ES2229302T3 - Mezcla estable para la deteccion de fosfatasa alcalina con una sal del acido o-cresolftaleina-monofosforico. - Google Patents
Mezcla estable para la deteccion de fosfatasa alcalina con una sal del acido o-cresolftaleina-monofosforico.Info
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Abstract
EL OBJETO DE LA PRESENTE INVENCION ES UNA MEZCLA ESTABLE PARA LA DETECCION DE FOSFATASA ALCALINA, CARACTERIZADO PORQUE LA MISMA CONTIENE UNA SAL N FTALEINMONOFOSFORICO Y N -METILGLUCAMINA, ASI COMO UN ELEMENTO ANALITICO PARA LA DETECCION DE FOSFATASA ALCALINA CON UNA MATRIZ QUE LLEVA ESTA MEZCLA. ADEMAS, ES OBJETO DE LA INVENCION, UN PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACION DE FOSFATASA ALCALINA CON UNA SAL DEL ACIDO O VENCION O CON UN ELEMENTO ANALITICO DE LA INVENCION, DE FORMA QUE EN PRESENCIA DE FOSFATASA ALCALINA SE OBSERVA UN CAMBIO DE COLOR. FINALMENTE, SON OBJETO DE LA INVENCION LA SAL DEL ACIDO O CRESOLFTALEINMONOFOSFORICO CON N EL PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACION DE DICHA SAL.
Description
Mezcla estable para la detección de fosfatasa
alcalina con una sal de ácido
o-cresolftaleína-monofosfórico.
La invención se refiere a una mezcla estable para
la detección de la fosfatasa alcalina, que contiene una sal del
ácido
o-cresolftaleína-monofosfórico. Es
también objeto de la invención un elemento analítico para detectar
la fosfatasa alcalina, que contiene una estructura (matriz) con un
sustrato de la enzima fosfatasa alcalina, que en presencia de la
enzima conduce a un cambio de color. Es también objeto de la
invención un procedimiento para la determinación de fosfatasa
alcalina con una sal del ácido
o-cresolftaleína-monofosfórico como
sustrato de enzima y con un aceptor de ácido fosfórico.
La determinación de la actividad de la fosfatasa
alcalina en los líquidos orgánicos humanos reviste una gran
importancia clínica. En la patente US-3 975 405 se
describe el uso del ácido
o-cresolftaleína-monofosfórico como
sustrato para la determinación de la fosfatasa alcalina. En calidad
de sales preferidas se mencionan las sales alcalinas,
alcalinotérreas y amónicas, así como las sales de aminas orgánicas
protonadas. Son ejemplos de tales aminas orgánicas protonadas el
ciclohexilamonio, el tetrametiletilendiamonio y el etanolamonio.
Para la ejecución de la detección de la fosfatasa alcalina en el
suero sanguíneo se utiliza el
o-cresolftaleína-monofosfato
disódico junto con la dietanolamina como aceptor de ácido fosfórico
que en concentración elevada (uno molar) actúa como tampón junto con
el cloruro magnésico. Sin embargo, esta sal del ácido
o-cresolftaleína-monofosfórico no es
estable a la hidrólisis no enzimática. Esto significa que incluso en
ausencia de la enzima a determinar ya descompone al
o-cresolftaleína-monofosfato y
forma color. Con ello se reduce la sensibilidad de la detección de
la fosfatasa alcalina, porque la medición tiene que realizarse en un
trasfondo de color intenso o bien puede darse incluso el caso de
simular la presencia de una enzima que realmente no existe.
En la solicitud de patente europea nº 0 182 179
se aborda este problema. En ella se recomienda separar físicamente
el sustrato de la enzima y el aceptor de ácido fosfórico antes de
realizar la detección, con el fin de aumentar la estabilidad de los
reactivos de detección de la fosfatasa alcalina y no ponerlos en
contacto hasta el momento de la reacción con el líquido de muestra a
analizar. Para ello se describe un elemento analítico de varias
capas, en el que el sustrato de la fosfatasa alcalina y el aceptor
de ácido fosfórico se hallan en capas diferentes. Se mencionan como
posibles sustratos de la fosfatasa alcalina las sales amónicas de
arilfosfatos, en las que el grupo arilo puede ser un grupo fenilo
sustituido por nitro, fenolftaleína, timolftaleína, arilo sustituido
por arilazo o fluoresceína y el grupo amonio puede ser entre otros
la N-metilglucamina. Se mencionan como receptores
preferidos del ácido fosfórico los aminoalcoholes, entre ellos la
N-metilglucamina. Los
o-cresolftaleína-monofosfatos no se
mencionan como posibles sustratos de la fosfatasa. Un inconveniente
importante del objeto de la solicitud de patente europea nº 0 182
179 consiste en la separación del sustrato y del aceptor de ácido
fosfórico. La incorporación de las sustancias en cuestión a capas
separadas de un elemento analítico es laborioso en el caso de la
fabricación de una tira analítica. Hay que tener en cuenta además
que cada capa absorbe un volumen de líquido de muestra. Precisamente
en el caso de utilizar elementos analíticos, la cantidad de líquido
de muestra disponible es a menudo muy pequeña y escasa. Por otro
lado, cuando se vierte la muestra líquida sobre las capas separadas
de sustrato y aceptor pueden surgir problemas de mezclado homogéneo
de sustrato, aceptor de ácido fosfórico y muestra, que pueden
desembocar en una gran dispersión de resultados.
El objetivo de la presente invención consiste por
tanto en superar los inconvenientes del estado de la técnica.
Esto se consigue con el objeto de la invención,
caracterizado en las reivindicaciones.
Es objeto de la invención una mezcla estable para
la detección de la fosfatasa alcalina que, como sustrato de enzima,
contiene la sal N-metilglucamina del ácido
o-cresolftaleína-monofosfórico y,
como aceptor de ácido fosfórico, contiene la
N-metilglucamina. Ambos están presentes con
preferencia en forma de mezcla homogénea separada.
Es también objeto de la invención un elemento
analítico para la detección de la fosfatasa alcalina, con
preferencia en una muestra líquida, que contiene una estructura
(matriz) con un sustrato de enzima fosfatasa alcalina, que en
presencia de la enzima conduce a un cambio de color, dicha
estructura (matriz) lleva la mezcla ya mencionada de la invención y
por consiguiente tanto el sustrato de enzima como el aceptor de
ácido fosfórico, en o sobre una capa.
Es también objeto de la invención un
procedimiento para la determinación de la fosfatasa alcalina con una
sal del ácido
o-cresolftaleína-monofosfórico como
sustrato de enzima y con un aceptor de ácido fosfórico, para ello se
pone en contacto la muestra a analizar con una mezcla de la
invención o con una elemento analítico de la invención y, en caso de
presencia de fosfatasa alcalina, se observa un cambio de color.
La sal del ácido
o-cresolftaleína-monofosfórico con
la N-metilglucamina es nueva. También lo es un
procedimiento para la obtención de dicha sal del ácido
o-cresolftaleína-monofosfórico con
la N-metilglucamina.
Se ha puesto de manifiesto de modo sorprendente
que una mezcla de la sal de N-metilglucamina del
ácido o-cresolftaleína-monofosfórico
y glucamina adicional, como aceptor de ácido fosfórico, que puede
emplearse para la determinación de la fosfatasa alcalina, es muy
estable a la hidrólisis no enzimática. Esto se cumple también cuando
la mezcla contiene sustancia tampón y todas las demás sustancias
requeridas para la detección de la fosfatasa alcalina. Precisamente
la presencia de la sustancia tampón y del aceptor de ácido fosfórico
se considera en la solicitud de patente europea nº 0 182 179 como
una causa importante de la hidrólisis no enzimática de los
sustratos de la enzima fosfatasa alcalina. En calidad de sal
N-metilglucamina del ácido
o-cresolftaleína-monofosfórico se
utilizan con ventaja la sal de la
D-N-metilglucamina y, como aceptor
de ácido fosfórico, se utiliza la
D-N-metilglucamina libre, es decir,
la añadida adicionalmente. La sal del ácido
o-cresolftaleína-monofosfórico puede
contener de 1 a 3 iones de N-metilglucamonio por
cada molécula de
o-cresolftaleína-monofosfato. El
o-cresolftaleína-monofosfato de la
presente invención contiene con preferencia de 2 a 3 iones
N-metilglucamonio por molécula. En la forma
especialmente preferida de ejecución, la sal del ácido
o-cresolftaleína-monofosfórico
contiene en promedio de 2,3 iones de
N-metilglucamonio por cada molécula de
o-cresolftaleína-monofosfato.
La mezcla de la invención es estable a la
hidrólisis no enzimática incluso en presencia de la sal sódica y/o
magnésica necesaria para la detección de la fosfatasa alcalina así
como en presencia de la sustancia tampón. La sustancia tampón está
presente en una cantidad tal que, para la detección de la fosfatasa
alcalina, se garantice un pH entre 10 y 12, con preferencia entre 10
y 11. El experto en la materia ya conoce las sustancias tampón
adecuadas. Únicamente a título de ejemplo y sin pretender que sea
exhaustiva se puede mencionar la siguiente lista: carbonatos,
boratos, fosfatos, sustancias tampón de Good, glutamato y aspartato.
La presencia de sal sódica y/o magnésica puede ser ventajosa para la
determinación de la fosfatasa alcalina, por consiguiente la
sustancia tampón puede estar presente por ejemplo en forma de dichas
sales o bien la sal sódica y/o magnésica pueden añadirse
adicionalmente a la mezcla estable de la invención.
Para ajustar las condiciones óptimas de la
actividad enzimática, la mezcla de la invención deberá contener con
ventaja en calidad de aceptor de ácido fosfórico por lo menos la
N-metilglucamina en una cantidad tal que el ácido
fosfórico, que se desprende del sustrato en presencia de la
fosfatasa alcalina, sea capturado por el aceptor de ácido fosfórico.
La mezcla estable de la presente invención contendrá con ventaja un
exceso de N-metilglucamina. La proporción molar
entre el sustrato de enzima y el aceptor de ácido fosfórico será por
lo menos de 1:1, con ventaja hasta 1:4. Obviamente se puede trabajar
también en otras proporciones, en el supuesto de que no se requieran
condiciones óptimas de actividad enzimática.
Aunque la sal alcalina del ácido
o-cresolftaleína-monofosfórico sea
muy inestable a la hidrólisis no enzimática, la sal de
N-metilglucamina es muy estable a la hidrólisis no
enzimática, incluso en presencia de concentraciones muy elevadas de
iones alcalinos.
La mezcla de la invención es muy estable en
solución. Sin embargo, en forma seca, es decir como mezcla de las
distintas sustancias secas, por ejemplo incluso en forma
liofilizada, e muy estable a la hidrólisis no enzimática. Puede
estar presente dentro o sobre una estructura (matriz) y formar parte
de este modo de un elemento analítico para la detección de la
fosfatasa alcalina. Se denomina estructura (matriz) cualquier
material en forma de capas, que sea capaz de contener la mezcla de
la invención sin influir negativamente en ella. En calidad de
materiales de la estructura (matriz) se toman en consideración en
general aquellos materiales que son capaces de recibir una solución
de la mezcla estable de la invención mediante hinchamiento o
absorción, por ejemplo por impregnación, o aquellos que pueden
recubrirse con la mezcla o que pueden fabricarse en presencia de la
mezcla de la invención y por ello la mezcla puede alojarse por sí
misma en el material que constituye la estructura (matriz). Lo
último es posible por ejemplo en caso de fabricación de capas de
tipo lámina con materiales filmógenos, que existen en presencia de
los componentes de la mezcla. En el marco de la presente invención
son especialmente preferidos los elementos analíticos que contienen
una estructura (matriz) porosa y absorbente, que se ha impregnado
con una solución de la mezcla de la invención y después se ha
secado. Como material de estructura (matriz) especialmente preferido
se emplea el
papel.
papel.
La estructura que lleva la mezcla de la invención
puede emplearse por sí misma como elemento analítico. También puede
ser ventajoso sujetar la estructura por ejemplo sobre un material
soporte inerte, que facilite la manipulación de la estructura. Estas
formas de ejecución son conocidas por ejemplo en las tiras de
análisis de orina. La estructura con la mezcla estable de la
invención puede estar contenida también en elementos analíticos de
varias capas, ya conocidos por el estado de la técnica. Puede formar
parte por ejemplo de un elemento analítico de varias capas, descrito
en la solicitud de patente europea nº 0 182 179, en tal caso la
estructura sustituye a la capa de extensión y la capa tampón de este
elemento analítico.
Para el análisis de la sangre total se ha
observado que es especialmente ventajoso utilizar un elemento
analítico como el descrito por ejemplo en la solicitud de patente
europea nº 0 461 392 a través de la figura 1. Sobre una lámina
soporte inerte (5), por ejemplo una lámina de plástico, se sujeta
una capa de transporte (2), que sirve para el acarreo del líquido de
la muestra desde la zona de recepción (7) hasta la zona de detección
(8). Como capa de transporte (2) es idóneo en principio cualquier
material que sea capaz de transportar el líquido a analizar desde la
zona de recepción (7) hasta la zona de detección (8) sin alterarlo,
de modo que no incida negativamente en el análisis. Es ventajoso en
especial utilizar como capa de transporte (2) un tejido no tejido
(vellón) de fibras de vidrio. Sobre la capa de transporte (2) se
sujeta, cubriéndola en parte, una capa (3) destinada a separar los
componentes corpusculares del líquido de muestra. En principio puede
utilizarse para ello cualquier material que permita separar de la
sangre los componentes corpusculares del líquido de muestra, en
especial los glóbulos sanguíneos, sobre todo los eritrocitos, no
dejando que estos alcancen en cantidades importantes la zona de
detección (8), de modo que no provoquen en ella ninguna
interferencia en la reacción de detección. Por lo demás, la capa
separadora (3) no debe provocar una alteración del líquido de
muestra, de modo que se altere la actividad de la fosfatasa alcalina
a analizar y se falsee el resultado. Se ha constatado que son
especialmente indicados como capa separadora (3) los tejidos no
tejidos de fibra de vidrio, descritos p.ej. en la patente europea nº
0 045 476. Sobre la capa separadora (3) se coloca con ventaja una
capa protectora (4), que impide que durante la introducción de la
muestra, por ejemplo mediante una pipeta, pueda dañarse la capa
separadora (3). Para ello ha dado buenos resultados una redecilla de
material inerte, por ejemplo de plástico. La capa protectora (4) y
la capa separadora (3) se sujetan sobre una lámina soporte inerte
(5). Tal sujeción puede efectuarse por ejemplo mediante una tira
autoadhesiva (6).
A los lados de la capa de transporte (2) se
sujeta una lámina soporte fabricada con plástico traslúcido con la
estructura (1) que contiene la mezcla de la invención. Tal sujeción
se efectúa con ventaja sobre una zona de pegado (9), por ejemplo
mediante una tira termoadhesiva. La estructura (matriz) (1) está
dispuesta de tal manera que, en caso de presionar hacia abajo la
lámina soporte traslúcida en dirección a la lámina soporte inerte
(5), pueda ponerse en contacto con la capa de transporte (2) de modo
que permita el paso del líquido.
Para la puesta en práctica del procedimiento de
la invención de determinación de la fosfatasa alcalina en muestras
líquidas se pone en contacto la muestra con una mezcla de la
invención, después de ello puede observarse un cambio de color, si
existe fosfatasa alcalina. Por lo general se detecta la fosfatasa
alcalina en líquidos corporales, por ejemplo sangre, o en muestras
extraídas de la sangre, como son el plasma o el suero. Obviamente,
también es posible analizar la presencia de fosfatasa alcalina en
otros líquidos. En principio se puede verter la mezcla de la
invención sobre la muestra a analizar, o al revés: se puede añadir
la muestra sobre la mezcla de la invención. Para el caso de que la
mezcla de la invención esté presente sin soporte, es decir, en forma
de polvo, de mezcla cristalina o en forma liofilizada, en la mayoría
de casos será ventajoso verter la mezcla sobre la muestra a
analizar.
Para el caso de que se utilice el elemento
analítico de la invención con una estructura (matriz) que lleve la
mezcla de la invención es ventajoso que la estructura se ponga en
contacto con el líquido a analizar. Por ejemplo, la estructura puede
sumergirse en el líquido a analizar. Para una forma especialmente
preferida de ejecución de la determinación de la fosfatasa alcalina
con un elemento analítico de la invención se vierte sangre total
sobre la capa protectora (4) del elemento analítico especialmente
preferido representado en la figura 1. La sangre penetra en la capa
separadora (3) y los eritrocitos se separan del plasma o del suero.
Por fuerzas capilares, el líquido resultante es absorbido hacia la
zona de detección (8). Presionando la lámina soporte con la
estructura de la invención (1) se pone en contacto la fase acuosa de
la capa de transporte (2) con la estructura (1). El líquido penetra
en la estructura y se inicia la reacción de determinación. La
reacción se observa visualmente, a través de la lámina soporte de la
estructura (1), gracias a la coloración que adquiere la estructura
(1) o bien se mide por fotometría de reflexión.
La sal de N-metilglucamina del
ácido
o-cresolftaleína-monofosfórico,
descrita como componente de la mezcla estable de la invención, es
nueva. Para su obtención se hace reaccionar el ácido
o-cresolftaleína-monofosfórico con
la N-metilglucamina. El experto en la materia ya
conoce la síntesis del ácido
o-cresolftaleína-monofosfórico por
la patente US-3 975 405. La
N-metilglucamina es un producto comercial. Se
utiliza con ventaja la
D-N-metilgluca-
mina.
mina.
La reacción del ácido
o-cresolftaleína-monofosfórico con
la N-metilglucamina se lleva a cabo con ventaja de
modo que se disuelve el ácido
o-cresolftaleína-monofosfórico en un
disolvente orgánico y se le añaden de dos a cuatro equivalentes de
la N-metilglucamina. Se separa por filtración la sal
precipitada y se purifica por recristalización en un disolvente
orgánico apropiado. Como disolvente orgánico idóneo como medio de
reacción han dado buenos resultados los alcoholes, por ejemplo el
etanol y en especial el metanol. Para la recristalización se toman
en consideración los disolventes no polares, por ejemplo el éter. La
sal del ácido
o-cresolftaleína-monofosfórico
obtenida de este modo contiene entre dos y tres iones de
N-metilglucamina por cada molécula de ácido
o-cresolftaleína-monofos-
fórico.
fórico.
Se ha puesto de manifiesto que la nueva sal del
ácido
o-cresolftaleína-monofosfórico es
especialmente indicada para la detección de la fosfatasa alcalina
porque el producto de descomposición enzimática de la
o-cresolftaleína posee un coeficiente de extinción
molar elevado y de este modo son posibles determinaciones muy
sensibles.
Dado que la misma amina orgánica se utiliza como
catión del sustrato de enzima y como aceptor de ácido fosfórico, la
preparación de la mezcla de la invención para la detección de la
fosfatasa alcalina resulta muy fácil. Además, esta mezcla es muy
estable a la hidrólisis no enzimática. Esto permite fabricar tales
mezclas sin cantidades notables de productos de hidrólisis, lo cual
se traduce en señales iniciales bajas en las mediciones y además
tales mezclas son estables al almacenaje. La presencia de iones
alcalinos, por ejemplo iones sodio, incluso en un gran exceso, no
influye en la estabilidad de la mezcla de la invención. Por el hecho
de que el elemento analítico de la invención posee una capa común
para el sustrato de enzima y para el receptor de ácido fosfórico se
facilita la fabricación. Además, al elemento analítico de la
invención le basta con poca cantidad de líquido de muestra, porque,
en lugar de las dos capas recomendadas por el estado de la técnica,
solamente la capa que contiene la mezcla de la invención tiene que
absorber el líquido de la muestra. Por otro lado, el uso de una sola
capa, que contiene el sustrato y el aceptor ya mezclados, conduce a
una mezcla homogénea en el momento de la recepción de la muestra, lo
cual se traduce en resultados reproducibles.
La invención se ilustra con mayor detalle
mediante los ejemplos siguientes.
Se sintetiza el ácido
o-cresolftaleína-monofosfórico con
arreglo a la patente US-3 975 405. Se disuelven 24 g
del ácido
o-cresolftaleína-monofosfórico en 94
ml de metanol y se le añaden 23 g de la
D-N-metilglucamina. La sal
N-metilglucamonio se aísla por precipitación en un
volumen 10 veces mayor de éter de dietilo. Se seca el precipitado
con vacío sobre ácido sulfúrico. Rendimiento: 44 g de la sal
o-cresolftaleínafosfato de
D-N-metilglucamonio.
Se disuelven 24 g del ácido
o-cresolftaleínafosfórico en 94 ml de metanol, se
ajusta el pH de la solución a 10,5 por adición de NaOH y se
precipita con un volumen 10 veces mayor de éter de dietilo. Se
separa el precipitado y se seca con vacío sobre ácido sulfúrico.
Rendimiento: 22 g de o-cresolftaleínafosfato
sódico.
Se impregna papel (papel de fibras largas,
fabricante: Schoeller, Gernsbach, Alemania; peso por unidad de
superficie: 12 g/m^{2}) con la mezcla de la invención, que se
fabrica del modo siguiente. Se mezclan:
| - agua, purificada | 500,0 ml |
| - hidróxido sódico (5N) | 91,0 ml |
| - D-N-glucamina | 187,4 g |
| - sal magnésica de ácido L-aspártico | 22,0 mg |
| - sal D-N-metilglucamina del ácido o-cresolftaleína-monofosfórico | 218,1 g |
y después se enrasa con agua hasta 1 litro.
Si es necesario se corrige el pH de la solución
con hidróxido sódico (5N) para ajustarlo a 11,0.
Una vez secado el papel impregnado se vierte
sobre dicho papel una muestra de suero sanguíneo, que contiene
fosfatasa alcalina. En función de la actividad enzimática se observa
un viraje de color del amarillo al violeta rojizo.
Se prepara un papel del modo descrito en el
ejemplo 3 con la mezcla de la invención para la detección de la
fosfatasa alcalina y se almacena a 50ºC durante varias semanas. Se
mide la extinción a 567 nm frente al agua después de determinados
intervalos de tiempo. En lugar de la sal
N-metilglucamonio del ácido
o-cresolftaleína-monofosfórico de la
invención, se prepara con arreglo al ejemplo 3 con la sal
o-cresolftaleína-monofosfato sódico,
obtenida con arreglo al ejemplo 2, una mezcla para la detección de
la fosfatasa alcalina y con ella se impregna el mismo papel de
fibras largas, de modo que se obtiene un elemento analítico similar
al descrito en el ejemplo 3. Se somete este papel a las mismas
condiciones de ensayo que el papel que contenía la sal de
metilglucamina.
En la tabla 1 se recogen los resultados obtenidos
al cabo de una semana y media y al cabo de tres semanas.
| Duración de | Extinción del papel | Extinción del papel con la |
| la prueba | con la sal sódica | sal N-metilglucamonio |
| 1,5 semanas | 2,664 | 1,022 |
| 3 semanas | 3,735 | 1,255 |
De la tabla se deduce que la sal sódica es mucho
más inestable a la hidrólisis no enzimática que la sal de
N-metilglucamonio.
Claims (6)
1. Mezcla estable a la hidrólisis no enzimática
para la detección de la fosfatasa alcalina, caracterizada
porque contiene la sal de N-metilglucamina del ácido
o-cresolftaleína-monofosfórico como
sustrato de enzima y la N-metilglucamina como
aceptor de ácido fosfórico.
2. Mezcla estable según la reivindicación 1,
caracterizada porque contiene la sal de la
D-N-metilglucamina y la
D-N-metilglucamina libre.
3. Mezcla estable según las reivindicaciones 1 ó
2, caracterizada porque la sal es la que contiene
2-3 iones de N-metilglucamonio por
cada molécula de
o-cresolftaleína-monofosfato.
4. Mezcla estable según una de las
reivindicaciones de 1 a 3, caracterizada porque está presente
en forma seca.
5. Elemento analítico para detectar la fosfatasa
alcalina, que contiene una estructura (matriz) con un sustrato de la
enzima fosfatasa alcalina, que en presencia de la enzima conduce a
un cambio de color, caracterizado porque la estructura lleva
una mezcla según una de las reivindicaciones de 1 a 4 y de este modo
tanto el sustrato de enzima como el aceptor de ácido fosfórico están
presentes dentro o sobre de una capa.
6. Procedimiento para la determinación de la
fosfatasa alcalina con una sal del ácido
o-cresolftaleína-monofosfórico como
sustrato de enzima y un aceptor de ácido fosfórico,
caracterizado porque se pone en contacto la muestra a
analizar con una mezcla según una de las reivindicaciones
1-4 o con un elemento analítico según la
reivindicación 5 y se observa un viraje de color cuando en la
muestra está presente la fosfatasa alcalina.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19632432 | 1996-08-12 | ||
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