ES2317710T3 - Tratamiento de la enfermedad de parkinson con oligonucleotidos. - Google Patents

Tratamiento de la enfermedad de parkinson con oligonucleotidos. Download PDF

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Abstract

Oligonucleótido antisentido para utilizar en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson en un mamífero, en el que el oligonucleótido antisentido debe ser administrado en: (a) la substantia nigra pars reticulata para la disminución de la decarboxilasa del ácido glutámico; (b) el globus pallidus interno para la disminución de la decarboxilasa del ácido glutámico; (c) la substantia nigra pars reticulata para la disminución de los receptores de glutamato; (d) el globus pallidus interno para la disminución de los receptores de glutamato; o (e) los núcleos motores talámicos para la disminución de los receptores GABA.

Description

Tratamiento de la enfermedad de Parkinson con oligonucleótidos.
Referencia cruzada a las solicitudes relacionadas
La presente solicitud reivindica la prioridad en virtud del artículo 119 de la disposición 35 U.S.C., basada en la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos número 60/107.191, presentada el 5 de noviembre de 1998.
Campo de la invención
La presente invención se refiere por lo general al campo de la terapia genética y un procedimiento de tratamiento de la enfermedad de Parkinson, y más particularmente a la utilización de oligonucleótidos antisentido o oligonucleótidos triplex introducidos en estructuras del cerebro específicas para disminuir la función de los circuitos del cerebro que se sabe que son hiperactivos en el cerebro parkinsoniano.
Antecedentes de la invención
Ciertas aberraciones en el circuito neuroquímico de los ganglios basales del cerebro se sabe que dan lugar a la enfermedad de Parkinson. Cuando mueren las neuronas de la dopamina (la patología primaria en la enfermedad de Parkinson), la pérdida de dopamina en el striatum (núcleo caudado y putamen) desencadena una serie de cambios en la actividad neural de otros núcleos del cerebro localizados a continuación del striatum. La Figura 1 representa los circuitos neuroquímicos normales de los ganglios basales del cerebro.
Los actuales enfoques en neurocirugía a este problema incluyen la destrucción del globus pallidus interno (GPi) mediante palidotomía o la implantación de electrodos para la estimulación eléctrica de esta región del cerebro. Existen serios inconvenientes a estos actuales enfoques en neurocirugía. La palidotomía es permanente; puede tener graves efectos secundarios dependiendo de la precisión de la lesión; y puede dar lugar a la demencia y también a otros problemas debido a la destrucción de las fibras del conducto que van a través del GPi de camino a otras estructuras. Los procedimientos de estimulación eléctrica requieren la implantación de electrodos en el cerebro y una caja de control bajo la piel. Con el transcurso del tiempo, podría tener lugar una reacción del tejido, haciendo de este modo inútiles o disfuncionales los electrodos. Además, la estimulación eléctrica crónica puede dañar el tejido, y se pueden desarrollar el kindling de los focos epilépticos como un resultado de la estimulación eléctrica crónica.
Las farmacoterapias tradicionales tienen también serios inconvenientes por el hecho de que los neuroquímicos que necesitan ser disminuidos en las estructuras diana se encuentran omnipresentes en el cerebro. La administración sistémica de los inhibidores de estos neuroquímicos puede provocar una crisis, una psicosis, un coma, e incluso la muerte.
La actual invención dispone de un número de características novedosas que representan mejoras sobre los actuales tratamientos para la enfermedad de Parkinson. En la presente invención se utiliza la neurocirugía molecular. El presente enfoque, a través de la utilización de oligonucleótidos antisentido o triplex específicos, elude los problemas presentados por los enfoques mediante neurocirugía y farmacoterapia convencionales. Por medio de la neurocirugía molecular, descrita posteriormente con más en detalle, la actual invención modifica con criterio selectivo el estatus funcional de los grupos específicos de neuronas sin interferir con el funcionamiento de otras neuronas cercanas. El presente enfoque selectivo se hace posible dirigiendo la aplicación de los oligonucleótidos a los neuroquímicos específicos en las estructuras neurales específicas. Con más precisión, la dirección selectiva tiene lugar mediante la introducción de vectores de expresión antisentido o triplex para proporcionar más cambios a largo plazo en la expresión génica. De esta manera, el resultado es la inhibición selectiva del funcionamiento anormal de ciertos circuitos neurales en el cerebro parkinsoniano sin interferir con el normal funcionamiento de estos neuroquímicos en el resto del cerebro. Además, mediante la alteración de la concentración o la secuencia de los oligonucleótidos, la presente invención hace posible valorar el grado en el que la actividad anormal se encuentra inhibida en los circuitos dianas. Esta capacidad de valorar asegura además que el tratamiento interfiere solamente con las funciones anormales y no provoca efectos secundarios no deseados.
La actual invención utiliza un procedimiento biológico molecular de tratamiento de la enfermedad de Parkinson. Los oligonucleótidos antisentido de la presente invención son secuencias cortas de nucleótidos del fosforotioato, diseñadas en laboratorio. Estos oligonucleótidos bloquean la traducción del ARN mensajero (mARN) en la proteína al ribosoma (Figura 2).
Otra manera de prevenir o disminuir la expresión de los genes nocivos es bloquear la transcripción del ADN. Este enfoque se utiliza también en la presente invención. Los oligonucleótidos, diseñados en laboratorio, forman estructuras triplex y bloquean el sitio de transcripción en los ADN diana.
Los oligonucleótidos antisentido o triplex se dirigen al globus pallidus interno y/o a la substantia nigra pars reticulata (SNr) donde se disminuye la expresión de la decarboxilasa del ácido glutámico (GAD_{67}, GAD_{65}, o una combinación de las dos isoformas). La decarboxilasa del ácido glutámico (bajo la forma de GAD_{67}, GAD_{65}, o una combinación de las dos isoformas) es la enzima de sintetización para la producción del ácido gamma-aminobutírico (GABA) neurotransmisor inhibidor. Como resultado de la disminución de la decarboxilasa del ácido glutámico, tiene lugar una disminución en la salida anormalmente elevada del GABA por el GPi y el SNr, y se mejoran los síntomas de la enfermedad de Parkinson.
Otras moléculas diana para el tratamiento del oligonucleótido antisentido o triplex de la presente invención son los receptores de glutamato en las neuronas en el GPi y el SNr. La expresión disminuida de estos receptores embota la respuesta de estas neuronas a los niveles incrementados de glutamato liberados por las proyecciones desde el núcleo subtalámico (STN) hacia el GPi y el SNr (Figura 3). Otras moléculas diana potenciales para el tratamiento del oligonucleótido antisentido o triplex de la presente invención son los receptores GABA en las neuronas en los núcleos motores talámicos que reciben entradas inhibitorias del GPi y del SNr en exceso.
En términos generales, la presente invención es útil para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson, que se puede llevar a cabo mediante la administración de los oligonucleótidos antisentido dirigidos hacia las transcripciones que codifican la enzima de sintetización GAD, llevando de este modo a un bloqueo altamente selectivo del GABA. Aunque las acciones del antisentido son selectivas, éstas serán relativamente de breve duración. Según la literatura, los sistemas vuelven al estado normal dentro de unos pocos días después del cese del tratamiento con los oligonucleótidos antisentido. Normalmente, para demostrar un efecto en la producción de la proteína, los oligonucleótidos antisentido necesitan ser administrados repetidas veces o mediante infusión continua. Por consiguiente, la presente invención emplea vectores de expresión del ARN. Estos vectores eucariotos produciendo el antisentido del ARN hacia la GAD_{65} o la GAD_{67} se deben inyectar en la región deseada del cerebro hacia las neuronas transfectadas de modo que cuando las células reciben una señal para producir el GABA, se activaría el antisentido y no se produciría el GABA.
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Descripción resumida de la invención
En consecuencia, es un objeto de la presente invención para proporcionar un oligonucleótido antisentido para utilizar en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson en un mamífero, en el que el oligonucleótido antisentido se administre en una de las siguientes regiones del cerebro:
(a) la substantia nigra pars reticulata para la disminución de la decarboxilasa del ácido glutámico;
(b) el globus pallidus interno para la disminución de la decarboxilasa del ácido glutámico;
(c) la substantia nigra pars reticulata para la disminución de los receptores de glutamato;
(d) el globus pallidus interno para la disminución de los receptores de glutamato; o
(e) los núcleos motores talámicos para la disminución de los receptores GABA.
Es un objetivo alternativo de la presente invención proporcionar un oligonucleótido triplex para utilizar en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson en un mamífero, en el que el oligonucleótido triplex se administre en una de las siguientes regiones del cerebro:
(a)
la substantia nigra pars reticulata para la disminución de la decarboxilasa del ácido glutámico;
(b)
el globus pallidus interno para la disminución de la decarboxilasa del ácido glutámico;
(c)
el substantia nigra pars reticulata para la disminución de los receptores de glutamato;
(d)
el globus pallidus interno para la disminución de los receptores de glutamato; o
(e)
los núcleos motores talámicos para la disminución de los receptores GABA.
La presente invención también se propone proporcionar la utilización de un oligonucleótido antisentido o un oligonucleótido triplex en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson en un mamífero, en el que el medicamento se administre a:
(a)
la substantia nigra pars reticulata para la disminución de la decarboxilasa del ácido glutámico;
(b)
el globus pallidus interno para la disminución de la decarboxilasa del ácido glutámico;
(c)
la substantia nigra pars reticulata para la disminución de los receptores de glutamato;
(d)
el globus pallidus interno para la disminución de los receptores de glutamato; o
(e)
los núcleos motores talámicos para la disminución de los receptores GABA.
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En la presente invención, si la administración se realiza en la substantia nigra pars reticulata o en el globus pallidus interno para la disminución de la decarboxilasa del ácido glutámico, la isoforma de dicha decarboxilasa del ácido glutámico es la GAD_{65}, la GAD_{67} o una combinación de la GAD_{65} y la GAD_{67}.
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Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 representa un diagrama de los efectos directos e indirectos normales de la dopamina en los circuitos neuroquímicos de los ganglios basales del cerebro.
La Figura 2 representa una representación esquemática de cómo el oligonucleótido antisentido puede bloquear la traducción de la proteína por la hibridación con el mARN complementario de la decarboxilasa del ácido glutámico. El oligonucleótido antisentido se hibridiza con el mARN diana complementario y provoca un bloqueo de la traducción de la proteína.
La figura 3 representa un diagrama de las aberraciones de los circuitos neuroquímicos de los ganglios basales del cerebro cuando tiene lugar la pérdida de dopamina en el cerebro parkinsoniano.
La Figura 4 representa un gráfico de barras que muestra la reducción porcentual en las rotaciones inducidas por la apomorfina de los animales infusionados con la GAD_{67} con el parkinsonismo inducido experimentalmente.
Las Figuras 5 a 7 representan gráficos de barras que muestran los cambios relativos en la actividad antes del tratamiento con los monos infusionados con la GAD_{67} con el parkinsonismo inducido experimentalmente.
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Descripción detallada Oligodesoxinucleotidos
Los oligonucleótidos del fosforotioato fueron sintetizados por Biosynthesis Inc., Lewisville, Texas.
Desde que los estudios iniciales de viabilidad fueron realizados sobre ratas, los primeros oligonucleótidos antisentido producidos fueron dirigidos contra secuencias de la enzima GAD de rata. La secuencia utilizada para generar el antisentido de la GAD_{67} de rata fue 5'-TGGAAGATGCCATCAGCTCGG-3' (número de identificación de la secuencia: 1). La secuencia utilizada para generar el antisentido de la GAD_{65} de rata fue 5'-CCGGAGATGC
CATGGGTTCTG-3' (número de identificación de la secuencia: 2). La secuencia utilizada para generar la GAD_{65} humana es 5'-CCGGAGATGCCATCGGCTTTG-3' (número de identificación de la secuencia: 3). La secuencia utilizada para generar la GAD_{67} humana es 5'-TCGAAGACGCCATCAGCTCGG-3' (número de identificación de la secuencia: 4). La secuencia antisentido usada para los estudios del mono (Saimiri sciureus) fue la GAD_{67}: 5'-GAA
GATGGGGTCGAAGACGC-3' (número de identificación de la secuencia: 5). El oligonucleótido de control para los estudios de la GAD_{67} del mono y de la rata fue una secuencia desorganizada de nucleótido de la secuencia antisentido de la GAD_{67} del mono: 5'-TAGGAGCAGACTGAGAGGGCG-3' (número de identificación de la secuencia: 6).
Estas secuencias se obtuvieron mediante la búsqueda en el GenBank de acuerdo con el nombre del gen apropiado. Estas secuencias se analizaron utilizando un programa buscador de marcos abiertos de lectura en el sitio World Wide Web del National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/gorf/orfig). La iniciación del sitio de la traducción se encontró y se seleccionó una molécula antisentido de 21 bases complementaria a la región que abarca de 8 bases 5' a 13 bases 3' (de -8 a +13) hacia el triplete de iniciación. Estos oligonucleótidos de 21 bases se analizaron para la reactividad cruzada con otros genes utilizando el servidor NCBI BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST/).
Los resultados de esta búsqueda indicaron que los oligos fueron solamente homólogos con los genes que se dirigieron en su contra. Según el algoritmo de BLAST, las moléculas antisentido de rata podrían reaccionar con el ARN de la enzima GAD de rata (Rattus norvegicus) y de ratón (Mus musculus). El análisis manual adicional de la GAD_{67} reveló una identidad del 90,5% secuencias entre la rata, el cerdo (Sus scrofa) y los humanos (Homo sapien) en el nivel del mARN que rodeaba el sitio de la iniciación de la traducción. El análisis manual de las secuencias de la GAD_{65} indica que el 85,7% se identifican con la GAD_{65} humana en la región que rodea la iniciación del sitio de la traducción. Según el algoritmo de BLAST, las moléculas antisentido de la GAD_{65} humana podrían reaccionar con el mARN de la GAD-2 humana (un gen del glutamato decarboxilasa encontrado en el páncreas humano) y la GAD_{65} humana. La molécula antisentido de la GAD_{67} humana podría reaccionar con la GAD_{67} humana (tanto en las isoformas del cerebro como en las del páncreas) y la GAD_{67} tanto del cerdo como del gato (Felis cattus).
El antisentido de la GAD_{67} de rata (número de identificación de la secuencia: 1) se compone de un 23,8% de adenosina, un 23,8% de citosina, un 33,3% de guanina, y un 19,0% de timina. El antisentido de la GAD_{65} de rata (número de identificación de la secuencia: 2) se compone de un 14,3% de adenosina, un 23,8% de citosina, un 38,1% de guanina, y un 23,8% de timina. La GAD_{67} humana (número de identificación de la secuencia: 4) se compone de un 23,8% de adenosina, un 33,3% de citosina, un 28,6% de guanina, y un 14,3% de timina. La GAD_{65} humana (número de identificación de la secuencia: 3) se compone de un 14,3% de adenosina, un 28,6% de citosina, un 33,3% de guanina, y un 23,8% de timina. Una molécula de secuencia alterada para ser utilizada en experimentos de control se diseñó mediante la desorganización del orden básico de la molécula antisentido. Este oligonucleótido del control para los estudios de la GAD_{67} fue una secuencia de nucleótido desorganizado de la secuencia antisentido de la GAD_{67} del mono (Saimiri sciureus): 5'-TAGGAGCAGACTGAGAGGGCG-3' (número de identificación de la secuencia: 6). La secuencia alterada tiene los mismos porcentajes de cada nucleótido que el antisentido pero la secuencia ha sido cambiada. Los oligonucleótidos de secuencia alterada se analizaron utilizando el servidor NCBI BLAST. Los resultados de este análisis indican que las moléculas de secuencia alterada no tienen ninguna homología perceptible con cualquier gen conocido.
El oligonucleótido antisentido se disolvió en el fluido cerebroespinal artificial estéril (124 mM de NaCl, 1 mM de KCl, 2,4 mM de CaCl_{2}, 26 mM de NaHCO_{3}, 1,24 mM de NaH_{2}PO_{4}, 2 mM de D-glucosa, y 1,3 mM de MgSO_{4}) hasta una concentración final de 43,1 \muM. Esto dio lugar a una infusión de 21,5 \muM/h durante un período de 2 semanas.
Animales
Los estudios iniciales se han realizado en varones adultos de ratas Sprague-Dawley (de 226 a 250 g). Los animales se anestesiaron con pentobarbital sódico y se colocaron en un marco estereotáxico estándar. A los animales se les administraron lesiones unilaterales del sistema negroestriatal de la dopamina utilizando la neurotoxina bromhidrato de 6-hidroxidopamina (6-OHDA-HBr). Dos inyecciones de 8 mM de 6-OHDA-HBr en 0,9% de NaCl que contenían 1,4 mM de ácido ascórbico se efectuaron en la substantia nigra pars compacta (SNc) en un lado del cerebro. Se colocó una inyección en el SNc medial y otra en el SNc lateral. Cuatro semanas después de provocar la lesión, las ratas se evaluaron por el grado de asimetría rotacional después de la inyección con la apomorfina agonista de la dopamina. Las rotaciones inducidas por la apomorfina en una dirección lejos del lado de la lesión son una medida estándar de parkinsonismo inducido experimentalmente en ratas. La capacidad de una droga de atenuar las rotaciones inducidas por la apomorfina es una aceptada medida de eficacia antiparkinson. El número de rotaciones completas de 360 grados se contó en épocas de 5 minutos durante un período total de observación de 1 hora. Las ratas que rotan un promedio de 5 veces por minuto o más se consideran que tienen por lo menos un 90% de lesión en el sistema negroestriatal de la dopamina. Los animales con pocas rotaciones tienen menor grado de daño del sistema de la dopamina.
Tratamiento Antisentido
Una vez se mostró que los animales tenían rotaciones inducidas por las lesiones en respuesta a la administración de la apomorfina, éstos se asignaron de forma aleatoria para recibir el tratamiento antisentido o las infusiones simuladas. El antisentido se administró por medio de minibombas osmóticas del modelo 2002 de Alzet (Alza Corp. Palo Alto, California), y una cánula a medida del calibre 32 (9,5 mm por debajo del soporte) que fue elaborada por Plastics One Inc (Roanoke, Virginia). Estas bombas se diseñan para bombear a una velocidad de aproximadamente 0,5 \mul/h durante 14 días. Esto da lugar a una infusión total antisentido de 7,241 \mumoles. Las bombas y la cánula se prepararon según las instrucciones del fabricante. En pocas palabras, las bombas se llenaron bajo condiciones estériles con 250 microlitros de antisentido de la GAD_{67} de rata (número de identificación de la secuencia: 1) o de solución excipiente de control o de secuencia alterada (número de identificación de la secuencia: 6). Se conectaron y se sujetaron a la bomba un moderador del flujo, la cánula para la infusión del cerebro y 4 mm de tubo del conectador. El montaje de la bomba se preparó entonces durante la noche a 37ºC en salino estéril. Las bombas se implantaron el día siguiente en los animales.
Para la implantación de la bomba, se anestesiaron las ratas con el pentobarbital sódico y se colocaron en un dispositivo estereotáxico estándar en una manta homeotérmica. La temperatura central se mantuvo a 37ºC. En algunos animales la cánula de infusión del cerebro se implantó justo por encima del núcleo entopeduncular (el roedor análogo del Gpi, 2,3 mm detrás del bregma, 2,5 mm del lateral de la línea media cerebral y 7,7 mm por debajo de la superficie del cráneo, según el atlas de Paxinos y Watson). Otros animales tenían la cánula de infusión del cerebro implantada justo por encima de la substantia nigra pars reticulata (5,3 mm detrás del bregma, 2,5 mm del lateral de la línea media cerebral y 8,2 mm por debajo de la superficie del cráneo, según el atlas de Paxinos y Watson). Estos dos objetivos se eligieron porque representan las dos áreas de salida principales de los ganglios basales. La hiperactividad de las neuronas que contienen el GABA en estas regiones del cerebro es probablemente muy responsable de la expresión de los síntomas parkinsonianos. Las cánulas se aseguraron en su sitio con acrílicos dentales. Todos los animales tenían la bomba de Alzet colocada en un bolsillo subcutáneo situado entre los omóplatos posteriores. Las heridas en el cuero cabelludo se cerraron con grapas tipo Autoclip y las ratas se mantuvieron calientes hasta que recobraron el sentido.
Las ratas se sometieron otra vez a las rotaciones inducidas por la apomorfina unos 7 y 14 días después de la implantación de la bomba osmótica. De quince a 17 días después de la implantación de la bomba, los animales se sacrificaron por decapitación y se extrajeron inmediatamente los cerebros para su análisis. Se extrajeron los cerebros y se ultracongelaron en hielo seco por inmunohistoquímica o por microdisección para el análisis HPLC del contenido de GABA.
Los experimentos antisentido adicionales se llevaron a cabo para que una sola inyección del oligonucleótido antisentido se administrara a nueve ratas. Estas nueve ratas se lesionaron con la 6-OHDA, tal y como se describió anteriormente. Aproximadamente de 3 a 4 semanas después de provocar la lesión, las ratas se sometieron a la asimetría rotacional inducida por la apomorfina, tal y como se describió anteriormente. Una vez que la integridad de la lesión se confirmó mediante una respuesta de rotación positiva, a los animales se les implantó una cánula guía situada en el cerebro recubriendo el núcleo entopeduncular. Dentro de las semanas de recuperación de la cirugía, la asimetría rotacional se evaluó otra vez para restablecer una respuesta de la línea base. Entonces se anestesiaron ligeramente las ratas con una mezcla de isofluorano/oxígeno y el oligonucleótido antisentido en la GAD_{67} (número de identificación de la secuencia: 1) se infusionó en el núcleo entopeduncular por medio de una cánula de inyección insertada a través de la cánula guía. Cada inyección contenía 250 ng de antisentido en 0,5 \mul.
Tres monos ardilla (1 macho y 2 hembras) se utilizaron para el presente estudio experimental. Todos los animales tenían medidas brutas de la actividad registradas mientras estaban en una jaula de observación con la utilización de un sistema automatizado de seguimiento de la actividad basado en el efecto Doppler. Las medidas de la actividad se registraron primero cuando los animales estaban en estado normal. Al menos se registraron de 3 a 5 sesiones de la actividad, durando cada una de ellas por lo menos de 2 a 3 horas. Los animales se hicieron entonces parkinsonianos por la administración de varias dosis de la neurotoxina MPTP (de 1,5 a 2,5 mg/kg, de forma intramuscular). La toxina se administró hasta que los animales desarrollaran un síndrome parkinsoniano estable. Los animales estuvieron en estado parkinsoniano estable durante un mínimo de 6 meses antes del tratamiento antisentido. Para la administración antisentido, a los animales se les implantó unas cánulas duales que cubrían el segmento interno del globus pallidus bilateralmente. Después de la cirugía, se registraron de nuevo las medidas de la actividad para asegurar que no había cambio en las medidas de la actividad de la línea base. Después de al menos un período de recuperación de una semana después de la cirugía, los monos se contuvieron en una silla de primates y el oligonucleótido antisentido se infusionan lentamente en el globus pallidus interno por medio de las cánulas internas insertadas a través de las cánulas guía implantadas. Para cada experimento, el oligonucleótido de la GAD_{67} (número de identificación de la secuencia: 5) fue diluido en fresco en el fluido cerebroespinal artificial esterilizado (CFS). Se llevó a cabo una inyección total de 500 ng, con 250 ng inyectados en cada uno de los lugares en cada lado del cerebro. El volumen de la inyección fue de 1,0 a 2,0 \mul. Después de la administración del antisentido, los animales se llevaron a sus jaulas y el seguimiento de la actividad comenzó de 24 a 48 horas más tarde y fue registrado varias veces durante las siguientes 2 a 3 semanas. Después de que los estudios antisentido se llevaran a cabo, se repitió el mismo procedimiento utilizando un oligonucleótido de secuencia alterada que fue una secuencia desorganizada del oligonucleótido antisentido. Los estudios con el oligonucleótido de secuencia alterada (número de identificación de la secuencia: 5) se llevaron a cabo exactamente como los estudios antisentido.
Resultados
En las ratas normales implantadas con antisentido de la GAD_{67} (número de identificación de la secuencia: 1) en el globus pallidus, el análisis HPLC demostró que una infusión antisentido de 2 semanas en el núcleo entopeduncular provocó una reducción del 65% en promedio en los niveles del GABA en comparación con el hemisferio contralateral no tratado.
Las ratas que tenían antisentido de la GAD_{67} (número de identificación de la secuencia: 1) infusionado sobre el núcleo entopeduncular tenían el número de rotaciones inducidas por la apomorfina reducidas una media del 52%. Las ratas que tenían el antisentido de la GAD_{67} (número de identificación de la secuencia: 1) infusionado sobre la substantia nigra pars reticulata (SNr) tenían el número de rotaciones inducidas por la apomorfina reducidas una media del 31%. La mejora combinada en asimetría rotacional de ambos grupos de animales es de aproximadamente el 39%. La Figura 4 es una representación gráfica de estos resultados. Un cambio en las coordenadas quirúrgicas puede mejorar la respuesta a la infusión antisentido del SNr. Las infusiones simultáneas en ambas estructuras pueden también mejorar la respuesta. En comparación, las ratas que recibieron infusión simulada mostraron un aumento en las rotaciones inducidas por la apomorfina del 23% durante el mismo periodo de tiempo.
Las ratas que habían recibido el procedimiento de una única inyección, las rotaciones inducidas por la apomorfina se redujeron una media del 34% cuando se midieron 24 horas después de la infusión. Durante 6 días después de la infusión, las rotaciones se incrementaron un 5% sobre niveles pre-antisentido. Las mismas ratas recibieron la infusión del oligonucleótido desorganizado (número de identificación de la secuencia: 6) y estos animales mostraron aumentos del 25% y del 38% en rotaciones inducidas por la apomorfina 24 horas y 6 días, respectivamente, después de la infusión del control.
Estos datos demuestran la viabilidad y la eficacia del presente tratamiento como un medio para reducir la sintomatología parkinsoniana en un modelo comúnmente aceptado para la eficacia de la investigación de nuevas terapéuticas antiparkinson potenciales.
Los resultados del estudio experimental del mono revelaron que aunque los ciclos de tiempo y las magnitudes del efecto se diferenciaran ligeramente a través de los 3 animales, todos los animales demostraron un incremento en la actividad espontánea (una disminución de la acinesia y la bradicinesia) después del tratamiento antisentido (número de identificación de la secuencia: 5) pero no después del tratamiento del oligonucleótido de secuencia alterada (número de identificación de la secuencia: 6). Las diferencias individuales de los animales podrían haber sido debidas a ligeras diferencias en la colocación de las cánulas de inyección y a diferencias individuales el grado de parkinsonismo y niveles de actividad espontánea. No obstante, estos estudios de primates no humanos presentan la prueba principal de que la terapia tiene efectos en potencia beneficiosos sobre los síntomas principales de la enfermedad de Parkinson.
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Referencias citadas en la descripción
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Documentos de patente citados en la descripción
\bullet US 10719198 P [0001]
\bullet WO 60107191 A [0033]
<110> Jay Schneider
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<120> Tratamiento de la Enfermedad de Parkinson con Oligonucleótidos
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<130> oligo no provisional de Schneider
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<140>
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<141>
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<150> 60/107.191
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<151> 5 de noviembre de 1998
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<160> 6
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<170> PatentIn Versión 2.1
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<210> 1
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Rattus norvegicus 
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<400> 1
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tggaagatgc catcagctcg g 
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21 
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<210> 2
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Rattus norvegicus 
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<210> 3
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
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<400> 3
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21 
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<210> 4
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
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<400> 4
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21 
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<210> 5
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Saimiri sciureus 
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20 
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<210> 6
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<211> 21
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<212> ADN
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<213> Saimiri sciureus 
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<400> 6
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taggagcaga ctgagagggc g 
\hfill
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Claims (12)

1. Oligonucleótido antisentido para utilizar en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson en un mamífero, en el que el oligonucleótido antisentido debe ser administrado en:
(a)
la substantia nigra pars reticulata para la disminución de la decarboxilasa del ácido glutámico;
(b)
el globus pallidus interno para la disminución de la decarboxilasa del ácido glutámico;
(c)
la substantia nigra pars reticulata para la disminución de los receptores de glutamato;
(d)
el globus pallidus interno para la disminución de los receptores de glutamato; o
(e)
los núcleos motores talámicos para la disminución de los receptores GABA.
2. Oligonucleótido triplex para utilizar en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson en un mamífero, en el que el oligonucleótido triplex debe ser administrado en:
(a)
la substantia nigra pars reticulata para la disminución de la decarboxilasa del ácido glutámico;
(b)
el globus pallidus interno para la disminución de la decarboxilasa del ácido glutámico;
(c)
la substantia nigra pars reticulata para la disminución de los receptores de glutamato;
(d)
el globus pallidus interno para la disminución de los receptores de glutamato; o
(e)
los núcleos motores talámicos para la disminución de los receptores GABA.
3. Oligonucleótido antisentido para la utilización de la parte (a) o de la parte (b) de la Reivindicación 1, en el que la isoforma de dicha decarboxilasa del ácido glutámico es la GAD_{65}.
4. Oligonucleótido antisentido para la utilización de la parte (a) o de la parte (b) de la Reivindicación 1, en el que la isoforma de dicha decarboxilasa del ácido glutámico es la GAD_{67}.
5. Oligonucleótido antisentido para la utilización de la parte (a) o de la parte (b) de la Reivindicación 1, en el que la isoforma de dicha decarboxilasa del ácido glutámico es una combinación de la GAD_{65} y la GAD_{67}.
6. Oligonucleótido triplex para la utilización de la parte (a) o de la parte (b) de la Reivindicación 2, en el que la isoforma de dicha decarboxilasa del ácido glutámico es la GAD_{65}.
7. Oligonucleótido triplex para la utilización de la parte (a) o de la parte (b) de la Reivindicación 2, en el que la isoforma de dicha decarboxilasa del ácido glutámico es la GAD_{67}.
8. Oligonucleótido triplex para la utilización de la parte (a) o de la parte (b) de la Reivindicación 2, en el que la isoforma de dicha decarboxilasa del ácido glutámico es una combinación de la GAD_{65} y la GAD_{67}.
9. Utilización de un oligonucleótido antisentido en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson en un mamífero, en el que el medicamento se debe administrar en:
(a)
la substantia nigra pars reticulata para la disminución de la decarboxilasa del ácido glutámico;
(b)
el globus pallidus interno para la disminución de la decarboxilasa del ácido glutámico;
(c)
la substantia nigra pars reticulata para la disminución de los receptores de glutamato;
(d)
el globus pallidus interno para la disminución de los receptores de glutamato; o
(e)
los núcleos motores talámicos para la disminución de los receptores GABA.
10. Utilización de la parte (a) o de la parte (b) de la Reivindicación 9, en el que la isoforma de dicha decarboxilasa del ácido glutámico es (i) la GAD_{65}, (ii) la GAD_{67} o (iii) una combinación de la GAD_{65} y la GAD_{67}.
11. Utilización de un oligonucleótido triplex en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson en un mamífero, en el que el medicamento se debe administrar en:
(a)
la substantia nigra pars reticulata para la disminución de la decarboxilasa del ácido glutámico;
(b)
el globus pallidus interno para la disminución de la decarboxilasa del ácido glutámico;
(c)
la substantia nigra pars reticulata para la disminución de los receptores de glutamato;
(d)
el globus pallidus interno para la disminución de los receptores de glutamato; o
(e)
los núcleos motores talámicos para la disminución de los receptores GABA.
12. Utilización de la parte (a) o de la parte (b) de la Reivindicación 11, en el que la isoforma de dicha decarboxilasa del ácido glutámico es (i) la GAD_{65}, (ii) la GAD_{67} o (iii) una combinación de la GAD_{65} y la GAD_{67}.
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