ES2268335T3 - Materiales de aposito para heridas que comprenden policaridos modificados quimicamente. - Google Patents

Abstract

Una composición terapéutica que comprende un polisacárido modificado químicamente, en el que al menos un residuo de sacárido ha injertado en el mismo una cadena lateral que comprende dos o más grupos carboxilatos en los que la cadena lateral tiene sólo un enlace con el polisacárido, y en el que el polisacárido modificado es hidrófilo pero tiene una solubilidad inferior a aproximadamente 1 gramo por litro en agua a 25º C.

Description

Materiales de apósito para heridas que comprenden polisacáridos modificados químicamente.

La presente invención se refiere a apósitos para heridas y a otras composiciones terapéuticas que comprenden ciertos polisacáridos modificados químicamente, procedimientos adecuados para la preparación de tales composiciones y al uso de tales composiciones como apósitos para heridas.

Concentraciones de especies de oxígeno reactivas tales como radicales hidroxilo (\cdotOH), oxígeno simple (^{1}O_{2}), radicales hidroperoxilo (\cdotOOH), aniones de radical superóxido (-O_{2}^{-}) y peróxido de hidrógeno (H_{2}O_{2}) pueden dar lugar a tejidos dañados, produciendo una afección conocida como estrés oxidativo. La presencia de un bajo nivel de especies de oxígeno reactivas puede ser ventajoso en las fases tempranas de la curación de heridas por macrófagos tanto atrayentes como activantes que abarcan y matan bacterias y citoquinas de liberación y factores de crecimiento. Sin embargo, estrés oxidativo prolongado y más grave puede retardar la curación debido a que producirá inflamación crónica, desvía suministro de energía disponible hacia defensa antioxidante a expensas de reconstrucción del tejido, y aumenta los niveles de metaloproteinasas de matriz que provocan la ruptura de tejido. En casos más graves, niveles elevados de especies de oxígeno reactivas pueden dar lugar al aumento de senescencia o apóptosis inducida por peróxido de hidrógeno (esto es, muerte celular programada) o necrosis de tejido (esto es, muerte celular no controlada y por tanto daño del tejido permanente).

En el estrés oxidativo leve se cree que el peróxido de hidrógeno (H_{2}O_{2}) es la especie dominante presente, formándose rápidamente a partir de superóxido mediante la enzima superóxido dismutasa. Esta reacción de dismutación mediada por enzima también minimiza la producción de oxígeno simple que puede generarse cuando el superóxido es producido demasiado rápido y por tanto tiene la oportunidad de dismutar de forma espontánea sin ayuda del enzima. La dismutación mediada por enzima rápida de superóxido también minimiza los niveles de radical hidroperoxilo, la forma no ionizada del superóxido. En cambio los niveles de peróxido de hidrógeno se mantienen bajos mediante las acciones de la catalasa y glutationa peroxidasa. Por tanto, en condiciones de estrés oxidativo leve cuando los niveles de peróxido de hidrógeno están aumentando ligeramente (en torno a 10^{-8} a 10^{-4} molar), se ha encontrado que se estimula la tasa de proliferación celular en cultivos de fibroblasto.

De acuerdo con lo anterior, la curación de heridas crónicas puede ser asistida con el uso de apósitos para herida antioxidantes que reaccionan de forma específica con especies de oxígeno reactivas en exceso tales como las enumeradas anteriormente y de ahí que reduzcan el nivel de estrés oxidativo.

El documento US-A-5667501 describe composiciones que comprenden polímeros modificados químicamente injertados con grupos químicos que confieren actividad antioxidante medida mediante un ensayo de difenilpicrilhidrazilo (DPPH) y que también generan bajos niveles de peróxido de hidrógeno mediante reacción con oxígeno molecular en el lecho de la herida para estimular la actividad macrófaga y proliferación de fibroblastos. Las composiciones se pueden usar para promover la curación de heridas crónicas. Preferiblemente, el polímero es un polímero que porta grupos funcionales hidroxilo, carbonilo o amida, o un polisacárido que porta grupos funcionales hidroxilo, dichos grupos funcionales se han transformado en derivados que son radicales libres persistentes o precursores de radicales libres persistentes, es decir son grupos antioxidantes eliminadores de radicales libres.

El documento US-A-5612321 describe composiciones que comprenden polisacáridos injertados con antioxidantes en al menos un grupo hidroxilo del polisacárido. Las composiciones se pueden usar entre otros para promover la curación de heridas crónicas. Preferiblemente, el polisacárido es ácido hialurónico y el grupo antioxidante comprende un grupo fenol.

En la bioquímica compleja de heridas infectadas y/o crónicas, se cree también que el hierro juega un importante papel. Por ejemplo, hierro puede jugar un papel en la catálisis de la generación de las especies de oxígeno reactivas descritas anteriormente, y con ello puede contribuir a la cronicidad de la herida. Además, las bacterias requieren hierro para el metabolismo y pueden secretar sideróforos para el fin de eliminar hierro. Por tanto parece que la eliminación del hierro libre del fluido de la herida, preferiblemente sin eliminación de otras especies disueltas tales como cinc que promueven la curación de heridas, podría ayudar en la reducción tanto de la colonización o infección de la herida por bacterias y cronicidad de heridas.

El documento US-A-6156334 describe nuevos cubrimientos para heridas que comprenden quelantes tales como el sideróforo deferoxamina injertado sobre un vehículo adecuado mediante una molécula de enlace, que elimina factores de interferencia tales como hierro del lecho de la herida. Foitzik A y col. en Proceedings of the Joint Meeting of the European Tissue Repair Society/The Wound Healing Society, Burdeos, 24 a 28 de Agosto de 1999, describen el tratamiento de úlceras venosas crónicas por medio de apósito de gasa que tiene deferoxamina acoplada al mismo. El apósito absorbente de hierro resultante es de fabricación cara, y sus propiedades antioxidantes y afinidad por especies beneficiosas tales como cinc son desconocidas.

El documento GB-A-2067203 describe polisacáridos que se han modificado mediante injerto de unidades de tetra-acetato de etilendiamina (EDTA) sobre la cadena de polisacárido. Los polisacáridos modificados resultantes se complejan fuertemente con iones de metal disueltos. Están indicados para uso en la recuperación de metales pesados de la solución y separación de metales en química analítica. No hay descripción de uso médico alguno de los polisacáridos modificados.

El documento EP-A-0718312 describe polisacáridos ácidos que se han reticulado mediante reacción en solución en un disolvente polar, aprótico con di- o polianhídridos. Un ejemplo preferido es ácido hialurónico reticulado con disacáridos. Los polisacáridos reticulados resultantes se pueden usar para un conjunto de aplicaciones médicas, incluyendo apósitos para heridas para heridas crónicas y quemaduras.

El documento EP-A-0640622 describe sistemas de liberación de fármaco en los que una molécula de fármaco está unida a un vehículo de polisacárido mediante un grupo de enlace que comprende un oligopéptido, en el que el grupo de enlace también comprende de forma opcional un resto ácido polibásico. No hay indicación o sugerencia de que las moléculas resultantes tengan efectos antioxidantes, o que estas puedan ser útiles en el tratamiento de heridas.

El documento WO 94/04129 describe distintas moléculas pequeñas que contienen tiol para uso como aditivos antioxidantes en composiciones de filtros solares cosméticos.

El documento US-A-5789507 describe resinas absorbentes de agua producidas por polimerización radical de un monómero soluble en agua, tal como un sulfonato de vinilo o un acrilato, en presencia de un polisacárido y un agente reticulante. Presumiblemente, esto da lugar a reticulación entre el polisacárido y el poliacrilato. Los polímeros superabsorbentes resultantes se pueden usar en un conjunto de productos absorbentes, incluyendo como la capa absorbente en vendajes.

El documento US-A-4997935 describe materiales de celulosa modificados para la fabricación de membranas de diálisis biocompatibles. Uno de los grupos sustituyentes presentes en la celulosa puede ser -CH(COOH)_{2}. No hay sugerencia en cuanto a referencia a composición terapéutica alguna que comprenda los materiales de celulosa modificados.

El documento US-A-4152170 describe pululanas reticuladas que se han producido mediante reacción de pululana con agentes reticulantes de anhídrido cíclico. Los materiales resultantes se pueden usar como superabsorbentes en aplicaciones sanitarias y médicas. No hay descripción de una composición terapéutica que contenga los pululanas reticuladas.

La presente invención proporciona composición terapéutica que comprende un polisacárido modificado químicamente, en el que al menos un residuo de sacárido ha injertado en el mismo una cadena lateral que porta dos o más grupos carboxilato, en los que la cadena lateral sólo tiene un enlace con el polisacárido, y en el que el polisacárido modificado es hidrófilo pero tiene una solubilidad inferior a aproximadamente 1 gramo por litro en agua a 25ºC.

La composición terapéutica comprende preferiblemente al menos 1% en peso en una base seca del polisacárido modificado químicamente, más preferiblemente al menos 5% en peso, aún más preferiblemente al menos 10% en peso, 25% en peso o 50% en peso. En ciertas realizaciones, la composición está constituida esencialmente por polisacárido modificado químicamente.

La cadena lateral en el polisacárido modificado es un grupo ramificado que tiene sólo un enlace con una molécula de polisacárido. Es decir, no es un grupo reticulante. Se ha encontrado que la presencia de dos grupos carboxilato proporciona una cadena lateral que es un ligando sorprendentemente efectivo y selectivo de la eliminación de hierro de la solución. Además, se ha encontrado que la presencia de la cadena lateral con dos grupos carboxilato confiere una reactividad inesperada del polisacárido con radicales libres que podría hacerlo útil para la eliminación de las especies de oxígeno reactivas del entorno de la herida.

Los dos grupos carboxilato pueden estar sustituidos geminalmente en la cadena lateral, o preferiblemente vicinalmente o más distancialmente en dicha cadena lateral. Es decir, los dos grupos carboxilato pueden estar unidos al mismo átomo de carbono, o más preferiblemente a átomos de carbono adyacentes o separados por más distancia. En cualquier caso los dos grupos carboxilato están configurados preferiblemente y dispuestos de modo que los dos grupos carboxilato pueden formar un complejo con un ión de metal único, tal como un ión férrico. Es decir, la cadena lateral puede formar preferiblemente un complejo quelato (bidentado o multidentado) con el ión a través de los grupos carboxilato. Esta complejación multidentada da lugar a eliminación mucho más efectiva de los iones de metal del fluido de la herida.

Preferiblemente, al menos uno de los grupos carboxilato está unido a un átomo de carbono insaturado, tal como en una cadena de alquileno o alquenileno, ya que tal unión puede fijar los grupos carboxilato en una configuración que es especialmente adecuada para complejación con hierro. Además, la conjugación del grupo carboxilato con el carbono insaturado ayuda a la propiedad de eliminación de radical libre del grupo carboxilato mediante la estabilización del radical carboxilato.

Pueden estar presentes más de dos grupos carboxilato en la cadena lateral. Los términos "-COOH" o "grupo carboxilato" en esta invención se refieren no sólo al grupo -COOH mismo, sino también a todas las sales farmacéuticamente aceptables, pares de iones, o grupos carboxilo protegidos, por ejemplo, anhídridos, lactonas o ésteres de los mismos fácilmente hidrolizables.

Preferiblemente la cadena lateral que porta los grupos carboxilato está unida a la cadena polisacárido a través de un enlace éster o amida. Preferiblemente, el enlace tiene lugar a través de un grupo -OH o grupo -NH_{2} en el polisacárido, a pesar de la esterificación o amidación de grupos carboxilato sobre polisacáridos tales como alginatos se podría encontrar dentro del alcance de la invención.

Preferiblemente, la cadena lateral que porta los grupos carboxilato es un grupo lineal o ramificado o cíclico que comprende de 1 a 10 átomos de carbono alquilo o alquileno, de forma opcional interrumpidos con -O-, -S-, -CO- o -NH-, que contiene preferiblemente al menos un enlace doble C=C, y de forma opcional está sustituido además con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo -OH, -NH_{2}, y halógeno. Tales grupos laterales pueden estar formados de forma conveniente mediante reacción del polisacárido con un anhídrido cíclico sustituido, como se describe con más detalle más adelante.

Preferiblemente, el grupo lateral comprende de 2 a 4 átomos de carbono de alquilo o alquileno y un enlace doble C=C. Más preferiblemente, el polisacárido modificado comprende dos grupos carboxilato unidos a una cadena alquenilo C_{3}, en particular.

-O-CO-CH=C(COOH)CH_{2}COOH

Tales cadenas laterales pueden estar formadas haciendo reaccionar un polisacárido con anhídrido cis-aconítico como se describe adicionalmente más adelante.

Los sustituyentes más preferidos son aquellos que proporcionan mayor afinidad por el hierro que por el cinc, en combinación con actividad de eliminación de radicales libres de DPPH como se determina mediante los ensayos capaces de medir estas actividades que se describen con detalle más adelante.

En ciertas realizaciones, el polisacárido está modificado además químicamente mediante la introducción de uno o más grupos tiol. Se ha encontrado también que la presencia de grupos tiol confiere una afinidad sorprendentemente alta por el hierro con una afinidad baja por el cinc y adicionalmente una reactividad con radicales libres que podría hacer el polisacárido derivatizado útil para la eliminación de especies de oxígeno reactivas del entorno de la herida.

Los grupos tiol pueden reemplazar grupos hidroxilo del polisacárido, pero preferiblemente los grupos tiol están presentes en una cadena lateral que está injertada sobre el polisacárido mediante un enlace éster o éter. Preferiblemente la cadena lateral tiene de 1 a 8 átomos de carbono. Una cadena lateral preferida es 2-etoxitiol, por ejemplo, en un polisacárido modificado que comprende un resto de la siguiente fórmula general

1

Tales cadenas laterales de estructura (III) pueden formarse de forma conveniente mediante reacción de un polisacárido o un polisacárido modificado, por ejemplo, hidroxietilcelulosa, con reactivo de Lawesson como se describe más adelante.

Preferiblemente, el polisacárido modificado químicamente de acuerdo con la presente invención es un glicano o aminoglicano modificado o derivatizado.

Preferiblemente, el glicano modificado o derivatizado es un guluronomannuronano modificado o derivatizado tal como un alginato o derivado de alginato.

Preferiblemente, el glicano modificado o derivatizado es un glucano modificado o derivatizado tal como celulosa o derivado de celulosa.

Más preferiblemente, el glicano modificado o derivatizado es una hidroxialquilcelulosa, por ejemplo, hidroxietilcelulosa, y el aminoglicano modificado o derivatizado es una quitina/quitosán modificada o derivatizada.

De forma opcional, el polisacárido modificado puede comprender una mezcla de dos o más glicanos, aminoglicanos modificados o derivados de los mismos.

Cada molécula de polisacárido comprenderá preferiblemente una pluralidad de las cadenas laterales que comprenden dos o más grupos carboxilato. Preferiblemente, al menos aproximadamente 1% de los residuos de sacárido en el polisacárido modificado de acuerdo con la presente invención están modificados por el injerto de cadenas laterales de acuerdo con la invención, es decir las cadenas laterales tienen al menos dos grupos carboxilato. Más preferiblemente, al menos aproximadamente el 5% de los residuos de sacárido están modificados de este modo y aún más preferiblemente al menos aproximadamente el 10% a aproximadamente el 20% de los residuos de sacárido están modificados de este modo. En ciertas realizaciones, la modificación del polisacárido es en primer lugar una modificación de superficie. Es decir, la concentración de las cadenas laterales es mayor en la superficie del polisacárido que en el cuerpo del polisacárido. Este es el caso, por ejemplo, si la modificación se ha llevado a cabo mediante reacción del polisacárido con el reactivo modificante en un disolvente en el que el polisacárido es insoluble (véase más adelante).

Preferiblemente el polisacárido modificado de acuerdo con la presente invención tiene una actividad de radical libre, es decir una actividad antioxidante, de al menos aproximadamente 15% en el ensayo de difenilpicrilhidrazilo (DPPH), medido como reducción en porcentaje en absorbancia a 524 nm después de 4 horas de una dispersión del 0,5% en relación p/v del polisacárido en DPPH 10^{-4} M, como se describe adicionalmente más adelante en el procedimiento 2. Preferiblemente la reducción en porcentaje en la absorbancia en el ensayo de DPPH es al menos aproximadamente 25%, más preferiblemente al menos aproximadamente 50% y lo más preferiblemente al menos aproximadamente 75%.

Preferiblemente, el polisacárido modificado de acuerdo con la presente invención absorberá agua o fluido de la herida y de ahí que llegue a humedecerse, hinchar o llegue a ser una masa gelatinosa pero no se disolverá o dispersará de forma espontánea en el mismo. Es decir, es hidrófilo pero tiene una solubilidad preferiblemente menor de aproximadamente 1 g/l en agua a 25ºC. La baja solubilidad hace de tales polisacáridos especialmente adecuados para uso como apósitos para heridas para eliminar hierro y especies de oxígeno reactivas del fluido de herida.

El polisacárido modificado de acuerdo con la presente invención forma preferiblemente complejos selectivamente con hierro frente a cinc. Es decir, el polisacárido modificado secuestra preferiblemente una mayor fracción de los iones de hierro que de los iones de cinc cuando se trata con un suero que contiene ambos tipos de iones como se describe con detalle en el procedimiento 1.

Más preferiblemente, el porcentaje de iones Fe^{3+} eliminados es al menos aproximadamente dos veces el porcentaje de iones Zn^{2+} eliminados, más preferiblemente es al menos aproximadamente cuatro veces el porcentaje de los iones Zn^{2+} eliminados. Preferiblemente, un complejo del polisacárido con Fe^{3+} en agua a pH neutro tiene una constante de estabilidad de al menos 10^{3}, preferiblemente al menos 10^{6}.

Las composiciones terapéuticas de acuerdo con la presente invención se pueden proporcionar en la forma de esferas, copos, polvo, y preferiblemente en la forma de una película, una almohadilla fibrosa, una red, una tela tejida o no tejida, una esponja secada por congelación, una espuma o combinaciones de las mismas. Tales formatos son especialmente útiles para apósitos para heridas, que se pueden preparar fácilmente mediante derivatización de o mediante injerto de cadenas laterales sobre polisacáridos ya proporcionados en los formatos relevantes. Además de los formatos sólidos descritos anteriormente, las composiciones pueden estar también en la forma de un gel o fluido viscoso para aplicación por vía tópica.

Preferiblemente, las composiciones terapéuticas de acuerdo con la invención son estériles. Preferiblemente las composiciones terapéuticas de acuerdo con la presente invención están envasadas en recipientes impermeables a microorganismos.

Las propiedades antioxidantes y secuestrantes de hierro de los polisacáridos modificados en las composiciones terapéuticas de acuerdo con la presente invención sugieren aplicaciones en un conjunto de aplicaciones médicas, incluyendo el tratamiento de heridas quirúrgicas y traumáticas agudas, quemaduras, fístulas, úlceras venosas, úlceras arteriales, llagas de presión (conocidas de otra forma como úlceras por decúbito), úlceras diabéticas, úlceras de etiología mixta, y otras heridas crónicas o necróticas y lesiones y trastornos inflamatorios. Otra aplicación terapéutica que es igualmente útil es el tratamiento o prevención de lipodermatoesclerosis (LDS). La LDS es un descoloramiento y endurecimiento pre-ulceroso de la piel en pacientes que sufren de insuficiencia venosa que lleva en última instancia a úlceras variciosas. Se cree que el exceso de hierro juega un papel en el mecanismo de LDS y por tanto que las propiedades
secuestrantes de hierro de estos polisacáridos modificados serán útiles en el tratamiento y prevención de LDS.

De acuerdo con lo anterior, en realizaciones preferidas de la presente invención la composición terapéutica es una composición para apósito para herida.

La presente invención proporciona además el uso de una composición terapéutica de acuerdo con la presente invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una herida. Preferiblemente, la herida es una herida crónica. Más preferiblemente la herida crónica se selecciona del grupo constituido por úlceras de etiología venosa, arterial o mixta, úlceras por decúbito o úlceras diabéticas.

La presente invención proporciona además el uso de una composición terapéutica de acuerdo con la presente invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de lipodermatoesclerosis.

En un aspecto más, la presente invención proporciona un procedimiento de tratamiento de una herida en un mamífero que comprende la aplicación a la misma de una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición terapéutica de acuerdo con la presente invención. Preferiblemente, la herida es una herida crónica.

En un aspecto más, la presente invención proporciona un procedimiento de tratamiento o prevención de lipodennatoesclerosis en un mamífero que comprende la aplicación a la piel con LDS, o piel propensa a desarrollar LDS, de una cantidad terapéuticamente efectiva de un polisacárido modificado de acuerdo con la presente invención. Piel propensa a desarrollar LDS incluiría, por ejemplo, la pierna inferior de individuos que sufren de insuficiencia venosa o venas variciosas.

La presente invención proporciona además un procedimiento para la producción de un polisacárido modificado que comprende la etapa de hacer reaccionar un polisacárido con un anhídrido cíclico, en el que el anhídrido cíclico está sustituido con al menos un grupo carboxilato. Preferiblemente, el anhídrido cíclico tiene la estructura general (IV):

2

En la que Z es un grupo lineal o ramificado o cíclico que comprende de 1 a 10 átomos de carbono de alquilo o alquileno, de forma opcional interrumpidos con -O-, -S-, -CO- o -NH-, que contiene preferiblemente al menos un doble enlace C=C, y de forma opcional está sustituido además con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo -OH, -NH_{2} y halógeno, y en la que Z está sustituido con al menos un grupo carboxilato.

Preferiblemente Z comprende de 2 a 4 átomos de carbono de alquilo alquileno y más preferiblemente contiene al menos un enlace doble C=C.

Preferiblemente, el anhídrido cíclico de estructura general (IV) es anhídrido cis-aconítico. Esto es, Z es -CH=C(COOH)-.

Preferiblemente el anhídrido cíclico de estructura general (IV) se hace reaccionar con dicho polisacárido en una cantidad de al menos 0,1 moles por mol de residuos de sacárido del polisacárido.

Preferiblemente, la reacción con el anhídrido cíclico se lleva a cabo en un disolvente aprótico, tal como tolueno. En ciertas realizaciones, el polisacárido no es soluble en el disolvente, con lo que la reacción con el anhídrido cíclico es en primer lugar una modificación de superficie del polisacárido.

En ciertas realizaciones el procedimiento de la presente invención comprende además la etapa de hacer reaccionar el polisacárido o derivado de polisacárido con reactivo de Lawesson que tiene la estructura (V).

3

Preferiblemente el reactivo de Lawesson se hace reaccionar con dicho polisacárido o derivado de polisacárido en una cantidad de al menos 0,1 moles por mol de residuos de sacárido del polisacárido o derivado de polisacárido.

La presente invención proporciona además polisacáridos modificados que se pueden obtener mediante procedimientos de acuerdo con la invención. Preferiblemente los polisacáridos modificados tienen estructuras como se definieron anteriormente para el primer aspecto de la invención.

Realizaciones específicas de la presente invención se describirán ahora además con referencia a los dibujos, en los que:

Figura 1 muestra cromatogramas de concentraciones de ión hierro y cinc para un suero de control (C) que no contiene hierro o cinc añadido, un suero de control que contiene iones de hierro y cinc añadidos (A), el suero A tras tratamiento con polisacáridos de acuerdo con la presente invención (B, C), y el suero A tras tratamiento con un polisacárido tiolado (E, ejemplo de referencia), y

Figura 2 muestra la reducción absoluta en absorbancia de DPPH a 524 nm frente a la concentración de antioxidante para ácido ascórbico (C, ejemplo de referencia), polisacáridos de acuerdo con la presente invención (A, B) y un polisacárido tiolado (D, ejemplo de referencia). La absorbancia de la solución de DPPH de partida fue de 0,506 UA.

Ejemplo 1

Se preparó una quitina/quitosán modificada mediante reacción con anhídrido cis-aconítico, como sigue.

Se dispuso quitina/quitosán (1,73 g, 10,0 mmol basado en residuos de sacárido) en un matraz de fondo redondo de tres bocas de 250 ml seco con 30 ml de tolueno anhidro. Se equipó el matraz con un condensador de agua y termómetro y se agitó y calentó luego la mezcla hasta 80ºC en una atmósfera de nitrógeno. Se añadió anhídrido cis-aconítico (Aldrich Chemical Co. número de catálogo 21.780-8) (4,68 g, 30,0 mmol) en porciones durante 10 minutos. Se mantuvo la temperatura de reacción a 80ºC durante unas tres horas más. Se dejó enfriar la mezcla hasta 30ºC antes de añadir agua desionizada (30 ml). Se agitó luego la mezcla durante 30 minutos para permitir que se complete la hidrólisis del anhídrido no reaccionado, luego se centrifugó para separar el quitina/quitosán modificado de los componentes disueltos. Se dispusieron los agregados sólidos de la centrífuga en un vaso de precipitados y se añadió lentamente 250 ml de carbonato de sodio acuoso saturado (Na_{2}CO_{3}). Se agitó vigorosamente la mezcla hasta que se formó una solución gelatinosa y se eliminaron todos los grumos. Se añadió luego con cuidado ácido clorhídrico 1 M (HCl) acuoso hasta que se detuvo la efervescencia. El quitosán modificado se precipitó con ello, y se dejó el precipitado reposar durante la noche antes de ser centrifugado de nuevo y se lava adicionalmente con agua y etanol antes de la centrifugación final. Finalmente, los agregados lavados se congelaron con corriente de aire y se secaron por congelación durante la noche.

La masa del producto fue 1,94 g, lo que representa un aumento de 0,21 g frente a la quitina/quitosán de partida. Esto sugiere que al menos 13,5% de los residuos de sacárido en el quitosán se han modificado mediante conversión de -NH_{2} en -NHCOCH_{2}C(CO_{2}H)=CHCO_{2}H.

La quitina/quitosán aconitilada mostró tanto complejación selectiva con Fe^{3+} en preferencia a Zn^{2+} y propiedades antioxidantes, como se determina en los procedimientos 1 y 2 descritos más adelante. Los resultados para este material se muestran como gráfico B en la figura 1 y como diagrama A en la figura 2. Ninguna de estas propiedades se observa para el material de partida quitina/quitosán no modificado.

Ejemplo 2

Se modificó una muestra de hidroxietilcelulosa mediante tratamiento con anhídrido cis-aconítico como sigue.

Se hizo reaccionar hidroxietilcelulosa (2,06 g, 10,0 mmol basado en residuos de sacárido) con anhídrido cis-aconítico (4,68 g, 30,0 mmol) como se describió anteriormente en el ejemplo 1. La masa del producto fue de 3,35 g lo que sugiere que al menos 0,83 grupos -OH por residuo de sacárido se ha modificado a grupos -OCOCH_{2}C(CO_{2}H)=CHCO_{2}H mediante reacción.

La hidroxietilcelulosa aconitilada mostró una afinidad tanto por Fe^{3+} como por Zn^{2+} (pero con selectividad diferente que el material del ejemplo 1) y también propiedades antioxidantes como se determinan en los procedimientos 1 y 2 descritos más adelante. Los resultados para este material se muestran como gráfico C en la figura 1 y como diagrama B en la figura 2. Ninguna de estas propiedades se observa para el material de partida hidroxietilcelulosa no modificada.

Ejemplo 3

(Ejemplo de referencia)

Se estudió como sigue el efecto de grupos tiol en las propiedades de polisacáridos como sigue.

Se modificó una muestra de hidroxietilcelulosa mediante tratamiento con reactivo de Lawesson como sigue. Se dispuso hidroxietilcelulosa (10,3 g, 50 mmol) en un matraz de fondo redondo de tres bocas de 250 ml seco con 150 ml de tolueno anhidro. A este se añadió reactivo de Lawesson (Aldrich Chemical Co. número de catálogo 22.743-9; 2,02 g, 5 mmol). Se equipó el matraz con un condensador de agua y se agitó y calentó luego la mezcla a reflujo en una atmósfera de nitrógeno durante 4 horas. Se dejó enfriar luego la mezcla de reacción hasta 30ºC antes de desactivar con solución de hidróxido de potasio (KOH) 1 M (100 ml) para asegurar la hidrólisis completa de reactivo de Lawesson. Después de dejar reposar durante unos 15 minutos más se decantaron las fases líquidas y se recogieron para eliminación. Se lavó el material sólido restante con KOH acuoso 1M (100 ml x 3) y con ácido clorhídrico acuoso 1 M (100 ml x 3), decantando las aguas de lavado entre cada alícuota de solución de lavado. Se lavó luego el material sólido restante con agua desionizada (100 ml x 3) y con etanol (100 ml x 3). Fue necesaria la centrifugación entre lavados. Se dispusieron los agregados resultantes en una bandeja y se congelaron por corriente de aire antes de ser secados por congelación. El rendimiento del producto fue de 4,03 g. El grado de tiolación se pudo aumentar mediante aumento de la proporción inicial de reactivo de Lawesson a polisacárido; la pérdida de producto durante el lavado pudo disminuir usando mezclas de isopropanol/agua como disolventes para los lavados alcalinos, ácidos y neutros.

La hidroxietilcelulosa tiolada mostró una gran afinidad por Fe^{3''1''} y particularmente baja actividad por Zn^{2+} y también propiedades antioxidantes como se determinan en los procedimientos 1 y 2 descritos más adelante. Los resultados para este material se muestran como gráfico E en la figura 1 y como diagrama D en la figura 2. Ninguna de estas propiedades se observa para el material de partida hidroxietilcelulosa no modificada.

Procedimiento 1

Se determinó como sigue la capacidad de polisacáridos modificados de acuerdo con la presente invención para secuestrar iones de hierro de forma selectiva frente a iones de cinc en medios acuosos.

Se añadió el polisacárido modificado con agitación a una solución que contiene iones de hierro y/o de cinc en una matriz adecuada tal como tampón, tampón que contiene suero o medio de cultivo celular que se pretende simule fluido de herida. Se continúa con un periodo de incubación adecuado, se usó cromatografía de iones para determinar los niveles de iones Fe^{3+} y/o Zn^{2+} que quedan en solución.

En el presente ejemplo se añadieron soluciones de FeCl_{3}\cdot6 H_{2}O y ZnSO_{4}\cdot7 H_{2}O en agua a medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM; Sigma Chemical Co. número de catálogo D 5546) que contiene suero bovino al 10% en relación v/v (Sigma Chemical Co. número de catálogo N 4637) para producir concentraciones finales de 50 ppm de Fe^{3+} y 50 ppm de Zn^{2+}. Se incubó la solución mixta a 37ºC con agitación suave durante 16 horas con el polisacárido modificado presente a una concentración de 2% en relación p/v. Se centrifugaron luego las muestras y se analizó una muestra de 0,9 ml del sobrenadante en cuanto al contenido de hierro y cinc mediante el siguiente procedimiento.

Se trató la solución centrifugada con 0,1 ml de una solución al 20% en relación p/v de ácido tricloroacético (TCA) para dar una concentración final de TCA al 2% en relación p/v. Se agitó el tubo durante 10 segundos y luego se centrifugó durante 15 minutos o más para eliminar sólidos. Se añadió el sobrenadante (0,5 ml) a un vial de HPLC seco limpio al que se añadió 0,5 ml de ácido nítrico 0,5 M (HNO_{3}) preparado en agua desionizada.

Se analizaron luego las muestras en cuanto a iones de hierro y cinc libres usando un equipo de HPLC Dionex DX500 de acuerdo con los siguientes detalles de procedimiento:

Instrumento:

HPLC Dionex DX500

Columna:

columna analítica Ionpac CS5A (artículo Dionex nº 046100)

\quad

Columna de guarda Ionpac CS5A (artículo Dionex nº 046104)

Eluyentes:

A - agua desionizada

\quad

B - concentrado de reactivo PDCA Metpac (artículo nº 046088)

\quad

C - diluyente de reactivo PAR Metpac (artículo Dionex nº 046094)

Reactivo de \hskip0.2cm post-columna:

\\[2.1mm]{}\hskip1.1cm detector de sal monosódica de 4-(2-piridilazo)resorcinol (PAR) 0,12 g/l

Longitud de onda:

530 nm

Temperatura:

25ºC

Caudal:

1,2 ml/minuto (eluyente A al 80%:eluyente B al 20%) en columna; eluyente C 0,6 ml/minuto postcolumna

Tamaño de la muestra:

100 \mul

Se muestran datos para las muestras preparadas de acuerdo con los ejemplos 1 a 3 en la figura 1. Se puede apreciar que los polisacáridos modificados eliminan iones de Fe^{3+} y Zn^{2+} del medio Eagle modificado de Dulbecco que contiene suero bovino con selectividades variantes.

Procedimiento 2

La capacidad de los materiales polisacáridos modificados para reaccionar con y eliminar radicales libres que contienen oxígeno se comprueba mediante el ensayo de DPPH descrito en el documento WO 94/13333, cuyo contenido completo se incorpora expresamente a esta invención como referencia. El ensayo se adapta a lo descrito por Blois M.S. en Nature 181: 1199 (1958), y Banda P.W. y col., en Analytical Letters 7: 41 (1974).

Brevemente, el polisacárido modificado en prueba (tamaños de muestra 2,5 mg; 5 mg, & 25 mg) se suspendió en 2,5 ml de tampón fosfato 0,1 M pH 7,0. Se añadió una solución de difenilpicrilhidrazilo (DPPH) en metanol (10^{-4} M) en una cantidad de 2,5 ml y se agitó la mezcla y se conservó en la oscuridad a 20ºC. Se valoraron las muestras mediante medida de su absorbancia de luz a 524 nm durante 6 horas en comparación con un control, prestando particular atención a la figura después de 4 horas. La reducción en porcentaje de absorbancia respecto al control después de 4 horas da el valor del ensayo de DPPH, con una reproducibilidad en general de \pm 5%. Este valor se puede expresar de forma conveniente en términos de una reducción simple en unidades de absorbancia (UA) respecto al control como se muestra en la figura 2 en la que la solución de control de DPPH que no contiene muestra de ensayo produjo una lectura de absorbancia de 0,506 UA. El ácido ascórbico, un antioxidante bien conocido, da una sustancia de control positivo útil para fines comparativos.

La aplicación de este ensayo a los productos de los ejemplo 1 a 3 dio lugar a valores de ensayo de DPPH de 80 a 90% para el control positivo (10^{-4} M) y para los tres materiales a su mayor concentración (0,5% en relación p/v) después de 4 horas, como se muestra en la figura 2. Por el contrario los polisacáridos no modificados quitina/quitosán e hidroxietilcelulosa mostraron valores de DPPH mucho menores, inferiores al 15%.

Las anteriores realizaciones se han descrito únicamente por medio de ejemplos. Serán evidentes para el lector especialista muchas otras realizaciones que se encuentran dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (28)

1. Una composición terapéutica que comprende un polisacárido modificado químicamente, en el que al menos un residuo de sacárido ha injertado en el mismo una cadena lateral que comprende dos o más grupos carboxilatos en los que la cadena lateral tiene sólo un enlace con el polisacárido, y en el que el polisacárido modificado es hidrófilo pero tiene una solubilidad inferior a aproximadamente 1 gramo por litro en agua a 25ºC.

2. Una composición terapéutica de acuerdo con la reivindicación 1, en la que uno o más funciones hidroxilo en las unidades de sacárido o en la cadena lateral se han transformado en una función tiol.

3. Una composición terapéutica de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en la que los dos grupos carboxilato están sustituidos 1,1 (geminalmente), 1,2 (vicinalmente) o 1,3 en dicha cadena lateral.

4. Una composición terapéutica de acuerdo con la reivindicación 2, en la que uno o más grupos hidroxilo en las unidades de sacárido se han transformado en grupos tiol.

5. Una composición terapéutica de acuerdo con la reivindicación 2, en la que uno o más grupos hidroxilo en cadenas laterales injertadas sobre las unidades de sacárido se han transformado en grupos tiol.

6. Una composición terapéutica de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en la que la cadena lateral está unida con la cadena de polisacárido mediante un enlace éster o amida.

7. Una composición terapéutica de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en la que la cadena lateral que porta los grupos carboxilato es un grupo lineal o ramificado o cíclico que comprende de 1 a 10 átomos de carbono de alquilo o alquileno, de forma opcional interrumpidos con -O-, -S--, -CO- o -NH-, que contiene de forma opcional al menos un doble enlace C=C, y de forma opcional está sustituido adicionalmente con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo -OH, -NH_{2} y halógeno.

8. Una composición terapéutica de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en la que al menos uno de dichos grupos carboxilato está unido a un átomo de carbono insaturado en dicha cadena lateral.

9. Una composición terapéutica de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en la que el polisacárido modificado comprende una cadena lateral de estructura general -X-COCH=C(COOH)CH_{2}COOH, en la que X es O o NH.

10. Una composición terapéutica de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en la que el polisacárido modificado es quitina/quitosán modificado o una celulosa modificada o una hidroxialquilcelulosa modificada o un alginato modificado.

11. Una composición terapéutica de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en la que están modificados al menos aproximadamente 1% de los residuos de sacárido de dicho polisacárido modificado.

12. Una composición terapéutica de acuerdo con la reivindicación 11, en la que están modificados al menos aproximadamente 5% de los residuos de sacárido.

13. Una composición terapéutica de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en la que el polisacárido modificado tiene una actividad de radical libre en el ensayo de difenilpicrilhidrazilo (DPPH) para actividad antioxidante como se define en esta invención de al menos aproximadamente 15%.

14. Una composición terapéutica de acuerdo con cualquier reivindicación precedente que es sustancialmente insoluble en agua.

15. Una composición terapéutica de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en la que el polisacárido modificado se compleja con iones de Fe^{3+} selectivamente frente a iones de Zn^{2+}.

16. Una composición terapéutica de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en la que el polisacárido modificado está predominantemente modificado en superficie.

17. Una composición terapéutica de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en la que los grupos carboxilato son grupos carboxilo.

18. Una composición terapéutica de acuerdo con cualquier reivindicación precedente en la forma de perlas, copos, polvo, una película, una almohadilla fibrosa, una red, una tela tejida o no tejida, una esponja secada por congelación, una espuma o cualquier combinación de las mismas.

19. Una composición terapéutica de acuerdo con alguna de las reivindicaciones 1 a 18, en la que la composición terapéutica es un apósito para herida.

20. Una composición terapéutica de acuerdo con cualquier reivindicación precedente que es estéril, y está envasada en un envase impermeable a los microorganismos.

21. Uso de una composición terapéutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una herida.

22. Uso de acuerdo con la reivindicación 21, en el que la herida es una herida crónica.

23. Uso de acuerdo con la reivindicación 22, en el que la herida crónica se selecciona del grupo constituido por úlceras de etiología venosa, arterial o mixta, úlceras por decúbito o úlceras diabéticas.

24. Uso de una composición terapéutica de acuerdo con alguna de las reivindicaciones 1 a 18 para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de lipodermatoesclerosis.

25. Un procedimiento para la producción de un polisacárido modificado para la fabricación de una composición terapéutica de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende la etapa de hacer reaccionar un polisacárido con un anhídrido cis-aconítico.

26. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 25, que comprende además la etapa de hacer reaccionar el polisacárido con reactivo de Lawesson de fórmula (V):

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27. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 26, en el que dicho reactivo de Lawesson de fórmula (V) se hace reaccionar con dicho polisacárido en una cantidad de al menos 0,1 moles por residuo de sacárido del polisacárido.

28. Un polisacárido modificado que se puede obtener mediante un procedimiento de acuerdo con alguna de las reivindicaciones 25 a 27.