ES2223051T3 - Vectores de adnc de alfavirus. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A MOLECULAS DE POLINUCLEOTIDO Y A SU USO PARA LA PRODUCCION DE PRODUCTOS DESEADOS DESPUES DE SU INTRODUCCION DENTRO EN CELULAS ANIMALES O HUMANAS. ADEMAS, LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A COMPOSICIONES FARMACEUTICAS QUE INCLUYEN DICHAS MOLECULAS DE POLINUCLEOTIDO Y A SU USO EN METODOS DE TRATAMIENTO TERAPEUTICO O PROFILACTICO.LA PRESENTE INVENCION ESTA TAMBIEN RELACIONADA CON EL USO DE TALES MOLECULAS DE POLINUCLEOTIDO EN ANIMALES PARA CONSEGUIR LA EXPRESION DE LOS PRODUCTOS DESEADOS, QUE PUEDEN SER RECUPERADOS A PARTIR DEL ANIMAL PERO NO DAN LUGAR A NINGUNA ACTIVIDAD BENEFICIOSA, P.EJ. TERAPEUTICA, EN EL CITADO ANIMAL. MAS ESPECIFICAMENTE, LA PRESENTE INVENCION ESTA DIRIGIDA A VECTORES DE ADNC DEL VIRUS ALFA COMPUESTOS DE ADNC RECOMBINANTE DE ADNC DERIVADO A PARTIR DE UN ALFAVIRUS Y HETEROLOGO, P.EJ. ADNC EXTRAÑO QUE CODIFICA UNA SUBSTANCIA DESEADA.

Description

Vectores de ADNc de alfavirus.

La presente invención se refiere a las moléculas de polinucleótidos y a su uso para la producción de los productos deseados, después de la introducción en células humanas o animales. Asimismo, la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden dichas moléculas de polinucleótidos y a su utilización en métodos de tratamiento profilácticos o terapéuticos. La presente invención también se refiere al uso de dichas moléculas de polinucleótidos en animales (con exclusión de los seres humanos) para lograr la expresión de los productos deseados, que se pueden recuperar de los animales pero que no dan lugar a ninguna actividad beneficiosa, por ejemplo, terapéutica, en el citado animal.

Más específicamente, la presente invención se dirige a los vectores de ADNc de un alfavirus, que comprenden ADNc recombinante, el cual consiste en ADNc derivado de un alfavirus y en ADNc heterólogo, es decir, extraño, que se codifica para una sustancia deseada.

El alfavirus es un género que pertenece a la familia Togaviridae, que tiene genomas de ARN monocatenarios de polaridad positiva dentro de un nucleocápside rodeado por una membrana que contiene proteínas virales del tipo espuela ("spike").

El género Alfavirus comprende, entre otros, el virus Sindbis, el virus Semliki Forest (SFV, Semliki Forest virus), el virus Ross River y los virus de encefalitis equina venezolana, occidental y oriental, que están íntimamente relacionados. En particular, los virus Sindbis y Semliki Forest se han estudiado ampliamente y el ciclo de vida, el modo de replicación, etc. de estos virus son bien conocidos y por ende, no es necesario que se los analice específicamente en la presente.

Los Alfavirus se replican muy eficazmente en las células animales, lo cual los hace valiosos como vectores para la producción de proteína y ácidos nucleicos en dichas células.

Los sistemas de expresión basados en el virus Sindbis se describen en los documentos de patente US-A-5.091.309 y US-A-5.217.879. Los vectores del virus Sindbis del documento de patente US-A-5.091.309 comprenden ARN derivado del ARN defectuoso interferente (DI, defective interfering) del Sindbis que tiene ARN heterólogo inserto en él.

En el documento de patente US-A-5.217.879 se describen moléculas de ARN del virus Sindbis recombinantes, auto-replicantes y auto-empacadoras, que comprenden una secuencia codificadora heteróloga y al menos una región de empalme del Virus Sindbis capaz de dirigir la síntesis del ARN mensajero subgenómico del virus Sindbis en una célula anfitriona. Las transcripciones de ARN se sintetizan in vitro por la transcripción del ADNc del Virus Sindbis que se ha insertado en un plásmido bajo el control de un promotor, como por ejemplo, el SP6. El promotor SP6 y otros promotores que se describen con relación a la transcripción del ADNc no son funcionales en las células animales o de seres humanos.

En el documento de patente WO 92/10578 (Garoff y Liljestrom) se describe un sistema de expresión basado en alfavirus. Un ejemplo ilustrativo de dichos virus es el virus Semliki Forest (SFV, Semliki Forest virus). Con anterioridad se había dado cuenta de que se había construido una copia de ADNc de tamaño real del genoma del ARN del SFV (Journal of Virology, Volumen 65, páginas 4107-4113, 1991). Mediante ingeniería, dicha copia se convirtió en un vector de transcripción del SP6 a partir del cual pueden transcribirse las moléculas de ARN genómicas del SFV de tamaño real in vitro. El ARN se puede transfectar en células animales, células en las que las moléculas de ARN soportarán una infección normal del virus del tipo salvaje, dado que las moléculas de ARN son de polaridad positiva y pueden funcionar como moléculas de ARN mensajero en las células. En la transfección, la primera porción del genoma se traduce en una poliproteína, que se auto-divide en cuatro proteínas no estructurales (nsP1-nsP4). Estas proteínas constituyen la replicasa del alfavirus y son las responsables de la producción de nuevas moléculas de ARN genómicas de extensión completa, así como también, de una especie de ARN subgenómica, partiendo de un promotor interno (el promotor 26S). También son responsables del cierre (capping) del extremo 5' de las nuevas moléculas de ARN. El plásmido del ADNc del pSFV4 se transformó nuevamente por ingeniería para obtener un plásmido de expresión de ADN general, eliminando partes de la región codificadora para las proteínas estructurales y reemplazando dichas porciones eliminadas con una región de unión para la inserción de secuencias codificadoras extrañas (Bio/ Technology; Volumen 9, páginas 1356-1361; 1991; Bio/ Technology, Volumen 11, páginas 916-920, 1993). Cuando las secuencias codificadoras de ADN extrañas se insertan en estos vectores, se obtienen grandes cantidades de proteína extraña cuando las proteínas estructurales del virus se traducen partiendo del subgenoma de ARN realizado por la replicasa del alfavirus.

De acuerdo con el documento de patente WO 92/10578, se provee una molécula de ARN que deriva de un genoma de ARN de un alfavirus y que es capaz de realizar una infección eficiente de las células animales, molécula de ARN que comprende las regiones genómicas completas del alfavirus, que resultan esenciales para la replicación de dicho ARN del alfavirus, y que comprende, además, una secuencia de ARN exógena capaz de expresar su función en dicha célula anfitriona, insertándose dicha secuencia de ARN exógena en una región de la molécula de ARN que no es esencial para la replicación de la misma. De acuerdo con el documento de patente WO 92/10578, dichas moléculas de ARN se pueden transferir a las células animales por medio de la transfección o empaque de dichas moléculas de ARN en partículas del alfavirus infecciosas para la posterior infección de las células animales. En ambos casos, la molécula de ARN transfectada o infectada podrá replicarse dentro de la célula animal diana y expresar la secuencias de ARN exógenas insertadas en dicha molécula de ARN. Dichas moléculas y estrategias para su expresión dentro de la célula se pueden usar como vacunas o estrategias de vacunación, con el propósito de prevenir o tratar una infección o el cáncer.

Como es difícil diseñar moléculas de ARN mediante la tecnología de ingeniería genética actual, se han llevado a cabo manipulaciones del genoma de los Alfavirus, tales como la inserción de secuencias codificadoras heterólogas, en la correspondiente molécula de ADNc. Posteriormente, la molécula de ADNc diseñada por técnicas de ingeniería se transcribió in vitro y las transcripciones de ARN obtenidas se usaron para transformar las células. Estas construcciones que comprenden la molécula de ADNc diseñada por ingeniería no pueden transcribirse en células animales o humanas porque los promotores usados para el control de transcripción no son funcionales en dichas células.

Obviamente, sería ventajoso si la molécula de ADNc pudiera usarse para transformar células y lograr la expresión de una sustancia deseada en estas células.

El documento de patente WO 90/11092 describe el uso de polinucleótidos descubiertos, como un producto farmacéutico que operativamente se codifica para un péptido biológicamente activo. Se propone que dichas moléculas se inyecten en el tejido para la expresión in vivo de dicho péptido. Específicamente, se sostiene que el polinucleótido es ADN y que el péptido puede funcionar como un antígeno y de este modo, se puede usar como una vacuna (véase también Science, Volumen 259, páginas 1745-1749; DNA and Cell Biology, Volumen 12, número 9, todo el volumen, 1993). No obstante, no se describen allí construcciones de ADNc virales recombinantes que comprendan secuencias codificadoras heterólogas, que puedan expresarse en células animales y humanas, ni tampoco se describe una construcción de ADNc que se transcriba en el ARN auto-replicante que codifica la replicasa necesaria para su replicación. Aunque el uso de ADN que se codifica para un polipéptido y para una polimerasa para transcribir el ADN se describe en el documento de patente WO 90/11092, la cantidad inicial de polimerasa se provee incluyendo el ARNm que se codifica para ello en la preparación, ARNm que luego es traducido por la célula.

De este modo, es un objeto de la presente invención proveer una molécula de ADNc recombinante complementaria a al ARN de un alfavirus y que comprende una secuencia de ADNc exógena, molécula que puede introducirse en células animales o humanas para lograr la transcripción o expresión de dicho ADNc, obteniéndose los productos deseados, tales como polinucleótidos o proteínas en las células que protegen a la molécula de ADNc.

De acuerdo con la presente invención, este objeto se logra colocando la molécula de ADNc completa bajo el control de transcripción de una secuencia promotora funcional en una célula animal o humana. Dicha secuencia promotora iniciará la transcripción por la polimerasa del ARN dependiente del ADN codificada por la célula anfitriona, es decir la célula animal o humana que protege a dicha molécula de ADNc.

En consecuencia, la presente invención se refiere a una molécula de ADNc que es complementaria a al menos una parte de un genoma de ARN de un alfavirus, molécula de ADNc que comprende el complemento de las regiones del genoma completo del ARN de un alfavirus, que son esenciales para la replicación de dicho ARN del alfavirus y que comprende además, una secuencia de ADNc exógena capaz de expresar su función en una célula anfitriona animal o humana, insertándose dicha secuencia de ADNc exógena en una región de la molécula de ADNc, que no es esencial para la replicación de la misma, y dicha molécula de ADNc, que es complementaria a al menos una parte del genoma de un alfavirus, que se coloca bajo el control de transcripción de una secuencia promotora funcional en dicha célula animal o humana.

La secuencia promotora de la presente invención puede comprender un promotor de origen eucariótico o procariótico. La región promotora también puede incluir elementos de control para la represión o aumento de la transcripción. Los promotores adecuados son el promotor precoz inmediato del citomegalovirus (pCMV, cytomegalovirus immediate early promotor) y el promotor de repetición de la terminal larga del virus del sarcoma de Rous (pRSV, Rous sarcoma virus), porque -en el caso de estos promotores y de otros similares- la transcripción es realizada por la polimerasa de ARN dependiente del ADN de la célula anfitriona. Además, se pueden usar los promotores SP6, T3 o T7 siempre que la célula se haya transformado de antemano con genes que codifican las moléculas de la polimerasa del ARN de los SP6, T3 o T7 que se insertan en el cromosoma o bien, permanecen episomales. La expresión de estos genes (SP6, T3, T7) que codifican la polimerasa del ARN depende de la polimerasa del ARN dependiente del ADN de la célula anfitriona.

De acuerdo con la presente invención, el inserto de ADNc exógeno comprende la secuencia codificadora para un producto deseado, convenientemente, una proteína o polipéptido biológicamente activa/o, por ejemplo una proteína o un polipéptido inmunogénica/o o antigénica/o o una proteína o polipéptido terapéuticamente activa/o.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, el inserto de ADNc exógeno comprende una secuencia complementaria a una secuencia de ARN, como por ejemplo, una secuencia de ARN antisentido, secuencia antisentido que se puede administrar a un individuo para inhibir la traducción de un polinucleótido complementario en las células de dicho individuo. El ADNc exógeno también puede comprender secuencias adicionales, tales como una secuencia complementaria a una secuencia de ARN, que es una secuencia ribozómica auto-divisoria. Convenientemente, el inserto del ADNc de la presente invención comprende una secuencia integral pero no se impide la aparición de una o más secuencias virales interruptoras.

Por definición, in vitro significa un proceso llevado a cabo fuera de un organismo vivo, en contraposición a in vivo que significa que el proceso se realiza dentro de un organismo vivo. De acuerdo con la presente invención, un organismo vivo también incluye las células vivas, tales como, las células eucarióticas o procarióticas cultivadas.

De acuerdo con la presente invención, la "transformación" significa la introducción en general de secuencias de polinucleótidos exógenas en el interior de una célula, eucariótica o procariótica, y la secuencia de polinucleótido exógena puede permanecer extracromosómica (episomal) o puede integrarse en forma estable en el genoma de la célula. El modo de transformación no es crucial, pero se puede usar cualquier medio conocido en la actualidad o que se pueda desarrollar en el futuro, de acuerdo con la invención.

El presente vector del ADNc del alfavirus se basa en el ADNc, que es complementario a una secuencia de ARN del alfavirus. Una vez transcripto desde el ADNc, bajo el control de transcripción del promotor heterólogo, el ARN del alfavirus podrá auto-replicarse por medio de su propia replicasa y por lo tanto, amplificar el número de copias de las moléculas de ARN recombinante transcriptas. La replicasa también cerrará los extremos 5' de cada una de estas moléculas. Como resultado de estos eventos, pueden obtenerse altos niveles de expresión de las secuencias de ADNc del inserto heterólogo in vivo en el animal o en el ser humano.

Contrariamente a lo expresado en el documento de patente WO 92/10578, la presente invención se dirige a una construcción de ADNc, que se puede introducir y transcribir per se en células animales o humanas, más que en las construcciones de ARN. No obstante, una vez que el ADNc se ha transcripto en el ARN, las posteriores etapas replicativas y la expresión genética son en principio, las mismas que se describen para los vectores en el documento de patente WO 92/10578.

A continuación, se describe una realización adecuada de la presente invención para ilustrar la presente invención sin restricciones de la misma. De acuerdo con esta realización, una molécula de ADNc que comprende los nucleótidos 1 a 8265 del pSFV1 (documento de patente WO 92/10578 y Bio/Technology, Volumen 9, páginas 1356-1361, 1991), que contiene un inserto heterólogo, por ejemplo, que codifica un antígeno viral (tal como la proteína de hemaglutinina de la influenza, la nucleoproteína de la influenza, la proteína de la membrana del VIH-1, el gag-pol del VIH-1, el nef del VIH-1) o una proteína terapéutica (tal como la hormona de crecimiento humana, interleucina-2, eritropoyetina o el factor VIII) o una ribozima o ARN antisentido, funcionalmente insertado en dirección 3' del promotor subgenómico del alfavirus, se clona bajo el promotor del CMV en un plásmido, de manera tal que la expresión del inserto del ADNc sea impulsada por el promotor del CMV. Partiendo desde el extremo 3' y en dirección 3' del Inserto de ADNc, se ubica una señal de terminación de la transcripción (por ejemplo, derivada del SV40) para detener la transcripción. Cuando este plásmido se transfiere a una célula animal, el promotor del CMV guiará la transcripción del inserto de ADNc con su inserto heterólogo para formar una larga molécula de ARN. Ésta se transportará al citoplasma donde se usa como ARNm para la traducción de las proteínas de la replicasa no estructurales del vector del SFV. Como la molécula de ARN inicialmente transcripta lleva las secuencias requeridas para su replicación, las proteínas de la replicasa iniciarán posteriormente la replicación de la molécula de ARN a los intermedios de la hebra minus. Posteriormente, la replicasa del SFV usará el promotor interno 26S que está en la hebra minus de la molécula de ARN recombinante, para producir la molécula de ARN mensajero que codifica la proteína heteróloga o que da lugar al ARN. Los eventos de replicación del ARN se han descrito en forma más detallada en el documento de patente WO 92/10578.

Se sabe que la replicación eficiente del genoma de un alfavirus requiere las terminaciones 5' y 3' adecuadas.

Así, de acuerdo con una realización adecuada de la invención se inserta una secuencia de ribozima auto-divisoria dentro de la región terminal del inserto de ADNc. Esta molécula de ribozima se ubica en el extremo 3' de la secuencia genómica del alfavirus, de manera tal que la misma, cuando se divide, genere el extremo 3' apropiado del alfavirus. En consecuencia, cuando se ha hecho la transcripción primaria y se ha terminado la elongación en la señal de detención de la transcripción (por ejemplo, SV40), la secuencia de riobozima, transportada dentro del dominio del extremo 3' de la transcripción se auto-dividirá para generar el extremo 3' adecuado.

De acuerdo con otra realización de la presente invención se consigue un extremo 3' exacto de la molécula de ARN del alfavirus con el uso de moléculas linealizadas del ADNc para la transfección inicial. De este modo, la síntesis del promotor resultará en una transcripción desfasada, confiriendo moléculas con los extremos 3' apropiados.

De acuerdo con una realización adecuada de la invención, en el ADNc recombinante, las regiones de la molécula de ADNc derivada del alfavirus comprenden secuencias complementarias a una porción 5' terminal, la(s) región (regiones) codificadora(s) para las proteínas no estructurales requeridas para la replicación del ARN, la región promotora subgenómica y una porción terminal 3' de dicho ARN viral.

Otra realización de la invención se refiere a un ADNc recombinante, en el que la secuencia de ADNc exógena codifica un polipéptido extraño o da lugar a un ARN, integrándose dicha secuencia en el ADNc complementario al ARN subgenómico del alfavirus, sustituyendo uno o más nucleótidos del mis-
mo.

Otra realización de la invención se refiere a un ADNc recombinante, en el que la secuencia de ADNc exógena codifica un polipéptido extraño o da lugar a un ARN, integrándose dicha secuencia en el ARN subgenómico del alfavirus sin sustituir ningún nucleótido del mismo.

Se puede usar una amplia variedad de orígenes de las células anfitrionas de animales (incluso, de seres humanos) de acuerdo con la presente invención. Dichas células anfitrionas se pueden seleccionar entre células de aves, mamíferos, anfibios, insectos y peces. Los ejemplos ilustrativos de las células de mamíferos son las células de seres humanos, mono, hámster, ratón y porcinos. Las células de aves adecuadas son las células de pollo.

Las presentes moléculas de ADNc se pueden usar para el tratamiento de una enfermedad infecciosa, del cáncer o de un trastorno metabólico o de otros tipos de deficiencias en los animales y los seres humanos. También se pueden usar para el tratamiento profiláctico o la vacunación de animales o seres humanos, para prevenir enfermedades infecciosas o el cáncer. Las moléculas constituyen en sí mismas productos farmacéuticos, que operativamente se codifican para un polipéptido biológicamente activo o que dan lugar a polinucleótidos biológicamente activos, tales como el ARN antisentido y se pueden administrar directamente como tales o en combinación con otros compuestos en los animales o seres humanos para la expresión de las secuencias deseadas.

De acuerdo con un aspecto de la invención, dichas moléculas se usan como moléculas de ADNc de plásmidos descubiertos y se pueden administrar por vía intramuscular, intradérmica, intranasal, epidérmica, mucosal, endovenosa o por cualquier otra vía.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, las presentes moléculas se mezclan con lípidos o con otros compuestos para mejorar el suministro (Trends in Biotechnology, Volumen 11, páginas 211-215, 1993). El ADNc también se puede unir a otras moléculas portadoras que se unen a los receptores celulares para la captación dentro de las células (Trends in Biotechnology, Volumen 11, páginas 202-205, 1993). Dichas estrategias combinadas se pueden usar por cualquier vía de administración. El ADNc descubierto también se puede administrar por medio de bombardeo de partículas (Current Opinion in Biotechnology, Volumen 4, páginas 583-590,1993).

Además, el presente polinucleótido del ADNc se puede administrar como parte del genoma de otro virus, como por ejemplo, un retrovirus. Anteriormente se había demostrado que la replicasa de alfavirus, cuando se produce a partir de un promotor viral heterólogo puede realizar de un modo eficiente la replicación de las moléculas de ARN del alfavirus (Journal of Virology, Volumen 65, páginas 6714-6723, 1991; Virus Research, Volumen 23, páginas 209-222, 1992).

La presente invención también se refiere a un método, en el que el presente ADNc, o las células cultivadas que comprenden este ADNc, se introduce(n) en un animal -salvo en un ser humano- para generar un producto por la expresión de dicho ADNc, producto que puede recuperarse a partir de dicho animal y que no tiene ningún efecto, lo cual beneficia a dicho animal individual en el cual se produce. Convenientemente, el producto de expresión se secreta en un fluido corporal, como por ejemplo la sangre, la leche o el líquido ascítico y se recupera recolectando dicho líquido. De acuerdo con una realización de este método, el producto de expresión tiene una actividad terapéutica o profiláctica y se recupera en un fluido corporal, como por ejemplo, la leche.

En otra realización de este método, se logra la expresión de un ADNc, que comprende ADNc exógeno que se codifica para una proteína o polipéptido inmunogénica/o o antigénica/o y provoca una respuesta de los anticuerpos, anticuerpos éstos que se recogen de dicho animal en un fluido corporal, tal como la sangre entera, el suero o el líquido ascítico.

De acuerdo con otra realización de este método, el ADNc comprende ADNc exógeno que se codifica para un determinante antigénico, antígenos o inmunógenos que se producen por la expresión del ADNc y se recuperan de dicho animal en un líquido corporal, como por ejemplo, la sangre entera o el suero.

Descripción de los dibujos

Figura 1: un sistema en capas de ADN/ARN. Se ilustra un vector de ADN de acuerdo con una realización de la presente, donde el ADNc del SFV que codifica las proteínas de la replicasa del SFV (GENES DE REPLICASA) se clona bajo el promotor del CMV (pCMV). Los genes exógenos (SECUENCIA EXÓGENA) se insertan después de la región de la replicasa, bajo el promotor subgenómico del SFV. Las secuencias 5' y 3' requeridas para la replicación del ARN del SFV se indican mediante casilleros negros. Las secuencias derivadas de SFV terminan con la secuencia poli-A (A). La secuencia de ribozima (R) auto-divisoria se sitúa inmediatamente después de la secuencia poli-A. Las secuencias requeridas para la terminación de la transcripción (del pCMV) y la poliadenilación de la transcripción se colocan últimas en la construcción (TERMINACIÓN DE LA TRANSCRIPCIÓN). El primer evento es la transcripción, desde el pCMV, de la construcción de extensión completa. Esto conlleva a la producción de una molécula de ARN que es de polaridad positiva con respecto a los genes de la replicasa, es decir, el ARN puede funcionar como un ARNm para la traducción de las proteínas de la replicasa (1). Inmediatamente después de la transcripción, la ribozima se auto-divide, separándose de la cadena (2). La molécula de ARN resultante se transporta al citoplasma de la célula (3). En el citoplasma, la primera parte del ARN se traduce para producir la replicasa del SFV (REP). Esta replicasa luego copiará el ARN completo en los intermediarios de la hebra minus (4). Los intermediarios de la hebra minus servirán entonces como plantillas para la producción, por la replicasa del SFV, de nuevas moléculas de ARN de hebra positiva de extensión completa (5), que posteriormente se pueden usar para nuevas rondas de síntesis de hebras minus, amplificando de esta manera la producción general del producto deseado (7). Los intermediarios de la hebra minus también sirven como plantillas para la producción de otras especias de ARN, ocurriendo la iniciación de la síntesis en el promotor subgenómico del SFV (flecha hacia la derecha) (6). Este ARN exógeno codifica la proteína exógena deseada o bien, de un modo alternativo, puede constituir en sí el producto final deseado (tal como una ribozima o una molécula antisentido) (8).

Figura 2: polinucleótido del ADNc del Alfavirus bajo el control de transcripción de un promotor heterólogo. A, un promotor heterólogo, tal como pCMV, pRSV, SP6; B, extremo 5' del ARN genómico del alfavirus que incluye las secuencias requeridas para la replicación de dicho ARN; C, región genómica de la región no estructural del alfavirus que codifica las proteínas de la replicasa nsP1, nsP2, nsP3 y nsP4; D, promotor sub-genómico (26S) de un alfavirus; E secuencia de ADNc heterólogo que se codifica funcionalmente (en el contexto del replicón subgenómico del alfavirus) para una proteína heteróloga o ARN; F, secuencias del extremo 3' requeridas para la replicación del ARN recombinante; G, secuencia Poli-A (puede ser opcional); H, señal eucariótica de detención de la transcripción, tal como una derivada del SV40.

Figura 3: polinucleótido del ADNc del alfavirus bajo el control de transcripción de un promotor heterólogo y que incluye una secuencia de ribozima auto-divisoria. A, un promotor heterólogo, tal como pCMV, pRSV, SP6; B, extremo 5' del ARN genómico del alfavirus, incluso las secuencias requeridas para la replicación de dicho ARN; C, región genómica de la región no estructural del alfa-virus que codifica las proteínas de la replicasa nsP1, nsP2, nsP3 y nsP4; D, promotor subgenómico (26S) de un alfavirus; E, secuencia del ADNc heterólogo que codifica funcionalmente (en el contexto del replicón subgenómico del alfavirus) una proteína heteróloga o ARN; F, secuencias del extremo 3' requeridas para la replicación del ARN recombinante; G, secuencia Poli-A (puede ser opcional); H, señal eucariótica de detención de la transcripción, tal como una derivada del SV40. La secuencia de la ribozima se presenta para ser insertada entre el tramo Poly-A y la señal de detención de transcripción de manera tal que cuando se auto-divide, genere el auténtico extremo 3' de una secuencia genómica del alfavirus.

Figura 4: actividad auto-divisoria in vitro de la ribozima de la hepatitis delta. Se usó el plásmido pSA1 como plantilla para la transcripción in vitro del ARN. Los productos de ARN se analizaron por electroforesis con gel de poliacrilamida y auto-radiografía.

Figura 5: actividad auto-divisoria de la ribozima de la hepatitis delta en el contexto del ARN del SFV. (A) Plásmido pSFV-H 1-Delta con la secuencia de la ribozima insertada en la posición 5284. (B) Análisis con gel de los productos divididos in vitro de ARN complementarios a pSFV-H1-Delta. Obsérvese que la forma no dividida y la forma 5' dividida de la transcripción primaria son tan grandes (5502 y 5284 respectivamente), que no se resuelven en el gel y apenas migran hacia el mismo.

Ejemplo 1 Actividad auto-divisoria in vitro de la ribozima de la hepatitis delta

Se linealizó el pSA1 (Nature, volumen 350, páginas 434-436, 1991) con BamHI antes de la transcripción. Se llevó a cabo la transcripción in vitro según se describiera anteriormente (Journal of Virology, volumen 65, páginas 4107-4113, 1991, Current Protocols in Molecular Biology, Unit. 16.20, 1994, Greene & Wiley Interscience) en presencia de 35SrCTP para marcar el ARN sintetizado. Después de 60 minutos de transcripción, un cuarto de la muestra se congeló a -80ºC. El resto se dividió en tres partes, de las cuales la primera se incubó a 56ºC durante 30 minutos en presencia de EDTA 25 mM. La segunda se incubó a 37ºC durante 30 minutos sin EDTA y la tercera, a 56ºC durante 30 minutos sin EDTA. Después de la incubación, se analizaron todas las muestras en un gel con secuenciamiento de poliacrilamida al 8% con tampón Tris-borato que contenía urea (Current Protocols in Molecular Biology, Greene & Wiley Interscience). El resultado se visualizó por auto-radiografía. Tal como se muestra en la Figura 4, después de 60 minutos de transcripción, aproximadamente el 50% del ARN de extensión completa sintetizado (100 nucleótidos) ya se había dividido en un producto más corto (de 85 nucleótidos) (franja 1). Se sabe que las altas temperaturas aumentan la actividad auto-divisoria, mientras que el EDTA inhibe a la misma, dado que su reacción depende de los iones magnesio (Nature, volumen 350, páginas 434-436, 1991). La franja 2 demuestra que no se produjo ninguna división adicional, ni siquiera a los 56ºC cuando se queló el magnesio de la reacción por el EDTA. En contraste, una nueva incubación del ARN a 37ºC (franja 3) o a 56ºC (franja 4) en ausencia del agente quelante demostró que hubo actividad auto-divisoria y que el ARN de extensión completa se acortaba progresivamente hasta convertirse en su producto de 85 nucleótidos.

Ejemplo 2 Actividad auto-divisoria in vitro de la ribozima de la hepatitis delta en el contexto del ARN del SFV

Para comprobar si la secuencia de ribozima puede funcionar en el contexto de una molécula de ARN del SFV, se sintetizó un fragmento de ADN que corresponde a una secuencia de la ribozima de la hepatitis delta del pSA1 y se clonó en el sitio de división de la endonucleasa de restricción Hindll 5284 de Helper 1 (Bio/Technology, vol 9, pages 1356-1361, 1991) para generar el plásmido pSFV-H1-Delta (Figura 5A). La clonación se llevó a cabo usando técnicas convencionales (Current Protocols in Molecular Biology, Greene & Wiley Interscience). El plásmido luego se linealizó con Spel y se llevó a cabo la transcripción in vitro como se describe en el EJEMPLO 1. La mitad de la muestra se congeló para el control, mientras que la otra mitad se incubó a 56ºC durante otros 60 minutos más. Luego las muestras se analizaron por electroforesis con gel y auto-radiografía, tal como se describe en el EJEMPLO 1. El resultado se muestra en la Figura 5B. La franja 1 representa el pequeño producto dividido (167 nucleótidos) generado durante la auto-división durante la transcripción. Cuando las transcripciones se incubaron por 60 minutos más a 56ºC (franja 2), se observa un marcado aumento en la especie de 167 nucleótidos, lo cual indica que la auto-división está progresando eficientemente.

Ejemplo 3 Auto-segmentación de la ribozima de la hepatitis delta in vivo, en el contexto del ARN de un SFV

Los plásmidos pSFV3-IacZ (Bio/Technology, volumen 9, páginas 1356-1361, 1991), pSFV-Helper 1 (BiolTechnology, volumen 9, páginas 1356-1361, 1991) y pSFV-H1-Delta se linealizaron con Spel y el ARN se sintetizó in vitro usando la polimerasa del ARN del SP6, según se describiera anteriormente. Inmediatamente después de la transcripción, se añadió EDTA a 25 mM y los ARN se pusieron en hielo. 20 \mud del ARN de LacZ se mezclaron con 20 \mul del ARN del Helper 1 ó con 20 ó 40 \mul del ARN del H1-Delta (dado que la auto-división se produce hasta en un 50% durante la transcripción; la duplicación de la cantidad del ARN del H1-Delta se diseñó para compensar la pérdida del ARN de extensión completa debido a este procesamiento). Los ARN mezclados se usaron después para transfectar las células renales de un hámster bebé (BHK, Baby Hamster Kidney) como se describiera anteriormente (Bio/Technology, volumen 9, páginas 1356-1361, 1991), para preparar un stock de virus mediante empaque in vivo del ARN del LacZ en las partículas del SFV (Bio/Technology, volumen 9, páginas 1356-1361, 1991). El sobrenadante de 24 horas de estos cultivos luego se usó para infectar monocapas de las células de BHK y después de 16 horas, las células se tiñeron con Xgal para visualizar la expresión de la beta-galactosidasa (proteína de LacZ). Usando diferentes cantidades del medio, fue posible determinar la titulación del stock de virus obtenido por la reacción de empaque in vivo. Sólo el ARN del Helper 1 soportó la producción de un stock infeccioso, dando lugar a una titulación de 5 x 10^{7} partículas infecciosas por ml (un total de 5 x 10^{8} partículas de 10^{7} células transfectadas). En contraste, ninguno de los experimentos que implicaban al ARN del H1-Delta produjo ningún virus detectable. Esto demuestra que la auto-división de la secuencia de la ribozima presente en el ARN de H1-Delta elimina eficazmente las secuencias 3' necesarias para la replicación de ARN, para que no pueda tener lugar la trans-complementación por la construcción helper.

Ejemplo 4 Expresión de LacZ de un vector en capas de ADN/ARN de acuerdo con la Figura 3

Un plásmido construido tal como se describe en la Figura 3, usando el promotor del CMV y que tiene, como secuencia heteróloga (E) el gen que codifica la proteína beta-galactosidasa de la células del Escherichia coli, se transfectó en 10^{6} células del BHK-21 usando Lipofectin (Life Technologies Inc. Gaithersburg, MD, EE.UU.). La transfección se realizó de acuerdo con las recomendaciones del proveedor. Para un vector de control, el mismo gen del LacZ se clonó como un fragmento del BamHI en el sitio de multiclonación del plásmido pBK-CMV (Stratagene Inc., La Jolla, CA, USA). Este plásmido expresa el gen de la beta-galactosidasa directamente del promotor del CMV. Después de 16 horas de incubación a 37ºC, se eliminó el medio y las células se lavaron con PBS y se fijaron a -20ºC, durante 5 minutos con 100% de metanol, seguido por un nuevo lavado con PBS. Las células se tiñeron con Xgal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D-galactopiranosida) según se describiera anteriormente (EMBO Journal, volumen 5, páginas 3133-3142, 1986). Después de la tinción, el experimento de control denotó la expresión de LacZ (Xgal positivo) en las células con una frecuencia de aproximadamente 0,03. En el experimento que usa la construcción en capas del ADN/ARN, la frecuencia de transfección fue de 0,005. En consecuencia, si bien la frecuencia de transfección en este experimento en particular fue más bien baja para el vector en capas de ADN/ARN, la expresión de beta-galactosidasa fue elevada, a juzgar por la tinción de Xgal. Por lo tanto, este experimento da evidencias del principio y de la viabilidad general de esta tecnología.

Claims (34)

1. Una molécula de ADNc complementaria a al menos parte del genoma del ARN de un alfavirus, molécula de ADNc que comprende el complemento de las regiones del genoma del ARN de un alfavirus completo, que son esenciales para la replicación de dicho ARN del alfavirus, y que además comprende una secuencia de ADNc exógena, capaz de expresar su función en una célula anfitriona animal o humana, insertándose dicha secuencia de ADNc exógena en una región de la molécula de ADNc, que no es esencial para la replicación de la misma, y colocándose dicha molécula de ADNc, que es complementaria a al menos parte del genoma de un alfa-virus, bajo el control de transcripción de una secuencia promotora funcional en dicha célula animal o humana.

2. La molécula de ADNc de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha secuencia promotora comprende un promotor precoz inmediato del citomegalovirius (pCMV) o un promotor de repetición de terminal larga del virus del sarcoma de Rous (pRSV, Rous sarcoma virus).

3. La molécula de ADNc de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha secuencia promotora comprende un promotor SP6, T3 ó T7, estando destinada dicha molécula de ADNc a la transformación de una célula anfitriona animal o humana, estando dicha célula anfitriona pre-transformada con genes que codifican las moléculas de la polimerasa del ARN del SP6, T3 ó T7, genes que se insertan en el cromosoma o bien, que permanecen episomales.

4. El ADNc de acuerdo con la reivindicación 1, 2 ó 3, en el que el ADNc complementario a las secuencias de ARN del alfavirus deriva del ARN del virus Semliki Forest (SFV, Semliki Forest virus).

5. El ADNc de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que la secuencia de ADNc exógena codifica una proteína o un polipéptido que comprende un determinante antigénico, siendo dicha proteína o polipéptido inmunogénica/o o antigénica/o.

6. El ADNc de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el ADNc exógeno codifica una proteína o un polipéptido que tiene actividad terapéutica.

7. El ADNc de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el ADNc exógeno da lugar a una molécula de ARN que funciona como una molécula antisentido.

8. El ADNc de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el ADNc exógeno también comprende ADNc que da lugar a una molécula de ARN que funciona como una molécula de ribozima.

9. El ADNc de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el inserto de ADNc exógeno lleva una secuencia auto-divisoria de ribozima que flanquea al extremo 3' correspondiente a la secuencia genómica del alfavirus o SFV.

10. El ADNc de acuerdo con la reivindicación 8, en el que la ribozima deriva del virus de la hepatitis delta.

11. El ADNc de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que las regiones de la molécula de ADNc derivada del alfavirus comprenden secuencias complementarias a una porción con terminal 5', la(s) región (regiones) codificadora(s) para las proteínas no estructurales requeridas para la replicación de ARN, la región promotora subgenómica y una porción terminal 3' de dicho ARN viral.

12. El ADNc de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que la secuencia de ADNc exógena codifica un polipéptido extraño o da lugar a ARN, integrándose dicha secuencia en el ADNc complementario al ARN subgenómico del alfavirus, sustituyendo uno o más nucleótidos de los mismos.

13. El ADNc de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que la secuencia de ADNc exógena codifica un polipéptido extraño o da lugar a ARN, integrándose dicha secuencia en el ARN subgenómico del alfavirus sin sustituir ningún nucleótido del mismo.

14. Un método para lograr la expresión del ADNc de acuerdo con cualquier reivindicación precedente en células animales o humanas cultivadas, comprendiendo el citado método poner en contacto las células cultivadas con el ADNc de manera tal que haga que el ADNc se asimile en el interior de las células cultivadas y que exprese su función en dichas células.

15. El método de acuerdo con la reivindicación 14, en el que el ADNc se introduce en las células como un polinucleótido descubierto por electroporación o bombardeo de partículas, o por transformación con la ayuda de adyuvantes o medios tales como microencapsulamiento o lípidos, polímeros no iónicos, moléculas portadoras que causan el suministro mediado por los receptores u otros compuestos que mejoran el suministro.

16. El método de acuerdo con la reivindicación 14, en el que el ADNc se combina con un vehículo del virus y se introduce en las células por medio de infección.

17. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14-16, en el que el ADNc se introduce en las células cultivadas por transformación, como por ejemplo, transfección o infección, in vitro y en el que además las células cultivadas que comprenden el ADNc han de introducirse en un animal, con exclusión de los seres humanos para obtener un producto por la expresión de dicho ADNc, producto que en una etapa posterior ha de recuperarse del animal.

18. Un método para lograr la expresión del ADNc de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en un animal, con exclusión de los seres humanos, en cuyo método el ADNc ha de introducirse en dicho animal, de manera que haga que el ADNc se asimile en el interior de las células de dicho animal y exprese su función en las citadas células, para producir así por expresión de dicho ADNc, un producto que en una etapa posterior ha de recuperarse del animal.

19. El método de acuerdo con la reivindicación 18, en el que el ADNc se combina con un vehículo del virus y se introduce en las células por medio de infección.

20. El método de acuerdo con la reivindicación 18, en el que el ADNc se introduce en las células como un polinucleótido descubierto por inyección, electroporación o bombardeo de partículas, o por transformación con la ayuda de adyuvantes o medios tales como la microencapsulamiento o lípidos, polímeros no iónicos, moléculas portadoras que causan el suministro mediado por los receptores u otros compuestos que mejoran el suministro.

21. El método de acuerdo con la reivindicación 17 ó 18, en el que el producto de expresión se secreta en un fluido corporal, tal como la sangre, la leche o el líquido ascítico y se recupera recolectando dicho fluido.

22. El método de acuerdo con la reivindicación 17 ó 18, en el que se logra la expresión de un ADNc, que comprende un ADNc exógeno que se codifica para una proteína o polipéptido inmunogénica/o o antigénica/o y provoca una respuesta de los anticuerpos, siendo recogidos los anticuerpos del animal en un fluido corporal, tal como la sangre entera, el suero o el líquido ascítico.

23. El método de acuerdo con la reivindicación 17 ó 18, en el que el ADNc comprende el ADNc exógeno que se codifica para un determinante antigénico, antígenos o inmunógenos que se producen por la expresión del ADNc y se recuperan del animal en un fluido corporal, como por ejemplo, sangre entera o suero.

24. Una preparación farmacéutica que comprende el ADNc de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-13 en una forma fisiológicamente administrable.

25. La preparación de acuerdo con la reivindicación 24, en la que el ADNc exógeno comprende una secuencia que se codifica para un polipéptido o proteína que comprende un determinante antigénico, que sirve como inmunógeno o antígeno en la preparación, constituyendo la preparación una vacuna para el tratamiento profiláctico o terapéutico de enfermedades tales como el cáncer o las enfermedades infecciosas.

26. La preparación de acuerdo con la reivindicación 24, en la que el ADNc exógeno comprende una secuencia que se codifica para una proteína o polipéptido que tiene actividad terapéutica, constituyendo dicha preparación una preparación terapéutica para el tratamiento de enfermedades, tales como los trastornos metabólicos, las enfermedades infecciosas o el cáncer.

27. La preparación de acuerdo con la reivindicación 24, en la que el ADNc exógeno comprende una secuencia de polinucleótidos complementaria a un ARN antisentido, preparación en la que dicho ARN antisentido sirve para inhibir la traducción de un polinucleótido complementario en células de un individuo después de la administración de la preparación a dicho individuo.

28. Una célula animal o célula humana que contiene una molécula de ADNc de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-13.

29. La célula de acuerdo con la reivindicación 28, que es una célula transformada en forma estable.

30. La célula de acuerdo con la reivindicación 28, en la que el ADNc se ha introducido en el interior de la misma, de acuerdo con el método de acuerdo con la reivindicación 15 ó 16, para lograr la expresión de dicho ADNc.

31. El método de acuerdo con la reivindicación 17, en el que las células transformadas consisten en células de acuerdo con la reivindicación 28 ó 29.

32. El uso del ADNc de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-13 en la preparación de un producto farmacéutico, de acuerdo con la reivindicación 24.

33. El uso de células humanas o animales cultivadas, transformadas in vitro con el ADNc de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en la preparación de un producto farmacéutico de acuerdo con la reivindicación 24 que constituye una preparación terapéutica para el tratamiento de los trastornos metabólicos, las enfermedades infecciosas o el cáncer, o que constituye una vacuna para el tratamiento profiláctico o terapéutico del cáncer o de las enfermedades infecciosas.

34. El uso de acuerdo con la reivindicación 33, en el que las células transformadas consisten en células de acuerdo con la reivindicación 28 ó 29.