresiva hasta alcanzar un 80% de los hombres a partir de los 80
años. Distintos orígenes étnicos presentan diversos niveles de
susceptibilidad en cuanto al desarrollo de la alopecia
androgenética. La caída del cabello sólo comienza una vez alcanzada
la pubertad y el ritmo de progresión varía significativamente.
Algunos hombres llegan a la calvicie total en menos de 5 años
mientras que a la mayoría le lleva de 15 a 25 años. Un estudio
reveló que la tasa promedio de caída del cabello es de un 5% anual.
La progresión varía de forma considerable, con períodos de caída
acelerada que duran de 3 a 6 meses seguidos de períodos inactivos
que duran de 6 a 18 meses.
No obstante, la denominación estándar que recibe
de "patrón masculino de caída del cabello", la alopecia
androgenética es también la forma más común de caída del cabello en
la mujer.
Los cabellos anágenos terminales, que
generalmente penetran hasta el subcutis a través de la dermis, se
reemplazan por vellos secundarios con extensiones angiofibróticas
residuales. Otra característica es un aumento en la razón de
cabellos telógenos con respecto a anágenos. El número total de
folículos pilosos en el ser humano se estima que es de 5 millones,
con 1 millón en la cabeza, de los cuales 100.000 cubren el cuero
cabelludo. La estructura básica del folículo piloso es
esencialmente la misma en toda la variedad de especies de mamíferos,
con modificaciones para algunas funciones especializadas. El
folículo piloso puede reconocerse como órgano independiente dentro
de la piel, formándose y manteniéndose sobre la base de interacción
que se da entre los componentes dérmicos y epidérmicos.
Por otra parte, el trastorno conocido como acné
vulgar es una enfermedad crónica inflamatoria de las unidades
poilosebáceas. Aunque en general no se relaciona al acné con altos
niveles séricos de andrógenos, se ha demostrado que pacientes
femeninas con acné presentan claros aumentos en los niveles de
andrógenos suprarrenales y en ovario.
\newpage
Se han formulado varias preparaciones para el
tratamiento y la prevención de la caída del pelo que desde hace
tiempo se conocen y utilizan Por ejemplo, preparaciones a base de
productos biológicos, tonificantes vasculares y vasodilatadores,
bloqueadores de testosterona y hasta la práctica de realizar
trasplantes quirúrgicos de pelo.
Los anti-andrógenos antagonizan
las respuestas biológicas inducidas por andrógenos endógenos o
exógenos. Sus métodos de acción varían con cada fármaco. La
especificidad de la acción androgénica se logra tanto a través del
reconocimiento específico de los genes diana como así también a
través de la especificidad de la interacción de la hormona
androgénica con el RA^{17}.
Los anti-andrógenos esteroideos
como el acetato de ciproterona (Androcure^{TM}) actúan mediante el
bloqueo de la unión de la hormona (testosterona o DHT) al RA así
como ejerciendo efectos progestacionales que suprimen la secreción
de gonadotropina. Los efectos secundarios debidos al uso de estos
anti-andrógenos pueden ser causa de feminización
masculina o de una posible teratogenicidad.
Los anti-andrógenos
no-esteroideos no tienen los efectos secundarios de
los esteroideos; existen como anti-andrógenos puros
que se unen de forma exclusiva al RA. Sin embargo debido a efectos
secundarios, algunos de esos anti-andrógenos tales
como la bicalutamida (Casodex®), están indicados exclusivamente para
el tratamiento del cáncer de próstata, evitándose un uso más
general para otros trastornos hormonodependientes. Actualmente, para
el tratamiento de diversas patologías relacionadas con andrógenos
se están empleando fármacos tales como flutamida (Eulexin^{TM}),
hidroxiflutamida o nilutamida (Anandron^{TM}).
Las terapias combinadas utilizan un
anti-andrógeno con un inhibidor de la
5-\alpha-reductasa tal como
finasterida (Proscar^{TM}). La testosterona circulante se
transforma en ciertos tejidos hormonales sensibles (próstata,
algunas regiones de la piel) en DHT mucho más potente a través de la
enzima 5-\alpha-reductasa.
Dutasterida es un fármaco similar a finasterida
que previene la conversión de la hormona testosterona en
dihidrotestosterona (DHT). Dutasterida es un inhibidor de
5-\alpha-reductasa que inhibe
tanto las isoenzimas tipo 1 como tipo 2. En la actualidad, este
fármaco desarrollado por GlaxoSmithKline, se encuentra transitando
las etapas finales del proceso de aprobación de uso en la
hiperplasia prostática benigna (HPB). Los estudios concernientes a
su empleo en el tratamiento de la caída del cabello parecen haberse
detenido.
En vista de la penetración poblacional y la
importancia que presentan estas patologías, se espera un aumento en
el uso de anti-andrógenos, debido a una población
que envejece, al número creciente de pacientes con HPB, y a un
aumento de la conciencia de la enfermedad y la tendencia hacia la
prevención de complicaciones a largo plazo.
Minoxidil ("Rogaine"^{TM}) es un potente
vasodilatador que está utilizándose en el tratamiento médico de la
calvicie. A causa de la escasa y variable eficacia y de los efectos
secundarios el minoxidil se convirtió rápidamente en una decepción.
Recientemente se lanzó al mercado finasterida formulada en 1 mg
("Propecia"^{TM}) como inhibidor de la
5-alfa-reductasa que reduce los
niveles circulantes de dihidrotestosterona (DHT) producida por la
testosterona. Dado que la estrategia es reducir los niveles de DHT
sistémica, debe administrarse la finasterida por vía oral ya que la
administración tópica es muy poco eficaz.
Los tratamientos actuales del acné incluyen
anticonceptivos orales más un complemento de antibióticos, que
pueden suministrarse tópica o sistémicamente. La combinación de
estrógeno-progestina con acetato de ciproterona
(CPA) tiene una acción antiandrogénica directa periférica en el
bloqueo del receptor de andrógenos.
La espironolactona se utiliza como
anti-andrógenos desde hace más de 20 años para el
tratamiento del acné y el hirsutismo. Sin embargo, sólo unos pocos
estudios sobre un número reducido de pacientes han demostrado
cierta eficacia de la espironolactona como terapia única o combinada
con anticonceptivos orales en el tratamiento del acné. Los efectos
secundarios son comunes pero no son causa habitual de interrupción
del tratamiento.
El avance en los campos de la biología, genética
y genómica ha hecho posible el estudio de algunos mecanismos
moleculares que regulan la expresión de genes que podrían ser la
base del desencadenamiento de distintas patologías. De estos datos,
surge con claridad la necesidad de encontrar productos farmacéuticos
capaces de impedir de forma sumamente específica la expresión de
aquellos genes implicados. Es por ello que los oligonucleótidos que
pueden actuar de diversos modos se han elegido como una nueva
categoría terapéutica. Estos oligonucleótidos interfieren o
impiden, de forma selectiva, la expresión de proteínas específicas,
y así ofrecen una manera de intervenir en procesos fundamentales
que ocasionan ciertas enfermedades. Podrían actuar por distintas
rutas tales como, por ejemplo, el desencadenamiento de la
degradación específica del ARNm a través de la digestión con ARNasa
H, el bloqueo de la traducción, como ribozimas, como pequeños ARN
interferentes (ARNi) o como aptámeros sobre proteínas reguladoras
de ADN. Los efectos secundarios en procesos normales son
mínimos.
\newpage
El modo de acción principal de los
oligonucleótidos farmacológicamente activos es la capacidad de unión
con sus dianas metabólicas moleculares. Según este objetivo, los
oligonucleótidos deben diseñarse de forma tal que puedan alcanzar
las regiones de accesibilidad en la molécula diana como, por
ejemplo, en el ARNm.
Existen varios modelos teóricos que predicen las
estructuras moleculares secundaria y terciaria y se centran en la
posibilidad de descubrir regiones de accesibilidad. Con respecto al
ARN, se ha desarrollado un software MFOLD^{18} y más
recientemente un algoritmo bioinformático^{19} que debe ser útil para
identificar secuencias cortas de cadena sencilla. Sin embargo, los
resultados obtenidos son en general decepcionantes cuando se
confrontan con los sometidos a prueba en ensayos bioquímicos de
unión al ARN mensajero, en especial cuando el tamaño del ARNm es
mayor de 800 oligonucleótidos.
Los oligonucleótidos ya están en el mercado,
tras la aprobación del fomivirsen (Vitravene^{TM}) para el
tratamiento de la retinitis por citomegalovirus. Además otros
productos van a lanzarse pronto, después de los resultados
alentadores que surgieron de los estudios clínicos realizados en
cinco áreas terapéuticas: cáncer, trastornos relacionados con el
sistema inmunitario (trastornos inflamatorios, rechazo de
trasplantes, adjuvantes de vacunas), trastornos cardiovasculares
(reestenosis vascular, hipertensión) trastornos neurológicos
(trastornos neurodegenerativos, cerebrovasculares, regulación de
neurotransmisores) y enfermedades infecciosas (infecciones
antivirales, parásitos antiprotozoarios).
Roy et al.^{20} (patente US
5.556.956) dieron a conocer métodos y composiciones, que incluyen
construcciones antisentido y anti-gen, a los
efectos de utilizarse en la regulación de la expresión del receptor
de andrógenos. La estrategia de Roy et al. es interferir con
la expresión del RA a través de oligonucleótidos que pueden inhibir
la transcripción por medio de la formación de una triple hélice,
seleccionando como diana la región del promotor del gen del
receptor de andrógenos (RA).
Harper et al.^{21} (patente US
5.877.160) describieron un método de reducción de la caída del
cabello asociada a andrógenos mediante la exposición de células del
cuero cabelludo a una cantidad eficaz de oligonucleótidos que
interactúan con regiones codificantes del gen del RA, con su
transcrito o con una secuencia diana en dirección 3' del sitio de
inicio de la transcripción en dicho gen. En particular, los
oligonucleótidos de Harper seleccionan como diana la posición -500
a +20 relativa al sitio de inicio de la transcripción. No obstante,
sus resultados no muestran actividad farmacológica en los tipos
celulares implicados en el ciclo del folículo piloso y, en
consecuencia, implicados en el crecimiento del cabello humano.
F. Hamy et al., Prostate Cancer and
Prostatic Diseases (2003), 6, 27-33; e Iris E. Eder,
Cancer Gene Therapy, Volumen 7, Nº 7, 2000, páginas 997 a 1007,
informaron sobre oligonucleótidos antisentido de receptores de
anti-andrógenos y su aplicación en la terapia de
cáncer de próstata.
Recientemente se han descrito (documento WO
01/83740), composiciones terapéuticas y métodos para inhibir la
expresión de proteínas de longitud completa en células y su
aplicación en la terapia del cáncer de próstata, y en particular a
composiciones "antisentido" dirigidas contra una secuencia de
ARNm de una unión del sitio aceptor de corte y empalme normal del
ARN mensajero preprocesado.
La alopecia androgenética y los trastornos de la
piel relacionados con andrógenos necesitan aún un enfoque mediante
un tratamiento antiandrogénico muy específico, más seguro y menos
tóxico, que pueda aplicarse de forma localizada de modo que se
eviten las consecuencias negativas y los efectos secundarios de una
terapia antiandrogénica sistémica de carácter más general.
El problema fundamental a resolver es la
generación de nuevos fármacos antiandrogénicos para aplicarse
especialmente tópicamente sin correr el riesgo de alcanzar órganos
potenciales que no estén implicados.
Los oligonucleótidos que seleccionan como diana
el receptor de andrógenos parecen ser el enfoque farmacológico más
apropiado. La actividad farmacológica de esos oligonucleótidos debe
demostrarse previamente en modelos celulares correctamente
establecidos, en cultivos primarios de fibroblastos de piel y en
células de la papila dérmica de folículos pilosos humanos. Debe
evaluarse el intervalo de concentración en el cual se demuestra la
actividad y los niveles de inhibición alcanzables en esos modelos.
Así definidos, estos oligonucleótidos parecen aptos para estudiar
una terapia antiandrogénica, tras la definición previa de una
formulación galénica apropiada para la administración tópica.
\newpage
Es por lo tanto un objeto de la invención
proveer oligonucleótidos farmacológicamente activos con actividad
antiandrogénica que actúen de forma específica en la diana
deseada.
Es otro objeto de la invención proveer
oligonucleótidos farmacológicamente activos que se unen a regiones
altamente sensibles en el ARNm del receptor de andrógenos.
Más particularmente, otro objeto de la invención
es proveer oligonucleótidos farmacológicamente activos que inhiben
la expresión del receptor de andrógenos en fibroblastos de piel
humana y células de papilas dérmicas derivadas de folículos
pilosos.
Más específicamente, es otro objeto de la
invención proveer oligonucleótidos farmacológicamente activos que
inhiben de forma específica la expresión del receptor de andrógenos
a concentraciones muy bajas sin ocasionar los efectos secundarios
producidos por las terapias antiandrogénicas de la técnica
anterior.
Más específicamente, otro objeto de esta
invención es proveer oligonucleótidos farmacológicamente activos
que inhiben específicamente la caída del cabello y enfermedades de
la piel relacionadas con andrógenos.
Otro objeto de la invención es proveer una
composición farmacéutica que incluye oligonucleótidos
farmacológicamente activos que inhiben específicamente la expresión
del receptor de andrógenos a concentraciones muy bajas.
Otro objeto de la invención es proveer una
composición farmacéutica que incluye oligonucleótidos
farmacológicamente activos que tienen actividad antiandrogénica
para la administración tópica.
Más específicamente, otro objeto de la invención
es proveer una composición farmacéutica que comprende
oligonucleótidos farmacológicamente activos que tienen actividad
antiandrogénica en forma de disolución acuosa.
Otro objeto de la invención es el uso de
oligonucleótidos farmacológicamente activos para preparar una
composición farmacéutica para el tratamiento de la caída del pelo y
enfermedades de la piel relacionadas con andrógenos.
Un último objeto de la invención, es un método
para el tratamiento de la caída del cabello relacionada con
andrógenos en seres humanos.
\vskip1.000000\baselineskip
La figura 1 muestra una autorradiografía del
análisis del cambio de la movilidad electroforética (EMSA) de
INN-18.1 radiomarcado
(+^{32}P-INN18.1), hibridado por separado con los
transcritos sentido y antisentido del RA.
La figura 2 muestra una autorradiografía del
análisis del cambio de la movilidad electroforética (EMSA) de
INN-18.1, que muestra el efecto de la competencia
durante la hibridación utilizando combinaciones de
INN-18.1 marcado con concentraciones crecientes de
INN-18.1 sin marcar (carriles 2-4) y
en combinación con concentraciones crecientes de un oligonucleótido
sin relación y sin marcar (control).
La figura 3 muestra los resultados de la
electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante para el
ensayo de la protección frente a la degradación por nucleasa S1 para
el oligonucleótido INN-18.1.
La figura 4 muestra los resultados de la
electroforesis en gel de agarosa desnaturalizante para el ensayo de
digestión con ARNasa H inducida por el INN-18.1
La figura 5 muestra los resultados de la
electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS del RA
traducido in vitro tras el tratamiento con el oligonucleótdo
INN-18.1 en el procedimiento de dos etapas.
La figura 6 muestra el análisis por
inmunotranferencia de la inhibición de la expresión del RA tras el
tratamiento con diferentes concentraciones de
INN-18.1 de cultivos primarios de fibroblastos
dérmicos.
La figura 7 muestra el análisis por
inmunotransferencia de la inhibición de la expresión del RA tras el
tratamiento con diferentes concentraciones de
INN-18.1 de cultivos primarios de células de papila
dérmica.
La figura 8 muestra una autorradiografía del
análisis del cambio de la movilidad electroforética (EMSA) de
INN-24 radiomarcado
(+^{32}P-INN-24), hibridado por
separado con los transcritos sentido y antisentido del RA.
La figura 9 muestra una autorradiografía del
análisis del cambio de la movilidad electroforética (EMSA) de
INN-24, que muestra el efecto de la competencia
durante la hibridación utilizando combinaciones de
INN-24 marcado con concentraciones crecientes de
INN-24 sin marcar (carriles 2-4) y
en combinación con concentraciones crecientes de un oligonucleótido
sin relación y sin marcar (control).
La figura 10 muestra los resultados del análisis
de la electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante para
el ensayo de la protección frente a la degradación por nucleasa S1
para el oligonucleótido INN-24.
La figura 11 muestra los resultados de la
electroforesis en gel de agarosa desnaturalizante para el ensayo de
digestión con ARNasa H inducida por el INN-24
La figura 12 muestra los resultados de la
electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS del RA
traducido in vitro tras el tratamiento con el oligonucleótdo
INN-24 en el procedimiento de dos etapas.
La figura 13 muestra el análisis por
inmunotransferencia de la inhibición de la expresión del RA tras el
tratamiento con diferentes concentraciones de
INN-24 de cultivos primarios de fibroblastos
dérmicos.
La figura 14 muestra el análisis por
inmunotransferencia de la inhibición de la expresión del RA tras el
tratamiento con diferentes concentraciones de
INN-24 de cultivos primarios de células de papila
dérmica.
La figura 15 muestra una autorradiografía del
análisis del cambio de la movilidad electroforética (EMSA) de
INN-71 radiomarcado
(+^{32}P-INN-71), hibridado por
separado con los transcritos sentido y antisentido del RA.
La figura 16 muestra una autorradiografía del
análisis del cambio de la movilidad electroforética (EMSA) de
INN-71, que muestra el efecto de la competencia
durante la hibridación utilizando combinaciones de
INN-71 marcado con concentraciones crecientes de
INN-71 sin marcar (carriles 2-4) y
en combinación con concentraciones crecientes de un oligonucleótido
sin relación y sin marcar (control).
La figura 17 muestra los resultados del análisis
de la electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante para
el ensayo de protección a la degradación por nucleasa S1 para el
oligonucleótido INN-71.
La figura 18 muestra los resultados de la
electroforesis en gel de agarosa desnaturalizante para el ensayo de
digestión con ARNasa H inducida por INN-71
La figura 19 muestra los resultados de la
electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS del RA
traducido in vitro tras el tratamiento con el
oligonucleótido INN-71 en el procedimiento de dos
etapas.
La figura 20 muestra el análisis por
inmunotransferencia de la inhibición de la expresión del RA tras el
tratamiento con diferentes concentraciones de
INN-71 de cultivos primarios de fibroblastos
dérmicos.
La figura 21 muestra el análisis por
inmunotransferencia de la inhibición de la expresión del RA tras el
tratamiento con diferentes concentraciones de
INN-71 de cultivos primarios de células de papila
dérmica.
La figura 22 muestra el análisis por
inmunotransferencia de la inhibición de la expresión del RA tras el
tratamiento con diferentes concentraciones de
INN-18.2 de cultivos primarios de células de papila
dérmica.
La figura 23 muestra el análisis por
inmunotransferencia de la inhibición de la expresión del RA tras el
tratamiento con diferentes concentraciones de
INN-24.1 de cultivos primarios de células de papila
dérmica.
La figura 24 muestra el análisis por
inmunotransferencia de la inhibición de la expresión del RA tras el
tratamiento con diferentes concentraciones de
INN-72 de cultivos primarios de células de papila
dérmica.
La figura 25 muestra el análisis por
inmunotransferencia de la inhibición de la expresión del RA tras el
tratamiento con diferentes concentraciones de
INN-73 de cultivos primarios de células de papila
dérmica.
La figura 26 muestra el análisis por
inmunotransferencia de la inhibición de la expresión del RA tras el
tratamiento con diferentes concentraciones de cultivos primarios de
células de papila dérmica.
\vskip1.000000\baselineskip
Sorprendentemente, se ha encontrado que la
expresión del receptor de andrógenos puede modularse mediante los
siguientes oligonucleótidos:
INN-18.1 (SEC ID Nº 1): | 5' | CATTGGTGAAGGATCGCC | 3' |
INN-18.2 (SEC ID Nº 5): | 5' | GGCGAAGTAGAGCATCCT | 3' |
\vskip1.000000\baselineskip
El diseño de estos principios activos es
consecuencia de haberse encontrado nuevas regiones de accesibilidad
en la estructura 3D del ARNm del receptor de andrógenos (RA). Estas
nuevas regiones de accesibilidad a su vez permiten que los
oligonucleótidos denominados INN-18.1 e
INN-18.2 (ODN) inhiban la expresión del RA a muy
bajas concentraciones (concentraciones nanomolares) en cultivos
celulares primarios de folículo piloso y derivados de piel humana,
seleccionando como diana regiones específicas del ARNm del RA:
INN-18.1 (SEC ID Nº 1): | +2251 |
INN-18.2 (SEC ID Nº 5): | +2277 |
(posición de nucleótidos en una
molécula de ARNm considerando como nucleótido +1 el punto de inicio
de la
traducción).
De esta manera se desencadena la digestión con
ARNasa H del ARNm del RA y se produce una disminución significativa
de los niveles de expresión del RA, (una tasa de inhibición de entre
el 60% - 80% aproximadamente).
Según la presente invención, los
oligonucleótidos cuyas secuencias se presentan pretenden abarcar
tanto ADN (ácido desoxirribonucleico con enlaces fosfodiéster),
S-ADN (enlaces fosforotioato, {PTO}), estructuras
mixtas ADN/S-ADN (PTO) o estructuras químicas
derivadas alquiladas o metiladas como sustituyentes en la base
nitrogenada.
Estos oligonucleótidos antiandrogénicos se
sintetizan químicamente y tras penetrar en la célula actúan
farmacológicamente gracias a su capacidad de desencadenar la
degradación del ARNm seleccionado como diana. Se trata de un
mecanismo similar a la degradación de ARN en el heterodúplex
intracelular ARN/ADN que tiene lugar de forma natural mediante la
ARNasa H.
A los efectos de poder diseñar moléculas
anti-andrógenos que sean farmacológicamente activas
en células derivadas de folículo piloso y piel, se siguió un
enfoque consistente en dos partes:
- i.
- Evaluación in vitro a fin de revelar regiones de accesibilidad en el ARNm del RA.
- ii.
- Actividad antiandrogénica en modelos celulares.
El fundamento de este procedimiento es el
descubrimiento de regiones de accesibilidad en la molécula del ARNm
del RA a través de la unión ("hibridación") de oligonucleótidos
cuyas secuencias son complementarias a aquellas de la región
examinada. Por lo tanto, al descubrirse una región de accesibilidad,
se diseñan los oligonucleótidos de secuencia específica (ODN) que
seleccionan esta región como diana y así poder establecer si
alcanzan la hibridación total.
Para diseñar principios activos, se siguió la
estrategia denominada "desplazamiento sobre el ARNm". Hace
posible la identificación in vitro de sitios de
accesibilidad en el ARNm del RA apropiados para la hibridación de
los oligonucleótidos. Se basa en seleccionar como diana varias
regiones en la molécula del ARNm, seleccionar secciones de entre 15
y 20 nucleótidos de longitud, en las que la compatibilidad cruzada
con cualquier otro gen expresado del genoma humano no es
significativa y luego mover las secuencias en dirección 3' y 5'. Una
vez que se descubre una región de accesibilidad, se diseñan los ODN
que rodean a las secuencias circundantes y luego se someten a
prueba para poder revelar actividad farmacológica.
La "estrategia de desplazamiento sobre el
ARNm" es la versión adaptada de la "estrategia de
desplazamiento sobre el gen", que se utiliza para lograr
secuenciar largos segmentos de ADN, partiéndose de seleccionar como
diana una región conocida para luego moverse en dirección 3' y 5'
desde las regiones recién secuenciadas, etc. Por tanto, es posible
"desplazarse" sobre el ADN para lograr descubrir las secuencias
circundantes. Esta estrategia se modificó de modo que se evaluara
la capacidad de unión de los oligonucleótidos sobre el ARNm,
revelándose así nuevas regiones de accesibilidad
"desplazándose" sobre la molécula del ARNm o bien sobre
aquellos farmacológicamente activos para encontrar nuevos
oligonucleótidos antiandrogénicos por desplazamiento dentro de las
regiones de accesibilidad detectadas.
Según esta estrategia de desplazamiento, se
sometió a prueba en el ARNm del receptor de andrógenos humano si
los oligonucleótidos que seleccionan como diana distintas regiones
del ARNm del RA podían unirse a la molécula de ARNm. Por lo tanto,
la molécula de ARNm se dividió en siete regiones (1 a 7) que
contenían aproximadamente 600 nucleótidos cada una. Luego se
diseñaron 3 oligonucleótidos que seleccionaban como diana cada
región y para los que la homología de secuencia con cualquier gen
humano no es significativa, para así someter a prueba si podían
unirse a la molécula del ARNm a través del análisis del cambio de la
movilidad electroforética, EMSA (véanse las figuras 1, 2, 8, 9, 15,
16).
Cada oligonucleótido se ha diseñado como
complemento de la región establecida como diana en el ARNm. El
diseño de otros oligonucleótidos para someterlos a prueba por medio
del EMSA se llevó a cabo moviendo la secuencia 5 nucleótidos en
dirección 3' y en dirección 5' siguiendo la secuencia de ARNm
circundante establecida como diana por el oligonucleótido
previamente diseñado.
El análisis del cambio de la movilidad
electroforética (EMSA) indica si el oligonucleótido podría unirse o
no al ARNm del RA para lograr la hibridación, revelándose así una
región de accesibilidad. Esta técnica consiste en los siguientes
pasos: a) Radiomarcado y purificación de oligonucleótidos; b)
Transcripción in vitro del ARNm del receptor de andrógenos
(RA); c) Hibridación del transcrito de ARNm del RA con
oligonucleótidos radiomarcados; y d) Moldeado de gel no
desnaturalizante, electroforesis y autorradiografía.
Como consecuencia de esta primera parte del
trabajo, se establecieron grupos de oligonucleótidos positivos.
1) Oligonucleótidos positivos para el
EMSA: aquellos que pueden unirse a la molécula de ARNm.
Se descartaron los oligonucleótidos que no
lograron unirse de manera específica a la molécula de ARNm.
Se sometieron a prueba los oligonucleótidos
positivos para el EMSA unidos a la molécula de ARNm en el ensayo de
protección frente a nucleasa S1; que indica si la hibridación del
oligonucleótido fue parcial o total. Si no tiene lugar la
degradación, la hibridación fue total, manteniendo el
oligonucleótido su longitud tras la digestión. Así se estableció el
segundo grupo de oligonucleótidos.
2) Oligonucleótidos positivos para la
protección de la digestión con nucleasa S1: se consideraron
aquellos en los cuales se evitó la degradación y que mantuvieron
completa la secuencia complementaria.
Se descartaron los oligonucleótidos que
perdieron tamaño como consecuencia de esta prueba. Los
oligonucleótidos positivos se consideraron aptos para someterse a
prueba para la digestión con ARNasa H; lo cual demuestra que la
capacidad de hibridación de los ODN puede desencadenar un mecanismo
de digestión del ARNm por ARNasa H, que dentro de las células será
responsable de la degradación del ARNm del RA. Así se estableció el
tercer grupo de oligonucleótidos.
3) Oligonucleótidos positivos para la
digestión del ARNm con ARNasa H: se consideraron aquellos que
pueden desencadenar la degradación del ARNm (véanse las figuras 4,
22, 28).
Luego, se someten a prueba estos
oligonucleótidos positivos en función de su capacidad de
desencadenar una degradación del ARNm por el mecanismo de ARNasa H
y de esta forma inhibir la expresión in vitro del receptor
de andrógenos (RA).
4) Oligonucleótidos positivos para la
inhibición de la traducción in vitro : aquellos que pueden
inhibir la expresión de la molécula del receptor de andrógenos como
consecuencia de la degradación del ARN desencadenada por un
mecanismo de ARNasa H, (véanse las figuras 5, 12, 19)
El INN-18.1 se une de forma
específica al ARNm del RA (figuras 1 y 2) completándose de esa forma
la hibridación del oligonucleótido anti-andrógenos
(figura 3).
La hibridación del INN-18.1 al
ARNm del RA induce la digestión con ARNasa H del transcrito (figura
4). por tanto, la traducción in vitro del ARNm del RA se ve
fuertemente disminuida (figura 5).
Gracias a la estrategia denominada de
"desplazamiento sobre el ARNm" y al rastreo inicial que
permitió establecer el oligonucleótido INN-18.1,
pudo establecerse el diseño de un nuevo oligonucleótido que actúa
mediante un mecanismo de acción similar de unión al ARNm, digestión
con ARNasa H e inhibición de la traducción que atacan las mismas
regiones de accesibilidad descubiertas. Se trata del oligonucleótido
INN-18.2.
\vskip1.000000\baselineskip
En la segunda parte, que tiene como objetivo dar
a conocer la actividad farmacológica, se sometieron a prueba los
oligonucleótidos positivos en los cultivos derivados de células de
folículo piloso y piel. Se evaluó la capacidad de estos
oligonucleótidos de modular y regular por disminución la expresión
del RA en estos modelos celulares.
Los oligonucleótidos según la presente
invención, son anti-andrógenos específicos en
cultivos celulares humanos. Como consecuencia de su actividad
farmacológica, la expresión del RA traducido se ve
significativamente disminuida en cultivos primarios humanos de
fibroblastos de piel y células de papila dérmica del folículo
piloso.
La actividad antiandrogénica de
INN-18.1 induce la inhibición de la traducción del
RA. El bajo nivel de expresión del RA se detecta a través de
inmunotransferencia de tipo Western en cultivos primarios de
fibroblastos dérmicos (figura 6) y células de papila dérmica
(figura 7).
En concordancia con el descubrimiento de
regiones de accesibilidad en la molécula del transcrito del RA y
siguiendo la estrategia denominada de "desplazamiento sobre el
ARNm" se pudo establecer la actividad farmacológica
antiandrogénica del nuevo oligonucleótido INN-18.2
(figura 2) que induce la inhibición de la traducción del RA.
Mediante técnicas de inmunotransferencia de tipo Western se detectan
bajos niveles de expresión del RA en cultivos primarios de células
de papila dérmica.
Los oligonucleótidos desnudos, sin protección
por parte de los vehículos o cualquier formulación farmacéutica
especialmente creada para tal fin, tienen una semivida muy corta. Es
por ello que al administrarse tópicamente alcanzan su diana tisular
próxima en la piel pero no otras dianas más lejanas cuando se
administran por vía sistémica, y para mejor provecho, esos
oligonucleótidos deben administrarse en forma de disolución acuosa.
Como consecuencia de su composición molecular, estos principios
activos antiandrogénicos son muy específicos para el receptor de
andrógenos, especialmente circunscrito al sitio de aplicación,
concretamente en la piel y el cuero cabelludo.
En resumen, debido a la capacidad de inhibición
demostrada en cultivos primarios de fibroblastos de piel humana y
de células de papila dérmica del folículo piloso humano, estos
principios activos son anti-andrógenos útiles en el
tratamiento de patologías dermatológicas relacionadas con
andrógenos.
Dada su capacidad de desencadenar la escisión
del ARNm a través de la ARNasa H, estas moléculas de
anti-andrógenos son muy específicas y brindan un
riesgo menor de toxicidad o efectos secundarios cruzados no
específicos. Los oligonucleótidos INN-18.1 e
INN-18.2 diseñados son inhibidores eficaces de la
expresión del RA.
Esta invención permite revelar regiones de
accesibilidad muy sensibles (distintas y mucho más sensibles que la
región de la vecindad del inicio de la traducción "cercana al
ATG") en la diana de ARNm del RA, más apropiado para el diseño
de moléculas antiandrogénicas sumamente eficaces.
Los oligonucleótidos INN-18.1,
INN-18.2 diseñados son
anti-andrógenos eficaces que pueden inhibir la
expresión del RA en fibroblastos de piel humana y células de papila
dérmica derivadas del folículo piloso humano que trabajan a
concentraciones muy bajas (250 nanoM a 1 microM).
Seleccionan como diana una región más sensible
del ARNm del RA: el efecto inhibidor que tienen podría alcanzar una
inhibición superior al 60% - 80% a concentraciones mucho menores
(que oscilan desde 1 microM hasta 0,25 microM) comparado con los
oligomeros antisentido que seleccionan como diana la región
"cercana al ATG" a concentraciones superiores a 10 microM y
hasta más de 40 microM.
La invención se describirá a modo de ilustración
con referencia a los siguientes experimentos y realizaciones, los
cuales no deben considerarse como una limitación de la
invención.
Los oligonucleotidos marcados con "*" son
solamente para referencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
El análisis del cambio de movilidad
electroforética comprende las siguientes etapas.
Se marcaron los oligonucleótidos mediante
incubación a 37ºC durante 30 minutos en un volumen final de 25
\mul:
Tris-Cl 50 mM pH 7,5
MgCl_{2} 10 mM
DTT 5 mM
10 pmol de oligonucleótidos desfosforilados en
el extremo 5'
20 pmol (150 microCi) de
[gamma-^{32}P]ATP (actividad específica
>3000 Ci/mmol)
50 microg/ml de BSA
3 U de polinucleótido quinasa de T4
Se detuvo la reacción mediante calentamiento a
60ºC durante 5 minutos y se llevó a cabo una extracción con
fenol/cloroformo. Se separaron los oligonucleótidos marcados del ATP
libre marcado por electroforesis en gel de poliacrilamida al 20%.
Se identificaron los oligonucleótidos marcados mediante
autorradiografía, se cortaron del gel y se eluyeron a 37ºC durante
toda la noche hasta un volumen final de 120 microL de agua tratada
con DEPC.
Se clonó el ADN del RA en el plásmido de
expresión pCIneo (Promega) bajo el control del promotor T7. Antes
de la transcripción in vitro, se linealizó el plásmido con
Xba I (Promega).
Se llevó a cabo la transcripción in vitro
del RA mediante incubación a 37ºC durante 90 minutos del plásmido
linealizado (1 microg) en un volumen final de 20 microL. (("kit de
transcripción in vitro",
Amersham-Pharmacia) que contenía: 4 NTP (GTP, ATP,
CTP, UTP) 0,5 mM, DTT 5 mM, inhibidor de ribonucleasa de placenta
humana (RPH) 20 unidades/microL en 20 mM de
HEPES-KOH, pH=7,6, MgCl_{2} 10 mM, ARN Pol de T7
20 U. Se detuvo la reacción mediante calentamiento a 75ºC durante
10 minutos.
Posteriormente, se añadieron 10 U de ADNasa
durante 10 minutos a 37ºC con el fin de escindir el molde. Se
precipitó el transcrito de ARN en dos volúmenes de etanol, y luego
se mantuvo toda la noche a -20ºC, se centrifugó a 12500 rpm durante
30 minutos a 4ºC. Se lavó el sedimento resultante con etanol al 70%,
una vez que se volvió a centrifugar el sedimento, se disolvió en 20
microL de agua DEPC.
Se incubaron oligonucleótidos radiomarcados (1
fmol) con 50-100 fmol del ARNm de RA a 37ºC durante
1 hora en un volumen final de 20 microL que contenía NaCl 100 mM,
fosfato 10 mM pH 7, EDTA 0,1 mM.
Se sometió a electroforesis la mezcla de
hibridación en un gel de poliacrilamida nativo de dos capas (al 4,5%
- 20%) a 4ºC en TBE 0,5X a 75 V.
Se realizaron las siguientes reacciones de
control:
- \sqbullet
- Ensayo de competencia: hibridación en presencia de cantidades crecientes del mismo oligonucleótido sin marcar.
- \sqbullet
- Ensayo de competencia: hibridación en presencia de un oligonucleótido de secuencia aleatoria sin marcar.
- \sqbullet
- Ensayo de competencia: hibridación en presencia de un oligonucleótido sin marcar que corresponde a la secuencia "sentido" del ARNm del RA.
- \sqbullet
- Hibridación de los oligonuceótidos con el transcrito de ARN antisentido.
\vskip1.000000\baselineskip
Las figuras 1, 8 y 15 (carril 2) muestran el
retardo de movilidad electroforética, partiendo de la incubación de
los oligonucleótidos radiomarcados INN-18.1,
INN-24* y INN-71* con el ARNm del RA
(transcrito del RA sentido), indicándose que ocurrió la unión. Los
oligonucleótidos libres migran a mayor velocidad en el frente. No
pudo observarse retardo cuando los mismos oligonucleótidos
incubados como controles con otro ARNm (en este caso el transcrito
"antisentido") no se unen a éste (carril 1).
En las figuras 2, 9 y 16, se observa la
especificidad de esta unión para los oligonucleótidos respectivos.
Se realizaron ensayos de competencia con concentraciones crecientes
del mismo oligonucleótido sin marcar, observándose la desaparición
de la banda retardada a causa de que se observa un efecto de
dilución isotópica (carriles 2 a 4 de cada figura). Del mismo modo,
los ensayos de competencia de cada oligonucleótido con
concentraciones crecientes de un oligonucleótido irrelevante (sin
relación con el RA) no marcado no tienen ningún efecto sobre el
ensayo de retardo (carriles 5-7 de cada figura).
Esto indica que el cambio de movilidad electroforética en los
carriles 2 a 4 se debe a la unión específica al transcrito del
RA.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Esta técnica indica que tanto los ODN se
hibridan con el ARNm del RA evitando la degradación del
oligonucleótido, así como que la hibridación es total o
parcial.
La hibridación parcial (sólo unos pocos
nucleótidos logran hibridarse con la secuencia diana) conduce a una
protección parcial de la molécula de oligonucleótido que a su vez
migra a mayor velocidad en la electroforesis en gel. La hibridación
total (toda la secuencia del oligonucleótido se hibrida con el ARNm)
da como resultado un oligonucleótido de longitud completa después
de la digestión con S1.
El ensayo de protección de la digestión con
nucleasa S1 consta de las siguientes etapas:
Según se describe en el punto a) del ensayo
EMSA
Según se describe en el punto b) del ensayo
EMSA
Según se describe en el punto c) del ensayo
EMSA
Posteriormente, se realizó una digestión con
nucleasa S1 en un volumen total de 20 microL durante 1 hora a 37ºC;
se añadieron a la reacción de hibridación 2 microL de tampón 10X de
nucleasa S1 (acetato de sodio 30 mM, pH=4,6; NaCl 100 mM,
ZnSO_{4} 1 mM).
e) Electroforesis Moldeado de gel
desnaturalizante, electroforesis y autorradriografía que muestra el
tamaño del oligonucleótido resultante.
Se sometió a electroforesis una alícuota
(100.000 cpm) de la mezcla de digestión en gel de poliacrilamida
desnaturalizante al 20%.
Tal como puede observarse en la figura 3, carril
3 (INN-18.1), figura 10, carril 3
(INN-24*), figura 17, carriles 4 y 5
(INN-71*), los oligonucleótidos se encuentran
protegidos frente a la degradación por la nucleasa S1 como
resultado de la hibridación con el ARNm del RA. La hibridación que
deja un heterodúplex de doble cadena tiene un efecto de protección
frente a la degradación por la nucleasa S1, que es una nucleasa de
cadena sencilla específica de ADN. Los oligonucleótidos
INN-18.1, INN-24*,
INN-71* mantuvieron su tamaño (migrando de la misma
forma que sus controles de oligonucleótidos no tratados), lo que
indica que la hibridación fue total. Se realizaron controles
negativos con ARN irrelevante procedente de E.coli (figura 3,
carril 2; figura 10, carril 2; figura 17, carril 3) sin observarse
señal alguna. Al realizarse controles negativos con ARN murino, pudo
observarse una señal débil en el INN-18.1 debido a
la presencia de una secuencia diana similar (figura 3, carril 1;
figura 17, carril 2).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Esta técnica puede demostrar que la capacidad de
hibridación de los ODN podría desencadenar un mecanismo de
digestión del ARNm por ARNasa H que, dentro de las células será
responsable de la degradación del mensajero del receptor de
andrógenos (ARNm del RA). Este mecanismo conduce a una disminución
de la expresión del RA y así puede exhibirse una actividad
antiandrogénica. Esta degradación de la ARNasa H implica las etapas
siguientes:
Según se describe en el punto a) del ensayo
EMSA.
Según se describe en el punto b) del ensayo
EMSA.
Se incubó el transcrito marcado del ARNm del RA
durante 1 hora a 37ºC con 1,25 microM del oligodesoxinucleótido y
0,25 U/microL de ARNasa H en un tampón que contenía NaCl 100 mM;
fosfato 10 mM pH=7, EDTA 0,1 mM y MgCl_{2} 1 mM. Las digestiones
se llevaron a cabo en un volumen total de 10 microL.
Se analizó el producto de la digestión (100.000
cpm) mediante electroforesis en gel desnaturalizante de agarosa
(agarosa al 0,7%, MOPS 20 mM (pH= 7), acetato de sodio 8 mM, EDTA 1
mM pH= 8,0). Luego se secó el gel y expuso a autorradiografía con
película.
Los INN-18.1 (figura 4 carril
1), INN-24* (figura 11 carril 1) y
INN-71* (figura 18 carril 1) permiten la
degradación del ARNm mediante la digestión con ARNasa H. Como
resultado de la degradación en la región donde se forma el
heterodúplex, se corta el transcrito en dos partes que migran por
separado de acuerdo a su longitud. El oligonucleótido que actúa
como control negativo, y que tiene la misma secuencia del
oligonucleótido sometido a prueba salvo en tres bases que se
sustituyeron (Mch-x), puede observarse en el carril
2 de todas las figuras sin actividad promotora de la
degradación.
La figura 4, carril 1, muestra dos bandas de ARN
más pequeñas (aproximadamente de 3000 nt y una débil de
aproximadamente 1000 nt en el frente).
La figura 11 carril 1 muestra dos bandas de ARN
más pequeñas de aproximadamente 2900 nt y 1400 nt.
La figura 18 carril 1 muestra una banda gruesa
más rápida, probablemente consistente en dos fragmentos no
resueltos de 2400 nt y 1900 nt.
El ARN intacto que puede observarse en cada
figura se debe probablemente a que la actividad de ARNasa H no es
completa.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Esta técnica refuerza la información que brinda
el uso de la digestión con ARNasa H. Se demuestra que puede
lograrse la inhibición en condiciones de traducción de la proteína.
A continuación en el presente documento, se describen dos
procedimientos alternativos que se han seguido.
Procedimiento en una sola etapa:
- a.
- Transcripción in vitro del ARNm del receptor de andrógenos (RA).
- b.
- Incubación del ARNm transcrito in vitro con el oligonucleótido sin marcar.
- c.
- Incubación con ARNasa H y un lisado de reticulocitos de conejo.
- d.
- Electroforesis en gel unidimensional en condiciones desnaturalizantes y autorradiografía.
\vskip1.000000\baselineskip
Procedimiento de dos etapas:
- a.
- Transcripción in vitro del ARNm del receptor de andrógenos (RA).
- b.
- Incubación del ARNm transcrito in vitro con el oligonucleótido sin marcar.
- c.
- Incubación con ARNasa H.
- d.
- Traducción con un lisado de reticulocitos de conejo.
- e.
- Electroforesis en gel unidimensional en condiciones desnaturalizantes y autorradiografía.
La reacción se realizó con TnT Coupled
Reticulocyte Lysate Systems ("sistemas de lisado de reticulocitos
acoplados a TnT") (Promega) a 30ºC durante 90 minutos. La
reacción se llevó a cabo en un volumen final de 50 microL. Se
incubó 1 microg del ADNc del RA linealizado con 25 microL de lisado
de reticulocitos de conejo TnT, 2 microL de tampón de reacción TnT,
1 microL de ARN polimerasa de T7 TnT, 1 microL de una mezcla de
aminoácidos menos metionina 1 mM, 2 microL de
(^{35}S)-metionina (>1000 Ci/mmol a 10 mCi/ml
-Amersham Pharmacia) y 40 unidades de inhibidor de ribonucleasa
Rnasin en presencia del oligonucleótido que va a someterse a prueba
a 1,25 \muM o condiciones de control sin hibridación de
oligonucleótidos.
Se desnaturalizó una alícuota (10 microL) de la
reacción de traducción en 40 microL de tampón de carga de SDS
(Tris-HCl 50 mM pH= 6,8, SDS al 2%, azul de
bromofenol al 0,1%, glicerol al 10%, ditiotreitol 100 mM) y se
cargó en un gel de poliacrilamida-SDS al 10%. Se
fijó el gel durante 30 min. en disolución de fijación de ácido
acético glacial al 10%-50% de metanol. Tras la fijación, se secó el
gel y se expuso a autorradiografía.
Se llevó a cabo la transcripción in vitro
del ARNm del RA tal como se describió en el punto 2 del protocolo
para el EMSA. Se incubó el transcrito del ARNm del RA con 1,25
microM del oligodesoxinucleótido y 0,25 U/microL de ARNasa H según
lo descrito anteriormente en el ejemplo 3) sobre la digestión con
ARNasa H.
La reacción de traducción se realizó a través de
la incubación de la totalidad del producto de transcripción (ARNm
del RA) tras el tratamiento con ARNasa H, 4 microL de la mezcla de
traducción 12,5X menos metionina (HEPES 25 mM pH 7,6, fosfato de
creatina 100 mM y 19 aminoácidos (312,5 microM cada uno), acetato de
potasio 100 mM, acetato de magnesio 0,5 mM, 20 microL de lisado de
reticulocitos (complementado con ARNt de hígado de ternero, EGTA,
creatina fosfoquinasa y hemina) y 4 microL de
(^{35}S)-metionina (>1000 Ci/mmol en 10 mCi/ml
-Amersham Pharmacia). La reacción se realizó a 30ºC durante 90
minutos en un volumen final de 50 microL.
Se diluyeron 5 microL de reacción de traducción
con 50 microL de tampón de muestra (0,5 ml de
Tris-HCl 1 M pH 6,8, 0,8 ml de glicerol, 1,6 ml de
SDS al 10% (p/v), 0,4 ml de 2-mercaptoetanol, 0,1 ml
de disolución saturada de Pyronin Y, 4,6 ml de agua). Se llevaron a
ebullición las proteínas en un baño de agua durante 4 minutos para
desnaturalizar, se cargó una alícuota de 10 microL sobre el gel. Se
separaron las muestras por SDS-PAGE. Se llevó a
cabo la electroforesis en un minigel de poliacrilamida al 8% a 160 V
durante 1 hora. Se cargaron marcadores moleculares sobre uno de los
carriles. Se fijó el gel en ácido acético al 7% (v/v) durante 1 hora
a temperatura ambiente y se secó durante 1 hora a 60ºC usando un
secador de geles, para exponerse luego a autorradiografía.
Como consecuencia de la degradación del
transcrito por la actividad ARNasa H, la traducción del RA se vio
fuertemente inhibida (figuras 5, 12 y 19 carril 2).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
Esta técnica permite establecer modelos
adecuados para evaluar las moléculas INN-18.1 e
INN-18.2 que se presentan en esta invención.
Estos ensayos tienen como objetivo dar a conocer
la actividad farmacológica, se sometieron a prueba los
oligonucleótidos positivos existentes en cultivos derivados de
células de folículo piloso y piel. Se evaluó la capacidad de estos
oligonucleótidos para modular y regular por disminución la expresión
del RA en estos modelos celulares.
Los cultivos celulares pueden ser:
A) Cultivos primarios de células de papila
dérmica.
- \bullet
- Aislamiento y cultivo.
B) Cultivos primarios de fibroblastos de piel
humana
- \bullet
- Aislamiento y cultivo
Como subproductos de procedimientos quirúrgicos
regulares se obtuvieron muestras de piel profundas. Se obtuvieron
muestras de la zona occipital del cuero cabelludo no afectada por la
calvicie en individuos sometidos a cirugía correctiva para el
tratamiento de la alopecia androgenética. Se extrajo cuidadosamente
la fascia y parte del tejido subcutáneo del cuero cabelludo para
exponer así la mayor cantidad posible de bulbos capilares. Se
lavaron las muestras con PBS que contenía penicilina (100 U/ml),
estreptomicina (100 mg/ml) y fungizona (2 mg/ml). Se cortaron en
fragmentos de 0,2 x 0,5 cm, se pusieron en disolución de dispasa
(grado II, 50 U/ml. Gibco) y se incubaron a 37ºC durante una hora.
Posteriormente, se realizaron todos los procedimientos quirúrgicos
bajo un microscopio de disección (Nikon SMZ1000). Se disecó cada
folículo anágeno libre de tejido circundante y se cortó de forma
transversal aproximadamente 1 mm por encima de la base. Se
transfirió el bulbo capilar a una placa de Petri llena de medio. Se
separó el epitelio de la vaina fibrosa y de la papila dérmica
mediante la aplicación de una presión suave ejercida por la punta
redondeada de una aguja sobre el extremo proximal del folículo. Se
realizó una incisión de forma proximal sobre la vaina fibrosa con la
punta biselada de una aguja logrando así una presión leve que hace
que la papila dérmica pueda salir del corte. Se cortó la papila a
lo largo de su tallo y se transfirió a un recipiente de cultivo. Se
pusieron los explantes de papila en placas de Petri de 35 mm,
generalmente, de cuatro a ocho en cada placa. Se utilizó medio de
cultivo DMEM con penicilina (100 U/ml), estreptomicina (100 mg/ml)
complementado con suero bovino fetal al 20%. Una vez establecido el
cultivo, se cambiaba el medio cada tres días. Pasadas 48 horas de la
adherencia, las células comenzaron a migrar desde los explantes
hacia los sustratos plásticos. Después de la migración celular
existió un retraso de 1 a 3 semanas antes de resultar evidente la
actividad de proliferación. Los cultivos celulares se mantuvieron y
establecieron en una atmósfera humidificada con 5% de CO_{2}.
\vskip1.000000\baselineskip
Se obtuvieron fibroblastos dérmicos de pequeños
trozos de dermis. Se examinó cada trozo bajo el microscopio de
disección a fin de asegurarse de la ausencia de derivados de
epidermis o músculo. Se transfirieron de diez a quince trozos a
placas de cultivo de 100 mm, permitiéndose la fijación sin medio de
cultivo durante de 15 a 20 minutos. De esta forma se cultivaron los
explantes en medio DMEM complementado con suero bovino fetal al 10%
y dihidrotestosterona (DHT) 10^{-7} M. Los cultivos primarios
permanecieron inalterados durante 1 semana antes del examen bajo un
microscopio de contraste de fases seguido de cambios de medio cada
semana. Después de 4 ó 5 semanas, cuando el número de células fue
suficiente, éstas se subcultivaron a fin de establecer cultivos
celulares primarios.
\vskip1.000000\baselineskip
La técnica incluye dos etapas:
- a)
- Ensayo de inhibición de oligonucleótidos antiandrogénicos. Tratamiento de cultivos celulares primarios.
- b)
- Ensayo de expresión del receptor de andrógenos. Electroforesis en gel de poliacrilamida y análisis por inmunotransferencia de tipo Western.
\vskip1.000000\baselineskip
Se sembraron fibroblastos dérmicos y células de
la papila dérmica (CPD) procedentes de cultivos celulares primarios
al 50% de confluencia en placas de cultivo de 100 mm durante de 18 a
24 h antes del tratamiento con oligonucleótidos. Se dejaron crecer
las células en un medio DMEM complementado con suero bovino fetal
al 10% y dihidrotestosterona (DHT) 10^{-7} M. Inmediatamente antes
del tratamiento, se lavaron las células con PBS y se complementaron
con adición de medio de cultivo sin suero. Se mezclaron los
oligonucleótidos a la concentración deseada con polietilenimina
(PEI) (disolución acuosa al 50% p/v - SIGMA) en una razón de carga
de 1:5, luego se diluyeron con medio DMEM y se agitaron en vórtex
(mezcla de transfección). Tras 10 min., se añadió la mezcla de
transfección a las células. Tras 24 hrs de incubación, se rasparon
las células del frasco y se recogieron en PBS. Se concentraron las
células mediante centrifugación y se resuspendieron en tampón de
lisis (Tris 125 mM, SDS al 2%, Triton X-100 al 5%,
fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 2 mM, pH 6,8). Se
centrifugaron los extractos una vez más, y se utilizaron las
alícuotas del sobrenadante para la determinación de proteínas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se diluyeron cincuenta microg de proteínas
totales con tampón de carga (Tris 125 mM, SDS al 4%, glicerol al
20%, mercaptoetanol al 5%, azul de bromofenol al 0,01%, pH= 6,8).
Una vez en ebullición, se separaron las muestras mediante
electroforesis en poliacrilamida-dodecilsulfato de
sodio (SDS-PAGE). La electroforesis se llevó a cabo
en minigeles de poliacrilamida al 8% a 160 V durante 1 hora. Se
aplicaron marcadores moleculares a uno de los carriles. Se
sometieron a electrotransferencia las proteínas sobre membranas de
nitrocelulosa (Hybond ECL, Amersham Pharmacia). Se bloquearon las
membranas con 5% de leche en polvo desnatada y se incubaron durante
al menos 1,5 h con un anticuerpo monoclonal contra el extremo
amino-terminal del receptor de andrógenos (RA) de
origen humano (RA N-20 sc-816
policlonal de conejo, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) a
0,4 mg/ml en PBS-Tween-20 al 0,1%.
Una vez lavadas con PBS, se incubaron las membranas con un
anticuerpo monoclonal contra el extremo
carboxi-terminal de la actina humana (anticuerpo
IgG1 monoclonal de ratón - actina C-2
sc-8432, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)
durante 1 hora, se volvieron a lavar y desarrollaron a través de un
método de quimioluminiscencia (Amersham Pharmacia).
La autorradiografía resultante se analizó por
densitometría usando el densitómetro personal SI y el sistema
analizador de imágenes Image Quant (Molecular Dynamics).
La inhibición de la expresión del RA se presenta
como resultados de experimentos de inmunotransferencia de tipo
Western (parte superior).
Las figuras 6, 13 y 20 corresponden a cultivos
primarios de fibroblastos de piel y la figuras 7, 14 y 21 a
cultivos primarios de papilas dérmicas. Se evaluó la inhibición de
la expresión del RA a distintas concentraciones de
INN-18.1, INN-24* y
INN-71* se presentan en comparación con controles no
activos, Scr-18.1, Scr-24* y
Scr-71*, que tienen una secuencia mixta del
oligonucleótido respectivo.
Los histogramas (figura inferior) representan el
porcentaje de expresión relativo a un control de oligonucleótidos
no activos.
La altura de cada columna representa un valor
relativo al control Scr-x y ese valor es la media de
determinaciones por triplicado llevados a cabo en experimentos
independientes.
Siguiendo el mismo enfoque, se muestra la
actividad farmacológica de cultivos primarios de papila dérmica a
distintas concentraciones del INN-18.2 (figura 22),
INN-24.1* (figura 23), INN-72*
(figura 24), INN-73* (figura 25),
INN-76* (figura 26) en las correspondientes
inmunotransferencias de tipo western.
<110> Kerner, Néstor Alberto; Alvarez
Roger, Maria Carolina; Balañá, María Eugenia
\vskip0.400000\baselineskip
<120> OLIGONUCLEÓTIDOS
ANTI-ANDRÓGENOS UTILIZABLES EN EL TRATAMIENTO DE
TRASTORNOS DERMATOLÓGICOS RELACIONADOS CON EL METABOLISMO DE LOS
ANDRÓGENOS, SUS COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS, SUS USOS Y MÉTODO DE
TRATAMIENTO
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 62618
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<150> P03 01 03517
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
26-09-2003
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN/ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCATTGGTGAAGGATCGCC
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN/ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAATCATTTCTGCTGGCG
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> ADN/ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCCTTCTTCGGCTGTGAAG
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
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<212> ADN/ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCACACGGTCCATACAACTGG
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN/ARN
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\vskip0.400000\baselineskip
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<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskipGGCGAAGTAGAGCATCCT
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 18
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<212> ADN/ARN
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<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido
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<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGGCGCACAGGTACTTCT
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
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<212> ADN/ARN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Oligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip-.1em\dddseqskipCCACCACCACCACACGG
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
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<223> Oligonucleótido
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCCGCCACCACCCCCACC
\hfill
Claims (10)
1. Un oligonucleótido
anti-andrógeno seleccionado del grupo que consiste
en las secuencias SEC ID Nº1 y SEC ID Nº5.
2. Oligonucleótido
anti-andrógeno según la reivindicación 1, en el que
las secuencias SEC ID Nº1 y SEC ID Nº5 son secuencias de ADN,
secuencias de S-ADN, secuencias mixtas de
ADN/S-ADN, o derivados alquilados o metilados en la
base nitrogenada.
3. Composición farmacéutica y/o cosmética,
caracterizada porque contiene un oligonucleótido
anti-andrógeno según las reivindicaciones
1-2 con un vehículo o vector.
4. Composición según la reivindicación 3,
caracterizada porque contiene además excipientes y/o
adyuvantes farmacéutica y/o cosméticamente aceptables.
5. Composición según la reivindicación 3,
caracterizada por estar en una forma adecuada para la
administración tópica.
6. Composición según la reivindicación 3,
caracterizada porque es una disolución acuosa.
7. Uso de un oligonucleótido
anti-andrógeno según las reivindicaciones
1-2, caracterizado porque es para la
fabricación de una composición para el tratamiento de la caída del
cabello asociada a andrógenos y trastornos de la piel relacionados
con andrógenos.
8. Uso según la reivindicación 7,
caracterizado porque dicha composición está en una forma
adecuada para la administración tópica.
9. Uso según la reivindicación 8,
caracterizado porque dicha composición está en forma de
disolución acuosa.
10. Método para el tratamiento de la caída del
cabello asociada a andrógenos en seres humanos, caracterizado
porque se exponen células del cuero cabelludo a una cantidad eficaz
de oligonucleótidos anti-andrógeno según las
reivindicaciones 1-2.
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Family Cites Families (8)
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US5877160A (en) | 1991-05-31 | 1999-03-02 | Genta Incorporated | Compositions and methods of treatment of androgen-associated baldness using antisense oligomers |
US5556956A (en) * | 1993-11-04 | 1996-09-17 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions relating to the androgen receptor gene and uses thereof |
CA2239976A1 (en) * | 1995-09-20 | 1997-03-27 | Paul A. Zamecnik | Antisense oligonucleotide chemotherapy for benign hyperplasia or cancer of the prostate |
US6489163B1 (en) * | 1996-05-08 | 2002-12-03 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Ribozyme mediated inactivation of the androgen receptor |
AU2001257526B2 (en) * | 2000-05-04 | 2007-07-19 | Avi Biopharma, Inc. | Splice-region antisense composition and method |
DE10141443B4 (de) * | 2001-08-23 | 2007-02-01 | Christos C. Prof. Dr. Zouboulis | Verwendung von molekularbiologisch hergestellten, nicht-viralen Wirkstoffen zur Behandlung der Akne |
EP1546344A4 (en) * | 2002-09-18 | 2007-10-03 | Isis Pharmaceuticals Inc | EFFICIENT REDUCTION OF TARGET RNA USING OLIGOMERIC COMPOUNDS WITH SINGLE AND DOUBLE STRAPS |
JP2006507841A (ja) * | 2002-11-14 | 2006-03-09 | ダーマコン, インコーポレイテッド | 機能的siRNAおよび超機能的siRNA |
-
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