ES2300156A1 - Method for in vitro diagnosis and prognosis of pancreatic cancer and for development of drugs against pancreatic cancer, involves determining stage or severity of cancer, where effect of therapy administered to individual is monitored - Google Patents
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Abstract
Description
Métodos para el diagnóstico in vitro y pronóstico in vitro del cáncer de páncreas y para el desarrollo de fármacos contra el cáncer de páncreas.Methods for diagnosing in vitro and in vitro pancreatic cancer prognosis and drug development against pancreatic cancer.
La presente invención se refiere a un método in vitro para detectar la presencia del cáncer de páncreas en un individuo, para determinar el estadio o la severidad de dicho cáncer en el individuo, o para monitorizar el efecto de la terapia administrada a un individuo que presente dicho cáncer; a la búsqueda, identificación, desarrollo y evaluación de la eficacia de compuestos para terapia de dicho cáncer, con el fin de desarrollar nuevos medicamentos; así como a agentes que inhiben la expresión y/o la actividad de la proteína GOLPH-2, y/o los efectos de esta expresión.The present invention relates to an in vitro method to detect the presence of pancreatic cancer in an individual, to determine the stage or severity of said cancer in the individual, or to monitor the effect of therapy administered to an individual presenting said cancer; to the search, identification, development and evaluation of the efficacy of compounds for said cancer therapy, in order to develop new medications; as well as agents that inhibit the expression and / or activity of the GOLPH-2 protein, and / or the effects of this expression.
El cáncer de páncreas fue la causa de más de 220.000 muertes en el mundo, y de más de 3.600 en España, durante el año 2.000 (GLOBOCAN). El comportamiento clínico del cáncer de páncreas es homogéneo y siempre infausto, sin diferencias notables en la supervivencia según el estadio. El número de pacientes con cáncer de páncreas de buen pronóstico es insignificante. Una posible explicación es que incluso en pacientes con tumores pequeños, encuadrados en el estadio I, la enfermedad está diseminada. Su diagnóstico en una fase inicial, salvo en casos fortuitos, es difícil; un 75% de los pacientes diagnosticados presentan enfermedad avanzada (Estadios III y IV). Se trata de una neoplasia muy agresiva, resistente a los tratamientos citostáticos y sólo entre un 1 y un 4% de los casos permanecen vivos a los cinco años del diagnóstico, siempre que el tumor esté localizado y haya podido ser extirpado en su totalidad (Warshaw A.L., and Fernándes del Castillo C., N. Eng. J. Med., 1992, 326:455-465; Ahlgren J.D., Semin. Oncol. 1996, 23:241-250). Es por todo ello que en el caso del cáncer de páncreas, tanto el desarrollo de sistemas de diagnóstico precoz como el de terapias eficaces, resultan cruciales para el control de la enfermedad (Byungwoo R., et al., Cancer Res., 2002, 62:819-826).Pancreatic cancer was the cause of more than 220,000 deaths in the world, and more than 3,600 in Spain, during the year 2,000 (GLOBOCAN). The clinical behavior of pancreatic cancer is homogeneous and always infamous, with no notable differences in survival according to the stage. The number of patients with pancreatic cancer with a good prognosis is negligible. One possible explanation is that even in patients with small tumors, framed in stage I, the disease is widespread. Its diagnosis in an initial phase, except in fortuitous cases, is difficult; 75% of patients diagnosed have advanced disease (Stages III and IV). It is a very aggressive neoplasm, resistant to cytostatic treatments and only between 1 and 4% of cases remain alive after five years of diagnosis, provided the tumor is localized and has been able to be completely removed (Warshaw AL, and Fernándes del Castillo C., N. Eng. J. Med., 1992, 326: 455-465; Ahlgren JD, Semin. Oncol. 1996, 23: 241-250). That is why in the case of pancreatic cancer, both the development of early diagnosis systems and effective therapies are crucial for disease control (Byungwoo R., et al ., Cancer Res., 2002, 62: 819-826).
Muchos de los genes y proteínas implicados en la progresión de estos carcinomas son todavía desconocidos; la identificación de genes y proteínas expresados diferencialmente en asociación con el proceso de invasividad tumoral, podría conducir a la identificación de marcadores biológicos y dianas terapéuticas, que podrían tener un gran valor para el diagnóstico, el pronóstico y el tratamiento de esta enfermedad.Many of the genes and proteins involved in the Progression of these carcinomas are still unknown; the identification of genes and proteins differentially expressed in association with the tumor invasiveness process, could lead to the identification of biological markers and therapeutic targets, that could have a great value for the diagnosis, the prognosis and the treatment of this disease.
La Fosfoproteína 2 de Golgi (Golgi phosphoprotein 2, GP73 o GOLPH-2) es una proteína transmembrana que se localiza en el aparato de Golgi. GOLPH-2 se expresa preferentemente en células epiteliales, en diferentes tejidos humanos (Kladney R.D., et al., 2000, Gene, 249:53-65). Las proteínas del aparato de Golgi, como GOLPH-2, están implicadas en el procesamiento de las proteínas sintetizadas en el retículo endoplásmico rugoso, y en el transporte de proteínas a través del aparato de Golgi. La función biológica de GOLPH-2 es desconocida; se ha demostrado que su expresión es muy alta en hepatocitos de pacientes afectados de hepatitis viral y que estos elevados niveles de expresión están inducidos por la infección viral (Kladney R.D., et al., 2002, Virology, 301:236-246; Kladney R.D., et al., 2002, Hepatology, 35:1431-1440). Por otro lado, se han solicitado patentes de composiciones, kits y métodos para detectar, caracterizar, prevenir y tratar cánceres humanos de mama (US20030124128) y cáncer de próstata (US20030108963), basados técnicamente en la sobreexpresión del gen golph2 en estos tumores; pero no se ha demostrado previamente que el gen golph-2, o la proteína GOLPH- 2 que codifica, estén sobreexpresados en muestras de tejido tumoral procedentes de individuos afectados de adenocarcinoma ductal de páncreas.Golgi Phosphoprotein 2 (Golgi phosphoprotein 2, GP73 or GOLPH-2) is a transmembrane protein that is located in the Golgi apparatus. GOLPH-2 is preferably expressed in epithelial cells, in different human tissues (Kladney RD, et al ., 2000, Gene, 249: 53-65). Golgi apparatus proteins, such as GOLPH-2, are involved in the processing of proteins synthesized in the rough endoplasmic reticulum, and in the transport of proteins through the Golgi apparatus. The biological function of GOLPH-2 is unknown; It has been shown that its expression is very high in hepatocytes of patients affected by viral hepatitis and that these high levels of expression are induced by viral infection (Kladney RD, et al ., 2002, Virology, 301: 236-246; Kladney RD , et al ., 2002, Hepatology, 35: 1431-1440). On the other hand, patents have been applied for compositions, kits and methods to detect, characterize, prevent and treat human breast cancers (US20030124128) and prostate cancer (US20030108963), technically based on the overexpression of the golph2 gene in these tumors; but it has not been previously demonstrated that the golph-2 gene, or the GOLPH-2 protein that it encodes, is overexpressed in tumor tissue samples from individuals affected by ductal adenocarcinoma of the pancreas.
Inesperadamente, los autores de la presente invención han descubierto, tras laboriosa investigación y empleando diferentes técnicas (DNA-chips y RT-PCR cuantitativa para medir los niveles de expresión génica y Western-blot para medir los niveles de expresión proteica), que la expresión génica de golph-2 está incrementada en el carcinoma de páncreas, en especial en el adenocarcinoma ductal de páncreas, al compararla con la expresión en tejido no tumoral procedente de los mismos individuos o de individuos afectados de pancreatitis. Los autores de la presente invención han descubierto que también la concentración de la proteína GOLPH-2 es muy elevada en el carcinoma de páncreas, especialmente en el adenocarcinoma ductal de páncreas, al compararla con la expresión en tejido no tumoral procedente de los mismos individuos, de individuos sanos, o de individuos afectados de pancreatitis. Estas evidencias convierten a GOLPH-2 en una útil diana para el desarrollo de nuevos métodos in vitro de diagnóstico y pronóstico, y para la identificación y desarrollo de compuestos para terapia del cáncer de páncreas, en especial de adenocarcinomas ductales de páncreas.Unexpectedly, the authors of the present invention have discovered, after laborious research and using different techniques (DNA-chips and quantitative RT-PCR to measure the levels of gene expression and Western-blot to measure the levels of protein expression), that the expression Golph-2 gene is increased in carcinoma of the pancreas, especially in ductal adenocarcinoma of the pancreas, when compared with non-tumor tissue expression from the same individuals or individuals affected by pancreatitis. The authors of the present invention have discovered that the concentration of GOLPH-2 protein is also very high in pancreatic carcinoma, especially in pancreatic ductal adenocarcinoma, when compared with non-tumor tissue expression from the same individuals, of healthy individuals, or of individuals affected by pancreatitis. This evidence makes GOLPH-2 a useful target for the development of new in vitro diagnostic and prognostic methods, and for the identification and development of compounds for pancreatic cancer therapy, especially ductal adenocarcinomas of the pancreas.
La presente invención proporciona por tanto un método in vitro para detectar la presencia del cáncer de páncreas, en especial del adenocarcinoma ductal de páncreas, para determinar el estadio o la severidad de dicho cáncer en el individuo, o para monitorizar el efecto de la terapia administrada a un individuo que presente dicho cáncer, basado en la detección y/o cuantificación de la proteína GOLPH-2, del mRNA del gen golph-2 o el correspondiente cDNA en una muestra de dicho individuo. Asimismo, la presente invención proporciona dianas o herramientas para la búsqueda, identificación, desarrollo y evaluación de la eficacia de compuestos para terapia del cáncer de páncreas, en especial del adenocarcinoma ductal de páncreas. Finalmente, la invención proporciona agentes caracterizados porque inhiben la expresión y/o la actividad de la proteína GOLPH-2 para el tratamiento del cáncer de páncreas, en especial del adenocarcinoma ductal de páncreas.The present invention thus provides an in vitro method for detecting the presence of pancreatic cancer, especially ductal adenocarcinoma of the pancreas, for determining the stage or severity of said cancer in the individual, or for monitoring the effect of the therapy administered. to an individual presenting said cancer, based on the detection and / or quantification of the GOLPH-2 protein, of the golph-2 gene mRNA or the corresponding cDNA in a sample of said individual. Also, the present invention provides targets or tools for the search, identification, development and evaluation of the efficacy of compounds for pancreatic cancer therapy, especially ductal pancreatic adenocarcinoma. Finally, the invention provides agents characterized in that they inhibit the expression and / or activity of the GOLPH-2 protein for the treatment of pancreatic cancer, especially ductal adenocarcinoma of the pancreas.
La presente invención tiene como objeto principal el desarrollo de un método in vitro para detectar la presencia del cáncer de páncreas, en especial del adenocarcinoma ductal de páncreas, para determinar el estadio o la severidad de dicho cáncer en el individuo, o para monitorizar el efecto de la terapia administrada a un individuo que presente dicho cáncer.The present invention has as its main object the development of an in vitro method to detect the presence of pancreatic cancer, especially ductal adenocarcinoma of the pancreas, to determine the stage or severity of said cancer in the individual, or to monitor the effect of the therapy administered to an individual presenting said cancer.
Un segundo objeto de la presente invención es un método in vitro para buscar, identificar, desarrollar y evaluar la eficacia de compuestos para la terapia del cáncer de páncreas, en especial del adenocarcinoma ductal de páncreas.A second object of the present invention is an in vitro method to search, identify, develop and evaluate the efficacy of compounds for pancreatic cancer therapy, especially ductal pancreatic adenocarcinoma.
Un objeto adicional de la invención reside en el uso de secuencias derivadas del gen golph-2 para el diagnóstico y pronóstico in vitro del cáncer de páncreas, en especial del adenocarcinoma ductal de páncreas, así como para la búsqueda, identificación, desarrollo y evaluación de la eficacia de compuestos para la terapia de dicho cáncer.A further object of the invention resides in the use of sequences derived from the golph-2 gene for the in vitro diagnosis and prognosis of pancreatic cancer, especially ductal adenocarcinoma of the pancreas, as well as for the search, identification, development and evaluation of the efficacy of compounds for the therapy of said cancer.
Otro objeto de la presente invención consiste en proporcionar agentes caracterizados porque inhiben la expresión y/o la actividad de la proteína GOLPH-2, para el tratamiento del cáncer de páncreas, en especial del adenocarcinoma ductal de páncreas.Another object of the present invention consists in provide agents characterized in that they inhibit expression and / or GOLPH-2 protein activity, for the pancreatic cancer treatment, especially adenocarcinoma ductal pancreas.
Por último, es también objeto de la invención una composición farmacéutica que comprenda uno o varios agentes terapéuticos junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable, para el tratamiento del cáncer de páncreas, en especial del adenocarcinoma ductal de páncreas.Finally, it is also the subject of the invention. a pharmaceutical composition comprising one or more agents therapeutic together with a pharmaceutically acceptable excipient, for the treatment of pancreatic cancer, especially ductal adenocarcinoma of the pancreas.
Figura 1: Curva de desnaturalización del producto de la PCR del gen diana, golph-2 (Tm = 82ºC) y del gen de referencia, ribl10 (Tm=84ºC), en experimentos de medida de la expresión génica por RT-PCR cuantitativa en tiempo real, en muestras de páncreas.Figure 1: Denaturation curve of PCR product of the target gene, golph-2 (Tm = 82 ° C) and the reference gene, ribl10 (Tm = 84 ° C), in experiments of measurement of gene expression by RT-PCR quantitative in real time, in pancreas samples.
Figura 2: Cálculo de la eficiencia de amplificación de las reacciones de PCR de golph-2, en experimentos de medida de la expresión génica por RT-PCR cuantitativa en tiempo real, en muestras de páncreas.Figure 2: Calculation of the efficiency of amplification of golph-2 PCR reactions, in experiments measuring gene expression by Real-time quantitative RT-PCR, in samples of pancreas.
Figura 3: Cálculo de la eficiencia de amplificación de las reacciones de PCR de ribl10, en experimentos de medida de la expresión génica por RT-PCR cuantitativa en tiempo real, en muestras de páncreas.Figure 3: Calculation of the efficiency of amplification of ribl10 PCR reactions, in experiments of gene expression measurement by RT-PCR quantitative in real time, in pancreas samples.
Para facilitar la comprensión de la presente solicitud de patente, exponemos a continuación el significado de algunos términos y expresiones en el contexto de la invención:To facilitate the understanding of this patent application, we explain below the meaning of Some terms and expressions in the context of the invention:
Los términos "sujeto" o "individuo" se refieren a miembros de especies de animales mamíferos, e incluye, pero no se limita, a animales domésticos, primates y humanos; el sujeto es preferiblemente un ser humano, masculino o femenino, de cualquier edad o raza.The terms "subject" or "individual" are refer to members of mammalian animal species, and includes, but it is not limited to pets, primates and humans; he subject is preferably a human being, male or female, of Any age or race.
El término "cáncer" se refiere a la enfermedad que se caracteriza por una proliferación descontrolada de células anormales capaces de invadir tejidos adyacentes y diseminarse a órganos lejanos.The term "cancer" refers to the disease characterized by uncontrolled proliferation of abnormal cells capable of invading adjacent tissues and spread to distant organs.
El término "carcinoma" se refiere al tejido que resulta del crecimiento celular anormal o descontrolado.The term "carcinoma" refers to tissue that results from abnormal or uncontrolled cell growth.
El término "cáncer de páncreas" o "cáncer en el páncreas" o "carcinoma de páncreas" se refiere a cualquier desorden proliferativo maligno de células del páncreas.The term "pancreatic cancer" or "cancer in the pancreas "or" pancreatic carcinoma "refers to any malignant proliferative disorder of cells of the pancreas.
El término "adenocarcinoma ductal de páncreas" se refiere a cualquier desorden proliferativo maligno de células ductales del páncreas.The term "ductal adenocarcinoma of pancreas "refers to any malignant proliferative disorder of ductal cells of the pancreas.
El término "tumor" se refiere a cualquier masa anormal de tejido producto de un proceso neoplásico, benigno (no canceroso) o maligno (canceroso).The term "tumor" refers to any abnormal tissue mass resulting from a benign neoplastic process (not cancerous) or malignant (cancerous).
El término "gen" se refiere a una cadena molecular de desoxirribonucleótidos, que codifica una proteína.The term "gene" refers to a chain molecular deoxyribonucleotides, which encodes a protein.
El término "DNA" se refiere al ácido desoxirribonucleico. Una secuencia de DNA es una secuencia de desoxirribonucleótidos.The term "DNA" refers to acid deoxyribonucleic. A DNA sequence is a sequence of deoxyribonucleotides.
El término "cDNA" se refiere a una secuencia de nucleótidos, complementaria de una secuencia de mRNA.The term "cDNA" refers to a nucleotide sequence, complementary to a sequence of mRNA
El término "RNA" se refiere al ácido ribonucleico. Una secuencia de RNA es una secuencia de ribonucleótidos.The term "RNA" refers to acid ribonucleic. An RNA sequence is a sequence of ribonucleotides
El término "mRNA" se refiere al ácido ribonucleico mensajero, que es la fracción del RNA total que se traduce a proteínas.The term "mRNA" refers to acid messenger ribonucleic, which is the fraction of total RNA that is Translates to proteins.
La frase "mRNA transcrito de" se refiere a la transcripción del gen (DNA) en mRNA, como primer paso para que el gen se exprese y traduzca a proteína.The phrase "mRNA transcribed from" refers to gene transcription (DNA) in mRNA, as a first step for The gene is expressed and translated into protein.
El término "secuencia de nucleótidos" o "secuencia nucleotídica" se refiere indistintamente a una secuencia de ribonucleótidos (RNA) o de desoxirribonucleótidos (DNA).The term "nucleotide sequence" or "nucleotide sequence" refers interchangeably to a ribonucleotide (RNA) or deoxyribonucleotide sequence (DNA).
El término "proteína" se refiere a una cadena molecular de aminoácidos, unidos por enlaces covalentes o no covalentes. El término incluye todas las formas de modificaciones post-traduccionales, por ejemplo glicosilación, fosforilación o acetilación.The term "protein" refers to a amino acid molecular chain, linked by covalent bonds or not covalent The term includes all forms of modifications post-translational, for example glycosylation, phosphorylation or acetylation.
Los términos "péptido" y "polipéptido" se refieren a cadenas moleculares de aminoácidos que representan un fragmento proteico. Los términos "proteína" y "péptido", se usan indistintamente.The terms "peptide" and "polypeptide" they refer to molecular chains of amino acids that represent a protein fragment The terms "protein" and "peptide", They are used interchangeably.
El término "anticuerpo" se refiere a una glucoproteína que exhibe una actividad de unión específica por una proteína particular, a la que se denomina "antígeno". El término "anticuerpo" comprende anticuerpos monoclonales, o anticuerpos policlonales, intactos, o fragmentos de ellos; e incluye anticuerpos humanos, humanizados y de origen no humano. Los "anticuerpos monoclonales" son poblaciones homogéneas de anticuerpos, altamente específicos, que están dirigidos contra un único sitio o "determinante" antigénico. Los "anticuerpos policlonales" incluyen poblaciones heterogéneas de anticuerpos, que están dirigidos contra diferentes determinantes antigénicos.The term "antibody" refers to a glycoprotein that exhibits a specific binding activity by a particular protein, which is called "antigen". He term "antibody" comprises monoclonal antibodies, or polyclonal antibodies, intact, or fragments thereof; and It includes human, humanized and non-human origin antibodies. The "monoclonal antibodies" are homogeneous populations of highly specific antibodies that are directed against a single site or antigenic "determinant". "Antibodies polyclonal "include heterogeneous antibody populations, that are directed against different determinants antigenic
El término "epítopo", tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a un determinante antigénico de una proteína, que es la secuencia de aminoácidos de la proteína que un anticuerpo específico reconoce.The term "epitope", as used In the present invention, it refers to an antigenic determinant of a protein, which is the amino acid sequence of the protein that a specific antibody recognizes.
El término "fase sólida", tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a una matriz no acuosa a la que se puede unir el anticuerpo. Ejemplos de materiales para fase sólida incluyen vidrio, polisacáridos, por ejemplo agarosa, poliacrilamida, poliestireno, alcohol polivinílico y siliconas. Ejemplos de formas de fase sólida son el pocillo de una placa de ensayo o una columna de purificación.The term "solid phase," as used in the present invention, refers to a non-aqueous matrix to which the antibody can bind. Examples of materials for solid phase include glass, polysaccharides, for example agarose, polyacrylamide, polystyrene, polyvinyl alcohol and silicones. Examples of solid phase forms are the well of a plate of test or a purification column.
El término "oligonucleótido cebador", tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a una secuencia nucleotídica, que es complementaria de una secuencia nucleotídica del gen golph-2. Cada cebador hibrida con su secuencia nucleotídica diana y actúa como un sitio de inicio para la polimerización del DNA.The term "oligonucleotide primer", such as used in the present invention, it refers to a nucleotide sequence, which is complementary to a sequence nucleotide of the golph-2 gene. Each hybrid primer with its target nucleotide sequence and acts as a starting site for the polymerization of DNA.
El término "sonda", tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a una secuencia nucleotídica complementaria de una secuencia nucleotídica derivada del gen golph-2, que se puede utilizar para detectar esa secuencia nucleotídica derivada del gen golph-2.The term "probe", as used in The present invention relates to a nucleotide sequence complementary to a nucleotide sequence derived from the gene golph-2, which can be used to detect that gene derived nucleotide sequence golph-2.
El término "diana terapéutica" se refiere a secuencias nucleotídicas o peptídicas, contra las que se puede diseñar y aplicar clínicamente un fármaco o compuesto terapéutico.The term "therapeutic target" refers to nucleotide or peptide sequences, against which you can Clinically design and apply a drug or compound therapeutic.
El término "antagonista" se refiere a cualquier molécula que inhiba la actividad biológica de la molécula antagonizada. Ejemplos de moléculas antagonistas incluyen, entre otros, proteínas, péptidos, variaciones de secuencia de péptidos naturales y pequeñas moléculas orgánicas (de peso molecular inferior a 500 daltons).The term "antagonist" refers to any molecule that inhibits the biological activity of the molecule antagonized Examples of antagonistic molecules include, among others, proteins, peptides, peptide sequence variations natural and small organic molecules (molecular weight less than 500 daltons).
La presente invención se basa en el descubrimiento de que tanto la expresión génica de golph-2, como la concentración de la proteína GOLPH-2 se ve incrementada en el cáncer de páncreas, en particular en el adenocarcinoma ductal de páncreas de un individuo.The present invention is based on the discovery that both gene expression of golph-2, as protein concentration GOLPH-2 is increased in cancer of pancreas, particularly in the ductal adenocarcinoma of the pancreas of An individual.
En este sentido, la presente invención proporciona, en primer lugar, un método in vitro para detectar la presencia de un cáncer en el páncreas de un individuo, en especial de un adenocarcinoma ductal de páncreas, para determinar el estadio o la severidad de dicho cáncer en el individuo, o para monitorizar el efecto de la terapia administrada a un individuo que presente dicho cáncer, que comprende:In this regard, the present invention provides, first of all, an in vitro method for detecting the presence of a cancer in the pancreas of an individual, especially a ductal adenocarcinoma of the pancreas, to determine the stage or severity of said cancer. in the individual, or to monitor the effect of the therapy administered to an individual presenting said cancer, which comprises:
a) la detección y/o cuantificación de la proteína GOLPH-2, del mRNA del gen golph- 2 o del correspondiente cDNA en una muestra de dicho individuo, ya) the detection and / or quantification of the GOLPH-2 protein, from the mRNA of the golph-2 gene or from corresponding cDNA in a sample of said individual, and
b) la comparación de la cantidad de proteína GOLPH-2, de la cantidad de mRNA del gen golph-2 o de la cantidad del correspondiente cDNA detectada en una muestra de un individuo, con la cantidad de proteína GOLPH-2, con la cantidad del mRNA del gen golph-2 o con la cantidad del correspondiente cDNA detectada en las muestras de individuos control o en muestras anteriores del mismo individuo o con los valores normales de referencia.b) comparison of the amount of protein GOLPH-2, of the amount of mRNA of the gene golph-2 or the amount of the corresponding cDNA detected in a sample of an individual, with the amount of GOLPH-2 protein, with the amount of the gene mRNA golph-2 or with the amount of the corresponding cDNA detected in the samples of control individuals or in samples previous of the same individual or with the normal values of reference.
El método proporcionado por la presente invención es de alta sensibilidad y especificidad, y se basa en que sujetos o individuos diagnosticados de cáncer de páncreas, en especial de adenocarcinoma ductal de páncreas, presentan niveles elevados de mRNA transcrito del gen golph-2 (niveles elevados de expresión del gen golph-2), o concentraciones elevadas de la proteína codificada por el gen golph-2 (proteína GOLPH-2), en comparación con los correspondientes niveles en muestras procedentes de sujetos sin historial clínico de estos cánceres.The method provided by the present invention is of high sensitivity and specificity, and is based on the fact that subjects or individuals diagnosed with pancreatic cancer, especially ductal pancreatic adenocarcinoma, have elevated levels of golph-2 gene transcribed mRNA ( high levels of expression of the golph-2 gene ), or high concentrations of the protein encoded by the golph-2 gene (GOLPH-2 protein ), compared to the corresponding levels in samples from subjects without clinical history of these cancers.
El presente método comprende una etapa de obtención de la muestra del individuo. Se puede trabajar con distintas muestras fluidas como, por ejemplo: orina, sangre, plasma, suero, líquido pleural, líquido ascítico, líquido sinovial, bilis, semen, exudado de flujo gástrico o líquido cefalorraquídeo. La muestra también puede ser tejido de páncreas, que se puede obtener por cualquier método convencional, preferiblemente resección quirúrgica.The present method comprises a step of Obtaining the individual's sample. You can work with different fluid samples such as: urine, blood, plasma, serum, pleural fluid, ascites fluid, synovial fluid, bile, semen, exudate of gastric flow or cerebrospinal fluid. The Sample can also be pancreas tissue, which can be obtained by any conventional method, preferably resection surgical
Las muestras pueden ser obtenidas de sujetos previamente diagnosticados, o no diagnosticados, de un determinado tipo de carcinoma; o también de un sujeto en tratamiento, o que ha sido tratado previamente contra un cáncer, en particular contra el cáncer de páncreas.Samples can be obtained from subjects previously diagnosed, or undiagnosed, of a given type of carcinoma; or also of a subject under treatment, or who has previously treated against cancer, particularly against pancreatic cancer.
El presente método comprende además una etapa de extracción de la muestra, ya sea para obtener el extracto de proteínas de ésta, o bien para obtener el extracto de RNA total. Uno de estos dos extractos representa el material de trabajo para la siguiente fase. Los protocolos de extracción de la proteína total o del RNA total son bien conocidos por el experto en la materia (Chomczynski P. et al., Anal. Biochem., 1987, 162: 156; Chomczynski P., Biotechniques, 1993, 15: 532).The present method further comprises a step of extracting the sample, either to obtain the protein extract thereof, or to obtain the total RNA extract. One of these two extracts represents the work material for the next phase. The total protein or total RNA extraction protocols are well known to those skilled in the art (Chomczynski P. et al ., Anal. Biochem., 1987, 162: 156; Chomczynski P., Biotechniques, 1993, 15: 532).
Cualquier ensayo convencional se puede utilizar en el marco de la invención para detectar un cáncer, siempre que mida in vitro los niveles de mRNA transcrito del gen golph-2 o su cDNA complementario, o la concentración de proteína GOLPH-2, en muestras recogidas de los individuos a analizar y de individuos control.Any conventional assay can be used in the context of the invention to detect a cancer, provided that it measures in vitro the levels of transcribed mRNA of the golph-2 gene or its complementary cDNA, or the concentration of GOLPH-2 protein, in samples collected from the individuals to analyze and control individuals.
Así pues, esta invención proporciona un método para detectar la presencia del cáncer de páncreas, en especial del adenocarcinoma ductal de páncreas, en un individuo, para determinar el estadio o la severidad de dichos cánceres en el individuo, o para monitorizar el efecto de la terapia administrada a un individuo que presente dicho cáncer, basado bien en la medida de la concentración de la proteína GOLPH-2, o bien en la medida del nivel de expresión del gen golph-2.Thus, this invention provides a method. to detect the presence of pancreatic cancer, especially Ductal adenocarcinoma of the pancreas, in an individual, to determine the stage or severity of such cancers in the individual, or to monitor the effect of therapy administered to an individual who present said cancer, based well on the measurement of concentration of the GOLPH-2 protein, or to the extent of expression level of the golph-2 gene.
En el caso de que lo que se pretenda detectar sea la proteína GOLPH-2, el método de la invención comprende una primera etapa de puesta en contacto del extracto de proteínas de la muestra con una composición de uno o más anticuerpos específicos contra uno o más epítopos de la proteína GOLPH-2, y una segunda etapa de cuantificación de los complejos formados por anticuerpos y la proteína GOLPH-2.In the event that what is intended to detect be the GOLPH-2 protein, the method of the invention it comprises a first stage of bringing the extract of sample proteins with a composition of one or more antibodies specific against one or more protein epitopes GOLPH-2, and a second stage of quantification of complexes formed by antibodies and protein GOLPH-2
Existe una amplia variedad de ensayos inmunológicos disponibles para detectar y cuantificar la formación de complejos específicos antígeno-anticuerpo; numerosos ensayos de unión de proteínas, competitivos y no competitivos, han sido previamente descritos, y un gran número de estos ensayos está disponible comercialmente.There is a wide variety of trials immunological available to detect and quantify the formation of specific antigen-antibody complexes; numerous protein binding assays, competitive and not competitive, have been previously described, and a large number of These trials are commercially available.
Así, la proteína GOLPH-2 se puede cuantificar con anticuerpos como, por ejemplo: anticuerpos monoclonales, policlonales, intactos o fragmentos recombinantes de ellos, combibodies y fragmentos Fab o scFv de anticuerpos, específicos contra la Proteína GOLPH-2; siendo estos anticuerpos humanos, humanizados o de origen no humano. Los anticuerpos que se emplean en estos ensayos pueden estar marcados o no; los anticuerpos no marcados se pueden utilizar en ensayos de aglutinación; los anticuerpos marcados se pueden utilizar en una amplia variedad de ensayos. Las moléculas marcadoras que se pueden utilizar para marcar los anticuerpos incluyen radionucleótidos, enzimas, fluoróforos, reactivos quimioluminiscentes, sustratos enzimáticos o cofactores, inhibidores enzimáticos, partículas, colorantes y derivados.Thus, the GOLPH-2 protein is can quantify with antibodies such as: antibodies monoclonal, polyclonal, intact or recombinant fragments of they, combibodies and Fab or scFv antibody fragments, specific against GOLPH-2 Protein; being these human, humanized or non-human origin antibodies. The antibodies used in these assays may be labeled or no; unlabeled antibodies can be used in assays of agglutination; labeled antibodies can be used in a Wide variety of essays. The marker molecules that can be Use to label antibodies include radionuclides, enzymes, fluorophores, chemiluminescent reagents, substrates enzymatic or cofactors, enzymatic inhibitors, particles, dyes and derivatives.
Existe una amplia variedad de ensayos bien
conocidos, que se pueden utilizar en la presente invención, que
utilizan anticuerpos no marcados (anticuerpo primario) y
anticuerpos marcados (anticuerpo secundario); entre estas técnicas
se incluyen el Western-blot o transferencia
Western, ELISA (Enzyme-Linked inmunosorbent assay o
ensayo inmunoabsorvente ligado a enzima), RIA (Radioinmunoassay o
Radioinmunoensayo), EIA competitivo (Competitive enzyme immunoassay
o Inmunoensayo enzimático competitivo), DAS-ELISA
(Double antibody sandwich-ELISA o ensayo ELISA
sándwich con doble anticuerpo), técnicas inmunocitoquímicas e
inmunohistoquímicas, técnicas basadas en el empleo de biochips o
microarrays de proteínas que incluyan anticuerpos específicos o
ensayos basados en precipitación coloidal en formatos tales como
dipsticks. Otras maneras para detectar y cuantificar la
proteína GOLPH-2, incluyen técnicas de
cromatografía de afinidad, ensayos de unión a ligando o ensayos de
unión a
lectina.There is a wide variety of well known assays, which can be used in the present invention, which use unlabeled antibodies (primary antibody) and labeled antibodies (secondary antibody); These techniques include Western-blot or Western blotting, ELISA (Enzyme-Linked immunosorbent assay or enzyme-linked immunosorbent assay), RIA (Radioimmunoassay or Radioimmunoassay), Competitive EIA (Competitive enzyme immunoassay or Competitive enzyme immunoassay), DAS-ELISA (Double antibody sandwich-ELISA or ELISA sandwich assay with double antibody), immunocytochemical and immunohistochemical techniques, techniques based on the use of biochips or microarrays of proteins that include specific antibodies or tests based on colloidal precipitation in formats such as dipsticks . Other ways to detect and quantify the GOLPH-2 protein include affinity chromatography techniques, ligand binding assays or binding assays.
lectin
El inmunoensayo preferido en el método de la invención es un ensayo ELISA sándwich con doble anticuerpo (DAS-ELISA). En este inmunoensayo se puede utilizar cualquier anticuerpo o combinación de anticuerpos, específicos contra uno o más epítopos de la proteína GOLPH-2. Como ejemplo de uno de los muchos posibles formatos de este ensayo, un anticuerpo, monoclonal o policlonal, o un fragmento de este anticuerpo, o una combinación de anticuerpos, que recubren una fase sólida, se ponen en contacto con la muestra a analizar, y se incuban durante un tiempo y en condiciones apropiados para formar los complejos antígeno-anticuerpo. Después de un lavado en condiciones apropiadas para eliminar los complejos no específicos, se incuba con los complejos antígeno-anticuerpo, en condiciones y tiempo apropiados, un reactivo indicador, que comprende un anticuerpo monoclonal o policlonal, o un fragmento de este anticuerpo, o una combinación de estos anticuerpos, unidos a un compuesto generador de una señal. La presencia de la proteína GOLPH-2 en la muestra a analizar, se detecta y cuantifica, en caso de que exista, midiendo la señal generada. La cantidad de proteína GOLPH-2 presente en la muestra analizar es proporcional a esa señal.The preferred immunoassay in the method of the invention is a double antibody sandwich ELISA assay ( DAS-ELISA ). In this immunoassay any antibody or combination of antibodies, specific against one or more epitopes of the GOLPH-2 protein can be used. As an example of one of the many possible formats of this assay, an antibody, monoclonal or polyclonal, or a fragment of this antibody, or a combination of antibodies, which cover a solid phase, are contacted with the sample to be analyzed, and they are incubated for a time and under appropriate conditions to form the antigen-antibody complexes. After washing under appropriate conditions to remove non-specific complexes, an indicator reagent, comprising a monoclonal or polyclonal antibody, or a fragment of this antibody, or a fragment of this antibody, is incubated with the antigen-antibody complexes. combination of these antibodies, bound to a compound generating a signal. The presence of the GOLPH-2 protein in the sample to be analyzed is detected and quantified, if it exists, by measuring the generated signal. The amount of GOLPH-2 protein present in the test sample is proportional to that signal.
En el caso de que se pretenda detectar el mRNA o el cDNA correspondiente al gen golph-2, y no la proteína, el método de la invención para detectar in vitro el carcinoma posee etapas diferentes. Así, una vez obtenida la muestra y extraído el RNA total, según el método de la invención se realiza la detección del mRNA o del correspondiente cDNA del gen golph-2, que comprende una primera etapa de amplificación del extracto de RNA total o del correspondiente cDNA sintetizado por transcripción inversa del mRNA, y una segunda etapa de cuantificación del producto de la amplificación del mRNA o del cDNA del gen golph-2.In the case that it is intended to detect the mRNA or cDNA corresponding to the golph-2 gene, and not the protein, the method of the invention for detecting carcinoma in vitro has different stages. Thus, once the sample is obtained and the total RNA is extracted, according to the method of the invention, the detection of the mRNA or the corresponding cDNA of the golph-2 gene is performed, which comprises a first stage of amplification of the total RNA extract or of the corresponding cDNA synthesized by reverse transcription of the mRNA, and a second stage of quantification of the amplification product of the mRNA or the cDNA of the golph-2 gene.
Un ejemplo de amplificación del mRNA, consiste en retrotranscribir el mRNA en cDNA (RT), seguido de la Reacción en Cadena de la polimerasa (PCR), usando oligonucleótidos cebadores, siendo las secuencias de los cebadores utilizados 5'-TTCCCAGTAAGGCTCTCTAAG-3' (SEQ ID NO 1) y 5'-CCAGCTAGATGCTCTGTAACT-3' (SEQ ID NO 2); la PCR es una técnica de amplificación de una determinada secuencia nucleotídica (diana) contenida en una mezcla de secuencias nucleotídicas. En la PCR, se utiliza un exceso de una pareja de oligonucleótidos cebadores, que hibridan con las hebras complementarias de la secuencia nucleotídica diana. A continuación, una enzima con actividad polimerasa (DNA Taq Polimerasa) extiende cada cebador, utilizando como molde la secuencia nucleotídica diana. Los productos de la extensión se convierten entonces en secuencias dianas, tras la disociación de la hebra diana original. Nuevas moléculas de cebador hibridan y la polimerasa las extiende; el ciclo se repite para aumentar exponencialmente el número de secuencias diana. Esta técnica está descrita en las patentes US 4683195 y US 4683202. Se han descrito previamente muchos métodos para detectar y cuantificar los productos de la amplificación por PCR, de los que cualquiera puede ser usado en esta invención. En un método preferido de la invención, el producto amplificado se detecta por electroforesis en gel de agarosa, de la manera siguiente: cinco microlitros del producto de la amplificación se someten a una separación por electroforesis en un gel de agarosa a una concentración del 2%, en un tampón TBE 0,5x a 100 vdc, durante una hora. Tras la electroforesis, el gel se tiñe con bromuro de etidio y el producto de la amplificación se visualiza al iluminar el gel con luz ultravioleta (uv); como alternativa a la tinción, y realización preferida, se puede transferir el producto amplificado a una membrana de nailon por técnicas de Southern blotting o transferencia Southern, para ser detectado con una sonda específica del cDNA del gen golph-2, convenientemente marcada.An example of mRNA amplification is to retrotranscribe the mRNA into cDNA (RT), followed by the Polymerase Chain Reaction (PCR), using oligonucleotide primers, with the sequences of the primers used being 5'-TTCCCAGTAAGGCTCTCTAAG-3 '( SEQ ID NO 1) and 5'-CCAGCTAGATGCTCTGTAACT-3 '(SEQ ID NO 2); PCR is an amplification technique of a certain nucleotide sequence (target) contained in a mixture of nucleotide sequences. In the PCR, an excess of a pair of oligonucleotide primers is used, which hybridize with the complementary strands of the target nucleotide sequence. Next, an enzyme with polymerase activity (DNA Taq Polymerase) extends each primer, using the target nucleotide sequence as a template. The products of the extension are then converted into target sequences, after dissociation of the original target strand. New primer molecules hybridize and polymerase extends them; The cycle is repeated to exponentially increase the number of target sequences. This technique is described in US patents 4683195 and US 4683202. Many methods have been previously described for detecting and quantifying the products of PCR amplification, of which anyone can be used in this invention. In a preferred method of the invention, the amplified product is detected by agarose gel electrophoresis, as follows: five microliters of the amplification product is subjected to electrophoresis separation in an agarose gel at a concentration of 2% , in a 0.5x TBE buffer at 100 vdc, for one hour. After electrophoresis, the gel is stained with ethidium bromide and the amplification product is visualized by illuminating the gel with ultraviolet (uv) light; as an alternative to staining, and preferred embodiment, it can transmit the amplified nylon membrane by Southern blotting techniques or Southern blot product to be detected with a probe specific for cDNA golph-2, appropriately labeled gene.
En otro ejemplo la detección del mRNA se realiza transfiriendo el mRNA a una membrana de nailon, mediante técnicas de transferencia como por ejemplo Northern-blot o transferencia Northern, y detectándolo con sondas específicas del mRNA o del correspondiente cDNA del gen golph-2.In another example the mRNA detection is performed transferring the mRNA to a nylon membrane, using techniques transfer such as Northern blot or Northern transfer, and detecting it with specific probes of the mRNA or the corresponding cDNA of the gene golph-2.
En una realización particular la amplificación y cuantificación del mRNA correspondiente al gen golph-2 se realiza a la vez mediante RT-PCR cuantitativa a tiempo real (Q-PCR).In a particular embodiment the amplification and quantification of the mRNA corresponding to the gene golph-2 is done at once by Real-time quantitative RT-PCR (Q-PCR).
El paso final del método de la invención para detectar in vitro un carcinoma, en una muestra procedente de un individuo, comprende comparar la cantidad de proteína GOLPH- 2, la cantidad de mRNA del gen golph-2 o la cantidad del correspondiente cDNA, detectada en una muestra de un individuo, con la cantidad de proteína GOLPH-2, la cantidad de mRNA del gen golph-2 o la cantidad del correspondiente cDNA, detectada en las muestras de sujetos control o en muestras anteriores no tumorales del mismo individuo, o con los valores normales de referencia.The final step of the method of the invention to detect in vitro a carcinoma, in a sample from an individual, comprises comparing the amount of GOLPH-2 protein, the amount of the mRNA of the golph-2 gene or the amount of the corresponding cDNA, detected. in a sample of an individual, with the amount of GOLPH-2 protein, the amount of the mRNA of the golph-2 gene or the amount of the corresponding cDNA, detected in the samples of control subjects or in previous non-tumor samples of the same individual, or with normal reference values.
En su segundo objeto, la invención también proporciona un método in vitro para identificar y evaluar la eficacia de agentes para terapia del cáncer de páncreas, en especial del adenocarcinoma ductal de páncreas que comprende:In its second object, the invention also provides an in vitro method for identifying and evaluating the efficacy of agents for pancreatic cancer therapy, especially ductal pancreatic adenocarcinoma comprising:
a) poner en contacto un cultivo de células tumorales, con el compuesto candidato, en las condiciones y durante el tiempo apropiados para permitir que interaccionen,a) contact a cell culture tumor, with the candidate compound, under the conditions and during the appropriate time to allow them to interact,
b) detectar y cuantificar los niveles de expresión del gen golph-2 o la proteína GOLPH-2, yb) detect and quantify the levels of expression of the golph-2 gene or protein GOLPH-2, and
c) comparar dichos niveles de expresión con los de cultivos control de células tumorales sin tratar con el compuesto candidato.c) compare these expression levels with the of control cultures of untreated tumor cells with the candidate compound.
La cuantificación de los niveles de expresión del gen golph-2 o la proteína GOLPH-2 se realizan de modo semejante a como se indica en el método de la invención para detectar in vitro la presencia de un carcinoma en un individuo.The quantification of the expression levels of the golph-2 gene or the GOLPH-2 protein is performed in a manner similar to that indicated in the method of the invention to detect in vitro the presence of a carcinoma in an individual.
Cuando un agente disminuye los niveles de expresión del gen golph-2 o revierte los efectos de la expresión elevada de dicho gen, preferiblemente disminuyendo los niveles de proliferación celular, este agente se convierte en candidato para la terapia del cáncer de páncreas, en especial del adenocarcinoma ductal de páncreas.When an agent lowers the levels of expression of the golph-2 gene or reverse the effects of high expression of said gene, preferably decreasing the cell proliferation levels, this agent becomes candidate for pancreatic cancer therapy, especially the ductal adenocarcinoma of the pancreas.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso de secuencias nucleotídicas o peptídicas derivadas del gen golph-2, en métodos de búsqueda, identificación, desarrollo y evaluación de la eficacia de compuestos para terapia del cáncer de páncreas, en especial del adenocarcinoma ductal de páncreas. Dentro de los métodos de búsqueda, resalta la importancia adquirida últimamente por los métodos de screening de fármacos, basados en el binding, competitivo o no, de la molécula potencial fármaco a la diana terapéutica.Another aspect of the invention relates to the use of nucleotide or peptide sequences derived from the gene golph-2, in search methods, identification, development and evaluation of the efficacy of compounds for therapy of pancreatic cancer, especially ductal adenocarcinoma of pancreas. Within the search methods, it highlights the importance lately acquired by drug screening methods, based on the binding, competitive or not, of the potential molecule drug to the therapeutic target.
Otro objeto adicional de la invención se refiere al uso de secuencias nucleotídicas o peptídicas derivadas del gen golph-2 para detectar la presencia del cáncer de páncreas, en especial del adenocarcinoma ductal de páncreas, para determinar el estadio o la severidad de dicho cáncer en el individuo, o para monitorizar el efecto de la terapia administrada a un individuo que presente dicho cáncer.Another additional object of the invention relates to to the use of nucleotide or peptide sequences derived from the gene golph-2 to detect the presence of cancer pancreas, especially ductal pancreatic adenocarcinoma, for determine the stage or severity of said cancer in the individual, or to monitor the effect of therapy administered to an individual who has said cancer.
Otro objeto de la invención consiste en proporcionar agentes caracterizados porque inhiben la expresión y/o la actividad de la proteína GOLPH-2. Estos agentes, que se pueden identificar y evaluar según la presente invención, pueden ser seleccionados del grupo formado por:Another object of the invention consists in provide agents characterized in that they inhibit expression and / or GOLPH-2 protein activity. These agents, which can be identified and evaluated according to the present invention, They can be selected from the group formed by:
a) un anticuerpo, o combinación de anticuerpos, específicos contra uno o más epítopos presentes en la proteína GOLPH-2, preferiblemente un anticuerpo monoclonal humano o humanizado; pudiendo ser también un fragmento del anticuerpo, un anticuerpo de cadena sencilla o un anticuerpo anti-idiotipo,a) an antibody, or combination of antibodies, specific against one or more epitopes present in the protein GOLPH-2, preferably a monoclonal antibody human or humanized; can also be a fragment of antibody, a single chain antibody or an antibody anti-idiotype,
b) agentes citotóxicos, tales como toxinas, moléculas con átomos radiactivos, o agentes quimio-terapéuticos, entre los que se incluyen, sin limitación, pequeñas moléculas orgánicas e inorgánicas, péptidos, fosfopéptidos, moléculas antisentido, ribozimas, siRNAs, moléculas de triple hélice, etc., que inhiben la expresión y/o la actividad de la Proteína GOLPH-2, yb) cytotoxic agents, such as toxins, molecules with radioactive atoms, or agents chemo-therapeutic, including, without limitation, small organic and inorganic molecules, peptides, phosphopeptides, antisense molecules, ribozymes, siRNAs, molecules triple helix, etc., which inhibit the expression and / or activity of GOLPH-2 Protein, and
c) compuestos antagonistas de la Proteína GOLPH-2, que inhiben una o más de las funciones de la Proteína GOLPH-2.c) Protein antagonist compounds GOLPH-2, which inhibit one or more of the functions of GOLPH-2 Protein.
Por último, constituye también un objeto de la presente invención una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o varios agentes de los mencionados anteriormente junto con uno o más excipientes y/o sustancias transportadoras. Además dicha composición puede contener cualquier otro ingrediente activo que inhiba la función de la proteína GOLPH-2.Finally, it is also an object of the present invention a pharmaceutical composition comprising a therapeutically effective amount of one or more agents of the mentioned above together with one or more excipients and / or transport substances. In addition said composition may contain any other active ingredient that inhibits the function of the GOLPH-2 protein.
Los excipientes, sustancias transportadoras y sustancias auxiliares tienen que ser farmacéuticamente y farmacológicamente tolerables, de modo que puedan ser combinados con otros componentes de la formulación o preparación y no ejerzan efectos adversos en el organismo tratado. Las composiciones farmacéuticas o formulaciones incluyen aquellas que son adecuadas para la administración oral o parenteral (incluyendo subcutánea, intradérmica, intramuscular e intravenosa), aunque la mejor vía de administración depende del estado del paciente. Las formulaciones pueden ser en forma de dosis sencillas. Las formulaciones se preparan de acuerdo con métodos conocidos en el campo de la farmacología. Las cantidades de sustancias activas para administrarse pueden variar en función de las particularidades de la terapia.Excipients, transport substances and auxiliary substances have to be pharmaceutically and pharmacologically tolerable, so that they can be combined with other components of the formulation or preparation and do not exert adverse effects on the treated organism. The compositions Pharmaceuticals or formulations include those that are suitable for oral or parenteral administration (including subcutaneous, intradermal, intramuscular and intravenous), although the best route of Administration depends on the patient's condition. Formulations They can be in the form of single doses. The formulations are prepared according to known methods in the field of pharmacology. The quantities of active substances for administered may vary depending on the particularities of the therapy.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención.The following examples illustrate the invention.
Microarrays. Se utilizaron los microarrays GeneChip Test 3 (Affymetrix, Santa Clara), que permiten testar la calidad del RNA, previamente al análisis de expresión con el array GeneChip Human Genome U133A (Affymetrix, Santa Clara), que representa 13.220 secuencias completas de genes anotados; el gen golph-2 está representado en el microarray por el set de sondas 217771_at de Affymetrix, que son oligonucleótidos sentido de 25 nucleótidos de longitud, diseñados en base a la secuencia Hs.182793 de Unigene, o AF236056 de GeneBank (Tabla 1). Microarrays The GeneChip Test 3 microarrays (Affymetrix, Santa Clara) were used, which allow to test the quality of the RNA, prior to the expression analysis with the GeneChip Human Genome U133A array (Affymetrix, Santa Clara), which represents 13,220 complete sequences of annotated genes; The golph-2 gene is represented in the microarray by the set of probes 217771_at of Affymetrix, which are sense oligonucleotides of 25 nucleotides in length, designed based on the sequence Hs. 182793 of Unigene, or AF236056 of GeneBank (Table 1).
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Muestras. Las muestras estudiadas procedían de biopsias clasificadas clínicamente, obtenidas por resección quirúrgica: Biopsias control de tejido pancreático no tumoral, procedentes de individuos que presentaban adenocarcinoma ductal de páncreas ("no tumoral") (n = 1); biopsias de tejido pancreático no tumoral, pero inflamado, procedentes de individuos sin adenocarcinoma ductal de páncreas, pero con pancreatitis crónica ("pancreatitis crónica") (n = 1); biopsias de tejido pancreático no tumoral, pero inflamado procedentes de individuos que presentaban adenocarcinoma ductal de páncreas, y pancreatitis ("pancreatitis") (n = 1); biopsias de tejido pancreático tumoral, procedentes de pacientes que presentaban adenocarcinoma ductal de páncreas (n = 10) en uno de los siguientes estadios: Estadio I, tumor limitado al páncreas, estadio III, tumor extendido a ganglios linfáticos regionales y estadio IVB, existe metástasis en tejidos u órganos distantes. Todas las muestras fueron clasificadas clínica e histológicamente (grado y estadio) en el Hospital Central de Asturias, el mismo hospital donde las muestras habían sido recogidas siguiendo los preceptos de la declaración de Helsinki. Las muestras se congelaron en nitrógeno líquido inmediatamente tras su extracción y se mantuvieron a -80ºC hasta el momento de su análisis. Samples The samples studied came from clinically classified biopsies, obtained by surgical resection: Control biopsies of non-tumor pancreatic tissue, from individuals presenting with ductal adenocarcinoma of the pancreas ("non-tumor") (n = 1); biopsies of non-tumor but inflamed pancreatic tissue, from individuals without pancreatic ductal adenocarcinoma, but with chronic pancreatitis ("chronic pancreatitis") (n = 1); biopsies of non-tumor, but inflamed, pancreatic tissue from individuals presenting with pancreatic ductal adenocarcinoma, and pancreatitis ("pancreatitis") (n = 1); Tumor pancreatic tissue biopsies, from patients presenting with ductal adenocarcinoma of the pancreas (n = 10) in one of the following stages: Stage I, tumor limited to the pancreas, stage III, tumor extended to regional lymph nodes and stage IVB, there is metastasis in distant tissues or organs. All samples were classified clinically and histologically (grade and stage) at the Central Hospital of Asturias, the same hospital where the samples had been collected following the precepts of the Helsinki declaration. The samples were frozen in liquid nitrogen immediately after extraction and kept at -80 until the time of analysis.
De cada tipo de tumor se recibieron los siguientes casos:For each type of tumor the following cases:
- - Tumor estadio I:- Stadium tumor I:
- 7 muestras7 samples
- - Tumor estadio III:- Stadium tumor III:
- 1 muestra1 sample
- - Tumor estadio IV:- Stadium tumor IV:
- 2 muestras2 samples
El análisis se llevó a cabo con RNA total procedente de sujetos individuales. Las 13 muestras que fueron analizadas se describen en la Tabla 2.The analysis was carried out with total RNA from individual subjects. The 13 samples that were analyzed are described in Table 2.
El RNA total de cada una de las biopsias se obtuvo homogenizando el tejido en TRlzol® Reagent (Life Technologies), siguiendo las recomendaciones del proveedor. El RNA total resultante se limpió con el kit Rneasy (QIAGEN) (Chomczynski P. et al., Anal. Biochem., 1987, 162: 156; Chomczynski P., Biotechniques, 1993, 15: 532). De cada preparación de RNA total se usaron 10 \mug como material de partida para la síntesis de la primera hebra de cDNA con la enzima transcriptasa inversa SuperScript^{TM} II RNase (Life Technologies), usando como cebador un oligonucleótido oligo-dT que contenía la secuencia del promotor de la RNA polimerasa del fago T7. La segunda hebra de cDNA se sintetizó utilizando los enzimas DNA polimerasa I de E. coli (Invitrogen Life Technologies), DNA ligasa de E. coli (Invitrogen Life Technologies), Rnasa H de E. coli (Invitrogen Life Technologies), y DNA polimerasa del fago T4 (Invitrogen Life Technologies). El cRNA marcado con biotina se sintetizó usando el kit ENZO BioArray^{TM} HighYield^{TM} Transcript Labeling Kit (Enzo Diagnostics Inc). Después de la transcripción in vitro, se eliminaron los nucleótidos no incorporados usando las columnas Rneasy (QIAGEN).The total RNA of each of the biopsies was obtained by homogenizing the tissue in TRlzol® Reagent (Life Technologies), following the recommendations of the provider. The resulting total RNA was cleaned with the Rneasy kit (QIAGEN) (Chomczynski P. et al ., Anal. Biochem., 1987, 162: 156; Chomczynski P., Biotechniques, 1993, 15: 532). From each total RNA preparation, 10 µg was used as a starting material for the synthesis of the first strand of cDNA with the enzyme reverse transcriptase SuperScript ™ II RNase (Life Technologies), using as an primer an oligo-dT oligonucleotide which It contained the T7 phage RNA polymerase promoter sequence. The second strand of cDNA was synthesized using E. coli DNA polymerase I enzymes (Invitrogen Life Technologies), E. coli DNA ligase (Invitrogen Life Technologies), E. coli Rnasa H (Invitrogen Life Technologies), and DNA polymerase of phage T4 (Invitrogen Life Technologies). The biotin-labeled cRNA was synthesized using the ENZO BioArray? HighYield? Transcript Labeling Kit (Enzo Diagnostics Inc). After in vitro transcription, unincorporated nucleotides were removed using the Rneasy columns (QIAGEN).
Se fragmentaron 15 \mug de cada cRNA biotinilado a 94ºC durante 35 minutos en una solución tampón que contenía 40 mM Tris-Acetato (pH 8.1), 100 mM KOAc y 30 mM MgOAc. El cRNA fragmentado se mezcló con buffer de hibridación (100 mM MES, 1M NaCl, 20 mM EDTA, 0.01% Tween 20) y se calentó a 99º durante 5 minutos y posteriormente a 45º durante 5 minutos, para a continuación ser cargado en el array de Affymetrix. El primer array en el que se realizó la hibridación fue el Test 3 de Affymetrix. Este array permite testar la calidad del RNA previo al análisis de expresión en el Affymetrix® GeneChip® Human Genome 133 A (HG-U133A).15 µg of each biotinylated cRNA was fragmented at 94 ° C for 35 minutes in a buffer solution containing 40 mM Tris-Acetate (pH 8.1), 100 mM KOAc and 30 mM MgOAc. The fragmented cRNA was mixed with hybridization buffer (100 mM MONTH, 1M NaCl, 20 mM EDTA, 0.01% Tween 20) and heated at 99 ° for 5 minutes and then at 45 ° for 5 minutes, to then be loaded into the array from Affymetrix. The first array in which hybridization was performed was Affymetrix Test 3. This array allows testing RNA quality prior to expression analysis in the Affymetrix® GeneChip® Human Genome 133 A (HG-U133A).
Para la hibridación, los arrays se incubaron en un horno rotatorio a 45º durante 16 horas y con una rotación constante de 60 rpm.For hybridization, arrays were incubated in a 45º rotary kiln for 16 hours and with a rotation 60 rpm constant.
El lavado y tinción de cada array se [levó a cabo en la Estación de Fluidos de Affymetrix®. Se usó un programa de lavado y tinción que incluía:The washing and staining of each array was [increased to out at the Affymetrix® Fluid Station. A program was used washing and staining that included:
- 10x2 ciclos de lavado con SSPE-T 6x (0.9 m NaCl, 60 mM NaH_{2}PO4, 6 mM EDTA, 0.01% Tween 20) a 25º,- 10x2 wash cycles with 6x SSPE-T (0.9 m NaCl, 60 mM NaH2PO4, 6 mM EDTA, 0.01% Tween 20) at 25 °,
- 4x15 ciclos con 0.1 mM MES, 0.1M NaCl, 0.01% Tween 20 a 50º,- 4x15 cycles with 0.1 mM MONTH, 0.1M NaCl, 0.01% Tween 20 to 50º,
- Tinción del cRNA biotinilado con un conjugado estreptavidina-ficoeritrina (10 \mug/mlMolecular Probes)- Staining of biotinylated cRNA with a conjugate Streptavidin-phycoerythrin (10 µg / ml Molecular Probes)
- 10x4 ciclos de lavado con SSPE-T a 25º- 10x4 wash cycles with SSPE-T at 25º
- Tinción con un anticuerpo anti-estreptavidina durante 10 minutos- Staining with an antibody anti-streptavidin for 10 minutes
- Tinción un conjugado estreptavidina-ficoeritrina (1 mg/ml, Molecular Probes) durante 10 minutos- Staining a conjugate Streptavidin-phycoerythrin (1 mg / ml, Molecular Probes) for 10 minutes
- 15x4 ciclos de lavado con SSPE-T a 30º- 15x4 wash cycles with SSPE-T at 30º
Los arrays se escanearon a 560 nm usando un microscopio confocal que utiliza emisión láser (Agilent GeneArray Scanner). El análisis de las lecturas de intensidad se realizó con el software Microarray Suite 5.0. Para la comparación de arrays, éstos fueron escalados a una intensidad total de 100.The arrays were scanned at 560 nm using a confocal microscope that uses laser emission (Agilent GeneArray Scanner) The analysis of the intensity readings was performed with Microarray Suite 5.0 software. For the comparison of arrays, these were scaled to a total intensity of 100.
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El análisis diferencial de la expresión del gen golph-2 en los estadios tumorales con respecto a los controles no tumorales, se realizó a partir de los datos de comparación de arrays obtenidos utilizando el software de Affymetrix. Los parámetros que se tuvieron en cuenta (en el orden en el que aparecen en la lista) fueron: i) Detección. Indica si el transcrito está Presente (P), Ausente (A) o Marginal (M), ii) Cambio: Indica si la expresión de un determinado transcrito Aumenta (I), Decrece (D), No Cambia (NC), Aumenta Marginalmente (MI), o Decrece Marginalmente (MD), iii) Signal Loq Ratio (SLR): Indica el nivel de cambio de expresión entre la línea base (control) y una muestra problema. Este cambio se expresa como el log_{2} del ratio (fold change o número de veces que la expresión del gen está elevada o reprimida en la muestra problema-tumoral frente a la muestra control-sana). Se considera significativo un valor de SLR de 1 (equivalente a un fold change de 2), para transcritos cuya expresión aumenta frente al control y de -1, para transcritos cuya expresión disminuye frente al control.Differential analysis of the expression of the golph-2 gene in tumor stages with respect to non-tumor controls was performed based on comparison data of arrays obtained using Affymetrix software. The parameters that were taken into account (in the order in which they appear in the list) were: i) Detection . Indicates whether the transcript is Present (P), Absent (A) or Marginal (M), ii) Change : Indicates whether the expression of a given transcript Increases (I), Decreases (D), Does not Change (NC), Increases Marginally (MI), or Marginally Decrease (MD), iii) Signal Loq Ratio (SLR): Indicates the level of expression change between the baseline (control) and a problem sample. This change is expressed as the log_ {2} of the ratio ( fold change or number of times the gene expression is elevated or repressed in the problem-tumor sample versus the control-healthy sample). An SLR value of 1 (equivalent to a fold change of 2) is considered significant, for transcripts whose expression increases against the control and -1, for transcripts whose expression decreases against the control.
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(Tabla pasa a página siguiente)(Table goes to page next)
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El análisis diferencial de la expresión del gen golph-2 en los estadios tumorales con respecto al control no tumoral (PA36), demostró que los niveles de expresión del gen golph-2 estaban incrementados en todas las biopsias de tumores de páncreas analizados, dándose los incrementos mayores en las biopsias de adenocarcinomas ductales de estadio III y IV, con incrementos incluso superiores a las 8 veces (SLR>3), lo que indica un cierto grado de correlación entre el estadio de la enfermedad y el nivel de expresión del gen (Tabla 3). Por otro lado, el análisis de expresión diferencial del gen golph-2 frente al control con pancreatitis crónica (PA46), demostró que los niveles de expresión del gen golph-2 estaban elevados más de 16 veces (SLR>4) en todas las biopsias de tumores de páncreas analizados, dándose los incrementos mayores en las biopsias de adenocarcinomas ductales de estadio III y IV, con incrementos superiores a las 64 veces (SLR>6) en todas las muestras, lo que indica un cierto grado de correlación entre el estadio de la enfermedad y el nivel de expresión del gen (Tabla 4).Differential analysis of gene expression golph-2 in tumor stages with respect to non-tumor control (PA36), showed that the expression levels of golph-2 gene were increased in all biopsies of pancreas tumors analyzed, with increases older in stage III ductal adenocarcinomas biopsies and IV, with increases even greater than 8 times (SLR> 3), which indicates a certain degree of correlation between the stage of the disease and level of gene expression (Table 3). For another side, differential gene expression analysis golph-2 versus control with chronic pancreatitis (PA46), demonstrated that gene expression levels golph-2 were elevated more than 16 times (SLR> 4) in all biopsies of pancreas tumors analyzed, giving the greatest increases in biopsies of ductal adenocarcinomas of stage III and IV, with increases greater than 64 times (SLR> 6) in all samples, indicating a certain degree of correlation between the stage of the disease and the level of gene expression (Table 4).
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Estos resultados demostraron que la expresión del gen golph-2 estaba incrementada en todas las biopsias de tumores de páncreas analizados, tanto frente a biopsias de tejido no tumoral, como frente a biopsias de pancreatitis; los incrementos mayores se producían en las biopsias de adenocarcinomas ductales de estadio III y IV, lo que indica un cierto grado de correlación entre el estadio de la enfermedad y el nivel de expresión del gen.These results showed that the expression of the golph-2 gene was increased in all Biopsies of pancreas tumors analyzed, both against biopsies of non-tumor tissue, as against pancreatitis biopsies; the major increases occurred in adenocarcinomas biopsies stage III and IV ductals, indicating a certain degree of correlation between the stage of the disease and the level of gene expression
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El método empleado consiste en la transcripción inversa del mRNA a cDNA y su posterior amplificación en un equipo LightCycler (Roche), utilizando SYBR Green para la detección del producto amplificado. La cuantificación se realiza en tiempo real y permite calcular la expresión relativa de la secuencia en diferentes muestras en la fase de amplificación lineal de la reacción.The method used consists of the reverse transcription of the mRNA to cDNA and its subsequent amplification in a LightCycler device (Roche ), using SYBR Green for the detection of the amplified product. The quantification is performed in real time and allows the relative expression of the sequence to be calculated in different samples in the linear amplification phase of the reaction.
Muestras. Las muestras estudiadas procedían de biopsias tipadas clínicamente, obtenidas por resección quirúgica: Biopsias de tejido pancreático no tumoral, procedentes de individuos que presentaban adenocarcinoma ductal de páncreas ("no tumoral") (n = 1); biopsias de tejido pancreático no tumoral, pero inflamado, procedentes de individuos control sin adenocarcinoma ductal de páncreas, pero con pancreatitis crónica ("pancreatitis crónica") (n = 1); biopsias de tejido pancreático tumoral, procedentes de individuos que presentaban adenocarcinoma ductal de páncreas (n = 5) en uno de los siguientes estadios: Estadio I, tumor limitado al páncreas y estadio IVB, existe metástasis en tejidos u órganos distantes. Todas las muestras fueron clasificadas clínica e histológicamente (grado y estadio) en el Hospital Central de Asturias, el mismo hospital donde las muestras habían sido recogidas siguiendo los preceptos de la declaración de Helsinki. Las muestras se congelaron en nitrógeno líquido inmediatamente tras su extracción y se mantuvieron a -80ºC hasta el momento de su análisis. Samples The samples studied came from clinically typed biopsies, obtained by surgical resection: Biopsies of non-tumor pancreatic tissue, from individuals presenting with ductal adenocarcinoma of the pancreas ("non-tumor") (n = 1); biopsies of non-tumor, but inflamed, pancreatic tissue, from control individuals without pancreatic ductal adenocarcinoma, but with chronic pancreatitis ("chronic pancreatitis") (n = 1); Tumor pancreatic tissue biopsies, from individuals presenting with ductal adenocarcinoma of the pancreas (n = 5) in one of the following stages: Stage I, tumor limited to the pancreas and stage IVB, there is metastasis in distant tissues or organs. All samples were classified clinically and histologically (grade and stage) at the Central Hospital of Asturias, the same hospital where the samples had been collected following the precepts of the Helsinki declaration. The samples were frozen in liquid nitrogen immediately after extraction and kept at -80 until the time of analysis.
RT-PCR Cuantitativa en Tiempo Real. El análisis se llevó a cabo con RNA total procedente de sujetos individuales. Las 7 muestras que fueron analizadas se describen en la Tabla 5. Quantitative RT-PCR in Real Time . The analysis was carried out with total RNA from individual subjects. The 7 samples that were analyzed are described in Table 5.
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El RNA total de cada una de las biopsias se obtuvo homogenizando el tejido en TRizol® Reagent (Life Technologies), siguiendo las recomendaciones del proveedor. El RNA total resultante se limpió con el kit Rneasy (QIAGEN) (Chomczynski P. et al., Anal. Biochem., 1987, 162: 156; Chomczynski P., Biotechniques, 1993, 15: 532). El RNA se cuantificó espectrofotométricamente y se digirieron 5 \mug de RNA total con DNasal. Se utilizó 1 \mug de RNA tratado con DNAsa como material de partida para la síntesis de la primera hebra de cDNA con la enzima transcriptasa inversa SuperScript^{TM} II RNase (Life Technologies), usando como cebador un oligonucleótido oligo-dT que contenía la secuencia del promotor de la RNA polimerasa del fago T7. Se prepararon alícuotas del cDNA diluido a la concentración de trabajo.The total RNA of each of the biopsies was obtained by homogenizing the tissue in TRizol® Reagent (Life Technologies), following the recommendations of the provider. The resulting total RNA was cleaned with the Rneasy kit (QIAGEN) (Chomczynski P. et al ., Anal. Biochem., 1987, 162: 156; Chomczynski P., Biotechniques, 1993, 15: 532). RNA was quantified spectrophotometrically and 5 µg of total RNA was digested with DNasal. 1 µg of DNAse-treated RNA was used as the starting material for the synthesis of the first strand of cDNA with the enzyme reverse transcriptase SuperScript ™ II RNase (Life Technologies), using as an primer an oligo-dT oligonucleotide containing the p7 phage RNA polymerase promoter sequence. Aliquots of the diluted cDNA were prepared at the working concentration.
El cDNA sintetizado se amplificó utilizando
cebadores específicos del gen humano golph-2
(5'-TTCCCAG
TAAGGCTCTCTAAG-3'
-SEQ ID NO 1- y 5'-CCAGCTAGATGCTCT
GTAACT-3' -SEQ ID NO 2-), y cebadores específicos
del gen que codifica la proteína ribosomal LI 0 humana
(5'-TGCGATGGCTGCACACA-3' -SEQ ID NO
13- y 5'-TCCCTTAG
AGCAACCCATACAAC-3' -SEQ ID NO 14-). Las reacciones
de PCR en tiempo real se prepararon utilizando el kit
LightCycler-FastStart DNA master SYBR Green 1 kit
(Roche), siguiendo las instrucciones del fabricante. El
programa de amplificación consistía en 1 ciclo de 95ºC durante 10
min ("hot start") seguido de 45 ciclos de 95ºC
(desnaturalización) durante 10 seg, 60ºC (anillamiento) durante 5
seg, 72ºC (amplificación y adquisición de fluorescencia) durante 10
seg. El programa de análisis de curvas de desnaturalización
consistía en un ciclo de un pulso de 95ºC, 65ºC durante 15 seg, y un
pulso de 95ºC durante el paso de amplificación y adquisición.The synthesized cDNA was amplified using specific primers of the human golph-2 gene (5'-TTCCCAG
TAAGGCTCTCTAAG-3 '-SEQ ID NO 1- and 5'-CCAGCTAGATGCTCT GTAACT-3' -SEQ ID NO 2-), and gene-specific primers encoding human LI 0 ribosomal protein (5'-TGCGATGGCTGCACACA-3 '-SEQ ID NO 13- and 5'-TCCCTTAG AGCAACCCATACAAC-3 '-SEQ ID NO 14-). Real-time PCR reactions were prepared using the LightCycler-FastStart DNA master SYBR Green 1 kit (Roche ), following the manufacturer's instructions. The amplification program consisted of 1 cycle of 95 ° C for 10 min ("hot start") followed by 45 cycles of 95 ° C (denaturation) for 10 sec, 60 ° C (banding) for 5 sec, 72 ° C (amplification and fluorescence acquisition) for 10 sec. The denaturation curve analysis program consisted of a pulse cycle of 95 ° C, 65 ° C for 15 sec, and a pulse of 95 ° C during the amplification and acquisition step.
En primer lugar se determinó la especificidad de los productos de PCR analizando las curvas de desnaturalización. Posteriormente, como medida relativa de la expresión génica, se calculó la relación entre la abundancia de mRNAs transcritos de golph-2 y la abundancia de transcritos de ribl10 y se comparó el dato de la relación en cada una de las muestras tumorales con los valores de la muestra control. Para calcular la eficiencia de las reacciones de PCR (golph-2 y ribl10) se construyó, para cada secuencia génica, una curva patrón realizada con diluciones seriadas de cDNA. A las concentraciones de cDNA molde para las reacciones en la curva patrón se les dieron valores arbitrarios 10, 5, 2.5, 1.25 y 0.625. La eficiencia se calculó utilizando la ecuación:First, the specificity of PCR products analyzing denaturation curves. Subsequently, as a relative measure of gene expression, calculated the relationship between the abundance of mRNAs transcribed from golph-2 and the abundance of ribl10 transcripts and the relationship data in each of the samples was compared Tumor with control sample values. To calculate the efficiency of PCR reactions (golph-2 and ribl10), for each gene sequence, a standard curve was constructed performed with serial dilutions of cDNA. At the concentrations of cDNA template for reactions in the standard curve were given arbitrary values 10, 5, 2.5, 1.25 and 0.625. Efficiency is calculated using the equation:
donde E es la eficiencia de amplificación y p es la pendiente de la recta patrón.where E is the amplification efficiency and p is the slope of the standard line.
La relación de los valores de expresión génica se determinó utilizando la siguiente ecuación, que relaciona los datos experimentales de la amplificación y corrige el error originado por la diferencia de eficiencia de las reacciones de PCR:The relationship of gene expression values It was determined using the following equation, which relates the experimental amplification data and corrects the error caused by the difference in efficiency of the reactions of PCR:
donde E es la eficiencia de amplificación, Cp es el punto de corte (Crossing point), diana es golph-2, referencia es ribl10, control es la muestra control (sano o pancreatitis) y muestra es la muestra tumoral.where E is the amplification efficiency, Cp is the cut-off point , target is golph-2, reference is ribl10, control is the control sample (healthy or pancreatitis) and sample is the tumor sample.
El análisis de los productos de PCR demostró la amplificación específica de dos productos con temperaturas de desnaturalización similares a las esperadas según el software empleado para el diseño de los cebadores, Primer Express (Applied Biosystems) (Figura 1).The analysis of the PCR products demonstrated the specific amplification of two products with denaturation temperatures similar to those expected according to the software used for the design of the primers, Primer Express (Applied Biosystems ) (Figure 1).
De cada una de las 5 diluciones de cDNA se amplificaron dos réplicas y los puntos de corte (Cp) de cada una de ellas se representaron en una gráfica respecto al logaritmo de la concentración de cDNA para construir la recta patrón (Tablas 6 y 7, Figuras 2 y 3).From each of the 5 dilutions of cDNA, amplified two replicates and the cut-off points (Cp) of each of they were represented in a graph with respect to the logarithm of the cDNA concentration to build the standard line (Tables 6 and 7, Figures 2 and 3).
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Dos réplicas de cada muestra (sana y tumoral) se amplificaron con los cebadores específicos de GOLPH-2 y ribl10. A partir de los puntos de corte generados en estas amplificaciones (Tabla 8), se calcularon los cambios de expresión del gen golph-2 en las muestras tumorales respecto al control no tumoral y al control de pancreatitis aplicando la ecuación anteriormente descrita (Tabla 9).Two replicas of each sample (healthy and tumor) are amplified with the specific primers of GOLPH-2 and ribl10. From the cut points generated in these amplifications (Table 8), the expression changes of the golph-2 gene in tumor samples with respect to non-tumor control and control of pancreatitis applying the equation described above (Table 9).
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- ribl10ribl10
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- golph-2golph-2
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Los resultados demostraron que la expresión del gen golph2 estaba incrementada en todas las muestras tumorales respecto a las muestras no tumorales, con un incremento medio de 13,5 veces, y respecto a las muestras con pancreatitis, con un incremento medio de 9,5 veces.The results showed that the expression of golph2 gene was increased in all tumor samples with respect to non-tumor samples, with an average increase of 13.5 times, and with respect to samples with pancreatitis, with a average increase of 9.5 times.
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Los resultados confirmaron los datos obtenidos midiendo la diferencia de expresión génica con DNA-chips (ejemplo 1), esto es, la expresión del gen golph-2 estaba fuertemente incrementada en las muestras tumorales respecto a las muestras no tumorales y respecto a las muestras con pancreatitis; confirmando por tanto que el incremento de la expresión génica de golph2 está asociado al adenocarcinoma ductal de páncreas.The results confirmed the data obtained measuring the difference in gene expression with DNA-chips (example 1), that is, gene expression golph-2 was strongly increased in the tumor samples with respect to non-tumor samples and with respect to samples with pancreatitis; confirming therefore that the increased gene expression of golph2 is associated with ductal adenocarcinoma of the pancreas.
<110> Medplant Genetics, S.L.<110> Medplant Genetics, S.L.
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<120> Métodos para el diagnóstico in vitro y pronóstico in vitro del cáncer de páncreas y para el desarrollo de fármacos contra el cáncer de páncreas<120> Methods for diagnosing in vitro and in vitro pancreatic cancer prognosis and drug development against pancreatic cancer
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<130> 200302357<130> 200302357
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<140> ES 200302357<140> ES 200302357
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<141> 2003-10-10<141> 2003-10-10
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<160> 14<160> 14
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<170> PatentIn version 3.1<170> PatentIn version 3.1
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<210> 1<210> 1
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<211> 21<211> 21
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<212> DNA<212> DNA
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<213> Artificial<213> Artificial
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<220><220>
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<221> misc_feature<221> misc_feature
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<223> Cebador para la amplificación PCR del gen GOLPH-2<223> Primer for PCR amplification of the GOLPH-2 gene
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<400> 1<400> 1
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<211> 21<211> 21
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<212> DNA<212> DNA
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<213> Artificial<213> Artificial
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<220><220>
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<223> Cebador para la amplificación PCR del gen GOLPH-2<223> Primer for PCR amplification of the GOLPH-2 gene
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<400> 2<400> 2
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<212> DNA<212> DNA
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<213> Artificial<213> Artificial
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<220><220>
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<221> misc_feature<221> misc_feature
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<223> Sonda correspondiente al set de sondas 217771_at<223> Probe corresponding to the set of probes 217771_at
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<211> 25<211> 25
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<212> DNA<212> DNA
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<213> Artificial<213> Artificial
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<220><220>
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<221> misc_feature<221> misc_feature
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<223> Sonda correspondiente al set de sondas 217771_at<223> Probe corresponding to the set of probes 217771_at
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<211> 25<211> 25
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<212> DNA<212> DNA
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<213> Artificial<213> Artificial
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<220><220>
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<223> sonda correspondiente al set de sondas 217771_at<223> probe corresponding to the set of probes 217771_at
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<223> Cebador para la amplificación por PCR del gen de la proteína ribosomal X10<223> Primer for amplification by PCR of the X10 ribosomal protein gene
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<223> cebador para la amplificación por PCR del gen de la proteína ribosomal X10<223> primer for amplification by PCR of the X10 ribosomal protein gene
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\hfill23
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\ hfill2. 3
Claims (19)
lectina.12. Method according to claims 10 or 11 characterized in that for the quantification of the complexes formed by the antibodies and the GOLPH-2 protein, techniques selected from the group consisting of Western-blot, ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay or immunosorbent assay) are used linked to enzyme), RIA (Radioimmunoassay or Radioimmunoassay), Competitive EIA (Competitive Enzyme Immunoassay or Competitive Enzyme Immunoassay), DAS-ELISA (Double antibody Sandwich-ELISA or sandwich ELISA with Double Antibody), immunocytochemical techniques and immunohistochemical techniques the use of biochips or microarrays of proteins that include specific antibodies, tests based on colloidal gold precipitation in formats such as dipsticks ; or by affinity chromatography techniques, ligand binding assays or binding assays to
lectin
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
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Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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Publications (2)
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|---|---|---|---|
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Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| WO1999050408A1 (en) * | 1998-03-27 | 1999-10-07 | University Of Nebraska Board Of Regents | Novel gene that is amplified and overexpressed in cancer and methods of use thereof |
| US20030124128A1 (en) * | 2001-06-21 | 2003-07-03 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of breast cancer |
-
2003
- 2003-10-10 ES ES200302357A patent/ES2300156B1/en not_active Withdrawn - After Issue
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1999050408A1 (en) * | 1998-03-27 | 1999-10-07 | University Of Nebraska Board Of Regents | Novel gene that is amplified and overexpressed in cancer and methods of use thereof |
| US20030124128A1 (en) * | 2001-06-21 | 2003-07-03 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of breast cancer |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| GRÜTZMANN, R. et al. "Systematic Isolation of Genes Differentially Expressed in Normal and Cancerous Tissue of the Pancreas". Pancreatology . 2003, vol. 3, pp.: 169-178, página 169, resumen; página 171, tabla-1; página 173, tabla-2; página 176, tabla-2 (cont.). * |
| US 20030124128 A1. (LILLIE, J et al.) 03.07.2003, página 1, párrafos 7-8; página 2, párrafos 9-11,16-20; página 3, párrafos 29-32,42-60; página 4, párrafos 62-67; página 6, párrafos 98-104; página 7, párrafos 105-116; página 10, párrafo 143. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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