ES2315666T3 - Protease. - Google Patents

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ES2315666T3 ES04738929T ES04738929T ES2315666T3 ES 2315666 T3 ES2315666 T3 ES 2315666T3 ES 04738929 T ES04738929 T ES 04738929T ES 04738929 T ES04738929 T ES 04738929T ES 2315666 T3 ES2315666 T3 ES 2315666T3
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Abstract

Polipéptido aislado que posee una actividad proteasa, y que presenta una temperatura de fusión (T m) de al menos 78ºC, determinada por calorimetría diferencial de barrido (DSC) en 10 mM de tampón de sodio, 50 mM de cloruro de sodio, pH 7,0, usando una velocidad de barrido constante de 1,5ºC/min, donde el polipéptido es seleccionado del grupo consistente en: (a) un polipéptido que posee una secuencia de aminoácidos que presenta un grado de identidad con los aminoácidos 1 a 188 de SEC ID Nº: 2 y/o 1 a 188 de SEC ID Nº: 12 de al menos el 60%; An isolated polypeptide having protease activity, and having a melting temperature (T m) of at least 78 ° C, determined by differential scanning calorimetry (DSC) in 10 mM sodium buffer, 50 mM sodium chloride, pH 7 , 0, using a constant sweep of 1.5 / min, wherein the polypeptide is selected from the group consisting of: (a) a polypeptide having an amino acid sequence exhibiting a degree of identity to amino acids 1 to 188 of SEQ ID NO: 2 and / or 1 to 188 of SEQ ID NO: 12 of at least 60%; (b) un polipéptido que es codificado por una secuencia de ácidos nucléicos que se hibridiza en condiciones de astringencia alta con cualquiera de los nucleótidos 499-1062 de SEC ID Nº: 1, y/o 502-1065 de SEC ID Nº: 11; (B) a polypeptide which is encoded by a nucleic acid sequence which hybridizes under high stringency conditions with either of nucleotides 499-1062 of SEQ ID NO: 1 and / or 502-1065 of SEQ ID NO: 11; y (c) un polipéptido que es codificado por una secuencia de ácidos nucléicos que presenta un grado de identidad para cualquiera de los nucleótidos 499-1062 de SEC ID Nº: 1, y/o 502-1065 de SEC ID Nº: 11 de al menos el 72%. and (c) a polypeptide which is encoded by a nucleic acid sequence having a degree of identity to nucleotides 499-1062 of any of SEQ ID NO: 1, and / or 502-1065 of SEQ ID NO: 11 to least 72%.

Description

Proteasas. Protease.

Campo de la invención Field of the Invention

La presente invención se refiere a un polipéptido aislado que tiene una actividad proteasa y es homólogo de las proteasas de Nocardiopsis , así como de secuencias de ácido nucleico aisladas codificantes de éste. The present invention relates to an isolated polypeptide having protease activity and is homologous Nocardiopsis proteases, as well as isolated nucleic acid sequences encoding it. La invención se refiere también a constructos de ácido nucleico, vectores, ya células huéspedes, incluyendo plantas transgénicas y animales no humanos, comprendiendo esas secuencias de ácidos nucleicos, así como métodos de producción y uso de la proteasa, en particular en alimentos para animales, por ejemplo en alimentos para peces. The invention also relates to nucleic acid constructs, vectors, and host cells, including transgenic plants and non-human animals, comprising these nucleic acid sequences as well as methods of producing and using the protease, in particular in animal feed, for example in fish feed.

La proteasa de la invención es termoestable, y se exponen unas cualidades estructurales características relevantes para la termoestabilidad de las proteasas de la familia peptidasa S2A o S1E. The protease of the invention is thermostable, and a relevant characteristics structural qualities for the thermostability of proteases of peptidase family S2A or the S1E are disclosed.

La proteasa de la invención degrada eficazmente también el inhibidor de soja Bowman-Birk, así como otros factores antinutritivos como la aglutinina de soja, y el inhibidor de tripsina Kunitz, así como las proteínas de almacenamiento de soja aisladas como la glicinina y la beta-conglicinina. The protease of the invention also effectively degrades the soybean Bowman-inhibitor Birk and other anti-nutritional factors such as soybean agglutinin, and the Kunitz trypsin inhibitor and proteins isolated soybean storage as glycinin and beta- conglycinin.

Antecedentes de la invención BACKGROUND OF THE INVENTION

Las proteasas derivadas de la especie Nocardiopsis NRRL 18262 y Nocardiopsis dassonvillei NRRL 18133 son descritas en WO 88/03947. Proteases derived from Nocardiopsis species NRRL 18262 and Nocardiopsis dassonvillei NRRL 18133 are described in WO 88/03947. Las secuencias de ADN y aminoácidos de la proteasa derivada de la especie Nocardiopsis NRRL 18262 son mostrados en la solicitud DK Nº. The DNA sequences and amino acid protease derived from Nocardiopsis species NRRL 18262 are shown in DK application No.. 1996 00013. WO 01/58276 expone el uso en alimentos para animales de proteasas estables al ácido relacionadas con las proteasas derivadas de la especie Nocardiopsis NRRL 18262, así como una proteasa derivada de Nocardiopsis alba DSM 14010. No obstante, estas proteasas no son termoestables. WO 01/58276 discloses 1996 00013. use in animal feed of stable proteases related to the proteases derived from Nocardiopsis species NRRL 18262 acid and a protease derived from Nocardiopsis alba DSM 14010. However, these proteases are not thermostable .

JP 2-255081-A expone una proteasa derivada de una cepa de especie Nocardiopsis OPC-210 (FERM P-10508), aunque sin información de secuencia. JP 2-255081-A discloses a protease derived from a strain of Nocardiopsis species OPC-210 (FERM P-10508), but no sequence information. La cepa ya no está disponible, ya que el depósito fue retirado. The strain is no longer available because the deposit was withdrawn.

DD 20043218 expone una preparación proteolítica derivada de una cepa de Nocardiopsis dassonvillei ZIMET 43647, aunque sin información de secuencia. DD 20043218 discloses a proteolytic preparation derived from a strain of Nocardiopsis dassonvillei ZIMET 43647, but without sequence information. La cepa ya no se encuentra disponible. The strain is no longer available.

JP 2003284571-A, publicada después de la primera fecha de solicitud de la presente invención, expone la secuencia de aminoácidos y la secuencia de ADN correspondiendo a una proteasa derivada de la especie Nocardiopsis TOA-1 (FERM P-18676). JP 2003284571-A, published after the first filing date of the present invention, discloses the amino acid sequence and DNA sequence corresponding to a protease derived from Nocardiopsis species TOA-1 (FERM P-18676). La secuencia ha sido introducida en GENESEQP con nº ADF43564. The sequence has been entered in GENESEQP with no ADF43564.

Unas proteasas termoestables están descritas en la técnica anterior, por ejemplo una proteasa de Termomonospora fusca YX está descrita por Lao y Wilson en Appl. A thermostable proteases are described in the prior art, for example a Termomonospora fusca protease YX is described by Lao it and Wilson in Appl. Environ. Environ. Microbiol. Microbiol. 62:4256-4259 (1996), y la secuencia fue depositada en las bases de datos públicas como sptrembl_086984. 62: 4256-4259 (1996), and the sequence was deposited in public databases as sptrembl_086984. No obstante, esta proteasa no es homóloga de las proteasas de Nocardiopsis , ya que el porcentaje de identidad con las proteasas de la invención es inferior al 60%. However, this protease is not homologous to Nocardiopsis proteases, as the percentage identity to the proteases of the invention is less than 60%.

Mitsuiki Shinji et al (Bioscience Biotechnology and Biochemistry, vol. 66, no. 1, 2002, pp 164-167) revelan una proteasa alcalina no termoestable de la especie Nocardiopsis con una temperatura óptima de aproximadamente 70ºC. Mitsuiki Shinji et al (Bioscience Biotechnology and Biochemistry, vol. 66, no. 1, 2002, pp 164-167) disclose a non - thermostable alkaline protease from Nocardiopsis species with an optimum temperature of about 70C.

EP-A-0506448 expone una proteasa de enzimogenes Lisobacter y de algunos mutantes de los mismos que pueden ser termoestables, no obstante el ADN de codificación presenta menos del 72% de identidad con los nucleótidos 499-1062 de SEC ID Nº:1 y los nucleótidos 502-1065 de SEC ID Nº:11. EP-A-0506448 discloses a protease enzimogenes Lisobacter and certain mutants thereof that may be thermostable, however the encoding DNA has less than 72% identity with nucleotides 499-1062 of SEQ ID NO: 1 and nucleotides 502-1065 of SEQ ID NO: 11.

Un objeto de la presente invención es proporcionar proteasas termoestables que sean homólogas a las proteasas de Nocardiopsis , en particular con un potencial para su uso en alimentos para animales y/o detergentes. An object of the present invention to provide thermostable proteases that are homologous to Nocardiopsis proteases, in particular with a potential for use in animal feed and / or detergents.

Resumen de la invención SUMMARY OF THE INVENTION

Varias proteasas termoestables fueron aisladas y caracterizadas, es decir una proteasa derivada de la especie Nocardiopsis dassonvillei , subespecie dassonvillei DSM 43235 (véase SEC ID Nº: 1 y 2); Several thermostable proteases were isolated and characterized, i.e. a protease derived from Nocardiopsis dassonvillei species, subspecies dassonvillei DSM 43235 (see SEQ ID NO: 1 and 2); una Proteasa sintética 22 (véase SEC ID Nº: 7 y 8); a synthetic Protease 22 (see SEQ ID NO: 7 and 8); una proteasa L2a derivada de la especie Nocardiopsis DSM 16424 (véase SEC ID Nºs: 9 y 10); one L2a protease derived from Nocardiopsis species DSM 16424 the (see SEQ ID NOs: 9 and 10); y Proteasa 8 derivada de Nocardiopsis alba DSM 15647 (véase SEC ID Nºs: 11 y 12). and Protease 8 derived from Nocardiopsis alba DSM 15647 (see SEQ ID NOs: 11 and 12).

La invención expone un polipéptido aislado que posee una actividad proteasa, y que tiene una temperatura de fusión (T_{m}) de al menos 78ºC, determinada por Calorimetría Diferencial de Barrido (DSC) en un tampón de fosfato de sodio a 10 mM, cloruro de sodio a 50 mM, pH 7,0, usando un índice de barrido constante de 1,5ºC/min, donde el polipéptido es seleccionado del grupo consistente en: (a) un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que posee un grado de identidad con los aminoácidos 1 a 188 de SEC ID Nº: 2 y/o 1 a 188 de SEC ID Nº: 12 de al menos 60%; The invention discloses an isolated polypeptide having a protease activity, and having a melting temperature (T_ {m}) of at least 78 ° C determined by Differential Scanning Calorimetry (DSC) in a buffer of sodium phosphate 10 mM, 50 mM sodium, pH 7.0, using a constant scan rate of 1.5 ° C / min, wherein the polypeptide is selected from the group consisting of chloride: (a) a polypeptide having an amino acid sequence having a degree of identity with amino acids 1 to 188 of SEQ ID NO: 2 and / or 1 to 188 of SEQ ID NO: 12 of at least 60%; (b) un polipéptido codificado por una secuencia de ácidos nucléicos que se hibridiza en condiciones de astringencia alta con cualquier nucleótido 499-1062 de SEC ID Nº: 1 y/o 502-1065 de SEC ID Nº: 11. y (c) un polipéptido que es codificado por una secuencia de ácidos nucléicos que tiene un grado de identidad para cualquiera de los nucleótidos 499-1062 de SEC ID Nº: 1 y/o 502-1065 de SEC ID Nº: 11 de al menos 72%. (B) a polypeptide encoded by a nucleic acid sequence which hybridizes under high stringency conditions with any nucleotide 499-1062 of SEQ ID NO: 1 and / or 502-1065 of SEQ ID NO: 11 and (c) polypeptide is encoded by a nucleic acid sequence having a degree of identity to nucleotides 499-1062 of any of SEQ ID NO: 1 and / or 502-1065 of SEQ ID NO: 11 of at least 72%. La invención también se refiere a secuencias de ácido nucleico aisladas codificantes de tales proteasas; The invention also relates to isolated nucleic acid sequences encoding such proteases; constructos de ácido nucleico, vectores, ya células huéspedes comprendiendo las secuencias de ácido nucleico; nucleic acid constructs, vectors, and host cells comprising the nucleic acid sequences; así como a métodos para producir y usar las proteasas, en particular en alimentos para animales. as well as methods for producing and using the proteases, in particular in animal feed.

También están descritos aquí: They are also described herein:

A. Un polipéptido aislado de la familia de peptidasas S2A y/o familia de peptidasas S1E que posee una actividad proteasa, y posee una secuencia amino comprendiendo al menos uno de los siguiente aminoácidos en la posición indicada: 10Y, 24S, 38T, 42G, 49T, 51T, 53Q, 54N, 82S, 86Q, 87S, 89T, 91T, 92S, 96A, 99A, 118N, 120T, 122R, 125Q, 129Y, 130S, 131L, 135N, 147F, 151S, 165S, 166V, 171Y, 179I, y/o 186I; A. An isolated polypeptide of peptidase family S2A of and / or peptidase family S1E of having a protease activity, and having an amino sequence comprising at least one of the following amino acids at the position indicated: 10Y, 24S, 38T, 42G, 49T, 51T, 53Q, 54N, 82S, 86Q, 87S, 89T, 91T, 92S, 96A, 99A, 118N, 120T, 122R, 125Q, 129Y, 130S, 131L, 135N, 147f, 151S, 165S, 166V, 171Y, 179I, and / or 186i; preferiblemente 10Y, 38T, 82S, 99A, 118N, 120T, 122R, 125Q, 129Y, 130S, 131L, 165S, y/o 171Y; preferably 10Y, 38T, 82S, 99A, 118N, 120T, 122R, 125Q, 129Y, 130S, 131L, 165S, and / or 171Y; más preferiblemente junto con al menos uno de 95P, 100V, y/o 1141; more preferably together with at least one of 95P, 100V, and / or 1141; y/o en conjunto con (H35 + D61 + S143); and / or together with (H35 + D61 + S143); donde cada posición corresponde a una posición de SEC ID Nº: 2; where each position corresponds to a position of SEQ ID NO: 2;

B. El polipéptido de B que comprende al menos uno de los siguientes aminoácidos en la posición indicada: 38T, 92S, 120T, 125Q, 131L, 135N, 147F, 151S, 165S, y/o 171Y; B. The polypeptide of B which comprises at least one of the following amino acids at the position indicated: 38T, 92S, 120T, 125Q, 131L, 135N, 147f, 151S, 165S, and / or 171Y;

C. El polipéptido de A que comprende al menos uno de los siguientes aminoácidos en la posición indicada: 10Y, 24S, 42G, 49T, 51T, 53Q, 54N, 82S, 86Q, 87S, 89T, 91T, 96A, 99A, 118N, 122R, 129Y, 130S, 166V, 179I, y/o 186I; C. The polypeptide of A which comprises at least one of the following amino acids at the position indicated: 10Y, 24S, 42G, 49T, 51T, 53Q, 54N, 82S, 86Q, 87S, 89T, 91T, 96A, 99A, 118N, 122R, 129Y, 130S, 166V, 179I, and / or 186i;

D. Un polipéptido aislado de la familia de peptidasas S2A y/o familia de peptidasas S1E que posee una actividad proteasa, y posee una secuencia amino comprendiendo a al menos uno de los siguientes aminoácidos en la posición indicada: 25S, 38T, 42P, 44S, 49Q, 54R, 62S, 89S, 91S, 92S, 95A, 99Q, 100I, 114V, 120T, 125Q, 129Q, 131L, 135N, 147F, 151S, 165S, 166F, 171Y, 176N, 179L, 180S, 184L, y/o 185T; D. An isolated polypeptide of peptidase family S2A of and / or peptidase family S1E of having a protease activity and has an amino sequence comprising at least one of the following amino acids at the position indicated: 25S, 38T, 42P, 44S , 49Q, 54R, 62S, 89S, 91S, 92S, 95A, 99Q, 100I, 114V, 120T, 125Q, 129Q, 131L, 135N, 147f, 151S, 165S, 166F, 171Y, 176N, 179L, 180S, 184L, and / or 185T; preferiblemente 25S, 38T, 42P, 44S, 54R, 62S, 125Q, 131L, 165S, 171Y, 176N, 179L, 180S, 184L, y/o 185T; preferably 25S, 38T, 42P, 44S, 54R, 62S, 125Q, 131L, 165S, 171Y, 176N, 179L, 180S, 184L, and / or 185T; más preferiblemente en conjunto con al menos uno de 24A, 51V, 53E, 86A, 87T, 961, y/o 186L; more preferably together with at least one of 24A, 51V, 53E, 86A, 87T, 961, and / or 186L; y/o en conjunto con (H35 + D61 + S143); and / or together with (H35 + D61 + S143); donde cada posición corresponde a una posición de SEC ID Nº: 12. where each position corresponds to a position of SEQ ID NO: 12.

E. El polipéptido de D que comprende al menos uno de los siguientes aminoácidos en la posición indicada: 38T, 92S, 120T, 125Q, 131L, 135N, 147F, 151S, 165S, y/o 171Y. E. The polypeptide of D which comprises at least one of the following amino acids at the position indicated: 38T, 92S, 120T, 125Q, 131L, 135N, 147f, 151S, 165S, and / or 171Y.

F. El polipéptido de D que comprende al menos uno de los siguientes aminoácidos en la posición indicada: 25S, 42P, 44S, 49Q, 54R, 62S, 89S, 91S, 95A, 99Q, 100I, 114V, 129Q, 166F, 176N, 179L, 180S, 184L, y/o 185T. F. The polypeptide of D which comprises at least one of the following amino acids at the position indicated: 25S, 42P, 44S, 49Q, 54R, 62S, 89S, 91S, 95A, 99Q, 100I, 114V, 129Q, 166F, 176N, 179L, 180S, 184L, and / or 185T.

G. El polipéptido de cualquiera de A, B, C, D, E, y F que tiene una T_{m} de al menos 78ºC medida por DSC en fosfato de sodio a 10 mM de, cloruro de sodio a 50 mM, pH 7,0; G. The polypeptide of any of A, B, C, D, E, and F which has a T_ {m} of at least 78 ° C as measured by DSC in sodium phosphate 10mM, sodium chloride 50 mM, pH 7.0; y/o una actividad relativa con pH9 y 80ºC de al menos 0,40; and / or a relative activity with pH9 and 80 ° C of at least 0.40;

H. El polipéptido de cualquiera de A, B, C, D, E, F, y G que tiene un porcentaje de identidad de al menos 60% con cualquiera de los aminoácidos -166 a 188, preferiblemente 1-188, de SEC ID Nº: 2; H. The polypeptide of any of A, B, C, D, E, F, and G which has a percentage identity of at least 60% with any of the amino acids -166 to 188, preferably 1-188, of SEQ ID NO: 2; aminoácidos -192 a 196, preferiblemente 1-196, de SEC ID Nº: 8; amino acids -192 to 196, preferably 1-196, of SEQ ID NO: 8; aminoácidos -195 a 189, preferiblemente 1-189 de SEC ID Nº: 10; amino acids -195 to 189, preferably 1-189 of SEQ ID NO: 10; y/o con los aminoácidos -167 a -1, preferiblemente 1-188, de SEC ID Nº: 12; and / or amino acids -167 to -1, preferably 1-188, of SEQ ID NO: 12;

I. El polipéptido de cualquiera de A, B, C, D, E, F, G; I. The polypeptide of any of A, B, C, D, E, F, G; y H que es i) una proteasa bacteriana; and H which is i) a bacterial protease; ii) una proteasa del Filum Actinobacteria ; ii) a protease of the phylum Actinobacteria; iii) de la clase Actinobacteria ; iii) the class Actinobacteria; iv) del orden Actinomicetales v) de la familia Nocardiopsaceae ; iv) the order Actinomycetales v) the family Nocardiopsaceae; vi) del género Nocardiopsis ; vi) of the genus Nocardiopsis; y/o una proteasa derivada de vii) especies de Nocardiopsis como las Nocardiopsis alkaliphila, Nocardiopsis antarctica, Nocardiopsis prasina, Nocardiopsis cornposta, Nocardiopsis exhalans, Nocardiopsis halophila, Nocardiopsis halotolerans, Nocardiopsis kunsanensis, Nocardiopsis listed, Nocardiopsis lucentensis, Nocardiopsis metallicus, Nocardiopsis synnemataformans, Nocardiopsis trehalosi, Nocardiopsis tropica, Nocardiopsis umidischolae, Nocardiopsis xinjiangensis , o Nocardiopsis dassonvillei , por ejemplo una proteasa derivada de Nocardiopsis antarctica o Nocardiopsis dassonvillei ., por ejemplo, Nocardiopsis dassonvillei DSM 43235, especie Nocardiopsis DSM 16424, o Nocardiopsis alba DSM 15647, tal como un polipéptido con la secuencia de aminoácidos de las partes de péptido maduro de cualquier SEC ID Nºs: 2, 8, 10 ó 12; and / or a protease derived from vii) species Nocardiopsis as alkaliphila Nocardiopsis antarctica Nocardiopsis, prasina Nocardiopsis, cornposta Nocardiopsis, exhalans Nocardiopsis, Nocardiopsis halophila, Nocardiopsis halotolerans, Nocardiopsis kunsanensis, Nocardiopsis listed, lucentensis Nocardiopsis, Nocardiopsis metallicus, synnemataformans Nocardiopsis, Nocardiopsis trehalosi, tropica Nocardiopsis, Nocardiopsis umidischolae, xinjiangensis Nocardiopsis, or Nocardiopsis dassonvillei, for example a protease derived from antarctica or Nocardiopsis dassonvillei Nocardiopsis., for example Nocardiopsis dassonvillei DSM 43235, species Nocardiopsis DSM 16424, or Nocardiopsis alba DSM 15647, such as a polypeptide having the amino acid sequence of the mature peptide parts of SEQ ID NOs any: 2, 8, 10 or 12;

J. Una secuencia de ácidos nucléicos aislada comprendiendo una secuencia de ácidos nucléicos que codifica el polipéptido de cualquiera de A, B, C, D, E, F, G, H o I; J. An isolated nucleic acid sequence comprising a nucleic acid sequence encoding the polypeptide of any of A, B, C, D, E, F, G, H or I;

K. Un constructo de ácido nucléico comprendiendo la secuencia de ácidos nucléicos de J enlazada operativamente a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un huésped de expresión adecuado; K. A nucleic acid construct comprising the nucleic acid sequence of J operably linked to one or more control sequences that direct the production of the polypeptide in a suitable expression host;

L. Un vector de expresión recombinante comprendiendo el constructo de ácido nucléico de K; L. A recombinant expression vector comprising the nucleic acid construct of K;

M. Una célula huésped recombinante comprendiendo el constructo de ácido nucléico de K o el vector de L; M. A recombinant host cell comprising the nucleic acid construct of K or the vector of L;

N. Un método para la producción de un polipéptido de cualquiera de A, B, C, D, E, F, G, H, o I, el método comprendiendo: (a) el cultivo de una célula huésped recombinante de M para producir un sobrenadante comprendiendo el polipéptido; N. A method for producing a polypeptide of any of A, B, C, D, E, F, G, H, or I, the method comprising: (a) culturing a recombinant host cell of M to produce a supernatant comprising the polypeptide; y (b) recuperación del polipéptido; and (b) recovering the polypeptide;

O. Una planta transgénica, o parte de planta, capaz de expresar el polipéptido de cualquiera de A, B, C, D, E, F, G, H, o I; O. A transgenic plant, or plant part, capable of expressing the polypeptide of any of A, B, C, D, E, F, G, H, or I;

P. Un animal transgénico, no humano, o productos, o elementos del mismo, capaces de expresar el polipéptido de cualquiera de los A, B, C, D, E, F, G, H, o I; P. A transgenic nonhuman animal, or products, or elements thereof, capable of expressing the polypeptide of any of the A, B, C, D, E, F, G, H, or I;

Q. Uso de al menos un polipéptido como definido en A, B, C, D, E, F, G, H o I (i) en alimentos para animales; Q. Use of at least one polypeptide as defined in A, B, C, D, E, F, G, H or I (i) in animal feed; (ii) en la preparación de una composición para su uso en alimentos para animales (iii) para mejorar el valor nutritivo de un alimento para animales; (Ii) in the preparation of a composition for use in animal feed (iii) for improving the nutritional value of an animal feed; (iv) para aumentar la proteína digerible y/o soluble en las dietas para animales; (Iv) for increasing digestible and / or soluble protein in animal diets; (v) para aumentar el grado de hidrólisis de las proteínas en las dietas para animales; (V) to increase the degree of hydrolysis of proteins in animal diets; y/o (vi) para el tratamiento de proteínas; and / or (vi) for the treatment of proteins;

R. Un aditivo de alimentos para animales comprendiendo al menos un polipéptido como definido en cualquiera de A, B, C, D, E, F, G, H o I; R. An animal feed additive comprising at least one polypeptide as defined in any of A, B, C, D, E, F, G, H or I; y (a) al menos una vitamina liposoluble, y/o (b) al menos una vitamina hidrosoluble, y/o (c) al menos un oligoelemento; and (a) at least one fat-soluble vitamin, and / or (b) at least one water soluble vitamin, and / or (c) at least one trace mineral;

S. Una composición de alimentos para animales, preferiblemente una alimentos para peces, que posee un contenido de proteína bruta de 50 a 800 g/kg y comprendiendo al menos un polipéptido tal y como está definido en cualquiera de A, B, C, D, E, F, G, H, o I; S. An animal feed composition, preferably a fish feed, having a crude protein content of 50-800 g / kg and comprising at least one polypeptide as defined in any of A, B, C, D , E, F, G, H, or I; o al menos un aditivo alimentario de R; or at least one food additive of R;

T. Una composición comprendiendo al menos un polipéptido tal y como está definido en cualquiera de las reivindicaciones A, B, C, D, E, F, G, H, o I, junto a al menos otra enzima seleccionada entre las alfa-amilasa (EC 3.2.1.1), fitasa (EC 3.1.3.8 o 3.1.3.26); T. A composition comprising at least one polypeptide such as defined in any of claims A, B, C, D, E, F, G, H, or I, with at least one other enzyme selected from amongst alpha-amylase (EC 3.2.1.1), phytase (EC 3.1.3.8 or 3.1.3.26); xilanasa (EC 3.2.1.8); xylanase (EC 3.2.1.8); galactanasa (EC 3.2.1.89); galactanase (EC 3.2.1.89); alfa-galactosidasa (EC 3.2.1.22); alpha-galactosidase (EC 3.2.1.22); proteasa (EC 3.4.-.-), fosfolipasa A1 (EC 3.1.1.32); protease (EC 3.4.-.-), phospholipase A1 (EC 3.1.1.32); fosfolipasa A2 (EC 3.1.1.4); phospholipase A2 (EC 3.1.1.4); lisofosfolipasa (EC 3.1.1.5); lysophospholipase (EC 3.1.1.5); fosfolipasa C (3.1.4.3); phospholipase C (3.1.4.3); fosfolipasa D (EC 3.1.4.4); phospholipase D (EC 3.1.4.4); y/o beta-glucanasa (EC 3.2.1.4 o EC 3.2.1.6); and / or beta-glucanase (EC 3.2.1.4 or EC 3.2.1.6); así como as well as

U. Un uso en detergentes de al menos un polipéptido tal y como se ha definido en cualquiera de A, B, C, D, E, F, G, H o I. U. A detergent usage of at least one polypeptide as defined in any of A, B, C, D, E, F, G, H or I.

También están descritos: They are also described:

I. Un polipéptido aislado que posee una actividad proteasa, el cual, después de la incubación durante cuatro horas a 37ºC y pH 6,5 ha degradado al menos un 36% (preferiblemente al menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, o al menos 81%) del inhibidor de soja Bowman-Birk, dicho porcentaje de degradación siendo determinado como 100% menos del porcentaje de intensidad de la banda inhibidora de Bowman-Birk intacta en un gel de SDS-PAGE (tris-glicina 4-20%) teñido después de la incubación, con respecto a la intensidad de la misma banda antes de la incubación, dichas intensidades de dichas bandas siendo determinadas por barrido de gel; I. An isolated polypeptide having protease activity, which after incubation for four hours at 37 ° C and pH 6.5 has degraded at least 36% (preferably at least 40%, 45%, 50%, 55% , 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, or at least 81%) of inhibitor soybean Bowman-Birk, said percentage degradation being determined as 100% minus the percentage intensity of the inhibitory band Bowman -Birk intact in an SDS-PAGE (tris-glycine 4-20%) stained after incubation, relative to the intensity of the same band before the incubation, said intensities of said bands being determined by scanning gel ; donde el polipéptido es seleccionado del grupo consistente en: (a) un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que presenta un grado de identidad con los aminoácidos 1 a 188 de SEC ID Nº: 2, 1 a 196 de SEC ID Nº: 8, 1 a 189 de SEC ID Nº: 10, y/o 1 a 188 de SEC ID Nº: 12 de al menos el 60%; wherein the polypeptide is selected from the group consisting of: (a) a polypeptide having an amino acid sequence exhibiting a degree of identity to amino acids 1 to 188 of SEQ ID NO: 2, 1 to 196 of SEQ ID NO: 8, 1 to 189 of SEQ ID NO: 10, and / or 1 to 188 of SEQ ID NO: 12 of at least 60%; (b) un polipéptido que es codificado por una secuencia de ácidos nucléicos que se hibridiza en condiciones de astringencia baja con cualquiera de los nucleótidos 499-1062 de SEC ID Nº: 1, 577-1164 de SEC ID Nº: 7, 586-1152 de SEC ID Nº: 9, y/o 502-1065 de SEC ID Nº: 11; (B) a polypeptide which is encoded by a nucleic acid sequence which hybridizes under low stringency conditions with either of nucleotides 499-1062 SEQ ID NO: 1, 577-1164 of SEQ ID NO: 7, 586-1152 SEQ ID NO: 9, and / or 502-1065 of SEQ ID NO: 11; y (c) un polipéptido que es codificado por una secuencia de ácidos nucléicos que presenta un grado de identidad para cualquiera de los nucleótidos 499-1062 de SEC ID Nº: 1, 577-1164 de SEC ID Nº: 7, 586-1152 de SEC ID Nº: 9, y/o 502-1065 de SEC ID Nº: 11 de al menos el 60%; and (c) a polypeptide which is encoded by a nucleic acid sequence having a degree of identity to nucleotides 499-1062 of any of SEQ ID NO: 1, 577-1164 of SEQ ID NO: 7, 586-1152 of SEQ ID NO: 9, and / or 502-1065 of SEQ ID NO: 11 of at least 60%;

II. II. Polipéptido de I, donde la incubación se desarrolla en un tampón de incubación comprendiendo ácido dimetilglutárico a 50 mM, NaCl a 150 mM, CaCl_{2} a 1 mM, 0,01% de Tritón X-100, pH 6,5; I polypeptide, wherein the incubation takes place in an incubation buffer comprising 50 mM dimethylglutaric acid, 150 mM NaCl, CaCl 2} {1 mM, 0.01% Triton X-100, pH 6.5;

III. III. Polipéptido de cualquiera de I, o II, donde, durante la incubación, la relación entre el polipéptido proteasa y el inhibidor Bowman-Birk es 1:10, en base a A_{280}; Polypeptide of any of I, or II, which, during incubation, the ratio between the protease polypeptide and the Bowman-Birk inhibitor is 1:10, based on {280} A_;

IV. IV. El polipéptido de cualquiera de I II, o III, donde el gel es teñido con azul brillante Coomassie; The polypeptide of any I II, or III, wherein the gel is dyed with Coomassie Brilliant Blue;

V. Polipéptido de cualquiera de I, II, III, o IV, donde el inhibidor Bowman-Birk es Sigma T-9777; V. The polypeptide of any of I, II, III, or IV, wherein the Bowman-Birk inhibitor is Sigma T-9777;

VI. SAW. Polipéptido de cualquiera de I II, III, IV, o V, también capaz de degradar al menos una de las siguientes proteínas de soja purificada: aglutinina de soja (SBA), el inhibidor de tripsina Kunitz, glicinina, y/o beta-conglicinina, usando los principios tal y como se han descrito en cualquiera de I, II, III, IV, o V; Polypeptide of any I II, III, IV, or V, also capable of degrading at least one of the following proteins purified soybean: soybean agglutinin (SBA), trypsin inhibitor Kunitz, glycinin, and / or beta-conglycinin , using the principles as described in any of I, II, III, IV, or V;

VII. VII. El polipéptido según la reivindicación VI que ha degradado al menos una de las proteínas de soja purificada hasta una extensión de al menos 10%, preferiblemente de al menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 92%, 94%, 96%, o al menos 98%; The polypeptide of claim VI which has degraded at least one of the proteins purified soybean to an extent of at least 10%, preferably at least 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80 %, 90%, 92%, 94%, 96%, or at least 98%;

VIII. VIII. Una secuencia de ácidos nucléicos aislada comprendiendo una secuencia de ácidos nucléicos que codifica el polipéptido de cualquiera de I, II, III, IV, V, VI, o VII; An isolated nucleic acid sequence comprising a nucleic acid sequence encoding the polypeptide of any of I, II, III, IV, V, VI, or VII;

IX. IX. Una secuencia de ácidos nucléicos aislada comprendiendo una secuencia de ácidos nucléicos que codifica un polipéptido que posee una actividad proteasa, polipéptido que, después de la incubación durante cuatro horas a 37ºC y pH 6,5, ha degradado al menos 36% (preferiblemente al menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, o al menos 81%) del inhibidor de soja Bowman-Birk, dicho porcentaje de degradación siendo determinado como 100% menos del porcentaje de intensidad de la banda inhibidora Bowman-Birk intacta en un gel de SDS-PAGE teñido (4-20% de Tris-glicina) después de la incubación, con respecto a la intensidad de la misma banda antes de la incubación, dichas intensidades de dichas bandas siendo determinadas por barrido del gel; A sequence of isolated nucleic acid comprising a nucleic acid sequence encoding a polypeptide having protease activity, which polypeptide, after incubation for four hours at 37 ° C and pH 6.5, has degraded at least 36% (preferably at least 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, or at least 81%) of inhibitor soybean Bowman-Birk, said percentage degradation being determined as 100% less the percentage of intensity of the Bowman-Birk inhibitor band on a gel intact stained SDS-PAGE (4-20% Tris-glycine) after incubation, relative to the intensity of the same band before the incubation, said intensities of said bands being determined by scanning the gel; donde la secuencia de ácidos nucléicos (a) se hibridiza en condiciones de astringencia baja con cualquiera de los nucleótidos 499-1062 de SEC ID Nº: 1, 577-1164 de SEC ID Nº: 7, 586-1152 de SEC ID Nº: 9, y/o 502 1065 de SEC ID Nº: 11; where the nucleic acid sequence (a) hybridizes under low stringency conditions with either of nucleotides 499-1062 SEQ ID NO: 1, 577-1164 of SEQ ID NO: 7, 586-1152 of SEQ ID NO: 9 , and / or 502 1065 of SEQ ID NO: 11; (b) tiene un grado de identidad con cualquiera de los nucleótidos 499-1062 de SEC ID Nº: 1577 1164 de SEC ID Nº: 7, 586-1152 de SEC ID Nº: 9, y/o 502-1065 de SEC ID Nº: 11 de al menos el 60%; (B) has a degree of identity with any of the nucleotides 499-1062 SEQ ID NO: 1577 1164 SEQ ID NO: 7, 586-1152 of SEQ ID NO: 9, and / or 502-1065 of SEQ ID NO 11 of at least 60%; y/o (c) codifica un polipéptido que tiene un grado de identidad con los aminoácidos 1 a 188 de SEC ID Nº: 2, 1 a 196 de SEC ID Nº: 8, 1 a 189 de SEC ID Nº: 10, y/o 1 a 188 de SEC ID Nº: 12 de al menos el 60%; and / or (c) encodes a polypeptide having a degree of identity to amino acids 1 to 188 of SEQ ID NO: 2, 1 to 196 of SEQ ID NO: 8, 1 to 189 of SEQ ID NO: 10, and / or 1 to 188 of SEQ ID NO: 12 of at least 60%;

X. Un constructo de ácido nucléico comprende la secuencia de ácidos nucléicos de cualquiera de VIII, o IX, ligada operativamente a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un huésped de expresión adecuada; X. A nucleic acid construct comprising the nucleic acid sequence of any of VIII, or IX, operably linked to one or more control sequences that direct the production of the polypeptide in a suitable expression host;

XI. XI. Un vector de expresión recombinante comprendiendo el constructo de ácido nucléico de X; A recombinant expression vector comprising the nucleic acid construct of X;

XII. XII. Una célula huésped recombinante comprendiendo el constructo de ácido nucléico de X o el vector de XI; A recombinant host cell comprising the nucleic acid construct of X or the vector of XI;

XIII. XIII. Un método para la producción de un polipéptido de I, el método comprendiendo: (a) cultivo de una célula huésped recombinante de XII para producir un sobrenadante comprendiendo el polipéptido; A method for producing a polypeptide of I, the method comprising: (a) cultivating a recombinant host cell of XII to produce a supernatant comprising the polypeptide; y (b) recuperación del polipéptido; and (b) recovering the polypeptide;

XIII. XIII. Una planta transgénica, o parte de planta, capaz de expresar el polipéptido de I; A transgenic plant, or plant part, capable of expressing the polypeptide of I;

XIV. XIV. Un animal transgénico, no humano, o productos, o elementos del mismo, capaces de expresar el polipéptido de I; A transgenic nonhuman animal, or products, or elements thereof, capable of expressing the polypeptide of I;

XV. XV. Un método para la producción de un polipéptido de I, el método comprendiendo (a) el cultivo de cualquiera de las cepas siguientes: (i) Nocardiopsis dassonvillei , subespecie dassonvillei DSM 43235, (ii) especie Nocardiopsis DSM 16424, o (iii) Nocardiopsis alba DSM 15647; A method for producing a polypeptide of I, the method comprising (a) culturing any of the following strains: (i) Nocardiopsis dassonvillei subspecies dassonvillei DSM 43235, (ii) species Nocardiopsis DSM 16424, or (iii) Nocardiopsis alba DSM 15647; y (b) recuperación del polipéptido; and (b) recovering the polypeptide;

XVI. XVI. Uso de al menos un polipéptido tal y como definido en I (i) en alimentos para animales; Use of at least one polypeptide defined as R (i) in animal feed; (ii) en la preparación de una composición para un uso en alimentos para animales; (Ii) in the preparation of a composition for use in animal feed; (iii) para mejorar el valor nutritivo de un alimento para animales; (Iii) for improving the nutritional value of an animal feed; (iv) para aumentar la proteína digerible y/o soluble en las dietas de animales; (Iv) for increasing digestible and / or soluble protein in animal diets; (v) para aumentar el grado de hidrólisis de las proteínas en las dietas de animales; (V) to increase the degree of hydrolysis of proteins in animal diets; y/o (vi) para el tratamiento de las proteínas; and / or (vi) for the treatment of proteins;

XVII. XVII. Un aditivo de alimento para animales comprendiendo al menos un polipéptido tal como se ha definido en I; An animal feed additive comprising at least one polypeptide as defined in I; y (a) al menos una vitamina liposoluble, y/o (b) al menos una vitamina hidrosoluble, y/o (c) al menos un oligo- and (a) at least one fat-soluble vitamin, and / or (b) at least one water soluble vitamin, and / or (c) at least one oligo-
elemento; element;

XVIII. XVIII. Una composición de alimento para animales que posee un contenido de proteína bruta de 50 a 800 g/kg y comprende al menos un polipéptido tal y como se ha definido en I, o al menos un aditivo alimentario de XVII; An animal feed composition having a crude protein content of 50-800 g / kg and comprising at least one polypeptide as defined in I, or at least one food additive of XVII;

XIX. XIX. Composición de producto alimentario de XVIII que es un producto alimentario para peces Composition XVIII food product is a food product for fish

XX. XX. Una composición comprendiendo al menos un polipéptido tal como se ha definido en I, con al menos otra enzima seleccionada entre las alfa-amilasa (EC 3.2.1.1), fitasa (EC 3.1.3.8 o 3.1.3.26); A composition comprising at least one polypeptide as defined in I with at least one other enzyme selected from amongst alpha-amylase (EC 3.2.1.1), phytase (EC 3.1.3.8 or 3.1.3.26); xilanasa (EC 3.2.1.8); xylanase (EC 3.2.1.8); galactanasa (EC 3.2.1.89); galactanase (EC 3.2.1.89); alfa-galactosidasa (EC 3.2.1.22); alpha-galactosidase (EC 3.2.1.22); proteasa (EC 3.4.-.-), fosfolipasa A1 (EC 3.1.1.32); protease (EC 3.4.-.-), phospholipase A1 (EC 3.1.1.32); fosfolipasa A2 (EC 3.1.1.4); phospholipase A2 (EC 3.1.1.4); lisofosfolipasa (EC 3.1.1.5); lysophospholipase (EC 3.1.1.5); fosfolipasa C (3.1.4.3); phospholipase C (3.1.4.3); fosfolipasa D (EC 3.1.4.4); phospholipase D (EC 3.1.4.4); y/o beta-glucanasa (EC 3.2.1.4 o EC 3.2.1.6); and / or beta-glucanase (EC 3.2.1.4 or EC 3.2.1.6); así como as well as

XXI. XXI. Uso de al menos un polipéptido en detergentes tal como se ha definido en I. Use of at least one polypeptide in detergents as defined in I.

También se describen aquí: Also disclosed herein are:

a. to. Un polipéptido aislado que posee una actividad proteasa, seleccionada del grupo consistente en: (a) un polipéptido que posee una secuencia de aminoácidos que presenta un grado de identidad (i) con los aminoácidos 1 a 188 de SEC ID Nº: 2 de al menos el 85%, (ii) con los aminoácidos 1 a 196 de SEC ID Nº: 8 de al menos el 85%, (iii) con los aminoácidos 1-189 de SEC ID Nº: 10 de al menos el 85%, y/o un grado de identidad con los aminoácidos 1-188 de SEC ID Nº: 12 de al menos el 89%; An isolated polypeptide having protease activity, selected from the group consisting of: (a) a polypeptide having an amino acid sequence exhibiting a degree of identity (i) amino acids 1 to 188 of SEQ ID NO: 2 of at least 85%, (ii) amino acids 1 to 196 of SEQ ID NO: 8 of at least 85%, (iii) amino acids 1-189 with SEQ ID NO: 10 of at least 85%, and / or a degree of identity to amino acids 1-188 of SEQ ID NO: 12 of at least 89%; (b) un polipéptido que es codificado por una secuencia de ácidos nucléicos que se hibridiza en condiciones de astringencia media-alta con (i) los nucleótidos 499-1062 de SEC ID Nº: 1, (ii) los nucleótidos 577-1164 de SEC ID Nº: 7, (iii) los nucleótidos 586-1152 de SEC ID Nº: 9, (iv) los nucleótidos 502-1065 de SEC ID Nº: 11, (v) una subsecuencia de cualquiera (i)-(iv) de al menos 100 nucleótidos; (B) a polypeptide which is encoded by a nucleic acid sequence which hybridizes under medium-high stringency conditions with (i) nucleotides 499-1062 SEQ ID NO: 1, (ii) nucleotides 577-1164 SEQ ID NO: 7, (iii) nucleotides 586-1152 SEQ ID NO: 9, (iv) nucleotides 502-1065 SEQ ID NO: 11, (v) a subsequence of any (i) - (iv) of at least 100 nucleotides; y/o (vi) una cadena complementaria de cualquier (i)-(v); and / or (vi) a complementary strand of any (i) - (v); c) una variante del polipéptido que posee una secuencia de aminoácidos de (i) los aminoácidos 1 a 188 de SEC ID Nº: 2, (II) aminoácidos 1 a 196 de SEC ID Nº: 8, (iii) aminoácidos 1-189 de SEC ID Nº: 10, o aminoácidos 1-188 de SEC ID Nº: 12, comprendiendo una sustitución, deleción, extensión, y/o inserción de uno o más aminoácidos; c) a variant polypeptide having an amino acid sequence of (i) amino acids 1 to 188 of SEQ ID NO: 2, (II) amino acids 1 to 196 of SEQ ID NO: 8, (iii) amino acids 1-189 of SEQ ID NO: 10, or amino acids 1-188 of SEQ ID NO: 12 comprising a substitution, deletion, extension, and / or insertion of one or more amino acids; (d) una variante alélica de (a), (b), o (c); (D) an allelic variant of (a), (b) or (c); y (e) un fragmento de (a), (b), (c), o (d) que posee una actividad proteasa; and (e) a fragment of (a), (b), (c) or (d) having a protease activity;

b. b. Una secuencia de ácidos nucléicos aislada comprendiendo una secuencia de ácidos nucléicos que An isolated nucleic acid sequence comprising a nucleic acid sequence that

(a) codifica el polipéptido de a; (A) encodes the polypeptide of a; (b) codifica un polipéptido que posee una actividad proteasa, y que se hibridiza en condiciones de astringencia media-alta con (i) los nucleótidos 499-1062 de SEC ID Nº: 1, (ii) los nucleótidos 577-1164 de SEC ID Nº: 7, (iii) los nucleótidos 586-1152 de SEC ID Nº: 9, (iv) los nucleótidos 502-1065 de SEC ID Nº: 11, (v) una subsecuencia de cualquiera (i)-(iv) de al menos 100 nucleótidos; (B) encodes a polypeptide having protease activity, and which hybridizes under medium-high stringency conditions with (i) nucleotides 499-1062 SEQ ID NO: 1, (ii) nucleotides 577-1164 of SEQ ID NO: 7, (iii) nucleotides 586-1152 SEQ ID NO: 9, (iv) nucleotides 502-1065 SEQ ID NO: 11, (v) a subsequence of any (i) - (iv) of the least 100 nucleotides; y/o (vi) una cadena complementaria de cualquier (i)-(v); and / or (vi) a complementary strand of any (i) - (v); y/o (c) codifica un polipéptido que posee una actividad proteasa y que tiene un grado de identidad (i) con los nucleótidos 499-1062 de SEC ID Nº: 1 de al menos el 86%, (ii) con los nucleótidos 577-1164 de SEC ID Nº: 7 de al menos el 65%, (iii) con los nucleótidos 586-1152 de SEC ID Nº: 9 de al menos el 85%, (IV) con los nucleótidos 502-1065 de SEC ID Nº: 11 de al menos el 89%; and / or (c) encodes a polypeptide having protease activity and having a degree of identity (i) to nucleotides 499-1062 SEQ ID NO: 1 of at least 86%, (ii) to nucleotides 577 -1164 of SEQ ID NO: 7 of at least 65%, (iii) nucleotides 586-1152 with SEQ ID NO: 9 of at least 85%, (IV) with nucleotides 502-1065 of SEQ ID NO 11 of at least 89%;

c. c. Una secuencia de ácidos nucléicos aislada producida por (a) hibridación de un ADN en condiciones de astringencia media-alta con (i) los nucleótidos 499-1062 de SEC ID Nº: 1, (ii) los nucleótidos 577-1164 de SEC ID Nº: 7, (iii) los nucleótidos 586-1152 de SEC ID Nº: 9, (iv) los nucleótidos 502-1065 de SEC ID Nº: 11, (v) una subsecuencia de cualquiera (i)-(iv) de al menos 100 nucleótidos; A sequence of isolated nucleic acid produced by (a) hybridizing a DNA under medium-high stringency conditions with (i) nucleotides 499-1062 SEQ ID NO: 1, (ii) nucleotides 577-1164 of SEQ ID NO : 7, (iii) nucleotides 586-1152 SEQ ID NO: 9, (iv) nucleotides 502-1065 SEQ ID NO: 11, (v) a subsequence of any (i) - (iv) of at least 100 nucleotides; y/o (vi) una cadena complementaria de cualquier (i)-(v); and / or (vi) a complementary strand of any (i) - (v); y (b) aislamiento de la secuencia de ácidos nucléicos; and (b) isolating the nucleic acid sequence;

d. d. Un constructo de ácido nucléico comprendiendo la secuencia de ácidos nucléicos de cualquier b, oc, enlazado operativamente con una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un huésped de expresión adecuada; A nucleic acid construct comprising the nucleic acid sequence of any b, or c, operably linked to one or more control sequences that direct the production of the polypeptide in a suitable expression host;

e. and. Un vector de expresión recombinante comprendiendo el constructo de ácido nucléico de d; A recombinant expression vector comprising the nucleic acid construct of d;

f. F. Una célula huésped recombinante comprendiendo el constructo de ácido nucléico de do el vector de e; A recombinant host cell comprising the nucleic acid construct of the vector and do;

g. g. Un método para la producción de a, el método comprendiendo: (a) cultivo de una célula huésped recombinante de f para producir un sobrenadante comprendiendo el polipéptido; A method for the production of a, the method comprising: (a) cultivating a recombinant host cell of f to produce a supernatant comprising the polypeptide; y (b) recuperación del polipéptido; and (b) recovering the polypeptide;

h. h. Una planta transgénica, o parte de planta, capaz de expresar el polipéptido de a; A transgenic plant, or plant part, capable of expressing the polypeptide of a;

i. i. Un animal transgénico, no humano, o productos, o elementos del mismo, capaces de expresar el polipéptido de a; A transgenic nonhuman animal, or products, or elements thereof, capable of expressing the polypeptide of a;

j. j. Un método para la producción de un polipéptido de a; A method for producing a polypeptide of a; el método comprendiendo (a) el cultivo de cualquiera de las cepas siguientes: (i) Nocardiopsis dassonvillei , subespecie dassonvillei DSM 43235, (ii) especie Nocardiopsis DSM 16424, o Nocardiopsis alba DSM 15647; the method comprising (a) culturing any of the following strains: (i) Nocardiopsis dassonvillei subspecies dassonvillei DSM 43235, (ii) Nocardiopsis species DSM 16424, or Nocardiopsis alba DSM 15647; y (b) recuperación del polipéptido; and (b) recovering the polypeptide;

k. k. Uso de al menos un polipéptido tal como se ha definido en a (i) en alimentos para animales; Use of at least one polypeptide as defined in (i) in animal feed; (ii) en la preparación de una composición para un uso en alimentos para animales (iii) para mejorar el valor nutritivo de un alimento para animales; (Ii) in the preparation of a composition for use in animal feed (iii) for improving the nutritional value of an animal feed; (iv) para aumentar la proteína digerible y/o soluble en dietas de animales; (Iv) for increasing digestible and / or soluble protein in animal diets; (v) para aumentar el grado de hidrólisis de las proteínas en dietas de animales; (V) to increase the degree of hydrolysis of proteins in animal diets; y/o (vi) para el tratamiento de las proteínas; and / or (vi) for the treatment of proteins;

l. l. Un aditivo de alimentos para animales comprendiendo al menos un polipéptido tal como se ha definido en a; An animal feed additive comprising at least one polypeptide as defined in to; y (a) al menos una vitamina liposoluble, y/o (b) al menos una vitamina hidrosoluble, y/o (c) al menos un oligoelemento; and (a) at least one fat-soluble vitamin, and / or (b) at least one water soluble vitamin, and / or (c) at least one trace mineral;

m. m. Una composición de alimentos para animales que posee un contenido de proteína bruta de 50 a 800 g/kg y comprendiendo al menos un polipéptido tal como se ha definido en a, o al menos un aditivo alimentario de l; A pet food composition having a crude protein content of 50-800 g / kg and comprising at least one polypeptide as defined in a, or at least one food additive of l;

n. n. Composición de producto alimentario de m que es un alimento para peces Composition foodstuff m which is a fish feed

o. or. Una composición comprendiendo al menos un polipéptido tal como se ha definido en a, con al menos otra enzima seleccionada entre las alfa-amilasa (EC 3.2.1.1), fitasa (EC 3.1.3.8 o 3.1.3.26); A composition comprising at least one polypeptide as defined in a, with at least one other enzyme selected from amongst alpha-amylase (EC 3.2.1.1), phytase (EC 3.1.3.8 or 3.1.3.26); xilanasa (EC 3.2.1.8); xylanase (EC 3.2.1.8); galactanasa galactanase
(EC 3.2.1.89); (EC 3.2.1.89); alfa-galactosidasa (EC 3.2.1.22); alpha-galactosidase (EC 3.2.1.22); proteasa (EC 3.4.-.-), fosfolipasa A1 (EC 3.1.1.32); protease (EC 3.4.-.-), phospholipase A1 (EC 3.1.1.32); fosfolipasa A2 (EC 3.1.1.4); phospholipase A2 (EC 3.1.1.4); lisofosfolipasa (EC 3.1.1.5); lysophospholipase (EC 3.1.1.5); fosfolipasa C (3.1.4.3); phospholipase C (3.1.4.3); fosfolipasa D (EC 3.1.4.4); phospholipase D (EC 3.1.4.4); y/o beta-glucanasa and / or beta-glucanase
(EC 3.2.1.4 o EC 3.2.1.6); (EC 3.2.1.4 or EC 3.2.1.6); así como as well as

p. p. Uso de al menos un polipéptido en detergentes tal como se ha definido en a. Use of at least one polypeptide in detergents as defined in a.

También se describe aquí: un polipéptido aislado que posee una actividad proteasa, seleccionada del grupo consistente en: (a) un polipéptido que posee una secuencia de aminoácidos que presenta un grado de identidad con los aminoácidos 1 a 188 de SEC ID Nº: 2, 1 a 188 de SEC ID Nº: 8, 1 a 196 de SEC ID Nº: 8, y/o con de al menos el 84%; Also it described here: an isolated polypeptide having protease activity, selected from the group consisting of: (a) a polypeptide having an amino acid sequence exhibiting a degree of identity to amino acids 1 to 188 of SEQ ID NO: 2, 1 to 188 of SEQ ID NO: 8, 1 to 196 of SEQ ID NO: 8, and / or at least 84%; (b) un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que presenta un grado de identidad con los aminoácidos -166 a 188 de SEC ID Nº: 2, y/o -192 a 196 de SEC ID Nº: 8, de al menos el 75%; (B) a polypeptide having an amino acid sequence exhibiting a degree of identity to amino acids -166 to 188 of SEQ ID NO: 2, and / or -192 to 196 of SEQ ID NO: 8, at least 75% ; (c) un polipéptido que es codificado por una secuencia de ácidos nucléicos que se hibridiza en condiciones de astringencia media-alta con (i) el ADN de codificación de una proteasa obtenible a partir del ADN genómico de Nocardiopsis dassonvillei , subespecie dassonvillei DSM 43235 mediante el uso de iniciadores SEC ID Nºs: 3 y 4. (ii) nucleótidos 499-1062 de SEC ID Nº: 1, y/o 577-1164 de SEC ID Nº: 7; (c) a polypeptide which is encoded by a nucleic acid sequence which hybridizes under medium-high stringency conditions with (i) DNA encoding a protease obtainable from genomic DNA from Nocardiopsis dassonvillei subspecies dassonvillei DSM 43235 by using primers SEQ ID NOs: 3 and 4. (ii) nucleotides 499-1062 of SEQ ID NO: 1 and / or 577-1164 of SEQ ID NO: 7; (iii) nucleótidos 1-1062 de SEC ID Nº: 1, y/o 1-1164 de SEC ID Nº: 7; (Iii) nucleotides 1-1062 of SEQ ID NO: 1, and / or 1-1164 of SEQ ID NO: 7; (iv) una subsecuencia de (i) o (ii) o (iii) de al menos 100 nucleótidos; (Iv) a subsequence of (i) or (ii) or (iii) of at least 100 nucleotides; y/o (v) una cadena complementaria de (i), (ii), (iii) o (iv); and / or (v) a complementary strand of (i), (ii), (iii) or (iv); (d) una variante del polipéptido con una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 1 a 188, o -166 a 188 de SEC ID Nº: 2, o aminoácidos 1 a 196, o -192 a 196 de SEC ID Nº: 8, comprendiendo una sustitución, deleción, extensión, y/o inserción de uno o más aminoácidos; (D) a variant polypeptide with an amino acid sequence of amino acids 1 to 188, or -166 to 188 of SEQ ID NO: 2, or amino acids 1 to 196, or -192 to 196 of SEQ ID NO: 8, comprising substitution, deletion, extension, and / or insertion of one or more amino acids; (e) una variante alélica de (a), (b) o (c); (E) an allelic variant of (a), (b) or (c); y (f) un fragmento de (a), (b), (c), (d) o (e) que posee una actividad proteasa; and (f) a fragment of (a), (b), (c), (d) or (e) having a protease activity;

Un polipéptido aislado que posee una actividad proteasa, y que presenta una temperatura de fusión (T_{m}) de al menos 78ºC, determinada por calorimetría diferencial de barrido (DSC) en un tampón de fosfato de sodio a 10 mM, de cloruro de sodio a 50 mM, pH 7,0, usando un índice de barrido constante de 1,5ºC/min, donde el polipéptido es seleccionado del grupo consistente en: (a) un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que presenta un grado de identidad con los aminoácidos 1 a 188 de SEC ID Nº: 2, 1 a 188 de SEC ID Nº: 8, y/o 1 a 196 de SEC ID Nº: 8, de al menos el 50%; An isolated polypeptide having protease activity, and having a melting temperature (T_ {m}) of at least 78 ° C, determined by differential scanning calorimetry (DSC) in a phosphate buffer 10 mM sodium, chloride 50 mM sodium, pH 7.0, using a constant scan rate of 1.5 ° C / min, wherein the polypeptide is selected from the group consisting of: (a) a polypeptide having an amino acid sequence exhibiting a degree of identity with amino acids 1 to 188 of SEQ ID NO: 2, 1 to 188 of SEQ ID NO: 8, and / or 1 to 196 of SEQ ID NO: 8, of at least 50%; (b) un polipéptido que posee una secuencia de aminoácidos que presenta un grado de identidad con los aminoácidos -166 a 188 de SEC ID Nº: 2, y/o -192 a 196 de SEC ID Nº: 8, de al menos el 50%; (B) a polypeptide having an amino acid sequence exhibiting a degree of identity to amino acids -166 to 188 of SEQ ID NO: 2, and / or -192 to 196 of SEQ ID NO: 8, of at least 50 %; (c) un polipéptido que es codificado por una secuencia de ácidos nucléicos que se hibridiza en condiciones de astringencia baja con el ADN de codificación de una proteasa obtenible a partir del ADN genómico de Nocardiopsis dassonvillei , subespecie dassonvillei DSM 43235 mediante el uso de iniciadores de SEC ID Nº. (c) a polypeptide which is encoded by a nucleic acid sequence which hybridizes under low stringency conditions with DNA encoding a protease obtainable from genomic DNA from Nocardiopsis dassonvillei subspecies dassonvillei DSM 43235 by use of primers SEQ ID NO. 3 y 4; 3 and 4; nucleótidos 499-1062 de SEC ID Nº: 1, y/o 577 1164 de SEC ID Nº: 7; nucleotides 499-1062 of SEQ ID NO: 1, and / or 577 1164 SEQ ID NO: 7; nucleótidos 1-1062 de SEC ID Nº: 1, y/o 1-1164 de SEC ID Nº: 7; nucleotides 1-1062 of SEQ ID NO: 1, and / or 1-1164 of SEQ ID NO: 7; una subsecuencia de (i) o (ii) o (iii) de al menos 100 nucleótidos; a subsequence of (i) or (ii) or (iii) of at least 100 nucleotides; y/o una cadena complementaria de (i), (ii), (iii) o (iv); and / or a complementary strand of (i), (ii), (iii) or (iv); (d) una variante del polipéptido con una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 1 a 188, o -166 a 188 de SEC ID Nº: 2, o aminoácidos 1 a 196, o -192 a 196 de SEC ID Nº: 8, comprendiendo una sustitución, deleción, extensión, y/o inserción de uno o más aminoácidos; (D) a variant polypeptide with an amino acid sequence of amino acids 1 to 188, or -166 to 188 of SEQ ID NO: 2, or amino acids 1 to 196, or -192 to 196 of SEQ ID NO: 8, comprising substitution, deletion, extension, and / or insertion of one or more amino acids; (e) una variante alélica de (a), (b) o (c); (E) an allelic variant of (a), (b) or (c); y (f) un fragmento de (a), (b), (c), (d) o (e) que posee una actividad proteasa; and (f) a fragment of (a), (b), (c), (d) or (e) having a protease activity;

Una secuencia de ácidos nucléicos aislada comprendiendo una secuencia de ácidos nucléicos que (a) codifica el polipéptido de la reivindicación 1; An isolated nucleic acid sequence comprising a nucleic acid sequence that (a) encodes the polypeptide of claim 1; (b) codifica un polipéptido que posee una actividad proteasa, y se hibridiza en condiciones de astringencia media-alta con (i) el ADN de codificación de una proteasa obtenible a partir del ADN genómico de Nocardiopsis dassonvillei , subespecie dassonvillei DSM 43235 mediante el uso de iniciadores SEC ID NºS. (b) encodes a polypeptide having protease activity, and hybridizes under medium-high stringency conditions with (i) DNA encoding a protease obtainable from genomic DNA from Nocardiopsis dassonvillei subspecies dassonvillei DSM 43235 by use primer SEQ ID NOs. 3 y 4; 3 and 4; (ii) nucleótidos 499-1062 o 1-1062 de SEC ID Nº: 1, y/o 577-1164 0 1-1164 de SEC ID Nº: 7; (Ii) nucleotides 499-1062 or 1-1062 of SEQ ID NO: 1 and / or 577-1164 0 1-1164 of SEQ ID NO: 7; (iii) una subsecuencia de (i) o (ii) de al menos 100 nucleótidos; (Iii) a subsequence of (i) or (ii) of at least 100 nucleotides; y/o (iv) una cadena complementaria de (i), (ii), o (iii); and / or (iv) a complementary strand of (i), (ii) or (iii); (c) codifica un polipéptido que posee una actividad proteasa y que presenta un grado de identidad con los nucleótidos 499-1062 SEC ID Nº: 1, y/o 577-1164 de SEC ID Nº: 7, de al menos el 85%; (C) encodes a polypeptide having protease activity and having a degree of identity to nucleotides 499-1062 SEQ ID's NO: 1 and / or 577-1164 of SEQ ID NO: 7, of at least 85%; y/o (d) codifica un polipéptido que posee una actividad proteasa y que presenta un grado de identidad con los nucleótidos 1-1062 SEC ID Nº: 1, y/o nucleótidos 1-1164 de SEC ID Nº: 7 de al menos el 81%; and / or (d) encodes a polypeptide having protease activity and having a degree of identity to nucleotides 1-1062 SEQ ID's NO: 1, and / or nucleotides 1-1164 of SEQ ID NO: 7 of at least 81%;

Una secuencia de ácidos nucléicos aislada comprendiendo una secuencia de ácidos nucléicos que codifica un polipéptido que posee una actividad proteasa y una temperatura de fusión (T_{m}) de al menos 78ºC, determinada por calorimetría diferencial de barrido (DSC) en un tampón de 10 mM de fosfato sódico, 50 mM de cloruro sódico, pH 7,0, usando un índice de barrido constante de 1,5ºC/min, donde la secuencia de ácidos nucléicos (a) codifica el polipéptido susodicho; A sequence of isolated nucleic acids comprising a nucleic acid sequence encoding a polypeptide having a protease activity and a melting temperature (T_ {m}) of at least 78 ° C, determined by differential scanning calorimetry (DSC) in a buffer 10 mM sodium phosphate, 50 mM sodium chloride, pH 7.0, using a constant scan rate of 1.5 ° C / min, wherein the nucleic acid sequence (a) encodes the polypeptide above; (b) se hibridiza en condiciones de astringencia baja con el ADN codificante de una proteasa obtenible a partir del ADN genómico de Nocardiopsis dassonvillei , subespecie dassonvillei DSM 43235 mediante el uso de iniciadores SEC ID NO: 3 y 4; (b) hybridizes under low stringency conditions with DNA encoding a protease obtainable from genomic DNA from Nocardiopsis dassonvillei subspecies dassonvillei DSM 43235 by use of primers SEQ ID NO: 3 and 4; nucleótidos 499-1062 o 1-1062 de SEC ID Nº: 1, y/o 577-1164 o 1-1164 de SEC ID Nº: 7; nucleotides 499-1062 or 1-1062 of SEQ ID NO: 1 and / or 577-1164 or 1-1164 of SEQ ID NO: 7; una subsecuencia de (i) o (ii) de al menos 100 nucleótidos; a subsequence of (i) or (ii) of at least 100 nucleotides; y/o una cadena complementaria de (i), (ii), o (iii); and / or a complementary strand of (i), (ii) or (iii); (c) presenta un grado de identidad con los nucleótidos 499-1062 de SEC ID Nº: 1, y/o 577 1164 de SEC ID Nº: 7, de al menos el 50%; (C) has a degree of identity to nucleotides 499-1062 of SEQ ID NO: 1, and / or 577 1164 SEQ ID NO: 7, of at least 50%; y/o (d) presenta un grado de identidad con los nucleótidos 1-1062 de SEC ID Nº: 1, y/o 1-1164 de SEC ID Nº: 7, de al menos el 50%; and / or (d) has a degree of identity to nucleotides 1-1062 of SEQ ID NO: 1, and / or 1-1164 of SEQ ID NO: 7, of at least 50%;

Una secuencia de ácidos nucléicos aislada producida por (a) hibridación de un ADN en condiciones de astringencia media-alta con el ADN de codificación de una proteasa obtenible a partir del ADN genómico de Nocardiopsis dassonvillei , subespecie dassonvillei DSM 43235 mediante el uso de cebadores SEC ID Nº. A sequence of isolated nucleic acids produced by (a) hybridizing a DNA under medium-high stringency conditions with DNA encoding a protease obtainable from genomic DNA from Nocardiopsis dassonvillei subspecies dassonvillei DSM 43235 by use of primers SEQ ID NO. 3 y 4; 3 and 4; nucleótidos 499-1062 o 1-1062 de SEC ID Nº: 1, y/o 577-1164 o 1-1164 de SEC ID Nº: 7; nucleotides 499-1062 or 1-1062 of SEQ ID NO: 1 and / or 577-1164 or 1-1164 of SEQ ID NO: 7; una subsecuencia de (i) o (ii) de al menos 100 nucleótidos; a subsequence of (i) or (ii) of at least 100 nucleotides; o una cadena complementaria de (i), (ii) o (iii); or a complementary strand of (i), (ii) or (iii); y (b) aislamiento de la secuencia de ácidos and (b) isolating acid sequence
nucléicos; nucleic;

Un constructo de ácido nucléico comprendiendo la secuencia de ácidos nucléicos anterior enlazada operativamente con una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un huésped de expresión adecuado; A nucleic acid construct comprising the above sequence of nucleic acids operably linked to one or more control sequences that direct the production of the polypeptide in a suitable expression host;

Un vector de expresión recombinante comprendiendo el constructo de ácido nucléico; A recombinant expression vector comprising the nucleic acid construct;

Una célula huésped recombinante comprendiendo el constructo de ácido nucléico o el vector; A recombinant host cell comprising the nucleic acid construct or the vector;

Un método para la producción del polipéptido anterior, el método comprendiendo: (a) el cultivo de una célula huésped recombinante según la reivindicación 8 para producir un sobrenadante comprendiendo el polipéptido; A method for producing the above polypeptide, the method comprising: (a) culturing a recombinant host cell according to claim 8 to produce a supernatant comprising the polypeptide; y (b) recuperación del polipéptido; and (b) recovering the polypeptide;

Una planta transgénica, o parte de planta, capaz de expresar el polipéptido anterior; A transgenic plant, or plant part, capable of expressing the above polypeptide;

Un animal transgénico, no humano, o productos, o elementos del mismos, capaces de expresar el polipéptido anterior; A transgenic nonhuman animal, or products, or elements thereof, capable of expressing the above polypeptide;

Uso de al menos uno de los polipéptidos anteriores (i) en alimentos para animales; Use of at least one of the above polypeptides (i) in animal feed; (ii) en la preparación de una composición para un uso en alimentos para animales (iii) para mejorar el valor nutritivo de un alimento para animales; (Ii) in the preparation of a composition for use in animal feed (iii) for improving the nutritional value of an animal feed; (iv) para aumentar la proteína digerible y/o soluble en dietas de animales; (Iv) for increasing digestible and / or soluble protein in animal diets; (v) para aumentar el grado de hidrólisis de las proteínas en dietas de animales; (V) to increase the degree of hydrolysis of proteins in animal diets; y/o (vi) para el tratamiento de las proteínas; and / or (vi) for the treatment of proteins;

Un aditivo de alimentos para animales comprendiendo al menos un polipéptido tal como se ha definido anteriormente; An animal feed additive comprising at least one polypeptide as defined above; y (a) al menos una vitamina soluble en grasa, y/o (b) al menos una vitamina soluble en agua, y/o (c) al menos un oligoelemento; and (a) at least one fat soluble vitamin, and / or (b) at least one water soluble vitamin, and / or (c) at least one trace mineral;

Una composición de alimentos para animales que posee un contenido de proteína bruta de 50 a 800 g/kg y comprendiendo al menos un polipéptido tal y como se ha definido anteriormente, o al menos un aditivo alimentario; A pet food composition having a crude protein content of 50-800 g / kg and comprising at least one polypeptide as defined above, or at least one food additive; [0031] Una composición comprendiendo al menos un polipéptido tal y como se ha definido anteriormente, con al menos otra enzima seleccionada entre alfa-amilasa (EC 3.2.1.1), fitasa (EC 3.1.3.8 o 3.1.3.26); [0031] A composition comprising at least one polypeptide as defined above, with at least one other enzyme selected from amongst alpha-amylase (EC 3.2.1.1), phytase (EC 3.1.3.8 or 3.1.3.26); xilanasa (EC 3.2.1.8); xylanase (EC 3.2.1.8); galactanasa (EC 3.2.1.89); galactanase (EC 3.2.1.89); alfa-galactosidasa (EC 3.2.1.22); alpha-galactosidase (EC 3.2.1.22); proteasa (EC 3.4.-.-), fosfolipasa Al (EC 3.1.1.32); protease (EC 3.4.-.-), phospholipase Al (EC 3.1.1.32); fosfolipasa A2 (EC 3.1.1.4); phospholipase A2 (EC 3.1.1.4); lisofosfolipasa (EC 3.1.1.5); lysophospholipase (EC 3.1.1.5); fosfolipasa C (3.1.4.3); phospholipase C (3.1.4.3); fosfolipasa D (EC 3.1.4.4); phospholipase D (EC 3.1.4.4); y/o beta-glucanasa (EC 3.2.1.4 o EC 3.2.1.6); and / or beta-glucanase (EC 3.2.1.4 or EC 3.2.1.6);

Uso en detergentes de al menos un polipéptido tal y como se ha definido anteriormente; Detergents use of at least one polypeptide as defined above;

Un polipéptido aislado de la familia de peptidasa S2A y/o familia de peptidasa S1E que posee una actividad proteasa, y con una secuencia amino comprendiendo al menos uno de los siguientes aminoácidos en la posición indicada: 10Y, 24S, 38T, 42G, 49T, 51T, 53Q, 54N, 82S, 86Q, 87S, 89T, 91T, 92S, 96A, 99A, 118N, 120T, 122R, 125Q, 129Y, 130S, 131 L, 135N, 147F, 151 S, 165S, 166V, 171 Y, 1791, y/o 1861; An isolated polypeptide of peptidase family S2A and / or peptidase family S1E having protease activity, and an amino sequence comprising at least one of the following amino acids at the position indicated: 10Y, 24S, 38T, 42G, 49T, 51T, 53Q, 54N, 82S, 86Q, 87S, 89T, 91T, 92S, 96A, 99A, 118N, 120T, 122R, 125Q, 129Y, 130S, 131 L, 135N, 147f, 151 S, 165S, 166V, 171 Y , 1791 and / or 1861; preferiblemente 10Y, 38T, 82S, 95P, 99A, 100V, 1141, 118N, 120T, 122R, 125Q, 129Y, 130S, 131 L, 165S, y/o 171Y; preferably 10Y, 38T, 82S, 95P, 99A, 100V, 1141, 118N, 120T, 122R, 125Q, 129Y, 130S, 131 L, 165S, and / or 171Y; más preferiblemente con al menos uno de 95P, 100V, y/o 1141; more preferably at least one of 95P, 100V, and / or 1141; y/o junto con (H35 + D61 + S143); and / or together with (H35 + D61 + S143); donde cada posición corresponde a una posición de SEC ID Nº: 2; where each position corresponds to a position of SEQ ID NO: 2;

La familia de polipéptidos S2A o S1E anteriores comprendiendo al menos uno de los siguientes aminoácidos en la posición indicada: 38T, 92S, 120T, 125Q, 131L, 135N, 147F, 151S, 165S, y/o 171Y; The family of polypeptides S2A or S1E above comprising at least one of the following amino acids at the position indicated: 38T, 92S, 120T, 125Q, 131L, 135N, 147f, 151S, 165S, and / or 171Y;

La familia de polipéptidos S2A o S1E anteriores comprendiendo al menos uno de los siguiente aminoácidos en la posición indicada: 10Y, 24S, 42G, 49T, 51T, 53Q, 54N, 82S, 86Q, 87S, 89T, 91T, 96A, 99A, 118N, 122R, 129Y, 130S, 166V, 1791, y/o 1861; The polypeptide family S2A or previous S1E comprising at least one of the following amino acids at the position indicated: 10Y, 24S, 42G, 49T, 51T, 53Q, 54N, 82S, 86Q, 87S, 89T, 91T, 96A, 99A, 118N , 122R, 129Y, 130S, 166V, 1791 and / or 1861;

La familia de polipéptidos S2A o S1E anteriores que posee una T_{m} de al menos 78ºC medida por DSC en fosfato de sodio a 10 mM, cloruro de sodio a 50 mM, pH 7,0; The family of polypeptides S2A or S1E above having a T_ {m} of at least 78 ° C as measured by DSC in sodium phosphate 10mM, sodium chloride 50 mM, pH 7.0; y/o una actividad relativa en pH9 ya 80ºC de al menos 0,40; and / or a relative activity at pH9 and 80 ° C of at least 0.40;

La familia de polipéptidos S2A o S1E anteriores con un porcentaje de identidad con los aminoácidos 1-188, o -166 a 188, de SEC ID Nº: 2, y/o con los aminoácidos 1-196, o -192 a 196, de SEC ID Nº: 8, de al menos el 50%; The family of polypeptides S2A or S1E above with a percentage identity with 1-188, or amino acids -166 to 188, of SEQ ID NO: 2, and / or with 1-196, or amino acids -192 to 196, of SEQ ID NO: 8, of at least 50%;

La familia de polipéptidos S2A o S1E anteriores que es i) una proteasa bacteriana; The family of polypeptides S2A or S1E above which is i) a bacterial protease; ii) una proteasa del Filum Actinobacteria ; ii) a protease of the phylum Actinobacteria; iii) de la clase Actinobacteria ; iii) the class Actinobacteria; iv) del orden de Actinomicetales de v) de la familia Nocardiopsaceae ; iv) the order of Actinomycetales v) the family Nocardiopsaceae; vi) del género Nocardiopsis ; vi) of the genus Nocardiopsis; y/o una proteasa derivada de vii) especies de Nocardiopsis tales como Nocardiopsis alba, Nocardiopsis antarctica, Nocardiopsis prasina, Nocardiopsis cornposta, Nocardiopsis exhalans, Nocardiopsis halophila, Nocardiopsis halotolerans, Nocardiopsis kunsanensis, Nocardiopsis listeri, Nocardiopsis lucentensis, Nocardiopsis metallicus, Nocardiopsis synnemataformans, Nocardiopsis trehalosi, Nocardiopsis tropica, Nocardiopsis umidischolae, Nocardiopsis xinjiangensis , o Nocardiopsis dassonvillei , por ejemplo una proteasa derivada de Nocardiopsis antarctica o Nocardiopsis dassonvillei , por ejemplo Nocardiopsis dassonvillei DSM 43235, tal como un polipéptido con la secuencia de aminoácidos de aminoácidos 1 a 188, o -166 a 188, de SEC ID Nº: 2; and / or a protease derived from vii) species Nocardiopsis such as alba Nocardiopsis antarctica Nocardiopsis, prasina Nocardiopsis, cornposta Nocardiopsis, exhalans Nocardiopsis, Nocardiopsis halophila, Nocardiopsis halotolerans, Nocardiopsis kunsanensis, Nocardiopsis listeri, lucentensis Nocardiopsis, Nocardiopsis metallicus, synnemataformans Nocardiopsis, trehalosi Nocardiopsis tropica Nocardiopsis, Nocardiopsis umidischolae, xinjiangensis Nocardiopsis, or Nocardiopsis dassonvillei, for example a protease derived from antarctica Nocardiopsis or Nocardiopsis dassonvillei, for example Nocardiopsis dassonvillei DSM 43235, such as a polypeptide with the amino acid sequence of amino acids 1 to 188, or -166 to 188, of SEQ ID NO: 2;

Una secuencia de ácidos nucléicos aislada comprendiendo una secuencia de ácidos nucléicos que codifica la familia de polipéptidos S2A o S1E anteriores; An isolated nucleic acid sequence comprising a nucleic acid sequence encoding the polypeptide family S2A or S1E above;

Un constructo de ácidos nucléicos comprendiendo la secuencia de ácidos nucléicos enlazada operativamente con una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un huésped de expresión adecuado; A nucleic acid construct comprising the nucleic acid sequence operably linked to one or more control sequences that direct the production of the polypeptide in a suitable expression host;

Un vector de expresión recombinante comprendiendo el constructo de ácido nucléico; A recombinant expression vector comprising the nucleic acid construct;

Una célula huésped recombinante comprendiendo el constructo de ácido nucléico o el vector; A recombinant host cell comprising the nucleic acid construct or the vector;

Un método para la producción de la familia de polipéptidos S2A o S1E anteriores, el método comprendiendo: (a) cultivo de una célula huésped recombinante para producir un sobrenadante comprendiendo el polipéptido; A method for producing the polypeptide family S2A or S1E above, the method comprising: (a) cultivating a recombinant host cell to produce a supernatant comprising the polypeptide; y (b) recuperación del polipéptido; and (b) recovering the polypeptide;

Una planta transgénica, o parte de planta, capaz de expresar la familia de polipéptidos S2A o Si E anteriores. A transgenic plant, or plant part, capable of expressing the polypeptide family S2A or if E above.

Un animal transgénico, no humano, o productos, o elementos del mismo, capaces de expresar el polipéptido anterior de la familia S2A o S1E. A transgenic nonhuman animal, or products, or elements thereof, capable of expressing the above family S2A polypeptide or S1E.

Uso de al menos uno de los polipéptidos anteriores S2A o S1E (i) en alimentos para animales (ii) en la preparación de una composición para un uso en alimentos para animales (iii) para mejorar el valor nutritivo de un alimento para animales; Use of at least one of the above S2A or S1E polypeptides (i) in animal feed (ii) in the preparation of a composition for use in animal feed (iii) for improving the nutritional value of an animal feed; (iv) para aumentar la proteína digerible y/o soluble en dietas de animales; (Iv) for increasing digestible and / or soluble protein in animal diets; (v) para aumentar el grado de hidrólisis de proteínas en dietas de animales; (V) to increase the degree of hydrolysis of proteins in animal diets; y/o (vi) para el tratamiento de las proteínas; and / or (vi) for the treatment of proteins;

Un aditivo de alimento para animales comprendiendo al menos uno de los polipéptidos anteriores S2A o S1E; An animal feed additive comprising at least one of the above S2A or S1E polypeptides; y (a) al menos una vitamina liposoluble, y/o (b) al menos una vitamina hidrosoluble, y/o (c) al menos un oligoelemento; and (a) at least one fat-soluble vitamin, and / or (b) at least one water soluble vitamin, and / or (c) at least one trace mineral;

Una composición de alimentos para animales que posee un contenido de proteína bruta de 50 a 800 g/kg y comprendiendo al menos uno de los polipéptidos anteriores S2A o S1E, o al menos un aditivo alimentario anterior; A pet food composition having a crude protein content of 50-800 g / kg and comprising at least one of the above S2A or S1E polypeptides, or at least one above feed additive;

Una composición comprendiendo al menos uno de los polipéptidos anteriores S2A o S1E, con al menos otra enzima seleccionada entre las alfa-amilasa (EC 3.2.1.1), fitasa (EC 3.1.3.8 o 3.1.3.26); A composition comprising at least one of the above S2A or S1E polypeptides, with at least one other enzyme selected from amongst alpha-amylase (EC 3.2.1.1), phytase (EC 3.1.3.8 or 3.1.3.26); xilanasa (EC 3.2.1.8); xylanase (EC 3.2.1.8); galactanasa (EC 3.2.1.89); galactanase (EC 3.2.1.89); alfa-galactosidasa (EC 3.2.1.22); alpha-galactosidase (EC 3.2.1.22); proteasa (EC 3.4.-.-), fosfolipasa A1 (EC 3.1.1.32); protease (EC 3.4.-.-), phospholipase A1 (EC 3.1.1.32); fosfolipasa A2 (EC 3.1.1.4); phospholipase A2 (EC 3.1.1.4); lisofosfolipasa (EC 3.1.1.5); lysophospholipase (EC 3.1.1.5); fosfolipasa C (3.1.4.3); phospholipase C (3.1.4.3); fosfolipasa D (EC 3.1.4.4); phospholipase D (EC 3.1.4.4); y/o beta-glucanasa (EC 3.2.1.4 o EC 3.2.1.6); and / or beta-glucanase (EC 3.2.1.4 or EC 3.2.1.6); así como as well as

Uso de al menos uno de los polipéptidos anteriores S2A o S1E en detergentes. Use of at least one of the above S2A or S1E polypeptides in detergents.

Los segundo, tercero, cuarto, y quinto aspectos anteriores, son, independientemente los unos de los otros, también subaspectos preferidos del primer aspecto de la invención, así como subaspectos preferidos de cada uno. The second, third, fourth, and fifth aspects above are, independently of each other, also preferred sub-aspects of the first aspect of the invention as well as preferred sub-aspects of each.

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Descripción detallada de la invención Detailed description of the invention

Los polipéptidos que poseen una actividad proteasa, o las proteasas, son designados también a veces peptidasas, proteinasas, hidrolasas peptídicos, o enzimas proteolíticas. Polypeptides having protease activity, or proteases, are also sometimes referred to as peptidases, proteinases, peptide hydrolases, or proteolytic enzymes. Las proteasas pueden ser del tipo exo que hidroliza péptidos empezando en cada extremo de las mismas, o del tipo endo que actúa internamente en cadenas polipéptidas (endopeptidasas). Proteases may be of the exo-type that hydrolyses peptides starting at either end thereof, or of the endo-type that act internally in polypeptide chains (endopeptidases). Las endopeptidasas muestran una actividad en los sustratos peptídicos bloqueados terminalmente en N y C que son importantes para la especificidad de la proteasa en cuestión. Endopeptidases show activity on peptide substrates endblocked N and C that are important to the specificity of the protease in question.

El término "proteasa" es definido aquí como una enzima que hidroliza enlaces peptídicos. The term "protease" is defined herein as an enzyme that hydrolyses peptide bonds. Incluye cualquier enzima del grupo de enzimas EC 3.4 (incluyendo cada una de las trece subclases del mismo). Includes any enzyme group EC 3.4 enzyme (including each of the thirteen subclasses thereof). El número EC se refiere a la Nomenclatura Enzimática de 1992 de NC-IUBMB, Academic Press, San Diego, California, incluyendo los suplementos 1-5 publicados en Eur. J. Biochem. EC number refers to Enzyme Nomenclature 1992 from NC-IUBMB, Academic Press, San Diego, California, including supplements 1-5 published in Eur. J. Biochem. 1994: 223: 1-5; 1994: 223: 1-5; Eur. J. Biochem. Eur. J. Biochem. 1995: 232: 1-6; 1995: 232: 1-6; Eur. J. Biochem. Eur. J. Biochem. 1996: 237: 1-5; 1996: 237: 1-5; Eur. J. Biochem. Eur. J. Biochem. 1997: 250: 1-6; 1997: 250: 1-6; y Eur. J. Biochem. and Eur. J. Biochem. 1999, 264, 610-650; 1999, 264, 610-650; respectivamente. respectively. La nomenclatura es complementada y actualizada regularmente; The nomenclature is supplemented and regularly updated; véase por ejemplo la red informática mundial (WWW) en http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html. see for example the World Wide Web (WWW) in http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html.

Las proteasas son clasificadas en base a su mecanismo catalítico en los grupos siguientes: Serina proteasas (S), Cisteína proteasas (C), proteasas aspárticas (A), Metalo proteasas (M), y proteasas desconocidas, o aún sin clasificar, (U), véase Handbook of Proteolytic Enzymes, AJ Barrett, ND Rawlings, JF Woessner (eds), Academic Press (1998), en particular la parte de introducción general. Proteases are classified on the basis of their catalytic mechanism into the following groups: Serine proteases (S), Cysteine ​​proteases (C), aspartic proteases (A), Metallo proteases (M), and unknown proteases, or as yet unclassified, (U ), see Handbook of Proteolytic Enzymes, AJ Barrett, ND Rawlings, JF Woessner (eds), Academic Press (1998), in particular the general introduction part.

En formas de realización particulares, las proteasas de la invención y para un uso según la invención, son seleccionadas del grupo consistente en: In particular embodiments, the proteases of the invention and for use according to the invention are selected from the group consisting of:

(a) (to)
Proteasas pertenecientes al grupo enzimático EC 3.4.-.-; Protease enzyme belonging to the group EC 3.4.-.-;

(b) (B)
Serina proteasas pertenecientes al grupo S del manual precedente; Serine proteases belonging to the S group of the preceding manual;

(c) (C)
Serina proteasas de la familia de peptidasa S2A; Serine proteases of peptidase family S2A; y/o I

(d) (D)
Serina proteasas de la familia de peptidasa S1E tal y como está descrito en Biochem. Serine proteases of peptidase family S1E the as described in Biochem. J. 290:205-218 (1993) y en la base de datos de proteasas MEROPS, publicación 6.20, 24 de Marzo de 2003, (www.merops.ac.uk). J. 290: 205-218 (1993) and in the database MEROPS protease, 06.20 publication, 24 March 2003 (www.merops.ac.uk). La base de datos está descrita en Rawlings, ND, O'Brien, EA & Barrett, AJ (2002) MEROPS: Base de datos de proteasas. The database is described in Rawlings, ND, O'Brien, EA & Barrett, AJ (2002) MEROPS: Database protease. Nucleic Acids Res. 30: 343-346. Nucleic Acids Res. 30: 343-346.

Para determinar si una proteasa proporcionada es una Serina proteasa, y una proteasa de la familia S2A, se hace referencia al manual anterior ya los principios indicados en éste. To determine whether a given protease is a serine protease and a family S2A protease, reference is made to the previous manual and the principles set forth therein. Tal determinación puede efectuarse para todos los tipos de proteasas, ocurriendo de forma natural o proteasas de tipo salvaje; Such determination may be made for all types of proteases, occurring naturally or wild-type proteases; o creadas genéticamente o proteasas sintéticas. or genetically or synthetic proteases created.

Una actividad proteasa puede ser medida usando cualquier ensayo, en el que se emplee un sustrato, incluyendo enlaces peptídicos importantes para la especificidad de la proteasa en cuestión. A protease activity can be measured using any assay, in which a substrate is employed, including peptide bonds important for the specificity of the protease in question. También se tienen que adaptar el pH de ensayo y la temperatura de ensayo a la proteasa en cuestión. It also has to adjust the pH test and the test temperature to the protease in question. Ejemplos de valores de pH de ensayo son pH 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ó 12. Ejemplos de temperaturas de ensayo son 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 90, ó 95ºC. Examples of pH values ​​are pH test 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, or 12. Examples of test temperatures are 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 90, or 95C.

Ejemplos de sustratos de proteasa son caseína, tal como la Caseína entrecruzada con azurina (caseína AZCL). Examples of protease substrates are casein, such as Azurine-Crosslinked Casein (AZCL casein). Dos ensayos de proteasa están descritos en el Ejemplo 2 de la presente, se puede usar cualquiera de éstos para determinar una actividad proteasa. Two protease assays are described in Example 2 of the present, one can use any of these to determine protease activity. Para los objetivos de esta invención, el llamado ensayo pNA es un ensayo preferido. For purposes of this invention, the so-called pNA assay is a preferred assay.

No hay ninguna limitación respecto al origen de la proteasa de la invención y/o para su uso según la invención. There is no limitation regarding the origin of the protease of the invention and / or for use according to the invention. De esta manera, el término proteasa incluye no sólo proteasas naturales o de tipo salvaje obtenidas a partir de microorganismos de cualquier género, sino también cualquier mutante, variante, fragmento, etc. Thus, the term protease includes not only natural or wild-type proteases obtained from microorganisms of any genus, but also any mutant, variant, fragment, etc. de los mismos exponiendo una actividad proteasa, así como proteasas sintéticas, tales como proteasas redistribuidas, y proteasas de consenso. thereof exhibiting protease activity, as well as synthetic proteases, such as proteases redistributed, and consensus proteases. Tales proteasas creadas genéticamente pueden ser preparadas según la técnica conocida, por ejemplo por mutagénesis dirigida, por PCR (mediante el uso de un fragmento de PCR conteniendo la mutación deseada como uno de los iniciadores en las reacciones de PCR), o por Mutagénesis Aleatoria. Such proteases genetically engineered can be prepared according to known technique, for example by mutagenesis, by PCR (using a PCR fragment containing the desired mutation as one of the primers in the PCR reactions), or by Random Mutagenesis. La preparación de las proteínas de consenso está descrita por ejemplo en EP 897985. La transposición de genes por ejemplo está descrita en general en WO 95/22625 y WO 96/00343. The preparation of consensus proteins is described for example in EP 897985. Gene shuffling is described for example in WO 95/22625 in general 96/00343 and WO. La recombinación de los genes de proteasa pueden realizarse de manera independiente con respecto a la secuencia específica de los progenitores mediante redistribución sintética como está descrito en Ness, JE et al , en Nature Biotechnology, Vol. 20 (12), páginas. Recombination of protease genes can be made independently with respect to the specific sequence of the parents by synthetic redistribution as described in Ness, JE et al, in Nature Biotechnology, Vol. 20 (12) pages. 1251-1255, 2002. Los oligonucleótidos sintéticos degenerados en su secuencia de ADN para proporcionar la posibilidad de encontrar todos los aminoácidos en el grupo de proteasas progenitoras son diseñados y los genes son ensamblados según la referencia. 1251-1255, 2002. Synthetic oligonucleotides degenerated in their DNA sequence to provide the possibility of all amino acids found in the group of parent proteases are designed and the genes assembled according are reference. La recuperación puede ser realizada para toda la secuencia en su longitud o sólo para una parte de la secuencia y ser combinada más tarde con el resto del gen para formar una secuencia de longitud total. Recovery can be performed for the entire length sequence or for only part of the sequence and later be combined with the rest of the gene to form a full length sequence. Las proteasas de las partes de péptido maduro de SEC ID Nº: 2, 8, 10 y 12, tal como la Proteasa 22 (SEC ID Nº: 8), y la proteasa derivada de Nocardiopsis dassonvillei , subespecie dassonvillei DSM 43235 (SEC ID Nº: 2), son ejemplos particulares de tales proteasas progenitoras que pueden ser sometidas a una recuperación como se ha descrito anteriormente, si se desea en conjunto con la proteasa derivada de la especie Nocardiopsis NRRL 18262, para proporcionar proteasas adicionales de la invención. Proteases parts mature peptide SEQ ID NO: 2, 8, 10 and 12, such as Protease 22 (SEQ ID NO: 8), and the protease derived from Nocardiopsis dassonvillei subspecies dassonvillei DSM 43235 (SEQ ID NO : 2), are particular examples of such parent proteases which can be subjected to a recovery as described above, if desired together with the protease derived from Nocardiopsis species NRRL 18262, to provide additional proteases of the invention. Los términos "obtenido a partir de" como se utiliza en este caso en relación a una fuente determinada significará que el polipéptido codificado por la secuencia de ácidos nucléicos es producido por la fuente o por una célula donde la secuencia de ácidos nucléicos de la fuente está presente. The terms "obtained from" as used herein in connection with a given source shall mean that the polypeptide encoded by the nucleic acid sequence is produced by the source or by a cell where the nucleic acid sequence source is I presented. En una forma de realización preferida, el polipéptido es segregado extracelularmente. In a preferred embodiment, the polypeptide is secreted extracellularly.

En una forma de realización específica, la proteasa es una variante hipoalergénica, diseñada para inducir una respuesta inmunológica reducida cuando es expuesta en animales, incluyendo el hombre. In a specific embodiment, the protease is a hypoallergenic variant, designed to induce an immune response reduced when exposed to animals, including man. Los términos respuesta inmunológica deben ser entendidos como cualquier reacción del sistema inmunitario de un animal expuesto a la proteasa. The terms immune response should be understood as any reaction by the immune system of an animal exposed to the protease. Un tipo de respuesta inmunológica es una respuesta alérgica que conduce a niveles en aumento de IgE en el animal expuesto. One type of immunological response is an allergic response leading to increased levels of IgE in the exposed animal. Se pueden preparar variantes hipoalergénicas por medio de técnicas conocidas en el arte. Hypoallergenic variants can be prepared by techniques known in the art. Por ejemplo la proteasa puede ser conjugada con porciones o epítopos de recubrimiento de fracciones polímeras de la proteasa implicadas en una respuesta inmunológica. For example the protease may be conjugated with portions or epitopes coating polymer fractions protease involved in an immunological response. La conjugación con polímeros pueden implicar un acoplamiento químico in vitro del polímero con la proteasa, por ejemplo tal y como está descrito en WO 96/17929, WO 98/30682, WO 98/35026, y/o WO 99/00489. Conjugation with polymers may involve in vitro chemical coupling of polymer to the protease, such as is described in WO 96/17929, WO 98/30682, WO 98/35026 and / or WO 99/00489. La conjugación puede además o de forma alternativa con respecto a ésta, implicar un acoplamiento en vivo de polímeros con la proteasa. Conjugation may in addition or alternatively relative thereto, imply coupling with live polymer protease. Tal conjugación puede ser obtenida por ingeniería genética de la secuencia de nucleótidos de codificación de la proteasa, por inserción de unas secuencias de consenso de codificación de otros sitios de glicosilación en la proteasa y por expresión de la proteasa en un huésped capaz de glicosilar la proteasa, véase por ejemplo WO 00/26354. Such conjugation may be obtained by genetic engineering of the nucleotide sequence encoding the protease, insertion of a consensus sequences encoding other glycosylation sites in the protease and expressing the protease in a host capable of glycosylating the protease , see for example WO 00/26354. Otra forma de proveer variantes hipoalergénicas es la ingeniería genética de la secuencia de nucleótidos de codificación de la proteasa en una forma tal que la proteasa se auto-oligomerice, teniendo como efecto el hecho de que los monómeros de las proteasas pueden proteger los epítopos de otros monómeros de proteasas y reducir así la antigenicidad de los oligómeros. Another way to provide allergenic variants is genetic engineering of the nucleotide sequence encoding the protease in such a way that the protease is self-oligomerice, having the effect that the monomers of proteases can protect epitopes from other protease monomers and thereby reduce the antigenicity of the oligomers. Tales productos y su preparación están descritos por ejemplo en WO 96/16177. Such products and their preparation are described for example in WO 96/16177. Los epítopos implicados en una respuesta inmunológica pueden ser identificados por varios métodos como el método de exposición en fagos descrito en WO 00/26230 y WO 01/83559, o el procedimiento aleatorio descrito en EP 561907. Una vez que se ha identificado un epítopo, su secuencia de aminoácidos puede ser alterada para producir propiedades inmunológicas alteradas de la proteasa mediante técnicas de manipulación de genes conocidas, como una mutagénesis dirigida en el sitio (véase por ejemplo WO 00/26230, WO 00/26354 y/o WO 00/22103) y/o la conjugación de un polímero puede ser realizada a una proximidad suficiente del epítopo para la protección del epítopo por el polímero. Epitopes involved in an immunological response may be identified by various methods such as the phage display method described in WO 00/26230 and WO 01/83559, or the random procedure described in EP 561907. Once an epitope has been identified, its amino acid sequence may be altered to produce altered immunological properties of the protease are manipulation techniques known genes, as directed mutagenesis at the site (see for example WO 00/26230, WO 00/26354 and / or WO 00/22103 ) and / or conjugation of a polymer may be performed at a sufficient proximity to the epitope protection epitopic polymer.

Un polipéptido, según otro aspecto de la presente invención, está definido en la reivindicación 1 y puede comprender una secuencia de aminoácidos que presente un grado de identidad con la parte de péptido maduro de cualquiera de las SEC ID Nº: 2, 8, 10, o 12, por ejemplo aminoácidos de 1 a 188 de SEC ID Nº: 2, y/o con los aminoácidos 1 a 196 de SEC ID Nº: 8 (las partes de péptido maduro), de por ejemplo al menos aproximadamente el 60%, y con una actividad proteasa (más adelante "polipéptidos homólogos"). A polypeptide according to another aspect of the present invention is defined in claim 1 and may comprise an amino acid sequence having a degree of identity to the mature peptide part of either of SEQ ID NOs: 2, 8, 10, or 12, for example amino acids 1 to 188 of SEQ ID NO: 2, and / or amino acids 1 to 196 of SEQ ID NO: 8 (parts mature peptide), of for example at least about 60%, and protease activity (hereinafter "homologous polypeptides"). En formas de realización particulares, el grado de identidad con cualquiera de las partes de péptido maduro de cualquiera de las SEC ID Nº: 2, 8, 10 ó 12 es aproximadamente de al menos 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 76%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o de al menos 99%. In particular embodiments, the degree of identity with either party mature peptide of any of SEQ ID NO: 2, 8, 10 or 12 is at least about 62%, 64%, 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 76%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92% , 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or at least 99%.

Para los objetivos de la presente invención, el grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos, así como el grado de identidad entre dos secuencias de nucleótidos, es determinado por el programa "alineación" que es una alineación Needleman-Wunsch (es decir una alineación global). For purposes of the present invention, the degree of identity between two amino acid sequences, as well as the degree of identity between two nucleotide sequences, it is determined by the "alignment" which is a Needleman-Wunsch alignment (ie alignment global). El programa es usado para una alineación de polipéptidos, así como de secuencias de nucleótidos. The program is used for alignment of polypeptide, as well as nucleotide sequences. La matriz de marcado por defecto BLOSUM50 es usada para la alineación de polipéptidos, y la matriz de identidad por defecto es usada para la alineación de nucleótidos. The matrix default dial BLOSUM50 is used for alignment of polypeptide, and the default identity matrix is ​​used for nucleotide alignment. La penalización para el primer residuo de un espacio es de -12 para los polipéptidos y de -16 para los nucleótidos. The penalty for the first residue of a gap is -12 for polypeptides and -16 for nucleotides. Las penalizaciones para otros residuos son de -2 para los polipéptidos, y de -4 para los nucleótidos. Penalties for other residues are -2 for polypeptides, and -4 for nucleotides.

La "alineación" forma parte del paquete FASTA versión v20u6 (véase WR Pearson y DJ Lipman (1988), "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85:2444-2448, y WR Pearson (1990) "Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA," Methods in Enzymology 183:63-98). "Alignment" is part of the FASTA package version v20u6 (WR Pearson and DJ see Lipman (1988), "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85: 2444-2448, and WR Pearson (1990) "Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA, "Methods in Enzymology 183: 63-98). Las alineaciones de proteínas FASTA usan el algoritmo Smith-Waterman sin limitación en su tamaño de espacio (véase "Smith-Waterman algorithm", TF Smith y MS Waterman (1981) J. Mol. Biol. 147:195-197). FASTA protein alignments use the Smith-Waterman algorithm with no limitation on its size space (see "Smith-Waterman algorithm", Smith TF and Waterman MS (1981) J. Mol Biol 147:.. 195-197). [0064] En una forma de realización particular, las partes de péptido maduro, o partes de péptido maduro previstas o deseadas, de las dos secuencias de aminoácidos son usadas para la alineación. [0064] In a particular embodiment, the mature peptide parts, or parts intended or desired mature peptide, the two amino acid sequences are used for alignment. En una alternativa, esta parte de la secuencia, cuya identidad de parte de péptido maduro de las SEC ID Nº: 2 y/o SEC ID Nº: 8 es examinada, es elegida, la cual, según una alineación múltiple realizada tal como se describe más abajo es más similar a la parte de péptido maduro de SEC ID Nº: 2 y/o 8, es decir a los residuos aminoácidos correspondientes identificados por la alineación múltiple. In an alternative, this part of the sequence, whose identity mature peptide part of SEQ ID NO: 2 and / or SEQ ID NO: 8 is examined, is chosen, which according to a multiple alignment made as described below is most similar to the mature peptide part of SEQ ID NO: 2 and / or 8, ie amino acids corresponding to residues identified by the multiple alignment.

En el presente contexto, la base para la numeración de los residuos aminoácidos o asignación de números de posición, en referencia al segundo aspecto de la invención, es la SEC ID Nº: 2 empezando por Al y terminando por T188. In the present context, the basis for numbering amino acid residues or assigning position numbers, referring to the second aspect of the invention is SEQ ID NO: 2 beginning and ending with T188 Al. Como alternativa, la base consiste en aminoácidos 1-188 de la proteasa derivada de la especie Nocardiopsis NRRL 18262 (SEC ID Nº: 1 tal como está descrita en WO 01/58276, preferiblemente SEC ID Nº: 1 tal como está descrita en WO 01/58276 donde A87 es sustituido por T87. Las proteasas pueden comprender extensiones en comparación con estas secuencias de referencia, por ejemplo SEC ID Nº: 2, es decir en el N-terminal, y/o los extremos C-terminal de éstas. Los aminoácidos de tales extensiones, si están presentes, deben ser numerados como se hace normalmente en la técnica, es decir para una extensión de C-terminal: 189, 190, 191 y sucesivamente, y para una extensión de N-terminal -1, -2, -3 y sucesivamente. Alternatively, the base consists of amino acids 1-188 of the protease derived from Nocardiopsis species NRRL 18262 (SEQ ID NO: 1 as described in WO 01/58276 is preferably SEQ ID NO: 1 as is described in WO 01 / 58,276 where A87 is replaced by T87 proteases may comprise extensions as compared to these reference sequences, e.g. SEQ ID NO:.. 2, ie the N-terminal and / or the C-terminal thereof the amino acids of such extensions, if present, should be numbered as is normally done in the art, ie to an extension of C-terminal 189, 190, 191 and on, and an extension of N-terminal -1 - 2, -3 and on.

Para cada residuo de aminoácidos en cada proteasa alineada con la secuencia de referencia, por ejemplo las SEC ID Nº: 2, como se ha explicado anteriormente (para los objetivos de determinación del grado de identidad), es posible asignar directamente y sin ambigüedad un residuo de aminoácidos en la secuencia de referencia a la que corresponda, por ejemplo, SEC ID Nº: 2. Los residuos correspondientes tienen la misma posición, o número asignados, en referencia, por ejemplo, a SEC ID Nº: 2. For each amino acid residue in each protease aligned to the reference sequence, for example SEQ ID NO: 2, as explained above (for the purposes of determining degree of identity), can be assigned directly and unambiguously a residue amino acid in the reference sequence corresponds to, for example, SEQ ID NO: 2. the corresponding residues have the same position, or number assigned a reference, for example, SEQ ID NO: 2.

Para cada residuo de aminoácidos en otra proteasa, la posición correspondiente de la secuencia de referencia, por ejemplo la SEC ID Nº: 2, puede ser definida de la manera siguiente: For each amino acid residue in another protease, the corresponding position of the reference sequence, for example SEQ ID NO: 2, can be defined as follows:

La secuencia de aminoácidos de la otra proteasa es designada SEQ X. Una posición correspondiente a la posición N de SEC ID Nº: 2 puede ser definida de la manera siguiente: la SEC X es alineada con la SEC ID Nº: 2 como se ha especificado más arriba. The amino acid sequence of the other protease is designated SEQ X. A position corresponding to position N of SEQ ID NO: 2 can be defined as follows: SEQ X is aligned with SEQ ID NO: 2 as specified higher. A partir de la alineación, la posición en la secuencia SEC X correspondiendo a la posición N de SEC ID Nº: 2 puede ser derivada claramente y sin ambigüedad, mediante el uso de los principios descritos más abajo. From the alignment, the position in sequence SEQ X corresponding to position N of SEQ ID NO: 2 can be clearly and unambiguously derived, using the principles described below.

La SEC X puede ser una parte madura de la proteasa en cuestión, o puede incluir también una parte de péptido señal, o puede ser un fragmento de la proteasa madura que posee una actividad proteasa, por ejemplo un fragmento de la misma longitud que la SEC ID Nº: 2, y/o puede ser el fragmento que se extiende desde Al hasta T188 cuando se alinea con la SEC ID Nº: 2 tal y como está descrito en este caso. SEQ X may be a mature part of the protease in question, or may also include a signal peptide part, or it may be a fragment of the mature protease which has protease activity, for example a fragment of the same length as the SEC ID NO: 2, and / or it may be the fragment which extends from Al to T188 when aligned with SEQ ID NO: 2 as described here.

Tres alineaciones son insertadas más abajo como Tablas I, II y III. Three alignments are inserted below as Tables I, II and III. Las alineaciones fueron preparadas tal y como se ha descrito anteriormente, mediante la alineación de la parte madura de otra proteasa (SEC X, SEC X2, y SEC X3, respectivamente) con la SEC ID Nº: 2. Se muestran aproximadamente 50 residuos de aminoácidos de cada proteasa. The alignments were prepared as described above, by aligning the mature part of another protease (SEQ X, SEQ X2, and SEQ X3, respectively) to SEQ ID NO: 2. Showing approximately 50 amino acid residues of each protease.

Si se observa primero la alineación de la Tabla 1, es evidente, por ejemplo, que el G42 de SEC ID Nº: 2 corresponde al P42 de SEC X, ya que estos residuos se sitúan en la extremidad superior el uno con respecto al otro en la alineación. If seen first alignment of Table 1, it is evident, for example, the G42 of SEQ ID NO: 2 corresponds to P42 of SEQ X, since these residues are located at the upper end of each relative to the other in alignment. Estos llevan ambos el número asignado 42, es decir, el número del residuo correspondiente en la SEC ID Nº: 2. Resulta evidente, también a partir de esta alineación, por ejemplo, que la SEC X no comprende 10Y sino 38T. These carry both assigned number 42, that is, the number of the corresponding residue in SEQ ID NO: 2. It is also clear from this alignment, for example, the SEC but X does not comprise 10Y 38T.

TABLA I TABLE I

1 one

Las Tablas II y III son ejemplos de los espacios que se producen por las alineaciones en cualquiera de las dos secuencias. Tables II and III are examples of the spaces produced by the alignments in either sequences.

En la alineación de la Tabla II, un espacio está formado en la SEC X2. In the alignment of Table II, a space is formed in SEQ X2. El residuo de aminoácidos destacado P de la SEC X2 es, para los objetivos de la presente, designado P28, aunque en SEC X es P25 como tal. The highlighted amino acid residue P of SEQ X2 is the, for the purposes of the present, designated P28, although in SEQ X as such it is P25.

TABLA II TABLE II

2 two

En la alineación de la Tabla III, un espacio está formado en la SEC ID Nº: 2. Cuando un espacio está formado entre los aminoácidos que poseen un número de posición nn y (nn+1) de SEC ID Nº: 2, a cada posición del espacio se le asigna un caso inferior o letra de subíndice: a, b, c, etc. In the alignment of Table III, a space is formed in SEQ ID NO: 2. When a space is formed between amino acids having position number nn and (nn + 1) of SEQ ID NO: 2, each space position is assigned a lower case or subscript letter: a, b, c, etc. al número de posición anterior, es decir nn. the number of previous position, i.e. nn. De esta manera, cada posición del espacio lleva el numero nna, nnb etc. Thus, each space position bears nna number, etc. nnb El residuo de aminoácidos destacado R de de la SEC X3, para los objetivos de la presente, es designado R33a, aunque en la SEC X3 se designa R34 como tal. The highlighted amino acid residue R of SEQ X3, for purposes hereof, is designated R 33A, while X3 R34 in SEQ designated as such.

TABLA III TABLE III

3 3

En otras formas de realización particulares de cada aspecto de la invención, el polipéptido de la invención tiene una temperatura de fusión (T_{m}) de al menos 78ºC, 79ºC, 80ºC, 81ºC, 82ºC, 83ºC, 84ºC, 85ºC, 86ºC, 87ºC, 88ºC, 89ºC, 90ºC, 91ºC, 92ºC, 93ºC, 94ºC, o de al menos 95ºC, determinada por calorimetría diferencial de barrido (DSC). In other particular embodiments of each aspect of the invention, the polypeptide of the invention has a melting temperature (T_ {m}) of at least 78 ° C, 79 ° C, 80 ° C, 81 ° C, 82 ° C, 83C, 84C, 85C, 86 ° C, 87 ° C, 88 ° C, 89 ° C, 90 ° C, 91 ° C, 92 ° C, 93 ° C, 94 ° C, or at least 95 ° C, determined by differential scanning calorimetry (DSC).

La calorimetría por análisis diferencial se realiza en un tampón de fosfato de sodio a 10 mM, cloruro de sodio a 50 mM, pH 7,0. Differential calorimetry analysis was performed in a sodium phosphate buffer to 10 mM, sodium chloride to 50 mM, pH 7.0.

El índice de barrido es constante, por ejemplo de 1,5ºC/min. The sweep rate is constant, for example 1.5 ° C / min.

El intervalo de barrido puede ser de 20 a 100ºC. The sweep range can be 20 to 100 ° C.

No existen limitaciones superiores en la T_{m}, no obstante, se considera actualmente que la T_{m} puede ser inferior a 150ºC, 145ºC, 140ºC, 135ºC, 130ºC, 125ºC, 120ºC, 115ºC, 110ºC, 105ºC, o inferior a 100ºC. There are upper limits on the T_ {m}, however, it is presently considered that the T_ {m} may be less than 150, 145C, 140C, 135C, 130, 125, 120, 115C, 110C, 105C, or below 100.

En una forma de realización alternativa, otro tampón es seleccionado para el barrido, por ejemplo un tampón de pH 5,0, 5,5, 6,0, o pH 6,5. In an alternative embodiment, another buffer is selected for the scanning, for example buffer pH 5.0, 5.5, 6.0, or pH 6.5.

En otras formas de realización alternativas, se puede utilizar un índice de barrido superior o inferior, por ejemplo uno inferior de 1,4ºC/min, 1,3ºC/min, 1,2ºC/min, 1,1ºC/min, 1,0ºC/min, o 0,9ºC/min. In other alternative embodiments, you can use a higher or lower rate sweep, one example below 1.4 ° C / min, 1.3 ° C / min, 1.2 ° C / min, 1.1 ° C / min, 1.0 ° C / min, or 0.9 ° C / min.

Se hace referencia al Ejemplo 2 para más detalles acerca del procedimiento de barrido. Reference is made to Example 2 for further details about the scanning procedure.

En una forma de realización particular, la proteasa de la invención muestra un perfil de actividad de temperatura corregida en comparación con la proteasa derivada de la especie Nocardiopsis NRRL 18262. Por ejemplo, la proteasa de la invención puede exhibir una actividad relativa a pH 9 y 80ºC de al menos 0,40, preferiblemente de al menos 0,45, 0,50, 0,55, 0,60, 0,65, 0,70, 0,75, 0,80, 0,85, 0,90, o de al menos 0,95, el término "relativa" refiriéndose a la actividad máxima medida para la proteasa en cuestión. In a particular embodiment, the protease of the invention shows an activity profile corrected temperature compared to the protease derived from Nocardiopsis species NRRL 18262. For example, the protease of the invention may exhibit a relative activity at pH 9 and 80 of at least 0.40, preferably at least 0.45, 0.50, 0.55, 0.60, 0.65, 0.70, 0.75, 0.80, 0.85, 0, 90, or at least 0.95, the term "relative" referring to the maximum activity measured for the protease in question. Para la Proteasa 22, la proteasa L2a, así como la proteasa derivada de Nocardiopsis dassonvillei , subespecie dassonvillei DSM 43235, la actividad es relativa a la actividad a 80ºC que se ajusta a 1.000 (100%), y para la Proteasa 8, y la proteasa derivada de la especie Nocardiopsis NRRL 18262, la actividad a 70ºC se ajusta a 1.000 (100%), véase los Ejemplos 2, 7, 8, y 9. En otro ejemplo, la proteasa de la invención muestra una actividad relativa a pH 9 y 90ºC de al menos 0,10, preferiblemente de al menos 0,15, 0,20, 0,25, 0,30, o de al menos 0,35. For Protease 22, Protease L2a and the protease derived from Nocardiopsis dassonvillei subspecies dassonvillei DSM 43235, the activity is relative to the activity at 80 which conforms to 1,000 (100%), and for Protease 8, and protease derived from Nocardiopsis species NRRL 18262, the activity at 70 ° C is set to 1.000 (100%), see Examples 2, 7, 8, and 9. in another example, the protease of the invention exhibits a relative activity at pH 9 and 90 ° C of at least 0.10, preferably at least 0.15, 0.20, 0.25, 0.30, or of at least 0.35. En una forma de realización particular, la actividad proteasa es medida usando el ensayo con Protazyme AK del Ejemplo 2. In a particular embodiment, the protease activity is measured using the Protazyme AK assay of Example 2.

Una selección de proteasas termoestables en relación con las SEC ID Nº: 2, 8, 10 o 12 de la invención puede ser realizada como se indica a continuación: Selección de una librería de ADN con iniciadores, por ejemplo cualquiera de las SEC ID Nº: 3 o 4, o preferiblemente con la partes maduras de codificación de péptido de cualquiera de las SEC ID Nº: 1, 7, 9 o 11; A selection of thermostable proteases related to SEQ ID NO: 2, 8, 10 or 12 of the invention can be performed as follows: Selection of a DNA library with primers, such as any of SEQ ID NO: 3 or 4, or preferably with the mature peptide encoding parts of either of SEQ ID NOs: 1, 7, 9 or 11; expresión de los clones de hibridación en una cepa adecuada, por ejemplo una cepa de Bacillus o E. coli . expression of hybridizing clones in a suitable strain, eg a strain of Bacillus or E. coli. En una fase siguiente, las proteasas expresadas relacionadas con cualquiera de las SEC ID Nº: 2, 8, 10 y/o 12 son purificadas, preferiblemente en un procedimiento de micropurificación (véase por ejemplo WO 03/037914), y la cantidad de proteasa activa es determinada para cada candidata mediante el uso del principio muy conocido de titulación de sitio activo (AST) con un inhibidor fuerte de la enzima. In a next step, the expressed proteases related to either of SEQ ID NO: 2, 8, 10 and / or 12 are purified, preferably in a process Micropurification (see for example WO 03/037914), and the amount of protease active is determined for each candidate by use of the well-known principle of active site titration (AST) with a strong inhibitor of the enzyme. En una fase posterior, una cantidad conocida de la enzima es incubada después a una temperatura alta deseada, por ejemplo a 85ºC, durante un tiempo deseado, por ejemplo de 2 horas; At a later stage, a known amount of the enzyme is then incubated at a desired high temperature, for example at 85, for a desired time, for example 2 hours; y la actividad proteasa residual es determinada, por ejemplo por medio de cualquiera de los ensayos de proteasa descritos aquí, por ejemplo el ensayo con Protazyme AK del Ejemplo 2. La mayor parte del procedimiento puede ser automatizado, y si se desea realizado con la ayuda de robots. and the residual protease activity is determined, for example by means of any of the protease assays described herein, for example the assay Protazyme AK of Example 2. Most of the process may be automated, and if desired performed with the assistance robots. La verificación de la termostabilidad se realiza por ejemplo mediante una purificación de la proteasa, y el establecimiento de la T_{m} por DSC se efectúa tal y como se describe en la parte experimental de la presente. The verification of thermostability is performed for example by purification of the protease, and establishment of the T_ {m} by DSC is carried out as described in the experimental part hereof.

La presente invención se refiere también al uso en alimentos para animales de los polipéptidos de la invención. The present invention also relates to use in animal feed of the polypeptides of the invention.

El grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos pueden ser determinado también por el método Clustal (Higgins, 1989, CABIOS 5: 151-153) usando el software LASERGENE^{TM} MEGALIGN^{TM} (DNASTAR, Inc., Madison, WI) con una tabla de identidad y los siguientes parámetros de alineación múltiples: Penalización de espacio de 10, y penalización de longitud de espacio de 10. Los parámetros de alineación pareados son Ktuple=1, espacio de penalización=3, ventanas=5, y diagonales=5. The degree of identity between two amino acid sequences can also be determined by the Clustal method (Higgins, 1989, CABIOS 5: 151-153) using the LASERGENE? {TM} ^ {TM software MEGALIGN} (DNASTAR, Inc., Madison, WI) with an identity table and the following multiple alignment parameters: gap penalty of 10 and gap length penalty of 10. the parameters are paired alignment Ktuple = 1, gap penalty = 3, windows = 5, and diagonals = 5. El grado de identidad entre dos secuencias de nucleótidos pueden ser determinado mediante el uso del mismo algoritmo y el paquete software tal y como se ha descrito anteriormente con los siguientes ajustes: Penalización de espacio de 10, y penalización de longitud de espacio de 10. Los parámetros de alineación pareados son Ktuple=3, espacio de penalización=3 y ventanas=20. The degree of identity between two nucleotide sequences can be determined using the same algorithm and software package such as described above with the following settings: Gap penalty of 10 and gap length penalty of 10. The paired alignment parameters are Ktuple = 3, gap penalty = 3 and windows = 20.

En una forma de realización particular, los polipéptidos homólogos tienen una secuencia de aminoácidos que difiere de los aminoácidos 1 a 188 de SEC ID Nº: 2 o -166 a 188 de SEC ID Nº: 2, o de los aminoácidos 1 a 196 de SEC ID Nº: 8 o -192 a 196 de SEC ID Nº: 8, por In a particular embodiment, the homologous polypeptides have an amino acid sequence that differs from amino acids 1 to 188 of SEQ ID NO: 2 or -166 to 188 of SEQ ID NO: 2, or amino acids 1 to 196 of SEQ ID NO: 8 or -192 to 196 of SEQ ID NO: 8, by

(i) (I)
no más de 75, 74, 73, 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 62, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, o no más de 20 aminoácidos; no more than 75, 74, 73, 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 62, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52 , 51, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27 , 26, 25, 24, 23, 22, 21, or no more than 20 amino acids;

(ii) (Ii)
no más de veinte, diecinueve, dieciocho, diecisiete, dieciséis, quince, catorce, trece, doce, o no más de once aminoácidos; no more than twenty, nineteen, eighteen, seventeen, sixteen, fifteen, fourteen, thirteen, twelve, or no more than eleven amino acids;

(iii) (Iii)
no más de diez, nueve, ocho, siete, seis, cinco, cuatro, tres, dos, o no más de un aminoácido; no more than ten, nine, eight, seven, six, five, four, three, two, or no more than one amino acid;

(iv) (Iv)
diez, o nueve, u ocho, o siete, o seis, o cinco aminoácidos; ten or nine, or eight, or seven, or six, or five amino acids; o or

(v) (V)
cuatro, o tres, o dos aminoácidos, o un aminoácido. four, or three, or two amino acids, or an amino acid.

En una forma de realización particular, los polipéptidos de la presente invención comprenden la secuencia de aminoácidos de las partes de péptido maduro de cualquiera de las SEC ID Nº: 2, 8, 10, o 12, o variantes alélicas de las mismas; In a particular embodiment, the polypeptides of the present invention comprise the amino acid sequence of the mature peptide parts of either of SEQ ID NO: 2, 8, 10, or 12, or allelic variants thereof; o fragmentos de éstas que poseen una actividad proteasa. or fragments thereof that have protease activity.

En otra forma de realización preferida, los polipéptidos de la presente invención consisten en las partes de péptido maduras de cualquiera de las SEC ID Nº: 2, 8, 10, o 12, o variantes alélicas de éstas; In another preferred embodiment, the polypeptides of the present invention consist of the mature peptide parts of either of SEQ ID NO: 2, 8, 10, or 12, or allelic variants thereof; o fragmentos de éstas que poseen una actividad proteasa. or fragments thereof that have protease activity.

Un fragmento de las partes de péptido maduro de cualquiera de las SEC ID Nº: 2, 8, 10, o 12 es un polipéptido que posee uno o más aminoácidos eliminados del termino amino y/o carboxilo de estas secuencias de aminoácidos. A fragment of the mature peptide parts of either of SEQ ID NO: 2, 8, 10, or 12 is a polypeptide having one or more amino acids deleted from the amino and / or carboxyl terminus of these amino acid sequences. En una forma de realización, un fragmento contiene al menos 75 residuos aminoácidos, o al menos 100 residuos aminoácidos, o al menos 125 residuos aminoácidos, o al menos 150 residuos aminoácidos, o al menos 160 residuos aminoácidos, o al menos 165 residuos aminoácidos, o al menos 170 residuos aminoácidos, o al menos 175 residuos aminoácidos. In one embodiment, a fragment contains at least 75 amino acid residues, or at least 100 amino acid residues, or at least 125 amino acid residues, or at least 150 amino acid residues, or at least 160 amino acid residues, or at least 165 amino acid residues, or at least 170 amino acid residues, or at least 175 amino acid residues.

Una variante alélica indica cualquiera de las dos o más formas alternativas de un gen ocupando el mismo lugar cromosómico. An allelic variant denotes any of two or more alternative forms of a gene occupying the same chromosomal locus. La variación alélica surge naturalmente a través de la mutación, y puede producir el polimorfismo en las poblaciones. Allelic variation arises naturally through mutation, and may result in polymorphism within populations. Las mutaciones de genes pueden ser silenciosas (ningún cambio en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos que poseen secuencias de aminoácidos alteradas. Gene mutations can be silent (no change in the encoded polypeptide) or may encode polypeptides having altered amino acid sequences. Una variante alélica de un polipéptido es un polipéptido codificado por la variante alélica de un gen. An allelic variant of a polypeptide is a polypeptide encoded by the allelic variant of a gene.

La presente invención también expone polipéptidos aislados que poseen una actividad proteasa y que son codificados por secuencias de ácidos nucleicos que se hibridizan en condiciones de astringencia alta o muy alta con una sonda de ácido nucleico que se hibridiza en las mismas condiciones con (a) nucleótidos 499-1062 de SEC ID Nº: 1 y/o nucleótidos 502-1065 de SEC ID Nº: 11; The present invention also discloses isolated polypeptides having protease activity and which are encoded by nucleic acid sequences which hybridize under high or very high stringency with a nucleic acid probe which hybridizes under the same conditions with (a) nucleotides 499-1062 of SEQ ID NO: 1 and / or nucleotides 502-1065 of SEQ ID NO: 11; (b) una subsecuencia de (a), o (c) una cadena complementaria de (a), o (b) (J. Sambrook, EF Fritsch, y T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor, New York). (B) a subsequence of (a), or (c) a complementary strand of (a) or (b) (J. Sambrook, EF Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition , Cold Spring Harbor, New York). En una forma de realización particular la sonda de ácido nucleico es seleccionada entre las secuencias de ácidos nucleicos más arriba de (a), (b), o (c). In a particular embodiment the nucleic acid probe is selected from the nucleic acid sequences upstream from (a), (b) or (c). Los nucleótidos de (a) corresponden a las partes codificantes de péptido maduro. The nucleotides of (a) correspond to mature peptide encoding parts.

La subsecuencia de los nucleótidos mencionados más arriba en (a) puede ser de al menos 100 nucleótidos, o en otra forma de realización de al menos 200 nucleótidos. The subsequence of the nucleotides mentioned above in (a) may be at least 100 nucleotides, or in another embodiment at least 200 nucleotides. Además, la subsecuencia puede codificar un fragmento de polipéptido que posee una actividad proteasa. Moreover, the subsequence may encode a polypeptide fragment that has protease activity.

Las secuencias de ácidos nucleicos de (a) o (b) más arriba, así como las secuencias de aminoácidos maduros correspondientes a las SEC ID Nº: 2, 8, 10, o 12, o un fragmento de éstas, pueden ser usadas para diseñar una sonda de ácido nucleico para identificar y clonar polipéptidos codificantes de ADN que poseen una actividad proteasa a partir de cepas de diferentes géneros o especies según los métodos bien conocidos en la técnica. The nucleic acid sequences of (a) or (b) above, and sequences corresponding mature amino acids to SEQ ID NO: 2, 8, 10, or 12, or a fragment thereof, may be used to design nucleic acid probe to identify and clone DNA encoding polypeptides having protease activity from strains of different genera or species according to methods well known in the art. En particular, tales sondas pueden ser usadas para una hibridación con el ADNc o genómico del género o especie de interés, siguiendo los procedimientos estándares de transferencia de Southern, para identificar y aislar el gen correspondiente de interés. In particular, such probes can be used for hybridization with the genomic or cDNA of the genus or species of interest, following standard Southern blotting procedures, to identify and isolate the corresponding gene of interest. Tales sondas pueden ser considerablemente más cortas que la secuencia entera, pero deberían ser de al menos 15, preferiblemente de al menos 25, y más preferiblemente de al menos 35 nucleótidos de longitud. Such probes can be considerably shorter than the entire sequence, but should be at least 15, preferably at least 25, and more preferably at least 35 nucleotides in length. También se puede usar sondas más largas. You can also use longer probes. Ambas sondas de ADN y ARN pueden ser usadas. Both DNA and RNA probes can be used. Las sondas son marcadas normalmente para detectar el gen correspondiente (por ejemplo, con ^{32}P, ^{3}H, ^{35}S, biotina o avidina). The probes are typically labeled for detecting the corresponding gene (for example, ^ {32} P ^ {3} H, ^ {35} S, biotin, or avidin). Tales sondas están incluidas en la presente invención. Such probes are encompassed by the present invention.

De esta manera, una librería de ADN genómico o de ADNc obtenida a partir de este otro tipo de organismos puede ser visualizada para el ADN que se hibridiza con las sondas descritas anteriormente y que codifica un polipéptido que posee una actividad proteasa. Thus a genomic DNA library or cDNA obtained from this other organisms can be visualized for DNA that hybridizes with the probes described above and which encodes a polypeptide having protease activity. El ADN genómico u otro de estos otros organismos puede ser separado por electroforesis en gel de agarosa o de poliacrilamida, o mediante otras técnicas de separación. Genomic or other such other organisms may be separated by agarose gel electrophoresis or polyacrylamide, or by other separation techniques. El ADN de las librerías o el ADN separado pueden ser transferido hacia e inmovilizado en nitrocelulosa u otro material de soporte adecuado. The DNA from the libraries or the separated DNA may be transferred to and immobilized on nitrocellulose or other suitable carrier material. Para identificar un clon o ADN que es homólogo a cualquiera de las SEC ID Nº: 1, 7, 9, o 11, o una subsecuencia de la misma, el material de soporte es usado en una transferencia de Southern. To identify a clone or DNA which is homologous to any of SEQ ID NO: 1, 7, 9, or 11, or a subsequence thereof, the carrier material is used in a Southern blot. Para los objetivos de la presente invención, la hibridación indica que la secuencia de ácidos nucléicos se hibridiza en una sonda de ácido nucleico marcada correspondiendo a las secuencias de (a), (b) o (c) más arriba, en condiciones de astringencia muy baja a muy alta. For purposes of the present invention, hybridization indicates that the nucleic acid sequence hybridizes probe labeled nucleic acid corresponding to the sequences (a), (b) or (c) above, in stringency conditions very low to very high. Las moléculas, que la sonda de ácido nucleico hibridiza en estas condiciones, son detectadas por medio de una película de rayos X. Molecules, the nucleic acid probe hybridizes under these conditions are detected using a x-ray film

En una forma de realización particular, la sonda de ácido nucleico es una secuencia de ácidos nucléicos que codifica los aminoácidos 1 a 188 de SEC ID Nº: 2, 1 a 196 de SEC ID Nº: 8, 1 a 189 de SEC ID Nº: 10, y/o 1 a 188 de SEC ID Nº: 12, o subsecuencias de éstas. In a particular embodiment, the nucleic acid probe is a nucleic acid sequence encoding amino acids 1 to 188 of SEQ ID NO: 2, 1 to 196 of SEQ ID NO: 8, 1 to 189 of SEQ ID NO: 10, and / or 1 to 188 of SEQ ID NO: 12, or subsequences thereof. En otra forma de realización, la sonda de ácido nucleico es nucleótidos 499-1062 de SEC ID Nº: 1, 577- 1164 de SEC ID Nº: 7, 586-1152 de SEC ID Nº: 9, y/o 502-1065 de SEC ID Nº: 11 (las regiones codificantes de polipéptido maduro). In another embodiment, the nucleic acid probe is nucleotides 499-1062 of SEQ ID NO: 1 577- 1164 of SEQ ID NO: 7, 586-1152 of SEQ ID NO: 9, and / or 502-1065 of SEQ ID NO: 11 (the mature polypeptide coding regions).

Para sondas largas de al menos 100 nucleótidos de longitud, unas condiciones de astringencia muy baja a muy alta son definidas como la prehibridación y la hibridación a 42ºC en 5X de SSPE, 0,3% de SDS, 200 \mug/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado, yo bien 25% de formamida para astringencias muy bajas y bajas, 35% de formamida para astringencias medias y medias-altas, o 50% de formamida para astringencias altas y muy altas, siguiendo los procedimientos estándares de la transferencia de Southern. For long probes of at least 100 nucleotides in length, stringency conditions very low to very high are defined as prehybridization and hybridization at 42 in 5X SSPE, 0.3% SDS, 200 \ mug / ml DNA salmon sperm sheared and denatured, and either 25% formamide for very low and low stringencies, 35% formamide for medium stringencies medium-high, or 50% formamide for high and very high stringencies, following standard procedures Southern blotting.

Para sondas largas de al menos 100 nucleótidos de longitud, el material de soporte finalmente es lavado tres veces cada 15 minutos usando 0,2 x SSC, 0,2% de SDS, 20% de formamida preferiblemente al menos a 45ºC (astringencia muy baja), más preferiblemente al menos a 50ºC (astringencia baja), más preferiblemente al menos a 55ºC (astringencia media), más preferiblemente al menos a 60ºC (astringencia media-alta), incluso más preferiblemente al menos a 65ºC (astringencia alta), y de manera más preferida al menos a 70ºC (astringencia muy alta). For long probes of at least 100 nucleotides in length, the carrier material is finally washed three times each 15 minutes using 0.2 x SSC, 0.2% SDS, 20% formamide preferably at least at 45 (very low stringency ), more preferably at least at 50 (low stringency), more preferably at least at 55 (medium stringency), more preferably at least at 60 (medium-high stringency), even more preferably at least at 65 (high stringency), and more preferably at least at 70 (very high stringency) manner.

Para sondas cortas de aproximadamente 15 nucleótidos a aproximadamente 70 nucleótidos de longitud, las condiciones de astringencia son definidas como prehibridación, hibridación, y post-hibridación de lavado de 5ºC a 10ºC bajo la T_{m} calculada por medio del cálculo según Bolton y McCarthy (1962, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48:1390) en 0.9 M de NaCl, 0.09 M de Tris-HCl, pH 7,6, 6 mM de EDTA, 0,5% NP-40, solución de Denhardt IX, 1 mM de pirofosfato de sodio, 1 mM de fosfato monobásico de sodio, 0.1 mM de ATP, y 0,2 mg de ARN de levadura por ml siguiendo los procedimientos estándares de la transferencia de Southern. For short probes about 15 nucleotides to about 70 nucleotides in length, stringency conditions are defined as prehybridization, hybridization and post-hybridization wash of 5 ° C to 10 ° C under the T_ {m} calculated by the calculation according to Bolton and McCarthy (1962, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA 48: 1390) in 0.9 M NaCl, 0.09 M Tris-HCl, pH 7.6, 6 mM EDTA, 0.5% NP-40, IX Denhardt's solution , 1 mM sodium pyrophosphate, 1 mM sodium monobasic phosphate, 0.1 mM ATP, and 0.2 mg of yeast RNA per ml following standard procedures Southern blotting.

Para sondas cortas de aproximadamente 15 nucleótidos a aproximadamente 70 nucleótidos de longitud, el material portador es lavado una vez en 6X de SSC más 0,1% de SDS durante 15 minutos y dos veces cada 15 minutos usando 6X de SSC a 5ºC a 10ºC por debajo de la T_{m} calculada. For short probes about 15 nucleotides to about 70 nucleotides in length, the carrier material is washed once in 6X SSC plus 0.1% SDS for 15 minutes and twice every 15 minutes using 6X SSC at 5 ° C to 10 ° C below the T_ {m} calculated.

La presente invención expone también variantes del polipéptido que poseen una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 1 a 188 de SEC ID Nº: 2, 1 a 196 de SEC ID Nº: 8, 1 a 189 de SEC ID Nº: 10, y/o 1 a 188 de SEC ID Nº: 12, comprendiendo una sustitución, deleción, y/o inserción de uno o más aminoácidos. The present invention also discloses variants of the polypeptide having an amino acid sequence of amino acids 1 to 188 of SEQ ID NO: 2, 1 to 196 of SEQ ID NO: 8, 1 to 189 of SEQ ID NO: 10, and / or 1 to 188 of SEQ ID NO: 12 comprising a substitution, deletion and / or insertion of one or more amino acids.

Las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos variantes pueden diferir de la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 1 a 188 de SEC ID Nº: 2, 1 a 196 de SEC ID Nº: 8, 1 a 189 de SEC ID Nº: 10, y/o 1 a 188 de SEC ID Nº: 12, por una inserción o deleción de uno o más residuos aminoácidos y/o la sustitución de uno o más residuos aminoácidos por distintos residuos aminoácidos. The amino acid sequences of the variant polypeptides may differ from the amino acid sequence of amino acids 1 to 188 of SEQ ID NO: 2, 1 to 196 of SEQ ID NO: 8, 1 to 189 of SEQ ID NO: 10, and / or 1 to 188 of SEQ ID NO: 12 by an insertion or deletion of one or more amino acid residues and / or substitution of one or more amino acid residues by different amino acid residues. En una forma de realización particular, los cambios de aminoácidos son de menor importancia, lo que representa sustituciones de aminoácidos conservadores que no afectan de manera importante el plegamiento y/o actividad de la proteína; In a particular embodiment, amino acid changes are minor, representing conservative amino acid substitutions that do not significantly affect the folding and / or activity of the protein; deleciones pequeñas, normalmente de uno a aproximadamente 30 aminoácidos; small deletions, typically of one to about 30 amino acids; pequeñas extensiones de terminal amino o carboxilo, tal como un residuo de metionina de terminal amino; small amino terminal extensions or carboxyl, such as a methionine residue amino terminal; un péptido pequeño de hasta aproximadamente 20-25 residuos; a small peptide of up to about 20-25 residues; o una extensión pequeña que facilite la purificación cambiando la carga neta u otra función, tal como un tracto de polihistidina, un epítopo antigénico o un dominio de unión. or a small extension that facilitates purification by changing net charge or another function, such as a poly-histidine tract, an antigenic epitope or a binding domain.

Ejemplos de sustituciones conservadoras se encuentran en el grupo de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos acídicos (ácido glutámico y ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina y asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina y valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina), y aminoácidos pequeños (glicina, alanina, serina, treonina y metionina). Examples of conservative substitutions are within the group of basic amino acids (arginine, lysine and histidine), acidic amino acids (glutamic acid and aspartic acid), polar amino acids (glutamine and asparagine), hydrophobic amino acids (leucine, isoleucine and valine), aromatic amino acids (phenylalanine, tryptophan and tyrosine), and small amino acids (glycine, alanine, serine, threonine and methionine). De esta manera, por ejemplo, la invención se refiere a un polipéptido que posee, o comprende, una secuencia tal y como se ha expuesto en las partes de péptido maduro de cualquiera de las SEC ID Nº: 2, 8, 10, o 12, donde las sustituciones de aminoácido conservadoras incluyen reemplazos, unos por otros, entre los aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), entre los aminoácidos acídicos (ácido glutámico y ácido aspártico), entre los aminoácidos polares (glutamina y asparagina), entre los aminoácidos hidrofóbicos (alanina, leucina, isoleucina, y valina), entre los aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina), y entre los aminoácidos pequeños (glicina, alanina, serina, treonina y metionina), o cualquier combinación o fragmentos activo de éstos. Thus, for example, the invention relates to a polypeptide having, or comprising, a sequence as set forth in parts mature peptide of any of SEQ ID NO: 2, 8, 10, or 12 where conservative amino acid substitutions include replacements, one for another, among the basic amino acids (arginine, lysine and histidine), among the acidic amino acids (glutamic acid and aspartic acid), among the polar amino acids (glutamine and asparagine), among hydrophobic amino acids (alanine, leucine, isoleucine, and valine), among the aromatic amino acids (phenylalanine, tryptophan and tyrosine), and among the small amino acids (glycine, alanine, serine, threonine and methionine), or any combination or active fragments thereof . Las sustituciones de aminoácido que generalmente no alteran la actividad específica son conocidas en la técnica y han sido descritas, por ejemplo, por H. Neurat y RL Hill, 1979, en, The Proteins, Academic Press, New York. Amino acid substitutions which do not generally alter the specific activity are known in the art and are described, for example, by H. Neurat and RL Hill, 1979, In, The Proteins, Academic Press, New York. Los cambios que ocurren más frecuentemente son Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Nal, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Nal, Ala/Glu, y Asp/Gly así como los mismos al revés. The changes that occur most frequently are Ala / Ser, Val / Ile, Asp / Glu, Thr / Ser, Ala / Gly, Ala / Thr, Ser / Asn, Ala / Nal, Ser / Gly, Tyr / Phe, Ala / Pro , Lys / Arg, Asp / Asn, Leu / Ile, Leu / Nal, Ala / Glu, and Asp / Gly as well as these in reverse.

En una forma de realización particular, los polipéptidos de la invención y para el uso según la invención son estables al ácido. In a particular embodiment, the polypeptides of the invention and for use according to the invention are acid stable. Para los objetivos de la presente, los términos estable al ácido significa que la actividad residual después de 2 horas de incubación a pH 2,0, pH 2,5 o pH 3,0 y 37ºC, es de al menos 50%, en comparación con la actividad residual de una muestra correspondiente incubada durante 2 horas a pH 9,0 y 5ºC. For purposes hereof, the terms acid-stable means that the residual activity after 2 hours of incubation at pH 2.0, pH 2.5 or pH 3.0 and 37 ° C, is at least 50%, compared the residual activity of a corresponding sample incubated for 2 hours at pH 9.0 and 5 ° C. En una forma de realización particular, la actividad residual es de al menos 60%, 70%, 80% o al menos 90%. In a particular embodiment, the residual activity is at least 60%, 70%, 80% or at least 90%. Un ensayo adecuado para determinar la estabilidad al ácido es el ensayo de estabilidad al pH del Ejemplo 2. A suitable assay for determining acid stability is the pH-stability assay of Example 2.

En otra forma de realización particular, los polipéptidos de la invención y para un uso según la invención tienen una actividad relativa a pH 7,0 de al menos 0,10, 0,15, 0,20, 0,25, 0,30 o al menos 0,35. In another particular embodiment, the polypeptides of the invention and for use according to the invention have a relative activity at pH 7.0 of at least 0.10, 0.15, 0.20, 0.25, 0.30 or at least 0.35. La prueba de perfil del pH del Ejemplo 2 es usada para la determinación. Test Example 2 pH profile is used for determination.

En otras formas de realización particulares también, los polipéptidos de la invención y para el uso según la invención poseen i) una actividad relativa a 60ºC y pH 9 de al menos 0,05, 0,10, 0,15 o al menos 0,19; In still further particular embodiment also, the polypeptides of the invention and for use according to the invention have i) a relative activity at 60 ° C and pH 9 of at least 0.05, 0.10, 0.15 or at least 0, 19; y/o ii) una actividad relativa a 70ºC de al menos 0,40, 0,50, o al menos 0,60. and / or ii) a relative activity at 70 ° C of at least 0.40, 0.50 or at least 0.60. La prueba de perfil de la temperatura del Ejemplo 2 es usada para estas determinaciones. The test temperature profile of Example 2 is used for these determinations.

El polipéptido de la invención y para el uso según la invención puede ser un polipéptido bacteriano o fúngico. The polypeptide of the invention and for use according to the invention may be a bacterial or fungal polypeptide. El polipéptido fúngico puede provenir de un hongo filamentoso o de una levadura. The fungal polypeptide may be from a filamentous fungus or a yeast.

En formas de realización particulares, el polipéptido de la invención es i) una proteasa bacteriana; In particular embodiments, the polypeptide of the invention is i) a bacterial protease; ii) una proteasa del Fylum Actinobacteria iii) de la clase Actinobacteria ; ii) a protease Fylum Actinobacteria iii) of the class Actinobacteria; iv) del orden de los Actinomicetales v) de la familia Nocardiopsaceae ; iv) the order Actinomycetales v) the family Nocardiopsaceae; vi) del género Nocardiopsis ; vi) of the genus Nocardiopsis; y/o una proteasa derivada de vii) las especies Nocardiopsis tales como Nocardiopsis alba, Nocardiopsis alkaliphila, Nocardiopsis antarctica, Nocardiopsis prasina, Nocardiopsis cornposta, Nocardiopsis exhalans, Nocardiopsis halophila, Nocardiopsis halotolerans, Nocardiopsis kunsanensis, Nocardiopsis listeri, Nocardiopsis lucentensis, Nocardiopsis metallicus, Nocardiopsis synnemataformans, Nocardiopsis trehalosi, Nocardiopsis tropica, Nocardiopsis umidischolae, Nocardiopsis xinjiangensis , o Nocardiopsis dassonvillei , por ejemplo Nocardiopsis dassonvillei , subeespecie dassonvillei DSM 43235, especie Nocardiopsis DSM 16424, o Nocardiopsis alba DSM 15647; and / or a protease derived from vii) Nocardiopsis species such as alba Nocardiopsis, alkaliphila Nocardiopsis antarctica Nocardiopsis, prasina Nocardiopsis, cornposta Nocardiopsis, exhalans Nocardiopsis, Nocardiopsis halophila, Nocardiopsis halotolerans, Nocardiopsis kunsanensis, Nocardiopsis listeri, lucentensis Nocardiopsis, Nocardiopsis metallicus, Nocardiopsis synnemataformans, Nocardiopsis trehalosi, Nocardiopsis tropica, Nocardiopsis umidischolae, Nocardiopsis xinjiangensis, or Nocardiopsis dassonvillei, Nocardiopsis dassonvillei eg, subeespecie dassonvillei DSM 43235, Nocardiopsis species DSM 16424, or Nocardiopsis alba DSM 15647; como un polipéptido con cualquiera de las secuencias de aminoácido maduro de SEC ID Nº: 2, 8, 10, y 12. En una forma de realización particular, la proteasa deriva de Nocardiopsis alba, Nocardiopsis antarctica , o Nocardiopsis dassonvillei. as a polypeptide with either of the mature amino acid sequences of SEQ ID NO: 2, 8, 10, and 12. In a particular embodiment, the protease derives from Nocardiopsis alba, Nocardiopsis antarctica, Nocardiopsis dassonvillei or.

La taxonomía anterior es conforme al capítulo: el plan de trabajo del manual por GM Garriti & JG Holt en Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 2001, segunda edición, volumen 1, David R. Bone, Richard W. Castenholz. The above taxonomy is according to chapter: the manual work plan by GM Garriti & JG Holt in Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 2001, second edition, Volume 1, David R. Bone, Richard W. Castenholz.

Se entenderá que para las especies mencionadas anteriormente, la invención incluye los estados perfecto e imperfecto, y otros equivalentes taxonómicos, por ejemplo, anamorfos, sin tener en cuenta el nombre de las especies por las que se conocen. It is understood that for the aforementioned species, the invention encompasses both the perfect and imperfect states, and other taxonomic equivalents, eg, anamorphs, regardless of the species name by which known. Aquellos expertos en la técnica reconocerán fácilmente la identidad de los equivalentes apropiados. Those skilled in the art will readily recognize the identity of appropriate equivalents.

Las cepas de estas especies son fácilmente accesibles al público en numerosas colecciones de cultivo, como la American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), y Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL). Strains of these species are readily accessible to the public in many culture collections such as American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), and Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).

Además, tales polipéptidos pueden ser identificados y obtenidos a partir de otras fuentes incluyendo microorganismos aislados de la naturaleza (por ejemplo, tierra, abonos, agua, etc.) mediante el uso de las sondas mencionadas más arriba. Furthermore, such polypeptides may be identified and obtained from other sources including microorganisms isolated from nature (eg, soil, composts, water, etc.) using the probes mentioned above. Las técnicas para aislar microorganismos de sus hábitats naturales son conocidas en el arte. Techniques for isolating microorganisms from natural habitats are known in the art. La secuencia de ácidos nucléicos pueden entonces ser derivada por medio de una selección de forma similar de una librería genómica o de ADNc de otro microorganismo. The nucleic acid sequence may then be derived by similarly selected from a genomic library or cDNA of another microorganism. Una vez que una secuencia de ácidos nucléicos de codificación de un polipéptido ha sido detectada con la(s) sonda(s), la secuencia puede ser aislada o clonada mediante técnicas conocidas por los especialistas en la materia (véase, por ejemplo, Sambrook et Al., 1989, supra ). Once a nucleic acid sequence encoding a polypeptide has been detected with the probe (s) (s), the sequence may be isolated or cloned by techniques known to those skilled in the art (see, e.g., Sambrook et al., 1989, supra).

Tal y como se define aquí, un polipéptido "aislado" es un polipéptido que no contiene esencialmente otros polipéptidos, por ejemplo, aproximadamente al menos 20% puro, preferiblemente aproximadamente al menos 40% puro, más preferiblemente aproximadamente 60% puro, aún más preferiblemente aproximadamente 80% puro, más preferiblemente aproximadamente 90% puro, y de forma aún más preferible aproximadamente 95% puro, determinado por SDS-PAGE. As defined herein, a polypeptide "isolated" is a polypeptide that is essentially free of other polypeptides, eg, at least about 20% pure, preferably at least about 40% pure, more preferably about 60% pure, even more preferably about 80% pure, more preferably about 90% pure, and still more preferably about 95% pure as determined by SDS-PAGE.

Los polipéptidos codificados por secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención incluyen también polipéptidos fusionados o polipéptidos de fusión divisibles donde otro polipéptido es fundido en el N-terminal o C-terminal del polipéptido o fragmento de éste. Polypeptides encoded by nucleic acid sequences of the present invention also include fused polypeptides or cleavable fusion which another polypeptide is fused at the N-terminus or C-terminus of the polypeptide or fragment thereof. Un polipéptido fusionado es producido por fusión de una secuencia de ácidos nucléicos (o de una parte de ésta) de codificación de otro polipéptido con una secuencia de ácidos nucléicos (o una parte de ésta) de la presente invención. A fused polypeptide is produced by fusing a nucleic acid sequence (or a portion thereof) encoding another polypeptide with a nucleic acid sequence (or a portion thereof) of the present invention. Las técnicas para producir polipéptidos de fusión son conocidas en el arte, por ejemplo por PCR, o por enlace de las secuencias codificantes para la codificación de los polipéptidos de tal forma que éstas estén dispuestas en trama y que la expresión del polipéptido fusionado esté controlado por el(los) mismo(s) promotor(es) y terminador. Techniques for producing fusion polypeptides are known in the art, for example by PCR, or by linkage of the coding sequences encoding the polypeptides so that they are arranged in frame and that expression of the fused polypeptide is controlled by (the) same (s) promoter (s) and terminator.

En otras formas de realización particulares también, la invención excluye una o más de las proteasas derivadas de (i) Nocardiopsis dassonvillei NRRL 18133 descrita en WO 88/03947; In still further particular embodiment also, the invention excludes one or more of the proteases derived from (i) Nocardiopsis dassonvillei NRRL 18133 described in WO 88/03947; (ii) especie Nocardiopsis cepa OPC-210 (FERM P-10508) descrita en JP 2-255081-A; (ii) Nocardiopsis species strain OPC-210 (FERM P-10508) described in JP-A 2-255081; (iii) cepa ZIMET 43647 de la especie Nocardiopsis dassonvillei descrita en DD 20043218. (iv) especie Nocardiopsis TOA-1 (FERM-P-18676), que está descrita en JP 2003284571; (iii) strain ZIMET 43647 of the species Nocardiopsis dassonvillei described in DD 20043218. (iv) Nocardiopsis species TOA-1 (FERM P-18676-), which is described in JP 2003284571; y/o (v) el ADN correspondiente. and / or (v) the corresponding DNA.

Secuencias de Ácidos Nucleicos Nucleic Acid Sequences

La presente invención se refiere también a ácidos nucleicos aislados que codifican un polipéptido de la presente invención. The present invention also relates to isolated nucleic acids encoding a polypeptide of the present invention. Las secuencias de ácidos nucleicos particulares de la invención son nucleótidos 499-1062 de SEC ID Nº: 1, 577-1164 de SEC ID Nº: 7, 586-1152 de SEC ID Nº: 9, y/o 502-1065 de SEC ID Nº: 11; Sequences particular nucleic acid of the invention are nucleotides 499-1062 of SEQ ID NO: 1, 577-1164 of SEQ ID NO: 7, 586-1152 of SEQ ID NO: 9, and / or 502-1065 of SEQ ID NO: 11; correspondientes a las regiones de codificación de polipéptido maduro de SEC ID Nº: 2, 8, 10, y 12, respectivamente. corresponding to the coding regions of the mature polypeptide of SEQ ID NO: 2, 8, 10, and 12, respectively. La presente invención incluye también secuencias de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido que posee la secuencia de aminoácidos de las partes de péptido maduro de cualquiera de las SEC ID Nº: 2, 8, 10, y 12, pero las cuales difieren de las partes correspondientes de SEC ID Nº: 1, 7, 9, y 11, respectivamente, en virtud de la degeneración del código genético. The present invention also includes nucleic acid sequences encoding a polypeptide having the amino acid sequence of parts of mature peptide of any of SEQ ID NO: 2, 8, 10, and 12, but which differ from the corresponding parts SEQ ID NO: 1, 7, 9, and 11, respectively, under the degeneracy of the genetic code. La presente invención se refiere también a subsecuencias de SEC ID Nº: 1 7, 9, y 11, que codifican fragmentos de SEC ID Nº: 2, 8, 10, y 12, respectivamente, que poseen una actividad proteasa. The present invention also relates to subsequences of SEQ ID NO: 1 7, 9, and 11, which encode fragments of SEQ ID NO: 2, 8, 10, and 12, respectively, which have protease activity.

Una subsecuencia de SEC ID Nº: 1 7, 9, y 11, es una secuencia de ácidos nucléicos englobada por SEC ID Nº: 1, 7, 9, y 11, respectivamente, excepto que uno o más nucleótidos del extremo 5' y/o 3' ha sido eliminado. A subsequence of SEQ ID NO: 1 7, 9, and 11, is a nucleic acid sequence encompassed by SEQ ID NO: 1, 7, 9, and 11, respectively, except that one or more nucleotides from the 5 'and / or 3 'has been removed. Preferiblemente, una subsecuencia contiene al menos 225 nucleótidos, más preferiblemente al menos 300 nucleótidos, incluso más preferiblemente al menos 375, 450, 500, 531, 600, 700, 800, 900 o 1000 nucleótidos. Preferably, a subsequence contains at least 225 nucleotides, more preferably at least 300 nucleotides, even more preferably at least 375, 450, 500, 531, 600, 700, 800, 900 or 1000 nucleotides.

La presente invención expone también secuencias de nucleótidos que poseen un grado de identidad para los nucleótidos 499-1062 de SEC ID Nº: 1 y/o 502-1065 de SEC ID Nº: 11 de al menos el 72%. The present invention also discloses nucleotide sequences which have a degree of identity to nucleotides 499-1062 of SEQ ID NO: 1 and / or 502-1065 of SEQ ID NO: 11 of at least 72%. En unas formas de realización particulares, el grado de identidad de cualquiera de estos nucleótidos es de al menos 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o de al menos 99%. In some particular embodiments, the degree of identity of any of these nucleotides is at least 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or at least 99%.

La presente invención expone también secuencias de ácidos nucleicos mutantes comprendiendo al menos una mutación en las partes codificantes de péptido maduro de cualquiera de las SEC ID Nº: 1 7, 9, o 11, donde la secuencia de ácidos nucléicos mutante codifica un polipéptido que (i) se compone de las partes de péptido maduro de cualquiera de las SEC ID Nº: 2, 8, 10, y 12, respectivamente, o (ii) es una variante de cualquiera de las secuencias de (i), donde la variante comprende una sustitución, deleción, y/o inserción de uno o más aminoácidos, o (iii) es una variante alélica de cualquiera de las secuencias de (i), o (iv) es un fragmento de cualquiera de las secuencias de (i). The present invention also discloses sequences of mutant nucleic acids comprising at least one mutation in the coding parts of the mature peptide of any of SEQ ID NO: 1 7, 9, or 11, wherein the sequence of mutant nucleic acid encoding a polypeptide ( i) consists of the parts of the mature peptide of any of SEQ ID NO: 2, 8, 10, and 12, respectively, or (ii) is a variant of any of the sequences of (i), where the variant comprises substitution, deletion and / or insertion of one or more amino acids, or (iii) is an allelic variant of any of the sequences of (i) or (iv) is a fragment of any of sequences (i).

Las técnicas usadas para aislar o clonar una secuencia de ácidos nucléicos de codificación de un polipéptido son conocidas en el estado de la técnica e incluyen el aislamiento de ADN genómico, la preparación de ADNc, o una combinación de éstos. The techniques used to isolate or clone a nucleic acid sequence encoding a polypeptide are known in the art and include isolation from genomic DNA, preparation from cDNA, or a combination thereof. La clonación de las secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención de tal ADN genómico puede ser efectuada, por ejemplo, usando la conocida reacción en cadena de polimerasa (PCR) o de la selección de anticuerpos de librerías de expresión para detectar fragmentos de ADN clonado con características estructurales compartidas. The cloning of the nucleic acid sequences of the present invention from such genomic DNA can be effected, for example, using the known polymerase chain reaction (PCR) or antibody screening of expression libraries to detect cloned DNA fragments with shared structural features. Véase, por ejemplo, Innis et al ., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York. See, for example, Innis et al, 1990, PCR. A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York. Se pueden usar otros procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos como la reacción en cadena de la ligasa (LCR), transcripción activada ligada (LAT) y amplificación basada en una secuencia de ácidos nucleicos (NASBA). They may be used other methods of nucleic acid amplification such as ligase chain reaction (LCR), ligated activated transcription (LAT) and a sequence-based amplification nucleic acid (NASBA). La secuencia de ácidos nucléicos puede ser clonada a partir de una cepa de Nocardiopsis u otra o de un organismo relacionado y por lo tanto, por ejemplo, puede ser un alélico o variante de especie de la región codificante de polipéptido de la secuencia de ácidos nucléicos. The nucleic acid sequence may be cloned from a strain of Nocardiopsis or another or related organism and thus, for example, may be an allelic or species variant of the polypeptide coding region of the nucleic acid sequence .

Los términos "secuencia de ácidos nucleicos" como se utiliza en este caso se refiere a una secuencia de ácidos nucléicos que es esencialmente libre de otras secuencias de ácidos nucleicos, por ejemplo, aproximadamente al menos 20% pura, preferiblemente aproximadamente al menos 40% pura, más preferiblemente aproximadamente al menos 60% pura, aún más preferiblemente aproximadamente al menos 80% pura, y de manera más preferida aproximadamente al menos 90% pura determinada por electroforesis de agarosa. The terms "nucleic acid sequence" as used herein refers to a nucleic acid sequence which is essentially free of other nucleic acid sequences, for example, at least about 20% pure, preferably at least about 40% pure , more preferably at least 60% pure, even more preferably at least 80% pure, and more preferably at least about 90% pure as determined by agarose electrophoresis. Por ejemplo, una secuencia de ácidos nucléicos aislada puede ser obtenida por medio de unos procedimientos de clonación estandar usados en ingeniería genética para recolocar la secuencia de ácidos nucléicos desde su ubicación natural hasta un sitio diferente donde se reproducirá. For example, a sequence of isolated nucleic acid can be obtained by means of standard cloning procedures used in genetic engineering to relocate the nucleic acid sequence from its natural location to a different site where it will be reproduced. Los procedimientos de clonación pueden implicar la escisión y el aislamiento de un fragmento de ácido nucleico deseado comprendiendo la secuencia de ácidos nucléicos de codificación del polipéptido, la inserción del fragmento en una molécula del vector, y la incorporación del vector recombinante en una célula huésped donde varias copias o clones de la secuencia de ácidos nucléicos serán replicadas. The cloning procedures may involve excision and isolation of a desired portion of a nucleic acid comprising the nucleic acid sequence encoding the polypeptide, insertion of the fragment into a vector molecule, and incorporation of the recombinant vector into a host cell where multiple copies or clones of the nucleic acid sequence will be replicated. La secuencia de ácidos nucléicos puede ser de origen genómico, de ADNc, ARN, semisintético, sintético, o de cualquier combinación de éstos. The nucleic acid sequence may be of genomic, cDNA, RNA, semisynthetic, synthetic origin, or any combination thereof.

Una modificación de una secuencia de ácidos nucléicos de codificación de un polipéptido de la presente invención puede ser necesaria para la síntesis de polipéptidos esencialmente similares al polipéptido. A modification of a nucleic acid sequence encoding a polypeptide of the present invention may be necessary for the synthesis of polypeptides substantially similar to the polypeptide. Los términos "esencialmente similares" al polipéptido se refieren a unas formas de polipéptido obtenidas de manera no natural. The terms "substantially similar" to the polypeptide refers to a polypeptide forms obtained unnaturally. Estos polipéptidos pueden diferir en una forma de ingeniería del polipéptido aislado de su fuente nativa, por ejemplo, variantes que difieren en una actividad específica, termostabilidad, pH óptimo, alergenicidad, o similar. These polypeptides may differ in a form of engineering isolated from its native source, eg, variants that differ in specific activity, thermostability, pH optimum, allergenicity, or the like polypeptide. La secuencia variante puede ser construida en base a la secuencia de ácidos nucléicos presentada como la parte codificante del polipéptido de SEC ID Nº: 1, 7, 9 y/u 11, por ejemplo, una subsecuencia de ésta, y/o por introducción de sustituciones de nucleótidos que no implican otra secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por la secuencia de ácidos nucléicos, sino que corresponden al uso del codón del organismo huésped destinado a la producción de la proteasa, o por introducción de sustituciones de nucleótido que pueden formar una secuencia de aminoácidos diferente. The variant sequence may be constructed based on the nucleic acid sequence presented as the polypeptide encoding part of SEQ ID NO: 1, 7, 9 and / or 11, eg, a subsequence thereof, and / or by introduction of nucleotide substitutions that do not involve another amino acid sequence of the polypeptide encoded by the nucleic acid sequence, but which correspond to the codon usage of the host organism intended for production of the protease, or by introduction of nucleotide substitutions which may form a sequence different amino acid. Para una descripción general de las sustituciones de nucleótidos, véase, por ejemplo, Ford et al ., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107. For a general description of nucleotide substitutions, see, e.g., Ford et al, 1991, Protein Expression and Purification 2:. 95-107. Los polipéptidos hipoalergénicos, por ejemplo, pueden ser preparados como se ha descrito anterior- Hypoallergenic polypeptides, for example, can be prepared as described previously
mente. mind.

Será evidente para los expertos en la técnica que tales sustituciones pueden realizarse fuera de las regiones criticas para la función de la molécula y seguir formando un polipéptido activo. It will be apparent to those skilled in the art that such substitutions can be made outside regions critical to the function of the molecule and continue to form an active polypeptide. Los residuos de aminoácidos esenciales para la actividad del polipéptido codificado por la secuencia de ácidos nucléicos aislada de la invención, y por lo tanto preferiblemente no sometida a una sustitución, pueden ser identificados según los procedimientos conocidos en la técnica, como una mutagénesis dirigida en el sitio o mutagénesis por barrido de alanina (véase, por ejemplo, Cunningham y Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). The amino acid residues essential to the activity of the polypeptide encoded by the nucleic acid sequence isolated from the invention, and therefore preferably not subject to substitution, may be identified according to procedures known in the art such as site-directed mutagenesis in the site or alanine-scanning mutagenesis (see, e.g., Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). En esta última técnica, las mutaciones son introducidas en cada residuo cargado positivamente en la molécula, y las moléculas mutantes resultantes son probadas para determinar una actividad proteasa para identificar residuos aminoácidos que son esenciales para la actividad de la molécula. In the latter technique, mutations are introduced at every positively charged residue in the molecule, and the resultant mutant molecules are tested for protease activity to determine a pinpoint amino acid residues that are critical to the activity of the molecule. Los sitios de interacción proteasa-sustrato pueden ser determinados también por análisis de la estructura tridimensional determinada por tales técnicas como el análisis de resonancia magnética nuclear, marcado por cristalografía o fotoafinidad (véase por ejemplo, de Vos et al ., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al ., 1992, Journal of Molecular Biology 224: 899-904; Wlodaver et al ., 1992, FEBS Letters 309: 59-64). Interaction sites protease-substrate can also be determined by analysis of the determined three - dimensional structure by such techniques as nuclear magnetic resonance, marked by crystallography or photoaffinity (see for example, de Vos et al, 1992, Science 255.: 306-312; Smith et al, 1992, Journal of Molecular Biology 224: 899-904; Wlodaver et al, 1992, FEBS Letters 309:. 59-64)..

También se describen aquí secuencias de ácidos nucleicos aisladas codificantes de un polipéptido de la presente invención, que se hibridizan en condiciones de astringencia muy baja, preferiblemente en condiciones de astringencia baja, más preferiblemente en condiciones de astringencia media, más preferiblemente en condiciones de astringencia media-alta, aún más preferiblemente en condiciones de astringencia alta, y más preferiblemente en condiciones de astringencia muy alta con una sonda de ácidos nucleicos que se hibridiza en las mismas condiciones con la secuencia de ácidos nucléicos, preferiblemente la parte codificante de péptido maduro de cualquiera de las SEC ID Nº: 1 7, 9, u 11, o de sus cadenas complementarias; here sequences isolated nucleic acid encoding a polypeptide of the present invention, which hybridize under very low stringency conditions, preferably low stringency conditions, more preferably medium stringency conditions, more preferably medium stringency conditions are also described -high, even more preferably high stringency conditions, and most preferably under very high stringency with a nucleic acid probe which hybridizes under the same conditions with the nucleic acid sequence, preferably the mature peptide encoding part of any SEQ ID NO: 1 7, 9, or 11, or their complementary strands; o variantes alélicas y subsecuencias de éstas (Sambrook et al ., 1989, supra ), tal como se define aquí. or allelic variants and subsequences thereof (Sambrook et al., 1989, supra), as defined herein.

También se describen aquí secuencias de ácidos nucleicos aisladas producidas por (a) hibridación de un ADN en condiciones de astringencia muy baja, baja, media, media-alta, alta, o muy alta con (i) nucleótidos 499-1062 de SEC ID Nº: 1, 577-1164 de SEC ID Nº: 7, 586-1152 de SEC ID Nº: 9, y/o 502-1065 de SEC ID Nº: 11, (ii) una subsecuencia de (i), o (iii) una cadena complementaria de (i), o (ii); here nucleic acid sequences isolated produced by (a) hybridizing a DNA under very low, low, medium, medium-high, high, or very high stringency conditions with (i) nucleotides 499-1062 of SEQ ID NO: are also disclosed : 1, 577-1164 of SEQ ID NO: 7, 586-1152 of SEQ ID NO: 9, and / or 502-1065 of SEQ ID NO: 11, (ii) a subsequence of (i) or (iii) a complementary strand of (i) or (ii); y (b) aislamiento de la secuencia de ácidos nucléicos. and (b) isolating the nucleic acid sequence. La subsecuencia es preferiblemente una secuencia de al menos 100 nucleótidos tal como una secuencia que codifica un fragmento de polipéptido que posee una actividad proteasa. The subsequence is preferably a sequence of at least 100 nucleotides such as a sequence encoding a polypeptide fragment which has protease activity.

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 
Métodos para producir secuencias de ácidos nucléicos mutantes Methods of producing mutant sequences nucleic acid

La presente invención expone también métodos para producir una secuencia de ácidos nucléicos mutante, comprendiendo la introducción de al menos una mutación en la secuencia codificante de polipéptido maduro de cualquiera de las SEC ID Nº: 1, 7, 9, u 11, o una subsecuencia de éstas, donde la secuencia de ácidos nucléicos mutante codifica un polipéptido que consiste en los péptidos maduros de cualquiera de las SEC ID Nº: 2, 8, 10, o 12, respectivamente; The present invention also discloses methods for producing a sequence of mutant nucleic acids, comprising introducing at least one mutation in the coding sequence for mature polypeptide of any of SEQ ID NO: 1, 7, 9, or 11, or a subsequence thereof, wherein the sequence of mutant nucleic acids encoding a polypeptide consisting of the mature peptides of either of SEQ ID NOs: 2, 8, 10, or 12, respectively; o un fragmento de éste que posee una actividad proteasa. or a fragment thereof having protease activity.

La introducción de una mutación en la secuencia de ácidos nucléicos para cambiar un nucleótido por otro nucleótido puede ser realizada por mutagénesis dirigida por medio de cualquier método conocido en la técnica. The introduction of a mutation in the nucleic acid sequence to switch one nucleotide for another nucleotide may be accomplished by site directed mutagenesis by any method known in the art. Resulta particularmente útil el procedimiento en el que se utiliza un vector de ADN bicatenario superenrollado con un inserto de interés y dos iniciadores sintéticos conteniendo la mutación deseada. It is the procedure in which a vector supercoiled dsDNA with an insert of interest and two synthetic primers containing the desired mutation is used particularly useful. Los iniciadores oligonucleótidos, cada uno complementario de unas cadenas opuestas del vector, se extienden durante una variación cíclica de la temperatura mediante una polimerasa de ADN Pfu . The oligonucleotide primers, each complementary to opposite strands a vector, extend during a cyclic variation of temperature using a Pfu DNA polymerase. Con la incorporación de los iniciadores, se genera un plásmido mutado conteniendo cortes fraccionados. With the addition of the initiators, a plasmid containing mutated fractionated cuts is generated. Después de la variación cíclica de la temperatura, el producto es tratado con DpnI que es específico al ADN metilado y hemimetilado para digerir el molde de ADN progenitor y seleccionar el ADN sintetizado conteniendo la mutación. After the cyclic variation of temperature, the product is treated DpnI which is specific to methylated and hemimethylated DNA to digest the parental DNA template and select mutation - containing synthesized DNA. Se pueden usar también otros procedimientos conocidos en el estado de la técnica. They can also be used other known processes in the prior art.

Constructos de ácidos nucleicos Nucleic acid constructs

La presente invención se refiere también a constructos de ácidos nucleicos comprendiendo una secuencia de ácidos nucléicos de la presente invención enlazada operativamente con una o más secuencias de control que dirigen la expresión de la secuencia codificante en una célula huésped adecuada en condiciones compatibles con las secuencias de control. The present invention also relates to nucleic acid constructs comprising a nucleic acid sequence of the present invention operably linked to one or more control sequences that direct expression of the coding sequence in a suitable host cell under conditions compatible with the sequences control. Se entenderá con la expresión que se incluye cualquier fase implicada en la producción del polipéptido incluyendo, pero no limitándose a éstos, la transcripción, modificación postranscripcional, traslación, modificación postraslaccional, y secreción. It is understood from the expression that any step involved in the production of the polypeptide including include, but not limited to, transcription, post-transcriptional modification, translation, postraslaccional modification, and secretion.

"Constructo de ácido nucleico" es definido aquí como una molécula de ácido nucleico, sea de una sola o de doble cadena, que es aislado de un gen producido naturalmente o que ha sido modificado para contener segmentos de ácido nucleico combinados y superpuestos en una forma tal que éstos, en una forma distinta, no existirían en la naturaleza. "Nucleic acid construct" is defined herein as a nucleic acid molecule, either single- or double-stranded, which is isolated from a gene naturally or which has been modified to contain segments of nucleic acid combined and juxtaposed in a manner such that these, in a form not exist in nature. Los términos constructo de ácido nucléico es sinónimo de los términos cassette de expresión cuando el constructo de ácido nucléico contiene todas las secuencias de control requeridas para la expresión de una secuencia codificante de la presente invención. The terms nucleic acid construct is synonymous with the terms expression cassette when the nucleic acid construct contains all the control sequences required for expression of a coding sequence of the present invention. Los términos "secuencia codificante" son definidos aquí como una secuencia de ácidos nucléicos que especifica directamente la secuencia de aminoácidos de su producto proteico. The terms "coding sequence" are defined herein as a nucleic acid sequence which directly specifies the amino acid sequence of its protein product. Los limites de la secuencia codificante son determinados generalmente por un sitio de unión de ribosoma (procariotas) o por el codón de inicio ATG (eucariotas) localizado exactamente arriba del marco de lectura abierto en el extremo 5' del ARNm y una secuencia terminadora de transcripción localizada exactamente debajo del marco de lectura abierto en el extremo 3' del ARNm. The boundaries of the coding sequence are generally determined by a binding site of the ribosome (prokaryotes) or by the ATG start codon (eukaryotes) located just above the open reading frame at the 5 'end of the mRNA and a transcription terminator sequence located just below the open reading frame at the 3 'end of the mRNA. Una secuencia codificante puede incluir, pero no se limita a éstos, ADN, ADNc, y secuencias de ácidos nucleicos recombinantes. A coding sequence can include, but is not limited to, DNA, cDNA, and recombinant nucleic acid sequences.

Una secuencia de ácidos nucléicos aislada de codificación de un polipéptido de la presente invención puede ser manipulada en una variedad de formas proporcionadas para la expresión del polipéptido. An isolated nucleic acid sequence encoding a polypeptide of the present invention may be manipulated in a variety of forms provided for polypeptide expression. La manipulación de la secuencia de ácidos nucléicos antes de su inserción en un vector puede ser deseable o necesaria dependiendo del vector de expresión. Manipulation of the nucleic acid sequence prior to its insertion into a vector may be desirable or necessary depending on the expression vector. Las técnicas para modificar las secuencias de ácidos nucleicos utilizando métodos de ADN recombinante son bien conocidos en la técnica. The techniques for modifying nucleic acid sequences utilizing recombinant DNA methods are well known in the art.

Se entiende que los términos "secuencias de control" incluyen aquí todos los componentes necesarios o ventajosos para la expresión de un polipéptido de la presente invención. It is understood that the terms "control sequences" include here all necessary or advantageous for the expression of a polypeptide of the present invention components. Cada secuencia de control puede ser nativa o extraña a la secuencia de ácidos nucléicos codificante del polipéptido. Each control sequence may be native or foreign to the nucleic acid sequence encoding the polypeptide. Tales secuencias de control incluyen, pero sin limitarse a ellos, una guía, una secuencia de poliadenilación, una secuencia de propéptido, un promotor, una secuencia de péptido señal, y un terminador de transcripción. Such control sequences include, but are not limited to, a leader, a polyadenylation sequence, a propeptide sequence, promoter, signal peptide sequence, and transcription terminator. Como mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor, y una señales de parada transcripcional y traslacional. At least the control sequences include a promoter, and transcriptional and translational signals stop. Las secuencias de control pueden estar provistas de enlaces con el fin de introducir unos sitios de restricción específicos que faciliten la ligadura de las secuencias de control con la región codificante de la secuencia de ácidos nucléicos de codificación de un polipéptido. The control sequences may be provided with linkers to introduce a specific restriction sites facilitating ligation of the control sequences with the coding region of the nucleic acid sequence encoding a polypeptide. Los términos "enlazado operativamente" son definidos aquí como una configuración donde una secuencia de control está dispuesta de manera apropiada en una posición relativa a la secuencia codificante de la secuencia de ADN para que la secuencia de control dirija la expresión de un polipéptido. The terms "operably linked" are defined herein as a configuration in which a control sequence is appropriately arranged in a position relative to the coding sequence of the DNA sequence to the control sequence directs the expression of a polypeptide.

La secuencia de control puede ser una secuencia promotora apropiada, una secuencia de ácidos nucléicos reconocida por una célula huésped para la expresión de la secuencia de ácidos nucléicos. The control sequence may be an appropriate promoter sequence, a nucleic acid sequence recognized by a host cell for expression of the nucleic acid sequence. La secuencia promotora contiene secuencias de control transcripcionales que median la expresión del polipéptido. The promoter sequence contains transcriptional control sequences which mediate the expression of the polypeptide. El promotor puede ser cualquier secuencia de ácidos nucléicos que muestra una actividad transcripcional en la célula huésped seleccionada incluyendo promotores mutantes, truncados, e híbridos, y puede ser obtenido a partir de genes de codificación de polipéptidos extracelulares o intracelulares sean homólogos o heterólogos a la célula huésped. The promoter may be any nucleic acid sequence which shows transcriptional activity in the host cell selected including mutant, truncated, and hybrid promoters, and may be obtained from genes encoding extracellular or intracellular polypeptides are homologous or heterologous to the cell Guest.

Unos ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de los constructos de ácidos nucleicos de la presente invención, especialmente en una célula huésped bacteriana, son los promotores obtenidos a partir del operón lac de E. coli , gen de agarasa de Streptomyces coelicolor (dagA), gen de levansucrasa de Bacillus subtilis (sacB), Gen de alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (amyL), Gen de amilasa maltogénico de Bacillus stearothermophilus (amyM), gen de alfa-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), Gen de lactamasa de Bacillus licheniformis (penP), genes de Bacillus subtilis xyIA y xyIB, y gen de beta-lactamasa procariótico (Villa-Kamaroff et al ., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 3727-3731), así como el promotor tac (DeBoer et al ., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80: 21-25). Examples of suitable promoters for directing the transcription of the nucleic acid constructs of the present invention, especially in a bacterial host cell, are the promoters obtained from the lac operon of E. coli, gene Streptomyces coelicolor agarase (dagA) gene, Bacillus subtilis levansucrase (sacB), Gen alpha-amylase from Bacillus licheniformis (amyL), maltogenic amylase gene from Bacillus stearothermophilus (amyM) gene, alpha-amylase from Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), lactamase gene from Bacillus licheniformis (penP), Bacillus subtilis xylA gene and xyIB, and beta-lactamase gene prokaryotic (Villa-Kamaroff et al, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. USA 75: 3727-3731) and the promoter tac (DeBoer et al, 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. USA 80: 21-25). Otros promotores están descritos en "Useful proteins from recombinant bacteria" en Scientific American, 1980, 242: 74-94; Other promoters are described in "Useful proteins from recombinant bacteria" in Scientific American, 1980, 242: 74-94; y en Sambrook et al ., 1989, supra . and in Sambrook et al., 1989, supra.

Unos ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de los constructos de ácido nucleico de la presente invención en una célula huésped de hongo filamentoso son promotores obtenidos a partir de los genes para la amilasa TAKA de Aspergillus oryzae , proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei , alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger , alfa-amilasa estable ácida de Aspergillus niger , glucoamilasa de Aspergillus niger o de Aspergillus awamori (glaA), lipasa de Rhizomucor miehei , proteasa alcalina de Aspergillus oryzae , isomerasa de fosfato triosa de Aspergillus oryzae , acetamidasa de Aspergillus nidulans , y proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), así como el promotor NA2-tpi (un híbrido de los promotores de los genes para la alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger e isomerasa fosfato triosa de Aspergillus oryzae ), y promotores mutantes, truncados, e híbridos de éstos. Examples of suitable promoters for directing the transcription of the nucleic acid constructs of the present invention in a filamentous fungal host cell are promoters obtained from the genes for Aspergillus oryzae TAKA amylase, Rhizomucor miehei aspartic proteinase, alpha- amylase Aspergillus niger neutral alpha-amylase acid stable Aspergillus niger, Aspergillus niger glucoamylase or Aspergillus awamori (glaA), Rhizomucor miehei lipase, alkaline protease from Aspergillus oryzae, triose phosphate isomerase Aspergillus oryzae, Aspergillus nidulans acetamidase and trypsin - like protease from Fusarium oxysporum (WO 96/00787), as well as the NA2-tpi promoter (a hybrid of the promoters from the genes for alpha-amylase and Aspergillus niger neutral triose phosphate isomerase Aspergillus oryzae), and mutant, truncated, and hybrid promoters thereof.

En un huésped de levadura, los promotores útiles son obtenidos a partir de los genes para la enolasa de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), galactocinasa de Saccharomyces cerevisiae (GAL1), dehidrogenasa de dehidrogenasa/gliceraldehido-3-fosfato de alcohol de Saccharomyces cerevisiae (ADH2/GAP), y kinasa de 3-fosfoglicerato de Saccharomyces cerevisiae . In a yeast host, useful promoters are obtained from the genes for Saccharomyces cerevisiae enolase (ENO-1), galactokinase of Saccharomyces cerevisiae (GAL1) dehydrogenase dehydrogenase / glyceraldehyde-3-phosphate alcohol Saccharomyces cerevisiae (ADH2 / GAP), and 3-phosphoglycerate kinase of Saccharomyces cerevisiae. Otros promotores útiles para las células huéspedes de levadura son descritos por Romanos et al ., 1992, Yeast 8: 423-488. Other useful for yeast host cells are described by promoters Romanos et al, 1992, Yeast 8:. 423-488.

La secuencia de control también puede ser una secuencia terminadora de transcripción adecuada, una secuencia reconocida por una célula huésped para terminar la transcripción. The control sequence may also be a suitable transcription terminator sequence, a sequence recognized by a host cell to terminate transcription. La secuencia terminadora es enlazada operativamente al terminal 3' de la secuencia de ácidos nucléicos de codificación del polipéptido. The terminator sequence is operably linked to the 3 'terminus of the nucleic acid sequence encoding the polypeptide. Cualquier terminador que sea funcional en la célula huésped seleccionada puede ser usada en la presente invención. Any terminator which is functional in the selected host cell may be used in the present invention.

Los terminadores preferidos para las células huéspedes de hongo filamentoso son obtenidos a partir de los genes para la amilasa TAKA de Aspergillus oryzae , glucoamilasa de Aspergillus niger , sintasa antranilata de Aspergillus nidulans , alfa-glucosidasa de Aspergillus niger , y proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum . The preferred host cells filamentous fungal terminators are obtained from the genes for TAKA amylase Aspergillus oryzae, Aspergillus niger glucoamylase, synthase antranilata Aspergillus nidulans, alpha-glucosidase from Aspergillus niger, and trypsin - like protease of Fusarium oxysporum.

Los terminadores preferidos para células huéspedes de levadura son obtenidos a partir de los genes para la enolasa de Saccharomyces cerevisiae , citocromo de Saccharomyces cerevisiae C (CYC1), y dehidrogenasa de gliceraldehido-3-fosfato de Saccharomyces cerevisiae . Preferred yeast host cells for terminators are obtained from the genes for Saccharomyces cerevisiae enolase, Saccharomyces cerevisiae cytochrome C of (CYC1), and glyceraldehyde dehydrogenase-3-phosphate Saccharomyces cerevisiae. Otros terminadores útiles para las células huéspedes de levadura son descritos por Romanos et al ., 1992, supra . Other useful terminators for yeast host cells are described by Romanos et al., 1992, supra.

Los terminadores preferidos para células huéspedes bacterianas, como una célula huésped de Bacillus , son los terminadores del gen de alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (amyL), el gen de amilasa maltogénico de Bacillus stearothermophilus (amyM), o el gen de alfa-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ). Preferred for bacterial host cells, such as a Bacillus host cell, terminators are terminators of the alpha-amylase from Bacillus licheniformis (amyL), the maltogenic amylase gene from Bacillus stearothermophilus (amyM), or the gene for alpha-amylase Bacillus amyloliquefaciens (amyQ).

La secuencia de control también puede ser una secuencia guía adecuada, una región no trasladada de un ARNm que es importante para la traslación por la célula huésped. The control sequence may also be a suitable leader sequence, a nontranslated region of an mRNA which translated is important for translation by the host cell. La secuencia guía es enlazada operativamente al terminal 5' de la secuencia de ácidos nucléicos de codificación del polipéptido. The leader sequence is operably linked to the 5 'terminus of the nucleic acid sequence encoding the polypeptide. Cualquier secuencia guía funcional en la célula huésped seleccionada puede ser usada en la presente invención. Any leader sequence functional in the selected host cell may be used in the present invention.

Los líderes preferidos para células huéspedes de hongo filamentoso son obtenidos a partir de los genes para la amilasa TAKA de Aspergillus oryzae y triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans . Preferred host cells for filamentous fungus leaders are obtained from the genes for Aspergillus oryzae TAKA amylase triose phosphate isomerase and Aspergillus nidulans.

Los líderes adecuados para células huéspedes de levadura son obtenidos a partir de los genes para la enolasa de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), fosfoglicerato kinasa de Saccharomyces cerevisiae , alfa-factor de Saccharomyces cerevisiae , y dehidrogenasa de dehidrogenasa/gliceraldehido-3-fosfato de alcohol de Saccharomices cerevisiae (ADH2/GAP). Suitable leaders for yeast host cells are obtained from the genes for Saccharomyces cerevisiae enolase (ENO-1), phosphoglycerate kinase, Saccharomyces cerevisiae alpha-factor from Saccharomyces cerevisiae, and dehydrogenase dehydrogenase / glyceraldehyde-3-phosphate Saccharomyces cerevisiae alcohol (ADH2 / GAP).

La secuencia de control también puede ser una secuencia de poliadenilación, una secuencia enlazada operativamente al terminal 3' de la secuencia de ácidos nucléicos, la cual, cuando es transcrita, es reconocida por la célula huésped como una señal para la adición de residuos de poliadenosina al ARNm transcrito. The control sequence may also be a polyadenylation sequence, a sequence operably linked to the 3 'terminus of the nucleic acid sequence which, when transcribed, is recognized by the host cell as a signal for addition of polyadenosine residues to transcribed mRNA. Cualquier secuencia de poliadenilación que sea funcional en la célula huésped de elección puede ser usada en la presente invención. Any polyadenylation sequence which is functional in the host cell of choice may be used in the present invention.

Las secuencias de poliadenilación preferidas para células huéspedes de hongo filamentoso son obtenidas a partir de los genes para la amilasa TAKA de Aspergillus oryzae , glucoamilasa de Aspergillus niger , antranilato sintasa de Aspergillus nidulans , proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum , y nigeralfa-glucosidasa de Aspergillus . The Preferred polyadenylation sequences for host cells filamentous fungus are obtained from the genes for TAKA amylase Aspergillus oryzae, Aspergillus niger glucoamylase, anthranilate synthase , Aspergillus nidulans, trypsin - like protease from Fusarium oxysporum, and nigeralfa-glucosidase aspergillus.

Las secuencias de poliadenilación útiles para células huéspedes de levadura están descritas por Guo y Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15: 5983-5990. Useful polyadenylation sequences for yeast host cells are described by Guo and Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15: 5983-5990.

La secuencia de control también puede ser una región codificante de péptido señal que codifica una secuencia de aminoácidos enlazada al terminal amino de un polipéptido y dirige el polipéptido codificado en la vía secretora de la célula. The control sequence may also be a signal peptide coding region encoding an amino acid sequence linked to the amino terminus of a polypeptide and directs the encoded polypeptide into the secretory pathway of the cell. El extremo 5' de la secuencia codificante de la secuencia de ácidos nucléicos puede contener de forma intrínseca una región codificante de péptido señal enlazada naturalmente en un marco de lectura de traslación con el segmento de la región codificante que codifica el polipéptido segregado. The 5 'end of the coding sequence of the nucleic acid sequence may inherently contain a coding region naturally linked in signal peptide reading frame with the segment translation of the coding region which encodes the secreted polypeptide. De forma alternativa, el extremo 5' de la secuencia codificante puede contener una región codificante de péptido señal que es extraña a la secuencia codificante. Alternatively, the 5 'end of the coding sequence may contain a signal peptide coding region which is foreign to the coding sequence. La región codificante extraña de péptido señal puede ser requerida en el sitio donde la secuencia codificante no contenga naturalmente una región codificante de péptido señal. The foreign signal peptide coding region may be required on the site where the coding sequence does not naturally contain a signal peptide coding region. De forma alternativa, la región codificante extraña del péptido señal simplemente puede reemplazar la región codificante natural del péptido señal con el fin de aumentar la secreción del polipéptido. Alternatively, the foreign signal peptide coding region may simply replace the natural signal peptide coding region in order to enhance secretion of the polypeptide. No obstante, cualquier región codificante del péptido señal que dirija el polipéptido expresado dentro de la vía secretora de una célula huésped de selección puede ser usada en la presente However, any signal peptide coding region which directs the expressed polypeptide into the secretory pathway of a host cell of choice may be used in the present
invención. invention.

Las regiones codificantes de péptido señal eficaces para células huéspedes bacterianas son las regiones codificantes de péptido señal obtenidas a partir de los genes para la amilasa maltogénica de Bacillus NCIB 11837, alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus , subtilisina de Bacillus licheniformis , alfa-amilasa de Bacillus licheniformis , proteasas neutrales de Bacillus stearothermophilus (nprT, nprS, nprM), y Bacillus subtilis prsA. Coding regions Effective signal peptide for bacterial host cells are the coding regions of the signal peptide obtained from the genes for the maltogenic amylase from Bacillus NCIB 11837, alpha-amylase from Bacillus stearothermophilus, Bacillus licheniformis alpha-amylase Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus neutral proteases (nprT, nprS, nprM), and Bacillus subtilis prsA. Otros péptidos señal son descritos por Simonen y Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137. Further signal peptides are described by Simonen and Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.

Las regiones codificantes de péptido señal eficaces para células huéspedes de hongo filamentoso son las regiones codificantes de péptido señal obtenidas a partir de los genes para la amilasa TAKA de Aspergillus oryzae , amilasa neutra de Aspergillus niger , glucoamilasa de Aspergillus niger , proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei , celulasa de Humicola insolens , y lipasa de Humicola lanuginosa . Coding regions Effective signal peptide for host cells filamentous fungus are the coding regions of the signal peptide obtained from the genes for TAKA amylase Aspergillus oryzae neutral amylase, Aspergillus niger, Aspergillus niger glucoamylase, aspartic proteinase from Rhizomucor miehei , Humicola insolens cellulase, and Humicola lanuginosa lipase.

Los péptidos señal útiles para células huéspedes de levadura son obtenidos a partir de los genes para un factor alfa de Saccharomyces cerevisiae e invertasa de Saccharomyces cerevisiae . Useful signal peptides for yeast host cells are obtained from the genes for Saccharomyces cerevisiae alpha - factor and invertase from Saccharomyces cerevisiae. Otras regiones codificantes de péptido señal útiles son descritas por Romanos et al ., 1992, supra . Other coding regions useful signal peptide are described by Romanos et al., 1992, supra.

La secuencia de control también puede ser una región codificante de propéptido que codifica una secuencia de aminoácidos situada en el terminal amino de un polipéptido. The control sequence may also be a propeptide coding region encoding an amino acid sequence positioned at the amino terminus of a polypeptide. El polipéptido resultante es conocido como una proenzima o propolipéptido (o un zimógeno en algunos casos). The resultant polypeptide is known as a proenzyme or propolypeptide (or a zymogen in some cases). Un propolipéptido es generalmente inactivo y pueden convertirse en un polipéptido activo maduro por seccionamiento catalítico o autocatalítico del propéptido a partir del propolipéptido. A propolypeptide is generally inactive and can be converted to a mature active polypeptide by catalytic or autocatalytic propeptide from the propolypeptide. La región codificante de propéptido puede ser obtenida a partir de los genes para la proteasa alcalina de Bacillus subtilis (aprE), proteasa neutra de Bacillus subtilis (nprT), alfa-factor de Saccharomyces cerevisiae , proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei y lacasa de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836). The coding region of propeptide may be obtained from the genes for laccase alkaline protease from Bacillus subtilis (aprE), neutral protease of Bacillus subtilis (nprT), alpha-factor from Saccharomyces cerevisiae, aspartic proteinase from Rhizomucor miehei and Myceliophthora thermophila (WO 95/33836).

En una forma de realización preferida, la región codificante de propéptido está constituida por nucleótidos 1-498 de SEC ID Nº: 1 que codifican los aminoácidos -166 a -1 de SEC ID Nº: 2, nucleótidos 82-576 de SEC ID Nº: 7 que codifican aminoácidos -165 a -1 de SEC ID Nº: 8, nucleótidos 88-585 de SEC ID Nº: 9 que codifican aminoácidos -166 a -1 de SEC ID Nº: 10, y nucleótidos 1-501 de SEC ID Nº: 11 que codifican aminoácidos -167 a -1 de SEC ID Nº: 12. In a preferred embodiment, the propeptide coding region is nucleotides 1-498 consisting of SEQ ID NO: 1 which encode amino acids -166 to -1 of SEQ ID NO: 2, nucleotides 82-576 of SEQ ID NO: 7 encoding amino acids -165 to -1 of SEQ ID NO: 8, nucleotides 88-585 of SEQ ID NO: 9 which encode amino acids -166 to -1 of SEQ ID NO: 10, and nucleotides 1-501 of SEQ ID NO : 11 encoding amino acids -167 to -1 of SEQ ID NO: 12.

En una forma de realización preferida, la región codificante del péptido señal está constituida por nucleótidos 1-81 de SEC ID Nº: 7 que codifican los aminoácidos 1-29 de SEC ID Nº: 8, o nucleótidos 1-87 de SEC ID Nº: 9 que codifican los aminoácidos 1-29 de SEC ID Nº: 10. In a preferred embodiment, the coding region of the signal peptide consists of nucleotides 1-81 of SEQ ID NO: 7 which encode amino acids 1-29 of SEQ ID NO: 8, or nucleotides 1-87 of SEQ ID NO: 9 encoding amino acids 1-29 of SEQ ID NO: 10.

En el terminal amino de un polipéptido donde están presentes ambas regiones del péptido señal y propéptido, la región del propéptido está situada cerca del terminal amino de un polipéptido y la región del péptido señal está situada cerca del terminal amino de la región del propéptido. At the amino terminus of a polypeptide where both regions of the signal peptide are present and propeptide, the propeptide region is located near the amino terminus of a polypeptide and the signal peptide region is located near the amino terminus of the propeptide region.

También puede ser deseable añadir secuencias reguladoras que permitan la regulación de la expresión del polipéptido relativa al crecimiento de la célula huésped. It may also be desirable to add regulatory sequences which allow for regulation of expression of the polypeptide relative to the growth of the host cell. Unos ejemplos de sistemas reguladores son los que producen la expresión del gen que debe ser activada o desactivada en respuesta a un estímulo químico o físico, incluyendo la presencia de un compuesto regulador. Examples of regulatory systems are those that cause the expression of the gene to be turned on or off in response to a chemical or physical stimulus, including the presence of a regulatory compound. Los sistemas reguladores en sistemas procarióticos incluyen los sistemas de operadores lac, tac, y trp. Regulatory systems in prokaryotic systems include systems operators lac, tac, and trp. En la levadura, el sistema ADH2 o sistema GAL1 pueden ser usados. In yeast, the ADH2 system or GAL1 system may be used. En hongos filamentosos, el promotor de alfa-amilasa TAKA, promotor de glucoamilasa de Aspergillus niger , y promotor de glucoamilasa de Aspergillus oryzae pueden ser usados como secuencias reguladoras. In filamentous fungi, the promoter TAKA alpha-amylase promoter, Aspergillus niger glucoamylase, and glucoamylase promoter from Aspergillus oryzae may be used as regulatory sequences. Otros ejemplos de secuencias reguladoras son las que permiten una amplificación génica. Other examples of regulatory sequences are those which allow for gene amplification. En sistemas eucarióticos, estos incluyen el gen de reductasa dihidrofolato que es amplificado en presencia de metotrexato, y los genes de metalotioneina que son amplificados con metales pesados. In eukaryotic systems, these include the dihydrofolate reductase gene which is amplified in the presence of methotrexate, and the metallothionein genes which are amplified with heavy metals. En estos casos, la secuencia de ácidos nucléicos de codificación del polipéptido sería enlazada operativamente con la secuencia reguladora. In these cases, the nucleic acid sequence encoding the polypeptide would be operably linked with the regulatory sequence.

Vectores de expresión Expression Vectors

La presente invención se refiere también a vectores de expresión recombinantes comprendiendo una secuencia de ácidos nucléicos de la presente invención, un promotor, y señales de parada transcripcional y traslacional. The present invention also relates to recombinant expression vectors comprising a nucleic acid sequence of the present invention, a promoter, and transcriptional and translational signals stop. Las varias secuencias de control y de ácidos nucleicos descritas anteriormente pueden estar unidas entre sí para producir un vector de expresión recombinante que puede incluir uno o más sitios de restricción adecuados para permitir la inserción o sustitución de la secuencia de ácidos nucléicos de codificación del polipéptido en tales sitios. Various control sequences and nucleic acids described above may be joined together to produce a recombinant expression vector which may include one or more convenient restriction sites to allow for insertion or substitution of the nucleic acid sequence encoding the polypeptide in such sites. De manera alternativa, la secuencia de ácidos nucléicos de la presente invención puede ser expresada mediante la inserción de la secuencia de ácidos nucléicos o de un constructo de ácidos nucléicos comprendiendo la secuencia en un vector apropiado para la expresión. Alternatively, the nucleic acid sequence of the present invention may be expressed by inserting the nucleic acid sequence or a nucleic acid construct comprising the sequence into an appropriate vector for expression. Con la creación del vector de expresión, la secuencia codificante se dispone en el vector para que la secuencia codificante sea enlazada operativamente con las secuencias de control apropiadas para la expresión. By creating the expression vector, the coding sequence in the vector is available for the coding sequence is operably linked with the appropriate expression control sequences.

El vector de expresión recombinante puede ser cualquier vector (por ejemplo, un plásmido o virus) que puede ser sometido de manera apropiada a procedimientos de ADN recombinante y producir la expresión de la secuencia de ácidos nucléicos. The recombinant expression vector may be any vector (eg, a plasmid or virus) which can be subjected appropriately to recombinant DNA procedures and cause expression of the nucleic acid sequence. La selección del vector dependerá generalmente de la compatibilidad del vector con la célula huésped donde el vector debe ser introducido. The selection of vector will generally depend on the compatibility of the vector with the host cell where the vector is to be introduced. Los vectores pueden ser plásmidos lineales o circulares cerrados. The vectors may be linear or closed circular plasmids.

El vector puede ser un vector de replicación de forma autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma, o una cromosoma artificial. The vector may be a replicating vector autonomously, ie, a vector which exists as an extrachromosomal entity, the replication is independent of chromosomal replication, eg a plasmid, an extrachromosomal element, a minichromosome, or an artificial chromosome . El vector puede contener cualquier medio para asegurar la autorreplicación. The vector may contain any means for assuring self-replication. De forma alternativa, el vector puede ser un vector que, cuando se introduce en la célula huésped, se integra en el genoma y es replicado con el(los) cromosoma(s) en los que se ha integrado. Alternatively, the vector may be a vector which, when introduced into the host cell, is integrated into the genome and replicated with (the) chromosome (s) into which has been integrated. Además, se puede utilizar un vector o plásmido único o dos o más vectores o plásmidos que contienen juntos el ADN total que debe ser introducido en el genoma de la célula huésped, o un transposón. Furthermore, you can use a single plasmid vector or two or more vectors or plasmids containing together or the total DNA to be introduced into the genome of the host cell, or a transposon.

Los vectores de la presente invención contienen preferiblemente uno o más marcadores seleccionables que permiten una selección fácil de células transformadas. The vectors of the present invention preferably contain one or more selectable markers which permit easy selection of transformed cells. Un marcador seleccionable es un gen cuyo producto proporciona una resistencia biocida o virica, una resistencia a metales pesados, prototrofía a auxótrofos, y similares. A selectable marker is a gene whose product provides a similar biocide or viral resistance, resistance to heavy metals, prototrophy to auxotrophs, and. Unos ejemplos de marcadores seleccionables bacterianos son los genes dal de Bacillus subtilis o Bacillus licheniformis . Examples of bacterial selectable markers are the dal genes from Bacillus subtilis or Bacillus licheniformis. Los marcadores adecuados para las células huéspedes de levadura son ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 y URA3. Suitable for yeast host cells are ADE2 markers, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1 URA3 and. Los marcadores seleccionables para un uso en una célula huésped de hongo filamentoso incluyen, pero no se limitan a éstos, amdS (acetamidasa), argB (ornitina carbamoiltransferasa), bar (fosfinotricina acetiltransferasa), hygB (higromicina fosfotransferasa), niaD (nitrato reductasa), pyrG (orotidina-5'-fosfato decarboxilasa), sC (sulfato adeniltransferasa), trpC (antranilato sintasa), así como equivalentes de éstos. Selectable markers for use in a host cell of filamentous fungi include, but are not limited to, amdS (acetamidase), argB (ornithine carbamoyltransferase), bar (phosphinothricin acetyltransferase), hygB (hygromycin phosphotransferase), niaD (nitrate reductase) , pyrG (orotidine-5'-phosphate decarboxylase), sC (sulfate adenyltransferase), trpC (anthranilate synthase), as well as equivalents thereof. Se prefiere el uso en una célula de Aspergillus de los genes amdS y pyrG de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae y el gen bar de Streptomyces hygroscopicus . Use in an Aspergillus cell are the amdS and pyrG from Aspergillus nidulans or Aspergillus oryzae and the bar gene genes from Streptomyces hygroscopicus it is preferred.

Los vectores de la presente invención contienen preferiblemente un(os) elemento(s) que permite(n) la integración estable del vector en el genoma de la célula huésped o replicación autónoma del vector en la célula independiente del genoma. The vectors of the present invention preferably contain a (I) element (s) that enable (s) stable integration of the vector into the genome of the host cell or autonomous replication of the vector in the cell independent of the genome.

Para una integración en el genoma de la célula huésped, el vector puede depender de la secuencia de ácidos nucléicos de codificación del polipéptido o de cualquier otro elemento del vector para una integración estable del vector en el genoma por recombinación homóloga o no homóloga. For integration into the genome of the host cell, the vector may rely on the nucleic acid sequence encoding the polypeptide or any other element of the vector for stable integration of the vector into the genome by homologous recombination or non-homologous. De manera alternativa, el vector puede contener otras secuencias de ácidos nucleicos para dirigir la integración por recombinación homóloga en el genoma de la célula huésped. Alternatively, the vector may contain other nucleic acid sequences for directing integration by homologous recombination into the genome of the host cell. Las secuencias de ácidos nucleicos adicionales permiten integrar el vector en el genoma de la célula huésped en un(os) sitio(s) preciso(s) en el cromosoma(s). The additional nucleic acid sequences enable the vector to integrate into the genome of the host cell in a (I) precise location (s) (s) in the chromosome (s). Para aumentar la probabilidad de integración de un sitio preciso, los elementos integracionales deberían contener preferiblemente un número suficiente de ácidos nucleicos, como 100 a 1,500 pares de bases, preferiblemente 400 a 1,500 pares de bases, y más preferiblemente 800 a 1,500 pares de bases, que son altamente homólogas a la secuencia de destino correspondiente para aumentar la probabilidad de recombinación homóloga. To increase the likelihood of integration of a precise location, the integrational elements should preferably contain a sufficient number of nucleic acids, such as 100 to 1.500 base pairs, preferably 400 to 1,500 base pairs, and more preferably from 800 to 1.500 base pairs, which they are highly homologous to the corresponding target sequence to enhance the probability of homologous recombination. Los elementos integracionales pueden ser cualquier secuencia homóloga a la secuencia de destino en el genoma de la célula huésped. The integrational elements may be any sequence homologous to the target in the genome of the host cell sequence. Además, los elementos integracionales pueden ser secuencias de ácidos nucleicos de no codificación o de codificación. Furthermore, the integrational elements may be nucleic acid sequences coding or non-coding. Por otra parte, el vector puede ser integrado en el genoma de la célula huésped mediante una recombinación no homóloga. Furthermore, the vector may be integrated into the genome of the host cell by nonhomologous recombination.

Para una replicación autónoma, el vector también puede incluir un origen de replicación que permite al vector replicarse de forma autónoma en la célula huésped en cuestión. For autonomous replication, the vector may also include an origin of replication enabling the vector to replicate autonomously in the host cell in question. Unos ejemplos de orígenes bacterianos de replicación son los orígenes de replicación de los plásmidos pBR322, pUC19, pACiC177, y pACYC184 permitiendo una replicación en E. coli , y pUB110. Examples of bacterial origins of replication are the origins of replication of pBR322, pUC19, pACiC177 plasmids, and pACYC184 permitting replication in E. coli, and pUB110. pE194. pE194. pTA1060, y pAM\beta1 permitiendo una replicación en Bacillus . pTA1060, and pAM \ beta1 permitting replication in Bacillus. Unos ejemplos de los orígenes de replicación para usar en una célula huésped de levadura son el origen de 2 micras de replicación, ARS1, ARS4, la combinación de ARS1 y CEN3, y la combinación de ARS4 y CEN6. Examples of origins of replication for use in a yeast host cell are the 2 micron origin of replication, ARS1, ARS4, the combination of ARS1 and CEN3, and the combination of ARS4 and CEN6. El origen de replicación puede ser un vector que posee una mutación que hace que éste funcione sensible a una temperatura en la célula huésped (véase, por ejemplo, Ehrlich, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences EEUU 75: 1433). The origin of replication may be a vector having a mutation which makes it function temperature-sensitive in the host cell (see, e.g., Ehrlich, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA 75: 1433).

Más de una copia de una secuencia de ácidos nucléicos de la presente invención puede ser insertada en la célula huésped para aumentar la producción del producto genético. More than one copy of a nucleic acid sequence of the present invention can be inserted into the host cell to increase production of the gene product. Un aumento del número de copias de la secuencia de ácidos nucléicos puede ser obtenido integrando al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula huésped o mediante la inclusión de un gen marcador seleccionable, amplificable con la secuencia de ácidos nucléicos donde las células conteniendo copias amplificadas del gen marcador seleccionable, y por lo tanto copias adicionales de la secuencia de ácidos nucléicos, pueden ser seleccionadas por medio del cultivo de las células en presencia del agente seleccionable apropiado. An increased number of copies of the nucleic acid sequence can be obtained by integrating at least one additional copy of the sequence into the genome of the host cell or by including a selectable, amplifiable marker gene with the nucleic acid sequence where cells containing amplified copies of the selectable marker gene, and thereby additional copies of the the nucleic acid sequence, can be selected by culturing cells in the presence of the appropriate selectable agent.

Los procedimientos usados para enlazar los elementos descritos anteriormente para construir los vectores de expresión recombinante de la presente invención son conocidos por un experto en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al ., 1989, supra ). The procedures used to ligate the elements described above to construct the recombinant expression vectors of the present invention are known to one skilled in the art (see for example, Sambrook et al., 1989, supra).

La proteasa también puede ser coexpresada con al menos otra enzima de interés para los alimentos para animales, tal como la alfa-amilasa (EC 3.2.1.1), fitasa (EC 3.1.3.8 o 3.1.3.26); The protease may also be coexpressed with at least one other enzyme of interest for animal feed, such as alpha-amylase (EC 3.2.1.1), phytase (EC 3.1.3.8 or 3.1.3.26); xilanasa (EC 3.2.1.8); xylanase (EC 3.2.1.8); galactanasa (EC 3.2.1.89); galactanase (EC 3.2.1.89); alfa-galactosidasa (EC 3.2.1.22); alpha-galactosidase (EC 3.2.1.22); proteasa (EC 3.4.-.-), fosfolipasa A1 (EC 3.1.1.32); protease (EC 3.4.-.-), phospholipase A1 (EC 3.1.1.32); fosfolipasa A2 (EC 3.1.1.4); phospholipase A2 (EC 3.1.1.4); lisofosfolipasa (EC 3.1.1.5); lysophospholipase (EC 3.1.1.5); fosfolipasa C (3.1.4.3); phospholipase C (3.1.4.3); fosfolipasa D (EC 3.1.4.4); phospholipase D (EC 3.1.4.4); y/o beta-glucanasa (EC 3.2.1.4 o EC 3.2.1.6). and / or beta-glucanase (EC 3.2.1.4 or EC 3.2.1.6).

Las enzimas pueden ser coexpresadas a partir de distintos vectores, de un vector, o por medio de una mezcla de ambas técnicas. The enzymes may be co-expressed from different vectors, from one vector, or using a mixture of both techniques. Cuando se usan distintos vectores, los vectores pueden tener distintos marcadores seleccionables, y distintos orígenes de replicación. When different vectors are used, the vectors may have different selectable markers, and different origins of replication. Cuando se usa sólo un vector, los genes pueden ser expresados a partir de uno o más promotores. When using only one vector, the genes can be expressed from one or more promoters. Si se clonan en función de la regulación de un promotor (di- o multi-cistrónico), el orden en el que los genes son clonados puede afectar los niveles de expresión de las proteínas. If cloned according to the regulation of a promoter (di- or multi-cistronic), the order in which the genes are cloned may affect the expression levels of proteins. La proteasa también puede ser expresada como una proteína de fusión, es decir que el gen de codificación de la proteasa es fusionado en la estructura con el gen de codificación de otra proteína. The protease may also be expressed as a fusion protein, i.e. that the gene encoding the protease is fused in frame with the gene encoding another protein. Esta proteína puede ser otra enzima o un dominio funcional de otra enzima. This protein may be another enzyme or a functional domain from another enzyme.

Células huéspedes host cells

La presente invención se refiere también a células huésped recombinantes, comprendiendo una secuencia de ácidos nucléicos de la invención, que son usadas de manera ventajosa en la producción recombinante de los polipéptidos. The present invention also relates to recombinant host cells, comprising a nucleic acid sequence of the invention, which are advantageously used in the recombinant production of the polypeptides. Un vector comprendiendo una secuencia de ácidos nucléicos de la presente invención es introducido en una célula huésped para mantener el vector como un integrante cromosómico o un vector extracromosómico de autoreplicación tal y como se ha descrito anteriormente. A vector comprising a nucleic acid sequence of the present invention is introduced into a host cell to maintain the vector as a chromosomal integrant or an extrachromosomal self-replicating vector as described above. Los términos "célula huésped" se refieren a cualquier progenie de una célula madre que no es idéntica a la célula madre a causa de las mutaciones que ocurren durante la replicación. The terms "host cell" refers to any progeny of a parent cell that is not identical to the parent cell due to mutations that occur during replication. La elección de una célula huésped dependerá en gran medida del gen de codificación del polipéptido y de su fuente. The choice of a host cell will depend largely on the gene encoding the polypeptide and its source.

La célula huésped puede ser un microorganismo unicelular, por ejemplo, un procariota, o un microorganismo no unicelular, por ejemplo, un eucariota. The host cell may be a unicellular microorganism, eg, a prokaryote, or a non-unicellular microorganism, eg, a eukaryote.

Las células unicelulares útiles son células bacterianas como bacterias gram positivas incluyendo, pero sin limitarse a éstas, una célula Bacillus , o una célula Streptomyces , o células de bacterias del ácido lático; Useful unicellular cells are bacterial cells such as gram positive bacteria including, but not limited to, a Bacillus cell, Streptomyces cell , or cells, or lactic acid bacteria; o bacterias gram negativas tales como bacterias de ácido (ático de la especie E. coli y Pseudomonas , incluyendo pero sin limitarse a especies de los géneros Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus, Pediococcus , y Enterococcus . or gram negative bacteria such as bacteria of (attic E. coli and Pseudomonas species, including but not limited to species of the genera Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus, Pediococcus, and Enterococcus.

La introducción de un vector en una célula huésped bacteriana puede, por ejemplo, ser efectuado por transformación del protoplasto (véase, por ejemplo, Chang y Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115), usando células competentes (véase, por ejemplo, Young y Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829, o Dubnau y Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209-221), electroporación (véase, p. ej., Shigekawa y Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751), o conjugación (ver, por ejemplo, Koehler y Thome, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771-5278). The introduction of a vector into a bacterial host cell may, for instance, be effected by protoplast transformation (see, e.g., Chang and Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115), using competent cells (see, example, Young and Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829, or Dubnau and Davidoff Abelson-1971, Journal of Molecular Biology 56: 209-221), electroporation (see, e.g., Shigekawa and Dower,.. 1988, Biotechniques 6: 742-751), or conjugation (see, e.g., Koehler and Thome, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771-5278).

La célula huésped puede ser un eucariota, como una célula de animal no humano, una célula de insecto, una célula vegetal, o una célula de hongos. The host cell may be a eukaryote, such as a non-human animal cell, an insect cell, a plant cell or a fungal cell.

En una forma de realización particular, la célula huésped es una célula de hongos. In a particular embodiment, the host cell is a fungal cell. "Hongos" como se utiliza en este caso incluye el phyla Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota, y Zygomycota (Hawksworth et al ., In, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8ª edición, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, Reino Unido) así como el Oomycota (como citado en Hawkswort et al ., 1995, supra , página 171) y todos los hongos mitospóricos (Hawkswort et al ., 1995, supra ). "Fungi" as used herein includes the phyla Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota, and zygomycota (Hawksworth et al., In, Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge Kingdom) and the Oomycota (as cited in Hawksworth et al., 1995, supra, page 171) and all mitosporic fungi (Hawksworth et al., 1995, supra).

En otra forma de realización particular, la célula huésped fúngica es una célula de levadura. In another particular embodiment, the fungal host cell is a yeast cell. "Levadura" tal y como se utiliza en este caso incluye la levadura ascosporogenea (Endomicetales), levadura basidiosporogenea, y levadura perteneciente a los hongos imperfecti (Blastomicetes). "Yeast" as used herein includes ascosporogenous yeast (Endomycetales), basidiosporogenous yeast, and yeast belonging to the Fungi imperfecti (Blastomicetes). Como la clasificación de la levadura puede cambiar en el futuro, para los objetivos de esta invención, la levadura será definida tal y como está descrita en Biology and Activities of Yeast (Skinner, FA, Passmore, SM, y Davenport, RR, eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series Nº. 9, Since the classification of yeast may change in the future, for the purposes of this invention, yeast shall be defined as is described in Biology and Activities of Yeast (Skinner, FA, Passmore, SM, and Davenport, RR, eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No.. 9
1980). 1980).

La célula huésped de levadura puede ser una célula Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces , o célula de Yarrowia . The yeast host cell may be a Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, or Yarrowia cell cell.

La célula huésped de hongo puede ser una célula de hongo filamentoso. The host fungal cell may be a filamentous fungal cell. Los "Hongos filamentosos" incluyen todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycota y Oomycota (como han sido definidas por Hawkswort et al ., 1995, supra ). The "Filamentous fungi" include all filamentous forms of the subdivision Eumycota and Oomycota (as defined by Hawksworth have been et al., 1995, supra). Los hongos filamentosos están caracterizados por una pared micelial compuesta por quitina, celulosa, glucano, quitosano, manano, y otros complejos polisacáridos. The filamentous fungi are characterized by a mycelial wall composed of chitin, cellulose, glucan, chitosan, mannan, and other complex polysaccharides. El crecimiento vegetativo se efectúa por alargamiento hifal y el catabolismo de carbono es estrictamente aeróbico. Vegetative growth is by hyphal elongation and carbon catabolism is obligately aerobic. Al contrario, el crecimiento vegetativo por levaduras como la Saccharomyces cerevisiae se realiza por injerto de un talo unicelular y el catabolismo de carbono puede ser fermentativo. In contrast, vegetative growth by yeasts such as Saccharomyces cerevisiae is by budding of a unicellular thallus and carbon catabolism may be fermentative.

Unos ejemplos de células huéspedes de hongo filamentoso, pero sin limitarse a éstas, son las células de las especies Acremonium, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Mucor, Myceliophthora, Neurospora, Penicillium, Thielavia, Tolypocladium , o Trichoderma . Examples of filamentous fungal host cells, but not limited to these, are cells of Acremonium, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Mucor, Myceliophthora, Neurospora, Penicillium, Thielavia, Tolypocladium, or Trichoderma species.

La células de hongos pueden ser transformadas por un procedimiento que implica la formación de protoplastos, la transformación de los protoplastos, y la regeneración de la pared celular según una forma conocida per se . The fungal cells may be transformed by a process involving protoplast formation, transformation of the protoplasts, and regeneration of the cell wall in a manner known per se. Los procedimientos adecuados de transformación de las células huéspedes de Aspergillus están descritos en EP 238 023 y Yelton et al ., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences EEUU 81: 1470-1474. Suitable methods of transformation of Aspergillus host cells are described in EP 238 023 and Yelton et al, 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America USA . 81: 1470-1474. Los métodos adecuados para transformar las especies de Fusarium ha sido descritos por Malardier et al ., 1989, gen 78: 147-156 y en WO 96/00787. Suitable methods for transforming Fusarium species methods has been described by Malardier et al, 1989, Gene . 78: 147-156 and WO 96/00787. La levadura puede ser transformada mediante el uso de los procedimientos descritos por Becker y Guarente, en Abelson, JN y Simon, MI, editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York; Yeast may be transformed using the procedures described by Becker and Guarente, In Abelson, JN and Simon, MI, editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press , Inc., New York; Ito et al ., 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; Ito et al, 1983, Journal of Bacteriology . 153: 163; y Hinnen et al ., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920. and Hinnen et al, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA . 75: 1920.

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Métodos de producción Production methods

La presente invención también se refiere a métodos para la producción de un polipéptido de la presente invención comprendiendo (a) el cultivo de una cepa, la cual en su forma de tipo salvaje, es capaz de producir el polipéptido; The present invention also relates to methods for producing a polypeptide of the present invention comprising (a) cultivating a strain, which in its wild-type form is capable of producing the polypeptide; y (b) la recuperación del polipéptido. and (b) recovering the polypeptide. Preferiblemente, la cepa es del género Nocardiopsis , más preferiblemente Nocardiopsis dassonvillei, Nocardiopsis alba , o Nocardiopsis antarctica , más preferiblemente Nocardiopsis dassonvillei , subespecie dassonvillei . Preferably, the strain is of the genus Nocardiopsis, more preferably Nocardiopsis dassonvillei, Nocardiopsis alba, Nocardiopsis antarctica or, more preferably Nocardiopsis dassonvillei subspecies dassonvillei.

La presente invención también se refiere a métodos para producir un polipéptido de la presente invención comprendiendo (a) el cultivo de una célula huésped en condiciones propicias para la producción del polipéptido; The present invention also relates to methods for producing a polypeptide of the present invention comprising (a) cultivating a host cell under conditions conducive for production of the polypeptide; y (b) la recuperación del polipéptido. and (b) recovering the polypeptide.

La presente invención expone también unos métodos para la producción de un polipéptido de la presente invención comprendiendo (a) el cultivo de una célula huésped en condiciones propicias para la producción del polipéptido, donde la célula huésped comprende una secuencia de ácidos nucléicos mutante comprendiendo al menos una mutación en los nucleótidos 499-1062 de SEC ID Nº: 1, 577-1164 de SEC ID Nº: 7, 586-1152 de SEC ID Nº: 9, y/o 502-1065 de SEC ID Nº: 11, donde la secuencia de ácidos nucléicos mutante codifica un polipéptido que (i) consiste en los aminoácidos 1 a 188 de SEC ID Nº: 2, 1 a 196 de SEC ID Nº: 8, 1 a 189 de SEC ID Nº: 10, y/o 1 a 188 de SEC ID Nº: 12, o (ii) es una variante de cualquiera de las secuencias de (i), donde la variante comprende una sustitución, deleción, y/o inserción de uno o más aminoácidos, o (iii) es una variante alélica de cualquiera de las secuencias de (i), o (iv) es un fragmento de cualquiera de las secuencias de ( The present invention also discloses methods for producing a polypeptide of the present invention comprising (a) cultivating a host cell under conditions conducive for production of the polypeptide, wherein the host cell comprises a sequence of mutant nucleic acids comprising at least a mutation in nucleotides 499-1062 SEQ ID NO: 1, 577-1164 of SEQ ID NO: 7, 586-1152 of SEQ ID NO: 9, and / or 502-1065 of SEQ ID NO: 11, wherein the sequence mutant nucleic acid encoding a polypeptide (i) consists of amino acids 1 to 188 of SEQ ID NO: 2, 1 to 196 of SEQ ID NO: 8, 1 to 189 of SEQ ID NO: 10, and / or 1 to 188 of SEQ ID NO: 12, or (ii) is a variant of any of the sequences of (i), where the variant comprises a substitution, deletion and / or insertion of one or more amino acids, or (iii) is an allelic variant of any of the sequences of (i) or (iv) is a fragment of any of sequences ( i). i).

En los métodos de producción de la presente invención, las células son cultivadas en un medio nutritivo adecuado para la producción del polipéptido usando métodos conocidos en el estado de la técnica. In the production methods of the present invention, the cells are grown in a nutrient medium suitable for production using methods known in the prior art polypeptide. Por ejemplo, la célula puede ser cultivada mediante un cultivo en un frasco de agitación, por fermentación a pequeña escala oa gran escala (incluyendo fermentaciones continuas, por lotes, en discontinuo, o en estado sólido) en fermentadores de laboratorio o industriales realizada en un medio adecuado y en condiciones que permitan expresar y/o aislar el polipéptido. For example, the cell may be cultivated by culture in a shake flask for small scale fermentation or large scale (including continuous fermentations, batch, batch, or solid state) in laboratory fermenters or industrial performed in a and suitable conditions that can express and / or isolating the polypeptide medium. El cultivo se desarrolla en un medio nutritivo adecuado comprendiendo fuentes de carbono y nitrógeno y sales inorgánicas, mediante el uso de procedimientos conocidos en la técnica. The cultivation takes place in a suitable nutrient medium comprising carbon and nitrogen sources and inorganic salts, using procedures known in the art. Los medios adecuados están disponibles provistos por proveedores comerciales o pueden ser preparados según las composiciones publicadas (por ejemplo, en los catálogos de American Type Culture Collection). Suitable media are available provided by commercial suppliers or may be prepared according to published compositions (eg, in catalogs of the American Type Culture Collection). Si el polipéptido es segregado en el medio nutritivo, el polipéptido puede ser recuperado directamente del medio. If the polypeptide is secreted into the nutrient medium, the polypeptide can be recovered directly from the medium. Si el polipéptido no es segregado, éste puede ser recuperado a partir de los lisatos de la célula. If the polypeptide is not secreted, it can be recovered from cell lysates.

Los polipéptidos pueden ser detectados usando métodos conocidos en la técnica que son específicos a los polipéptidos. The polypeptides may be detected using methods known in the art that are specific for the polypeptides. Estos métodos de detección pueden incluir el uso de anticuerpos específicos, la formación de un producto, o la desaparición de un sustrato. These detection methods may include use of specific antibodies, formation of a product, or disappearance of a substrate. Por ejemplo, un ensayo de proteasa puede ser usado para determinar la actividad del polipéptido tal y como está descrito aquí. For example, a protease assay may be used to determine the activity of the polypeptide as described herein.

El polipéptido resultante puede ser recuperado por medio de métodos conocidos en la técnica. The resulting polypeptide may be recovered by methods known in the art. Por ejemplo, el polipéptido puede ser recuperado del medio nutritivo mediante procedimientos convencionales incluyendo, pero sin limitarse a éstos, centrifugado, filtración, extracción, secado por pulverización, evaporación, o precipitación. For example, the polypeptide may be recovered from the nutrient medium by conventional procedures including, but not limited to, centrifugation, filtration, extraction, spray drying, evaporation, or precipitation.

Los polipéptidos de la presente invención pueden ser purificados usando una variedad de procedimientos conocidos en la técnica incluyendo, sin limitarse a éstos, cromatografía (por ejemplo, intercambio fónico, de afinidad, hidrofóbica de cromatoenfoque, y exclusión de tamaño), procedimientos electroforéticos (por ejemplo, isoelectroenfoque preparatorio), solubilidad diferencial (por ejemplo, precipitación de sulfato amónico), SDS-PAGE, o extracción (véase, por ejemplo, Protein Purification, J.-C. Janson y Lars Ryden, editores, Ediciones VCH, New York, 1989). Polypeptides of the present invention can be purified using a variety of methods known in the art including, but not limited to, chromatography (e.g., ion exchange, affinity, hydrophobic chromatofocusing, and size exclusion), electrophoretic procedures ( example, preparative isoelectric focusing), differential solubility (eg, ammonium sulfate precipitation), SDS-PAGE, or extraction (see, e.g., Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishing, New York , 1989).

Plantas Plants

La presente invención se refiere también a una planta transgénica, a una parte de planta, oa una célula vegetal que ha sido transformada con una secuencia de ácidos nucléicos de codificación de un polipéptido que posee una actividad proteasa de la presente invención para expresar y producir el polipéptido en cantidades recuperables. The present invention also relates to a transgenic plant, a plant part, or plant cell which has been transformed with a nucleic acid sequence encoding a polypeptide having protease activity of the present invention to express and produce the polypeptide in recoverable quantities. El polipéptido puede ser recuperado de la planta o de parte de la planta. The polypeptide may be recovered from the plant or plant part. De forma alternativa, la planta o parte de planta conteniendo el polipéptido recombinante puede ser usado como tal para mejorar la calidad de un alimento o alimentos, por ejemplo, para mejorar su valor nutritivo, sabor, y propiedades reológicas, o destruir un factor antinutritivo. Alternatively, the plant or plant part containing the recombinant polypeptide may be used as such for improving the quality of a food or food, for example, to improve its nutritional value, taste, and rheological properties, or to destroy an antinutritive factor.

En una forma de realización particular, el polipéptido está destinado a las vacuolas de almacenamiento del endosperma en semillas. In a particular embodiment, the polypeptide is intended for endosperm storage vacuoles in seeds. Esto puede obtenerse por sintetización de éste como precursor con un péptido señal adecuado, véase Horvath et al en PNAS, Feb. 15, 2000, vol. This can be obtained by synthesizing it as a precursor with a suitable signal peptide, see Horvath et al in PNAS, Feb. 15, 2000, vol. 97, nº. 97, no. 4, p. 4, p. 1914-1919. 1914-1919.

La planta transgénica puede ser dicotiledónea (una dicot) o monocotiledónea (una monocot) o variantes de estas creadas genéticamente. The transgenic plant can be dicotyledonous (dicot one) or monocotyledonous (monocot one) or genetically engineered variants thereof. Unos ejemplos de plantas monocotiledóneas son hierbas, como pastos (pasto azul, Poa), forraje como Festuca, Lolium , césped templado, como Agrostis, y cereales, p. Examples of monocot plants are grasses, such as pasture (blue grass, Poa), forage as Festuca, Lolium, temperate grass, such as Agrostis, and cereals, p. ejemplo, trigo, avena, centeno, cebada, arroz, sorgo, tritical (híbrido estabilizado de trigo ( Tricicum ) y centeno ( Secale ), y maíz (maíz). Unos ejemplos de plantas dicotiledóneas son el tabaco, las leguminosas, como el girasol ( Helianthus ), lupinos de algodón ( Gossypium ), patata, remolacha azucarera, guisantes, habas y soja, y plantas crucíferas (familia Brassicaceae), como la coliflor, semilla de colza, y el organismo de modelo Arabidopsis thaliana muy relacionado. Las plantas de bajo fitato tal como están descritas por ejemplo en la patente estadounidense nº. 5,689,054 y patente estadounidense nº. 6,111,168 son ejemplos de plantas creadas genéticamente. eg wheat, oats, rye, barley, rice, sorghum, triticale (hybrid stabilized wheat (Tricicum) and rye (Secale), and maize (corn). Examples of dicot plants are snuff, legumes, such as sunflower (Helianthus), lupins, cotton (Gossypium), potato, sugar beet, peas, beans and soybean, and cruciferous plants (family Brassicaceae), such as cauliflower, rape seed, and the body of model Arabidopsis thaliana closely related. plants low phytate as are described for example in U.S. patent No.. 5,689,054 and U.S. patent No.. 6,111,168 are examples of plants genetically engineered.

Unos ejemplos de partes de planta son el vástago, callo, hojas, raíz, frutas, semillas, y tubérculos, así como los tejidos individuales comprendiendo estas partes, por ejemplo epidermis, mesofilo, parénquima, tejidos vasculares, meristemas. Examples of plant parts are stem, callus, leaves, root, fruits, seeds, and tubers as well as the individual tissues comprising these parts, e.g. epidermis, mesophyll, parenchyma, vascular tissues, meristems. Además, unos compartimientos de célula vegetal específicos, como el cloroplasto, apoplasto, mitocondria, vacuola, peroxisomas, y citoplasma son considerados como una parte de planta. In addition, a specific plant cell compartments, such as chloroplast, apoplast, mitochondria, vacuole, peroxisomes, and cytoplasm are considered to be a plant part. Además, cualquier célula vegetal, de cualquier origen de tejido, es considerada como una parte de planta. Furthermore, any plant cell of any tissue origin, is considered to be a plant part. Asimismo, las partes de planta como los tejidos específicos y las células aisladas para facilitar el uso de la invención, son consideradas también partes de plantas, por ejemplo embriones, endospermas, aleurona y películas de semillas. Likewise, plant parts such as specific tissues and cells isolated to facilitate the use of the invention are also considered plant parts, e.g. embryos, endosperms, aleurone and seed films. También se incluyen en el ámbito de la presente invención la progenie de tales plantas, partes de planta y células vegetales. Also included in the scope of the present invention are the progeny of such plants, plant parts and plant cells.

La planta transgénica o célula vegetal de expresión de un polipéptido de la presente invención puede ser construida conforme a los métodos conocidos en la técnica. The transgenic plant or plant cell expressing a polypeptide of the present invention can be constructed according to methods known in the art. En resumen, la planta o célula vegetal es construida mediante la incorporación de uno o más constructos de expresión de codificación de un polipéptido de la presente invención en el génoma huésped de la planta y la propagación de la planta modificada o célula vegetal resultante en una planta transgénica o célula vegetal. In short, the plant or plant cell is constructed by incorporating one or more expression constructs encoding a polypeptide of the present invention in the plant host genome and propagating the modified plant or resulting plant cell into a plant or transgenic plant cell.

Convenientemente, el constructo de expresión es un constructo de ácidos nucléicos que comprende una secuencia de ácidos nucléicos de codificación de un polipéptido de la presente invención enlazado operativamente a unas secuencias reguladoras apropiadas requeridas para la expresión de la secuencia de ácidos nucléicos en la planta o parte de la planta seleccionada. Conveniently, the expression construct is a nucleic acid construct comprising a nucleic acid sequence encoding a polypeptide of the present invention operably linked to appropriate regulatory sequences required for expression of the nucleic acid sequence in the plant or part of the selected plant. Además, el constructo de expresión puede comprender un marcador seleccionable útil para identificar células huéspedes en las cuales se ha integrado el constructo de expresión y las secuencias de ADN necesarias para la introducción del constructo en la planta en cuestión (este último depende del método de introducción del ADN que debe ser utilizado). Furthermore, the expression construct may comprise a selectable marker useful for identifying host cells into which has been incorporated the expression construct and the DNA sequences necessary for introduction of the construct into the plant in question (the latter depends on the method of introduction DNA that must be used).

La selección de secuencias reguladoras, tales como secuencias promotoras y terminadoras y opcionalmente secuencias de señal o de tránsito son determinadas, por ejemplo, en base a, cuándo, dónde, y cómo expresar el polipéptido deseado. The selection of regulatory sequences, such as promoter and terminator sequences and optionally signal sequences or transit are determined, for example, based on when, where, and how to express the desired polypeptide. Por ejemplo, la expresión del gen de codificación de un polipéptido de la presente invención puede ser constitutiva o inducible, o puede ser desarrollable, específica a una etapa o tejido, y el producto genético puede estar previsto para un tejido específico o una parte de planta tal como semillas u hojas. For example, expression of the gene encoding a polypeptide of the present invention may be constitutive or inducible, or may be developmental, specific to a stage or tissue, and the gene product may be provided to a specific tissue or plant part as seeds or leaves. Las secuencias reguladoras han sido descritas por ejemplo, por Tague et al ., 1988, Plant Physiology 86: 506. Regulatory sequences are described , for example, by Tague et al, 1988, Plant Physiology 86:. 506.

Para la expresión constitutiva, los siguientes promotores puede ser usados: el promotor 35S-CaMV (Franck et al ., 1980, Cell 21: 285-294), la ubiquitina de maíz 1 (Christensen AH, Sharrock RA y Quail 1992. Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation), o el promotor de actina de arroz 1 (Plant Mo. Biol. 18, 675-689.; Zhang W, McElroy D. y Wu R 1991, Analysis of rice Act1 5' region activity in transgenic rice plants. Plant Cell 3, 1155-1165). For constitutive expression, the following promoters may be used: the 35S-CaMV promoter (Franck et al, 1980, Cell . 21: 285-294), the maize ubiquitin 1 (Christensen AH, Sharrock RA and Quail 1992. Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation), or the rice actin 1 (Plant Mo. Biol 18, 675-689 .; Zhang W, McElroy D.. and Wu R 1991, Analysis of rice Act1 5 'region activity in transgenic rice plants. Plant Cell 3, 1155-1165). Los promotores específicos a un órgano pueden ser, por ejemplo, un promotor procedente de tejidos sumergidos de almacenamiento como semillas, tubérculos de patata, y frutas (Edwards & Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet. 24: 275-303), o de tejidos sumergidos metabólicos como meristemas (Ito et al ., 1994, Plant Mol. Biol. 24: 863-878), una semilla promotora específica como la glutelina, prolamina, globulina, o promotora de albúmina de arroz (Wu et al ., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 885-889), un promotor de Vicia faba de la legúmina B4 y el gen proteico de semilla desconocida de Vicia faba (Journal of Plant Physiology 152: 708-711), un promotor de una proteína de cuerpo de aceite de semilla (Chen et al ., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 935-941), el promotor napA de proteína de almacenamiento de Brassica napus , o cualquier otro promotor específico de semilla conocido en el estado de la técnica, por ejemplo tal como se describe en WO 91/14772. An organ specific promoters may be, for example, a promoter from storage submerged as seeds, potato tubers, and fruits (Edwards & Coruzzi, 1990, Ann Rev. Genet. 24.: 275-303) tissue, or submerged metabolic tissues as meristems (Ito et al, 1994, Plant Mol Biol . 24:.. 863-878), a seed specific promoter such as the glutelin, prolamin, globulin, or albumin promoter from rice (Wu et al. 1998, Plant and Cell Physiology 39: 885-889), a promoter of the Vicia faba legumin B4 and of the unknown protein gene of Vicia faba seed (Journal of Plant Physiology 152: 708-711), a promoter of a protein of seed oil body (Chen et al, 1998, Plant and Cell Physiology 39:. 935-941), the promoter napA storage protein from Brassica napus, or any other seed specific promoter known in the prior art, for example as described in WO 91/14772. Además, el promotor puede ser un promotor específico de hoja tal como el promotor rbcs del arroz o del tomate (Kiozuka et al ., 1993, Plant Physiology 102: 991-1000, el promotor del gen de metiltransferasa de adenina del virus chlorella (Mitra y Higgins, 1994, Plant Molecular Biology 26: 85-93), o el promotor de gen aldP procedente del arroz (Kagaya et al ., 1995, Molecular and General Genetics 248: 668-674), o un promotor inducible enrollado tal como el promotor de patata pin2 (Xu et al ., 1993, Plant Molecular Biology 22: 573-588). Asimismo, el promotor puede ser inducible por tratamientos abióticos tales como la temperatura, sequía o alteraciones de la salinidad o inducibles por sustancias aplicadas exógenamente que activan el promotor, por ejemplo etanol, estrógenos, hormonas vegetales como etileno, ácido abscísico, ácido giberélico y/o metales pesados. Furthermore, the promoter may be a leaf specific promoter such as the rbcs promoter from rice or tomato (Kiozuka et al, 1993, Plant Physiology . 102: 991-1000, the methyltransferase gene promoter of chlorella virus adenine (Mitra and Higgins, 1994, Plant Molecular Biology 26: 85-93), or the aldP gene promoter from rice (Kagaya et al, 1995, Molecular and General Genetics 248:. 668-674), or an inducible promoter such as wound potato pin2 promoter (Xu et al, 1993, Plant Molecular Biology . 22: 573-588). Likewise, the promoter may inducible by abiotic treatments be such as temperature, drought or alterations in salinity or inducible by exogenously applied substances that activate the promoter, e.g. ethanol, oestrogens, plant hormones like ethylene, abscisic acid, gibberellic acid and / or heavy metals.

También se puede usar un elemento intensificador del promotor para conseguir la mayor expresión de la proteasa en la planta. It can also use a promoter enhancer element to achieve higher expression of the protease in the plant. Por ejemplo, el elemento intensificador del promotor puede ser un intrón que es instalado entre el promotor y la secuencia de nucleótidos de codificación de un polipéptido de la presente invención. For example, the promoter enhancer element may be an intron which is installed between the promoter and the nucleotide sequence encoding a polypeptide of the present invention. Por ejemplo, Xu et al ., 1993, supra revelan el uso del primer intrón del gen de actina de arroz 1 para aumentar la expresión. For example, Xu et al., 1993, supra disclose the use of the first intron of rice actin 1 to enhance expression.

Por otra parte, el uso del codón puede ser optimizado para las especies vegetales en cuestión para mejorar la expresión (véase Horvath et al en referencia a lo anterior). Furthermore, the codon usage may be optimized for the plant species in question to improve expression (see Horvath et al in reference to the above).

El gen del marcador seleccionable y cualquier otra parte del constructo de expresión puede ser elegido entre los que están disponibles en la técnica. The selectable marker gene and any other parts of the expression construct may be chosen from those available in the art.

El constructo de ácidos nucléicos es incorporado en el genoma de la planta según técnicas convencionales conocidas en el estado de la técnica, incluyendo una transformación mediada por Agrobacterium , transformación mediada por virus, microinyección, bombardeo de partículas, transformación biolística y electroporación (Gasser et al ., 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, Bio/Technology 8: 535; Shimamoto et al ., 1989, Nature 338: 274). The nucleic acid construct is incorporated into the plant genome as known in the prior art conventional techniques, including Agrobacterium -mediated transformation, virus - mediated transformation, microinjection, particle bombardment, biolistic transformation , and electroporation (Gasser et al ., 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, Bio / Technology 8: 535; Shimamoto et al, 1989, Nature 338: 274)..

Actualmente, la transferencia del gen mediado por Agrobacterium tumefacien es el método seleccionado para generar dicotiledóneas transgénicas (como resumen, véase Hooikas y Schilperoort, 1992, Plant Molecular Biology 19: 15-38), y ésta puede ser utilizada también para transformar monocotiledóneas, aunque otros métodos de transformación son generalmente preferidos para estas plantas. Currently, transfer mediated by Agrobacterium tumefacien gene is the selected method for generating transgenic dicots (as a summary, see Hooykas and Schilperoort, 1992, Plant Molecular Biology 19: 15-38), and it can also be used for transforming monocots, although other transformation methods are generally preferred for these plants. Actualmente, el método seleccionado para generar monocotiledóneas transgénicas, complementando el procedimiento de Agrobacterium , es el bombardeo de partículas (partículas microscópicas de oro o de tungsteno revestidas con el ADN transfomante) de callos embrionarios o embriones en desarrollo (Christou, 1992, Plant Journal 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Current Opinion Biotechnology 5: 158-162; Vasil et al ., 1992, Bio/Technology 10: 667-674). Currently, the method selected for generating transgenic monocots, supplementing the procedure of Agrobacterium, is particle bombardment (microscopic gold particles or tungsten coated with the transforming DNA) of embryonic calli or developing embryos (Christou, 1992, Plant Journal 2 : 275-281; Shimamoto, 1994, Current Opinion Biotechnology 5: 158-162; Vasil et al, 1992, Bio / Technology 10: 667-674).. Un método alternativo para la transformación de monocotiledóneas se basa en la transformación de protoplastos tal y como han descrito Omirulleh et al ., 1993, Plant Molecular Biology 21: 415-428. An alternative method for transformation of monocots is based on protoplast transformation as described Omirulleh et al, 1993, Plant Molecular Biology . 21: 415-428.

Después de la transformación, los transformantes que han incorporado aquí el constructo de expresión son seleccionados y regenerados en plantas enteras según métodos bien conocidos en la técnica. After transformation, the transformants having incorporated the expression construct herein are selected and regenerated into whole plants according to methods well known in the art.

La presente invención también se refiere a métodos para producir un polipéptido de la presente invención comprendiendo (a) el cultivo de una planta transgénica o de una célula vegetal comprendiendo una secuencia de ácidos nucléicos codificante de un polipéptido que posee una actividad proteasa de la presente invención en condiciones propicias para la producción del polipéptido; The present invention also relates to methods for producing a polypeptide of the present invention comprising (a) cultivating a transgenic plant or a plant cell comprising a nucleic acid sequence encoding a polypeptide having protease activity of the present invention under conditions conducive for production of the polypeptide; y (b) la recuperación del polipéptido. and (b) recovering the polypeptide.

Animales Animals

La presente invención también se refiere a un animal no humano ya productos o elementos del mismo, cuyos ejemplos son fluidos biológicos como la leche y la sangre, órganos, carne, y células animales. The present invention also relates to a non-human animal and products or elements thereof, examples of which are biological fluids such as milk and blood, organs, flesh, and animal cells. Las técnicas para la expresión de proteínas, por ejemplo en células mamíferas, son conocidas en la técnica, véase por ejemplo el manual sobre la Expresión de Proteínas: un enfoque práctico, Higgins y Hames (eds), Prensa de la Universidad de Oxford (1999), y los otros tres manuales en esta serie relativa a la transcripción del gen, el tratamiento del RNA, y el Tratamiento Postraslaccional. Techniques for expressing proteins, eg in mammalian cells are known in the art, see for example the manual on Protein Expression: A Practical Approach, Higgins and Hames (eds), University Press Oxford (1999 ), and three other handbooks in this series on gene transcription, RNA processing, and Postraslaccional treatment. En términos generales, para preparar un animal transgénico, unas células seleccionadas de un animal seleccionado son transformadas con una secuencia de ácidos nucléicos de codificación de un polipéptido que posee una actividad proteasa de la presente invención para expresar y producir el polipéptido. Generally speaking, to prepare a transgenic animal, selected cells of a a selected animal are transformed with a nucleic acid sequence encoding a polypeptide having protease activity of the present invention to express and produce the polypeptide. El polipéptido puede ser recuperado del animal, por ejemplo de la leche de animales hembras, o el polipéptido puede ser expresado en beneficio del propio animal, por ejemplo para facilitar la digestión del animal. The polypeptide may be recovered from the animal, for instance milk female animals, or the polypeptide may be expressed to the benefit of the animal itself, for example to facilitate the digestion of the animal. Unos ejemplos de animales son mencionados más abajo en la sección denominada Alimentos para Animales. Examples of animals are mentioned below in the section entitled Feedstuffs.

Para producir un animal transgénico con el fin de recuperar la proteasa de la leche del animal, un gen de codificación de la proteasa puede ser insertado en los huevos fertilizados de un animal determinado, por ejemplo mediante el uso de un vector de expresión de transgen que comprenda un promotor de proteínas de leche adecuado y el gen de codificación de la proteasa. To produce a transgenic animal in order to recover the protease of the animal's milk, a gene encoding the protease may be inserted into the fertilized eggs of a particular animal, for example by the use of an expression vector transgene comprises a promoter suitable milk protein and the gene encoding protease. El vector de expresión del transgen es microinyectado en los huevos fertilizados, y preferiblemente integrado de forma permanente en el cromosoma. The transgene expression vector is microinjected in it fertilized eggs, and preferably permanently integrated into the chromosome form. Un vez que el huevo empieza a crecer ya dividirse, el embrión potencial es implantado en una madre portadora, y los animales portadores del transgen son identificados. A Once the egg begins to grow and divide, the potential embryo is implanted into a surrogate mother, and animals carrying the transgene are identified. El animal resultante puede ser multiplicado después por reproducción convencional. The resulting animal can then be multiplied by conventional breeding. El polipéptido puede ser purificado de la leche del animal, véase por ejemplo Meade, HM et al (1999): Expression of recombinant proteins in the milk of transgenic animals, Gene expression systems: Using nature for the art of expression. The polypeptide may be purified from the animal's milk, see e.g. Meade, HM et al (1999): Expression of recombinant proteins in the milk of transgenic animals, Gene expression systems: Using nature for the art of expression. JM Fernández y JP Hoeffler (eds.), Academic Press. JM Fernandez and JP Hoeffler (eds.), Academic Press.

Como alternativa, para producir un animal no humano que contenga en el genoma de sus células somáticas y/o germinales, una secuencia de ácidos nucléicos que incluya un constructo de transgen heterólogo con un transgen de codificación de la proteasa, el transgen puede ser enlazado operativamente a una primera secuencia reguladora para una expresión específica de la proteasa en la glándula salival, tal como se describe en WO 00/064247. Alternatively, to produce a non-human animal containing the genome of its somatic and / or germ cells a nucleic acid sequence comprising a construct of heterologous transgene with a transgene encoding the protease, the transgene may be operably linked a first regulatory sequence for a specific protease expression in salivary gland, as described in WO 00/064247.

Composiciones compositions

En otro aspecto más, la presente invención se refiere a composiciones comprendiendo un polipéptido de la presente invención. In another aspect, the present invention relates to compositions comprising a polypeptide of the present invention.

Las composiciones de polipéptido pueden ser preparadas según métodos conocidos en la técnica y pueden estar en forma de composición líquida o seca. The polypeptide compositions may be prepared by methods known in the art and may be in liquid or dry composition. Por ejemplo, la composición de polipéptido puede tener la forma de un granulado o microgranulado. For instance, the polypeptide composition may be in the form of a granulate or microgranulate. El polipéptido que debe ser incluido en la composición puede ser estabilizado según los métodos conocidos en la técnica. The polypeptide to be included in the composition may be stabilized by methods known in the art.

Se proporcionan unos ejemplos más abajo de usos preferidos de polipéptidos o composiciones de polipéptido según la invención. examples below of preferred polypeptides or polypeptide compositions according to the invention uses are provided.

Alimentos para animales Animal feed

La presente invención se dirige también a métodos de uso de los polipéptidos de la invención en alimentos para animales, así como a composiciones de alimentos y aditivos alimentarios comprendiendo los polipéptidos de la invención. The present invention is also directed to methods of using the polypeptides of the invention in animal feed, as well as to feed compositions and food additives comprising the polypeptides of the invention.

El término animal incluye todos los animales, incluyendo seres humanos. The term animal includes all animals, including humans. Unos ejemplos de animales son no rumiantes y rumiantes. Examples of animals are non-ruminants and ruminants. Los animales rumiantes incluyen por ejemplo, animales como ovejas, cabras, caballos, y ganado bovino, por ejemplo ganado bovino para carne, vacas, y terneros jóvenes. Ruminant animals include, for example, animals such as sheep, goats, horses, and cattle, such cattle meat, cows, and young calves. En una forma de realización particular, el animal es un animal no rumiante. In a particular embodiment, the animal is a non-ruminant animal. Los animales no rumiantes incluyen animales monogástricos, por ejemplo cerdos o puercos (incluyendo pero no limitándose a éstos, lechones, cerdos en crecimiento y cerdas); Non-ruminant animals include monogastric animals, eg pigs or swine (including but not limited to, piglets, growing pigs, and sows); aves de corral como pavos, patos y pollos (incluyendo pero sin limitarse a éstos, pollos jóvenes, gallinas ponedoras); poultry such as turkeys, ducks and chickens (including but not limited to, young chickens, laying hens); terneros jóvenes; young calves; y peces (incluyendo pero sin limitarse a éstos, salmones, truchas, tilapias, siluros y carpas; y crustáceos (incluyendo aunque sin limitarse a éstos, gambas y camarones). and fish (including but not limited to, salmon, trout, tilapia, catfish and carps; and crustaceans (including but not limited to, shrimp and prawn).

El término alimento o composición de alimento define cualquier compuesto, preparación, mezcla, o composición adecuada para, o destinada a ser ingerido por un animal. The term feed or feed composition defines any compound, preparation, mixture, or composition suitable for, or intended to be ingested by an animal.

En el uso según la invención, la proteasa puede ser proporcionada al animal antes de, después de, o simultáneamente con la dieta. In the use according to the invention, the protease may be provided to the animal before, after, or simultaneously with the diet. Esta última es la preferida. The latter is preferred.

En una forma de realización particular, la proteasa, en la forma en la que es añadida al alimento, o incluida en un aditivo alimentario está definida adecuadamente. In a particular embodiment, the protease, in the form in which it is added to food or a food additive included in is properly defined. Definida adecuadamente significa que la preparación de proteasas es al menos 50% pura tal y como se determina por cromatografía de exclusión por tamaño (véase Ejemplo 12 de WO 01/58275). properly defined means that the protease preparation is at least 50% pure as determined by size exclusion chromatography (see Example 12 of WO 01/58275). En otras formas de realización particulares la preparación de proteasas es al menos 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 94, o al menos 95% pura determinada mediante este método. In other particular embodiments the protease preparation is at least 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 94, or at least 95% pure as determined by this method.

Una preparación de proteasa definida adecuadamente es ventajosa. A protease preparation is advantageous properly defined. Por ejemplo, es mucho más fácil dosificar correctamente en el alimento una proteasa que sea esencialmente libre de interferir o contaminar otras proteasas. For example, it is much easier to dose correctly to the feed a protease that is essentially free from interfering or contaminating other proteases. El término dosis se refiere, en particular, a una forma adecuada para obtener resultados consistentes y constantes, ya la capacidad de optimizar la dosificación en base al efecto deseado. The term dose refers in particular to a form suitable for obtaining consistent and constant results, and the capability of optimizing dosage based upon the desired effect.

Para su uso en alimentos para animales, sin embargo, la proteasa no necesita ser tan pura; For use in animal feed, however, the protease need not be that pure; ésta puede por ejemplo incluir otras enzimas, en este caso, ésta podría definirse como una preparación de proteasas. this may for example include other enzymes, in this case, it could be defined as a protease preparation.

La preparación de proteasas puede ser (a) añadida directamente al alimento (o usada directamente en un proceso de tratamiento de proteínas), o (b) puede ser usada en la producción de una o más composiciones intermedias tales como aditivos alimentarios o premezclas que se añaden posteriormente al alimento (o usada en un proceso de tratamiento). The protease preparation can be (a) added directly to the feed (or used directly in a treatment process of proteins), or (b) can be used in the production of one or more intermediate compositions such as feed additives or premixes that subsequently added to the feed (or used in a treatment process). El grado de pureza descrito anteriormente se refiere a la pureza de la preparación de proteasa original, según se use con (a) o (b) más arriba. The degree of purity described above refers to the purity of the original protease preparation, as used with (a) or (b) above.

Las preparaciones de proteasa con purezas de este orden de magnitud son obtenibles en particular mediante el uso de métodos recombinantes de producción, mientras que éstas no pueden ser obtenidas fácilmente y están también expuestas a una variación entre lotes mucho mayor cuando la proteasa es producida por métodos de fermentación tradicional. The protease preparations with purities of this order of magnitude are obtainable in particular by using recombinant methods of production, whereas they may not be easily obtained and are also exposed to a variation between much larger batches when the protease is produced by methods traditional fermentation.

Por supuesto, la preparación de proteasa puede ser mezclada con otras enzimas. Of course, the protease preparation may be mixed with other enzymes.

En una forma de realización particular, la proteasa para un uso según la invención es capaz de solubilizar proteínas. In a particular embodiment, the protease for use according to the invention is capable of solubilising proteins. Un ensayo adecuado para determinar una proteína solubilizada está descrito en el Ejemplo 3. A suitable assay for determining a solubilized protein is described in Example 3.

La proteína puede ser una proteína animal, como la harina de carne y hueso, y/o la harina de pescado; The protein may be an animal protein, such as meat and bone, and / or fish meal; o puede ser una proteína vegetal. or it may be a vegetable protein.

El término proteínas vegetales como se utiliza en este caso se refiere a cualquier compuesto, composición, preparación o mezcla que incluya al menos una proteína derivada de u originada a partir de proteínas vegetales, incluyendo proteínas modificadas y derivados de proteína. The term vegetable proteins as used herein refers to any compound, composition, preparation or mixture that includes at least one protein derived from or originating from vegetable proteins, including modified proteins and protein derivatives. En formas de realización particulares, el contenido de proteína de las proteínas vegetales es de al menos 10, 20, 30, 40, 50, o 60% (p/p). In particular embodiments, the protein content of the vegetable proteins is at least 10, 20, 30, 40, 50, or 60% (w / w).

Las proteínas vegetales pueden ser derivadas de fuentes de proteína vegetal, tal como las leguminosas y los cereales, por ejemplo materiales procedentes de plantas de las familias Fabaceae ( Leguminosae ), Cruciferaceae, Chenopodiaceae , y Poaceae , como la harina de soja, harina de lupino y harina de colza. Vegetable proteins may be derived from vegetable protein sources, such as legumes and cereals, for example materials from plants of the families Fabaceae (Leguminosae), Cruciferaceae, Chenopodiaceae, and Poaceae, such as soy flour, lupine flour and rapeseed meal.

En una forma de realización particular, la fuente de proteínas vegetales es un material de una o más plantas de la familia Fabaceae , por ejemplo soja, lupina, guisantes, o habas. In a particular embodiment, the vegetable protein source is material from one or more plants of the family Fabaceae, eg soybean, lupine, pea, or bean.

En otra forma de realización particular, la fuente de proteína vegetal es un material de una o más plantas de la familia Chenopodiaceae , por ejemplo remolacha, remolacha azucarera, espinaca o quinoa. In another particular embodiment, the vegetable protein source is material from one or more plants of the family Chenopodiaceae, eg beet, sugar beet, spinach or quinoa.

Otros ejemplos de fuentes de proteína vegetal son las semillas de colza, semillas de girasol, semillas de algodón y col. Other examples of vegetable protein sources are rapeseed, sunflower seed, cottonseed et al.

La soja es una fuente preferida de proteína vegetal. Soybean is a preferred vegetable protein source.

Otros ejemplos de fuentes de proteína vegetal son los cereales como la cebada, el trigo, el centeno, la avena, el maíz (maíz), el arroz, el tritical, y el sorgo. Other examples of vegetable protein sources are cereals such as barley, wheat, rye, oats, corn (maize), rice, triticale, and sorghum.

El tratamiento según la invención de proteínas con al menos una proteasa de la invención produce una solubilización incrementada de las proteínas. The treatment according to the invention of proteins with at least one protease of the invention results in an increased solubilisation of proteins.

A continuación se dan ejemplos de % de proteína solubilizada obtenible mediante el uso de las proteasas de la invención en un modelo monogástrico in vitro : Al menos 102%, 103%, 104%, 105%, 106%, o al menos 107%, con respecto a un ensayo en blanco. Examples of% obtainable solubilized protein is given by using the proteases of the invention in a monogastric in vitro model: At least 102%, 103%, 104%, 105%, 106%, or at least 107%, relative to a blank. El porcentaje de proteína solubilizada es determinado mediante el uso del modelo monogástrico in vitro del Ejemplo 3 y/o del Ejemplo 10. El término solubilización de proteínas significa básicamente el transporte de proteína(s) en la solución. The percentage of solubilised protein is determined using the monogastric in vitro model of Example 3 and / or Example 10. The term solubilisation of proteins basically means transport protein (s) in the solution. Tal solubilización puede ser debida a una liberación mediada por proteasa de una proteína procedente de otros componentes de las composiciones naturales generalmente complejas como un producto alimentario. Such solubilisation may be due to protease-mediated release of protein from other components of the usually complex natural compositions such as a food product.

En otra forma de realización particular, la proteasa para un uso según la invención es capaz de aumentar la cantidad de proteínas digeribles. In another particular embodiment, the protease for use according to the invention is capable of increasing the amount of digestible proteins. A continuación se dan ejemplos de % de proteína digerida o digerible obtenible con el uso de las proteasas de la invención en un modelo monogástrico in vitro : Al menos 104%, 105%, 106%, 107%, 108%, 109%, 110%, 111%, 112%, 113%, 114%, 115%, o al menos 116%, con respecto a un ensayo en blanco. Examples of% of digested protein or indigestible obtainable using the proteases of the invention in a monogastric model are given in vitro: At least 104%, 105%, 106%, 107%, 108%, 109%, 110 %, 111%, 112%, 113%, 114%, 115%, or at least 116%, relative to a blank. El porcentaje de proteína digerida o digerible es determinado mediante el uso del modelo in vitro del Ejemplo 3 y/o del Ejemplo The percentage of digested or digestible protein is determined using the in vitro model of Example 3 and / or Example
10. 10.

A continuación se dan ejemplos de % de proteína digerida o digerible obtenible mediante el uso de las proteasas de la invención en un modelo in vitro de acuicultura: Al menos 103%, 104%, 105%, 106%, 107%, 108%, 109% o al menos 110%, con respecto a un blanco. Examples of% of digested protein or indigestible obtainable are given by using the proteases of the invention in an in vitro aquaculture model: At least 103%, 104%, 105%, 106%, 107%, 108%, 109% or at least 110%, relative to a blank. El porcentaje de proteína digerida o digerible es determinado mediante el uso del modelo in vitro de acuicultura del Ejemplo 4. The percentage of digested or digestible protein is determined using the aquaculture in vitro model of Example 4.

En otra forma de realización particular también, la proteasa para un uso según la invención es capaz de incrementar el Grado de Hidrólisis (DH) de las proteínas. In another particular embodiment also, the protease for use according to the invention is capable of increasing the Degree of Hydrolysis (DH) of proteins. A continuación se dan ejemplos de aumento de grado de hidrólisis obtenible en un modelo monogástrico in vitro : De al menos 102%, 103%, 104%, 105%, 106%, o al menos 107%, con respecto a un ensayo en blanco. Examples of increased degree of obtainable hydrolysis in a monogastric in vitro model are given: at least 102%, 103%, 104%, 105%, 106%, or at least 107%, relative to a blank . El DH es determinado usando el modelo monogástrico in vitro del Ejemplo 3. A continuación se dan ejemplos del aumento del Grado de Hidrólisis obtenible en un modelo in vitro de acuicultura: De al menos 102%, 103%, 104%, 105%, 106%, o al menos 107%, con respecto a un blanco. The DH is determined using the monogastric in vitro model of Example 3. Examples of the increased degree of hydrolysis obtainable in an in vitro model of aquaculture are given: at least 102%, 103%, 104%, 105%, 106 %, or at least 107%, relative to a blank. El DH es determinado usando el modelo in vitro de acuicultura del Ejemplo 4. The DH is determined using the aquaculture in vitro model of Example 4.

En una forma de realización particular de un procedimiento de (pre-) tratamiento de la invención, la(s) protea- In a particular embodiment of a method of (pre-) treatment of the invention, the (s) protea-
sa(s) en cuestión están afectando (o actuando sobre, o ejerciendo su influencia de solubilización sobre) las proteínas o fuentes de proteína. sa (s) in question is affecting (or acting on, or exerting its solubilising influence on of) the proteins or protein sources. Para conseguir esto, la proteína o fuente de proteína es suspendida típicamente en un solvente, por ejemplo un solvente acuoso tal como el agua, y los valores de pH y de temperatura son ajustados en función de las características de la enzima en cuestión. To achieve this, the protein or protein source is typically suspended in a solvent, for example an aqueous solvent such as water, and the pH and temperature are adjusted to the characteristics of the enzyme in question. Por ejemplo, el tratamiento puede realizarse con un valor de pH con el que la actividad de proteasa real es de al menos 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o de al menos 90%. For example, treatment can be performed with a pH value with which actual protease activity is at least 40%, 50%, 60%, 70%, 80% or at least 90%. Asimismo, por ejemplo, el tratamiento puede realizarse a una temperatura en la que la actividad de proteasa real sea de al menos 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o de al menos 90%. Also, for example, treatment can be performed at a temperature at which actual protease activity is at least 40%, 50%, 60%, 70%, 80% or at least 90%. Las indicaciones de porcentaje de actividad anteriores son relativas a las actividades máximas. Indications percentage of previous activity are relative to the maximum activities. La reacción enzimática se continúa hasta obtener el resultado deseado, después de lo cual puede ser o no detenida por inactivación de la enzima, por ejemplo por una fase de tratamiento térmico. The enzymatic reaction is continued until the desired result, after which may or may not halted by inactivating the enzyme, e.g. by a heat treatment step.

En otra forma de realización particular de un proceso de tratamiento de la invención, la acción de la proteasa es sostenida, lo que indica por ejemplo, que la proteasa es añadida a las proteínas o fuentes de proteína, pero que su influencia de solubilización es tal que no se activa hasta más tarde cuando se desee, una vez que se han establecido las condiciones de solubilización adecuadas, o una vez que se ha inactivado cualquier inhibidor enzimático, o se podría aplicar cualquier otro medio para posponer la acción de la enzima. In another particular embodiment of a treatment process of the invention, the protease action is sustained, indicating for example that the protease is added to the proteins or protein sources, but its influence solubilization is such that is not activated until later when desired, once established conditions suitable solubilization, or once inactivated any enzyme inhibitor, or could apply other means to postpone the action of the enzyme.

En una forma de realización, el tratamiento es un pretratamiento para alimentos para animales o proteínas para un uso en los alimentos para animales. In one embodiment, the treatment is a pretreatment for animal feed or proteins for use in animal feed.

Los términos mejorar el valor nutritivo de un alimento para animales significa mejorar la disponibilidad y/o digestibilidad de las proteínas, llevando de ese modo una mayor extracción de las proteínas de los componentes de las dietas, a mayores rendimientos de las proteínas, a una mayor degradación de las proteínas y/oa un uso mejor de las proteínas. The terms of improving the nutritional value of an animal feed means improving the availability and / or protein digestibility, thereby bringing greater protein extraction component of diets, higher yields of proteins, greater protein degradation and / or a better use of proteins. El valor nutritivo del alimento es por lo tanto incrementado, y el rendimiento del animal como el índice de crecimiento y/o el aumento de peso y/o el ratio de conversión del alimento (es decir, el peso del alimento ingerido con respecto al aumento de peso) del animal es/son mejorados. The nutritional value of food is therefore increased, and the animal performance such as growth rate and / or weight gain and / or the ratio of feed conversion (i.e. the weight of ingested feed relative to increase weight) of the animal is / are improved.

En una forma de realización particular la ratio de conversión del producto alimentario es aumentado en al menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% o al menos 10%. In a particular embodiment the conversion ratio of food product is increased by at least 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% or at least 10%. En otra forma de realización particular el aumento de peso es aumentado en al menos 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10% o al menos 11%. In another particular embodiment the weight gain is increased by at least 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10% or at least 11%. Estas cifras se refieren a experimentos de control sin adición de proteasas. These figures refer to control experiments without addition of proteases.

La ratio de conversión de alimentos (FCR) y el aumento de peso pueden ser calculados tal como se describe en EEC (1986): Directive de la Commission du 9 avril 1986 fixant la méthode de calcul de la valeur énérgetique des aliments composés destinés á la volaille. The conversion ratio (FCR) and the weight gain may be calculated as described in EEC (1986): Directive de la Commission du 9 avril 1986 fixant la méthode de calcul de la valeur ENERGETIQUE des aliments composés destinies to the volaille. Journal Officiel des Communautés Européennes, L130, 53 - 54. Journal Officiel des Communautés Européennes, L130, 53-54.

La proteasa puede ser añadida al alimento en cualquier forma, en forma de una proteasa relativamente pura, o en forma de mezcla con otros componentes destinados a la adición en alimentos para animales, es decir en forma de aditivos de alimentos para animales, tales como las denominadas premezclas para alimentos para animales. The protease may be added to the feed in any form, as a relatively pure protease, or in admixture with other components intended for addition to animal feed, i.e. in the form of additives of animal feed, such as called premixes for animal feeds.

En otro aspecto la presente invención se refiere a composiciones para usar en los alimentos para animales, como los alimentos para animales y aditivos de alimentos para animales, por ejemplo premezclas. In another aspect the present invention relates to compositions for use in animal feed, such as animal feed and animal feed additives, for example premixes.

Aparte de la proteasa de la invención, los aditivos de alimentos para animales de la invención contienen al menos una vitamina liposoluble, y/o al menos una vitamina hidrosoluble, y/o al menos un oligoelemento. Apart from the protease of the invention, additives of animal feed of the invention contain at least one fat-soluble vitamin, and / or at least one water soluble vitamin, and / or at least one trace element. El aditivo alimentario también puede contener al menos un macromineral. The food additive may also contain at least one macro.

Además, unos ingredientes opcionales aditivos en productos alimentarios son los agentes colorantes, por ejemplo carotenoides como beta-caroteno, astaxantina, y luteína; In addition, an optional additive ingredients in food products are coloring agents, carotenoids such as beta-carotene, astaxanthin, and lutein; compuestos aromáticos; aromatics; estabilizadores; stabilizers; péptidos antimicrobianos; antimicrobial peptides; ácidos grasos poliinsaturados; polyunsaturated fatty acids; especies generadoras de oxígeno reactivo; reactive oxygen generating species; y/o al menos otra enzima seleccionada entre las alfa-amilasa (EC 3.2.1.1), fitasa (EC 3.1.3.8 o 3.1.3.26); and / or at least one other enzyme selected from amongst alpha-amylase (EC 3.2.1.1), phytase (EC 3.1.3.8 or 3.1.3.26); xilanasa (EC 3.2.1.8); xylanase (EC 3.2.1.8); galactanasa (EC 3.2.1.89); galactanase (EC 3.2.1.89); alfa-galactosidasa (EC 3.2.1.22); alpha-galactosidase (EC 3.2.1.22); proteasa (EC 3.4.-.-), fosfolipasa A1 (EC 3.1.1.32); protease (EC 3.4.-.-), phospholipase A1 (EC 3.1.1.32); fosfolipasa A2 (EC 3.1.1.4); phospholipase A2 (EC 3.1.1.4); lisofosfolipasa (EC 3.1.1.5); lysophospholipase (EC 3.1.1.5); fosfolipasa C (3.1.4.3); phospholipase C (3.1.4.3); fosfolipasa D (EC 3.1.4.4); phospholipase D (EC 3.1.4.4); amilasa tal como, por ejemplo, alfa-amilasa (EC 3.2.1.1); amylase such as, for example, alpha-amylase (EC 3.2.1.1); y/o beta-glucanasa (EC 3.2.1.4 o EC 3.2.1.6). and / or beta-glucanase (EC 3.2.1.4 or EC 3.2.1.6).

En una forma de realización particular estas otras enzimas son definidas correctamente (tal como han sido definidas anteriormente para las preparaciones de proteasas). In a particular embodiment these other enzymes are defined correctly (as have been defined above for protease preparations).

Unos ejemplos de péptidos antimicrobianos (AMP's) son CAP18, Leucocina A, Tritrpticina, Protegrina-1, Tanatina, Defensina, Lactoferrina, Lactoferricina, y Ovispirina tal como Novispirina (Robert Lehrer, 2000), Plectasinas, y Estatinas, incluyendo los compuestos y polipéptidos descritos en WO 03/044049 y WO 03/048148, así como variantes o fragmentos de los anteriores que retengan actividad antimicrobiana. Examples of antimicrobial peptides (AMP's) are CAP18, Leucocina A, Tritrpticina, Protegrin-1, thanatin, Defensin, Lactoferrin, Lactoferricin, and Ovispirina as Novispirin (Robert Lehrer, 2000), Plectasinas, and Statins, including the compounds and polypeptides WO 03/044049 described in WO 03/048148 and as well as variants or fragments of the above that retain antimicrobial activity.

Unos ejemplos de polipéptidos antifúngicos (AFP's) son el Aspergillus giganteus , y péptidos de Aspergillus niger , así como variantes y fragmentos de éstos que retengan actividad antifúngica, tal y como se describe en WO 94/01459 y WO 02/090384. Examples of antifungal polypeptides (AFP's) are the Aspergillus giganteus, and Aspergillus niger peptides, as well as variants and fragments thereof which retain antifungal activity, as described in WO 94/01459 and WO 02/090384.

Unos ejemplos de ácidos grasos poliinsaturados son los ácidos grasos poliinsaturados C18, C20 y C22, como el ácido araquidónico, ácido docosohexaenoico, ácido eicosapentanoico y ácido gamma-linolénico. Examples of polyunsaturated fatty acids are polyunsaturated fatty acids C18, C20 and C22, as arachidonic acid, docosohexaenoico acid, eicosapentaenoic acid and gamma-linolenic acid.

Unos ejemplos de especies generadoras de oxígeno reactivo son productos químicos como el perborato, persulfato, o percarbonato; Examples of reactive oxygen generating species are chemicals such as perborate, persulphate, or percarbonate; y enzimas como una oxidasa, una oxigenasa o un sintetasa. and enzymes such as an oxidase, an oxygenase or synthetase.

Generalmente, las vitaminas hidrosolubles y liposolubles, así como los oligoelementos forman parte de una llamada premezcla destinada a ser añadida en el producto alimentario, mientras que los macrominerales son generalmente añadidos separadamente en el producto alimentario. Generally, watersoluble and liposoluble vitamins, trace elements as well as part of a premix call destined to be added in the food product, whereas macro minerals are usually separately added to the food product. Una premezcla enriquecida con una proteasa de la invención es un ejemplo de un aditivo de alimentos para animales de la invención. Enriched with a protease of the invention premix is ​​an example of an animal feed additive of the invention.

En una forma de realización particular, el aditivo de alimentos para animales de la invención está destinado a ser incluido (o prescrito para ser incluido) en dietas o alimentos para animales en niveles del 0,01 al 10,0%; In a particular embodiment, the animal feed additive of the invention is intended to be included (or prescribed to be included) in animal diets or feed at levels of 0.01 to 10.0%; más particularmente del 0,05 al 5,0%; more particularly 0.05 to 5.0%; o 0,2 al 1,0% (el % indica los gramos de aditivo por 100 g de producto alimentario). or 0.2 to 1.0% (% indicates the grams of additive per 100 g of food product). Se realizan así, en particular, premezclas. premixes perform well in particular.

Las listas siguientes son listas no exclusivas de ejemplos de estos componentes: The following lists are not exclusive lists of examples of these components:

Ejemplos de vitaminas liposolubles son la vitamina A, vitamina D3, vitamina E, y vitamina K, por ejemplo vitamina K3. Examples of fat soluble vitamins are vitamin A, vitamin D3, vitamin E, and vitamin K, vitamin K3 for example.

Ejemplos de vitaminas hidrosolubles son la vitamina B12, la biotina y colina, vitamina B1, vitamina B2, vitamina B6, niacina, ácido fólico y pantotenato, por ejemplo Ca-D-pantotenato. Examples of water soluble vitamins are vitamin B12, biotin and choline, vitamin B1, vitamin B2, vitamin B6, niacin, folic acid and pantothenate, for example Ca-D-pantothenate.

Ejemplos de oligoelementos son el manganeso, zinc, hierro, cobre, yodo, selenio, y cobalto. Examples of trace minerals are manganese, zinc, iron, copper, iodine, selenium, and cobalt.

Ejemplos de macrominerales son el calcio, fósforo y sodio. Examples of macro minerals are calcium, phosphorus and sodium.

Los requisitos nutritivos de estos componentes (ejemplificados con aves de corral y lechones/cerdos) están anotados en la Tabla A de WO 01/58275. The nutritional requirements of these components (exemplified with poultry and piglets birds / pigs) are listed on Table A of WO 01/58275. Los requisitos nutritivos significan que estos componentes deberían estar provistos en la dieta en las concentraciones indicadas. Nutritional requirements mean that these components should be provided in the diet in the concentrations indicated.

Como alternativa, el aditivo de alimentos para animales de la invención comprende al menos uno de los componentes individuales específicos en la Tabla A de WO 01/58275. Alternatively, the animal feed additive of the invention comprises at least one of the specific individual components in Table A of WO 01/58275. Al menos uno significa cualquiera de uno o más, uno, o dos, o tres, o cuatro, y así sucesivamente hasta los trece totales, o hasta los quince componentes individuales totales. At least one means any one or more, one, or two, or three, or four, and so on until the total, or until the fifteen total thirteen individual components. Más específicamente, al menos este componente individual está incluido en el aditivo de la invención en una cantidad tal con el fin de proveer una concentración en el alimento situada en la gama indicada en la columna cuatro, o columna cinco, o columna seis de la Tabla A. More specifically, at least the individual component is included in the additive of the invention in such an amount so as to provide a concentration in the food belonging to the range indicated in column four, or column five, or column six of Table TO.

La presente invención se refiere también a composiciones de alimentos para animales. The present invention also relates to animal feed compositions. Las composiciones de alimentos o dietas para animales poseen un contenido de proteínas relativamente alto. Food compositions or diets for animals have relatively high protein content. Las dietas de las aves de corral y de los cerdos pueden ser caracterizadas como está indicado en la Tabla B de WO 01/58275, columnas 2-3. Diets poultry and pigs can be characterized as indicated in Table B of WO 01/58275, columns 2-3. Las dietas de los peces pueden ser caracterizadas como está indicado en la columna 4 de esta Tabla B. Además, estas dietas para peces presentan generalmente un contenido de grasa bruta de 200-310 g/kg. The fish diets can be characterized as indicated in column 4 of this Table B. Furthermore, these fish diets usually have a crude fat content of 200-310 g / kg. La patente WO 01/58275 corresponde a la patente US 09/779334 incorporadas en la presente como referencia. WO 01/58275 patent the corresponding to US patent 09/779334 incorporated herein by reference.

Una composición de alimento para animales según la invención tiene un contenido de proteína bruta de 50-800 g/kg, y comprende también al menos una proteasa tal y como se reivindica aquí. A composition animal feed according to the invention has a crude protein content of 50-800 g / kg, and also comprises at least one protease as claimed herein.

Además, o como alternativa (respecto al contenido de proteína bruta indicado más arriba), la composición del alimento para animales de la invención posee un contenido de energía metabolizable de 10-30 MJ/kg; In addition, or alternatively (relative to the crude protein content indicated above), the animal feed composition of the invention has a metabolizable energy content of 10-30 MJ / kg; y/o un contenido de calcio de 0,1-200 g/kg; and / or a calcium content of 0.1-200 g / kg; y/o un contenido de fósforo disponible de 0,1-200 g/kg; and / or a phosphorus content available 0.1-200 g / kg; y/o un contenido de metionina de 0,1-100 g/kg; and / or a content of methionine of 0.1-100 g / kg; y/o un contenido de metionina más cisteína de 0,1-150 g/kg; and / or a content of methionine plus cysteine ​​of 0.1-150 g / kg; y/o un contenido de lisina de 0,5-50 g/kg. and / or lysine content of 0.5-50 g / kg.

En unas formas de realización particulares, el contenido de energía metabolizable, proteína cruda, calcio, fósforo, metionina, metionina más cisteína, y/o de lisina está situado en cualquiera de las gamas 2, 3, 4 o 5 en la Tabla B de WO 01/58275 (R. 2-5). In some particular embodiments, the content of metabolisable energy, crude protein, calcium, phosphorus, methionine, methionine plus cysteine, and / or lysine is located in any of the ranges 2, 3, 4 or 5 in Table B of WO 01/58275 (R. 2-5).

La proteína bruta es calculada como el nitrógeno (N) multiplicado por un factor 6,25, es decir proteína bruta (g/kg)= N (g/kg) x 6.25. The crude protein is calculated as nitrogen (N) multiplied by a factor 6.25, i.e. Crude protein (g / kg) = N (g / kg) x 6.25. El contenido de nitrógeno es determinado por el método Kjeldahl (AOAC, 1984, Official Methods of Analysis 14th ed., Association of Official Analytical Chemists, Washington DC). The nitrogen content is determined by the Kjeldahl method (AOAC, 1984, Official Methods of Analysis 14th ed., Association of Official Analytical Chemists, Washington DC).

La energía metabolizable puede ser calculada en base a la publicación sobre requisitos nutritivos NRC en cerdos, novena edición corregida 1988, subcomisión sobre la nutrición de cerdos, comité sobre nutrición animal, comité de agricultura, consejo de investigación nacional. The metabolizable energy can be calculated based on the publication NRC nutritional requirements in swine, ninth revised edition 1988, subcommittee on swine nutrition, committee on animal nutrition, agriculture committee, National Research Council. National Academy Press, Washington, DC, pp. National Academy Press, Washington, DC, pp. 2-6, y la Tabla de Valores Energéticos para Alimentos para Aves de Corral, Spelderholt centre for poultry research and extension, 7361 DA Beekbergen, Paises Bajos. 2-6, and Table of Energy Values ​​for Poultry Food, Spelderholt center for poultry research and extension, 7361 DA Beekbergen, Netherlands. Grafisch bedrijf Ponsen & looijen bv, Wageningen. Grafisch bedrijf Ponsen & Looijen bv, Wageningen. ISBN 90-71463-12-5. ISBN 90-71463-12-5.

El contenido dietético de calcio, fósforo y aminoácidos disponibles en dietas completas para animales es calculado en base a tablas alimentarias tales como la Veevoedertabel 1997, gegevens over chemische samenstelling, verteerbaarheid en voederwaarde van voedermiddelen, Central Veevoederbureau, Runderweg 6, 8219 pk Lelystad. The dietary content of calcium, phosphorus and amino acids available in complete animal diets is calculated based on food tables such as Veevoedertabel 1997, gegevens over chemische Samenstelling, verteerbaarheid in voederwaarde van voedermiddelen, Central Veevoederbureau, Runderweg 6, 8219 pk Lelystad. ISBN 90-72839-13-7. ISBN 90-72839-13-7.

En una forma de realización particular, la composición de alimentos para animales de la invención contiene al menos una proteína o fuente de proteína tal y como se ha definido anteriormente. In a particular embodiment, the animal feed composition of the invention contains at least one protein or protein source as defined above. También puede contener proteína animal, tal como la harina de carne y de hueso, y/o harina de pescado, normalmente en una cantidad del 0-25%. It may also contain animal protein, such as meat and bone, and / or fish meal, usually in an amount of 0-25%.

También en otras formas de realización particulares, la composición de alimentos para animales de la invención contiene 0-80% de maíz; In other particular embodiments, the animal feed composition of the invention contains 0-80% maize; y/o 0-80% de sorgo; and / or 0-80% sorghum; y/o 0-70% de trigo; and / or 0-70% wheat; y/o 0-70% de cebada; and / or 0-70% Barley; y/o 0-30% de avena; and / or 0-30% oats; y/o 0-40% de harina de soja; and / or 0-40% soybean meal; y/o 0-25% de harina de pescado; and / or 0-25% fish meal; y/o 0-25% de harina de carne y de hueso; and / or 0-25% meat and bone; y/o 0-20% de lactosuero. and / or 0-20% whey.

Los alimentos para animales pueden ser fabricados por ejemplo en forma de alimento triturado (no granulado) o alimento granulado. The feed can be produced for example in the form of comminuted feed (non pelleted) or pelleted feed. Normalmente, los productos alimentarios molidos son mezclados y unas cantidades suficientes de vitaminas esenciales y minerales son añadidas según las especificaciones para las especies en cuestión. Typically, the milled food products are mixed and sufficient quantities of essential vitamins and minerals are added according to the specifications for the species in question. Unas enzimas pueden ser añadidas en forma de formulaciones de enzimas sólidas o líquidas. Enzymes can be added as solid or liquid formulations of enzymes. Por ejemplo, una formulación de enzima sólida es añadida habitualmente antes de o durante la fase de mezcla; For example, a formulation of solid enzyme is typically added before or during the mixing stage; y una preparación enzimática líquida es añadida habitualmente después de la fase de granulación. and a liquid enzyme preparation is added usually after the granulation phase. La enzima también puede ser incorporada en un aditivo o premezcla para alimentos. The enzyme can also be incorporated into a food additive or premix.

La concentración de enzima final en la dieta está en la gama de 0,01-200 mg de proteína enzimática por kg de dieta, por ejemplo en la gama de 0,5-25 mg de proteína enzimática por kg de dieta para animales. The final enzyme concentration in the diet is in the range of 0.01-200 mg enzyme protein per kg diet, for example in the range 0.5-25 mg enzyme protein per kg animal diet.

La proteasa debería ser aplicada así en una cantidad eficaz, es decir en una cantidad adecuada para mejorar la solubilización y/o mejorar el valor nutritivo de la comida. Protease and it should be applied in an effective amount, ie in an amount adequate for improving solubilisation and / or improving the nutritional value of food. Se considera actualmente que la enzima es administrada en una o más de las cantidades siguientes (gamas de dosificación): 0,01-200. It is currently considered that the enzyme is administered in one or more of the following amounts (dosage ranges): 0.01-200. 0,01-100. 0.01-100. 0,5-100. 0.5-100. 1-50. 1-50. 5-100. 5-100. 10-100. 10-100. 0,05-50, o 0,10-10 - todas estas gamas presentándose en mg de proteína de enzima proteasa por kg de alimentos (ppm). 0.05-50, or from 0.10 to 10 - all these ranges appearing in mg protease enzyme protein per kg of feed (ppm).

Para determinar los mg de proteína enzimática por kg de comida, la proteasa es purificada de la composición alimentaria, y la actividad específica de la proteasa purificada es determinada usando un ensayo relevante (véase en función de una actividad proteasa, sustratos, y ensayos). For determining mg enzyme protein per kg of feed, the protease is purified from the feed composition, and the specific activity of the purified protease is determined using a relevant assay (see function of a protease, substrates activity, and assays). La actividad proteasa de la composición alimentaria como tal es determinada también por el mismo ensayo, y la dosificación en mg de proteína enzimática por kg de producto alimentario es calculada en base a estas dos determinaciones. The protease activity of the feed composition as such is also determined by the same assay, and dosage in mg enzyme protein per kg food product is calculated on the basis of these two determinations.

Se aplican los mismos principios para determinar los mg de proteína enzimática en aditivos alimentarios. the same principles apply for determining mg enzyme protein in feed additives. Por supuesto, si se dispone de una muestra de la proteasa usada para preparar el aditivo alimentario o el producto alimentario, la actividad específica es determinada a partir de esta muestra (sin necesidad de purificar la proteasa de la composición alimentaria o del aditivo). Of course, if available a sample of the protease used to prepare the food additive or food product, the specific activity is determined from this sample (no need to purify the protease from the feed composition or the additive).

Composiciones para detergentes Detergent compositions

La proteasa de la invención puede ser añadida y así convertirse en un componente de una composición para detergentes. The protease of the invention may be added and thus become a component of a detergent composition.

La composición para detergentes de la invención por ejemplo puede ser formulada como una composición para detergentes de lavado a mano oa máquina incluyendo una composición de aditivo adecuada para el pretratamiento de tejidos teñidos y una composición para suavizante de tejidos añadido durante el enjuague, o ser formulada como una composición para detergentes para un uso en operaciones de limpieza de superficie dura en hogares en general, o ser formuladas para operaciones de lavado de vajilla a mano o en lavavajillas. The composition for detergents of the invention may for example be formulated as a composition for washing detergents hand or machine including a composition suitable for pretreatment of stained fabrics additive and a composition for fabric softener added during rinsing, or be formulated as a detergent composition for use in operations hard surface cleaning in general household, or be formulated for dishwashing operations by hand or in a dishwasher.

En un aspecto específico, la invención provee un aditivo para detergentes comprendiendo la proteasa de la invención. In a specific aspect, the invention provides a detergent additive protease of the invention comprising. El aditivo para detergentes así como la composición de detergentes puede comprender una u otras enzimas más como otra proteasa, proteasas alcalinas de Bacillus, una lipasa, una cutinasa, una amilasa, una carbohidrasa, una celulasa, una pectinasa, una mananasa, una arabinasa, una galactanasa, una xilanasa, una oxidasa, por ejemplo una lacasa, y/o una peroxidasa. The detergent additive as well as the detergent composition may comprise one or more other enzymes more as another protease, alkaline proteases from Bacillus, a lipase, a cutinase, an amylase, a carbohydrase, a cellulase, a pectinase, a mannanase, an arabinase, one galactanase, a xylanase, an oxidase, a laccase for example, and / or a peroxidase.

En general las propiedades de la(s) enzima(s) elegida(s) deberían ser compatibles con el detergente seleccionado, (es decir pH óptimo, compatibilidad con otros ingredientes enzimáticos y no enzimáticos, etc.), y la(s) enzima(s) debería(n) estar presentes en cantidades efectivas. In general the properties of the enzyme (s) (s) chosen (s) should be compatible with the selected detergent, (ie pH-optimum, compatibility with other enzymatic ingredients and non-enzymatic, etc.), and the enzyme (s) (s) should (n) be present in effective amounts.

Las lipasas adecuadas incluyen las de origen bacteriano o fúngico. Suitable lipases include those of bacterial or fungal origin. Los mutantes de proteína creados genéticamente o modificados químicamente están incluidos. Protein mutants genetically created or modified chemically are included. Ejemplos de lipasas útiles incluyen lipasas de Humicola (sinónimo de Thermomyces ), por ejemplo de H. lanuginosa ( T. lanuginosus ) tal y como están descritas en EP 258068 y EP 305216 o de H. insolens tal y como están descritas en WO 96/13580, una lipasa de Pseudomonas , por ejemplo de P. alcaligenes o P. pseudoalcaligenes (EP 218272), P. cepacia (EP 331376), P. stutzeri (GB 1,372,034), P. fluorescens , especie Pseudomonas , cepa SD 705 (WO 95/06720 y WO 96/27002), P. wisconsinensis (WO 96/12012), una lipasa de Bacillus , por ejemplo de B. subtilis (Dartois et al . (1993), Biochemica et Biophysica Acta, 1131, 253-360), B. stearothermophilus (JP 64/744992) o B. pumilus (WO 91/16422). Examples of useful lipases include lipases from Humicola (synonym Thermomyces), e.g. H. lanuginosa (T. lanuginosus) as described in EP 258068 are EP 305216 and H. insolens or as are described in WO 96 / 13580, a Pseudomonas lipase, e.g. P. alcaligenes or P. pseudoalcaligenes (EP 218 272), P. cepacia (EP 331376), P. stutzeri (GB 1,372,034), P. fluorescens, Pseudomonas species, strain SD 705 (WO 95/06720 and WO 96/27002), P. wisconsinensis (WO 96/12012), a Bacillus lipase, eg from B. subtilis (Dartois et al. (1993), Biochemica et Biophysica Acta, 1131, 253-360 ), B. stearothermophilus (JP 64/744992) or B. pumilus (WO 91/16422). Otros ejemplos son variantes de lipasa tal y como están descritas en WO 92/05249, WO 94/01541, EP 407225, EP 260105, WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615, WO 97/04079 y WO 97/07202. Other examples are lipase variants as described in WO 92/05249 are, WO 94/01541, EP 407225, EP 260105, WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95 / 14783, WO 95/22615, WO 97/04079 and WO 97/07202. Las enzimas de lipasa preferidas comercialmente disponibles incluyen Lipolase^{TM} y Lipolase Ultra^{TM} (Novozymes NS). Preferred lipase enzymes include Lipolase commercially available {TM} and Lipolase Ultra TM} {(Novozymes NS). Las amilasas adecuadas (alfa y/o beta) incluyen las que son de origen bacteriano o fúngico. Suitable amylases (alpha and / or beta) include those that are bacterial or fungal origin. Se incluyen los mutantes de proteína creados genéticamente o modificados químicamente. protein mutants genetically engineered or chemically modified included. Las amilasas incluyen, por ejemplo, alfa-amilasas obtenidas de Bacillus , por ejemplo una cepa especial de B. licheniformis , descrita más detalladamente en GB 1,296,839. Amylases include, for example, alpha-amylases obtained from Bacillus, eg a special strain of B. licheniformis, described in more detail in GB 1,296,839. Ejemplos de amilasas útiles son las variantes descritas en WO 94/02597, WO 94/18314, WO 95/26397, WO 96/23873, WO 97/43424, WO 00/60060, y WO 01/66712, especialmente las variantes con sustituciones en una o más de las siguientes posiciones: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 181, 188, 190, 197, 202, 208, 209, 243, 264, 304, 305, 391, 408, y 444. Las amilasas comercialmente disponibles son Natalase^{TM}, Supramyl^{TM}, Stainzyme^{TM}, Duramyl^{TM}, Termamyl^{TM}, Fungamyl^{TM} y BAN^{TM} (Novozymes NS), Rapidase^{TM} y Purastar^{TM} (de Genencor International Inc.). Examples of useful amylases are the variants described in WO 94/02597, WO 94/18314, WO 95/26397, WO 96/23873, WO 97/43424, WO 00/60060, WO 01/66712 and, especially the variants with substitutions in one or more of the following positions: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 181, 188, 190, 197, 202, 208, 209, 243, 264, 304, 305, 391 , 408, and 444. commercially available amylases are Natalase ^ {TM}, {TM} Supramyl ^, ^ {TM} Stainzyme, Duramyl {TM}, {TM} Termamyl, Fungamyl ^ {TM} and {BAN ™ TM} (Novozymes NS), Rapidase ™ and Purastar {TM}} ^ {TM (Genencor International Inc.).

Las células adecuadas incluyen las que son de origen bacteriano o fúngico. Suitable cells include those that are of bacterial or fungal origin. Se incluyen los mutantes de proteína creados genéticamente o modificados químicamente. protein mutants genetically engineered or chemically modified included. Las celulasas adecuadas incluyen celulasas del género Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, por ejemplo las celulasas fúngicas producidas a partir de Humicola insolens, Myceliophthora thermophila y Fusarium oxysporum descritas en US 4,435,307, 5,648,263, 5,691,178, 5,776,757 y WO 89/09259. Suitable cellulases include cellulases from the genera Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, e.g. the fungal cellulases produced from Humicola insolens, Myceliophthora thermophila and Fusarium oxysporum disclosed in US 4,435,307, 5,648,263, 5,691,178, 5,776,757 and WO 89 / 09259. Las celulasas especialmente adecuadas son las celulasas alcalinas o neutras que poseen beneficios para el cuidado del color. Especially suitable cellulases are the alkaline or neutral cellulases have benefits for color care. Ejemplos de tales celulasas son las celulasas descritas en EP 0 495257, EP 531372, WO 96/11262, WO 96/29397, WO 98/08940. Examples of such cellulases are cellulases described in EP 0 495257, EP 531372, WO 96/11262, WO 96/29397, WO 98/08940. Otros ejemplos son variantes de celulasas como las que están descritas en WO 94/07998, EP 0 531 315, 5,457,046, 5,686,593, 5,763,254, WO 95/24471, WO 98/12307 y WO 99/01544. Other examples are cellulase variants such as those described in WO 94/07998, EP 0531315, 5457046, 5686593, 5763254, WO 95/24471, WO 98/12307 and WO 99/01544. Las celulasas comercialmente disponibles incluyen Celluzyme^{TM}, y Carezyme^{TM} (Novozymes NS), Clazinase^{TM}, y Puradax HA^{TM} (Genencor International Inc.), y KAC- 500(B)^{TM} (Kao Corporation). Commercially available cellulases include Celluzyme ^ {TM}, and {TM} ^ Carezyme (Novozymes), Clazinase ^ {TM}, and Puradax HA ^ {TM} (Genencor International Inc.), and KAC- 500 (B) + {TM} (Kao Corporation).

Las peroxidasas/oxidasas adecuadas incluyen las que son de origen vegetal, bacteriano o fúngico. Peroxidases / oxidases include those suitable are vegetable, bacterial or fungal origin. Se incluyen los mutantes de proteína creados genéticamente o modificados químicamente. protein mutants genetically engineered or chemically modified included. Ejemplos de peroxidasas útiles incluyen peroxidasas de Coprinus, p . Examples of useful peroxidases include peroxidases from Coprinus, p. ejemplo de C. cinereus , y variantes de éstas como las que están descritas en WO 93/24618, WO 95/10602, y WO 98/15257. example C. cinereus, and variants thereof such as those described in WO 93/24618, WO 95/10602, WO 98/15257 and. Las peroxidasas comercialmente disponibles incluyen Guardzyme^{TM} Commercially available peroxidases include Guardzyme ^ {TM}
(Novozymes). (Novozymes).

La(s) enzima(s) de detergente puede(n) ser incluida(s) en una composición de detergente mediante la adición de aditivos separados conteniendo una o más enzimas, o por adición de un aditivo combinado comprendiendo todas estas enzimas. The enzyme (s) (s) of detergent may (n) be included (s) in a detergent composition by adding separate additives containing of one or more enzymes, or by adding a combined additive comprising all of these enzymes. Un aditivo para detergentes de la invención, es decir un aditivo separado o un aditivo combinado, puede estar formulado por ejemplo como un granulado, un líquido, un gel, etc. A detergent additive of the invention, ie a separate additive or a combined additive, can be formulated eg as a granulate, a liquid, a gel, etc. Las formulaciones preferidas de aditivo para detergentes son los granulados, en particular granulados no pulverulentos, líquidos, en particular líquidos estabilizados, o geles. Preferred detergent additive formulations are granulates, in particular non-dusting granulates, liquids, in particular stabilized liquids, or gels.

Los granulados no pulverulentos pueden ser producidos, por ejemplo, tal y como está descrito en US 4,106,991 y 4,661,452 y pueden ser revestidos opcionalmente mediante métodos conocidos en la técnica. Non-dusting granulates may be produced, for example, as is described in US 4,106,991 and 4,661,452 and may optionally be coated by methods known in the art. Unos ejemplos de materiales de revestimiento cerosos son los productos de óxido de poli(etileno), (polietilenoglicol, PEG) con pesos molares medios de 1000 a 20000; Examples of waxy coating materials are oxide products poly (ethylene), (polyethyleneglycol, PEG) with mean molar weights of 1000 to 20000; nonilfenoles etoxilados que poseen 16 a 50 unidades de óxido de etileno; ethoxylated nonylphenols having 16 to 50 ethylene oxide units; alcoholes grasos etoxilados en los que el alcohol contiene de 12 a 20 átomos de carbono y donde se encuentran 15 a 80 unidades de óxido de etileno; ethoxylated fatty alcohols in which the alcohol contains from 12 to 20 carbon atoms and which are 15 to 80 ethylene oxide units; alcoholes grasos; fatty alcohols; ácidos grasos; fatty acids; y mono- y di- y triglicéridos de ácidos grasos. and mono- and di- and triglycerides of fatty acids. En GB 1483591 se proveen ejemplos de materiales de revestimiento para la formación de películas adecuadas para la aplicación mediante técnicas de lecho fluidizado. In GB 1483591 examples of coating materials for forming suitable for application by fluid bed techniques are provided films. Las preparaciones enzimáticas líquidas pueden, por ejemplo, ser estabilizadas mediante la adición de un poliol como el propilenoglicol, azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico o ácido bórico según métodos establecidos. Liquid enzyme preparations may, for instance, be stabilized by adding a polyol such as propylene glycol, sugar or sugar alcohol, lactic acid or boric acid according to established methods. Unas enzimas protegidas pueden ser preparadas según el método descrito en EP A Protected enzymes may be prepared according to the method described in EP
238216. 238,216.

La composición de detergente de la invención puede ser de cualquier forma apropiada, por ejemplo, una barra, una pastilla, un polvo, un gránulo, una pasta o un líquido. The detergent composition of the invention may be of any suitable shape, for example, a bar, a tablet, a powder, a granule, a paste or a liquid. Un detergente líquido puede ser acuoso, conteniendo generalmente hasta 70% de agua y 0-30% de solvente orgánico, o no acuoso. A liquid detergent may be aqueous, containing generally up to 70% water and 0-30% organic solvent, or nonaqueous.

La composición de detergente comprende uno o más agentes tensioactivos, que pueden ser no iónicos incluyendo semipolares y/o aniónicos y/o catiónicos y/o zwitteriónicos. The detergent composition comprises one or more surfactants, which may be nonionic including semi-polar and / or anionic and / or cationic and / or zwitterionic. Los agentes tensioactivos están presentes en general en un nivel del 0,1% al 60% en peso. Surfactants are generally present in a level from 0.1% to 60% by weight.

Cuando está incluido dentro, el detergente contendrá en general desde aproximadamente 1% hasta aproximadamente 40% de agente tensioactivo aniónico tal como un alquilbencenosulfonato lineal, alfa-olefinsulfonato, sulfato de alquilo (sulfato de alcohol graso), etoxisulfato de alcohol, alcanosulfonato secundario, éster metílico de ácido alfa-sulfo graso, ácido alquilo o alquenilsuccínico o jabón. When included in the detergent it will generally contain from about 1% to about 40% of anionic surfactant such as linear alkylbenzenesulfonate, alpha-olefinsulfonate, alkyl sulfate (fatty alcohol), alcohol ethoxysulfate, secondary alkanesulfonate, sulfate ester methyl alpha-sulfo fatty of acid, alkyl or alkenylsuccinic or soap.

Cuando está incluido dentro, el detergente contiene en general desde aproximadamente 0,2% hasta aproximadamente 40% de agente tensioactivo no-iónico tal como un alcohol etoxilado, nonilfenol, etoxilato alquilpoliglicósido, óxido de alquildimetilamina, monoetanolamida de ácido graso etoxilado, monoetanolamida de ácido graso, polihidroxialquilamidas de ácido graso, o derivados N-acilo N-alquilo de glucosamina ("glucamidas"). When included in the detergent generally it contains from about 0.2% to about 40% of nonionic surfactant such as an ethoxylated alcohol, nonylphenol ethoxylate alkylpolyglycoside, alkyldimethylamine oxide, ethoxylated fatty acid monoethanolamide, monoethanolamide acid fatty, polyhydroxyalkylamides fatty acid, or N-acyl N derivatives alkyl-glucosamine ( "glucamides").

El detergente puede contener 0-65% de un constructor de detergente o agente complejante tal como zeolita, difosfato, trifosfato, fosfonato, carbonato, citrato, ácido nitrilotriacético, ácido etilenodiaminatetraacético, ácido dietilenotriaminopentaacético, ácido alquilo o alquenilsuccínico, silicatos solubles o silicatos estratificados (por ejemplo SKS-6 de Hoechst). The detergent may contain 0-65% of a detergent builder or complexing agent such as zeolite, diphosphate, triphosphate, phosphonate, carbonate, citrate, nitrilotriacetic acid, ethylenediaminetetraacetic acid, diethylenetriaminepentaacetic acid, alkyl or alkenylsuccinic, soluble silicates or layered silicates ( eg SKS-6 from Hoechst).

El detergente puede comprender uno o más polímeros. The detergent may comprise one or more polymers. Unos ejemplos son carboximetilcelulosa, poli(vinilpirrolidona), poli(etilenoglicol), poli(vinil alcohol), poli(vinilpiridina-N-oxido), poli(vinilimidazol), policarboxilatos como poliacrilatos, copolímeros de ácido maléico/acrílico y copolímeros de lauril metacrilato/ácido acrílico. Examples are carboxymethylcellulose, poly (vinylpyrrolidone), poly (ethylene glycol), poly (vinyl alcohol), poly (vinylpyridine-N-oxide), poly (vinylimidazole), polycarboxylates such as polyacrylates, maleic / acrylic copolymers and lauryl methacrylate / acrylic acid.

El detergente puede contener un sistema blanqueante que puede comprender una fuente de H_{2}O_{2} como el perborato o percarbonato que puede estar combinado con un activador blanqueador de formación de perácidos como tetraacetiletilenodiamina o nonanoiloxibencenosulfonato. The detergent may contain a bleaching system which may comprise a source of H {2} {2} O_ as perborate or percarbonate which may be combined with a bleach activator formation of peracids as tetraacetylethylenediamine or nonanoyloxybenzenesulfonate. De forma alternativa, el sistema blanqueante puede comprender peroxiácidos por ejemplo de amida, imida, o de un tipo de sulfona. Alternatively, the bleaching system may comprise peroxyacids of eg the amide, imide, or sulfone type a.

La(s) enzima(s) de la composición de detergente de la invención puede(n) ser estabilizada(s) usando agentes convencionales estabilizantes, por ejemplo un poliol como el propilenoglicol o glicerol, azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico, ácido bórico, o un derivado de ácido bórico, por ejemplo éster de borato aromático, o un derivado de ácido fenil borónico como el ácido 4-formilfenil borónico, y la composición puede estar formulada tal y como está descrito, por ejemplo en WO 92/19709 y WO 92/19708. The enzyme (s) (s) of the detergent composition of the invention may (n) be stabilized (s) using conventional stabilizing agents, eg a polyol such as propylene glycol or glycerol, sugar or sugar alcohol, lactic acid, boric or boronic acid derivative, for example aromatic borate ester, or a derivative of phenyl boronic acid as 4-formylphenyl boronic acid and the composition may be formulated as described, for example in WO 92/19709 92/19708 and WO.

El detergente puede contener también otros ingredientes de detergentes convencionales como por ejemplo acondicionadores para tejidos incluyendo arcillas, reforzadores de espuma, supresores de espuma, agentes anticorrosivos, agentes de suspensión de suciedad, agentes de antiposo de suciedad, tintes, bactericidas, blanqueadores ópticos, hidrotropos, inhibidores de decoloración, o perfumes. The detergent may also contain other conventional detergent ingredients such as conditioners for fabrics including clays, foam boosters, suds suppressors, anticorrosion agents, soil suspending agents antiposo dirt, dyes, bactericides, optical brighteners, hydrotropes , tarnish inhibitors, or perfumes.

Se considera actualmente que en las composiciones de detergentes, cualquier enzima, en particular la enzima de la invención, puede ser añadida en una cantidad correspondiente a 0,01-100 mg de proteína enzimática por litro de detergente, preferiblemente 0,05-5 mg de proteína enzimática por litro detergente, en particular 0,1-1 mg de proteína enzimática por litro de detergente. It is currently considered that in the detergent compositions any enzyme, in particular the enzyme of the invention may be added in an amount corresponding to 0.01-100 mg of enzyme protein per liter of detergent, preferably 0.05-5 mg of enzyme protein per liter detergent, in particular 0.1-1 mg of enzyme protein per liter of detergent.

La enzima de la invención puede estar incorporada también en las formulaciones para detergentes descritas en WO 97/07202. The enzyme of the invention may also be incorporated in detergent formulations disclosed in WO 97/07202.

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Depósito de material biológico Deposit of biological material

Los siguientes materiales biológicos han sido depositados según las condiciones del tratado de Budapest con el DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Alemania), y con los siguientes números de registro: The following biological materials have been deposited under the terms of the Budapest Treaty with the DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Germany), and with the following accession numbers:

  \newpage \ newpage 

Depósito Deposit Número de registro Registry number Fecha de depósito Deposit date
Nocardiopsis alba Nocardiopsis alba DSM 15647 DSM 15647 30 de mayo de 2003 May 30, 2003
Nocardiopsis especie Nocardiopsis species DSM 16424 DSM 16424 24 de mayo de 2004 May 24, 2004

Estas cepas han sido depositadas en unas condiciones que aseguran que el acceso al cultivo estará disponible durante el trámite de esta solicitud de patente a quien sea designado por el Comisario de Patentes y Marcas Registradas que debe aparecer en los párrafos 37 CFR \NAK1.14 y 35 USC \NAK122. These strains have been deposited under conditions that assure that access to the culture will be available during the pendency of this patent application who is designated by the Commissioner of Patents and Trademarks to be displayed in paragraphs 37 CFR \ NAK1.14 and 35 USC \ NAK122. El depósito representa un cultivo esencialmente puro de la cepa depositada. The deposit represents a substantially pure culture of the deposited strain. El depósito está disponible según lo requerido por las leyes de patentes extranjeras en aquellos países donde las contrapartidas de la solicitud expuesta, o de su progenie estén depositados. The deposit is available as required by foreign patent laws in countries where counterparts of exposed application, or its progeny are deposited. No obstante, se entenderá que la disponibilidad de un depósito no constituye una licencia para poner en práctica la invención expuesta en la derogación de derechos de patentes concedidas por medio de una acción gubernamental. However, it is understood that the availability of a deposit does not constitute a license to practice the invention set forth in derogation of patent rights granted by government action.

Nocardiopsis dassonvillei , subeespecie dassonvillei DSM 43235 está disponible al público por DSMZ. Nocardiopsis dassonvillei, subeespecie dassonvillei DSM 43235 is publicly available from DSMZ. También se depositó en otras instituciones depositarias tales como las siguientes: ATCC 23219, IMRU 1250, NCTC 10489. It was also deposited in other depository institutions such as: ATCC 23219, IMRU 1250, NCTC 10489.

La invención descrita y reivindicada aquí no debe ser limitada en su ámbito por las formas de realización específicas descritas aquí, ya que estas formas de realización están previstas como ilustraciones de varios aspectos de la invención. The invention described and claimed herein is not to be limited in scope by the specific embodiments herein disclosed, since these embodiments are provided as illustrations of several aspects of the invention. Cualquiera de las formas de realización equivalentes está destinadas a formar parte del campo de esta invención. Any equivalent embodiments are intended to be part of the scope of this invention. En efecto, de la descripción precedente los expertos en la materia deducirán varias modificaciones de la invención además de las que están mostradas y descritas aquí. Indeed, the foregoing description those skilled in the art will recognize various modifications of the invention in addition to those that are shown and described herein. Tales modificaciones también están previstas como una parte del ámbito de las reivindicaciones anexas. Such modifications are also provided as part of the scope of the appended claims. En caso de conflicto se tendrá en cuenta la descripción presente incluyendo las definiciones. In case of conflict shall take into account the present disclosure including definitions.

Varias referencias son citadas aquí, cuyas descripciones han sido incorporadas completas como referencia. Various references are cited herein, the disclosures of which are incorporated complete reference.

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Ejemplos Examples

Ejemplo 1 Example 1

Clonación y expresión de la proteasa de Nocardiopsis dassonvillei , subespecie dassonvillei DSM 43235 Cloning and expression of the protease of Nocardiopsis dassonvillei, subspecies dassonvillei DSM 43235 Reactivos y medios Reagents and media

LB agar LB agar
Descrito en Ausubel, FM et al . Described in Ausubel, FM et al. (eds.) "Current protocols in Molecular Biology". (Eds.) "Current protocols in Molecular Biology". John Wiley and Sons, 1995 John Wiley and Sons, 1995

LB-PG agar LB-PG agar
LB agar con suplemento del 0,5% de Glucosa y 0,05 M de fosfato de potasio, pH 7,0 LB agar supplement of 0.5% Glucose and 0.05 M potassium phosphate, pH 7.0

PS-1 PS-1
10% de sacarosa, 4% de harina de soja, 1% Na_{3}PO_{4}-12H_{2}O, 0,5% de CaCO_{3}, y 0,01% de ácido plurónico 10% sucrose, 4% soybean flour, 1% Na {3} {4} PO -12H_ {2} O, 0.5% CaCO_ {3}, and 0.01% pluronic acid

TE TEA
10 mM Tris-HCl, pH 7,4 10 mM Tris-HCl, pH 7.4

1 mM EDTA, 1 mM EDTA,

pH pH
8,0 8.0

TEL TEL
50 mg/ml de Lisozima en tampón TE 50 mg / ml lysozyme in TE buffer

Tiocianato thiocyanate
5M de tiocianato de guanidio 100 mM de EDTA 5M guanidium thiocyanate 100 mM EDTA

0,6% en p/v de N-laurilsarcosina, sal de sodio 0.6% w / v N-lauroyl sarcosine of sodium salt

60 g de tiocianato, 20 ml 0,5 m de EDTA, pH 8,0, 20 ml de H_{2}O se disuelve a 65ºC. 60 g thiocyanate, 20 ml 0.5 M EDTA, pH 8.0, 20 ml of H {2} O dissolves at 65C. Temperatura de enfriamiento a temperatura ambiente (RT) y adición de 0,6 g de N-laurilsarcosina. Cooling temperature to room temperature (RT) and addition of 0.6 g of N-lauryl sarcosine. Adición de H_{2}O en 100 ml y filtrado de éste a través de un filtro estéril de 0,2 \mu. Addition of H {2} O in 100 ml and filter it through a 0.2 sterile filter \ mu.

NH_{4}Ac NH {4} Ac
7,5 M de CH_{3}COONH_{4} 7.5 M CH 3} {4} {COONH_

TER TER
1 \mug/ml Rnase A en tampón TE 1 \ mug / ml Rnase A in TE buffer

CIA INC
Cloroformo/alcohol isoamilico 24:1 Chloroform / isoamyl alcohol 24: 1
Procedimiento experimental experimental procedure

La SEC ID Nº: 1 es la secuencia de ADN de codificación de una proforma de la proteasa Nocardiopsis dassonvillei , subespecie dassonvillei DSM 43235. Los nucleótidos 499-1062 corresponden a la parte de codificación del péptido maduro. SEQ ID NO: 1 is the DNA sequence encoding a proform of the protease Nocardiopsis dassonvillei subspecies dassonvillei DSM 43235. The nucleotides 499-1062 represent the portion encoding the mature peptide.

La SEC ID Nº: 2 es la secuencia de aminoácidos deducida de la SEC ID Nº: 1. Los aminoácidos -166 a -1 son el propéptido, y los aminoácidos 1 a 188 el péptido maduro. SEQ ID NO: 2 is the deduced amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. Amino acids -166 to -1 is the propeptide, and amino acids 1 to 188 the mature peptide.

Clonación de SEC ID Nº: 1 Cloning of SEQ ID NO: 1

El tipo salvaje fue cultivado durante 3 días antes de la recogida en el medio siguiente a 30ºC: The wild type was grown for 3 days prior to harvest in the following medium at 30 ° C:

4 4

El ADN genómico de Nocardiopsis dassonville , subespecie dassonvillei DSM 43235 fue aislado según el procedimiento siguiente: Genomic DNA from Nocardiopsis Dassonville subspecies dassonvillei DSM 43235 was isolated according to the following procedure:

1. one.
Recogida de 1,5 ml de cultivo y resuspensión en 100 \mul de TEL. Collecting 1.5 ml culture and resuspended in 100 \ mul TEL. Incubación a 37ºC durante 30 min. Incubation at 37 for 30 min.

2. two.
Adición de 500 \mul de tampón de tiocinato y disposición a temperatura ambiente durante 10 min. Adding 500 \ mul thiocyanate buffer and disposal at room temperature for 10 min.

3. 3.
Adición de 250 \mul de NH_{4}Ac y disposición en hielo durante 10 min. Adding 250 \ l of NH {4} and available Ac on ice for 10 min.

4. Four.
Adición de 500 \mul de CIA y mezcla. Adding 500 \ mul of CIA and mix.

5. 5.
Transferencia en una microcentrifugadora y centrifugado durante 10 min. Transfer in a microcentrifuge and spin for 10 min. a máxima velocidad. at full speed.

6. 6.
Transferencia de sobrenadante a un tubo de Eppendorf nuevo y adición de 0,54 de isopropanol frío por volumen. Transfer supernatant to a new Eppendorf tube and adding 0.54 volume of cold isopropanol. Mezcla rigurosa. Mix rigorous.

7. 7.
Centrifugado y lavado del granulado de ADN con 70% de EtOH. Centrifuging and washing the DNA pellet with 70% EtOH.

8. 8.
Resuspensión del ADN genómico en 100 \mul de TER. Resuspension of genomic DNA in 100 \ mul RET.

El ADN genómico fue usado como molde para una amplificación por PCR mediante el uso de iniciadores de SEC ID Nº. Genomic DNA was used as template for PCR amplification using primers SEQ ID NO. 3 y 4. El fragmento de PCR fue aislado en 0,7% de gel de agarosa y digerido con enzimas de restricción Cla I y BamH I. El iniciador 1565 (SEC ID Nº: 4) afecta a un sitio BamH I cambiando un codón de arginina de CGG a AGA e introduce un nuevo sitio BamH I hacia abajo desde el codón de detención. 3 and 4. The PCR fragment was isolated by 0.7% agarose gel and digested with restriction enzymes Cla I and BamH I. The initiator 1565 (SEQ ID NO: 4) affects a BamH I site by changing a codon arginine CGG to AGA and introduces a new BamH I site down from the stop codon.

Iniciadores initiators

1423: 5'-GCT TTT AGT TCA TCG ATC GCA TCG GCT GCT CCG GCC CCC GTC CCC CAG-3' (SEC ID Nº: 3) 1423: 5'-GCT TTT AGT TCA TCG ATC GCA TCG GCT GCT GTC CCC CCC GCC GCC CAG-3 '(SEQ ID NO: 3)

1565: 5'- GCG GAT CCT ATT AGG TTC TGA TCC TGA CAC CCC AG-3' 1565: 5'- GCG GAT CCT ATT AGG TTC TGA TCC TGA CAC CCC AG-3 '

  \hskip3.2cm \ hskip3.2cm 
(SEC ID Nº: 4) (SEQ ID NO: 4)

El fragmento de PCR digerido y purificado fue ligado al plásmido digerido Cla I y BamH I pDG268NeoMCS-PramyQ/PrcryIII/cryIIIAstab/Sav (Patente EEUU: 5,955,310). The digested PCR fragment was purified and ligated to Cla I-digested plasmid and BamH I pDG268NeoMCS-PramyQ / PrcryIII / cryIIIAstab / Sav (US Patent: 5,955,310).

La mezcla de ligación fue usada para una transformación en E. coli TOP10F' (Invitrogen BV, Países Bajos) y varias colonias fueron seleccionadas para una minipreparación (centrifugado QIAprep, QIAGEN Gmbh, Alemania). The ligation mixture was used for transformation into E. coli TOP10F '(Invitrogen BV, Netherlands) and several colonies were selected for miniprep (QIAprep spin, QIAGEN GmbH, Germany). Los plásmidos purificados fueron controlados para su inserción antes de la transformación en una cepa de Bacillus subtilis derivada de B. subtilis DN 1885 con genes rotos apr npr y pel (Diderichsen et al (1990), J. Bacterol., 172, 4315-4321). The purified plasmids were checked for insertion before transformation into a strain of Bacillus subtilis derived from B. subtilis DN 1885 with apr npr genes broken and pel (Diderichsen et al (1990), J. Bacterol., 172, 4315-4321 ). La ruptura fue realizada esencialmente tal y como se ha descrito en "Bacillus subtilis and other Gram-Positive Bacteria," American Society for Microbiology, p.618, eds. Rupture was performed essentially as described in "Bacillus subtilis and other Gram-Positive Bacteria," American Society for Microbiology, P.618, eds. AL Sonenshein, JA Hoch and Richard Losick (1993). AL Sonenshein, JA Hoch and Richard Losick (1993). Las células transformadas fueron depositadas en placas en 1% de leche desnatada de placas agar LB-PG, con un suplemento de 6 pg/ml de cloranfenicol. The transformed cells were deposited on plates in 1% skim milk LB agar plate-PG, supplemented with 6 pg / ml chloramphenicol. Las células depositadas en placas fueron incubadas toda una noche a 37ºC y unas colonias conteniendo proteasas fueron identificadas por una zona de clarificación circundante. Deposited in plaques cells were incubated overnight at 37 and colonies containing a protease were identified by a surrounding area of ​​clarification. Las colonias positivas de proteasas fueron seleccionadas y la secuencia codificante de la enzima expresada a partir del constructo de expresión fue confirmado por análisis de secuencia de ADN. Positive colonies were selected and protease coding sequence of the expressed enzyme from the expression construct was confirmed by DNA sequence analysis.

Fermentación Fermentation

La célula huésped de Bacillus subtilis transformada tal y como se ha descrito anteriormente fue fermentada en una mesa de agitación giratoria (250 rpm) en 500 ml en frascos Erlenmeyer con deflector conteniendo 100 ml de medio PS-1 con un suplemento de 6 \mug/ml de cloranfenicol, a 37ºC durante 16 horas ya 26ºC durante 4 días más. The host cell of Bacillus subtilis transformed as described above was fermented on a table rotary shaking (250 rpm) in 500 ml Erlenmeyer flasks with baffle containing 100 ml of PS-1 supplemented with 6 \ mug / ml chloramphenicol, at 37 ° C for 16 hours and 26 ° C for 4 days.

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Ejemplo 2 example 2

Purificación y caracterización de la proteasa Nocardiopsis dassonvillei , subespecie dassonvillei DSM 43235 Purification and characterization Nocardiopsis dassonvillei protease, subspecies dassonvillei DSM 43235 Ensayos de proteasa Protease assays 1) Ensayo de pNA: 1) pNA assay:

Sustrato de pNA: PNA substrate:
Suc-AAPF-pNA (Bachem L-1400). Suc-AAPF-pNA (Bachem L-1400).

Temperatura: Temperature:
Temperatura ambiente (25ºC) room temperature (25)

Tampones de ensayo: Assay buffers:
100 mM de ácido succínico, 100 mM de HEPES, 100 mM de CHES, 100 mM de CABS, 1 mM de CaCl_{2}, 150 mM de KCl, 0.01% de Tritón X-100 ajustados a valores de pH 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0, 11,0 y 12.0 con HCl o NaOH. 100mM succinic acid, 100mM HEPES, 100mM CHES, 100mM CABS, 1 mM CaCl {2} of 150 mM KCl, 0.01% Triton X-100 adjusted to pH 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0, 11.0 and 12.0 with HCl or NaOH.

Se mezclan 20 \mul de proteasa (diluida en 0,01% de Tritón X-100) con 100 \mul de tampón de ensayo. 20 \ mul protease (diluted in 0.01% Triton X-100) with 100 \ uL of assay buffer are mixed. El ensayo es iniciado mediante la adición de 100 \mul de sustrato de pNA (50 mg disueltos en 1,0 ml de DMSO y diluidos después 45 x con 0,01% de Tritón X-100). The assay is initiated by adding 100 \ mul pNA substrate (50mg dissolved in 1.0ml DMSO and diluted after 45 x with 0.01% Triton X-100). El aumento en OD_{405} es vigilado como una medida de la actividad proteasa. Increased OD_ {405} is monitored as a measure of protease activity.

2) Ensayo de Protazyme AK : 2) Test Protazyme AK:

Sustrato: Substratum:
comprimidos Protazyme AK (caseína reticulada y teñida; de Megazyme) Protazyme AK tablets (crosslinked and dyed casein; from Megazyme)

Temperatura: Temperature:
controlada (temperatura de ensayo). controlled (assay temperature).

Tampones de ensayo: Assay buffers:
100 mM de ácido succínico, 100 mM de HEPES, 100 mM de CHES, 100 mM de CABS, 1 mM de CaCl_{2}, 150 mM de KCl, 0,01% de Tritón X-100 ajustados a valores de pH 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0 y 11,0 con HCl o NaOH. 100mM succinic acid, 100mM HEPES, 100mM CHES, 100mM CABS, 1 mM CaCl {2} of 150 mM KCl, 0.01% Triton X-100 adjusted to pH 2, 0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0 and 11.0 with HCl or NaOH.

Un comprimido Protazyme AK es suspendido en 2,0 ml de 0,01% de Tritón X-100 mediante una agitación suave. Protazyme AK tablet is suspended in 2.0ml 0.01% Triton X-100 by gentle stirring. 500 \mul de esta suspensión y 500 \mul de tampón de ensayo son mezclados en un tubo Eppendorf y colocados en hielo. 500 \ l of this suspension and 500 \ uL of assay buffer are mixed in an Eppendorf tube and placed on ice. Se añaden 20 \mul de muestra de proteasa (diluidos en 0,01% de Tritón X-100). 20 \ mul protease sample (diluted in 0.01% Triton X-100) are added. El ensayo es iniciado por transferencia del tubo Eppendorf a un termomezclador Eppendorf, que se ajusta a la temperatura de ensayo. The assay is initiated by transferring the Eppendorf tube to an Eppendorf thermomixer, which is set to the test temperature. El tubo es incubado durante 15 minutos en el termomezclador Eppendorf a su máxima velocidad de agitación (1400 rpm). The tube is incubated for 15 minutes on the Eppendorf thermomixer at its highest shaking rate (1400 rpm). La incubación es detenida por transferencia del tubo de vuelta al baño de hielo. Incubation is stopped by transferring the tube back to the ice bath. El tubo es centrifugado después en un centrifugador de congelación durante unos minutos y 200 \mul de sobrenadante es transferido a una placa de microtitulación. The tube is then centrifuged in a centrifuge freezing for a few minutes and 200 \ l of supernatant is transferred to a microtiter plate. OD_{650} es leída como una medida de la actividad proteasa. {650} OD_ is read as a measure of protease activity. Un tampón ciego es incluido en el ensayo (en vez de la enzima). A buffer blind is included in the assay (instead of enzyme).

Procedimiento experimental experimental procedure

La fermentación de proteasa descrita en el ejemplo 1 fue centrifugada (20000 xg, 20 min) y los sobrenadantes fueron decantados cuidadosamente de los precipitados. Protease fermentation described in Example 1 was centrifuged (20000 xg, 20 min) and the supernatants were decanted carefully precipitates. Los sobrenadantes combinados fueron filtrados a través de una placa Seitz EKS para eliminar el resto de las células huéspedes de Bacillus . The combined supernatants were filtered through a Seitz EKS plate to remove the rest of the Bacillus host cells. El filtrado EKS fue transferido a 50 mM de H_{3}BO_{3}, 5 mM de ácido succínico, 1 mM de CaCl_{2}, pH 7 en una columna Sephadex G25 y aplicado a una columna de bacitracina silica equilibrada en el mismo tampón. The EKS filtrate was transferred to 50mM H {3} BO {3}, 5mM succinic acid, 1mM CaCl {2}, pH 7 on a Sephadex G25 column and applied to a column of silica bacitracin balanced in same buffer. Después de un lavado extensivo de la columna con el tampón de equilibrado, la proteasa fue eluida por fase con 100 mM de H_{3}BO_{3}, 10 mM de ácido succínico, 2 mM de CaCl_{2}, 1 M de NaCl, 25% de isopropanol, pH 7. El eluato de bacitracina fue transferido a 50 mM de H_{3}BO_{3}, 10 mM de CH_{3}COOH, 1 mM de CaCl_{2}, pH 4,5 y aplicado a una columna S de Sefarosa HP equilibrada en el mismo tampón. After extensive washing of the column with the equilibration buffer, the protease was eluted by step with 100 mM H {3} BO {3}, 10mM succinic acid, 2mM CaCl {2}, 1 M NaCl, 25% isopropanol, pH 7. The bacitracin eluate was transferred to 50mM H 3} {3} {BO, 10mM CH 3} {COOH, 1 mM CaCl {2} of pH4.5 and applied to a S Sepharose HP column equilibrated in the same buffer. Después de un lavado extensivo de la columna con el tampón de equilibrado, la proteasa fue eluida con un gradiente de NaCl lineal (0 - After extensive washing of the column with the equilibration buffer, the protease was eluted with a linear NaCl gradient (0 - -> 0,5M) en el mismo tampón. -> 0.5M) in the same buffer. Fracciones de la columna fueron analizadas para determinar la actividad proteasa (usando el ensayo con Protazyme AK a 37ºC y pH 9) y unas fracciones activas fueron analizadas también por SDS-PAGE. Fractions from the column were analyzed for protease activity (using the Protazyme AK assay at 37 ° C and pH 9) and active fractions were also analyzed by SDS-PAGE. Las fracciones donde sólo una banda era vista en el gel de SDS-PAGE teñido con Coomassie fueron agrupadas en forma de preparación purificada y usadas para otra caracterización. Fractions, where only one band was seen on SDS-PAGE gel Coomassie stained were pooled as purified preparation and used for another characterization.

Actividad según pH, estabilidad según pH, y actividad según temperatura According pH activity, pH stability as and activity according to temperature

Se usó el ensayo con pNA para obtener el perfil de actividad en función del pH así como el perfil de estabilidad en función del pH. The pNA assay was used for obtaining the activity profile versus pH profile and stability in function of pH. Para el perfil de estabilidad según el pH la proteasa fue diluida 10x en los tampones de ensayo e incubada durante 2 horas a 37ºC. For stability profile pH Protease as it was diluted 10x in the assay buffers and incubated for 2 hours at 37C. Después de la incubación las muestras de proteasa fueron transferidas con el mismo pH - pH 9, antes del ensayo para determinar la actividad residual, por dilución en el tampón de ensayo de pH 9. Se usó el ensayo con Protazyme AK para obtener el perfil de actividad según la temperatura a un pH 9. Los resultados aparecen en las Tablas 1-3 más abajo. After incubation the protease samples were transferred to the same pH - pH 9, before assay for residual activity, by dilution in assay buffer of pH 9. The assay Protazyme AK was used to obtain the profile activity according to the temperature at pH 9. the results are shown in Tables 1-3 below.

TABLA 1 TABLE 1 Perfil de actividad en función del pH Activity profile versus pH

5 5

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TABLA 2 TABLE 2 Perfil de estabilidad según pH PH stability profile as

6 6

TABLA 3 TABLE 3 Perfil de actividad según temperatura Temperature activity profile as

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7 7

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 
Calorimetría diferencial de barrido (DSC) Differential Scanning Calorimetry (DSC)

Se usó la DSC para determinar la estabilidad de la temperatura con un pH 7,0 de las proteasas derivadas de Nocardiopsis dassonvillei , subespecie dassonvillei DSM 43235 y de la especie Nocardiopsis , NRRL 18262. Las proteasas purificadas fueron dializadas toda la noche a 4ºC en 10 mM de fosfato sódico, 50 mM de cloruro sódico, pH 7,0 y pasaron sobre un instrumento de VP-DSC (Microcalometría) con un índice de barrido constante de 1,5ºC/min de 20 a 100ºC. DSC was used to determine temperature stability at pH 7.0 of the proteases derived from Nocardiopsis dassonvillei subspecies dassonvillei DSM 43235 Nocardiopsis species and, NRRL 18262. Purified proteases were The dialyzed overnight at 4 ° C in 10 mM sodium phosphate, 50 mM sodium chloride, pH 7.0 and passed over a VP-DSC instrument (Microcalometría) with a constant scan rate of 1.5 ° C / min from 20 to 100C. El tratamiento de datos se realizó usando el software original de Microcalometría. Data processing was performed using the original software Microcalometría.

Las temperaturas de desnaturalización o de fusión resultantes, T_{m}, eran: Para la proteasa de la invención derivada de Nocardiopsis dassonvillei , subespecie dassonvillei de: 83,0ºC; Denaturation temperatures or resulting fusion, T_ {m}, were: For the protease of the invention derived from Nocardiopsis dassonvillei subspecies dassonvillei of: 83,0ºC; para la proteasa derivada de la especie de Nocardiopsis , NRRL 18262 de: 76,5ºC. for the protease derived from Nocardiopsis species, NRRL 18262 of: 76.5 ° C.

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Otras características Other features

Se comprobó que la proteasa era inhibida por metil fenil sulfonil fluoruro. It was found that the protease was inhibited by phenyl sulfonyl fluoride methyl. Su peso molecular relativo determinado por SDS-PAGE era M_{r} = 20 kDa, y la secuencia N-terminal: ADIIGGLAYYMGGRC. Its relative molecular weight as determined by SDS-PAGE was M_ {r} = 20kDa, and the N-terminal sequence: ADIIGGLAYYMGGRC.

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Ejemplo 3 example 3

Rendimiento de la proteasa de Nocardiopsis dassonvillei , subespecie dassonvillei DSM 43235 en un modelo de digestión in vitro monogástrico Performance Nocardiopsis dassonvillei protease, subspecies dassonvillei DSM 43235 in a model of digestion in vitro monogastric

El rendimiento de una preparación purificada de la parte madura de la proteasa que posee una SEC ID Nº: 2 (preparada tal y como está descrita en los Ejemplos 1 y 2) fue probado en un modelo in vitro simulando la digestión en animales monogástricos. The performance of a purified preparation of the mature part of the protease having a SEQ ID NO: 2 (prepared as is described in Examples 1 and 2) was tested in an in vitro model simulating the digestion in monogastric animals. En particular, se evaluó la proteasa con respecto a su capacidad para mejorar la solubilización y la digestión de proteínas de maíz/SBM (harinas a base de maíz/soja). In particular, the protease was evaluated for its ability to improve solubilisation and digestion of maize proteins / SBM (flour from corn / soy). En las tablas más abajo, esta proteasa es designada "proteasa de la invención". In the tables below, this protease is designated "protease of the invention". El sistema in vitro consistía en 15 frascos donde el sustrato de maíz/SBM era incubado inicialmente con HCl/pepsina - simulando una digestión gástrica - y posteriormente con pancreatina - simulando una digestión intestinal. The in vitro system consisted of 15 flasks in which maize substrate / SBM was initially incubated with HCl / pepsin - simulating gastric digestion - and subsequently with pancreatin - simulating intestinal digestion. 10 de los frascos fueron dosificados con la proteasa al principio de la fase gástrica mientras que los frascos restantes servían de blancos. 10 of the flasks were dosed with the protease at the start of the gastric phase whereas the remaining flasks served as targets. Al final de la fase de incubación intestinal las muestras de digestión in vitro fueron eliminadas y analizadas para determinar la proteína solubilizada y digerida. At the end of the intestinal incubation phase samples of in vitro digestion they were removed and analyzed for solubilised and digested protein.

Resumen del procedimiento de digestión in vitro Summary of in vitro digestion procedure

8 8

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 
Condiciones Terms

Sustrato: Substratum:
4 g de SBM, 6 g de maíz (premezclado) 4 g SBM, 6 g maize (premixed)

pH: pH:
3,0 en fase de estómago/6,8-7,0 en fase intestinal 3.0 under stomach / intestinal 6.8-7.0 in stage

HCl: HCl:
0,105 M durante 1,5 horas (es decir, premezcla de HCl-sustrato durante 30 min) 0.105 M for 1.5 hours (ie, HCl-substrate premixing for 30 min)

pepsina: pepsin:
3000 U/g por dieta durante 1 hora 3000 U / g diet for 1 hour by

pancreatina: pancreatin:
8 mg/g por dieta durante 4 horas 8 mg / g diet for 4 hours by

temperatura: temperature:
40ºC. 40.

Replicados: replicated:
5 5

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 
Soluciones solutions

0,39 M de NaOH 0.39 M NaOH

0,105 M de HCl 0.105 M HCl

0,105 M de HCl conteniendo 6000 U de pepsina por 5 ml 0.105 M HCl containing 6000 U pepsin per 5 ml

1 M de NaHCO_{3} conteniendo 16 mg de pancreatina por ml 1M sat'd {3} containing 16 mg pancreatin per ml

125 mM de tampón NaAc, pH 6,0 125 mM NaAc buffer, pH 6.0

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 
Determinaciones de proteína enzimática Determinations of enzyme protein

La cantidad de proteína de enzima proteásica (a continuación proteína enzimática abreviada EP) es calculada en base a los valores A_{280} ya las secuencias de aminoácidos (composiciones de aminoácidos) usando los principios resumidos en SC Gill & PH von Hippel, Analytical Biochemistry 182, 319-326. The amount of protein protease enzyme (hereinafter protein abbreviated enzymatic EP) is calculated based on A_ {280} and amino acid sequences (amino acid compositions) values ​​using the principles outlined in SC Gill & PH von Hippel, Analytical Biochemistry 182, 319-326. (1989). (1989).

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 
Procedimiento experimental para modelo in vitro Experimental procedure for in vitro model

El procedimiento experimental se definió según el perfil mencionado anteriormente. The experimental procedure was defined according to the above profile. El pH se midió en periodos de 1, 2,5, y 5,5 horas. The pH was measured at periods of 1, 2.5, and 5.5 hours. Se terminaron las incubaciones después de 6 horas y se retiraron muestras de 30 ml y se dispusieron en hielo antes del centrifugado (10000 X g, 10 min, 4ºC). incubations after 6 hours and samples were completed 30 ml were removed and placed on ice before centrifugation (10000 X g, 10 min, 4). Los sobrenadantes fueron retirados y almacenados a -20ºC. The supernatants were removed and stored at -20 ° C.

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 
Análisis Analysis

Se analizó el grado en % de proteína de todas las muestras con el método OPA así como el contenido de proteína solubilizada y digerida mediante el uso de una filtración en gel. the degree was analyzed in% protein of all samples with the OPA method as well as content of solubilised and digested using gel filtration protein.

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 
Determinación de DH por el método OPA DH determination by the OPA method

El grado de hidrólisis (OH) de proteína en distintas muestras fue determinado usando una placa de microtitulación semiautomatizada basada en un método calorimétrico (Nielsen, PM; Petersen, D.; Dambmann, C. Improved method for determining food protein degree of hydrolysis. J. Food Sci. 2001, 66, 642-646). The degree of hydrolysis (OH) of protein in different samples was determined using an semi-automated microtiter plate based colorimetric method on a (Nielsen, PM;. Petersen, D .; Dambmann, C. Improved method for Determining food protein degree of hydrolysis J . Food Sci. 2001, 66, 642-646). El agente reactivo de OPA fue preparado como se indica a continuación: 7.620 g de di-Na tetraborato decahidrato y 200 mg de dodecil sulfato de sodio (SDS) fueron disueltos en 150 ml de agua desionizada. The OPA reagent was prepared as follows: 7.620 g di-Na tetraborate of decahydrate and 200 mg of sodium dodecyl sulfate (SDS) were dissolved in 150 ml of deionized water. Los agentes reactivos fueron disueltos completamente antes de continuar. The reagents were completely dissolved before continuing. Se disolvieron 160 mg de o-ftaldialdehido al 97% (OPA) en 4 ml de etanol. 160 mg o-phthaldialdehyde of 97% (OPA) in 4 ml of ethanol were dissolved. La solución de OPA fue transferida cuantitativamente a la solución mencionada anteriormente mediante un aclarado con agua desionizada. The OPA solution was transferred quantitatively to it the above-mentioned solution by rinsing with deionized water. Se añadieron 176 mg de ditiotreitol al 99% (DTT) a la solución que fue preparada con 200 ml de agua desionizada. 176 mg dithiothreitol was added to 99% (DTT) to the solution which was prepared with 200 ml of deionized water. Una serina estándar (0.9516 meqv/l) fue preparada por solubilización de 50 mg de serina (Merck, Alemania) en 500 ml de agua desionizada. A serine standard (0.9516 meqv / l) was prepared by solubilising 50 mg serine (Merck, Germany) in 500 ml of deionized water.

La solución de muestra fue preparada mediante la dilución de cada muestra hasta una absorbencia (280 nm) de aproximadamente 0,5. The sample solution was prepared by diluting each sample to an absorbance (280 nm) of about 0.5. Generalmente, los sobrenadantes eran diluidos (100 x) usando una estación automatizada de dilución Tecan (Männedorf, Suiza). Generally, supernatants were diluted the (100 x) using an automated Tecan dilution station (Männedorf, Switzerland). Todas las otras lecturas del espectrofotómetro fueron realizadas a 340 nm usando agua desionizada como control. All other spectrophotometer readings were performed at 340 nm using deionized water as control. Se dispensaron 25 \mul de muestra, estándar y ciega en una placa de microtitulación. 25 \ mul sample, standard and blind in a microtiter plate were dispensed. La placa de microtitulación fue insertada en un lector iEM MF (Labsistems, Finlandia) y 200 \mul de agente reactivo de OPA fue proporcionado automáticamente. The microtiter plate was inserted into a reader MF IEM (Labsistems, Finland) and 200 \ l of OPA reagent was automatically provided. Las placas fueron agitadas (2 min; 700 rpm) antes de medir la absorbencia. The plates were shaken (2 min; 700 rpm) before measuring absorbance. Finalmente, se calculó el DH. Finally, the DH was calculated. Se efectuó la determinación óctuple de todas las muestras. the Eightfold determination of all samples was performed.

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 
Estimación de proteínas solubilizadas y digeridas Solubilized protein estimation and digested

El contenido de proteína solubilizada en los sobrenadantes de las muestras digeridas in vitro fue determinado por cuantificación de la proteína bruta (CP) usando una filtración en gel HPLC. The content of solubilised protein in supernatants from in vitro digested samples was determined by quantifying crude protein (CP) using gel filtration HPLC. Los sobrenadantes fueron descongelados, filtrados a través de filtros de 0,45 pM de policarbonato y diluidos (1:50, v/v) con H_{2}O. Supernatants were thawed, filtered through 0.45 pM filter and polycarbonate diluted (1:50, v / v) with H {2} O. Las muestras diluidas fueron cromatografiadas por HPLC usando una columna de filtración en gel (Global) de péptido Superdex PE (7,5 x 300 mM). Diluted samples were chromatographed by HPLC were using a gel filtration column (Global) PE Superdex peptide (7.5 x 300 mM). El eluyente usado para la elución isocrática fue de 50 mM de tampón de fosfato de sodio (pH 7,0) conteniendo 150 mM de NaCl. The eluent used for isocratic elution was 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0) containing 150 mM NaCl. El volumen total de eluyente por operación fue 26 ml y el caudal de 0,4 ml/min. The total volume of eluant was 26 ml per operation and the flow rate of 0.4 ml / min. Los perfiles de elución fueron registrados a 214 nm y el área total bajo los perfiles eran determinados por integración. Elution profiles were recorded at 214 nm and the total area under the profiles was determined by integration. Para estimar el contenido de proteína a partir de las áreas integradas, se estableció una curva de calibrado (R^{2}=0,9993) a partir de una serie de dilución de una muestra de maíz/SBM de referencia digerida in vitro con un contenido de proteínas totales conocido. To estimate protein content from integrated areas of a calibration curve (R {2} = 0.9993) was established from a serial dilution of a sample of corn / SBM reference digested in vitro with containing known total protein. La determinación de proteínas en esta muestra de referencia se efectuó usando el método Kjeldahl (determinación de % de nitrógeno; Official Methods of Analysis 14th ed., Washington DC). The protein determination in this reference sample was carried out using the Kjeldahl method (determination of% nitrogen;. Official Methods of Analysis 14th ed, Washington DC).

El contenido de proteína digerida fue determinado mediante la integración del área de cromatograma correspondiendo a péptidos y aminoácidos con una masa molecular de 1500 dalton o menos (Savoie, L.; Gauthier, SF Dialysis Cell For The In-vitro Measurement Of Protein Digestibility. J. Food Sci. 1986, 51, 494-498; Babinszky, L.; Van, DMJM; Boer, H.; Den, HLA An In-vitro Method for Prediction of The Digestible Crude Protein Content in Pig Feeds. J. Sci. Food Agr. 1990, 50, 173-178; Boisen, S.; Eggum, BO Critical Evaluation of In-vitro Methods for Estimating Digestibility in Simple-Stomach Animals. Nutrition Research Reviews 1991, 4, 141-162). The content of digested protein was determined by integrating the area of chromatogram corresponding to peptides and amino acids with a molecular mass of 1500 daltons or less (Savoie, L .; Gauthier, SF Dialysis Cell For The In-vitro Measurement Of Protein Digestibility. J . Food Sci 1986, 51, 494-498;. Babinszky, L .; Van, DMJM; Boer, H .; Den, An in-vitro HLA Method for Prediction of The Digestible Crude Protein Content in Pig Feeds J. Sci.. Food Agr 1990, 50, 173-178;. Boisen, S .; Eggum, BO Critical Evaluation of in-vitro Methods for Estimating Digestibility in Simple-Stomach Animals Nutrition Research Reviews 1991, 4, 141-162).. Para determinar la línea de división de 1500 dalton, la columna de filtración en gel se calibró usando citocromo C, (Boehringer, Alemania), aprotinina, gastrina I, y sustancia P (Sigma Aldrich, EEUU), como estándares de masa To determine the dividing line of 1500 Daltons column gel filtration was calibrated using cytochrome C (Boehringer, Germany), aprotinin, gastrin I, and substance P (Sigma Aldrich, USA), as mass standards
molecular. molecular.

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 
Resultados results

Los resultados mostrados en las Tablas 4 y 5 más abajo indican que la proteasa aumentaba el grado de hidrólisis (DH), así como la proteína soluble y digerible de forma significante. The results shown in Tables 4 and 5 below indicate that the protease increased the degree of hydrolysis (DH) as well as soluble and digestible protein significantly so.

TABLA 4 TABLE 4

9 9

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 
TABLA 5 TABLE 5

10 10

Ejemplo 4 example 4

Rendimiento de la proteasa de Nocardiopsis dassonvillei subespecie dassonvillei DSM 43235 en un modelo de acuicultura in vitro Performance Nocardiopsis protease dassonvillei subspecies dassonvillei DSM 43235 on aquaculture in vitro model

La preparación de proteasa tal y como está descrita en el ejemplo 3 fue evaluada en un modelo de acuicultura in vitro simulando la digestión de un pez en agua fría. The protease preparation as is described in Example 3 was evaluated in vitro model simulating the digestion of aquaculture fish in cold water. El sistema in vitro consistía en 15 frascos donde el sustrato SBM era incubado inicialmente con HCl/pepsina - simulando una digestión gástrica - y posteriormente con pancreatina - simulando una digestión intestinal. The in vitro system consisted of 15 flasks in which SBM substrate was initially the incubated with HCl / pepsin - simulating gastric digestion - and subsequently with pancreatin - simulating intestinal digestion. Se dosificaron 10 de los frascos con la proteasa al principio de la fase gástrica mientras que los 5 frascos restantes servían de blancos. 10 were dosed flasks with protease at the start of the gastric phase whereas the remaining flasks served five white. Al final de la fase de incubación intestinal, las muestras de digestión in vitro fueron eliminadas y analizadas para determinar la proteína solubilizada y digerida. At the end of the intestinal incubation phase, samples of in vitro digestion were removed and analyzed for solubilised and digested protein.

Resumen del procedimiento de digestión en agua in vitro Summary digestion process water in vitro

11 eleven

Condiciones Terms

Sustrato: Substratum:
10 g de SBM extrudido 10 g of extruded SBM

pH: pH:
3,0 en fase estomacal/6,8-7,0 en fase intestinal 3.0 in stomach / intestinal 6.8-7.0 phase phase

HCl: HCl:
0,155 M durante 6 horas 0.155 M for 6 hours

Pepsina: Pepsin:
4000 U/g por dieta durante 6 horas 4000 U / g diet for 6 hours per

Pancreatina: pancreatin:
8 mg/g por dieta durante 17 horas 8 mg / g diet for 17 hours for

Temperatura: Temperature:
15ºC 15ºC

Replicados: replicated:
5 5
Soluciones solutions

1,1 M de NaOH 1.1M NaOH

0,155 M de HCl/pepsina (4000 u/g por comida) 0.155 M HCl / pepsin (4000 u / g per meal)

1 M de NaHCO_{3} conteniendo 16 mg de pancreatina/ml 1M sat'd {3} containing 16 mg pancreatin / ml

125 mM de tampón NaAc, pH 6.0 125 mM NaAc buffer, pH 6.0

Procedimiento experimental para un modelo in vitro en agua Experimental procedure for in vitro model water

El producto experimental fue formado según el resumen indicado más arriba. The experimental product was formed as summarized indicated above. El pH fue medido en periodos de 1, 5, 8 y 23 horas. The pH was measured at periods of 1, 5, 8 and 23 hours. Las incubaciones se terminaron después de 24 horas y unas muestras de 30 ml fueron retiradas y colocadas en hielo antes del centrifugado (13000 xg, 10 min, 0ºC). Incubations were terminated after 24 hours and samples of 30 ml were removed and placed on ice before centrifugation (13000 xg, 10 min, 0). Los sobrenadantes fueron retirados y almacenados a -20ºC. The supernatants were removed and stored at -20 ° C.

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 
Análisis Analysis

Todos los sobrenadantes fueron analizados usando el método OPA (% de grado de hidrólisis) y por HPLC ÄKTA para determinar la proteína solubilizada y digerida (véase el ejemplo monogástrico). All supernatants were analyzed using the OPA method (% degree of hydrolysis) and by ÄKTA HPLC to determine solubilised and digested protein (see monogastric example).

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 
Pretratamiento de sobrenadantes in vitro con columnas EASY SPE Pretreatment of in vitro supernatants with EASY SPE columns

Antes del análisis en HPLC ÄKTA, los sobrenadantes del sistema in vitro fueron pretratados usando una purificación de muestras en fase sólida. Before HPLC analysis ÄKTA, supernatants in vitro system were pretreated using a sample purification solid phase. Esto se realizó para mejorar la cromatografía y de ese modo prevenir los perfiles y lineas básicas de elución inestables. This was done to improve the chromatography and thereby prevent profiles and basic lines unstable elution. Las columnas usadas para la extracción eran columnas de extracción de fase sólida (Columnas Chromabond EASY SPE de Macherey-Nagel). The columns used for extraction were columns of solid phase extraction (SPE Columns Chromabond EASY Macherey-Nagel). Se eluyeron 2 ml de agua milliQ a través de las columnas mediante el uso de una cámara de vacío (vacío 0,15 x 100 kPa). 2 mL milliQ water was eluted through the columns by use of a vacuum chamber (vacuum 0.15 x 100 kPa). Posteriormente 3 ml de muestra in vitro fue dispuesta sobre la columna y eluida (vacío de 0,1 x 100 kPa), los primeros ml de muestra eluida fueron retirados y un tubo limpio fue colocado debajo de la columna, el resto de la muestra fue eluido después y mantenido para una dilución complementaria. Subsequently 3 mL in vitro sample was dispensed onto the column and eluted (vacuum 0.1 x 100 kPa), the first ml of eluted sample were removed and a clean tube was placed beneath the column, the rest of the sample was eluate after and maintained for further dilution.

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 
Resultados results

Los resultados mostrados en las Tablas 6 y 7 más abajo indican que el grado de proteasa aumentaba de forma significativa el grado de hidrólisis y de digestibilidad de la proteína. The results shown in Tables 6 and 7 below indicate that the degree of protease significantly increased the degree of hydrolysis and protein digestibility.

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 
TABLA 6 TABLE 6 Grado de hidrólisis (DH) Degree of hydrolysis (DH)

12 12

TABLA 7 TABLE 7 Proteína cruda solubilizada v digerida Digested crude protein solubilized v

13 13

Ejemplo 5 example 5

Construcción de cepas de Bacillus subtilis L2, L2 HV0 y L2 HV1 Construction of Bacillus subtilis strains L2, L2 and L2 HV1 HV0

Dos variantes "de cola" (que poseen extensiones C-terminal) de la proteasa que poseen la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 1-188 de SEC ID Nº: 2 fueron formadas también. Two variants "tail" (having C-terminal extensions) of the protease having the amino acid sequence of 1-188 amino acids of SEQ ID NO: 2 were also formed. La variante de cola llamada a partir de ahora L2 HV0 poseía los 8 aminoácidos suplementarios siguientes en el C-terminal: QSHVQSAP con la extensión de secuencia de ADN siguiente insertada enfrente del codón de detención TM (entre los nucleótidos 1059 y 1060 de SEC ID Nº: 1): 5'-CAATCGCATGTTCAATCCGCTCCA-3' (SEC ID Nº: 5). The variant of tail call from now L2 HV0 had the following 8 additional amino acids at the C-terminal: QSHVQSAP with the extension sequence following DNA inserted in front of the stop codon TM (between nucleotides 1059 and 1060 of SEQ ID NO : 1): 5'-CAATCGCATGTTCAATCCGCTCCA-3 '(SEQ ID NO: 5).

La variante de cola llamada L2 HV1 poseía los 4 aminoácidos extra siguientes en el C-terminal: QSAP, con la extensión de secuencia de ADN siguiente insertada enfrente del codón de detención TAA (entre los nucleótidos 1059 y 1060 de SEC ID Nº: 1): 5'-CAATCGGCTCCT-3' (SEC ID Nº: 6). Variant queue called L2 HV1 had the 4 amino acids extra following the C-terminus: QSAP, with the extension sequence following DNA inserted in front of the TAA stop codon (between nucleotides 1059 and 1060 of SEQ ID NO: 1) : 5'-CAATCGGCTCCT-3 '(SEQ ID NO: 6).

Tres cepas de Bacillus subtilis fueron construidas: la primera alojando el constructo de ADN de codificación de la proteasa teniendo la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 1-188 de SEC ID Nº: 2, llamada L2, y las otras dos alojando los constructos de ADN de codificación de las variantes de cola L2 HV0, y L2 HV1, respectivamente. Three strains of Bacillus subtilis were constructed: the first housing the DNA construct encoding the protease having the amino acid sequence of 1-188 amino acids of SEQ ID NO: 2, called L2, and the other two accommodating the DNA constructs coding variants tail HV0 L2, and L2 HV1, respectively. Estos constructos fueron fusionados por PCR con respecto al ADN codificante del péptido señal a partir de SAVINASE^{TM} Bacillus clausii (Takami,H.; Kobaiashi,T.; Kobaiashi,M.; Yamamoto,M.; Nakamura,S.; Aono,R.; Horikoshi,K.; Clonación molecular, secuencia de nucleótidos y expresión del gen estructural para proteasa alcalina de la especie Bacillus alcalifílica 221) Biosci. These constructs were fused by PCR with respect to the DNA encoding the signal peptide from SAVINASE ^ to {TM} Bacillus clausii (Takami, H .; Kobaiashi, T .; Kobaiashi, M .; Yamamoto, M .; Nakamura, S .; Aono, R .; Horikoshi, K .; molecular cloning, nucleotide sequence and expression of the structural gene for alkaline protease from alkaliphilic Bacillus species 221) Biosci. Biotechnol. Biotechnol. Biochem. Biochem. 56:1455 (1992) e integrado por recombinación homóloga en el genoma de la célula huésped de Bacillus subtilis (como se ha descrito en el Ejemplo 1). 56: 1455 (1992) and integrated by homologous recombination into the genome of the host cell of Bacillus subtilis (as described in Example 1). Los genes son expresados bajo el control de un sistema de promotor triple (como se ha descrito en WO 99/43835), consistiendo en los promotores del gen alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (amyL), gen alfa-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), y el promotor de Bacillus turingiensis cryIIIA incluyendo una secuencia estabilizante. The genes are expressed under the control of a triple promoter system (as described in WO 99/43835), consisting of the promoters of the alpha-amylase gene from Bacillus licheniformis (amyL), alpha-amylase gene from Bacillus amyloliquefaciens (amyQ ), and Bacillus thuringiensis cryIIIA promoter including stabilizing sequence one. El gen que codifica la acetiltransferasa de cloranfenicol fue usado como marcador. The gene encoding the chloramphenicol acetyltransferase was used as marker. (Como está descrito en por ejemplo Diderichsen,B.; Poulsen, GB; Joergensen, ST; A useful cloning vector for Bacillus subtilis . Plasmid 30:312 (1993)). (As described in for example Diderichsen, B .; Poulsen, GB; Joergensen, ST, A useful cloning vector for Bacillus subtilis Plasmid 30: 312 (1993).).

Unos transformantes resistentes al cloranfenicol fueron controlados para determinar una actividad proteasa en placas de agar LB-PG con 1% de leche desnatada (con un suplemento de 6 \mug/ml de cloranfenicol). A chloramphenicol resistant transformants were checked to determine protease activity in LB agar plates with PG-1% skim milk (supplemented with 6 \ g / ml chloramphenicol). Algunas colonias positivas de proteasa fueron analizadas después mediante una secuenciación del ADN del inserto para determinar una secuencia de ADN de gen correcto, y se seleccionó una cepa de cada constructo, llamadas cepa B. subtilis L2, B. subtilis L2 HV0, B. subtilis L2 HV1. Some protease positive colonies were then analyzed by DNA sequencing of the insert to determine a correct DNA sequence gene, and a strain of each construct was selected, called strain B.subtilis L2, B.subtilis L2 HV0, B.subtilis L2 HV1.

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 

Ejemplo 6 example 6

Fermentación de las cepas B. subtilis L2, L2 HV0 y L2 HV1 Fermentation of B. subtilis strains L2, L2 HV0 and L2 HV1

Las tres cepas B. subtilis L2, L2 HV0 y L2 HV1, fueron fermentadas en una mesa de agitación rotatoria en frascos Erlenmeyer con deflectores de 500 ml conteniendo 100 ml de TY con un suplemento de 6 mg/l de cloramfinicol. The three B. subtilis strains L2, L2 HV0 and L2 HV1, were fermented on a rotary shaking table in Erlenmeyer flasks with baffles containing 500 ml 100 ml TY supplemented with 6 mg / l cloramfinicol.

Seis frascos Erlenmeyer para cada una de las tres cepas B. subtilis fueron fermentados en paralelo. Six Erlenmeyer flasks for each of the three B. subtilis strains were fermented in parallel. Dos de los seis frascos Erlenmeyer fueron incubados a 37ºC (250 rpm), dos a 30ºC (250 rpm), y los dos últimos a 26ºC (250 rpm). Two of the six Erlenmeyer flasks were incubated at 37 ° C (250 rpm), two at 30 (250 rpm), and the last two at 26 ° C (250 rpm).

Una muestra fue tomada de cada frasco de agitación el día 1, 2 y 3 y analizada para determinar la actividad proteolítica. A sample was taken from each shake flask at day 1, 2 and 3 and analyzed for proteolytic activity.

TABLA 8 TABLE 8 Actividad proteolítica a 37ºC Proteolytic activity at 37

14 14

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 
TABLA 9 TABLE 9 Actividad proteolítica a 30ºC Proteolytic activity at 30 ° C

15 fifteen

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 
TABLA 10 TABLE 10 Actividad proteolítica a 26ºC Proteolytic activity at 26 ° C

16 16

Como se puede ver en las tablas 8-10 más arriba, el efecto de las colas aumenta el nivel de expresión para la S2A proteasa de Nocardiopsis dassonvillei , subespecie dassonvillei , DSM 43235 cuando es expresada en B. subtilis . As seen in Tables 8 to 10 above, the effect of the tails increases the expression level for the S2A protease from Nocardiopsis dassonvillei subspecies dassonvillei DSM 43235 when expressed in B. subtilis. Se observa un incremento de hasta el 40% en este experimento, pero en general se observa una mejora para ambas variantes de cola, L2 HV1 y L2 HV0, a las tres temperaturas probadas. an increase of up to 40% is observed in this experiment, but overall an improvement for both variants tail, L2 HV1 and L2 HV0 is observed at all three temperatures tested.

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 

Ejemplo 7 example 7

Proteasa 22 protease 22

Una proteasa llamada "Proteasa 22" fue diseñada de tal forma que comprendiera los siguientes aminoácidos característicos de la parte madura (aminoácidos 1-188) de SEC ID Nº: 2: 10Y, 38T, 82S, 95P, 99A, 100V, 114I, 118N, 120T, 122R, 125Q, 129Y, 130S, 131L, 165S, y 171Y; A protease called "Protease 22" was designed so that comprise the following characteristic amino acids of the mature part (amino acids 1-188) of SEQ ID NO: 2: 10Y, 38T, 82S, 95P, 99A, 100V, 114i, 118N , 120T, 122R, 125Q, 129Y, 130S, 131L, 165S, and 171Y; donde cada posición corresponde a una posición de SEC ID Nº: 2. where each position corresponds to a position of SEQ ID NO: 2.

La parte madura de la proteasa 22 representa los aminoácidos 1-196 de SEC ID Nº: 8. La secuencia de ADN correspondiente a la SEC ID Nº: 8 es la SEC ID Nº: 7. The mature part of Protease 22 amino acids 1-196 of represents SEQ ID NO: 8. The DNA sequence corresponding to SEQ ID NO: 8 is SEQ ID NO: 7.

La secuencia de ADN de SEC ID Nº: 7 fue construida e introducida en un huésped de Bacillus para la expresión. The DNA sequence of SEQ ID NO: 7 was constructed and introduced into a Bacillus host for expression. La proteasa expresada fue purificada y caracterizada como una proteasa alfa-lítica (familia peptidasa S1E y/o S2A). The expressed protease was purified and characterized as an alpha-lytic protease (peptidase family S1E and / or S2A).

La relación temperatura-actividad de la proteasa 22 fue medida a un pH 9, usando el ensayo Protazyme AK del Ejemplo 2. Con el fin de realizar una comparación, la proteasa de la especie Nocardiopsis NRRL 18262 fue incluida. The temperature-activity relationship of Protease 22 was measured at pH 9 using Protazyme AK assay of Example 2. In order to make a comparison, protease Nocardiopsis species NRRL 18262 was included. Los resultados están mostrados en la Tabla 11 más abajo. The results are shown in Table 11 below.

La temperatura de desnaturalización o de fusión de la proteasa 22 fue determinada como se ha descrito en el ejemplo 2 a una T_{m} = 83.5ºC. The denaturation temperature or melting Protease 22 was determined as described in Example 2 to a T_ {m} = 83.5ºC.

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 
TABLA 11 TABLE 11 Perfiles de temperatura Temperature profiles

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 

17 17

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 

De estos resultados se deduce que la proteasa 22 tiene una temperatura de fusión más alta, y una temperatura óptima más alta a pH 9, ambas en comparación con la proteasa de la especie Nocardiopsis , NRRL 18262, es decir, un aumento de temperatura de fusión de 7,0ºC, y un aumento de temperatura óptima de aproximadamente 10ºC. From these results it appears that Protease 22 has a temperature higher melting, and optimal highest temperature at pH 9, both as compared with the protease of the species Nocardiopsis, NRRL 18262, ie, an increase in melting temperature of 7,0ºC, and increased optimum temperature of about 10.

  \newpage \ newpage 

Ejemplo 8 example 8

Proteasa L2a protease L2a

La parte madura de proteasa L2a representa los aminoácidos 1-189 de SEC ID Nº: 10. La SEC ID Nº: 9 es la secuencia de ADN correspondiente a SEC ID Nº: 10. The mature part of protease L2a represents the 1-189 amino acids of SEQ ID NO: 10. SEQ ID NO: 9 is the DNA sequence corresponding to SEQ ID NO: 10.

La secuencia de ADN de SEC ID Nº: 9 fue construida e introducida en un huésped de Bacillus para la expresión tal y como está descrito en el Ejemplo 1, y purificada tal y como está descrito en el Ejemplo 2. The DNA sequence of SEQ ID NO: 9 was constructed and introduced into a Bacillus host for expression as described in Example 1, and purified as described in Example 2.

La proteasa L2a es una proteasa alfa-lítica (familia peptidasa S1E y/o S2A). The L2a protease is an alpha-lytic protease (peptidase family S1E and / or S2A).

La relación de actividad según la temperatura de la proteasa L2a fue medida a pH 9, usando el ensayo Protazyme AK del Ejemplo 2. Con el fin de realizar una comparación, la proteasa de la especie Nocardiopsis , NRRL 18262 (proteasa 10) fue incluida. The activity ratio according to the L2a protease temperature was measured at pH9, using the Protazyme AK assay of Example 2. In order to make a comparison, the protease of the species Nocardiopsis, NRRL 18262 (Protease 10) was included. Los resultados están mostrados en la Tabla 12 más abajo. The results are shown in Table 12 below.

La desnaturalización o temperatura de fusión de la proteasa L2a fue determinada tal y como está descrito en el ejemplo 2 a una T_{m} = 78.2ºC. The denaturation or melting temperature of the L2a protease was determined as described in Example 2 to a T_ {m} = 78.2ºC.

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 
TABLA 12 TABLE 12 Perfil de actividad según la temperatura Activity profile as the temperature

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18 18

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 

A partir de estos resultados, se puede ver que la proteasa L2a presenta una temperatura de fusión más alta, y una temperatura óptima más alta a pH 9, ambas comparadas con la proteasa de la especie Nocardiopsis , NRRL 18262, es decir, un aumento de la temperatura de fusión de 1,7ºC, y un aumento óptimo de la temperatura de aproximadamente 10ºC. From these results, it can be seen that the L2a protease has a temperature higher melting, and optimal highest temperature at pH 9, both as compared with the protease of the species Nocardiopsis, NRRL 18262, ie increased the melting temperature of 1.7 ° C and an optimum temperature rise of about 10 ° C.

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 

Ejemplo 9 example 9

Proteasa 8 protease 8

La parte madura de la proteasa 8 representa los aminoácidos 1-188 de SEC ID Nº: 12. La SEC ID Nº: 11 es la secuencia de ADN correspondiente a la SEC ID Nº: 12. The mature part of protease 8 is amino acids 1-188 of the SEQ ID NO: 12. SEQ ID NO: 11 is the DNA sequence corresponding to SEQ ID NO: 12.

La secuencia de ADN de SEC ID Nº: 11 fue construida e introducida en un huésped Bacillus para la expresión tal y como está descrito en el Ejemplo 1, y purificada tal y como está descrito en el Ejemplo 2. The DNA sequence of SEQ ID NO: 11 was constructed and introduced into a Bacillus host for expression as described in Example 1, and purified as described in Example 2.

La proteasa 8 es una proteasa alfa-lítica (familia peptidasa S1E y/o S2A). Protease 8 is an alpha-lytic protease (peptidase family S1E and / or S2A).

La relación temperatura-actividad de la proteasa 8 fue medida a pH 9, usando el ensayo con Protazyme AK del Ejemplo 2. Con el fin de realizar una comparación, la proteasa de especie Nocardiopsis , NRRL 18262 (proteasa 10) fue incluida. The temperature-activity relationship of Protease 8 was measured at pH9, using the Protazyme AK assay of Example 2. In order to make a comparison, species Nocardiopsis protease, NRRL 18262 (Protease 10) was included. Los resultados están mostrados en la Tabla 13 más abajo. The results are shown in Table 13 below.

La temperatura de desnaturalización o de fusión de la proteasa 8 fue determinada tal y como está descrito en el Ejemplo 2 a una T_{m} = 78.3ºC. The denaturation temperature or melting Protease 8 was determined as described in Example 2 to a T_ {m} = 78.3ºC.

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 
TABLA 13 TABLE 13 Perfil de actividad de temperatura Temperature activity profile

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 

19 19

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 

A partir de estos resultados, se puede ver que la Proteasa 8 presenta una temperatura de fusión más alta, y una temperatura más alta óptima a pH 9, ambas en comparación con la Proteasa 10, por ejemplo un aumento de la temperatura de fusión de 1,8ºC. From these results, it can be seen that Protease 8 has a temperature higher melting, and a higher temperature optimum at pH 9, both as compared to Protease 10, for example an increase of the melting temperature of one , 8 ° C.

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 

Ejemplo 10 example 10

Rendimiento de la Proteasa L2a en un modelo monogástrico de digestión in vitro L2a Protease performance in a monogastric in vitro digestion model

El rendimiento de la proteasa purificada L2a descrita en el Ejemplo 8 fue evaluado en un modelo in vitro simulando la digestión en animales monogástricos, en comparación con la proteasa conocida derivada de la especie Nocardiopsis , NRRL 18262 ("Proteasa 10"). The performance of the purified protease L2a described in Example 8 was evaluated in an in vitro model simulating digestion in monogastric animals, in comparison with the known protease derived from Nocardiopsis species, NRRL 18262 ( "Protease 10"). En particular, la proteasa fue evaluada para determinar su capacidad para mejorar la solubilización y digestión de las proteínas de maíz/SBM (harina de maíz/de soja). In particular, the protease was tested for its ability to improve solubilisation and digestion of proteins corn / SBM (maize flour / soy). El sistema in vitro consistía en 18 frascos donde el sustrato de maíz/SBM fue incubado inicialmente con HCl/pepsina - simulando una digestión gástrica - y posteriormente con pancreatina - simulando una digestión intestinal. The in vitro system consisted of 18 flasks in which maize substrate / SBM was initially incubated with HCl / pepsin - simulating gastric digestion - and subsequently with pancreatin - simulating intestinal digestion. Ocho de los frascos fueron dosificados con la proteasa al principio de la fase gástrica mientras que los diez frascos restantes servían de blancos. Eight of the flasks were dosed with the protease at the start of the gastric phase whereas the remaining ten bottles were used as targets. Al final de la fase de incubación intestinal, las muestras de digestión in vitro fueron extraidas y analizadas para determinar la proteína solubilizada y digerida. At the end of the intestinal incubation phase, samples of in vitro digestion were extracted and analyzed for solubilised and digested protein.

Resumen del procedimiento de digestión in vitro Summary of in vitro digestion procedure

20 twenty

Condiciones Terms

Sustrato: Substratum:
4 g de SBM, 6 g de maíz (premezclado) 4 g SBM, 6 g maize (premixed)

pH: pH:
3,0 fase estomacal/6,8-7,0 fase intestinal 3.0 stomach step / 6.8-7.0 intestinal phase

HCl: HCl:
0,105 M durante 1,5 horas (es decir, premezcla de 30 min de HCl-sustrato) 0.105 M for 1.5 hours (i.e. 30 min premix HCl-substrate)

pepsina: pepsin:
3000 U/g por dieta durante 1 hora 3000 U / g diet for 1 hour by

pancreatina: pancreatin:
8 mg/g por dieta durante 4 horas 8 mg / g diet for 4 hours by

temperatura: temperature:
40ºC. 40.

Replicados: replicated:
n n
Soluciones solutions

0,39 M de NaOH 0.39 M NaOH

0,105 M de HCl 0.105 M HCl

0,105 M de HCl conteniendo 6000 U de pepsina por 5 ml 0.105 M HCl containing 6000 U pepsin per 5 ml

1 M de NaHCO_{3} conteniendo 16 mg de pancreatina por ml 1M sat'd {3} containing 16 mg pancreatin per ml

125 mM de tampón NaAc, pH 6,0 125 mM NaAc buffer, pH 6.0

Determinaciones de proteína enzimática Determinations of enzyme protein

La cantidad de proteína de enzima proteásica (EP) es calculada en base a los valores A_{280} ya las secuencias de aminoácidos (composiciones de aminoácidos) usando los principios resumidos en SC Gill & PH von Hippel, Analytical Biochemistry 182, 319-326, (1989). The amount of protease enzyme protein (EP) is calculated based on {280} A_ and amino acid sequences (amino acid compositions) using the principles outlined values ​​in SC Gill & von Hippel PH, Analytical Biochemistry 182, 319-326 , (1989).

Procedimiento experimental para modelo in vitro Experimental procedure for in vitro model

El procedimiento experimental fue tal y como se ha resumido más arriba. The experimental procedure was as summarized above. El pH fue medido en periodos de 1, 2,5, y 5,5 horas. The pH was measured at periods of 1, 2.5, and 5.5 hours. Las incubaciones se terminaron después de 6 horas y unas muestras de 30 ml fueron retiradas y dispuestas en hielo antes del centrifugado (10000 xg, 10 min, 4ºC). Incubations were terminated after 6 hours and samples of 30 ml were removed and placed on ice before centrifugation (10000 xg, 10 min, 4). Los sobrenadantes fueron extraídos y almacenados a 20ºC. The supernatants were removed and stored at 20 ° C.

Análisis Analysis

Todas las muestras fueron analizadas para determinar el contenido de proteína solubilizada y digerida mediante el uso de una filtración en gel. All samples were analyzed for content of solubilised and digested protein using gel filtration.

Estimación de proteína solubilizada y digerida Estimation of solubilised and digested protein

El contenido de proteína solubilizada en los sobrenadantes de las muestras digeridas in vitro fue calculado por cuantificación de la proteína bruta (CP) usando una HPLC de filtración en gel. The content of solubilised protein in supernatants from in vitro digested samples was estimated by quantifying crude protein (CP) using gel filtration HPLC. Los sobrenadantes fueron descongelados, filtrados a través de filtros de policarbonato de 0,45 \muM y diluidos (1:50, v/v) con H_{2}O. Supernatants were thawed, filtered through polycarbonate filters of 0.45 \ uM and diluted (1:50, v / v) with H {2} O. Las muestras diluidas fueron cromatografiadas por HPLC usando una columna de filtración en gel (Global) de péptido Superdex PE (7,5 x 300 mm). Diluted samples were chromatographed by HPLC were using a gel filtration column (Global) PE Superdex peptide (7.5 x 300 mm). El eluyente usado para una elución isocrática fue un tampón de fosfato de sodio de 50 mM (pH 7,0) conteniendo 150 mM de NaCl El volumen total de eluyente por prueba fue de 26 ml y el caudal fue de 0,4 ml/min. The eluent used for isocratic elution was phosphate buffer 50 mM sodium (pH 7.0) containing 150 mM NaCl The total volume of eluent per test was 26 ml and the flow rate was 0.4 ml / min . Unos perfiles de elución fueron registrados a 214 nm y el área total según los perfiles fue determinada por integración. Elution profiles were recorded at 214 nm and the total area under the profiles was determined by integration. Para calcular el contenido de proteína de las áreas integradas, se formó una curva de calibración (R^{2}=0,9993) a partir de una serie de dilución de una muestra de maíz/SBM de referencia digerida in vitro con un contenido de proteínas totales conocido. To calculate the protein content of the integrated areas, a calibration curve (R {2} = 0.9993) from a serial dilution of a sample of corn / SBM reference digested in vitro with a content formed total protein known. La determinación de proteína en esta muestra de referencia fue efectuada usando el método Kjeldahl (determinación de % de nitrógeno; AOAC (1984) Official Methods of Analysis 14th ed., Washington DC). The protein determination in this reference sample was carried out using the Kjeldahl method (determination of% nitrogen; AOAC (1984) Official Methods of Analysis 14th ed, Washington DC.).

El contenido de proteína digerida fue calculado por integración del área del cromatograma correspondiente a péptidos y aminoácidos que poseen una masa molecular de 1500 dalton o menos (Savoie, L.; Gauthier, SF Dialysis Cell For The In-vitro Measurement Of Protein Digestibility. J. Food Sci. 1986, 51, 494-498; Babinszky, L.; Van, DMJM; Boer, H.; Den, HLA An In-vitro Method for Prediction of The Digestible Crude Protein Content in Pig Feeds. J. Sci. Food Agr. 1990, 50, 173-178; Boisen, S.; Eggum, BO Critical Evaluation of In-vitro Methods for Estimating Digestibility in Simple-Stomach Animals. Nutrition Research Reviews 1991, 4, 141-162). The content of digested protein was estimated by integrating the area of the chromatogram corresponding to peptides and amino acids having a molecular mass of 1500 daltons or less (Savoie, L .; Gauthier, SF Dialysis Cell For The In-vitro Measurement Of Protein Digestibility. J . Food Sci 1986, 51, 494-498;. Babinszky, L .; Van, DMJM; Boer, H .; Den, An in-vitro HLA Method for Prediction of The Digestible Crude Protein Content in Pig Feeds J. Sci.. Food Agr 1990, 50, 173-178;. Boisen, S .; Eggum, BO Critical Evaluation of in-vitro Methods for Estimating Digestibility in Simple-Stomach Animals Nutrition Research Reviews 1991, 4, 141-162).. Para determinar la línea de división de 1500 dalton, la columna de filtración en gel fue calibrada usando citocromo C (Boehringer Alemania), aprotinina, gastrina I, y sustancia P (Sigma Aldrich, EEUU), como estándares de masa molecular. To determine the dividing line of 1500 Daltons column gel filtration was calibrated using cytochrome C (Boehringer Germany), aprotinin, gastrin I, and substance P (Sigma Aldrich, USA), as molecular mass standards.

Resultados results

Los resultados mostrados en la Tabla 14 más abajo indican que la proteasa L2a, como la Proteasa 10, aumenta de forma significativa el nivel de proteína soluble y digerible con respecto al blanco. The results shown in Table 14 below indicate that the L2a protease, like Protease 10, significantly increased the level of soluble and digestible protein relative to the blank. Además, se comprueba que al menos numéricamente, la proteasa L2a mejora el nivel de proteína digerible comparada con la Proteasa conocida 10. Furthermore, it is found that at least numerically, the L2a protease improves the level of digestible protein as compared to Protease 10 known.

TABLA 14 TABLE 14 Proteína cruda solubilizada v digerida Digested crude protein solubilized v

21 twenty-one

Ejemplo 11 example 11

Prueba de alimentación de peces Fish feeding test

Toda una reserva hembra de trucha arco iris ( Oncorhyncus mykiss ), con una masa corporal inicial de aproximadamente 27,3 g, fue alimentada con una dieta básica práctica conteniendo 49% de SBM (Comida a base de Alubias de Soja) y 12% de FM (Comida para peces), sin (Control), y con, la adición de la proteasa de la invención teniendo los aminoácidos 1-188 de SEC ID Nº: 2, en una cantidad de 50 mg de proteína de enzima proteásica/kg de producto alimentario. All female reserve rainbow trout (Oncorhynchus mykiss), with an initial body mass of about 27.3 g, was fed with a basic diet containing 49% practice SBM (Food based soybeans) and 12% FM (feed for fish), without (Control), and with the addition of the protease of the invention having amino acids 1-188 of the SEQ ID nO: 2, in an amount of 50 mg protease protein / kg enzyme food product. Los peces fueron alimentados ad libitum . The fish were fed ad libitum. La prueba de alimentación fue realizada en tanques de 500 I, en parte de una unidad de semi-recirculación con una temperatura del agua de 15ºC +/- 1ºC, con 50 peces por tanque y 4 replicados por tratamiento. The test was conducted in feed tanks 500 I, part of a semi-recirculating unit with a water temperature of 15 ° C +/- 1 ° C, with 50 fish per tank and 4 replicates per treatment. La supervivencia, crecimiento, y conversión del producto alimentario fueron medidos durante un periodo de alimentación de 85 días. Survival, growth, and conversion of the foodstuff were measured over a feeding period of 85 days.

Los resultados están mostrados en la Tabla 15 más abajo. The results are shown in Table 15 below. Un aumento importante del peso corporal fue obtenido al añadir la proteasa de la invención a la dieta. A significant increase in body weight was obtained by adding the protease of the invention to the diet.

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 
TABLA 15 TABLE 15 Resultados con peces in vivo Fish in vivo results

22 22

Ejemplo 12 example 12

Degradación proteolítica de las principales proteínas de alubias de soja purificadas proteolytic degradation of key proteins purified soy bean

Hemos estudiado la capacidad de la proteasa de la especie Nocardiopsis , NRRL 18262 y la proteasa de la invención teniendo los aminoácidos 1-188 de SEC ID Nº: 2 para degradar proteínas de alubias de soja purificadas. We have studied the ability of protease species Nocardiopsis, NRRL 18262 and the protease of the invention having amino acids 1-188 of the SEQ ID NO: 2 to degrade proteins purified soy beans. Las proteínas de soja purificadas estudiadas fueron tres factores llamados anti-nutritivos de proteína de soja: Aglutinina de soja (SBA), el inhibidor de tripsina Kunitz de soja, el inhibidor Bowman-Birk de soja; Purified soy proteins studied were three factors called anti-nutritional soy protein: Soybean agglutinin (SBA), the Kunitz trypsin inhibitor, soybean Bowman-Birk inhibitor, soybean; y dos de las principales proteínas de almacenamiento de soja: Glicinina y beta-conglicinina. and two of the major storage proteins soybean glycinin and beta conglycinin.

Estas proteínas de soja fueron obtenidas como sigue: la SBA fue purificada de harina de soja no calentada (prod. No. S-9633, Sigma) por cromatografía de afinidad usando N-aminocaproil-beta-d-galactopiranosilamina Sefarosa (Sigma). These soy proteins were obtained as follows: SBA was purified from unheated soybean meal (prod No. S-9633, Sigma.) By affinity chromatography using N-aminocaproyl-beta-d-galactopiranosilamina Sepharose (Sigma). Las fracciones de elución de la columna fueron analizadas usando una SDS-PAGE (tris-glicina 4-20%), y unas fracciones conteniendo proteína esencialmente pura fueron agrupadas. Elution fractions of the column were analyzed using SDS-PAGE (Tris-Glycine 4-20%), and fractions containing essentially pure protein were pooled. La glicinina y beta-conglicinina de soja fueron purificadas según los procedimientos descritos por Fischer, M. et al : Enzymatic Extractability of Soybean Meal Proteins and Carbohydrates: Heat and Humidity Effects. Glycinin and beta - conglycinin-soybean were purified according to the procedures described by Fischer, M. et al: Enzymatic Extractability of Soybean Meal Proteins and Carbohydrates: Heat and Humidity Effects. J. Agric. J. Agric. Food Chem. 2001: 49: 4463-4469. 2001 Food Chem. 49: 4463-4469. El Inhibidor de Bowman-Birk y el inhibidor de tripsina Kunitz son productos comerciales (Sigma T-9777 y Fluka 93618, respectivamente). The Bowman-Birk inhibitor and the Kunitz trypsin inhibitor are commercial products (Sigma T-9777 and Fluka 93618, respectively).

Las proteínas de soja purificada fueron incubadas con las dos proteasas durante 4 horas a 37ºC y pH 6,5 (proteasa: proteína de soja = 1:10, basada en A_{280}). Proteins purified soybean were incubated with the two proteases for 4 hours at 37 ° C and pH 6.5 (protease: soy protein = 1:10, based A_ {280}). Tampón de incubación: 50 mM de ácido dimetil glutárico, 150 mM de NaCl, 1 mM de CaCl_{2}, 0,01% de Tritón X-100, pH 6,5. Incubation buffer: 50 mM dimethyl glutaric acid, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl {2} of 0.01% Triton X-100, pH 6.5.

La capacidad de las proteasas para degradar cada una de estas cinco proteínas fue determinada como la reducción de intensidad relativa a la banda de proteína de soja intacta en geles de SDS-PAGE (4-20% de tris-glicina) teñidos con Azul Brillante Coomassie. The ability of the proteases to degrade each of these five proteins was determined as the reduction of intensity on the band intact soy protein on SDS-PAGE (4-20% Tris-Glycine) stained with Coomassie Brilliant Blue . En caso de glicinina y beta-conglicinina, los términos "banda de proteína de soja intacta" se refiere en efecto a dos y tres bandas, respectivamente, ya que estas dos proteínas, cuando están expuestas al entorno reductor en el gel de SDS-PAGE, se desnaturalizan formando dos y tres subunidades, respectivamente. If glycinin and beta-conglycinin, the terms "protein band intact soybean" refers in fact to two and three bands, respectively, as these two proteins, when exposed to the reducing environment on the SDS-PAGE , denatured subunits forming two three, respectively.

La intensidad de las bandas de proteína de soja intactas (antes y después del tratamiento con las dos proteasas) fue determinada mediante un escaneado de los geles de SDS teñidos, y la degradación de cada una de las cinco proteínas por cada una de las dos proteasas determinada como la intensidad de la banda de proteína de soja intacta respectiva después, relativa a la intensidad de la banda de proteína de soja intacta respectiva antes del tratamiento de proteasas. The intensity of the protein bands of intact soybean (before and after treatment with the two proteases) was determined by scanning the stained SDS-gels, and the degradation of each of the five proteins by each of the two proteases determined as the intensity of the respective protein band after, relative to the intensity of the protein band corresponding intact soybean protease pretreatment intact soybean. El porcentaje de degradación de proteína es calculado de la manera siguiente: 100% - ((intensidad de banda después/intensidad de banda antes) x 100%). The percentage protein degradation is calculated as follows: 100% - ((band intensity after / band intensity before) x 100%). Los resultados son mostrados en la Tabla 16 más abajo. The results are shown in Table 16 below.

TABLA 16 TABLE 16 Porcentaje de degradación de proteínas de soja aisladas Percentage degradation of isolated soy protein

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 

23 2. 3

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 

Ejemplo 13 example 13

Alimentos para animales y aditivos de alimentos para animales Animal feed and feed additives

Un aditivo de alimentos para animales comprendiendo la proteasa de la invención con los aminoácidos 1-188 de SEC ID Nº: 2 en forma de vitaminas y premezcla mineral, es compuesto tal y como está mostrado en la Tabla 17 más abajo. An animal feed additive comprising the protease of the invention with amino acids 1-188 of SEQ ID NO: 2 as vitamins and mineral premix, is composed as is shown in Table 17 below. Las vitaminas y los carotenoides están disponibles comercialmente de productos nutritivos DSM. Vitamins and carotenoids are commercially available from DSM nutritional products. Todas las cantidades son en g/kg. All amounts are in g / kg.

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 
TABLA 17 TABLE 17 Composición de premezcla Premix composition

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 

24 24

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 

La premezcla de la Tabla 17 es incluida en un producto alimentario para truchas con una composición tal y como está mostrada en la Tabla 18 más abajo. Premix of Table 17 is included in a trout feed product with a composition as is shown in Table 18 below. La cantidad de cada ingrediente está indicada en % (p/p). The amount of each ingredient is indicated in% (w / w). La concentración de proteasa de la invención en el producto alimentario es de 51 mg de proteína de enzima proteásica por kg. The concentration of protease of the invention in the food product is 51 mg protease enzyme protein per kg.

TABLA 18 TABLE 18 Composición de producto alimentario para truchas Foodstuff composition trout

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 

25 25

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 
Referencias citadas en la descripción References cited in the description Esta lista de referencias citada por el solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información del lector. This list of references cited by the applicant has been compiled solely for the information of the reader. No forma parte del documento de patente europea. Not part of the European patent document. La misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; It has been made with the greatest care; la OEP sin embargo no asume responsabilidad alguna por eventuales errores u omisiones. EPO however assumes no responsibility for any errors or omissions. Documentos de patente citados en la descripción Patent documents cited in the description

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<110> Novozymes A/S <110> Novozymes A / S

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<120> Proteasas <120> Proteases

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<130> 10436.504-WO <130> 10436.504-WO

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<160> 12 <160> 12

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<170> PatentIn versión 3.2 <170> PatentIn version 3.2

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<210> 1 <210> 1

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<211> 1065 <211> 1065

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<212> ADN <212> DNA

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<213> Nocardiopsis dassonvillei , subespecie dassonvillei DSM 43235 <213> Nocardiopsis dassonvillei, subspecies dassonvillei DSM 43235

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<220> <220>

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<221> CDS <221> CDS

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<222> (1)..(1062) <222> (1) .. (1062)

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<220> <220>

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<221> mat_péptido <221> mat_péptido

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<222> (499)..(1062) <222> (499) .. (1062)

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<400>1 <400> 1

26 26

27 27

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<210> 2 <210> 2

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<211> 354 <211> 354

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<212> PRT <212> PRT

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<213> Nocardiopsis dassonvillei , subespecie dassonvillei DSM 43235 <213> Nocardiopsis dassonvillei, subspecies dassonvillei DSM 43235

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<400> 2 <400> 2

28 28

29 29

30 30

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<210> 3 <210> 3

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<211> 48 <211> 48

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<212> ADN <212> DNA

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<213> Sintética <213> Sintética

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<220> <220>

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<221> misc_característica <221> misc_característica

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<223> Iniciador <223> Initiator

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<400> 3 <400> 3

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 

  \hskip1cm \ hskip1cm 
31 31

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<210> 4 <210> 4

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<211> 35 <211> 35

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<212> ADN <212> DNA

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<213> Sintética <213> Sintética

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<220> <220>

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<221> misc_característica <221> misc_característica

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<223> Iniciador <223> Initiator

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<400> 4 <400> 4

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 

  \hskip1cm \ hskip1cm 
32 32

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<210> 5 <210> 5

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<211> 24 <211> 24

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<212> ADN <212> DNA

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<213> Sintética <213> Sintética

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<220> <220>

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<221> misc_característica <221> misc_característica

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<223> Iniciador <223> Initiator

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<400> 5 <400> 5

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 

  \hskip1cm \ hskip1cm 
33 33

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<210> 6 <210> 6

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<211> 12 <211> 12

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<212> ADN <212> DNA

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<213> Sintética <213> Sintética

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<220> <220>

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<221> misc_característica <221> misc_característica

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<223> Iniciador <223> Initiator

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<400> 6 <400> 6

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 

  \hskip1cm \ hskip1cm 
34 3. 4

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<210> 7 <210> 7

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<211> 1164 <211> 1164

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<212> ADN <212> DNA

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<213> Sintética ("Proteasa 22") <213> Synthetic ( "Protease 22")

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<220> <220>

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<221> CDS <221> CDS

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<222> (1)..(1164) <222> (1) .. (1164)

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<220> <220>

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<221> sig_péptido <221> sig_péptido

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<222> (1)..(81) <222> (1) .. (81)

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<220> <220>

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<221> misc_característica <221> misc_característica

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<222> (82)..(576) <222> (82) .. (576)

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<223> Propéptido <223> propeptide

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<220> <220>

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<221> mat_péptido <221> mat_péptido

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<222> (577)..(1164) <222> (577) .. (1164)

  \newpage \ newpage 

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<400> 7 <400> 7

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 

35 35

36 36

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<210> 8 <210> 8

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<211> 388 <211> 388

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<212> PRT <212> PRT

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<213> Sintética ("Proteasa 22") <213> Synthetic ( "Protease 22")

  \newpage \ newpage 

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<400> 8 <400> 8

38 38

39 39

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<210> 9 <210> 9

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<211> 1155 <211> 1155

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<212> ADN <212> DNA

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<213> especie Nocardiopsis , DSM 16424 <213> Nocardiopsis species DSM 16424

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<220> <220>

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<221> sig_ péptido <221> SiG peptide

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<222> (1)..(87) <222> (1) .. (87)

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<220> <220>

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<221> CDS <221> CDS

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<222> (1)..(1152) <222> (1) .. (1152)

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<220> <220>

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<221> mat_péptido <221> mat_péptido

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<222> (586)..(1152) <222> (586) .. (1152)

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<400> 9 <400> 9

40 40

41 41

42 42

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<210> 10 <210> 10

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<211> 384 <211> 384

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<212> PRT <212> PRT

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<213> Especie Nocardiopsis , DSM 16424 <213> Nocardiopsis species DSM 16424

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<400> 10 <400> 10

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 

43 43

44 44

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<210> 11 <210> 11

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<211> 1068 <211> 1068

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<212> ADN <212> DNA

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<213> Nocardiopsis alba DSM 15647 <213> Nocardiopsis alba DSM 15647

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<220> <220>

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<221> CDS <221> CDS

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<222> (1)..(1065) <222> (1) .. (1065)

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<220> <220>

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<221> mat_péptido <221> mat_péptido

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<222> (502)..(1065) <222> (502) .. (1065)

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<220> <220>

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<221> sig_péptido <221> sig_péptido

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<222> (502)..(1065) <222> (502) .. (1065)

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<400> 11 <400> 11

45 Four. Five

46 46

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<210> 12 <210> 12

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<211> 355 <211> 355

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<212> PRT <212> PRT

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<213> Nocardiopsis alba DSM 15647 <213> Nocardiopsis alba DSM 15647

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 

  \vskip0.400000\baselineskip \ Vskip0.400000 \ ester 

<400> 12 <400> 12

  \vskip1.000000\baselineskip \ Vskip1.000000 \ ester 

47 47

48 48

Claims (22)

1. Polipéptido aislado que posee una actividad proteasa, y que presenta una temperatura de fusión (T_{m}) de al menos 78ºC, determinada por calorimetría diferencial de barrido (DSC) en 10 mM de tampón de sodio, 50 mM de cloruro de sodio, pH 7,0, usando una velocidad de barrido constante de 1,5ºC/min, donde el polipéptido es seleccionado del grupo consistente en: 1. An isolated polypeptide having protease activity, and having a melting temperature (T_ {m}) of at least 78 ° C, determined by differential scanning calorimetry (DSC) in 10 mM sodium buffer, 50 mM chloride sodium, pH 7.0, using a constant sweep of 1.5 / min, wherein the polypeptide is selected from the group consisting of:
(a) (to)
un polipéptido que posee una secuencia de aminoácidos que presenta un grado de identidad con los aminoácidos 1 a 188 de SEC ID Nº: 2 y/o 1 a 188 de SEC ID Nº: 12 de al menos el 60%; a polypeptide having an amino acid sequence exhibiting a degree of identity to amino acids 1 to 188 of SEQ ID NO: 2 and / or 1 to 188 of SEQ ID NO: 12 of at least 60%;
(b) (B)
un polipéptido que es codificado por una secuencia de ácidos nucléicos que se hibridiza en condiciones de astringencia alta con cualquiera de los nucleótidos 499-1062 de SEC ID Nº: 1, y/o 502-1065 de SEC ID Nº: 11; a polypeptide which is encoded by a nucleic acid sequence which hybridizes under high stringency conditions with either of nucleotides 499-1062 of SEQ ID NO: 1 and / or 502-1065 of SEQ ID NO: 11; y Y
(c) (C)
un polipéptido que es codificado por una secuencia de ácidos nucléicos que presenta un grado de identidad para cualquiera de los nucleótidos 499-1062 de SEC ID Nº: 1, y/o 502-1065 de SEC ID Nº: 11 de al menos el 72%. a polypeptide which is encoded by a nucleic acid sequence having a degree of identity to nucleotides 499-1062 of any of SEQ ID NO: 1, and / or 502-1065 of SEQ ID NO: 11 of at least 72% .
2. Polipéptido según la reivindicación 1 que 2. Polypeptide according to claim 1
(a) (to)
posee un grado de identidad con los aminoácidos 1 a 196 de SEC ID Nº: 8 de al menos el 87%; It has a degree of identity to amino acids 1-196 of SEQ ID NO: 8 of at least 87%;
(b) (B)
es codificado por una secuencia de ácidos nucléicos que se hibridiza en condiciones de astringencia media con los nucleótidos 577-1164 de SEC ID Nº: 7; It is encoded by a nucleic acid sequence which hybridizes under medium stringency conditions with nucleotides 577-1164 of SEQ ID NO: 7; y/o I
(c) (C)
es codificado por una secuencia de ácidos nucléicos que presenta un grado de identidad con los nucleótidos 577-1164 de SEC ID Nº: 7 de al menos el 66%. It is encoded by a nucleic acid sequence having a degree of identity to nucleotides 577-1164 of SEQ ID NO: 7 of at least 66%.
3. Polipéptido según la reivindicación 1 que 3. Polypeptide according to claim 1
(a) (to)
presenta un grado de identidad con los aminoácidos 1 a 189 de SEC ID Nº: 10 de al menos el 93%; It has a degree of identity to amino acids 1-189 of SEQ ID NO: 10 of at least 93%;
(b) (B)
es codificado por una secuencia de ácidos nucléicos que se hibridiza en condiciones de astringencia muy alta con los nucleótidos 586-1152 de SEC ID Nº: 9. y/o is encoded by a nucleic acid sequence which hybridizes under very high stringency conditions with nucleotides 586-1152 of SEQ ID NO: 9 and / or
(c) (C)
es codificado por una secuencia de ácidos nucléicos que presenta un grado de identidad con los nucleótidos 586-1152 de SEC ID Nº: 9 de al menos el 95%. It is encoded by a nucleic acid sequence having a degree of identity to nucleotides 586-1152 of SEQ ID NO: 9 of at least 95%.
4. Ácido nucleico aislado comprendiendo un ácido nucleico que codifica el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-3. 4. An isolated nucleic acid comprising a nucleic acid encoding the polypeptide of any of claims 1-3.
5. Ácido nucleico aislado comprendiendo un ácido nucleico que codifica un polipéptido que posee una actividad proteasa y una temperatura de fusión (T_{m}) de al menos 78ºC, determinada por calorimetría diferencial de barrido (DSC) en 10 mM de fosfato de sodio, 50 mM de tampón de cloruro de sodio, pH 7,0, usando una velocidad de barrido constante de 1,5ºC/min, donde el ácido nucleico 5. An isolated nucleic acid comprising a nucleic acid encoding a polypeptide having protease activity and a melting temperature (T_ {m}) of at least 78 ° C, determined by differential scanning calorimetry (DSC) in 10 mM sodium phosphate , 50 mM sodium chloride buffer of pH 7.0, using a constant sweep of 1.5 / min, wherein the nucleic acid
(a) (to)
se hibridiza en condiciones de astringencia alta con cualquiera de los nucleótidos 499-1062 de SEC ID Nº: 1, y/o 502 1065 de SEC ID Nº: 11; It hybridizes at high stringency conditions with either of nucleotides 499-1062 of SEQ ID NO: 1, and / or 502 1065 SEQ ID NO: 11; (b) presenta un grado de identidad con cualquiera de los nucleótidos 499-1062 de SEC ID Nº: 1, y/o 502-1065 de SEC ID Nº: 11 de al menos el 72%; (B) has a degree of identity to any nucleotide 499-1062 of SEQ ID NO: 1 and / or 502-1065 of SEQ ID NO: 11 of at least 72%; y/o I
(c) (C)
codifica un polipéptido que presenta un grado de identidad con los aminoácidos 1 a 188 de SEC ID Nº: 2 y/o 1 a 188 de SEC ID Nº: 12 de al menos el 60%. It encodes a polypeptide which has a degree of identity to amino acids 1 to 188 of SEQ ID NO: 2 and / or 1 to 188 of SEQ ID NO: 12 of at least 60%.
6. Ácido nucleico según la reivindicación 5 que 6. Nucleic acid according to claim 5
(a) (to)
se hibridiza en condiciones de astringencia media con los nucleótidos 577-1164 de SEC ID Nº: 7; it hybridizes under medium stringency conditions with nucleotides 577-1164 of SEQ ID NO: 7;
(b) (B)
presenta un grado de identidad con los nucleótidos 577-1164 de SEC ID Nº: 7 de al menos el 66%; It has a degree of identity to nucleotides 577-1164 of the SEQ ID NO: 7 of at least 66%; y/o I
(c) (C)
codifica un polipéptido que presenta un grado de identidad con los aminoácidos 1 a 196 de SEC ID Nº: 8 de al menos el 87%. It encodes a polypeptide which has a degree of identity to amino acids 1-196 of SEQ ID NO: 8 of at least 87%.
7. Ácido nucleico según la reivindicación 5 que 7. Nucleic acid according to claim 5
(a) (to)
se hibridiza en condiciones de astringencia muy alta con los nucleótidos 586-1152 de SEC ID Nº: 9; it hybridizes under very high stringency conditions with nucleotides 586-1152 of SEQ ID NO: 9;
(b) (B)
presenta un grado de identidad con los nucleótidos 586-1152 de SEC ID Nº: 9 de al menos el 95%; It has a degree of identity to nucleotides 586-1152 of SEQ ID NO: 9 of at least 95%; y/o I
(c) (C)
codifica un polipéptido que presenta un grado de identidad con los aminoácidos 1 a 189 de SEC ID Nº: 10 de al menos el 93%. It encodes a polypeptide which has a degree of identity to amino acids 1-189 of SEQ ID NO: 10 of at least 93%.
8. Constructo de ácidos nucléicos comprendiendo el ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 4-7 enlazado operativamente con una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un huésped de expresión adecuada. 8. A nucleic acid construct the nucleic acid of any of claims 4-7 operably linked to one or more control sequences that direct the production of the polypeptide in a suitable expression host comprising.
9. Vector de expresión recombinante comprendiendo el constructo de ácido nucléico según la reivindicación 8. 9. Recombinant expression vector construct comprising nucleic acid according to claim 8.
10. Célula huésped recombinante comprendiendo el constructo de ácido nucléico de la reivindicación 8 o el vector de la reivindicación 9. 10. A recombinant host cell comprising the nucleic acid construct of claim 8 or the vector of claim 9.
11. Método para la producción de un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, método comprendiendo: (a) el cultivo de una célula huésped recombinante de la reivindicación 10 para producir un sobrenadante comprendiendo el polipéptido; 11. Method for producing a polypeptide of any of claims 1-3, method comprising: (a) culturing a recombinant host cell of claim 10 to produce a supernatant comprising the polypeptide; y (b) recuperación del polipéptido. and (b) recovering the polypeptide.
12. Planta, o parte de planta, transgénica capaz de expresar el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-3. 12. Plant, or plant part, capable of expressing the transgenic polypeptide of any of claims 1-3.
13. Animal transgénico no humano, o productos, o elementos del mismo, capaces de expresar el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-3. 13. Transgenic animal nonhuman, or products, or elements thereof, capable of expressing the polypeptide of any of claims 1-3.
14. Método para la producción de un polipéptido según la reivindicación 1, el método comprendiendo 14. Method for producing a polypeptide according to claim 1, the method comprising
(a) (to)
el cultivo de cualquiera de las cepas siguientes: cultivating any of the following strains:
(i) (I)
Nocardiopsis dassonvillei , subespecie dassonvillei DSM 43235, Nocardiopsis dassonvillei, subspecies dassonvillei DSM 43235,
(ii) (Ii)
una especie Nocardiopsis DSM 16424, o DSM 16424 Nocardiopsis a species, or
(iii) (Iii)
Nocardiopsis alba DSM 15647; Nocardiopsis alba DSM 15647; y Y
(b) (B)
recuperación del polipéptido. recovering the polypeptide.
15. Uso de al menos un polipéptido tal y como está definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-3 (i) en alimentos para animales; 15. Use of at least one polypeptide as defined in any being of claims 1-3 (i) in animal feed claims; (ii) en la preparación de una composición para usar en alimentos para animales; (Ii) in the preparation of a composition for use in animal feed; (iii) para mejorar el valor nutritivo de un alimento para animales; (Iii) for improving the nutritional value of an animal feed; (iv) para aumentar la proteína digerible y/o soluble en dietas de animales; (Iv) for increasing digestible and / or soluble protein in animal diets; (v) para aumentar el grado de hidrólisis de las proteínas en dietas de animales; (V) to increase the degree of hydrolysis of proteins in animal diets; y/o (vi) para el tratamiento de las proteínas. and / or (vi) for the treatment of proteins.
16. Aditivo de alimentos para animales comprendiendo al menos un polipéptido tal y como está definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-3. 16. animal feed additive comprising at least one polypeptide as defined in any of claims 1-3. y Y
(a) (to)
al menos una vitamina liposoluble, y/o at least one fat-soluble vitamin, and / or
(b) (B)
al menos una vitamina hidrosoluble, y/o at least one water soluble vitamin, and / or
(c) (C)
al menos un oligoelemento. at least one trace mineral.
17. Composición de alimentos para animales que posee un contenido de proteínas brutas de 50 a 800 g/kg y comprendiendo al menos un polipéptido tal como está definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-3, o al menos un aditivo de producto alimentario según la reivindicación 16. 17. Composition of animal feed having a crude protein content of 50-800 g / kg and comprising at least one polypeptide as defined in any of claims 1-3, or at least one additive of food product according to claim 16.
18. Composición de alimentos para animales según la reivindicación 17 que es un producto alimentario para peces. 18. Composition of animal feed of claim 17 which is a fish feed product.
19. Composición comprendiendo al menos un polipéptido tal como está definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-3, con al menos otra enzima seleccionada entre una amilasa, fitasa, xilanasa, galactanasa, alfa-galactosidasa, proteasa, fosfolipasa, y/o beta-glucanasa. 19. Composition comprising at least one polypeptide as defined in any of claims 1-3, with at least one other enzyme selected from amongst amylase, phytase, xylanase, galactanase, alpha-galactosidase, protease, phospholipase, and / or beta- glucanase.
20. Uso de al menos un polipéptido tal como está definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-3 en detergentes. 20. Use of at least one polypeptide as is defined in any of claims 1-3 in detergents.
21. Especie Nocardiopsis DSM 16424. 21. Nocardiopsis species DSM 16424.
22. Nocardiopsis alba DSM 15647. 22. Nocardiopsis alba DSM 15647.
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