ES2276298T3 - Hibridos de topoisomerasa y metodos de uso. - Google Patents

Hibridos de topoisomerasa y metodos de uso. Download PDF

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Abstract

Una topoisomerasa híbrida que comprende una subunidad de unión a ADN de una topoisomerasa de tipo II procedente de una procariota Gram-negativa, y una subunidad hidrolizante de ATP de una topoisomerasa de tipo II procedente S. aureus.

Description

Híbridos de topoisomerasa y métodos de uso.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a topoisomerasas híbridas, a métodos para evaluar la actividad de topoisomerasas, y a métodos para identificar compuestos que modulan la actividad de topoisomerasas.
Antecedentes
El desarrollo continuo de resistencia a agentes antibacterianos existentes es un grave problema médico que está empeorando. A fin de mantener tratamientos eficaces para enfermedades bacterianas, es necesario desarrollar nuevos fármacos que ataquen a las bacterias a través de interacciones con nuevas proteínas diana, o con nuevas clases de compuestos que exploten los agentes quimioterapéuticos validados (Sefton, 2002, Drugs, 62:557-566).
Las topoisomerasas de tipo II procariotas (bacterianas) son enzimas que modifican el estado topológico de un ADN circular cerrado bicatenario, a costa de la hidrólisis del trifosfato de adenosina (ATP). La ADN girasa (girasa) y la topoisomerasa IV (topoIV) son ambas topisomerasas de tipo II bacterianas. Estas enzimas son tetrámeras, compuestas de dos monómeros distintos, cada uno por duplicado. La girasa está compuesta de las proteínas GyrA y GyrB; la topo IV está compuesta de las proteínas ParC y ParE. Para el organismo Staphyloccocus aureus (S. aureus), la proteína ParC se conoce de forma intercambiable como ParC o GrlA, y la proteína ParE se conoce de forma intercambiable como ParE o GrlB. Además, GyrA y ParC son homólogas, como lo son GyrB y ParE. Es bien sabido que GyrA y ParC interaccionan con ADN, mientras que GyrB y ParE contienen la función de hidrólisis de ATP de la enzima. De este modo, GyrA y ParC se conocen como subunidades de unión (y de escisión) de ADN de topoisomerasas de tipo II, y GyrB y ParE se conocen como subunidades hidrolizantes de ATP de las topoisomerasas de tipo II. Se han publicado varias revisiones de estas enzimas (véase, por ejemplo: Champoux, 2001, Annu. Rev. Biochem., 70:369-413; Reece y Maxwell, 1991, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol., 26:335-375).
Los antibióticos quinolónicos son fármacos medica y comercialmente importantes, que inhiben la girasa y/o la topo IV. Se sabe que estos fármacos se unen específicamente a la subunidad de GyrA o ParC de la enzima, alejada del sitio de unión a ATP de la enzima. También se conocen los agentes que modulan la función hidrolizante de ATP de topoisomerasas de tipo II, e incluyen la familia de ciclotialidinas así como también la cumarinas (novobiocina, clorobiocina, cumermicina A_{1}). Estos productos naturales son potentes inhibidores de la actividad de ATPasa de girasa, y se ha demostrado que se unen dentro de y adyacentes al bolsillo de unión a ATP de la enzima (Lewis et al., 1996, EMBO J., 15:1412-1420). Además, la novobiocina se ha aplicado clínicamente como un agente antibacteriano, aunque con alcance limitado. Las propiedades físicas y farmacológicas no ideales de este agente han amortiguado su uso como fármaco, pero han validado el concepto de la inhibición de la ATPasa de girasa para el tratamiento de infecciones bacterianas. Como consecuencia, continúa existiendo un interés en la industria farmacéutica por desarrollar fármacos candidatos que inhiban la actividad de ATPasa de la girasa (documentos WO 99/49077; WO 99/46595; US 5.998.152; US 6.197.527; US 6.608.087; US 6.632.809; Annedi y Kotra, 2001, Curr. Opin. Investig. Drugs, 2:752-754; Lafitte et al., 2002, Biochemestry, 41:7217-7223; Boehm et al.,2000, J. Med. Chem., 43:2664-2674).
En la bibliografía existe un amplio conocimiento que se refiere a la función hidrolizante de ATP de girasa, GyrB, y sus fragmentos, para la enzima de Escherichia coli (E. coli). Como comparación, se ha dado a conocer la caracterización bioquímica mucho menor de las subunidades hidrolizantes de ATP de otras topoisomerasas de tipo II. Mientras que los fragmentos proteínicos de longitud completa y N-terminales de la proteína GyrB de E. coli muestran una actividad elevada de la hidrólisis de ATP, la GyrB de S. aureus y la ParE de S. aureus aisladas no la muestran.
Para el desarrollo de nuevos antibacterianos, habitualmente se desean agentes que sean activos contra un amplio intervalo de especies bacterianas. En consecuencia, es particularmente valioso poseer un ensayo para determinar moduladores de una ATPasa de topoisomerasas de tipo II de Gram positivas (por ejemplo, S. aureus) así como de una Gram negativa (por ejemplo, E. coli). Se han dado a conocer estudios en los que se mezclan subunidades de girasa A y B procedentes de diferentes especies de bacterias (Simon et al., 1995, FEBS Lett., 373:88-92; Brown et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:6110-6119; Orr y Staudenbauer, 1982, J. Bacteriol., 151:524-527). Adicionalmente, se han dado a conocer intentos para mezclar subunidades de girasa y de topo IV procedentes de E. coli (Kato et al., 1992, J. Biol. Chem., 267:25676-25684). Existe la necesidad de identificar nuevos compuestos que modulen las topoisomerasas procariotas para uso en el tratamiento de infecciones bacterianas.
Sumario
La presente invención proporciona topoisomerasas híbridas que comprenden una subunidad de unión a ADN de una topoisomerasa de tipo II procedente de una procariota Gram-negativa, y una subunidad hidrolizante de ATP de una topoisomerasa de tipo II procedente de S. aureus. En algunas realizaciones, la procariota Gram-negativa se selecciona de Enterobacteriáceas, Pseudomonadáceas, especies de Bacterióides, especies de Haemophilus, especies de Helicobacter, especies de Neisseria, Campulobacter jejuni, especies de Legionella, y Moraxella catarrhalis. En algunas realizaciones, la procariota Gram-negativa es E. coli. En algunas realizaciones, la subunidad de unión a ADN de topoisomerasa de tipo II es GyrA procedente de E. coli. En algunas realizaciones, la subunidad hidrolizante de ATP es GyrB o ParE de S. aureus. En otras realizaciones, la topoisomerasa híbrida comprende GyrA de E. coli y GyrB de S. aureus. En otras realizaciones, la topoisomerasa híbrida comprende GyrA de E. coli y ParE de S. aureus.
La presente invención también proporciona métodos para evaluar la actividad de topoisomerasas, que comprende proporcionar una topoisomerasa híbrida que comprende una subunidad de unión a ADN de una topoisomerasa de tipo II procedente de una procariota Gram-negativa, y una subunidad hidrolizante de ATP de una topoisomerasa de tipo II procedente de S. aureus, y determinar la actividad de topoisomerasa. En algunas realizaciones, los métodos comprenden además poner en contacto la topoisomerasa híbrida con ADN. En algunas realizaciones, la actividad de topoisomerasa se determina detectando un cambio en la topología del ADN. En algunas realizaciones, el cambio en la topología de ADN se determina detectando la relajación del ADN, el superenrollamiento del ADN, o la pérdida de encadenamiento del ADN. En algunas realizaciones, la actividad de topoisomerasa se determina detectando la actividad de ATPasa. En algunas realizaciones, la actividad de ATPasa se detecta midiendo el ortofosfato inorgánico, o el difosfato de adenosina.
La presente invención también proporciona métodos para identificar compuestos que modulan la actividad de topoisomerasa, que comprenden: a) proporcionar una topoisomerasa híbrida, que comprende una subunidad de unión a ADN procedente de una topoisomerasa de tipo II procariota, y una subunidad hidrolizante de ATP procedente de una topoisomerasa de tipo II procariota; b) poner en contacto la topoisomerasa híbrida con un compuesto de ensayo; y c) determinar la actividad de topoisomerasa, en la que un cambio en la actividad de topoisomerasa en presencia de dicho compuesto, comparada con la actividad de topoisomerasa en ausencia de dicho compuesto, indica que dicho compuesto modula la actividad de topoisomerasa. Algunas realizaciones comprenden además poner en contacto a la topoisomerasa híbrida con ADN y un compuesto de ensayo. En algunas realizaciones, la actividad de topoisomerasa se determina detectando un cambio en la topología del ADN. En algunas realizaciones, el cambio en la topología de ADN se determina detectando la relajación del ADN, el superenrollamiento del ADN, o la pérdida de encadenamiento del ADN. En algunas realizaciones, la actividad de topoisomerasa se determina detectando la actividad de ATPasa. En algunas realizaciones, la actividad de ATPasa se detecta midiendo ortofosfato inorgánico, o el difosfato de adenosina. En algunas realizaciones, el ensayo comprende además determinar si el compuesto tiene actividad antibacterina. En algunas realizaciones, la subunidad de unión a ADN es GyrA de E. coli, y la subunidad hidrolizante de ATP es GyrB de S. aureus. En algunas realizaciones, la subunidad de unión a ADN es GyrA de E. coli, y la subunidad hidrolizante de ATP es ParE de S. aureus.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestra una medida de IC_{50} típica para novobiocina, un producto natural inhibidor de girasa, en condiciones de ensayo típicas.
La Figura 2 muestra el efecto de GyrA equimolar de E. coli sobre la actividad de GyrB de S. aureus con relación a otros tratamientos.
La Figura 3 muestra el efecto de la variación de las cantidades de GyrA de E. coli como un activador de GyrB de S. aureus, en presencia o en ausencia de ADN.
La Figura 4 muestra el superenrollamiento, dependiente de ATP, de ADN plasmídico para GyrA de E. coli y GyrB de S. aureus híbridos, con el efecto del superenrollamiento, dependiente de ATP, de girasa de E. coli con fines comparativos.
La Figura 5 muestra el efecto de GyrA equimolar de E. coli sobre la actividad de ParE de S. aureus con relación a otros tratamientos.
Descripción detallada
La presente invención proporciona, en parte, topoisomerasas híbridas que tienen una actividad de ATPasa potenciada, y que son útiles para identificar sistemáticamente compuestos que modulen (activen, potencien o inhiban) la actividad de topoisomerasas. Los métodos de la presente invención se pueden someter a formatos de identificación sistemática de alto rendimiento.
Se ha encontrado que combinando las subunidades de unión a ADN con las subunidades hidrolizantes de ATP procedentes de diferentes topoisomerasas de tipo II se potencia la actividad de ATPasa. Por ejemplo, se ha encontrado que combinando GyrA de E. coli (la subunidad de unión a ADN, procedente de E. coli) con GyrB de S. aureus (la subunidad hidrolizante de ATP, procedente de S. aureus), se potencia la actividad de ATPasa de la proteína GyrB de S. aureus. Adicionalmente, se ha encontrado que combinando GyrA de E. coli con ParE de S. aureus (la subunidad de ATPasa de topoisomerasa IV), se potencia enormemente la actividad de ATPasa de la proteína ParE de S. aureus. Por ejemplo, la potenciación de la actividad de ATPasa hace posible ensayos sensibles de la actividad de ATPasa de topoisomerasas de S. aureus. Además, los ensayos de la invención se pueden usar para identificar y determinar cambios en la topología del ADN. Por ejemplo, la presente invención proporciona ensayos de identificación para identificar compuestos que modulan la actividad de topoisomerasas de tipo II de S. Aureus, usando, por ejemplo, GyrA de E. coli para potenciar la actividad de las subunidades hidrolizantes de ATP de S. aureus.
Como se usa aquí, la expresión "topoisomerasa híbrida" se refiere a una enzima de topoisomerasa de tipo II que comprende una subunidad de unión a ADN y una subunidad hidrolizante de ATP, que no están complejadas entre sí por naturaleza. Por ejemplo, "topoisomerasa híbrida" incluye una subunidad de unión a ADN y una subunidad hidrolizante de ATP que se juntan procedentes de dos especies procariotas diferentes, tal como un híbrido que comprende GyrA de E. coli y GyrB de S. aureus, o un híbrido que comprende GyrA de E. coli y ParE de S. aureus. La expresión "topoisomerasa híbrida" también incluye una subunidad de unión a ADN y una subunidad hidrolizante de ATP que se juntan a partir de dos topoisomerasas de tipo II diferentes de la misma especie procariota, por ejemplo, un híbrido que comprende GyrA (girasa) de S. pneumonia y ParE (topo IV) de S. pneumonia.
Por ejemplo, las topoisomerasas híbridas formadas a partir de GyrA de E. coli y GyrB de S. aureus o ParE de S. aureus proporcionan una ATPasa activa que se puede ensayar convenientemente mediante métodos estándares (por ejemplo, verde de malaquita) a niveles nanomolares individuales de enzima. Los ensayos completamente formateados, que usan topoisomerasas híbridas, permiten la identificación de compuestos que modulan la actividad de ATPasa de las topoisomerasas híbridas. Tal modulación de la actividad de topoisomerasas también se puede monitorizar evaluando la topología del ADN. Por ejemplo, la girasa híbrida que comprende GyrA de E. coli y GyrB de S. aureus presenta una actividad de superenrollamiento del ADN dependiente del ATP, que es la reacción completa de la enzima girasa natural. Por lo tanto, los ensayos estándares que miden la actividad de superenrollamiento del ADN, dependiente de ATP, se pueden usar para identificar compuestos que modulan la enzima; y más particularmente, para identificar compuestos que inhiben la enzima.
Las topoisomerasas híbridas de la presente invención se pueden usar para evaluar y monitorizar la actividad de topoisomerasas. Las topoisomerasas híbridas de la presente invención se pueden usar en ensayos para identificar compuestos que modulan la actividad de topoisomerasas.
En un aspecto, la presente invención proporciona topoisomerasas híbridas que comprenden una subunidad de unión a ADN de una topoisomerasa de tipo II procedente de una fuente (especie o topoisomerasa), y una subunidad hidrolizante de ATP de una topoisomerasa de tipo II procedente de otra fuente (especie o topoisomerasa).
Las subunidades de topoisomerasa de tipo II procedentes de cualquier procariota se pueden usar en las topoisomerasas híbridas y en los ensayos de la invención, incluyendo pero sin limitarse a la familia de Enterobacteriáceas (tales como E. coli, Klebsiella pneumoniae, y Salmonella typhimurium), la familia de Pseudomonadáceas (tal como Pseudomonas aeruginosa), especies de Bacteroides (tales como Bacteroides fragilis), especies de Haemophilus (tales como Haemophilus influenzae y Haemophylus parainfluenzae), especies de Helicobacter (tales como Helicobacter pylori), especies de Neisseria (tales como Neisseria gonorrheae y Neisseria meningitidis), Campylobacter jejuni, especies de Legionella (tales como Legionella pneumophila), Moraxella catarrhalis, especies de Bacilus (tales como Bacillus subtilis), especies de Enterococus (tales como Enterococcus faecalis y Enterococcus faecium), especies de Staphilococcus (tales como Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis), especies de Streptococcus (tales como Streptococcus pneumoniae, Streptococcus mutants, y Streptococcus pyogenes), Micoplasma pneumoniae, y Clostridium dificile.
En algunas realizaciones, la subunidad de unión a ADN procede de una procariota Gram-negativa, y la subunidad hidrolizante de ATP procede de S. aureus.
Las procariotas Gram-negativas incluyen la familia de Enterobactereáceas (tales como E. coli, Klebsiella pneumoniae, y Salmonella typhimurium), la familia de Pseudomonadáceas (tales como Pseudomonas aeruginosa), especies de Bacteroides (tales como Bacteroides fragilis), especies de Haemophilus (tales como Haemophilus influenzae y Haemophilus parainfluenzae), especies de Helicobacter (tal como Helicobacter pylori), especies de Neisseria (tales como Neisseria gonorrhoeae y Neisseria meningitidis), Campylobacter jejuni, especies de Legionella (tales como Legionella pneumophila), y Moraxella catarrhalis.
En algunas realizaciones, la subunidad de unión a ADN es GyrA de E. coli, y la subunidad hidrolizante de ATP es GyrB de S. aureus.
En algunas realizaciones, la subunidad de unión a ADN es GyrA de E. coli, y la subunidad hidrolizante de ATP es ParE de S. aureus.
En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos para evaluar la actividad de topoisomerasa. En algunas realizaciones, la actividad de topoisomerasa se evalúa combinando una topoisomerasa híbrida que comprende una subunidad de unión a ADN de una topoisomerasa de tipo II procedente de una fuente (especie o topoisomerasa) y una subunidad hidrolizante de ATP de una topoisomerasa de tipo II procedente de otra fuente (especie o topoisomerasa), y determinando la actividad de topoisomerasa.
La actividad de topoisomerasa se puede determinar usando cualquier método o ensayo. Muchos de tales métodos son conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, la actividad de topoisomerasa se puede determinar detectando la actividad de ATPasa; véase, por ejemplo, DNA Topoisomerase Protocol, Osheroff y Bjomsti ed., Methods in Molecular Biology, Vol. 95(2001). La actividad de ATPasa se puede determinar, detectar, medir o cuantificar de muchas maneras conocidas por los expertos en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, cuantificando el ortofosfato inorgánico (fosfato) o el difosfato de adenosina (ADP). Como alternativa, la actividad de topoisomerasa se puede determinar observando los cambios en la topología del ADN (incluyendo la relajación, el superenrollamiento o la pérdida de encadenamiento de ADN).
En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos para identificar compuestos que modulan la actividad de topoisomerasa, usando topoisomerasas híbridas.
Como se usa aquí, los términos "modular" o "modula", con referencia a la actividad de topoisomerasa, incluye cualquier alteración medible, ya sea una inhibición o un potenciación, de la actividad de topoisomerasas.
En algunas realizaciones, los compuestos se identifican proporcionando una topoisomerasa híbrida que comprende una subunidad de unión a ADN, procedente de una topoisomerasa de tipo II procariota, y una subunidad hidrolizante de ATP, procedente de una topoisomerasa de tipo II procariota, poniendo en contacto la topoisomerasa híbrida con un compuesto de ensayo, y determinando la actividad de topoisomerasa, en la que un cambio en la actividad de topoisomerasa en presencia del compuesto, según se compara con la actividad de topoisomerasa en ausencia del compuesto, indica que el compuesto modula la actividad de topoisomerasa. Los moduladores de topoisomerasas se identifican como aquellos compuestos que, cuando están presentes, dan como resultado una alteración en la actividad de la topoisomerasa híbrida.
La presente invención también proporciona métodos para identificar agentes antibacterianos basados en la identificación de compuestos que inhiben la actividad de topoisomerasa o la actividad de ATPasa de topoisomerasas, usando las topoisomerasas híbridas de la presente invención.
En algunas realizaciones, los compuestos que se identifican como capaces de modular la actividad de topoisomerasa se ensayan adicionalmente para determinar la capacidad para exterminar o inhibir el crecimiento de bacterias. Los ensayos de la actividad antibacteriana son bien conocidos por los expertos en la técnica.
Las proteínas de topoisomerasas y de girasas se pueden obtener para uso en la presente invención según procedimientos bien conocidos en la técnica. Las proteínas de topoisomerasas y de girasas se pueden obtener mediante aislamiento o purificación a partir de fuentes naturales, o se pueden expresar usando tecnología recombinante. En la bibliografía se han descrito numerosas técnicas para obtener proteínas y subunidades de topoisomerasas y de girasas, incluyendo proteínas y subunidades de topoisomerasas de tipo II bacterianas (Staudenbauer y Orr, 1981, Nucleic Acids Res., 9:3589-3603; Brockbank y Barth, 1993, J. Bacteriol., 175:3269-3277; Gootz et al.,1999, Antimicrob.Agents Chemother., 43:1845-1855; Mizuuchi et al., 1984, J. Biol. Chem., 259:9199-9201; Hallett et al., 1990, Gene, 93:139-142). Estas preparaciones también incluyen métodos en los que se han preparado topoisomerasas modificadas con un marcador de afinidad mediante métodos estándares de ADN recombinante, para facilitar la purificación de la proteína resultante (Pan y Fisher, 1999, Antimicrob. Agents Chemother., 1999, 43:1129-36; Gross et al., 2003, Antimicrob. Agents Chemother., 47:1037-46). En las bases de datos, tales como GenBank, se puede encontrar la información de secuencias para polipéptidos de subunidades de topoisomerasas identificados, y los genes y ADNc que codifican los polipéptidos de las subunidades de topoisomerasas.
Generalmente, se desean preparaciones proteínicas de pureza elevada (> 95%). Sin embargo, se pueden usar preparaciones menos puras, con tal de que no contengan niveles elevados de otras enzimas que hidrolizan el ATP.
Las enzimas que hidrolizan ATP a ADP y fosfato inorgánico son comunes, y, como consecuencia, los métodos para detectar los productos de reacción son bien conocidos en la bibliografía. Estos métodos se pueden usar con los ensayos de la presente invención para monitorizar la actividad de ATPasa de las topoisomerasas. Tales métodos incluyen, pero no se limitan a, el sistema de detección de fosfato a base de molibdato de amonio/verde de malaquita (Lanzetta et al., Anal. Biochem., 100:95-97; Cogan et al., 1999 Anal. Biochem., 271:29-35), la reacción de metiltioguanosina (MESG)/nucleósido fosforilasa (Banik y Roy, 1990, Biochem. J., 266:611-614; Ali et al., 1993, Biochemistry, 32:2717-2724), la detección a base de ^{32}P radioactivo (Sugino y Cozzarelli, 1980, J. Biol. Chem., 255:6299-6306) (incluyendo el centelleo por efecto de proximidad) (Jeffery et al., 2002, Anal. Biochem., 304:55-62), y el sistema de enzimas acopladas de piruvato quinasa/lactato deshidrogenasa (Ali et al., 1993, Biochemistry, 32:2717-2724; Tamura y Gellert, 1990, J. Biol. Chem., 265:21342-21349).
La GyrB de S. aureus purificada no tiene una ATPasa muy activa. Blanche et al. (1996, Antimicrob. Agents Chemother., 40:2714-2720) ha dado a conocer que la actividad de superenrollamiento del ADN de la girasa de S. aureus (que contiene tanto la proteína GyrA como GyrB) se puede incrementar en \sim 500 veces mediante adición de concentraciones elevadas (0,7 M) de glutamato de potasio. La adición de esta sal a un tampón de ensayo que contiene GyrB de S. aureus da como resultado un incremento de la actividad, del orden de alrededor de 10 veces. Se encuentra que la adición de GyrA equimolar de E. coli a la proteína GyrB de S. aureus, en ausencia de glutamato de potasio (K glu), aumenta la actividad de ATPasa en alrededor de 20 veces. El ADN activa además la mezcla de GyrA/GyrB para un incremento total, con respecto a la actividad de ATPasa de GyrB inicial, de alrededor de 620 veces.
La actividad de ATPasa de ParE de S. aureus también se potencia mediante la adición de GyrA de E. coli o de ADN. El ADN añadido a ParE de S. aureus potencia la actividad de ATPasa aproximadamente unas 2 veces. El cotratamiento de ParE de S. aureus con ADN y con GyrA de E. coli activa la mezcla de GyrA/ParE de las especies cruzadas hasta un incremento total, con respecto a la actividad de ParE, de alrededor de 4,3 veces.
En algunas realizaciones de los ensayos de la presente invención, el ADN se incluye con las subunidades proteínicas. Se puede usar una variedad de diferentes tipos de ADN bicatenario con los métodos de la presente invención, incluyendo, pero sin limitarse a, ADN de esperma de salmón sometido a ultrasonidos, oligonucleótidos sintéticos hibridados, o ADN plasmídico ya sea que esté cortado, o cerrado circularmente tanto superenrollado como relajado. Los expertos en la técnica apreciarán que las enzimas de girasa muestran cierta especificidad de secuencia y de longitud con relación a su sustrato polinucleotídico (Fisher et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:4165-419; Lockshon y Morris, 1985, J. Mol. Biol., 181:63-74; Lother et al. 1984, Nucleic Acids Res., 12:901-914; Morrison et al., 1980, J. Biol. Chem., 255:2211-2219). Se puede usar, con resultados similares, una variedad de diferentes tipos de ADN, incluyendo los de origen natural o sintético, lineal o cerrado circularmente. Para el ADN cerrado circularmente, son aceptables tanto las topologías superenrolladas como relajadas, al igual que también es aceptable la forma cortada. La elección exacta del ADN usado puede impactar en la concentración óptima del ADN, así como en la magnitud de la activación de ATPasa en cierto grado, pero los ajustes están dentro de la pericia de la técnica.
En algunas realizaciones, la subunidad de unión a ADN y la subunidad hidrolizante de ATP se combinan en mezclas equimolares. En algunas realizaciones, la subunidad de unión a ADN y la subunidad hidrolizante de ATP se combinan en mezclas equimolares, por ejemplo, el uso de cantidades equimolares de GyrA de E. coli y de GyrB o ParE de S. aureus, en presencia de ADN, es una composición muy económica en términos de uso de proteína para el ensayo de la actividad de ATPasa. Como alternativa, las mezclas no equimolares de GyrA de E. coli y de GyrB o ParE de S. aureus también dan como resultado la activación de ATPasa, y se pueden emplear, aunque con un grado menor de eficacia.
Como se usan aquí, las expresiones "condiciones que promueven la actividad de topoisomerasa", "condiciones que promueven la actividad de ATPasa de topoisomerasas" y "condiciones que promueven la actividad hidrolizante de ATP específica", se refieren a condiciones de reacción que apoyan la actividad catalítica de las topoisomerasas de la presente invención. Los ensayos de la presente invención se realizan en condiciones tales que las topoisomerasas híbridas tienen cierta o todas sus actividades catalíticas. Tales condiciones son conocidas por los expertos en la técnica. El Mg^{2+} es importante para mantener la actividad catalítica de topoisomerasas de tipo II, generalmente en un intervalo de alrededor de 1 hasta alrededor de 20 mM, más particularmente de alrededor de 3 hasta alrededor de 8 mM. La actividad catalítica se mantiene mediante un intervalo amplio de pH, de alrededor de pH 6 hasta alrededor de pH 9, más particularmente de alrededor de pH 7 hasta alrededor de pH 8. En algunas realizaciones de la presente invención, el pH oscila desde alrededor de 7 hasta alrededor de 8. Los agentes tamponantes de pH adecuados incluyen, pero no se limitan a, tris(hidroxietil)aminometano (TRIS), N-(2-hidroxietil)piperazin-N'-(ácido 2-etanosulfónico) (HEPES), y ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico (MOPS), a una concentración de alrededor de 10 hasta alrededor de 100 mM.
En algunas realizaciones de la presente invención, se incluye un electrolito de soporte, a concentraciones que oscilan desde alrededor de 25 mM hasta alrededor de 150 mM (cuyos ejemplos incluyen, pero no se limitan a, cloruro de sodio, cloruro de potasio, o cloruro de amonio, acetato de sodio, acetato de potasio, o acetato de amonio). En algunas realizaciones, se incluye alrededor de 50 mM hasta alrededor de 90 mM de acetato de amonio.
En algunas realizaciones de la presente invención, opcionalmente se incluyen reactivos depuradores de metales, tales como ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) o fenantrolina. Si se incluyen tales reactivos depuradores de metales, no se deben de usar en gran exceso con respecto al ión de magnesio.
En algunas realizaciones de la presente invención, también se pueden incluir agentes reductores tales como tris(carboxietilfosfina) (TCEP) o ditiotreitol (DTT), cuya concentración oscila desde alrededor de 1 mM hasta alrededor de 10 mM. Se puede incluir la poliamina espermidina (desde alrededor de 2 mM hasta alrededor de 5 mM), así como agentes estabilizantes, tales como glicerina (que oscila desde alrededor de 2 hasta alrededor de 10% p/v), o seroalbúmina bovina.
La invención se ilustra adicionalmente por medio de los siguientes ejemplos, que están destinados a elaborar varias realizaciones de la invención. Estos ejemplos no están destinados ni se deben de interpretar como limitantes del alcance de la invención. Estará claro que la invención se puede practicar de otro modo diferente de como se describe particularmente aquí. En vista de las enseñanzas de este documento, son posibles numerosas modificaciones y variaciones de la presente invención, y, por lo tanto, están dentro del alcance de la invención.
Ejemplos Ejemplo 1 Métodos
Los genes que codifican la proteína GyrA procedente de E. coli y la proteína GyrB procedente de S. aureus se amplificaron a partir de ADN genómico usando la reacción de cadena de polimerasa, con cebadores basados en la información de secuencias disponible de GenBank. El gen gyrA de E. coli se clonó en un plásmido de expresión bajo el control de un promotor tac para la expresión recombinante en E. coli. El gen gyrB de S. aureus se clonó en un plásmido de expresión bajo el control de un promotor T7 para la expresión recombinante en E. coli. Los cultivos separados de E. coli, que contienen los plásmidos de expresión, se hicieron crecer a 37ºC hasta fase semilogarítmica; se añadió isopropil-beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG) para inducir la expresión durante varias horas. La GyrA de E. coli y la GyrB de S. aureus recombinantes se purificaron a partir de los lisados celulares bacterianos, usando una combinación de cromatografía de intercambio iónico y de exclusión molecular, para producir subunidades de girasa de > 95% de pureza.
La topoisomerasa híbrida se formó combinando GyrA de E. coli y GyrB de S. aureus, a una concentración de 1 \muM cada uno en un tampón que contiene 50 mM de Tris(pH 7,5), 75 mM de acetato de amonio y 2 mg/ml de ADN de esperma de salmón sometido a ultrasonidos. La disolución se mezcló ligeramente, y se usó inmediatamente o se almacenó a temperatura ambiente o en hielo durante varias horas. La disolución madre enzimática se diluyó entonces 1:1000 en tampón de ensayo que carece de ATP. La disolución madre de enzima diluida se dispensó entonces a 50 \mul por pocillo en una placa de 96 pocillos estándar, de fondo transparente. Se prepararon en DMSO series de diluciones de los moduladores de ATPasa candidatos, y se dispensaron 2 \mul de estos en el tampón que contiene la enzima. La reacción enzimática se inició mediante adición de 50 \mul de 500 \muM de ATP en tampón de ensayo (véase la tabla más abajo) y se dejó transcurrir durante 3 horas. Al final de ese tiempo, se añadieron 150 \mul por pocillo de reactivo paralizante, y la disolución se incubó durante alrededor de 5 minutos. El transcurso se monitorizó midiendo la absorbancia a 650 nM (A650). Junto con los compuestos de ensayo, se incluyeron pocillos que no contenían compuesto y que contenían un control positivo (2 \muM de novobiocina), como referencia de una inhibición del 0 y del 100%. Se preparó en tándem una placa de ensayo "sin reacción", conteniendo la placa de ensayo todos los componentes de la reacción y el compuesto de ensayo, pero no la enzima. Después se analizó, para determinar la inhibición de la reacción de ATPasa de GyrB de S. aureus, el cambio inducido por la enzima en A650 entre las dos placas de ensayo.
Condiciones de ensayo
Tampón:
50 mM de Trishidroxietilaminometano (TRIS) pH 7,5, 75 mM de acetato de amonio, 5% p/v de glicerina, 0,5 mM de EDTA, 5,5 mM de cloruro de magnesio, 1 mM de ditiotrietol, 200 nM (13 \mug/ml) de seroalbúmina bovina
ADN:
2 \mug/ml (\sim 3 \muM de pares de bases)
Enzima:
1 nM de cada uno de GyrA de E. coli, GyrB de S. aureus
Compuesto de ensayo:
Dilución 1:50 a partir de disolución madre de DMSO (2% final de DMSO)
ATP:
250 \muM
Reactivo paralizante:
0,92 mM de hidrocloruro de verde de malaquita, 8,5 mM de molibdato de amonio tetrahidratado en ácido clorhídrico 1 N
Lectura:
Absorbancia a 650 nm
En la Figura 1 se muestran los resultados. El ensayo descrito se realizó con el producto natural potente, inhibidor de girasa, novobiocina, y se generó una curva de IC_{50}. El valor de IC_{50} obtenido de 1,7 nM concuerda bien con el valor de 2,2 nM para la constante de disociación del complejo de novobiocina/girasa híbrida determinada separadamente. Además, se ha demostrado, con un conjunto de compuestos diversos, que existe una correlación directa entre los valores de IC_{50} de la inhibición de ATPasa usando el ensayo de enzima híbrida, y la actividad antibacteriana dirigida contra S. aureus.
Ejemplo 2 Ensayo de a actividad de GyrB de S. aureus en presencia de diversos efectores
En la Figura 2 se proporciona la ilustración de la mejora en la actividad de ATPasa de GyrB de S. aureus vía la reconstitución de la actividad de ATPasa de GyrB de S. aureus con GyrA de E. coli. Las comparaciones de la actividad de ATPasa de diferentes tratamientos de GyrB de S. aureus se realizaron en tampones similares, y se variaron las concentraciones totales de enzimas de tal manera que se produjo, en una hora o menos, una cantidad medible de fosfato (\sim 2-20 \muM). Todas las medidas contenían 50 mM de TRIS a pH 7,5, 5% de glicerina, 75-100 mM de electrolito (ya sea como cloruro de sodio o como acetato de amonio), 0,5 mM de EDTA, 5,5 mM de cloruro de magnesio, 1 mM de DTT, y 300 \mum de ATP. Las concentraciones de GyrB de S. aureus variaron desde 600 nM hasta 12,5 nM en estas comparaciones. Cuando se añadió GyrA de E. coli estaba presente a la misma concentración molar que la GyrB de S. aureus. Cuando esta presente, K glu estaba a una concentración de 0,7 M. Para las medidas que contienen ADN, se encontraba presente ADN de esperma de salmón sometido a ultrasonidos, 25 \mug/ml.
Ejemplo 3 Ensayo del efecto de ADN sobre la potencia de GyrA de E. coli como activador de GyrB de S. aureus
En la Figura 3 se ejemplifica adicionalmente el efecto de cantidades variables de GyrA de E. coli con relación a GyrB de S. aureus. Se midieron las actividades de mezclas de diversas reacciones de las dos proteínas, usando métodos esencialmente como se describen anteriormente en el Ejemplo 1. En ausencia de ADN, se requieren excesos de GyrA de E. coli para aumentar sustancialmente la actividad de GyrB de S. aureus. Por el contrario, cuando el ADN está presente, se potencia el efecto estimulador de GyrA de E. coli, y es sustancialmente completo con un equivalente individual de la proteína activante.
Ejemplo 4 Ensayo del superenrollamiento de ADN plasmídico con GyrB de S. aureus y GyrA de E. coli
En la Figura 4 se proporciona la ilustración de la dependencia de ATP del superenrollamiento del híbrido de GryA de E. coli y GyrB de E. coli. Las líneas 1 y 2 muestran la actividad de superenrollamiento de la girasa (GyrA de E. coli/GyrB de S. E. coli) de E. coli en presencia y en ausencia de ATP, respectivamente. Las líneas 3 y 4 muestran los resultados análogos para el híbrido de especies cruzadas de GyrA de E. coli/GyrB de S. aureus. La observación del superenrollamiento, dependiente del ATP, del ADN plasmídico relajado estableció que el híbrido de especies cruzadas llevó a cabo la reacción completa de ADN girasa.
Las reacciones de superenrollamiento de girasa de E. coli y del híbrido del GyrA de E. coli y GyrB de S. aureus se realizaron con muestras de 50 \mul que contienen 0,5 \mug de ADN plasmídico pBR322 relajado, y 20 nM de cada una de las subunidades de GyrA y GyrB apropiadas. Las reacciones, llevadas a cabo a temperatura ambiente, se iniciaron mediante adición de ATP hasta una concentración final de 1 nM, y se dejaron transcurir durante 20 minutos. Las reacciones se paralizaron con tampón de carga de gel de agarosa (10 \mul), y se analizaron 20 \mul de esta disolución mediante electroforesis en gel y con fluorescencia con bromuro de etidio bajo transiluminación con luz ultravioleta. A continuación se describe la composición del tampón.
Condiciones de ensayo
Tampón:
50 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)piperazin-1-etanosulfónico (HEPES) pH 7,5, 75 mM de acetato de amonio, 5% p/v de glicerina, 0,5 mM de EDTA, 5,5 mM de cloruro de magnesio, 1 mM de ditiotreitol, 200 nM 13 \mug/ml) de seroalbúmina bovina, 2 mM de espermidina
ADN:
0,5 \mug de pBR322 relajado
Enzima:
20 nM de cada uno de GyrA de E. coli; GyrB de E. coli o de S. aureus, según sea apropiado
ATP:
1 mM, cuando está presente
Reactivo paralizante:
30% p/v de Ficoll 400 (Pharmacia), 100 mM de EDTA, 5% p/v de dodecilsulfato de sodio, 0,2 \mug/ml de azul de bromofenol
Lectura:
Electroforesis en gel de agarosa (0,8 p/v) llevado a cabo a 3 V/cm durante 3 horas en un tampón de experimento de 90 mM de TRIS, 90 mM de ácido bórico, 2 mM de EDTA (1x TBE). Después de la electroforesis, el ADN se tiñó en 5 \mug/ml de bromuro de etidio, y se fotografió con transiluminación con luz ultravioleta.
Ejemplo 5 Ensayo de la actividad de ParE de S. aureus en presencia de diversos efectores
En la Figura 5 se proporciona la ilustración de la mejora en la actividad de ATPasa de ParE de S. aureus vía la reconstitución de ParE de S. aureus con GyrA de E. coli y ADN. Las comparaciones de la actividad de ATPasa de diferentes tratamientos de ParE de S. aureus se realizaron en el siguiente tampón: 50 mM de TRIS pH 7,5, 75 mM de acetato de amonio, 5% p/v de glicerina, 0,5 mM de EDTA, 5,5 mM de cloruro de magnesio, 1 mM de ditiotreitol, 200 nM (13 \mug/ml) de seroalbúmina bovina. La concentración total de cada subunidad enzimática (según sea apropiado) fue 100 nM. Para la medida que contiene ADN, estaba presente ADN de esperma de salmón sometido a ultrasonidos, 200 \mug/ml. Las reacciones se iniciaron mediante adición de ATP hasta una concentración final de 500 \muM, y se dejaron transcurrir durante 30 minutos, después de lo cual se paralizaron y se analizaron para determinar la producción de fosfato como se describe en el Ejemplo 1. La actividad de ATPasa de la ParE de S. aureus se potenció por ADN. En presencia de GyrA de E. coli equimolar, está mejora se potenció.

Claims (24)

1. Una topoisomerasa híbrida que comprende una subunidad de unión a ADN de una topoisomerasa de tipo II procedente de una procariota Gram-negativa, y una subunidad hidrolizante de ATP de una topoisomerasa de tipo II procedente S. aureus.
2. La topoisomerasa híbrida de la reivindicación 1, en la que la procariota Gram-negativa se selecciona de Enterobacteráceas, Pseudomonadáceas, especies de Bacteroides, especies de Hameophilus, especies de Helicobacter, especies de Neisseria, Campylobacter jejuni, especies de Legionella, y Moraxella catarrhalis.
3. La topoisomerasa híbrida de la reivindicación 1, en la que la procariota Gram-negativa es E. coli.
4. La topoisomerasa híbrida de la reivindicación 1, en la que la subunidad de unión a ADN de la topoisomerasa de tipo II es GyrA procedente de E. coli.
5. La topoisomerasa híbrida de la reivindicación 1, en la que la subunidad hidrolizante de ATP es GyrB o ParE de S. aureus.
6. La topoisomerasa híbrida de la reivindicación 1, en la que la topoisomerasa híbrida comprende GyrA de E. coli y GyrB de S. aureus.
7. La topoisomerasa híbrida de la reivindicación 1, en la que la topoisomerasa híbrida comprende GyrA de E. coli y ParE de S. aureus.
8. Un método para evaluar la actividad de topoisomerasa, que comprende:
a)
proporcionar la topoisomerasa híbrida de la reivindicación 1, y
b)
determinar la actividad de topoisomerasa.
9. El método de la reivindicación 8, que comprende además poner en contacto la topoisomerasa híbrida con un ADN, después de la etapa a).
10. El método de la reivindicación 9, en el que la actividad de topoisomerasa se determina detectando un cambio en la topología del ADN.
11. El método de la reivindicación 10, en el que el cambio en la topología del ADN se determina detectando la relajación del ADN, el superenrollamiento del ADN, o la pérdida de encadenamiento de ADN.
12. El método de la reivindicación 8, en el que la actividad de topoisomerasa se determina detectando la actividad de ATPasa.
13. El método de la reivindicación 12, en el que la actividad de ATPasa se detecta midiendo ortofosfato inorgánico o adenosina de difosfato.
14. El método de la reivindicación 8, en el que la topoisomerasa híbrida comprende GyrA de E. coli y GyrB de S. aureus.
15. El método de la reivindicación 8, en el que la topoisomerasa híbrida comprende GyrA de E. coli y ParE de S. aureus.
16. Un método para identificar compuestos que modulan la actividad de topoisomerasa, que comprende:
a)
proporcionar una topoisomerasa híbrida que comprende una subunidad de unión a ADN procedente de una topoisomerasa de tipo II procariota, y una subunidad hidrolizante de ATP procedente de una topoisomerasa de tipo II procariota;
b)
poner en contacto la topoisomerasa híbrida con un compuesto de ensayo; y
c)
determinar la actividad de topoisomerasa, en la que un cambio en la actividad de topoisomerasa en presencia de dicho compuesto, en comparación con la actividad de topoisomerasa en ausencia de dicho compuesto, indica que dicho compuesto modula la actividad de topoisomerasa.
17. El método de la reivindicación 16, que comprende además poner en contacto la topoisomerasa híbrida con ADN y un compuesto de ensayo.
\newpage
18. El método de la reivindicación 17, en el que la actividad de topoisomerasa se determina detectando un cambio en la topología del ADN.
19. El método de la reivindicación 18, en el que el cambio en la topología del ADN se determina detectando la relajación de ADN, el superenrollamiento de ADN, o la pérdida de encadenamiento de ADN.
20. El método de la reivindicación 16, en el que la actividad de topoisomerasa se determina detectando la actividad de ATPasa.
21. El método de la reivindicación 20, en el que la actividad de ATPasa se detecta midiendo ortofosfato inorgánico o difosfato de adenosina.
22. El método de la reivindicación 16, que comprende además determinar si el compuesto tiene actividad antibacteriana.
23. El método de la reivindicación 16, en el que la subunidad de unión a ADN es GyrA de E. coli, y la subunidad hidrolizante de ATP es GyrB de S. aureus.
24. El método de la reivindicación 16, en el que la subunidad de unión a ADN es GyrA de E. coli, y la subunidad hidrolizante de ATP es ParE de S. aureus.
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