ES2204985T3

ES2204985T3 - Procedimiento para la separacion de compuestos aromaticos de soluciones que contienen productos.

Info

Publication number: ES2204985T3
Application number: ES96117241T
Authority: ES
Inventors: Eckhard Dr. Schuler; Karl-Heinz Wenz
Original assignee: Aventis Behring GmbH
Current assignee: CSL Behring GmbH
Priority date: 1995-11-28
Filing date: 1996-10-28
Publication date: 2004-05-01
Anticipated expiration: 2016-10-28
Also published as: CA2191406C; ATE250430T1; DE19544297A1; AU706030B2; US5883256A; EP0776668A2; EP0776668B1; CA2191406A1; DE59610731D1; JP4047407B2; AU7199796A; JPH09183795A; EP0776668A3

Abstract

SE DESCRIBE UN PROCEDIMIENTO PARA LA RETIRADA DE COMPUESTOS AROMATICOS DE UNA DISOLUCION QUE CONTIENE UN PRODUCTO, EN PARTICULAR UNA DISOLUCION PROTEINICA, PONIENDO EN CONTACTO LA DISOLUCION CON UN MATERIAL DE SOPORTE. EL PROCEDIMIENTO SE LLEVA PREFERIBLEMENTE A CABO EN UNION CON UNA INACTIVACION VIRAL CON ACRIDINA O DERIVADOS DE LA ACRIDINA, Y HACE POSIBLE EL RETIRAR DE LA DISOLUCION ESTOS INACTIVADORES VIRALES, SIN QUE OCURRAN PERDIDAS SIGNIFICANTES DEL PRODUCTO O CAMBIOS EN LA ACTIVIDAD BIOLOGICA DE LA DISOLUCION.

Description

Procedimiento para la separación de compuestos aromáticos de soluciones que contienen productos.

El presente invento se refiere a un procedimiento para la separación de compuestos aromáticos de soluciones que contienen productos.

Desde hace tiempo, compuestos aromáticos tales como, por ejemplo, acridina o derivados de acridina encuentran aplicación en medicina, por ejemplo en el tratamiento de heridas. Además de esto, se sabe que con ayuda de acridina y derivados de acridina se pueden inactivar tanto a los virus encapsulados como también los virus acapsulados tales como, por ejemplo el poliovirus. En este caso, circunstancialmente es muy importante separar estos compuestos después de su aplicación para la inactivación de virus, de modo que su concentración en el producto final permanezca siendo toxicológicamente inocuo aún en el caso de un tratamiento de larga duración.

Un método sencillo para la separación de acridinas de una solución consiste en su desalinización. De este modo, en diferentes procedimientos de purificación de proteínas se separó, por ejemplo, Rivanol® por desalinización del producto. Sin embargo, este modo de proceder tiene diversos inconvenientes en referencia a una eventual aplicación a las proteínas plasmáticas: por un lado, una parte de las proteínas, y con ello del producto, pueden precipitar conjuntamente, lo que conduce a pérdidas de rendimiento. Por otro lado, en un modo de proceder de este tipo la separación de acridina o, respectivamente, sus derivados no es completa después de esta etapa. En un procedimiento de proceso farmacéutico, un agente añadido se debería poder empobrecer de nuevo, después de su utilización, de manera tan drástica que sólo unas pocas ppm queden contenidas en el producto, en forma no ligada. Esto es importante sobre todo en el caso de la preparación de sustancias que deban ser administradas varias veces, por ejemplo en el marco de una terapia de larga duración.

La separación de sustancias anfífilas no desnaturalizantes a partir de productos de proteínas plasmáticas por precipitación de las proteínas plasmáticas se da a conocer en el documento EP-A-0 050 061. Sin embargo, muchas veces, una precipitación como la anteriormente descrita no es conveniente para obtener un producto de elevada pureza.

Un procedimiento para la separación de productos químicos de proceso, solubles en lípidos, de un material biológico, por cromatografía de intercambio, hidrófuga, en una resina C-6 a C-24 se da a conocer en la memoria de patente europea nº 0 366 946.

Un procedimiento parecido, que se puede utilizar en un sistema de "flujo constante" para la elaboración de sangre o productos de la sangre, se describe en el documento WO 95/00631.

En el documento EP 0 312 248 se describe un procedimiento para la purificación de derivados de acridina, entre otros mediante cromatografía en fase inversa.

Por lo tanto, un objeto del presente invento es poner a disposición un procedimiento con el cual se puedan separar compuestos aromáticos a partir de soluciones que contienen productos, especialmente que contienen proteínas, sin que aparezcan al mismo tiempo variaciones significativas de la composición del producto o de la estructura de los componentes individuales. En este caso, se debe mantener en gran medida una existente actividad biológica de la solución.

Otro objeto se ha de ver en plantear el procedimiento de tal modo que se puedan separar de la solución los compuestos aromáticos unidos a los productos o, respectivamente, que se pueda impedir o al menos inhibir la unión de compuestos aromáticos a los productos.

Se encontró, ahora, que se pueden eliminar compuestos aromáticos de una solución acuosa que contiene proteínas o péptidos con actividad biológica, por la puesta en contacto de la solución con un material de soporte, estando modificado el material de soporte por radicales alquilo C_{1} a C_{5}, y separándose a continuación del material de soporte la solución que contiene proteínas o péptidos.

Preferentemente, se separan de la solución acridina, hipericina, psoraleno, azul de metileno y derivados de estos compuestos. En especial, se separan de la solución preferentemente acridina y/o un derivado de acridina.

Derivados de acridina son, por ejemplo, etacridina, 9-aminoacridina (= aminacrina), 3,6-acridindiamina (proflavina), acrisorcina, cloruro de acrizano (= cloruro de fenacridano), naranja de acridina, quinacrina, acricida, acridon, ácido acridin-9-carboxílico, acranil (dihidroclo-ruro de 1-[(6-cloro-2-metoxi-9-acrinidil)-amino]-3-(dietil-amino)-2-propanol), cloruro de 3,7-diamino-5-fenilfenacinio (fenosafranina, safranina B extra), fenoxazina, fenotiazina y acriflavina (cloruro de 3,6-diamino-10-metilacridinio), así como sus sales tales como, por ejemplo, cloruros, sulfatos y bromuros. Derivados de acridina preferidos son proflavina y acriflavina.

En el procedimiento conforme al invento, como solución que contiene producto se prefiere especialmente una solución de proteínas o una solución de péptidos. De modo igualmente preferido, se emplean soluciones acuosas. La solución puede abarcar, por ejemplo, los siguientes materiales de partida:

plasma sanguíneo, suero sanguíneo, crioprecipitado, fibrinógeno, trombina, protrombina, factor V, factor VII, factor VIII, factor IX, factor X, factor XII, factor XIII, antitrombina III, albúmina, prealbúmina, \alpha1-globulina, \beta-globulina, gamma-globulina, inmunoglobulina G, inmunoglobulina M, inmunoglobulina A, inmunoglobulina D, inmunoglobulina E, fibrinógeno, fibronectina, \alpha1-antiplasmina, antitripsina, plasminógeno, plasmina, uroquinasa, prouroquinasa, PAl-1, PAl-2, proteína C, proteína S, inhibidor de la proteína C, suero liofilizado, fracción I, fracción II, fracción III, fracción IV, fracción IV-1, fracción IV-2, fracción IV-3, fracción IV-4, fracción V, fracción VI, proteína ligadora de retinol, transferrina, quininógeno, activante del plasminógeno tisular, calicreína, trombomodulina, vitronectina, GC-globulina, macroglobulina, inhibidor de la proteinasa leucocitaria, factores del crecimiento, sobrenadante del cultivo celular de células normales y permanentes, extractos de células normales y permanentes, sangre entera, líquidos corporales, suspensiones de células, sobrenadantes de cultivos celulares, extractos de hibridomas, extractos de tejidos de origen animal o vegetal, extractos o sobrenadantes de microorganismos, secreciones de células transgénicas o, respectivamente, de animales, soluciones de cultivo, extractos o suspensiones de células vegetales, extractos de órganos, leche, preparaciones de antígenos o vacunas.

Conocidos materiales de soporte en forma de gel modificados polarmente se comercializan bajo la marca comercial LiChroprep CN®, LiChroprep NH_{2}® y LiChroprep Diol® por la razón social Merck (Darmstadt). A estos materiales de soporte pertenecen también polimerizados mixtos como el producto comercializado por Biosepra bajo la marca comercial SDR Hyper D®-Gel.

Para mantener lo más baja posible una pérdida de rendimiento del producto, se utilizan materiales de soporte modificados de forma hidrófuga, con grupos laterales cortos, puesto que éstos manifiestan una escasa afinidad hacia las proteínas. Por grupos laterales cortos se entienden aquí los grupos que presentan 1 a 5 átomos de carbono, especialmente radicales alquilo(C_{1}-C_{5}). Preferidos de modo particular son los geles de sílice, que están modificados de forma hidrófuga con radicales etilo.

En esta categoría de materiales de soporte entran, por ejemplo, los siguientes productos comerciales: LiChroprep RP-2 (razón social Merck, Darmstadt), gel de sílice 60 silanizado (razón social Merck, Darmstadt) y TMS-250 (radical alquilo(C_{1}), bloqueado terminal con grupos trimetilsililo; razón social TosoHaas).

Para reducir la interacción hidrófuga del producto con el material de soporte y reducir, con ello, pérdidas de rendimiento es ventajoso, en este caso, bloquear los grupos cargados del material de soporte, por ejemplo con grupos dimetilsililo o trimetilsililo. En este grupo de materiales de soporte entran, por ejemplo, ODS-Prep (C18, bloqueado terminal, razón social TosoHaas) y Prep C18 (de la razón social Waters).

Conforme al invento, la puesta en contacto de la solución con el material de soporte puede tener lugar por cromatografía en columna o cromatografía discontinua. Además, existe la posibilidad de poner en contacto la solución con el material de soporte por filtración a través de éste o por inundación del material de soporte. En este caso, la solución se hace fluir a través o sobre un dispositivo adecuado, por ejemplo una membrana, que contiene el material de soporte o que está recubierta por éste. Por ejemplo, es adecuada una membrana sobre la cual está inmovilizada el grupo funcional, especialmente un grupo hidrófugo o cargado. Preferentemente, los compuestos aromáticos se deberían separar de una solución que contenga hasta 50 mg/ml de estas sustancias. El contenido remanente de compuestos aromáticos en la solución, después de la puesta en contacto con el material de soporte, se puede determinar, después, mediante fotometría, por ejemplo fotometría de fluorescencia. Preferentemente, el contenido remanente se sitúa en menos de 1 ppm y, de modo particularmente preferido, en menos de 0,1 ppm.

El contenido remanente de compuestos aromáticos que permanece en la solución después de la puesta en contacto con el material de soporte hay que atribuirlo, entre otras causas, a la unión de compuestos aromáticos al producto, especialmente a proteínas. Conforme al invento este contenido remanente se puede seguir reduciendo añadiendo a la solución, antes de la puesta en contacto con el material de soporte, un aditivo, el cual impida en gran medida la unión de compuestos aromáticos a las proteínas, o que desprenda de nuevo los compuestos aromáticos ya unidos.

Como aditivos son adecuados, en este caso, sustancias hidrófugas y anfífilas tales como detergentes, los cuales se pueden añadir a las soluciones en una concentración de 0,1 - 5%, preferentemente de 0,2 - 1,5% y, de modo muy preferido, de 0,3 - 1,2%.

Si a la separación de productos aromáticos le antecede una inactivación de virus por acridina o derivados de acridina, entonces se dan dos posibilidades para la adición del aditivo. O bien la unión de acridina y derivados de acridina a las proteínas se reduce ya en la activación de los virus por acridina y derivados de acridina, bloqueando los dominios hidrófugos de las proteínas por adición de sustancias hidrófugas o, respectivamente, anfífilas, o bien la acridina o, respectivamente, derivado de acridina ya unido, se desaloja después de la inactivación de los virus por una sustancia hidrófuga o, respectivamente, un detergente. El desprender nuevamente del producto de la tanda de solución la acridina o derivado de acridina unido a la proteína, tan sólo después de una inactivación de virus, es interesante sobre todo cuando la adición de una sustancia concreta anfífila o, respectivamente, detergente fuera a interferir negativamente con el método de inactivación de virus. En este caso, la adición de un aditivo con el fin de desprender acridina y derivados de acridina unidos a las proteínas sólo es posible después de la propia inactivación de los virus por acridina o derivados de acridina.

Preferentemente, el aditivo se separa de la solución al mismo tiempo que el compuesto aromático. Particularmente preferido es el procedimiento conforme al invento, según el cual la separación simultánea de acridina y/o derivados de acridina y detergentes, por ejemplo Triton X-100, tiene lugar con ayuda de una cromatografía en fase inversa por unión de estas sustancias a un material de soporte de sílice, al cual están unidos grupos laterales C_{1} a C_{24}.

Como aditivos son adecuados, por ejemplo, polivinil-alcoholes (PVA), polivinilpirrolidona, Tween® 20, Tween® 40, Tween® 60, Tween® 80, Nonidet® P40, polietilenglicoles, desoxicolato, CHAPS, alquilfenol oxietilado (por ejemplo Triton® X-100), polioxietileno parcialmente esterificado con ácido graso (por ejemplo Myrj 45), derivados de polioxietileno-alcoholes grasos (por ejemplo Brij), dodecil-N-betaína, palmitoillisolecitina, dodecil-\beta-alanina, ácido N-dodecilaminoetanosulfónico, bromuro de tetradecilamonio, cloruro de hexadeciltrimetilamonio, cloruro de dodecilpiridinio, condensados de óxido de etileno-óxido de propileno (copolímeros de bloque plurónicos), bromuro de cetiltrimetilamonio, cloruro de dodeciltrimetilbencilamonio (Triton® K-60), aminas oxietiladas (etomeas), alquilfenol oxietilado sulfatado (Triton® W-30), colato de sodio, desoxicolato de sodio, Igepon A (sulfoetilsulfonato de sodio), Igepon T (N-oleil-etanol-sulfonato de N-metilo) y Nacconol® NR (dodecil-bencenosulfonato de sodio).

La denominación química de los nombres comerciales utilizados se indica a continuación, siempre que no se haya citado anteriormente:

Tween® 20:} monolaureato de poli(oxietileno)_{n}-sorbitano

Tween® 40:} monopalmitato de poli(oxietileno)_{n}-sorbitano

Tween® 60:} monoestearato de poli(oxietileno)_{n}-sorbitano

Tween® 80:} monooleato de poli(oxietileno)_{n}-sorbitano

Nonidet® P40: etilfenolpoli(etileno)_{n}-glicoléter

CHAPS: 1-propanosulfonato de 3-[(3-colamidopropil)-dimetilamonio]

Triton® X-100: octilfenolpoli(etilenglicoléter)_{n}

En otra forma de ejecución, el procedimiento conforme al invento va a continuación de un procedimiento para la inactivación de virus por acridina y/o derivados de acridina. Un procedimiento para la preparación de plasma sanguíneo inactivado contra virus puede abarcar, por ejemplo, la adición de acridina y/o derivados de acridina al plasma sanguíneo, una incubación de la acridina y/o derivado de acridina con el plasma sanguíneo y la separación de la acridina y/o derivado de acridina del plasma sanguíneo tal como se ha descrito anteriormente. La acridina y/o derivados de acridina se añaden, en este caso, preferentemente en una cantidad de 10 \mug hasta 100 mg por litro. La incubación puede tener lugar durante 1 - 6 horas y todo el procedimiento se lleva a cabo preferentemente a una temperatura de 2ºC a 50ºC, especialmente a 10ºC hasta 37ºC o 10ºC hasta 25ºC.

En otra forma de ejecución de este invento, al procedimiento para la inactivación de virus después de la etapa de incubación se añade un aditivo, el cual inhibe en gran medida la unión de acridina y derivados de acridina a las proteínas o, respectivamente, desprende de nuevo acridina y derivados de acridina ya unidos. Para ello, se añaden preferentemente detergentes tales como Triton X-100 o Triton X-114 en una concentración de hasta el 1%, preferentemente 0,2% - 0,8% y, de modo muy preferido, 0,4% - 0,7%. A continuación, la acridina y/o los derivados de acridina se separan preferentemente junto con el aditivo, en una etapa, a través de una columna de cromatografía con material de soporte hidrófugo, especialmente un material de C_{2}, por ejemplo una columna LiChroprep-RP.

En esta forma de ejecución se prefiere, además, mezclar la solución inactivada de virus con Triton X-100 e incubarla durante 5 - 60 minutos, preferentemente 5 - 30 minutos, por ejemplo bajo agitación, y separar después a través de una columna de cromatografía, tanto la acridina y/o derivados de acridina, como también el Triton X-100.

El procedimiento conforme al invento tiene la ventaja de que se pueden separar compuestos aromáticos de una solución que contiene productos, especialmente una solución de proteínas, sin que al mismo tiempo se modifique la composición del producto o sin una modificación de la actividad biológica de esta solución. Además, de la combinación de un procedimiento para la inactivación de virus con acridina y/o derivados de acridina con el procedimiento conforme al invento para la separación de estas sustancias de la solución resulta la ventaja de que todavía en la cromatografía del material que contiene virus quedan retenidos por el material de soporte otros virus aún no inactivados por acridina o, respectivamente, derivados de acridina (por ejemplo virus acapsulados tales como, por ejemplo, parvovirus o virus encapsulados tales como, por ejemplo, virus BVDV) y, con ello, son separados de la solución del producto, por lo que se aporta una contribución adicional para el empobrecimiento general de virus en un procedimiento de producción.

Una ventaja más resulta en el caso del empleo de materiales de soporte C_{2}, modificados de forma hidrófuga, puesto que la unión de compuestos aromáticos de una solución acuosa transcurre rápidamente y de forma efectiva, tanto como no se une ningún material hidrófugo (por ejemplo proteínas de origen no viral) y, con ello, las eventuales perdidas de producto se mantiene bajo mínimos. Esto permite, por ejemplo, la rápida separación de compuestos aromáticos de soluciones de proteínas que contienen virus, con rendimientos de proteínas y de actividad muy elevados.

Los siguientes ejemplos deben ilustrar con más detalle el invento. Con excepción de los datos de la concentración de acriflavina y, respectivamente, proflavina - éstos se indican en % en peso - los datos de las concentraciones se refieren a % en volumen.

Ejemplo 1 Separación de 0,001% de acriflavina de una solución que contiene factor VIII, con LiChroprep RP-2

En este ejemplo y en los siguientes ejemplos, a excepción de los datos para la acriflavina - o, respectivamente, la concentración de proflavina - éstos se indican en porcentajes en peso - los datos de concentración se indican en porcentajes en volumen, así por ejemplo los datos para PVA y Triton en los Ejemplos 2 y 3.

A 20 ml de una solución, que contiene factor F VIII y factor de von Willebrand con un DO_{280-320} de 2,5 y un valor del pH de 6,9, se añade 0,001% de acriflavina. A continuación, la tanda se bombea a través de una columna, que contiene 4 ml de LiChroprep RP-2. El flujo de líquido contiene ya sólo 0,2 ppm de acriflavina. La determinación de la acriflavina tiene lugar fotométricamente a 450 nm.

Ejemplo 2 Separación con LiChroprep RP-2 de 0,001% de acriflavina en presencia de polivinilalcohol o de polivinilpirrolidona, de una solución que contiene factor VIII

A 20 ml de una solución, que contiene factor F VIII y factor de von Willebrand con un DO_{280-320} de 2,5 y un valor del pH de 6,9, se añade acriflavina hasta una concentración final de 0,001% y polivinilalcohol PVA (Hoechst AG) o polivinilpirrolidona PVP K60 (BASF) en diferentes concentraciones. A continuación, la tanda se bombea a través de una columna, que contiene 4 ml de LiChroprep RP-2. A continuación, se determina fotométricamente el contenido en acriflavina en la solución de proteínas. Tal como se puede ver en la siguiente Tabla 1, tanto con PVA como también con PVP se puede impedir, en función de la concentración, la unión no específica de acriflavina a la proteína.

TABLA 1 Influencia de PVA y PVP sobre la concentración de acriflavina remanente en el producto

Aditivo	Concentración en la tanda [%]	Concentración remanente de acriflavina
PVA	0,1%	0,3 ppm
PVA	1,0%	<0,1 ppm*)
PVA	2,0%	<0,1 ppm*)

*) el límite de detección fotométrico está en 0,1 ppm.

Ejemplo 3 Separación, con ayuda de LiChroprep RP-2, de 0,001% de acriflavina de una solución que contiene factor VIII, después de la adición de Triton X-100

A 20 ml de una solución, que contiene factor F VIII y factor de von Willebrand con un DO_{280-320} de 2,5 y un valor del pH de 6,9, se añade acriflavina hasta una concentración final de 0,001%. Después de un tiempo de incubación de 4 horas, a la tanda se añade, además, Triton X-100 en diferentes concentraciones y, al cabo de 10 minutos de agitación, la tanda se bombea a través de una columna que contiene 4 ml de LiChroprep RP-2. A continuación, el contenido en acriflavina se determina fotométricamente en la solución de proteínas. Tal como se puede ver en la Tabla 2 siguiente, con Triton X-100 se puede desalojar la acriflavina de su unión no específica a la proteína, de manera dependiente de la concentración.

TABLA 2 Influencia de Triton X-100 sobre la concentración de acriflavina remanente en el producto

Aditivo	Concentración en la tanda	Concentración remanente de acriflavina
	[%]	acriflavina
Triton X-100	0,1%	0,4 ppm
Triton X-100	0,2%	0,2 ppm
Triton X-100	0,4%	<0,1 ppm*)
Triton X-100	0,5%	<0,1 ppm*)

*) el límite de detección fotométrico está en 0,1 ppm.

Claims

1. Un procedimiento para la separación de compuestos aromáticos de una solución acuosa, que contiene proteínas o péptidos con actividad biológica, poniendo en contacto esta solución con un material de soporte, el cual está modificado por radicales alquilo C_{1} a C_{5} y, a continuación, la solución que contiene proteínas o péptidos se separa del material de soporte modificado.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el compuesto aromático se selecciona del grupo constituido por:

acridina, hipericina, psoraleno, azul de metileno y derivados de estos compuestos.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el compuesto aromático es acridina y/o un derivado de acridina.

4. Procedimiento según al menos una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el material de soporte es un gel de sílice.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, caracterizado porque el gel de sílice se ha modificado de forma hidrófuga con grupos etilo.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el procedimiento se lleva a cabo por cromatografía en columna o cromatografía discontinua.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el procedimiento se lleva a cabo por filtración a través del material de soporte o por inundación del material de soporte.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la solución contiene un aditivo, el cual impide en gran medida la unión de compuestos aromáticos a las proteínas, o que desprende nuevamente los compuestos aromáticos ya unidos.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, caracterizado porque el aditivo es una sustancia hidrófuga o anfífila.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, caracterizado porque el aditivo se selecciona del grupo constituido por polivinilalcoholes (PVA), polivinilpirrolidona, Tween® 20, Tween® 40, Tween® 60, Tween® 80, Nonidet® P40, polietilenglicoles, desoxicolato, CHAPS, alquilfenol oxietilado, polioxietileno parcialmente esterificado con ácido graso, derivados de polioxietileno-alcoholes grasos, dodecil-N-betaína, palmitoillisolecitina, dodecil-\beta-alanina, ácido N-odecilaminoetanosulfónico, bromuro de tetradecilamonio, cloruro de hexadeciltrimetilamonio, cloruro de dodecilpiridinio, condensados de óxido de etileno-óxido de propileno, bromuro de cetiltrimetilamonio, cloruro de dodeciltrimetilbencilamonio, aminas oxietiladas, alquilfenol oxietilado sulfatado, colato de sodio, desoxicolato de sodio, Igepon A (sulfoetilsulfonato de sodio), sulfoetilsulfonato de sodio, N-oleiletano-sulfonato de N-metilo y dodecilbencenosulfonato de sodio.

11. Procedimiento según la reivindicación 9, caracterizado porque el aditivo es un polivinilalcohol, polivinilpirrolidona o un alquilfenol oxietilado.

12. Procedimiento según una de las reivindicaciones 8 a 11, caracterizado porque el aditivo se separa de la solución al mismo tiempo que el compuesto aromático.

13. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la solución es plasma sanguíneo o un producto plasmático.