ES2201551T3 - Oil in water emulsions containing saponins. - Google Patents

Oil in water emulsions containing saponins.

Info

Publication number
ES2201551T3
ES2201551T3 ES98954264T ES98954264T ES2201551T3 ES 2201551 T3 ES2201551 T3 ES 2201551T3 ES 98954264 T ES98954264 T ES 98954264T ES 98954264 T ES98954264 T ES 98954264T ES 2201551 T3 ES2201551 T3 ES 2201551T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
composition according
oil
antigen
qs21
sb62
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES98954264T
Other languages
Spanish (es)
Inventor
Nathalie Garcon
Patricia Marie Christine Aline Francoise Momin
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
GlaxoSmithKline Biologicals SA
Original Assignee
GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to GBGB9718902.1A priority Critical patent/GB9718902D0/en
Priority to GB9718902 priority
Priority to GBGB9720982.9A priority patent/GB9720982D0/en
Priority to GB9720982 priority
Application filed by GlaxoSmithKline Biologicals SA filed Critical GlaxoSmithKline Biologicals SA
Application granted granted Critical
Publication of ES2201551T3 publication Critical patent/ES2201551T3/en
Anticipated expiration legal-status Critical
Application status is Expired - Lifetime legal-status Critical

Links

Classifications

    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL, OR TOILET PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12Viral antigens
    • A61K39/29Hepatitis virus
    • A61K39/292Serum hepatitis virus, hepatitis B virus, e.g. Australia antigen
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL, OR TOILET PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005Vertebrate antigens
    • A61K39/0011Cancer antigens
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL, OR TOILET PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/002Protozoa antigens
    • A61K39/015Hemosporidia antigens, e.g. Plasmodium antigens
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL, OR TOILET PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12Viral antigens
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL, OR TOILET PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL, OR TOILET PURPOSES
    • A61K9/00Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10Dispersions; Emulsions
    • A61K9/107Emulsions ; Emulsion preconcentrates; Micelles
    • A61K9/1075Microemulsions or submicron emulsions; Preconcentrates or solids thereof; Micelles, e.g. made of phospholipids or block copolymers
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL, OR TOILET PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL, OR TOILET PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511Organic adjuvants
    • A61K2039/55566Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL, OR TOILET PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511Organic adjuvants
    • A61K2039/55572Lipopolysaccharides; Lipid A; Monophosphoryl lipid A
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL, OR TOILET PURPOSES
    • A61K39/00Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511Organic adjuvants
    • A61K2039/55577Saponins; Quil A; QS21; ISCOMS
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00Reverse Transcribing DNA Viruses
    • C12N2730/00011Reverse Transcribing DNA Viruses
    • C12N2730/10011Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10134Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02ATECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection
    • Y02A50/30Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
    • Y02A50/38Medical treatment of vector-borne diseases characterised by the agent
    • Y02A50/408Medical treatment of vector-borne diseases characterised by the agent the vector-borne disease being caused by a protozoa
    • Y02A50/411Medical treatment of vector-borne diseases characterised by the agent the vector-borne disease being caused by a protozoa of the genus Plasmodium, i.e. Malaria
    • Y02A50/412Medical treatment of vector-borne diseases characterised by the agent the vector-borne disease being caused by a protozoa of the genus Plasmodium, i.e. Malaria the medicinal preparation containing antigens or antibodies, e.g. vaccines, antisera
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02ATECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection
    • Y02A50/30Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
    • Y02A50/46Medical treatment of waterborne diseases characterized by the agent
    • Y02A50/462The waterborne disease being caused by a virus
    • Y02A50/463The waterborne disease being caused by a virus the virus being the Hepatitis A virus [HAV]
    • Y02A50/464The waterborne disease being caused by a virus the virus being the Hepatitis A virus [HAV] the medicinal preparation containing antigens or antibodies, e.g. vaccines, antisera

Abstract

Una composición que comprende una emulsión de aceite en agua y una saponina, en la que dicho aceite es un aceite metabolizable, caracterizado porque la relación del aceite metabolizable:saponina (p/p) está en el intervalo entre 1:1 y 200:1. A composition comprising an oil in water and a saponin, wherein said oil is a metabolizable oil, wherein the ratio of the metabolisable oil: saponin (w / w) is in the range between 1: 1 and 200: 1 .

Description

Emulsiones de aceite en agua que contienen saponinas. Oil in water emulsions containing saponins.

La presente invención se refiere a una composición de vacunas en emulsión de aceite en agua. The present invention relates to a vaccine composition in oil emulsion in water. En particular la presente invención a una formulación de adyuvantes de vacunas a base de una emulsión de aceite en agua que comprende un aceite metabolizable y una saponina. In particular the present invention a vaccine adjuvant formulation based on an oil in water emulsion comprising a metabolizable oil and a saponin. La invención además se refiere a procedimientos para preparar la emulsión y su uso en medicina. The invention further relates to processes for preparing the emulsion and its use in medicine.

Inducción de respuestas de células T citotóxicas (abreviadamente CTL) se produce naturalmente durante la infección de una célula diana, o síntesis no controlada de un antígeno tumoral, en el que la degradación enzimática de un antígeno diana tiene lugar en el citoplasma de la célula. Induction of responses of cytotoxic T cells (abbreviated CTL) occurs naturally during infection of a target cell, or synthesis uncontrolled a tumor antigen, wherein enzymatic degradation of a target antigen occurs in the cytoplasm of the cell. Este fenómeno permite que los péptidos citoplásmicos derivados del patógeno, o antígeno específico del tumor entren en la ruta de Th1 (procesamiento del antígeno endógeno) y se presenten en la superficie de la célula asociada con una molécula MHC de clase 1. Si un antígeno de vacuna no entra en el citoplasma de la célula hospedadora, entonces pudiera que los tomase la célula y se introdujera en la ruta de procesamiento del antígeno exógeno y por último presentarse en la superficie de la célula asociada a una molécula MHC de clase II. This phenomenon allows cytoplasmic peptides derived from the pathogen, or tumor specific antigen entering the Th1 pathway (endogenous antigen processing) and presented on the surface of the cell associated with an MHC class 1. If an antigen of vaccine does not enter the cytoplasm of the host cell, then it might that would take the cell and introduced in the processing path of the exogenous antigen and finally displayed on the surface of the cell associated with a MHC class II molecule. Esta vía alternativa generalmente da como resultado respuestas de auxiliares T y respuestas de anticuerpo específico de antígeno. This alternative route generally results in T-helper responses and responses of antigen-specific antibody.

Después de la vacunación convencional con subunidades o vacunas no vivas, el antígeno en general no entra en el citoplasma de una célula hospedadora y, por lo tanto, no entrará en la ruta del procesamiento del antígeno endógeno y por ultimo no inducirá a una respuesta de CTL. After conventional vaccination with subunit or non-living vaccines, antigen generally does not enter the cytoplasm of a host cell and, therefore, will not enter the path of endogenous antigen processing and ultimately will not induce a response in CTL. La inducción de CTL se cree que se correlaciona con las respuestas del perfil de citoquina Th-1, específicamente con secreción de IFN-\gamma y IL-2. CTL induction is believed to correlate with the cytokine profile responses Th1, specifically with IFN- secretion \ gamma and IL-2. La secreción de IFN-\gamma se asocia con respuestas protectoras contra patógenos intracelulares, que incluyen parásitos, bacterias y virus. Secretion of IFN- \ gamma is associated with protective responses against intracellular pathogens, including parasites, bacteria and viruses. La activación de leucocitos mediante IFN-\gamma potencia la muerte de patógenos intracelulares e incrementa la expresión de receptores de Fc. Leukocyte activation by IFN- \ gamma enhances the death of intracellular pathogens and increases expression of Fc receptors. También se puede producir la citotoxicidad directa, especialmente en sinergia con linfotoxina (otro producto de células TH1). It can also cause direct cytotoxicity, especially in synergism with lymphotoxin (another product of TH1 cells). IFN-\gamma es también tanto un inductor como un producto de células NK, que son los efectores innatos principales de protección. IFN- \ gamma is also both an inducer and a product of NK cells, which are major innate effectors of protection. Las respuestas de tipo TH1, bien mediante IFN-\gamma u otros mecanismos, proporcionan ayuda preferencial para IgG2a de tipo murino e isotipos de inmunoglobulina IgG1 humana. TH1 type responses, either through IFN- \ gamma or other mechanisms, provide preferential help for IgG2a and murine IgG1 human immunoglobulin isotypes.

La solicitud de patente internacional Nº WO 95/17210 describe un sistema de emulsión de adyuvantes a base de escualeno, \alpha-tocoferol y monooleato de sorbitán polioxietilenado (TWEEN80), formulado con la QS21 inmunoestimulante, opcionalmente con 3D-MPL. The International Patent Application No. WO 95/17210 discloses an adjuvant emulsion system based on squalene, \ alpha-tocopherol and polyoxyethylene sorbitan monooleate (TWEEN80), formulated with the immunostimulant QS21, optionally with 3D-MPL. Esta formulación de adyuvantes es un inductor muy potente de un amplio intervalo de respuestas inmunes. This adjuvant formulation is a very potent inducer of a wide range of immune responses.

Las fracciones de saponina inmunológicamente activas (por ejemplo, Quil A) que tienen actividad adyuvante derivada de la corteza del árbol sudamericano Quillaja Saponaria Molina se conocen en la técnica. Fractions of Immunologically active saponin (e.g. Quil A) having adjuvant activity derived from the bark of the South American tree Quillaja Saponaria Molina are known in the art. Los derivados de Quil A, por ejemplo QS21 (una fracción purificada por HPLC derivada de Quil A) y el procedimiento de su producción se describe en la patente de Estados Unidos Nº 5.057.540. Derivatives of Quil A, for example QS21 (HPLC purified fraction derivative of Quil A) and the method of their production is disclosed in US Patent No. 5,057,540. Entre QS21 (conocida como QA21) se describen también otras fracciones tales como QA17. Between QS21 (known as QA21) other fractions are also disclosed such as QA17. El uso de dichas saponinas en aislamiento se acompaña con desventaja a causa de necrosis total, es decir, muerte de tejido localizado, se produce en el sitio de inyección, por lo tanto conduciendo al dolor. The use of such saponins in isolation is accompanied with disadvantage due to total necrosis, ie, localized tissue death, occurs at the injection site, thereby leading to pain.

Las fracciones de saponina inmunológicamente activas que tienen actividad adyuvante derivada de la corteza del árbol sudamericano Quillaja Saponaria Molina se conocen en la técnica. Fractions of Immunologically active saponin having adjuvant activity derived from the bark of the South American tree Quillaja Saponaria Molina are known in the art. Por ejemplo QS21, una fracción purificada por HPLC del árbol Quillaja Saponaria Molina y el procedimiento de su producción (conocido como QA21) se describe en la patente de Estados Unidos Nº 5.057.540. For example QS21, an HPLC purified fraction from the Quillaja Saponaria Molina tree the method of its production (known as QA21) is disclosed in U.S. Patent No. 5,057,540. El uso de dichas saponinas en acompaña con una desventaja debido a necrosis total, es decir, muerte de tejido localizado, se produce en el sitio de inyección, que conduce al dolor. The use of such saponins in accompanied with a disadvantage due to total necrosis, ie, localized tissue death, occurs at the injection site, which leads to pain.

Lípido A monofosforilo 3 De-O-acilado es un adyuvante bien conocido fabricado por Ribi Immunochem, Montana. Monophosphoryl lipid A 3 De-O-acylated is a well known adjuvant manufactured by Ribi Immunochem, Montana. Químicamente a menudo se suministra en forma de una mezcla de lípido A monofosforilo 3 De-O-acilado bien con 4, 5, ó 6 cadenas aciladas. Chemically it is often supplied as a mixture of monophosphoryl lipid A 3 De-O-acylated with either 4, 5, or 6 acylated chains. Se puede preparar mediante procedimientos enseñados en el documento GB 2122204B. It can be prepared by methods taught in GB 2122204B. Una forma preferida de lípido A monofosforilo 3 De-O-acilado está en forma de una emulsión que tiene un tamaño de partícula menor que 0,2 \mum en diámetro y su procedimiento de fabricación se describe en la patente europea A preferred form of 3 De monophosphoryl lipid A-O-acylated is in the form of an emulsion having a particle size less than 0.2 \ mum in diameter and its manufacturing method described in the European patent
Nº EP 0 671 948 B1. No. EP 948 671 B1 0.

Con el fin de que cualquier composición de aceite en agua sea adecuada para administración humana, la fase oleosa del sistema de emulsión tiene que comprender un aceite metabolizable. In order for any oil in water composition to be suitable for human administration, the oil phase of the emulsion system has to comprise a metabolisable oil. El significado de la expresión aceite metabolizable se conoce bien en la técnica. The meaning of the term metabolizable oil is well known in the art. Metabolizable se puede definir como "que es capaz de transformarse mediante metabolismo" (Dorland's Illustrated Medical Dictionary, WB Sanders Company, edición 25 (1974)). Metabolizable can be defined as "that is capable of being transformed by metabolism" (Dorland's Illustrated Medical Dictionary, WB Sanders Company, 25th edition (1974)). El aceite puede ser cualquier aceite vegetal, aceite de pescado, animal o sintético, que no sea tóxico para el receptor y sea capaz de transformarse mediante metabolismo. The oil can be any vegetable or synthetic oil, fish oil, animal that is not toxic to the recipient and is capable of being transformed by metabolism. Las nueces, semillas y granos son comúnmente fuentes de aceites vegetales. Nuts, seeds and grains are common sources of vegetable oils. Los aceites sintéticos son también parte de esta invención y pueden incluir aceites comercialmente disponibles tales como NEOBEE® y otros. Synthetic oils are also part of this invention and can include commercially available oils such as NEOBEE® and others. El escualeno (2,6,10,15,19,23-hexametil-2,6,10,14,18,22-tetracosahexaeno) es un aceite insaturado que se encuentra e grandes cantidades en el aceite de hígado de tiburón y en cantidades menores en aceite de oliva, aceite de germen de trigo, aceite de salvado de arroz y levadura, y es un aceite particularmente preferido para uso en esta invención. Squalene (2,6,10,15,19,23-hexamethyl-2,6,10,14,18,22-tetracosahexaene) is an unsaturated oil which is found in large quantities and shark liver oil and lower quantities in olive oil, wheat germ oil, rice bran oil, and yeast, and is a particularly preferred for use in this invention oil. El escualeno es un aceite metabolizable en virtud del hecho que es un intermedio en la biosíntesis de colesterol (Merck index, edición 10, entrada Nº 8619). Squalene is a metabolisable oil virtue of the fact that is an intermediate in the biosynthesis of cholesterol (Merck index, 10th edition, No. 8619 entry).

Las emulsiones de aceite en agua se conocen per se en la técnica, y se ha sugerido que son útiles como composiciones de adyuvantes (documento EPO 399843). Oil emulsions in water are known per se in the art, and have been suggested to be useful as adjuvant compositions (EPO 399843 document).

Las respuestas inmunológicas a la administración de antígeno formulado en las emulsiones de aceite en agua descritas en la solicitud de patente internacional Nº WO 95/17210, se pueden caracterizar porque se observan tanto la respuesta de Th2 como la de Th1. Immunological to administration of antigen formulated responses in oil in water emulsions described in International Patent Application No. WO 95/17210, can be characterized in that both Th2 and Th1 the observed. Dado que en muchos casos las respuestas de tipo Th1 se han identificado como críticas para la profilaxis y tratamiento de enfermedad, es, por lo tanto, deseable que se desarrolle un adyuvante desviado de Th1. Since in many cases Th1-type responses have been identified as critical for the prophylaxis and treatment of disease is, therefore, desirable that an adjuvant deviated from Th1 to develop. Más sorprendentemente esto se ha llevado a cabo por los presentes inventores, no mediante adición de inmunoestimuladores extra, sino mediante una reducción de uno de los componentes originales. More surprisingly this has been carried out by the present inventors not by addition of extra immunostimulators, but by reducing one of the original components.

Las emulsiones de adyuvante de aceite en agua descritas en la solicitud de patente internacional Nº WO 95/17210 tienen una relación alta de escualeno:saponina (p/p). The emulsions of oil in water adjuvant described in International Patent Application No. WO 95/17210 have a high ratio of squalene: saponin (w / w). Las realizaciones de la presente invención tienen la relación de escualeno:QS21 en el intervalo de 1:1 a 200:1, se prefiere también el intervalo 20:1 a 200:1, preferiblemente 20:1 a 100:1 y más preferible sustancialmente 48:1. Embodiments of the present invention have the ratio of squalene: QS21 in the range of 1: 1 to 200: 1, also preferred is the range 20: 1 to 200: 1, preferably 20: 1 to 100: 1 and more preferably substantially 48: 1. Esta reducción de uno de los componentes tiene el efecto sorprendente de mejorar cualitativamente la respuesta inmune resultante. This reduction of one of the components has the surprising effect of qualitatively improving the resultant immune response. Usando esta nueva formulación de adyuvantes se mantienen las respuestas fuertes de tipo Th2, pero además dichas formulaciones provocan una respuesta inmune potenciada asociada específicamente con respuestas de tipo Th1, caracterizadas por respuestas altas de IFN-\gamma, proliferativas de células T y CTL. Using this new adjuvant formulation strong Th2-type responses are maintained, but moreover such formulations elicit an enhanced immune response specifically associated with Th1-type responses, characterized by high IFN- responses \ gamma, proliferative T cell and CTL.

Una realización preferida de la presente invención es un adyuvante o una formulación farmacéutica que comprende Quil A o derivado de la misma, tal como QS21 y una emulsión de aceite en agua, en la que la emulsión de aceite en agua comprende un aceite metabolizable, tal como escualeno y un polisorbato (que incluye monooleato de sorbitán polioxietilenado, TWEEN 80™), dichas emulsiones se caracterizan porque la reacción del aceite:QS21 está en el intervalo de 20:1 a 200:1 (p/p). A preferred embodiment of the present invention is an adjuvant or pharmaceutical formulation comprising Quil A or derivative thereof, such as QS21 and an oil in water, wherein the oil-in-water comprises a metabolizable oil, such as squalene and polysorbate (including polyoxyethylene sorbitan monooleate, TWEEN 80 ™), said emulsions are characterized in that the reaction of the oil: QS21 is in the range of 20: 1 to 200: 1 (w / w). En otra realización preferente, la formulación de adyuvantes comprende además otros inmunomoduladores, que incluyen \alpha-tocoferol y 3D-MPL. In another preferred embodiment, the adjuvant formulation further comprises other immunomodulators, including \ -tocopherol and 3D-MPL.

Dichas formulaciones una vez combinadas con un antígeno o preparación antigénica son adecuadas para un amplio intervalo de vacunas monovalentes o polivalentes. Such formulations once combined with one antigen or antigenic preparation are suitable for a broad range of monovalent or polyvalent vaccines. Adicionalmente la emulsión de aceite en agua puede contener trioleato de sorbitán polioxietilenado (SPAN 85). Additionally the oil in water emulsion may contain polyoxyethylene sorbitan trioleate (SPAN 85). Una forma preferida de lípido A monofosforilo 3 De-O-acilado se describe en la solicitud de patente internacional publicada en el Nº 92116556-SmithKline Beecham Biologicals sa A preferred form of 3 De monophosphoryl lipid A-O-acylated described in International Patent Application No. 92116556 published in SmithKline Beecham Biologicals sa-

Preferiblemente las formulaciones de vacunas de la presente invención contienen un antígeno o composición antigénica capaz de provocar una respuesta inmune contra un patógeno humano, dicho antígeno o composición antigénica se deriva de VIH-1, (tal como tal, nef, gp120 o gp160), los virus herpes humanos, tales como gD o derivados de los mismos o proteína temprana inmediata tal como ICP27 de VSH1 o VSH2, citomegalovirus ((esp de tipo humano) (tal como gB o derivados del mismo), rotavirus (incluyendo virus vivos atenuados), virus Epstein Barr (tal como gp350 o derivados del mismo), virus varicela Zóster (tal como gpI, II e IE63), o de un virus de hepatitis tal como virus de hepatitis B (por ejemplo antígeno de superficie de hepatitis B o un derivado del mismo), virus de hepatitis A, virus de hepatitis C y virus de hepatitis E, o de otros patógenos virales tales como paramixovirus: virus sincitial respiratorio (tales como proteínas F y G o derivadas de las mismas), virus de pa Preferably the vaccine formulations of the present invention contain an antigen or antigenic composition capable of eliciting an immune response against a human pathogen, said antigen or antigenic composition is derived from HIV-1, (as such, nef, gp120 or gp160), human herpes viruses, such as gD or derivatives thereof or protein immediate early as ICP27 from HSV1 or HSV2, cytomegalovirus ((esp human type) (such as gB or derivatives thereof), rotavirus (including live-attenuated) , Epstein Barr virus (such as gp350 or derivatives thereof), varicella Zoster virus (such as gpl, II and IE63), or from a hepatitis virus such as hepatitis B virus (eg antigen hepatitis B surface or derivative thereof), hepatitis A virus, hepatitis C virus and hepatitis E virus, or from other viral pathogens, such as paramyxoviruses: respiratory syncytial virus (such as F and G proteins or derivatives thereof), virus pa rainfluenza, virus del sarampión, virus de las paperas, virus de papiloma humano, (por ejemplo VPH6, 11, 16, 18,...), flavivirus (por ejemplo, virus de la fiebre amarilla, virus dengue, virus de la encefalitis transmitido por garrapatas, virus de la encefalitis japonesa) o virus de influenza, o derivadas de bacterias patógenas tales como Neisseria spp , incluyendo N. gonorrhea y N. meningitidis (por ejemplo polisacáridos capsulares y conjugados de los mismos, proteínas de unión a transferrina, proteínas de unión a lactoferrina, PilC, adhesinas); rainfluenza, measles virus, mumps virus, human papilloma virus (for example HPV6, 11, 16, 18, ...), flaviviruses (e.g. yellow fever virus, dengue virus, encephalitis virus tick - borne encephalitis virus, Japanese) or influenza virus, or derived from bacterial pathogens such as Neisseria spp, including N. gonorrhea and N. meningitidis (for example capsular polysaccharides and conjugates thereof, transferrin - binding proteins, lactoferrin binding proteins, PilC, adhesins); Steptococcus spp , incluyendo S. pneumoniae (por ejemplo polisacáridos capsulares y conjugados de los mismos, PsaA, PspA, estreptolisina, proteínas de unión a colina), S. pyogenes (por ejemplo proteínas M o fragmentos de las mismas, proteasa C5A, ácidos lipoteicoicos), S. agalactiae , S. mutans ; Streptococcus spp, including S. pneumoniae (for example capsular polysaccharides and conjugates thereof, PsaA, PspA, streptolysin, choline - binding proteins), S. pyogenes (for example M proteins or fragments thereof, C5A protease, lipoteichoic acids ), S. agalactiae, S. mutans; Haemophilus spp , incluyendo H. influenzae tipo B (por ejemplo, PRP y conjugados de la misma), H. influenzae no caracterizable (por ejemplo OMP26, adhesinas de alto peso molecular, P5, P6, lipoproteína D), H. ducreyi ; Haemophilus spp, including H. influenzae type B (for example PRP and conjugates thereof), H. influenzae characterizable (for example OMP26, high molecular weight adhesins, P5, P6, lipoprotein D), H. ducreyi; Moraxella spp incluyendo M. catarrhalis , también conocida como Branhamella catarrhalis (por ejemplo adhesinas e invasinas de alto y bajo peso molecular); Moraxella spp , including M catarrhalis, also known as Branhamella catarrhalis (for example adhesins and invasins high and low molecular weight); Bordetella spp , incluyendo B. pertussis (por ejemplo, pertactina , toxina de pertussis o derivados de las mismas, hemaglutinina filamentosa, ciclasa de adenilato, fimbrias), B. parapertussis y B. bronchiseptica ; Bordetella spp, including B. pertussis (for example pertactin, pertussis toxin or derivatives thereof, filamenteous hemagglutinin, adenylate cyclase, fimbriae), B. parapertussis and B. bronchiseptica; Mycobacterium spp. Mycobacterium spp. , incluyendo M. tuberculosis (por ejemplo ESAT6, antígeno 85a, -B o -C), M. Bovis , M. leprae , M. avium , M. paratuberculosis , M. smegmatis ; , Including M. tuberculosis (for example ESAT6, Antigen 85A, -B or -C), M. bovis, M. leprae, M. avium, M. paratuberculosis, M. smegmatis; Legionella spp , incluyendo L. pneumophila ; Legionella spp, including L. pneumophila; Escherichia spp , incluyendo E. coli enterotóxica (por ejemplo, factores de colonización, toxina termolábil o derivadas de la misma, toxina termoestable o derivadas de la misma), E. coli enterohemorrágica, E. coli enteropatogénica (por ejemplo toxina de tipo toxina shiga o derivados de la misma); Escherichia spp, including enterotoxic E. coli (for example colonization factors, heat - labile or toxin derived therefrom, thermoset or toxin derived therefrom), enterohemorrhagic E. coli, enteropathogenic E. coli (for example shiga toxin toxin type or derivatives thereof); Vibrio spp , incluyendo V. cholera (por ejemplo toxina de cólera o derivados de la misma); Vibrio spp, including V. cholera (for example cholera toxin or derivatives thereof); Shigella spp , incluyendo S. sonnei , S. dysenteriae , S. flexnerii ; Shigella spp, including S. sonnei, S. dysenteriae, S. flexnerii; Yersinia spp , incluyendo Y. enterocolitica (por ejemplo proteína Yop), Y. pestis , Y. pseudotuberculosis ; Yersinia spp, including Y. enterocolitica (for example Yop protein), Y. pestis, Y. pseudotuberculosis; Campylobacter spp , incluyendo C. jejuni (por ejemplo toxinas, adhesinas e invasinas) y C. coli ; Campylobacter spp, including C. jejuni (for example toxins, adhesins and invasins) and C. coli; Salmonella spp , incluyendo S. Typhi , S. paratyphi , S. choleraesuis , S. enteritidis ; Salmonella spp, including S. typhi, S. paratyphi, S. choleraesuis, S. enteritidis; Listeria spp , incluyendo L. monpcytogenes ; Listeria spp, including L. monpcytogenes; Helicobacter spp , incluyendo H. pylori (por ejemplo ureasa, catalasa, toxina de vacuolación); Helicobacter spp, including H. pylori (for example urease, catalase, vacuolating toxin); Pseudomonas spp , incluyendo P. aeruginosa ; Pseudomonas spp, including P. aeruginosa; Staphylococcus spp . Staphylococcus spp. incluyendo S. aureus , S. epidermidis ; including S. aureus, S. epidermidis; Enterococcus spp. Enterococcus spp. , incluyendo E. faecalis , E. faecium ; , Including E. faecalis, E. faecium; Clostridium spp ., incluyendo C. tetani (por ejemplo toxina de tétanos y derivadas de la misma), C. botulinum (por ejemplo toxina botulínica y derivadas de la misma), C. difficile (por ejemplo toxinas A y B de clostridium y derivadas de las mismas); Clostridium spp., Including C. tetani (for example tetanus toxin and derivative thereof), C. botulinum (for example botulinum toxin and derivative thereof), C. difficile (for example toxins A and B and derivatives of clostridium from the same); Bacillus spp. Bacillus spp. , incluyendo B. anthracis (por ejemplo toxina botulínica y derivadas de la misma); , Including B. anthracis (for example botulinum toxin and derivatives thereof); Corynebacterium spp. Corynebacterium spp. , incluyendo C. diphtheriae (por ejemplo toxina diftérica y derivadas de la misma); , Including C. diphtheriae (for example diphtheria toxin and derivatives thereof); Borrelia spp. Borrelia spp. , incluyendo B. burgdorferi (por ejemplo (OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. garinii (por jemplo (OspA, OspC, DbpA, DbpB); B. afzelii (por ejemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. andersonii (por ejemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. hermsii ; Ehrlichia spp. , incluyendo E. equi y el agente de ehrlichiosis granulocítica humana; Rickettsia spp . incluyendo R. rickettsii ; Chlamydia spp. , incluyendo C. trachomatis (por ejemplo MOMP, proteínas de unión a heparina), C. pneumoniae (por ejemplo MOMP proteínas de unión a heparina), C. psittaci ; Leptospira spp. , incluyendo L. interrogans ; Treponema spp. , incluyendo T. pallidum (por ejemplo las proteínas de membrana exterior raras), T. denticola , T. hyodysenteriae ; o derivadas de parásitos tales como Plasmodium spp. , incluyendo P. falciparum ; Toxoplasma spp. , incluyendo T. gondii (por ejemplo SAG2, SAG3, Tg34); Entamoeba spp. , incluyendo E. histolytica ; Babesia spp. , incluyendo B. microti ; Trypanosoma spp. , incluyendo T. cruzi ; Giarda , Including B. burgdorferi (for example (OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. garinii (for xample (OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. afzelii (for example OspA, OspC, DbpA, DbpB), B . andersonii (for example OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. hermsii; Ehrlichia spp, including E. equi and the agent of human granulocytic ehrlichiosis;. R. rickettsii Rickettsia spp including;.. Chlamydia spp, including C. trachomatis (for example MOMP, heparin - binding proteins), C. pneumoniae (for example MOMP heparin binding proteins), C. psittaci; Leptospira spp, including L. interrogans;.. Treponema spp, including T. pallidum (for example proteins rare outer membrane), T. denticola, T. hyodysenteriae; or derived from parasites such as Plasmodium spp, including P. falciparum;.. Toxoplasma spp, including T. gondii (for example SAG2, SAG3, Tg34); Entamoeba spp, including E. histolytica;.. Babesia spp, including B. microti; Trypanosoma spp, including T. cruzi;. Giardia spp. , incluyendo G. lamblia ; spp., including G. lamblia; Leshmania spp. Leshmania spp. , incluyendo L. major ; , Including L. major; Pneumocystis spp. Pneumocystis spp. , incluyendo P. carinii ; , Including P. carinii; Trichomonas spp. Trichomonas spp. , incluyendo T. vaginalis ; , Including T. vaginalis; Schisostoma spp. Schisostoma spp. , incluyendo S. mansoni , o derivadas de levaduras tales como Candida spp. , Including S. mansoni, or derived from yeast such as Candida spp. , incluyendo C. albicans ; , Including C. albicans; Cryptococcus spp. Cryptococcus spp. , incluyendo C. neoformans . , Including C. neoformans.

Los derivados del antígeno de superficie de la hepatitis B se conocen bien en la técnica e incluyen, entre otros, los antígenos PreS1, PreS2 expuestos y descritos en las solicitudes de patentes europeas EP-A-414 374; Derivatives surface antigen of hepatitis B described in European patent applications EP-A-414374 are well known in the art and include, inter alia, the antigen PreS1, PreS2 and exposed; EP-A-0304 578 y EP 198-474. EP-A-0304 578 and EP 198-474. En un aspecto preferido la formulación de vacunas de la invención comprende el antígeno de VIH-1, gp 120, especialmente cuando se expresan en células CHO. In a preferred aspect the vaccine formulation of the invention comprises the HIV-1 antigen, gp120, especially when expressed in CHO cells. En una realización adicional, la formulación de vacunas de la invención comprende gD2t como se ha definido anteriormente en esta memoria descriptiva. In a further embodiment, the vaccine formulation of the invention comprises gD2t as defined above in this specification.

En una realización preferida de la presente invención las vacunas que contienen el adyuvante reivindicado comprenden los virus VPH considerados responsables de verrugas genitales, (VPH 6 o VPH 11 y otros) y los virus VPH responsables del cáncer cervical (VPH 16, VPH 18 y otros). In a preferred embodiment of the present invention vaccines containing the claimed adjuvant comprise the HPV viruses considered responsible for genital warts, (HPV 6 or HPV 11 and others) and the HPV viruses responsible for cervical cancer (HPV16, HPV18 and others ). Formas particularmente preferidas de vacuna comprenden partículas L1 o capsómeros, y proteínas de fusión que comprenden uno o más antígenos seleccionados de las proteínas E6, E7, L1 y L2 del VPH 6 y del VPH 11. Las formas más preferidas de proteínas de fusión son: L2E7 como se describe en el documento GB 95 15478.7, y la proteína D (1/3)-E7 descrita en el documento GB 9717953.5. Particularly preferred vaccine forms comprise L1 particles or capsomers, and fusion proteins comprising one or more antigens selected from the E6, E7, L1 and L2 of HPV 6 protein and HPV 11. The most preferred forms of fusion protein are: L2E7 as disclosed in GB 95 15478.7 document, and D (1/3) -E7 protein described in GB 9717953.5.

Las vacunas de la presente invención comprenden además antígenos derivados de parásitos que ocasionan la malaria. The vaccines of the present invention further comprise antigens derived from parasites that cause malaria. Por ejemplo, los antígenos preferidos de Plasmodium falciparum incluyen RTS,S y TRAP. For example, preferred antigens of Plasmodium falciparum include RTS, S and TRAP. RTS es una proteína híbrida que comprende sustancialmente toda la porción terminal C de la proteína del circumsporocito (abreviadamente CS) de P. falciparum unida mediante cuatro aminoácidos de la porción preS2 del antígeno de superficie de hepatitis B al antígeno de superficie (S) del virus de hepatitis B. Su estructura completa se describe en la solicitud de patente internacional Nº PCT/EP92/02591, publicada en el documento Nº WO 93/10152 que reivindica prioridad de la solicitud de patente de Reino Unido Nº 9124390.7. RTS is a hybrid protein comprising substantially all the C - terminal portion of protein circumsporocito (abbreviated CS) protein of P.falciparum linked via four amino acids of the preS2 portion of surface antigen hepatitis B surface antigen (S) virus hepatitis B. Its full structure is disclosed in international patent application No. PCT / EP92 / 02591, published in document WO 93/10152 No. claiming priority from patent application No.9124390.7 UK. Cuando se expresa en RTS de levadura se produce en forma de una partícula de lipoproteína y cuando se coexpresa con el antígeno S de VBH produce una partícula mezclada conocida como RTS,S. When expressed in yeast RTS it is produced as a lipoprotein particle, and when co-expressed with the S antigen from HBV it produces a mixed particle known as RTS, S. Los antígenos TRAP se describen en la solicitud de patente internacional Nº PCT/GB89/00895, publicada en el documento WO 90/01496. TRAP antigens are described in International Patent Application No. PCT / GB89 / 00895, published under WO 90/01496 on. Una realización preferida de la presente invención es una vacuna de malaria en la que la preparación antigénica comprende una combinación de los antígenos RTS,S y TRAP. A preferred embodiment of the present invention is a malaria vaccine wherein the antigenic preparation comprises a combination of the RTS, S and TRAP antigens. Otros antígenos de plasmodios que son probables candidatos a ser componentes de una vacuna de fase múltiple de malaria son P. falciparum MSP1, AMA1, MSP3, EBA, GLURP, RAP1, RAP2, secuestrina, PfEMP1, Pf332, LSA1, LSA3, STARP, SALSA, PfEXP1, Pfs25, Pfs28, PFS27/25, Pfs16, Pfs48/45, Pfs230 y sus análogos en Plasmodium spp. Other plasmodia antigens that are likely candidates to be components of a multiphase vaccine are P. falciparum malaria MSP1, AMA1, MSP3, EBA, GLURP, RAP1, RAP2, secuestrina, PfEMP1, Pf332, LSA1, LSA3, STARP, SALSA , PfEXP1, Pfs25, Pfs28, PFS27 / 25, Pfs16, Pfs48 / 45, Pfs230 and their analogues in Plasmodium spp.

Las formulaciones también pueden contener un antígeno antitumoral y son útiles para los cánceres de tratamiento inmunoterapéutico. The formulations may also contain an anti-tumor antigen and are useful for immunotherapeutic treatment cancers. Por ejemplo, la formulación de adyuvantes encuentra utilidad con antígenos de rechazo tumoral tal como los cánceres de próstata, mama, colorrectal, pulmón, pancreático, renal o melanoma. For example, the adjuvant formulation finds utility with tumor rejection antigens such as prostate, breast, colorectal, lung, pancreatic, renal or melanoma. Los antígenos ejemplares incluyen antígenos MAGE 1 y MAGE 3 u otro MAGE para el tratamiento de melanoma, PRAME, BAGE o GAGE (Robbins y Kawakami, 1996, Current Opinions in Immunology 8, pp. 628-636; Van der Eynde y col., International Journal of Clinical & Laboratory Research (presentado 1997); Correale y col., (1997), Journal of the National Cancer Institute 89, p 293. Sin duda estos antígenos se expresan en un amplio intervalo de tipos de tumores tales como melanoma, carcinoma de pulmón, sarcoma y carcinoma de vejiga. Otros antígenos específicos de tumores son adecuados para uso con adyuvante de la presente invención e incluyen, pero no se restringen a antígeno prostático específico (abreviadamente PSA) o Her-2/neu, KSG (GA733), MUC-1 y antígeno carcinoembriónico (abreviadamente CEA). Por consiguiente en un aspecto de la presente invención se proporciona una vacuna que comprende una composición de adyuvantes según la presente invención y un antígeno de rechazo tumoral Exemplary antigens include MAGE 1 and MAGE 3 or other MAGE for the treatment of melanoma, PRAME, BAGE or GAGE ​​(Robbins and Kawakami, 1996, Current Opinions in Immunology 8, pp 628-636;.. Van der Eynde et al, International Journal of Clinical & Laboratory Research (submitted 1997). Correale et al, (1997), Journal of the National Cancer Institute 89, p 293. Clearly these antigens are expressed in a wide range of tumor types such as melanoma, lung carcinoma, sarcoma and bladder carcinoma. Other tumor-specific antigens are suitable for use with adjuvant of the present invention and include, but are not restricted to prostate specific antigen (abbreviated PSA) or Her-2 / neu, KSG (GA733 ), MUC-1 and carcinoembryonic antigen (CEA abbreviated). Accordingly in one aspect of the present invention a vaccine comprising an adjuvant composition according to the present invention and a tumor rejection antigen is provided . .

Se prevé que las composiciones de la presente invención se utilizarán para formular vacunas que contienen antígenos derivados Borrelia sp. It is anticipated that the compositions of the present invention will be used to formulate vaccines containing antigens derived Borrelia sp. , Por ejemplo, los antígenos pueden incluir ácido nucleico, antígeno o preparaciones antigénicas derivadas de patógenos, proteínas o péptidos producidas recombinantemente y proteínas de fusión quiméricas. , For example, antigens may include nucleic acid, antigen or antigenic preparations derived from pathogens, recombinantly produced protein or peptides, and chimeric fusion proteins. En particular el antígeno es OspA. In particular the antigen is OspA. El OspA puede ser una proteína madura completa y una forma lípida en virtud de la célula hospedadora ( E. coli ) llamada (Lipo-OspA) o un derivado no lípido. The OspA may be a full mature protein and a lipid form under the host cell (E. coli) call (Lipo-OspA) or a derivative no lipid. Tales derivados no lípidos incluyen la proteína de fusión no lípida NS1-OspA que tiene los primeros 81 aminoácidos N terminal de la proteína no estructural (abreviadamente NS1) del virus de influenza, y la proteína completa OspA, y otras, MDP-OspA es un a forma no lípida de OspA que lleva 3 aminoácidos N-terminal adicionales. Such derivatives not lipids include fusion protein not lipid NS1-OspA which has the first 81 terminal amino acids N nonstructural protein (abbreviated as NS1) of the influenza virus, and the complete OspA protein, and another, MDP-OspA is a to form lipid not OspA carrying 3 additional N-terminal amino acids.

Las vacunas de la presente invención se pueden utilizar para la profilaxis o terapia de alergia. The vaccines of the present invention can be used for prophylaxis or therapy of allergy. Dichas vacunas comprenderían antígenos específicos de alérgenos (por ejemplo Der p1) y no específicos de alérgenos (por ejemplo el decapéptido de Stanworth). Such vaccines would comprise allergen specific antigens (for example Der p1) and allergen non-specific (eg the stanworth decapeptide).

La relación QS21: 3D-MPL (p/p) en una realización preferida de la presente invención estará típicamente en el, orden de 1 : 10 a 10 : 1, preferiblemente 1 : 5 a 5 : 1 ya menudo sustancialmente 1 : 1. El intervalo preferido para sinergia óptima está entre 2,5: 1y 1:1 de 3D-MPL:QS21. The ratio QS21: 3D-MPL (w / w) in a preferred embodiment of the present invention will typically be in the, range 1: 10 to 10: 1, preferably 1: 5 to 5: 1 and often substantially 1: 1. the preferred range for optimal synergy is 2.5: 1 and 1: 1 3D-MPL: QS21. Típicamente las dosificaciones de QS21 y 3D-MPL en una vacuna para administración humana estará en el intervalo entre 1 \mug y 1000 \mug, preferiblemente 10 \mug-500 \mug, y más preferiblemente 10-100 \mug por dosis. Typically the dosages of QS21 and 3D-MPL in a vaccine for human administration will be in the range between 1 \ mug and 1000 \ mug, preferably 10 \ mug-500 \ mug, and most preferably 10-100 \ mug per dose. Típicamente el aceite comprenderá entre 2 y 10% de escualeno, entre 2 y 10% de \alpha-tocoferol y entre 0,4 y 2% de monooleato de sorbitán polioxietilenado (TWEEN 80). Typically the oil will comprise from 2 to 10% squalene, from 2 to 10% \ alpha tocopherol and from 0.4 to 2% polyoxyethylene sorbitan monooleate (TWEEN 80). Preferiblemente la relación de escualeno: \alpha-tocoferol es igual o menor que 1 ya que esto proporciona una emulsión más estable. Preferably the ratio of squalene: \ alpha tocopherol is equal or less than 1 as this provides a more stable emulsion. El trioleato de sorbitán polioxietilenado (SPAN 85) puede también estar presente a un nivel de 0,5-1%. Polyoxyethylene sorbitan trioleate (SPAN 85) may also be present at a level of 0.5-1%. En algunos casos puede ser ventajoso que las vacunas de la presente invención contengan adicionalmente un estabilizador, por ejemplo otros emulsionantes/tensioactivos que incluyen ácido caprílico (merck index edición 10, entrada nº 1739), del que tricaprilina es una realización particularmente preferida. In some cases it may be advantageous that the vaccines of the present invention will further contain a stabilizer, for example other emulsifiers / surfactants, including caprylic acid (merck index 10th edition, No. 1739 entry), which tricaprylin a particularly preferred embodiment.

Por lo tanto, otra realización de esta invención es una vacuna que contiene QS21 y una emulsión aceite en agua que cae dentro de la relación deseada, que se formula en presencia de un esterol, preferiblemente colesterol, con el fin de reducir la reactogenicidad local conferida mediante la QS21. Therefore, another embodiment of this invention is a vaccine containing QS21 and an oil in water emulsion falling within the desired ratio, which is formulated in the presence of a sterol, preferably cholesterol, in order to reduce the local reactogenicity conferred by QS21. La relación de la QS21 a colesterol (p/p), presente en una realización específica de la presente invención se prevé que esté en el intervalo de 1:1 a 1:20, sustancialmente 1:10. The ratio of QS21 to cholesterol the (w / w), present in a specific embodiment of the present invention is expected to be in the range of 1: 1 to 1:20, substantially 1:10.

Las emulsiones previas utilizadas en la solicitud de patente internacional Nº WO 95/17210 mantienen obviamente algunas ventajas sobre los adyuvantes convencionales que inducen no Th-1. The previous emulsions used in International patent application WO 95/17210 obviously hold No. some advantages over conventional adjuvants that induce Th-1 no.

Sin embargo, la inclusión de QS21 ha hecho hasta ahora este potente adyuvante reactogénico, por lo tanto, conduciendo al dolor. However, the inclusion of QS21 has so far made this potent adjuvant reactogenic, thereby, leading to pain. Se ha observado que la formulación del QS21 en liposomas que contienen colesterol puede ayudar a prevenir la necrosis que se produce en el lugar de la inyección. It has been observed that the formulation of the QS21 into cholesterol containing liposomes may help prevent the necrosis occurring at the site of injection. Esta observación está sujeta a la solicitud de patente internacional Nº PCT/EP96/01464. This observation is subject to the International Patent Application No. PCT / EP96 / 01464.

En las realizaciones de la presente invención el esterol preferido es colesterol. In embodiments of the present invention the preferred sterol is cholesterol. Otros esteroles que se podrían utilizar en realizaciones de la presente invención incluyen \beta-sitosterol, estigmasterol, ergosterol, ergocalciferol y colesterol. Other sterols which could be used in embodiments of the present invention include \ beta-sitosterol, stigmasterol, ergosterol, ergocalciferol and cholesterol. Los esteroles se conocen bien en la técnica. Sterols are well known in the art. El colesterol se conoce bien y se describe, por ejemplo, en Merck Index, edición 11, página 341, como un esterol que se procuce naturalmente encontrado en la grasa animal. Cholesterol is well known and is described, for example, Merck Index, 11th edition, page 341, as a naturally procuce sterol found in animal fat.

Se sabe que la QS21 en solución acuosa degenera con el tiempo en una forma inactiva de adyuvante, QS21-H, cuya degeneración está mediada por hidrólisis ^{-}OH en el medio acuoso. It is known that QS21 in aqueous solution degenerates over time in an inactive form of adjuvant, QS21-H, which degeneration is mediated by hydrolysis ^ {-} OH in the aqueous medium. Dicha degeneración se puede producir cuando la QS21 está presente en la fase acuosa de un adyuvante de aceite en agua. Such degeneration may occur when the QS21 is present in the aqueous phase of an oil in water adjuvant. Sorprendentemente se ha encontrado que la adición de colesterol a la fase oleosa de la emulsión de aceite en agua tiene el efecto de mantener la QS21 en su forma activa, con beneficios obvios para la estabilidad en almacenamiento de la formulación adyuvante/vacuna. Surprisingly it has been found that the addition of cholesterol to the oil phase of the oil in water emulsion has the effect of maintaining the QS21 in its active form, with obvious benefits to the shelf stability of the adjuvant / vaccine formulation. La presente invención proporciona un procedimiento de estabilización de una preparación de saponina, preferiblemente, QS21, en su forma activa de adyuvante no hidrolizada, cuando la QS21 está presente en una emulsión de aceite en agua a base de adyuvante. The present invention provides a method of stabilizing a saponin preparation, preferably QS21, in its non-hydrolysed adjuvant active form, when the QS21 is present in an oil in water emulsion based adjuvant. Este procedimiento comprende la adición de un esterol, preferiblemente colesterol, en la fase oleosa de una emulsión de aceite en agua. This method comprises the addition of a sterol, preferably cholesterol, into the oil phase of an oil in water.

Dichas preparaciones se utilizan como sistemas de adyuvantes de vacunas y una vez formulada junto con antígeno o preparaciones antigénicas para vacunas potentes. Such preparations are used as vaccine adjuvant systems and once formulated together with antigen or antigenic preparations for potent vaccines. Ventajosamente, preferentemente inducen una respuesta Th1. Advantageously, preferentially induce a Th1 response.

Los sistemas de emulsión de la presente invención tienen un tamaño de gota de aceite pequeño en el intervalo submicrónico. Emulsion systems of the present invention have a small droplet size in the submicron range oil. Preferiblemente los tamaños de la gota de aceite estarán en el intervalo entre 120 y 750 nm, y más preferiblemente entre 120 y 600 nm de diámetro. Preferably the sizes of oil drop will range between 120 and 750 nm, and more preferably between 120 and 600 nm in diameter.

La cantidad de proteína en cada dosis de vacuna se selecciona como una cantidad que induce una respuesta inmunoprotectora sin efectos secundarios significativos adversos en las vacunas típicas. The amount of protein in each vaccine dose is selected as an amount which induces an immunoprotective response without significant adverse side effects in typical vaccinees. Dicha cantidad variará dependiendo de qué inmunógeno específico se emplea y cómo se presenta. Such amount will vary depending upon which specific immunogen is employed and how it is presented. En general, se espera que cada dosis comprenderá 1-1000 \mug de proteína, preferiblemente 1-500 \mug, preferiblemente 1-100 \mug, más preferiblemente 1 a 50 \mug. In general, it is expected that each dose will comprise 1-1000 \ mug of protein, preferably 1-500 \ mug, preferably 1-100 \ mug, more preferably 1 to 50 \ mug. Una cantidad óptima para una vacuna particular se puede determinar mediante estudios estándar que implican la observación de respuestas inmunes adecuadas en sujetos. An optimal amount for a particular vaccine can be ascertained by standard studies involving observation of appropriate immune responses in subjects. Después de una vacunación inicial, los sujetos pueden recibir uno o varias inmunizaciones reforzadoras espaciadas adecuadamente. Following an initial vaccination, subjects may receive one or several booster immunizations adequately spaced.

Las formulaciones de la presente invención se pueden utilizar tanto para propósitos profilácticos como terapéuticos. Formulations of the present invention can be used for both prophylactic and therapeutic purposes. En un aspecto adicional de la presente invención se proporciona una vacuna para uso en medicina como se ha descrito en esta memoria descriptiva. In a further aspect of the present invention it is provided a vaccine for use in medicine as described herein. La preparación de vacunas se describe en general en New Trends and Developments in Vaccines, editado por Voller y col., University Park Press, Baltimore, Maryland, Estados Unidos 1978. Vaccine preparation is generally described in New Trends and Developments in Vaccines, edited by Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, United States 1978.

Se prevé que las composiciones de la presente invención se usarán para formular vacunas que contienen antígenos derivados de una amplia diversidad de fuentes. It is anticipated that the compositions of the present invention used to formulate vaccines containing antigens derived from a wide variety of sources. Por ejemplo, los antígenos pueden incluir un antígeno o preparaciones antigénicas humanas, bacterianas, o de ácido nucleico viral, derivadas de patógenos, antígeno o preparaciones antigénicas derivadas de tumores, antígenos derivados de hospedadores, incluyendo el decapéptido liberador de histamina de IgE (conocido como decapéptido de Stanworth), proteína o péptidos producidos recombinantemente y proteínas de fusión quiméricas. For example, antigens may include an antigen or preparations antigenic human, bacterial, or viral nucleic acid, pathogen-derived antigen or antigenic preparations derived from tumor antigens derived from hosts, including releasing decapeptide histamine IgE (known as Stanworth decapeptide), recombinantly produced peptides or protein and chimeric fusion proteins.

  \newpage \ newpage 

Las preparaciones de vacunas de la presente invención se pueden utilizar para proteger o tratar un mamífero susceptible a, o que padece una enfermedad, mediante la administración de dicha vacuna mediante vía sistémica oa la mucosa. The vaccine preparations of the present invention can be used to protect or treat a mammal susceptible to or suffering from a disease, by administering said vaccine via systemic or mucosal. Estas administraciones pueden incluir inyección mediante las vías intramuscular, intraperitoneal, intradérmica o subcutánea; These administrations may include injection via the intramuscular, intraperitoneal, intradermal or subcutaneous routes; o mediante la administración a la mucosa de los tractos oral/alimentario o respiratorio. or by administration to the mucosa of the oral / alimentary, or respiratory tracts.

Ejemplo 1 Example 1 Preparación de los adyuvantes de emulsión de aceite en agua Preparation of emulsion adjuvants Oil in water

Las formulaciones de adyuvantes de emulsión de aceite en agua usadas en los ejemplos siguientes se preparan comprendiendo cada una el siguiente componente de emulsión de aceite en agua: 5% de escualeno, 5% de \alpha-tocoferol, 2,0% de monooleato de sorbitán polioxietilenado (TWEEN 80). Adjuvant formulations emulsion oil in water used in the following examples are prepared each comprising the following oil emulsion component in water: 5% squalene, 5% \ -tocopherol, 2.0% monooleate polyoxyethylene sorbitan (TWEEN 80).

Se preparó la emulsión como sigue en una forma dos veces concentrada. The emulsion was prepared as follows in a form concentrated twice. Todos los ejemplos utilizados en los experimentos inmunológicos se diluyen con la adición de componentes y diluyentes extra para proporcionar bien una concentración 1 x (equivalente a una relación de escualeno:QS21 (p/p) de 240:1) o diluciones adicionales de los mismos. All examples used in the immunological experiments are diluted with the addition of components and extra diluent to provide either a 1 * concentration (equivalent to a ratio of squalene: 1: QS21 (w / w) 240) additional or dilutions thereof .

Brevemente, se disuelve el TWEEN 80 en solución salina tamponada con fosfato (abreviadamente PBS) para proporcionar una solución de 2% en el PBS. Briefly, the TWEEN 80 is dissolved in phosphate buffered saline (PBS abbreviated) to provide a 2% solution in the PBS. Para proporcionar 100 ml de una emulsión concentrada dos veces, se agitan con vórtice 5 ml de alfatocoferol DL y 5 ml de escualeno hasta mezclar completamente. To provide 100 ml two fold concentrate emulsion, stirred with 5 ml of vortex DL alpha tocopherol and 5ml of squalene to thoroughly mix. Se añaden 95 ml de solución PBS/TWEEN al aceite y se mezclan completamente. 95ml of PBS / TWEEN solution is added to the oil and mixed thoroughly. Después la emulsión resultante se pasa a través de una aguja de jeringa y finalmente se microfluidifica utilizando una máquina Microfluidics M110S. The resulting emulsion is passed through a syringe needle and finally microfluidised by using an M110S Microfluidics machine. Las gotas de aceite resultantes tienen un tamaño de aproximadamente 145-180 nm (expresado como media de z medido por PCS) y se denomina "dosis completa" de SB62. The resulting oil droplets have a size of approximately 145-180 nm (expressed as z average measured by PCS) and is termed "full dose" SB62.

Se añaden los otros componentes de adyuvantes/vacunas (QS21, 3D-MPL o antígeno) a la emulsión en una mezcla única. the other components of adjuvants / vaccines (QS21, 3D-MPL or antigen) are added to the emulsion in a single mixture.

Las vacunas que contienen antígenos usadas en esta memoria descriptiva se formulan bien con dosis completa de adyuvante SB62 para proporcionar una relación alta (240:1) de escualeno:QS21 o con una cantidad inferior de SB62 para proporcionar una formulación de relación inferior (48:1), estas formulaciones de adyuvantes se llaman SB62 y SB62' respectivamente. Vaccines containing antigens used herein are formulated either with full dose SB62 adjuvant to give a high ratio (240: 1) of squalene: QS21 or with a lower amount of SB62 to give a formulation of lower ratio (48: 1), these adjuvant formulations are called SB62 and SB62 'respectively. Opcionalmente se pueden formular otras vacunas con la adición de colesterol a la fase oleosa de la emulsión (designadas mediante la adición de la letra "c"). Optionally may be formulated with other vaccines the addition of cholesterol to the oil phase of the emulsion (designated by adding the letter "c").

Ejemplo 2 example 2 Estudios de inmunogenicidad con antígeno recombinante S,L* Immunogenicity studies with recombinant antigen S, L *

Se llevó a cabo un estudio en ratones Balb/C con el fin de comparar la inmunogenicidad de diversas formulaciones que contienen S,L*. A study was conducted in Balb / C mice in order to compare the immunogenicity of various formulations containing S, L *. S,L* es un antígeno compuesto que comprende una proteína (L*) de antígeno L de superficie modificado y una proteína S ambas derivadas del virus de la hepatitis B (abreviadamente HB). S, L * is a composite antigen comprising a protein (L *) L antigen modified surface and an S protein both derived from the Hepatitis B Virus (abbreviated HB). Este antígeno compuesto es el sujeto de la solicitud de patente europea Nº EP 0 414 374. Este esquema de inmunización usado en el modelo de ratones transgénicos HB que se ha mostrado previamente que soporta la inducción de CTL en ratones Balb/c. This compound antigen is the subject of European Patent Application No. EP 0 414 374. This immunization scheme used in the transgenic mice model HB previously shown that supports CTL induction in BALB / c mice.

Las diferentes formulaciones de adyuvantes, que utilizan los sistemas de emulsiones descritos en el ejemplo 1, con diferentes relaciones de escualeno:QS21, y que comprenden opcionalmente colesterol (relación de QS21:colesterol p/p de 1:10), se combinaron con S,L* y se compararon en su capacidad para inducir respuestas inmunes humorales y mediadas por células (producción de citoquina y CTL). Different adjuvant formulations, using the emulsion systems described in Example 1, with differing ratios of squalene: QS21, and optionally comprising cholesterol (QS21 ratio: cholesterol w / w of 1:10), were combined with S , L * and compared in their ability to induce humoral immune responses and cell mediated (CTL and cytokine production). S,L* adsorbido en hidróxido de aluminio (AlOH_{3}) se utilizó como un control inductor de Th1. S, L * was adsorbed on aluminum hydroxide (AlOH_ {3}) was used as an inducer of Th1 control.

Brevemente, se inmunizaron intramuscularmente grupos de 10 ratones 4 veces a intervalos de 3 semanas con 2 \mug de S,L* liofilizado combinado con diversos sistemas de emulsiones de aceite en agua (SB62). Briefly, groups of 10 mice were immunized intramuscularly 4 times at 3 weeks interval with 2 \ mug of S, L * combined with various systems lyophilised oil-in-water (SB62). 14 días después de la cuarta inmunización se analizó la producción de citoquinas (IL5 e IFN-\gamma) y la actividad de CTL después de reestimulación in vitro de células de bazo y de ganglios linfáticos con antígeno S,L*. 14 days after the fourth immunization the production of cytokines (IL5 and IFN- \ gamma) and CTL activity was analyzed after in vitro restimulation of spleen and lymph node antigen S, L *. La respuesta de anticuerpo a S,L* y el perfil isotópico inducido se controlaron mediante ELISA a los 21 días después de II y 14 días después de IV. The antibody response to S, L * and the induced isotopic profile were monitored by ELISA at 21 days post II and 14 days post IV.

Grupos de ratones Groups of mice

Se inmunizaron intramuscularmente grupos de 10 ratones Balb/C con formulaciones descritas más adelante. Groups of 10 Balb / C mice with formulations described below were immunized intramuscularly. SB62 se formuló junto con el antígeno a una relación alta (240:1, SB62) o baja (48:1, SB62') de escualeno:QS21, opcionalmente con la adición de colesterol (c). SB62 was formulated together with the antigen at a high ratio (240: 1, SB62) or low (48: 1, SB62 ') of squalene: QS21, optionally with the addition of cholesterol (c).

TABLA 1 TABLE 1 Grupos de ratones y composiciones de vacunas utilizadas en el ejemplo 2 Groups of mice and vaccines compositions used in example 2

Grupo Group Antígeno S,L* Antigen S, L * Nombre de adyuvante Adjuvant name Composición de formulación Composition Formulation
de adyuvantes adjuvant
GR 1 GR 1 2 \mu 2 \ mu SB62 SB62 25 \mul de SB62/ 5 \mug de QS21/ 25 \ mul SB62 / 5 \ mug QS21 /
5 \mug de 3D-MPL 5 \ mug 3D-MPL
GR 2 GR 2 2 \mu 2 \ mu SB62c SB62c 25 \mul de SB62c/ 5 \mug de QS21/ 25 \ mul SB62c / 5 \ mug QS21 /
5 \mug de 3D-MPL 5 \ mug 3D-MPL
GR 3 GR 3 2 \mu 2 \ mu SB62' SB62 ' 5 \mul de SB62/ 5 \mug de QS21/ 5 \ mul SB62 / 5 \ mug QS21 /
5 \mug de 3D–MPL 5 \ mug 3D-MPL
GR 4 GR 4 2 \mu 2 \ mu SB62'c SB62'c 5 \mul de SB62c/ 5 \mug de QS21/ 5 \ mul SB62c / 5 \ mug QS21 /
5 \mug de 3D-MPL 5 \ mug 3D-MPL
GR 5 GR 5 2 \mu 2 \ mu Alum Alum 50 \mug de AlOH_{3} 50 \ mug of AlOH_ {3}

Esquema de inmunización Immunization schedule

Se inmunizaron los animales intramuscularmente en la pata (50 \mul para todos los grupos excepto para el grupo 5 donde se inyectó 100 \mul) en los días 0, 21, 42 y 63. Se tomó sangre del seno retroorbital en varios instantes después de las inmunizaciones. Animals were immunized intramuscularly in the leg (50 \ mul for all groups except for group 5 where 100 \ mul was injected) at days 0, 21, 42 and 63. Blood was taken from the retroorbital sinus at various times after immunizations. El día 77, se sacrificaron los animales de cada grupo, se retiraron los bazos y ganglios linfáticos que drenan el lugar de la inyección (ganglios linfáticos ilíacos) para reestimulación in vitro . On day 77, animals from each group were sacrificed, spleens and lymph nodes draining the site of injection (iliac lymph nodes) for in vitro restimulation were removed. Se obtuvieron conjuntos de 3 ó 4 bazos y 1 conlunto de 10 LN para cada grupo y se trataron separadamente en los ensayos in vitro . Sets of 3 or 4 spleens and 1 conlunto 10 LN for each group were obtained and treated separately in the in vitro assays.

Serología de ratones Serology of mice

La cuantificación de los anticuerpos anti-HBs se realizó mediante ELISA utilizando antígeno de superficie de HB como antígeno de recubrimiento. Quantification of anti-HBs antibodies was performed by ELISA using HB surface antigen as coating antigen. Las soluciones de antígeno y anticuerpo se utilizaron a 50 \mul por pocillo. The antigen and antibody solutions were used at 50 \ per well. Se diluyó el antígeno a una concentración final de 1 \mug/ml en PBS y se adsorbió durante una noche a 4ºC a los pocillos de placas de microtitulación de 96 pocillos (Maxisorb Immuno-plate, Nunc, Dinamarca). The antigen was diluted at a final concentration of 1 \ g / ml in PBS and was adsorbed overnight at 4 to the wells of 96 well microtiter (Maxisorb Immuno-plate, Nunc, Denmark). Después las placas se incubaron durante 1 hora a 37ºC con PBS que contenía albúmina sérica bobina al 1% y TWEEN 20 (tampón de saturación) al 0,1%. Plates were incubated for 1 hour at 37 with PBS containing bovine serum albumin and 1% TWEEN 20 (saturation buffer) 0.1%. Las diluciones dos veces de sueros (comenzando en dilución 1/100) en el tampón de saturación se añadieron a las placas recubiertas con los HBs y se incubaron durante 1 hora 30 minutos a 37ºC. Dilutions twice sera (starting at 1/100 dilution) in the saturation buffer were added to plates coated with HBs and incubated for 1 hour 30 minutes at 37C. Se lavaron las placas cuatro veces con PBS 0,1% de TWEEN 20 y se añadió a cada pocillo IgG1, IgG2a, IgG2b o Ig anti-ratón conjugado con biotina (Amersham, Reino Unido) diluido 1/1000 en tampón de saturación y se incubó durante 1 hora 30 minutos a 37ºC. Plates were washed four times with PBS 0.1% TWEEN 20 was added to each well IgG1, IgG2a, IgG2b or anti-mouse Ig conjugated to biotin (Amersham, UK) diluted 1/1000 in saturation buffer and it incubated for 1 hour 30 minutes at 37C. Después de una etapa de lavado, se añadió complejo estreptavidina-peroxidasa biotinilada (Amersham, Reino Unido) diluida 1/5000 en tampón de saturación durante 30 minutos adicionales a 37ºC. After a washing step, biotinylated (Amersham, UK) diluted 1/5000 in saturation buffer for an additional 30 minutes at 37C it was added streptavidin-peroxidase complex. Se lavaron las placas como se ha indicado anteriormente y se incubaron durante 20 minutos con una solución de o -fenilendiamina (Sigma) al 0,04% H_{2}O_{2} al 0,03% en 0,1% de TWEEN 20 tampón citrato 0,05 M pH 4,5. Plates were washed as above and incubated for 20min with a solution of o - phenylenediamine (Sigma) 0.04% H {2} {2} O_ 0.03% in 0.1% TWEEN 20 0.05M citrate buffer pH 4.5. Se detuvo la reacción con H_{2}SO_{4} 2 N y se leyó a 492/620 nm. the reaction was stopped with H {2} {4} SO 2 N and read at 492/620 nm is. Se calcularon los títulos ELISA a partir de una referencia de SoftmaxPro (usando una ecuación de cuatro parámetros) y se expresó en UE/ml. ELISA titers were calculated from a reference by SoftmaxPro (using a four parameters equation) and expressed in EU / ml.

Proliferación de células T T cell proliferation

Dos semanas después de la segunda inmunización, se sacrificaron los ratones, se retiraron asépticamente el bazo y los ganglios linfáticos en conjuntos (3 ó 4 órganos por conjunto de células esplénicas, 1 conjunto de 10 órganos por células de ganglios linfáticos (abreviadamente LNC)). Two weeks after the second immunization, mice were killed, were aseptically removed spleens and lymph nodes in sets (3 or 4 organs per pool for splenic cells, 1 set of 10 bodies by lymph node cells (abbreviated LNC)) . Las suspensiones celulares se prepararon en medio RPMI 1640 (GIBCO) que contenía L-glutamina 2 mM, antibióticos, 2-mercaptoetanol 5 x 10^{-5} M y 1% de suero de ratón normal singénico. Cell suspensions were prepared in RPMI 1640 medium (GIBCO) containing 2 mM L-glutamine, antibiotics, 2-mercaptoethanol 5 x 10 {- 5} M and 1% syngeneic normal mouse serum. Se cultivaron las células a una concentración final de 2 x 10^{6} células/ml (para LNC o células de bazo (abreviadamente SPC)) en 200 \mul en placas de 96 pocillos de fondo redondo con diferentes concentraciones (10-0,03 \mug/ml) de antígeno S,L* (25D84). Cells were cultured at a final concentration of 2 x 10 6} {cells / ml (for LNC or spleen cells (abbreviated SPC)) in 200 \ mul in 96 well round bottom with different concentrations (10-0 03 \ mug / ml) antigen S, L * (25D84). Cada ensayo se llevó a cabo por cuadruplicado. Each assay was performed in quadruplicate. Después de 96 horas de cultivo a 37ºC en CO_{2} al 5%, se pulsaron las células durante 18 h con ^{3}H-timidina (Amersham, Reino Unido, 5Ci/mmol) a 0,5 \muCi/pocillo y después se recogieron en filtros de fibra de vidrio con un recolector de células. After 96 hours of culture at 37 ° C in CO 2 {} 5%, the cells were pulsed for 18 h with ^ {3} H-thymidine (Amersham, UK, 5ci / mmol) at 0.5 \ uCi / well and then they harvested on glass fiber filters with a cell harvester. Se midió la radiactividad incorporada en un contador de centelleo líquido. built on a liquid scintillation counter radioactivity measured. Los resultados se expresan en cpm (media de cpm en pocillos cuadriplicados) o como índices de estimulación (media de cpm en cultivos de células con antígeno / media de cpm en cultivo de células sin antígeno). Results are expressed in cpm (mean cpm in quadruplicate wells) or as stimulation indices (mean cpm in cultures of cells with antigen / mean cpm in cell culture without antigen).

  \newpage \ newpage 
Producción de citoquinas Cytokine Production

Dos semanas después de la segunda inmunización, se sacrificaron los ratones, se retiraron asépticamente el bazo y los ganglios linfáticos en conjuntos (3 ó 4 órganos por conjunto para células esplénicas, 1 conjunto de 10 órganos para LNC). Two weeks after the second immunization, mice were sacrificed, spleens removed aseptically and lymph nodes in sets (3 or 4 organs per pool for splenic cells, 1 set of 10 organs for LNC). Se prepararon las suspensiones de células en medio RPMI 1640 (GIBCO) que contenía L-glutamina 2 mM, antibióticos, 2-mercaptoetanol 5 x 10^{-5} M y 5% de suero de ternera fetal. cell suspensions in RPMI 1640 medium (GIBCO) containing 2 mM L-glutamine, antibiotics, 2-mercaptoethanol 5 x 10 were prepared {- 5} M and 5% fetal calf serum. Se cultivaron las células a una concentración final de 2,5 a 5 x 10^{6} células/ml (respectivamente para LNS o SPC) en 1 ml, en 24 pocillos de fondo plano con diferentes concentraciones (1-0,01 \mug/ml) de S,L* (25D84). cells at a final concentration of 2.5 to 5 × 10 6} {cells / ml were cultured (respectively for LNS or SPC) in 1ml, in flat-bottomed 24 wells with different concentrations (1-.01 \ mug / ml) of S, L * (25D84). Se recogieron los sobrenadantes 96 horas más tarde y se congelaron hasta ensayo para la presencia de IFNg e IL-5 mediante ELISA. Supernatants were harvested 96 hrs later and frozen until assay for the presence of IFNg and IL-5 by ELISA.

Producción de IFN-\gamma IFN- production \ gamma

La cuantificación de IFN-\gamma se realizó mediante ELISA utilizando reactivos de Genzyme. Quantification of IFN- \ gamma is performed by ELISA using reagents from Genzyme. Las soluciones de muestras y anticuerpos se utilizaron a 50 \mul por pocillo. The solutions of samples and antibodies were used at 50 \ per well. Se recubrieron placas de microtitulación de 96 pocillos (Maxisorb Immuno-plate, Nunc, Dinamarca) durante una noche a 4ºC con 50 \mul de IFNg de hámstaer anti-ratón diluido en 1,5 \mug/ml en tampón carbonato pH 9,5. microtiter plates 96 wells (Maxisorb Immuno-plate, Nunc, Denmark) were coated overnight at 4 with 50 \ mul hámstaer IFNg diluted mouse anti-1.5 \ mug / ml in carbonate buffer pH 9.5 . Después las placas se incubaron durante 1 hora a 37ºC con 100 \mul de PBS que contenía 1% de albúmina sérica bovina y 0,1% de TWEEN 20 (tampón de saturación). Plates were incubated for 1 hour at 37 with 100 \ l of PBS containing 1% bovine serum albumin and 0.1% TWEEN 20 (saturation buffer). Las diluciones dos veces de los sobrenadantes de estimulación in vitro (comenzando a ½) en tampón de saturación se añadieron a las placas recubiertas con anti-IFNg y se incubaron durante 1 hora 30 minutos a 37ºC. Dilutions of the supernatants twice in vitro stimulation (starting at ½) in saturation buffer to plates coated with anti-IFNg and incubated for 1 hour 30 minutes at 37 were added. Se lavaron las placas 4 veces con PBS TWEEN al 0,1% (tampón de lavado) y se añadió a cada pocillo IFNg de cabra anti-ratón conjugado con biotina diluido en tampón de saturación a una concentración final de 0,5 \mug/ml y se incubó durante 1 hora a 37ºC. the plates 4 times with PBS TWEEN 0.1% were washed (wash buffer) and added to each well IFNg goat anti-mouse biotin conjugated diluted in saturation buffer at a final concentration of 0.5 \ mug / ml and incubated for 1 hour at 37 ° C. Después de una etapa de lavado, se añadió conjugado AMDEX (Amersham) diluido 1/10000 en tampón de saturación durante 30 minutos a 37ºC. After a washing step, AMDEX conjugate was added (Amersham) diluted 1/10000 in saturation buffer for 30 minutes at 37C. Se lavaron las placas como se ha indicado anteriormente y se incubaron con 50\mul de TMB (Biorad) durante 10 minutos. Plates were washed as above and incubated with 50 \ mul of TMB (Biorad) for 10 minutes. Se detuvo la reacción con H_{2}SO_{4} 0,4 N y se leyó a 450 nm. the reaction was stopped with H {2} {4} SO 0.4N and read at 450 nm. Se calcularon las concentraciones utilizando una curva estándar (estándar de IFN\gamma de ratón) de SoftmaxPro (ecuación de cuatro parámetros) y se expresó en pg/ml. Concentrations were calculated using a (standard IFN \ mouse gamma) by SoftmaxPro (four parameters equation) standard curve and expressed in pg / ml.

Producción de IL-5 IL-5

Se realizó la cuantificación de IL5 mediante ELISA uilizando reactivos de Pharmingen. Quantitation of IL5 was performed by ELISA uilizando reagents from Pharmingen. Se utilizaron soluciones de muestras y anticuerpos a 50 \mul por pocillo. Samples and antibody solutions 50 \ per well were used. Las placas de microtitulación de 96 pocillos (Maxisorb Immuno-plate, Nunc, Dinamarca) se recubrieron durante una noche a 4ºC con 50 \mul de IL5 de rata anti-ratón diluida a 1 \mug/ml en tampón carbonato pH 9,5. Microtiter plates 96-well (Maxisorb Immuno-plate, Nunc, Denmark) were coated overnight at 4 with 50 \ mul IL5 diluted 1 rat anti-mouse \ mug / ml in carbonate buffer pH 9.5. Después las placas se incubaron durante 1 hora a 37ºC con 100 \mul de PBS que contenía 1% de albúmina sérica bovina y 0,1% de TWEEN 20 (tampón de saturación). Plates were incubated for 1 hour at 37 with 100 \ l of PBS containing 1% bovine serum albumin and 0.1% TWEEN 20 (saturation buffer). Se añadieron las diluciones dos veces de sobrenadantes de estimulación in vitro (comenzando a ½) en tampón de saturación a las placas recubiertas con anti-IL5 y se incubaron durante 1 hora 30 minutos a 37ºC, Se lavaron las placas 4 veces con PBS TWEEN al 0,1% (tampón de lavado) y se añadió a cada pocillo IL5 de rata anti-ratón conjugado a biotina diluida en tampón de saturación a una concentración final de 1 \mug/ml y se incubó durante 1 hora a 37ºC. Dilutions were added twice supernatants in vitro stimulation (starting at ½) in saturation buffer to plates coated with anti-IL5 and incubated for 1 hour 30 minutes at 37, the plates 4 times with PBS TWEEN were washed to 0.1% (wash buffer) and added to each well IL5 rat anti-mouse biotin conjugate diluted in saturation buffer at a final concentration of 1 \ mug / ml and incubated for 1 hour at 37 ° C. Después de una etapa de lavado, se añadió conjugado AMDEX (Amersham) diluido 1/10000 en tampón de saturación durante 30 minutos a 37ºC. After a washing step, AMDEX conjugate was added (Amersham) diluted 1/10000 in saturation buffer for 30 minutes at 37C. Se lavaron las placas cono se ha indicado anteriormente y se incubaron con 50 \mul de TMB (Biorad) durante 15 minutos. the plates were washed cone indicated above and incubated with 50 \ mul of TMB (Biorad) for 15 minutes. Se detuvo la reacción con H_{2}SO_{4} 0,4 N y se leyó a 450 nm. the reaction was stopped with H {2} {4} SO 0.4N and read at 450 nm. Se calcularon las concentraciones utilizando una curva estándar (IL5 de ratón recombinante) de SoftmaxPro (ecuación de cuatro parámetros) y se expresó en pg/ml. Concentrations were calculated using a standard curve (recombinant mouse IL5) by SoftmaxPro (four parameters equation) and expressed in pg / ml.

Inducción de CTL CTL induction

Dos semanas después de la segunda inmunización, se sacrificaron los ratones, se retiraron asépticamente los bazos en conjuntos de 3 ó 4 ratones (2 conjuntos de 3 y un conjunto de cuatro ratones por grupo). Two weeks after the second immunization, mice were killed, spleens were aseptically removed in sets of 3 or 4 mice (2 pools of 3 and a set of four mice per group). Se prepararon las suspensiones de células en medio RPMI 1640 (GIBCO) que contenía L-glutamina 2 mM, antibióticos, 2-mercaptoetanol cell suspensions in RPMI 1640 medium (GIBCO) containing 2 mM L-glutamine, antibiotics, 2-mercaptoethanol were prepared
5 x 10^{-5} M y 5% de suero de ternera fetal. 5 x 10 {- 5} M and 5% fetal calf serum. Se cultivaron las células a una concentración final de 2 x 10^{6} células/ml en 10 ml de medio que contenía 2 \mug/ml de SL* y 1,25% de ConA sup (matraces Falcon de 25 cm^{2}) y se incubaron durante 8 días a 37ºC en 5% de CO_{2}. Cells were cultured at a final concentration of 2 x 10 6} {cells / ml in 10 ml medium containing 2 \ mug / ml SL * and 1.25% ConA sup of (Falcon flasks of 25 cm { 2}) and incubated for 8 days at 37 in 5% CO 2 {}.

Ensayo de CTL CTL assay

El día antes del ensayo de CTL (d 7), se prepararon las células diana mediante incubación de células P815 (10^{6} células/ml) con S,L* (lote 25D84) o péptido S_{28-39} a 10 \mug/ml. The day before the CTL assay (d 7), target cells were prepared by incubation of P815 cells (10 6} {cells / ml) with S, L * (batch 25D84) or peptide S {28-39} to 10 \ mug / ml. Después de 1 hora de incubación en tubos Falcon de15 ml en un pequeño volumen, se transfirieron las células a placas de 24 pocillos y se incubaron durante una noche a 37ºC. After 1 hour incubation of15 ml Falcon tubes in a small volume, cells are transferred to 24 well plates and incubated overnight at 37 ° C.

El día del ensayo, 2 x 10^{6} células P815 se pulsaron con S,L* y S_{28-39} y las P815-S se centrifugaron, se resuspendieron en 50 \mul de FCS y se incubaron con 75 \mul de ^{51}Cr (375 \muCi) durante 1 hora a 37ºC (agitando cada 15'). On the test day, 2 x 10 6} {P815 cells pulsed with S, L * and S 28-39} and {P815-S are centrifuged, resuspended in 50 \ mul FCS and incubated with 75 \ mul ^ {51} Cr (375 \ uCi) for 1 hour at 37 ° C (shaking every 15 '). Después las células se lavaron cuatro veces con 10 ml de medio completo y se incubaron durante 30' a 4ºC después del cuarto lavado. Cells were washed four times with 10 ml complete medium and incubated for 30 'at 4 ° C after the fourth wash. Después las células se centrifugaron y se volvieron a suspender a una concentración de 2 x 10^{4} células/ml. The cells were centrifuged and resuspended at a concentration of 2 x 10 4} {cells / ml.

Después las células efectoras se centrifugaron, se contaron y se volvieron a suspender a 2 x 10^{6} células/ml. Then the effector cells were centrifuged, counted and resuspended at 2 x 10 6} {cells / ml. Se realizaron diluciones en serie tres veces de las células efectoras en placas de 96 pocillos con fondo en V, comenzando a una concentración de 2 x 10^{5} células/pocillo/100 \mul. Serial dilutions were performed three times of effector cells in 96 well plates with V bottom, starting at a concentration of 2 x 10 5} {cells / well / 100 \ mul.

  \newpage \ newpage 

Se añadieron 2 x 10^{3} células diana en 100 \mul a las células efectoras por triplicado. 2 x 10 {3} target cells were added in 100 \ mul to effector cells in triplicate. Se valoró la liberación espontánea y máxima mediante la incubación de células diana con medio o Tritón X100 al 3% respectivamente. Spontaneous and maximum release are assessed by incubating target cells with medium or Triton X100 3% respectively.

Se centrifugaron las placas 3' a 700 rpm y se incubaron durante 4 horas a 37ºC. plates 3 'were centrifuged at 700 rpm and incubated for 4 hours at 37. Después del tiempo de incubación, se transfirieron 50 \mul de sobrenadante desde cada pocillo a placas Luma y se secaron durante una noche antes de contar en un contador de centelleo Top-count. After the incubation time, 50 \ mul of supernatant were transferred from each well to Luma plates and dried overnight before counting in a scintillation counter Top-count.

Los resultados se expresan como lisis específica y se calcularon como sigue: Results are expressed as specific lysis and calculated as follows:

% de SR = (media de cpm de la muestra-media de cpm del medio / media de cpm máxima-media de cpm del medio) x 100 % SR = (mean cpm sample-cpm medium average / mean cpm max-average cpm medium) x 100

Resultados results Serología Serology

Las respuestas humorales (isotipos Ig e IgG) se midieron mediante ELISA utilizando antígeno de superficie de HB como antígeno de recubrimiento. Humoral responses (Ig and isotypes IgG) were measured by ELISA using HB surface antigen as coating antigen. Solamente se muestran los datos de los 21 días del instante después de II. Only data from the 21 days immediately after II are shown.

Los resultados se muestran en las figuras 1 y 2. The results are shown in Figures 1 and 2.

Figura 1, muestra las respuestas de anticuerpo de Ig específica de Hbs medidas en ambos sueros de ratones individuales y media del grupo, 14 días después de II. Figure 1 shows the antibody responses of Hbs specific Ig measures in both sera from individual mice and group average, 14 days after II.

Figura 2, muestra la distribución de subtipos de Ig específica de Hbs en el suero de los ratones vacunados. Figure 2 shows the distribution of subtypes Hbs specific Ig in the serum of vaccinated mice.

\bullet \ bullet
Como se puede ver en la figura 1, las formulaciones relativas a SB62 inducen títulos de anticuerpos mucho más altos que la formulación de S,L* Alum. As seen in Figure 1, SB62 related formulations induce much higher titers than the formulation of S, L * Alum antibodies.

\bullet \ bullet
El análisis estadístico en sueros individuales (Anova 1 test de Newman Keuls) no muestran diferencia significativa en títulos de anticuerpos inducidos por SB62 y SB62'c o igualmente entre los títulos de anticuerpos inducidos por SB62 y SB62'c. Statistical analysis on individual sera (1 Anova Newman Keuls test) show no significant difference in titers induced by SB62 and SB62'c or equally between the titers induced by SB62 and SB62'c antibodies. Por lo tanto, los títulos de anticuerpos anti-S,L* resultantes son independientes del la relación escualeno:QS21. Therefore, the titers of anti-S, L * are independent of the resulting relationship squalene: QS21.

\bullet \ bullet
El perfil de la distribución subisotípica (como se muestra en la figura 2) es comparable para todas las formulaciones relativas a SB62 (25-30% de IgG2a) mientras que las de Alum inducen solamente 4% de IgG2a. The profile distribution subisotípica (as shown in figure 2) is comparable for all SB62 related formulations (25-30% IgG2a) whereas Alum induce only those of 4% IgG2a.
Respuestas inmunes mediadas por células cell mediated immune responses

Las respuestas inmunes mediadas por células (linfoproliferación, producción de IFN\gamma / IL5 y CTL) se midieron a los 14 días después de IV después de reestimulación in vitro de células esplénicas y de ganglios linfáticos ilíacos con antígeno S,L*. The cell - mediated immune responses (lymphoproliferation, IFN \ / IL5 and CTL) were measured at 14 days post IV after in vitro restimulation of splenic cells and iliac lymph node cells with antigen S, L *.

Producción de citoquinas Cytokine Production

La producción de citoquinas (IFN\gamma e IL-5) se ha medido después de las 96 horas de reestimulación in vitro de células esplénicas y células de ganglios linfáticos ilíacos con S,L*. Cytokine production (IFN \ gamma and IL-5) was measured after 96 hours of in vitro restimulation of splenic cells and iliac lymph nodes cells with S, L *. Estos resultados se representan en las figuras 3 a 6. These results are shown in Figures 3 to 6.

Figura 3, muestra los resultados de la producción de IFN-\gamma por las células esplénicas (media de los datos obtenidos con tres conjuntos / grupo). 3 shows the results of the production of IFN- \ gamma by (mean of data obtained with three pools / group) spleen cells.

Figura 4, muestra los resultados de la producción de IL-5 por las células esplénicas (media de los datos obtenidos con tres conjuntos / grupo). Figure 4 shows the results of the production of IL-5 by (mean of data obtained with three pools / group) spleen cells.

Figura 5, muestra los resultados de la producción de IFN-\gamma por las células de los ganglios linfáticos ilíacos (media de los datos obtenidos con tres conjuntos / grupo). Figure 5 shows the results of the production of IFN- \ gamma by cells of iliac lymph nodes (mean of data obtained with three pools / group).

Figura 6, muestra los resultados de la producción de IL-5 por las células de los ganglios linfáticos ilíacos (media de los datos obtenidos con tres conjuntos / grupo). Figure 6 shows the results of IL-5 production by cells of iliac lymph nodes (mean of data obtained with three pools / group).

TABLA 2 TABLE 2 Relación de IFN-\gamma: IL-5 producidas por células detectadas en células esplénicas Ratio IFN \ gamma: IL-5 produced by cells detected in splenic cells

Reestimulación restimulation Grupos groups
GR 1 GR 1 GR 2 GR 2 GR 3 GR 3 GR 4 GR 4 GR 5 GR 5
10 \mug/ml de S,L* 10 \ g / ml S, L * 22,9 22.9 10,7 10.7 51,7 51.7 17,0 17.0 0,9 0.9

Descripción Description

\bullet \ bullet
Pequeñas cantidades de emulsión son beneficiosas para la producción de IFN-\gamma. Small amounts of emulsion are beneficial to IFN- production \ gamma. Niveles muy altos de IFN-\gamma se producen después de la reestimulación de células esplénicas de animales inmunizados con formulaciones que contienen la emulsión de baja relación. Very high levels of IFN- \ gamma occur after restimulation of splenic cells from animals immunized with formulations containing the low ratio emulsion. Estos niveles son significativamente mayores que los obtenidos después de la vacunación con las formulaciones correspondientes utilizando una emulsión de dosis completa. These levels are significantly higher than those obtained after vaccination with corresponding formulations using the emulsion full dose. La producción más fuerte de IFN-\gamma se obtiene después de la reestimulación de células esplénicas de animales inmunizados con S,L* SB62 y SB62'c. The strongest IFN- production \ gamma is obtained after restimulation of splenic cells from animals immunized with S, L * SB62 and SB62'c.

\bullet \ bullet
El efecto beneficioso de las formulaciones de relación baja (grupos 3 y 4 en las figuras 5 y 6) es mucho más marcado cuando se miran las células derivadas de los ganglios linfáticos que drenan (ganglios linfáticos ilíacos) comparado con los cogidos del bazo. The beneficial effect of the low ratio formulations (groups 3 and 4 in Figures 5 and 6) is much more pronounced when cells derived from the lymph nodes draining (iliac lymph nodes) compared caught spleen look.

\bullet \ bullet
Una relación IFN-\gamma: IL-5 > 1 claramente sugiere que se induce una respuesta pro TH1 por todas las formulaciones relativas a SB62 (véase tabla 1). A relationship IFN- \ gamma: IL-5> 1 clearly suggests that a pro TH1 response is induced by all SB62 related formulations (see table 1).

\bullet \ bullet
Los animales inmunizados con formulaciones de S,L* SB62c producen niveles más altos de IL-5 que los inmunizados con formulaciones de S,L*SB62 que no contienen colesterol. Animals immunized with formulations of S, L * SB62c produce higher levels of IL-5 immunized with formulations of S, L * SB62 formulations not containing cholesterol. Los animales inmunizados con S,L* Alum son los que producen los más altos niveles de IL-5. Animals immunized with S, L * Alum are those that produce the highest levels of IL-5.

\bullet \ bullet
Se observa una producción más fuerte de IFN-\gamma cuando se usan las formulaciones (SB62' y SB62'c) de relación baja de escualeno: QS21. a stronger IFN- production \ gamma is observed when the formulations (SB62 'and SB62'c) low ratio of squalene are used: QS21.
Respuesta de células T citotóxicas Response of cytotoxic T cells

Las respuestas de CTL anti-S,L* se proporcionan en la figura 7. CTL responses anti-S, L * are provided in Figure 7.

Figura 7, muestra la actividad de CTL de las células T esplénicas estimuladas in vitro durante 7 días con antígeno S,L* (media de % de lisis específica de tres conjuntos). Figure 7 shows the CTL activity of splenic T cells stimulated in vitro for 7 days with antigen S, L * (mean% specific lysis of three sets).

Descripción de los resultados de CTL Description of the results of CTL

\bullet \ bullet
Se obtiene lisis específica con todas las formulaciones de emulsiones de aceite en agua. Specific lysis is obtained with all formulations of oil-in-water.

\bullet \ bullet
Se observa una respuesta más fuerte de CTL con formulaciones que contienen emulsiones de SB62' cuando se mira la relación limitante de E/T tal como 3/1. a stronger CTL response with formulations containing SB62 emulsions' when the limiting ratio of E / T ratio such as 3/1 you look observed.
Conclusiones conclusions

1. one.
La producción más fuerte de IFN-\gamma se observa después de la inmunización con emulsiones de SB62'. The strongest IFN- production \ gamma is observed following immunization with SB62 emulsion '.

2. two.
Una respuesta CTL ligeramente mejor se induce mediante formulaciones que contenían emulsiones SB62' en comparación con la correspondiente formulación que usa una emulsión de dosis completa. A slightly better CTL response is induced by formulations containing SB62 emulsions' compared to the corresponding formulation using a full dose emulsion.

3. 3.
El perfil de tipo TH1 de la respuesta inmune inducida por todas las formulaciones relativas a SB62 se confirma adicionalmente mediante la relación IFN-\gamma / IL-5. The TH1 type profile of the induced all SB62 related formulations is further confirmed immune response by IFN- ratio \ gamma / IL-5.

4. Four.
No se observa ninguna diferencia significativa entre títulos de anticuerpos inducidos después de la inmunización con SB62c o SB62'c. no significant difference between titers induced following immunization with antibodies SB62c or SB62'c not observed.

5. 5.
No se observa ninguna diferencia significativa entre títulos de anticuerpos inducidos después de la inmunización con SB62c y SB62'. no significant difference between titers induced following immunization with SB62c and SB62 'antibodies are not observed.

6. 6.
Un perfil isotópico comparable (25-30% de IgG2a) se obtiene con todas las formulaciones relativas a SB62 que sugieren la inducción de una respuesta inmune específica de HBs de tipo TH1. A comparable isotope profile (25-30% IgG2a) is obtained with all SB62 related formulations suggesting the induction of a specific immune response of the TH1 type HBs.
TABLA 3 TABLE 3 Tabla sumario que muestra los resultados del ejemplo 2 Summary table showing the results of Example 2

Parámetro Parameter Formulaciones que contienen S,L* Formulations containing S, L *
inmune immune SB62 SB62 SB62c SB62c SB62' SB62 ' SB62'c SB62'c Alum Alum
Títulos de titles +++ +++ +++ +++ ++ ++ +++ +++ + +
Anticuerpo Antibody
Tipo de TH Type TH TH1 TH1 TH1 TH1 TH1 TH1 TH1 TH1 TH2 TH2
(% de IgG2a) (% IgG2a) (29) (29) (26) (26) (29) (29) (30) (30) (4) (4)
IFN-\gamma (SPC) IFN- \ gamma (SPC) + + ++ ++ +++ +++ ++++ ++++ + +
IL – 5 (SPC) IL - 5 (SPC) - - + + + + ++ ++ +++ +++
CTL CTL + + + + ++ ++ ++ ++ - -

Ejemplo 3 example 3 Estudios de inmunogenicidad con antígenos de malaria TRAP y RTS,S Immunogenicity studies with Malaria antigens TRAP and RTS of, S

Los experimentos de inmunización que utilizan los antígenos de malaria de Plasmodium falciparum TRAP y RTS,S en combinación con diversos adyuvantes, cada uno a base de un sistema de emulsión de aceite en agua. Immunization experiments using the malaria antigens of Plasmodium falciparum TRAP and RTS, S in combination with various adjuvants, each based on a system of oil - in - water. La RTS es una proteína híbrida que comprende sustancialmente toda la porción terminal C de la proteína del circumsporocito (abreviadamente CS) de P. falciparum unido mediante cuatro aminoácidos de la porción preS2 del antígeno de superficie de Hepatitis B al antígeno de superficie (S) del virus de la hepatitis B. Su estructura completa se describe en la solicitud de patente internacional Nº PCT/EP92/02591, publicado en el documento número WO 93/10152 que reivindica prioridad de la solicitud de patente de Reino Unido Nº 9124390.7. RTS is a hybrid protein comprising substantially all the C - terminal portion of protein circumsporocito (abbreviated CS) of P. falciparum linked via four amino acids of the preS2 portion of Hepatitis surface antigen B surface antigen (S) hepatitis B. Its full structure is disclosed in international patent application No. PCT / EP92 / 02591, published in document WO 93/10152 number claiming priority from patent application No.9124390.7 UK. Cuando se expresa en RTS de levadura se produce en forma de una partícula de lipoproteína y cuando se coexpresa con el antígeno S de VBH produce una partícula mezclada conocida como RTS,S. When expressed in yeast RTS it is produced as a lipoprotein particle, and when co-expressed with the S antigen from HBV it produces a mixed particle known as RTS, S.

Los antígenos TRAP se describen en la solicitud de patente internacional Nº PCT/GB89/00895, publicada en el documento WO 90/01496. TRAP antigens are described in International Patent Application No. PCT / GB89 / 00895, published under WO 90/01496 on. Los antígenos TRAP son polipéptidos, también llamados proteínas anónimas relativas a trombospondina, que comparten homología con diversas proteínas de P. falciparum . TRAP antigens are polypeptides, also called anonymous proteins on thrombospondin, which share homology with various P.falciparum proteins.

Las formulaciones de adyuvantes diferentes que utilizan los sistemas de emulsión se describen en el ejemplo 1, con diferentes relaciones de escualeno:QS21, y comprendiendo opcionalmente colesterol (relación QS21:colesterol p/p de 1:10), se combinaron con los antígenos de malaria y se compararon en su capacidad para inducir respuestas inmunes humorales y mediadas por células (proliferación de células T y producción de citoquinas). Formulations using different adjuvants emulsion systems are described in example 1, with differing ratios of squalene: QS21, and optionally comprising cholesterol (QS21: cholesterol ratio w / w of 1:10), they were combined with antigens malaria and compared in their ability to induce humoral immune responses and cell mediated (proliferation of T cells and cytokine production). SB62 se formuló junto con el antígeno en una relación alta (240:1, SB62) o baja (48:1, SB62') de escualeno:QS21, opcionalmente con la adición de colesterol.(c). SB62 was formulated together with the antigen at a high ratio (240: 1, SB62) low (48: 1, SB62 ') or squalene. QS21, optionally with the addition of cholesterol (c).

Se inmunizaron dos veces (en volúmenes de 2 x 50 \mul) grupos de 5 ratones (hembras de ratones de seis semanas de edad, raza C57/BL6 x CBA/J [H-2k]) en la almohadilla de la pata trasera, con espacio de 14 días, bien con were immunized twice (in volumes of 2 x 50 \ mul) Groups of 5 mice (female mice six weeks of age, race C57 / BL6 x CBA / J [H-2k]) in the rat hind paw, with space for 14 days, along with
10 \mug de RTS,S o con 4 \mug de TRAP combinado con diversos sistemas de emulsiones de aceite en agua (SB62). 10 \ mug of RTS, S or 4 \ mug TRAP combined with various oil emulsion systems in water (SB62). Catorce días después de la segunda inmunización la producción de citoquinas (IL 5 e IFN-\gamma) y proliferación de células T se analizó después de reestimulación in vitro de células de bazo y de ganglios linfáticos con los antígenos de malaria. Fourteen days after the second immunization the production of cytokines (IFN- and IL 5 \ gamma) and T cell proliferation was analyzed after in vitro restimulation of spleen and lymph node with the malaria antigens. La respuesta de anticuerpos a RTS,S y TRAP y el perfil isotópico que se indujo se investigó mediante ELISA. Antibody response to RTS, S and TRAP and the isotopic profile that was induced was investigated by ELISA.

TABLA 4 TABLE 4 Grupos de animales y formulaciones de vacunas utilizadas en el ejemplo 3 Groups of animals and vaccine formulations used in Example 3

Nº de grupo Group No. Antígeno Antigen Adyuvante adjuvant
1 one RTS,S RTS, S SB62 / QS21 / 3D - MPL SB62 / QS21 / 3D - MPL
2 two TRAP TRAP SB62 / QS21 / 3D - MPL SB62 / QS21 / 3D - MPL
3 3 RTS,S /TRAP RTS, S / TRAP SB62 / QS21 / 3D - MPL SB62 / QS21 / 3D - MPL
4 4 RTS,S RTS, S AlOH / QS21 / 3D - MPL AlOH / QS21 / 3D - MPL
5 5 RTS,S /TRAP RTS, S / TRAP AlOH / QS21 / 3D - MPL AlOH / QS21 / 3D - MPL
6 6 RTS,S RTS, S SB62c / QS21 / 3D - MPL SB62c / QS21 / 3D - MPL
7 7 RTS,S /TRAP RTS, S / TRAP SB62c / QS21 / 3D - MPL SB62c / QS21 / 3D - MPL
8 8 RTS,S RTS, S SB62c' / QS21 / 3D - MPL SB62c '/ QS21 / 3D - MPL
9 9 RTS,S /TRAP RTS, S / TRAP SB62c' / QS21 / 3D - MPL SB62c '/ QS21 / 3D - MPL
10 10 - - SB62 / QS21 / 3D - MPL SB62 / QS21 / 3D - MPL
11 eleven Vir. Vir. Vac. Vac. 3D7 3D7

Notas a pie de página Footnotes page

Dosis completa de emulsión de aceite en agua de SB62. full dose oil in water emulsion SB62.

Emulsión de aceite en agua de SB62' ejemplificada en las figuras como dosis 1/5 de SB62. Oil in water emulsion SB62 'exemplified in the figures as SB62 1/5 dose.

Emulsión de aceite en agua de SB62c o SB62'c (cualquier dosis) más colesterol en la fase oleosa. Oil-in-water SB62c or SB62'c (any dose) plus cholesterol in the oil phase.

Vir. Vir. Vac. Vac. 3D7 = una construcción de virus vaccinia recombinante que expresa la proteína de CS y administrada a 10^{6} UFP por ratón. 3D7 = a construction of recombinant vaccinia virus expressing CS protein and administered at 10 6} {PFU per mouse.

Proliferación de células T T cell proliferation

Células de bazo o de ganglios linfáticos poplíteos se retiraron asépticamente y se lavaron. Spleen cells or popliteal lymph nodes were aseptically removed and washed. Se cultivaron 100 \mul de células en medio RPMI (1% de suero normal de ratón inactivado por calor, NMS) que contenía 2 x 10^{6}/ml de células en placas de fondo redondo en presencia de antígenos RTS,S o TRAP. 100 \ l of cells were cultured in RPMI medium (1% normal mouse serum heat inactivated, NMS) containing 2 × 10 {6} / ml cells in round bottom plates in the presence of antigens RTS, S or TRAP. Después de la estimulación durante 96 horas con 0,1, 0,5 y 2,5 \mug de antígeno, o 48 horas con 2 \mug/ml de ConA, se marcaron las células con After stimulation for 96 hours with 0.1, 0.5 and 2.5 \ mug antigen, or 48 hours with 2 \ g / ml ConA, the cells were labeled with
^{3}H-timidina (1 \muCi/pocillo) durante 16 horas antes de que se recogieran y se contaran en un contador \beta. ^ {3} H-thymidine (1 \ uCi / well) for 16 hours before they were harvested and counted in a counter \ beta.

Medio RPMI RPMI

RPMI 1640 sin L-glutamina (Life technologies Nº 31870025), L-glutamina 2mM (Life technologies Nº 25030024), 2-mertcaptoetanol 50 \muM (Life technologies Nº 11360039), piruvato sódico 1 mM (Life technologies Nº 11360039), aminoácidos no esenciales 1 x MEM (10 x solución madre, Life technologies Nº11140035), penicilina 100 UI/ml-estreptomicina 100 \mug/ml (Life technologiesNº 15140114). RPMI 1640 without L-glutamine (Life technologies No. 31870025), 2mM L-glutamine (Life technologies No. 25030024), 2-mertcaptoetanol 50 \ uM (Life technologies No. 11360039), 1 mM sodium pyruvate (Life technologies No. 11360039), amino acids 1 x MEM essential (10 x stock solution, Nº11140035 Life technologies), penicillin 100 IU / ml streptomycin-100 \ mug / ml (Life technologiesNº 15140114).

Detección de citoquinas Cytokine detection

Células de bazo o de ganglios linfáticos poplíteos se retiraron asépticamente y se lavaron. Spleen cells or popliteal lymph nodes were aseptically removed and washed. Se cultivaron 1000 \mul de células en medio RPMI (5% de suero de ternera fetal inactivado por calor, FCS) que contenía 5 x 10^{6}/ml de células en placas de fondo plano de 24 pocillos en presencia de antígenos RTS,S o TRAP. 1000 \ uL of cells were cultured in RPMI medium (5% fetal calf serum heat inactivated FCS) containing 5 × 10 {6} / ml of cells were plated in flat-bottom 24 wells in the presence of antigens RTS , S or TRAP. Después las placas se incubaron (37ºC, 5% de CO_{2}) durante un número de horas con 0,5 y 2,5 \mug de antígeno, o 4 \mug/ml final de ConA. The plates were incubated (37, 5% CO 2 {}) for a number of hours with 0.5 to 2.5 \ mug antigen, or 4 \ mug / ml final ConA.

La duración del tiempo durante las que se incubaron las células depende de la citoquina particular a detectar, la The length of time during which the cells were incubated depends on the particular cytokine to be detected, the
IL-2 se estimuló durante 72 horas, la IL-5 durante 72 ó 96 horas e IFN-\gamma durante 96 horas. IL-2 was stimulated for 72 hours, the IL-5 for 72 or 96 hours and IFN- \ gamma for 96 hours. Cada citoquina se detectó utilizando kits de ELISA disponible comercialmente (IL-2 e IFN-\gamma, Duoset Genzyme Nº 80-3573-00 y 80-3931-00 respectivamente; IL-5 se detectó utilizando el kit Pharmingen). Each cytokine was detected using commercially available ELISA kits (IL-2 and IFN \ gamma, Duoset Genzyme No. 80-3573-00 and 80-3931-00 respectively; IL-5 was detected using the Pharmingen kit).

Serología Serology

Se analizaron los anticuerpos dirigidos contra TRAP utilizando un sándwich ELISA. Antibodies directed against TRAP using a sandwich ELISA were analyzed. Un antisuero oveja A sheep antiserum
anti-TRAP se recubrió en placas de ELISA que se utilizó para capturar antígeno TRAP añadido a 0,5 \mug/ml. anti-TRAP was coated onto ELISA plates which was used to capture TRAP antigen added at 0.5 \ mug / ml. Las titraciones de suero reunido de grupos experimentales se añadieron y se incubaron. Titrations of pooled serum experimental groups were added and incubated. Finalmente, se utilizaron anticuerpos específicos de isotipos anti-ratón biotinilados seguido de estreptavidina-peroxidasa para detectar anticuerpos unidos específicos de TRAP. Finally, specific antibody isotype biotinylated anti-mouse followed by streptavidin peroxidase to detect bound antibodies specific to TRAP were used.

Las respuestas humorales anti VBH se analizaron mediante un ELISA directo, HBsAg se recubrió en la placa de ELISA a 1 \mug/ml. Humoral responses were analyzed by anti VBH a direct ELISA, HBsAg was coated onto the ELISA plate 1 \ mug / ml. Suero reunido de los diferentes grupos experimentales se titraron y se detectaron anticuerpos unidos como se ha descrito anteriormente. together of the different experimental groups and titraron serum antibodies were detected as described above.

Resultados results Proliferación de células linfoides en respuesta a antígeno Proliferation of lymphoid cells in response to antigen

Las respuestas proliferativas en respuesta al antígeno se puede ver en las figuras 8 a 11. Todas las preparaciones de vacunas estimularon células en el ganglio linfático poplíteo local que eran capaces de proliferar in vitro en respuesta al antígeno, la magnitud de la cual era independiente de la adición de colesterol. Proliferative responses in response to antigen can be seen in figures 8 to 11. All vaccine preparations stimulated cells in the local popliteal lymph node which were capable of proliferating in vitro in response to antigen, the magnitude of which was independent of the addition of cholesterol.

Todas las preparaciones de vacunas eran capaces de estimular células esplénicas que proliferaban in vitro en respuesta al antígeno. All vaccine preparations were capable of stimulating splenic cells which proliferated in vitro in response to antigen. Cuando se consideran los índices de estimulación, las preparaciones que provocaron las respuestas más altas en el bazo eran las que tenían la relación escualeno:QS21 baja (48:1 o dosis 1/5 de SB62). When considering the stimulation indices, the preparations which caused the highest responses in the spleen were the ones ratio squalene: QS21 low (48: 1 or 1/5 dose SB62).

Figura 8, muestra las respuestas proliferativas de células de ganglios linfáticos poplíteos (en forma de conteo bruto por minuto (abreviadamente CPM)) derivadas de los grupos experimentales después de estimulación con antígenos TRAP y RTS,S. Figure 8 shows the proliferative responses of popliteal lymph node cells (as crude counts per minute (CPM abbreviated)) derived from the experimental groups after stimulation with TRAP and RTS antigens, S.

Figura 9, muestra las respuestas proliferativas de células esplénicas (en forma de conteo bruto por minuto (abreviadamente CPM)) derivadas de los grupos experimentales después de estimulación con antígenos TRAP y RTS,S. 9 shows the proliferative responses of splenic cells (in raw counts as per minute (abbreviated CPM)) derived from the experimental groups after stimulation with TRAP and RTS antigens, S.

Figura 10, que muestra las respuestas proliferativas de células de ganglios linfáticos poplíteos (índice de estimulación) derivadas de los grupos experimentales después de estimulación con antígenos TRAP y RTS,S. Figure 10 showing the proliferative responses of popliteal lymph node cells (Stimulation index) derived from the experimental groups after stimulation with TRAP and RTS antigens, S.

Figura 11, que muestra las respuestas proliferativas de células esplénicas (índice de estimulación) derivadas de los grupos experimentales después de estimulación con antígenos TRAP y RTS,S. Figure 11, showing the proliferative responses of splenic cells (Stimulation index) derived from the experimental groups after stimulation with TRAP and RTS antigens, S.

Descripción de resultados de proliferación Description of proliferation results

Las figuras 1 y 2, claramente muestran que todas las formulaciones de vacunas estimulan las células linfoides que son capaces de proliferar in vitro en presencia de antígeno en una forma dependiente de dosis. Figures 1 and 2, clearly show that all the vaccine formulations stimulate lymphoid cells which are capable of proliferating in vitro in the presence of antigen in a dose dependent manner. Los datos de conteo bruto sugieren que la inclusión de colesterol en las formulaciones de adyuvantes no tienen efecto en la magnitud de las respuestas proliferativas (por ejemplo, una comparación entre los grupos 1 y 6, denominados RTS,S/MPL/QS21/SB62 y RTS,S/MPL/QS21/SB62c respectivamente). Data gross count suggest that the inclusion of cholesterol in the adjuvant formulations has no effect on the magnitude of the proliferative responses (for example a comparison between groups 1 and 6, termed RTS, S / MPL / QS21 / SB62 and RTS, S / MPL / QS21 / SB62c respectively).

El examen de las cpm junto con los resultados de índice de estimulación (obtenidos dividiendo el conteo bruto para la proliferación específica de antígeno por la que se deriva de la proliferación específica de no antigénica (medio solo)) muestra que la formulación de vacunas que genera las respuestas proliferativas más altas depende del origen del linfocito medido. Examination of the cpm together with the results of stimulation index (obtained by dividing the gross count for antigen-specific proliferation by that derived from the specific proliferation of antigen (medium alone)) shows that the vaccine formulation which generates the highest proliferative responses depends on the origin of the lymphocyte measured. Las formulaciones de adyuvantes que contienen la relación de escualeno:QS21 baja (48:1) generan las respuestas proliferativas más altas en el bazo. The adjuvant formulations containing the ratio of squalene: QS21 low (48: 1) generate the highest proliferative responses in the spleen.

Producción de citoquinas in vitro tras la estimulación con antígeno Cytokine production in vitro after stimulation with antigen

La producción de citoquinas, medias in vitro en respuesta a antígeno, puede ser tanto una medida cuantitativa como cualitativa de la inducción de respuestas inmunes in vivo. Cytokine production in vitro in response to antigen averages, can be both a quantitative and qualitative measure of the induction of immune responses in vivo. En general se toman niveles altos de IFN-\gamma e IL-2 para que sean una medida de las repuestas inmunes de tipo Th1, e IL-5 se considera que es una citoquina de tipo Th2. In general high levels of IFN- \ gamma and IL-2 they are taken to be a measure of immune responses Th1 and IL-5 is considered to be a Th2 cytokine. Las figuras siguientes (figura 12 a 14) demuestran el uso de SB62', que contiene una relación reducida de escualeno:QS21 (denominada dosis 1/5 de SB62), tenia un efecto marcado para potenciar la producción de IFN-\gamma (figura 6). The following figures (Figure 12 to 14) demonstrate the use of SB62 ', containing a reduced ratio of squalene: QS21 (termed SB62 1/5 dose), had a marked to enhance the production of IFN- \ gamma effect (Figure 6).

Además, existe evidencia de que la adición de colesterol no tiene efectos cualitativos o cuantitativos en el perfil de citoquinas producidas in vitro en respuesta a antígeno. Furthermore, there is evidence that the addition of cholesterol has no qualitative or quantitative effects on the cytokine profile produced in vitro in response to antigen. Este efecto puede tener consecuencias significativas en la inducción de respuestas inmunes de tipo Th1 y también inmunoterapéuticas. This effect may have significant in the induction of immune responses Th1 and immunotherapeutic implications.

Figura 12, muestra producción de IL-2 de células esplénicas después de estimulación con antígeno TRAP o RTS,S. 12 shows production of IL-2 of splenic cells after stimulation with antigen TRAP or RTS, S. 14 días después de VII. 14 days after VII.

Figura 13, muestra producción de IFN-\gamma mediante células esplénicas después de estimulación con antígeno TRAP o RTS,S. Figure 13 shows production of IFN- \ gamma by spleen cells after stimulation with TRAP or antigen RTS, S. 14 días después de VII. 14 days after VII.

Figura 14, muestra producción de IL-5 mediante células esplénicas después de estimulación con antígeno TRAP o RTS,S. Figure 14 shows IL-5 production by spleen cells after stimulation with TRAP or antigen RTS, S. 14 días después de VII. 14 days after VII.

Serología Serology

Otra medida de inmunidad que puede correlacionarse con una respuesta inmune de tipo Th1, o alternativamente de un tipo Th2 es el subisotipo de IgG que se provoca. Another measure of immunity that can correlate with an immune response Th1, or alternatively a Th2 type is subisotype IgG is caused. Una estimulación preferencial del subisotipo IgG1 se toma generalmente para que sea una medida de la inducción de la respuesta inmune de tipo Th2, y recíprocamente IgG2a e IgG2b se toma para que sea una medida de la respuesta inmune de tipo Th1. A preferential stimulation of the IgG1 sub-isotype is generally taken to be a measure of the induction of Th2 type immune response, and conversely IgG2a and IgG2b is taken to be a measure of immune response type Th1.

Los estudios de ELISA se realizaron en suero de ratón en conjunto y se determinaron los títulos de punto medio tanto para anticuerpos específicos de HBsAg como TRAP. ELISA studies were performed in mouse serum and whole mid-point titers for both HBsAg-specific antibodies were determined as TRAP. Para estas figuras se calculó la relación de los títulos de punto medio de IgG1 e IgG2 específicos de antígeno y se tomó para que fuera una medida del balance Th1/Th2 de la respuesta inmune humoral (los resultados se muestran en la tabla 4). For these figures the ratio of the mid-point titers of IgG1 and IgG2 specific antigen was calculated and taken to be a measure of the Th1 / Th2 balance of the humoral immune response (the results are shown in Table 4).

TABLA 4 TABLE 4 La relación de IgG1:IgG2a, que representa el balance Th1/Th2. The ratio of IgG1: IgG2a, representing the Th1 / Th2 balance. Una relación < 1 representa una respuesta inmune de tipo Th1, una relación > 1 indicando una respuesta de tipo Th2 A ratio <1 represents a Th1 - type immune response, a ratio> 1 indicating a Th2 type response

Relación de títulos de punto medio de IgG1 : IgG2a List of titles midpoint of IgG1: IgG2a
Grupo Group HBsAg HBsAg TRAP TRAP
1 one 0,44 0,44
2 two 0,36 0.36
3 3 1,46 1,46 1,68 1,68
4 4 0,37 0,37
5 5 0,39 0,39 11,83 11.83
6 6 0,28 0.28
7 7 0,2 0.2 7,21 7.21
8 8 0,66 0,66
9 9 0,3 0.3 0,77 0,77

Descripción de los resultados serológicos Description of serologic results

Se analizaron conjuntos de suero de ratón de cada grupo y se encontraron que habían estimulado exitosamente anticuerpos específicos de HBsAg y TRAP. sets of mouse serum of each group were analyzed and found to have successfully stimulated HBsAg-specific antibodies and TRAP. En general, títulos de punto medio de anticuerpos contra HBsAg eran más altos que los encontradas contra TRAP. In general, titles midpoint of antibodies against HBsAg were higher than those found against TRAP. La distribución de isotipo difería entre los dos antígenos. The isotype distribution differed between the two antigens. RTS,S en todas las formulaciones provocaba una configuración clara de Th1, como se indicaba mediante una relación IgG1:IgG2a inferior a 1. RTS, S in all formulations elicited a clear Th1 configuration, as indicated by a ratio IgG1: IgG2a less than 1.

En contraste, los anticuerpos específicos de TRAP mostraban una configuración de isotipos de tipo Th2. In contrast, TRAP-specific antibodies exhibited a Th2 isotypes configuration type. Las únicas excepciones a esta observación eran los grupos 2, que recibieron TRAP únicamente, y el grupo 9, que recibió TRAP/RTS,S en una formulación SB62' (que contenía una relación baja de escualeno:QS21, denominada dosis 1/5 de SB62). The only exceptions to this observation were groups 2, who received TRAP alone, and group 9, who received TRAP / RTS, S SB62 formulation in a '(containing a low ratio of squalene: QS21, termed dose 1/5 SB62). Por lo tanto, el uso de SB62' puede ser útil en el diseño de vacunas que inducen Th1 con antígenos que se sabe preferentemente que inducen respuestas inmunes de tipo Th2. Therefore, the use of SB62 'may be useful in designing vaccines which induce Th1 preferably antigens known to induce immune responses of Th2.

Ejemplo 4 example 4 Estudios inmunológicos que utilizan un modelo de regresión tumoral de tipo murino Immunological studies using a model of murine tumor regression

Este experimento investigó el uso potencial de adyuvantes de emulsiones de aceite en agua para el tratamiento terapéutico de virus de papiloma humano (abreviadamente VPH) que expresa tumores. This experiment investigated the potential use of emulsion adjuvants Oil in water for therapeutic treatment of virus (abbreviated HPV) expressing tumors human papilloma that. Se inocularon células tumorales (TC1), que se sabe que expresan la proteína E7 de VPH 16, en ratones C57BL/6 de 6-8 semanas de edad. tumor cells (TC1), which are known to express the E7 protein of HPV16 in C57BL / 6 mice 6-8 weeks old were inoculated. Estas células tumorales si se dejan sin tratar se desarrollaban en tumores de tamaño mensurable. These tumor cells if left untreated tumors developed in measurable size. Se investigó el potencial de las vacunas que comprenden E7, a base de adyuvantes de emulsiones de aceite en agua, para evitar el establecimiento de estos tumores. the potential of E7 comprising vaccines, based emulsion adjuvants Oil in water, to avoid the establishment of these tumors was investigated. Se evaluó en el modelo de tumor TC1-E7 el potencial terapéutico de diversas emulsiones de aceite en agua (para detalles véase el ejemplo 1) dosis completa de SB62, 1/5 de SB62, dosis completa de SB62c y 1/5 de SB62c en combinación con antígeno recombinante ProtD1/3 E7 VPH 16. Además, se comparó la contribución de los programas de vacunación. It was evaluated in the TC1 tumor model-E7 therapeutic potential of various oil in water emulsions (see for details example 1) SB62 full-dose, SB62 1/5, SB62c full dose and SB62c 1/5 in combination with recombinant antigen ProtD1 / 3 E7 HPV 16. in addition, the contribution of vaccination programs compared.

Brevemente, grupos de 8-10 ratones C57BL/6 se provocaron 5 x 10^{5} células tumorales (en el costado). Briefly, groups of 8-10 C57BL / 6 mice were challenged 5 x 10 5} {tumor cells (in the flank). Después los grupos de ratones se inmunizaron dentro de la almohadilla de la pata con 5 \mug de ProtD1/3 E7 combinada con diversas formulaciones, 7 y 14 días después de la provocación tumoral subcutánea. After groups of mice were immunized in the footpad with 5 \ mug of ProtD1 / 3 E7 combined with various formulations, 7 and 14 days after subcutaneous tumor challenge.

Se compararon otros esquemas de vacunación: 2 vacunaciones con 5 \mug de ProtD1/3 E7 en SB62 (días 14 y 21 después de la provocación de tumores); other vaccination schedules were compared: 2 vaccinations with 5 \ mug of ProtD1 / 3 E7 SB62 in (days 14 and 21 after challenge of tumors); y 4 vacunaciones con 5 \mug de ProtD1/3 E7 en SB62 (7, 14, 21, 28 días después de la provocación de tumores). and 4 vaccinations with 5 \ mug of ProtD1 / 3 E7 SB62 in (7, 14, 21, 28 days after tumor challenge).

Las respuestas de anticuerpo a E7 se controlaron mediante ELISA en los instantes 2 y 4 semanas después de la segunda vacunación. Antibody responses to E7 were monitored by ELISA at instants 2 and 4 weeks after the second vaccination. Se analizó la respuesta linfoproliferativa mediante reestimulación in vitro de células de bazo y de ganglios linfáticos durante 72 horas con la proteína E7 (10, 1, 0,1 \mug/ml) 2 y 4 semanas después de la segunda vacunación. The lymphoproliferative response was analyzed by in vitro of spleen cells and lymph nodes at 72 hours with the E7 (10, 1, 0.1 \ mug / ml) 2 and 4 weeks after the second vaccination protein restimulation. Las respuestas de CTL se midieron después de reestimulación in vitro de células esplénicas con células tumorales irradiadas (TC1) o un péptido derivado de E7. CTL responses were measured after in vitro restimulation of spleen cells with irradiated tumor cells (TC1) or an E7 - derived peptide. El ensayo de liberación de cromo se realizó en células TC1, en una línea de células tumorales singénicas : EL4 pulsadas o no con un péptido derivado de E7 o infectadas bien con un virus vaccinia recombinante de E7 o con el virus vaccinia de tipo salvaje. The chromium release assay was performed on TC1 cells, on a syngeneic tumor cell line: EL4 pulsed or not with an E7-derived peptide or infected either with a E7 recombinant vaccinia virus or vaccinia virus wild type.

TABLA 5 TABLE 5 Grupos de ratones Groups of mice

Grupo Group Programa de vacunación Vaccination program Antígeno (VPH 16) Antigen (HPV 16) Excipiente excipient
(días después de provocación) (Days after challenge)
A TO 7, 14 7, 14 - - PBS PBS
b b 7, 14 7, 14 ProtD1/3 E 7 ProtD1 / 3 E 7 PBS PBS
c c 7, 14 7, 14 ProtD1/3 E 7 ProtD1 / 3 E 7 DQ DQ
d d 7, 14 7, 14 - - DQ DQ
e and 7, 14 7, 14 ProtD1/3 E 7 ProtD1 / 3 E 7 SB62 SB62
f F 7, 14 7, 14 - - SB62 SB62
g g 7, 14 7, 14 ProtD1/3 E 7 ProtD1 / 3 E 7 SB62' SB62 '
h h 7, 14 7, 14 - - SB62' SB62 '
i i 7, 14 7, 14 ProtD1/3 E 7 ProtD1 / 3 E 7 SB62c SB62c
j j 7, 14 7, 14 - - SB62c SB62c
k k 7, 14 7, 14 ProtD1/3 E 7 ProtD1 / 3 E 7 SB62'c SB62'c
l l 7, 14 7, 14 - - SB62'c SB62'c
m m 7, 14, 21, 28 7, 14, 21, 28 ProtD1/3 E 7 ProtD1 / 3 E 7 SB62 SB62
n n 14, 21 14, 21 ProtD1/3 E 7 ProtD1 / 3 E 7 SB62 SB62

Experimentos terapéuticos: protocolo Therapeutic experiments: protocol

\bullet \ bullet
Se inyectaron subcutáneamente en el costado de ratones C57BL/6 inmunocompetentes 5 x 10^{5} células tumorales que expresan TC1-E7 (200 \mul). They were injected subcutaneously into the flank of C57BL / 6 immunocompetent 5 x 10 5} {tumor cells expressing TC1-E7 (200 \ mul).

\bullet \ bullet
Las vacunaciones se realizaron en cualquiera de los días 7, 14, 21 ó 28 días después del la provocación de tumores, con 5 \mug de ProtD1/3 E 7 VPH 16 inyectada en la almohadilla de la pata (100 \mul : 50 \mul / almohadilla de pata). Vaccinations were performed at either 7, 14, 21 or 28 days after the induction of tumors, with 5 \ mug of ProtD1 / 3 E 7 HPV16 injected into the footpad (100 \ mul: 50 \ mul / footpad). Cada vacuna se formuló en presencia de diferentes adyuvantes: SB62, SB62c, SB62' o SB62'c. Each vaccine was formulated in the presence of different adjuvants: SB62, SB62c, SB62 'or SB62'c.

  \newpage \ newpage 

\bullet \ bullet
Dos y cuatro semanas después de la segunda inmunización se sacrificaron los ratones y se cogieron los bazos o ganglios linfáticos poplíteos y se analizaron en ensayos de linfoproliferación o CTL. Two and four weeks after the second immunization mice were sacrificed and spleens or popliteal lymph the nodes were taken and analyzed in lymphoproliferation or CTL assays.
Formulaciones comparativas a base de liposomas (DQ) Comparative liposome-based formulations (DQ)

Se incubó antígeno ProtD1/3-E7 (5 \mug) 30 minutos con MPL (5 \mug) antes de la adición de tampón en forma de una mezcla 10 veces concentrada de PBS pH 7,4 y H_{2}O. antigen ProtD1 / 3-E7 (5 \ mug) 30 minutes with MPL (5 \ mug) A mixture 10-fold concentrated PBS pH 7.4 and H {2} O incubated before addition of buffer as. Después de 30 minutos se añadió QS21 (5 \mug) a la formulación mezclada con liposomas en una relación de peso QS21/Colesterol de 1:5 (denominada DQ). After 30 minutes was added QS21 (5 \ mug) to the formulation mixed with liposomes in a weight ratio QS21 / Cholesterol of 1: 5 (called DQ). Se añadieron 50 \mug/ml de tiomersal a la formulación como conservante 30 minutos después de la adición de la QS21. 50 \ mug / ml of thiomersal was added as preservative to the formulation 30 minutes after the addition of QS21. Todas las incubaciones se llevaron a cabo a temperatura ambiente con agitación. All incubations were carried out at room temperature with stirring.

Líneas celulares cell lines

Células TC1 (obtenidas de la Universidad de John Hopkin) o EL4 se desarrollaron en RPMI 1640 (Bio Whittaker) que contenía 10% de FCS y aditivos: L-glutamina 2 mM, 1% de antibióticos (10000 U/ml de penicilina, 10000 \mug/ml de estreptomicina) 1% de aminoácidos no esenciales 100 x, 1% de piruvato sódico (Gibco), 2-mercaptoetanol TC1 cells (obtained from University John Hopkin) or EL4 were grown in RPMI 1640 (Bio Whittaker) containing 10% FCS and additives: L-glutamine 2 mM, 1% antibiotics (10,000 U / ml penicillin, 10000 \ mug / ml streptomycin) 1% non essential amino acid 100x, 1% sodium pyruvate (Gibco), 2-mercaptoethanol
5 x 10^{-5} M. Antes de la inyección en un costado de los ratones, las células TC1 se tripsinizaron y se lavaron en medio exento de suero. 5 x 10 {- 5} M. Before injection into a flank of the mice, the TC1 cells were trypsinized and washed in serum free medium.

Desarrollo tumoral tumor development

Se siguió el desarrollo individual tumoral durante el tiempo. individual tumor development was followed over time. Se midieron los dos principales diámetros (A, B) utilizando calibres dos veces por semana, A x B representa la "superficie tumoral" y se expresa como la media de los 5 valores en cada grupo. the two main diameters (A, B) were measured using calipers twice a week, A x B represents the "tumor surface" and is expressed as the mean of the 5 values ​​in each group.

Linfoproliferación in vitro Lymphoproliferation in vitro

Se realizó la linfoproliferación en bazos individuales y en conjuntos de ganglios linfáticos. lymphoproliferation was performed on individual spleens and lymph nodes sets. La suspensión celular se incubó con cloruro amónico tamponado con Tris durante 4 minutos a 4ºC con el fin de lisar los glóbulos rojos Se sembraron en placas por triplicado 2 x 10^{5} células de bazo o células de ganglios linfáticos poplíteos, en microplacas de 96 pocillos, en medio RPMI que contenía 1% de suero de ratón normal. The cell suspension was incubated with ammonium chloride Tris buffered for 4 minutes at 4 ° C in order to lyse the red cells were plated in triplicate 2 x 10 {5} spleen cells or cells from popliteal lymph nodes, microplates 96-well in RPMI medium containing 1% normal mouse serum. Después de 72 horas de incubación con diferentes cantidades de E7 (10-1-0,1 \mug/ml), 100 \mul de sobrenadante de cultivo se retiraron y se reemplazaron por medio reciente que contenía 1 \muCi de ^{3}H-timidina. After 72 hours of incubation with different amounts of E7 (10-1-0,1 \ mug / ml), 100 \ l of culture supernatant was removed and replaced with fresh medium containing 1 \ Ci of ^ {3} H-thymidine. Después de pulsar durante 16 horas, se recogieron las células en placas de filtro. After pressing for 16 hours, the cells were collected filter plates. Se contó la radiactividad incorporada en un contador \beta. built in a counter \ beta radioactivity counted. Los resultados se expresan en cuentas por minuto (CPM, media de pocillos triplicados) o como índices de estimulación (media de CPM en cultivos con antígeno \div media de CPM en cultivos sin antígeno). Results are expressed in counts per minute (CPM, mean of triplicate wells) or as stimulation indices (mean CPM in cultures with antigen \ div mean CPM in cultures without antigen).

Ensayo de CTL CTL assay

Se cultivaron 2 x 10^{6} células de bazo junto con 2 x 10^{6} células TC1 irradiadas (18000 rads) durante 7 días. 2 x 10 6} {spleen cells were cultured with 2 x 10 6} {TC1 cells irradiated (18,000 rads) for 7 days. Las células diana eran bien células TC1 cargadas (1 hora a 37ºC) con Cr^{51} (DuPont NEN 37MBq/ml) o células EL4 (células tumorales singénicas) infectadas con un virus vaccinia recombinante de E7 (recibido de TC Wu de la Universidad de John Hopkins). Target cells were either TC1 cells loaded (1hr at 37) with Cr ^ {51} (DuPont NEN 37MBq / ml) or EL4 cells (syngeneic tumor cells) infected with a recombinant vaccinia virus E7 (received TC Wu John Hopkins University). Los resultados derivados de estas células se compararon con los de las dianas de EL4 que se habían infectado con el virus vaccinia de tipo salvaje (la infección de vaccinia de realizó a una MOI (multiplicidad de infección) de 10 en un volumen pequeño de medio exento de suero, durante 1 hora a 37ºC en un incubador de CO_{2}. Se añadió medio reciente y se incubaron las células durante una noche antes de uso). The results derived from these cells were compared with those of the target EL4 were infected with vaccinia wild-type virus (infection of vaccinia performed at a MOI (multiplicity of infection) of 10 in a small volume of free medium serum for 1 hour at 37 in an incubator of CO {2}. fresh medium was added and cells were incubated overnight before use). Se usaron 10 \mug/ml de péptido derivado de E7 (49-57) (QCB) para pulsar células El4 durante 1 hora a 37ºC mientras se realizaba la carga de las células con Cr^{51}. 10 \ mug / ml of E7-derived peptide (49-57) (QCB) to press EL4 cells for 1 hour at 37C while charging the cells with Cr ^ {51} was performed was used. Se añadieron 2000 células diana a cada pocillo de placa de 96 pocillos (nunc 2-45218 de fondo en V) siendo la relación más alta efector/diana 100/l. 2000 target to each well of 96 well plate (Nunc 2-45218 V bottom) cells were added being the highest ratio effector / target 100 / l. Los controles de liberación máxima de Cr^{51} se realizaron por sextuplicado y eran dianas en medio o en triton al 1,5%. The maximum release of Cr ^ {51} were performed in sextuplicate and were targets in medium or in triton 1.5%. Todas las placas se centrifugaron suavemente y se incubaron durante 4 horas a 37ºC en CO_{2} al 7%. All plates were gently centrifuged and incubated for 4 hours at 37 ° C in CO 2} {7%. Se depositaron 50 \mul del sobrenadante en Lumaplate de 96 pocillos (Packard) se dejaron secar durante una noche y se contaron en un contador Top Count. 50 \ mul supernatant were deposited in Lumaplate 96 well plates (Packard) were allowed to dry overnight and counted on a Top Count. Los datos se expresan como porcentaje de lisis específica que se calcula a partir de las cpm mediante la fórmula (liberación experimental-liberación espontánea) \div (liberación máxima-liberación espontánea) x 100. Data are expressed as percentage specific lysis is calculated from cpm by the formula (experimental release-spontaneous release) \ div (maximum release-spontaneous release) x 100.

Serología Serology

La cuantificación de anticuerpo anti E7 se realizó mediante ELISA utilizando E7 como antígeno de recubrimiento. Quantitation of anti E7 antibody was performed by Elisa using E7 as coating antigen. Las soluciones de antígeno y anticuerpo se utilizaron a 50 \mul por pocillo. The antigen and antibody solutions were used at 50 \ per well. Se diluyó el antígeno a una concentración final de 3 \mug/ml en tampón carbonato pH 9,5 y se adsorbió durante una noche a 4ºC a los pocillos de las placas de microtitulación de 96 pocillos (Maxisorb Immuno-plate, Nunc, Dinamarca). The antigen was diluted at a final concentration of 3 \ g / ml in carbonate buffer pH 9.5 and adsorbed overnight at 4 to the wells of the microtiter plates 96 well plates (Maxisorb Immuno-plate, Nunc, Denmark) . Después las placas se incubaron durante 1 hora a 37ºC con PBS que contenía 1% de albúmina sérica bovina y 1% de Tween 20 (tampón de saturación). Plates were incubated for 1 hour at 37 with PBS containing 1% bovine serum albumin and 1% Tween 20 (saturation buffer). Se añadieron diluciones dos veces de suero (comenzando a dilución 1/100) en el tampón de saturación a las placas recubiertas con E7 y se incubaron durante 1 hora 30 minutos a 37ºC. dilutions were added twice serum (starting at 1/100 dilution) in the saturation buffer E7-coated plates and incubated for 1 hour 30 minutes at 37C. Se lavaron las placas 3 veces con PBS 1% de Tween 20 y se añadió IgG1, IgG2a, IgG2b o IgGtot anti-ratón conjugado con biotina (Amersham, Reino Unido) diluido 1/5000 en tampón de saturación a cada pocillo y se incubó durante 1 hora 30 minutos a 37ºC. the plates 3 times with PBS 1% Tween 20 were washed and added IgG1, IgG2a, IgG2b or IgGtot conjugated mouse anti-biotin (Amersham, UK) diluted 1/5000 in saturation buffer to each well and incubated for 1 hour 30 minutes at 37 ° C. Después de una etapa de lavado, se añadió complejo estreptavidina-peroxidasa biotinilada (Amersham, Reino Unido) diluida 1/5000 en tampón de saturación durante 30 minutos adicionales a 37ºC. After a washing step, biotinylated (Amersham, UK) diluted 1/5000 in saturation buffer for an additional 30 minutes at 37C it was added streptavidin-peroxidase complex. Se lavaron las placas como se ha indicado anteriormente y se incubaron durante 10 minutos con TMB (Tetrametilbencidina). Plates were washed as above and incubated for 10 min with TMB (tetramethylbenzidine). Se detuvo la reacción con H_{2}SO_{4} 4 N y se leyó a 450 nm. the reaction was stopped with H {2} {4} SO 4N and read at 450 nm. Se calcularon diluciones de punto medio mediante SoftmaxPro (usando una ecuación de cuatro parámetros). Midpoint dilutions were calculated by SoftmaxPro (using a four parameters equation).

Inmunohistoquímica immunohistochemistry

Se retiraron los tumores y se fijaron en acetona y paraformaldehído antes de seccionar. tumors were removed and fixed in acetone and paraformaldehyde prior to sectioning. Después las secciones en criostato de 5 \mum de espesor se investigaron y se tiñeron para CD4, CD8 y CD3 que expresan infiltración de células T. Antes de la adición de los anticuerpos monoclonales teñidos, se lavaron las secciones y se saturaron con 0,5% de albúmina sérica bovina (abreviadamente BSA), 5% de suero de conejo normal (abreviadamente NRS) en PBS. After cryostat sections of 5 \ mum thickness were investigated and stained for CD4, CD8 and CD3 expressing T-cells infiltration Before addition of dyed monoclonal antibodies, sections were washed and saturated with 0.5 % bovine serum albumin (BSA abbreviated), 5% normal rabbit serum (NRS abbreviated) in PBS. Después de esta etapa los anticuerpos monoclonales de rata anti-CD3, CD4 y CD8 se añadieron y se incubaron durante una noche a 4ºC. After this step the rat monoclonal antibodies anti-CD3, CD4 and CD8 were added and incubated overnight at 4 ° C. Después las secciones se lavaron y se reveló la unión de los anticuerpos monoclonales de rata con Ig conejo anti-rata biotinilado. The sections were washed and binding of rat monoclonal antibodies with rabbit anti-rat Ig biotinylated revealed. Después de la incubación durante 30 minutos, a temperatura ambiente (abreviadamente TA), se añadió estreptavidina-peroxidasa de rábano picante y se incubó durante otros 30 minutos a TA. After incubation for 30 minutes at room temperature (abbreviated TA), was added streptavidin-horseradish peroxidase was added and incubated for another 30 minutes at RT. La unión de estreptavidina-peroxidasa de rábano picante se reveló con DAB durante 10 minutos a TA. Binding of streptavidin-horseradish peroxidase was revealed with DAB for 10 minutes at RT. Después las secciones se tiñeron en contraste con hematoxilina y se deshidrataron con etanol, isopropanol y finalmente xilol. The sections were stained with hematoxylin and contrast were dehydrated with ethanol, isopropanol and finally xylol.

Resultados results

Desarrollo tumoral (para una representación del crecimiento medio tumoral /grupo véase la figura 15) tumor growth (for a representation of the tumor growth medium / group see figure 15)

Figura 15, muestra el desarrollo medio tumoral después de la provocación y vacunación los días 7 y 14 con diversas formulaciones que contienen ProtD1/3 E7. Figure 15 shows the mean tumor growth after challenge and vaccination on days 7 and 14 with various formulations containing ProtD1 / 3 E7.

Figura 16, muestra el desarrollo tumoral medio observado durante un período de 4 semanas para los grupos que reciben el antígeno en formulaciones de DQ y SB62, también se representan los resultados que comparan los programas diferentes de vacunaciones. Figure 16 shows the mean tumor growth observed over a period of 4 weeks for the groups receiving the antigen in DQ and SB62 formulations, the results comparing the different vaccination programs are also depicted. Estas vacunas se administraron los días 7 y 14; These vaccines were administered on days 7 and 14; o los días 14 y 21; or 14 and 21; o los días 7, 14, 21 y 28. or days 7, 14, 21 and 28.

Figura 16, comparación con las formulaciones comparativas y otros programas de vacunaciones. Figure 16, compared with the comparative formulations and other vaccination programs.

Descripción de los estudios de regresión tumorales Description of studies of tumor regression

con el antígeno ProtD1/3 E7. with ProtD1 / 3 E7 antigen.

\bullet \ bullet
La vacunación bien con ProtD1/3 E7o adyuvante solo no tiene ningún efecto en el desarrollo de la TC1-E7 que expresa tumor. Vaccination well with ProtD1 / 3 E7o adjuvant alone has no effect on the development of the TC1-E7 expressing tumor.

\bullet \ bullet
El análisis del desarrollo individual tumoral mostró un rechazo completo tumoral en diversos grupos: The analysis of tumor development individual showed complete tumor rejection in several groups:

Grupo Group Porcentaje de rechazo tumoral Percentage tumor rejection
c c 40% 40%
e and 40% 40%
g g 60% 60%
j j 20% twenty%
l l 10% 10%

La mejor formulación para inducir rechazo tumoral se formuló con la dosis baja de emulsión de aceite en agua de SB62'. The best formulation to induce tumor rejection were formulated with the low dose of emulsion SB62 Oil in water '.

\bullet \ bullet
Se observó un efecto terapéutico después de 4 vacunaciones mejor que el visto después de 2. El análisis del desarrollo individual tumoral mostró que 60% de los animales rechazaron completamente su tumor después de 4 vacunaciones con formulaciones a base de SB62 mientras que solamente 40% de ratones que habían recibido 2 vacunaciones mostraron completa regresión. a therapeutic effect after 4 vaccinations than seen better after 2. Analysis of individual tumor growth showed that 60% of the animals completely rejected their tumor after 4 vaccinations with SB62 based formulations while only 40% was observed mice that had received 2 vaccinations showed complete regression.

\bullet \ bullet
Si se retrasa la primera vacunación hasta el día 14 después de la provocación de tumores, no se pudo observar ningún rechazo completo. If the first vaccination to day 14 after tumor challenge is delayed, it was not observed any complete rejection. Sin embargo, el desarrollo tumoral parecía estar suprimido. However, tumor growth appeared to be deleted.

  \newpage \ newpage 
Resultados de proliferación Results of proliferation

\bullet \ bullet
No se observó respuesta proliferativa en este experimento tanto con células esplénicas como de ganglios linfáticos que recibieron ProtD1/3 E7 o adyuvantes solos. No proliferative response in this experiment with both spleen cells and lymph node that received ProtD1 / 3 E7 or adjuvants alone was observed.

\bullet \ bullet
La linfoproliferación específica de antígeno se incremento en los grupos de ratones que recibieron ProtD1/3 E7 en presencia de adyuvantes. The antigen-specific lymphoproliferation was increased in the groups of mice that received ProtD1 / 3 E7 in the presence of adjuvants. Se observaron respuestas proliferativas altas tanto con DQ como SB62' en el bazo. high proliferative responses with both DQ SB62 'in the spleen were observed. Véase la figura 17 y 18. See Figure 17 and 18.

Figura 17, linfoproliferación observada en células esplénicas, 2 semanas después de la segunda vacunación. Figure 17, Lymphoproliferation observed in spleen cells, 2 weeks after the second vaccination.

Figura 18, linfoproliferación observada en células esplénicas 2 semanas después de la segunda vacunación. Figure 18, Lymphoproliferation observed in spleen cells 2 weeks after the second vaccination.

Serología Serology

\bullet \ bullet
Respuesta de anticuerpo anti E7: se midieron IgG total y subisotipos (IgG1, IgG2a, IgG2b) mediante ELISA utilizando la proteína E7 como antígeno de recubrimiento. Anti E7 antibody response: IgG total and measured subisotipos (IgG1, IgG2a, IgG2b) by ELISA using the E7 protein as coating antigen. Los títulos de Ig anti-E7 observados 2 semanas después de la segunda vacunación se proporcionan en la tabla 6. La figura 19 muestra el porcentaje relativo de los diferentes isotipos de IgG en el suero de ratones vacunados 2 semanas después de la segunda vacunación.La respuesta débil de anticuerpo inducida después de dos vacunaciones con la ProtD1/3 E7 sola se incrementó fuertemente en animales que recibieron un adyuvante. Titers of anti-E7 Ig observed 2 weeks after the second vaccination are given in table 6. Figure 19 shows the relative percentage of the different IgG isotypes in the serum of vaccinated mice 2 weeks after the second vacunación.La weak antibody response induced after two vaccinations with ProtD1 / 3 E7 alone was strongly increased in animals that received an adjuvant. La respuesta más fuerte se obtuvo SB62. The strongest response was obtained SB62.

\bullet \ bullet
La respuesta débil de anticuerpo inducida después de dos vacunaciones con la ProtD1/3 E7 sola se incrementó fuertemente en animales que recibieron un adyuvante. The weak antibody response induced after two vaccinations with ProtD1 / 3 E7 alone was strongly increased in animals that received an adjuvant. La respuesta más fuerte se obtuvo SB62. The strongest response was obtained SB62.

\bullet \ bullet
El subisotipo predominante de anticuerpo específico de E7 inducido por todas las formulaciones de vacunas fue IgG2b (80-90% del total de las IgG). The predominant sub-isotype specific antibody induced E7 all vaccine formulations was IgG2b (80-90% of total IgG).
TABLA 6 TABLE 6 Títulos de Ig anti-E7 observados 2 semanas después de la segunda vacunación Ig titers anti-E7 observed 2 weeks after the second vaccination

Grupo Group Título de subtipos de Ig Ig subtypes title
IgG1 IgG1 IgG2a IgG2a IgG2b IgG2b
a to 0 0 0 0 0 0
b b 1420 1420 0 0 4070 4070
c c 7850 7850 1110 1110 70170 70170
d d 0 0 0 0 0 0
e and 11880 11880 470 470 86610 86610
f F 0 0 0 0 0 0
g g 13670 13670 1580 1580 62560 62560
h h 0 0 0 0 0 0
i i 13073 13073 1650 1650 89930 89930
j j 0 0 0 0 0 0
k k 260 260 0 0 2630 2630
l l 0 0 0 0 0 0

Figura 19, porcentaje relativo de los diferentes isotipos de IgG en el suero de ratones vacunados 2 semanas después de la segunda vacunación. Figure 19, relative percentage of the different IgG isotypes in the serum of vaccinated mice 2 weeks after the second vaccination.

  \newpage \ newpage 
Resultados de CTL CTL results

\bullet \ bullet
Una respuesta de CTL se podría detectar en los instantes 2 y 4 semanas después de la vacunación final. A CTL response could be detected at the instants 2 and 4 weeks after the final vaccination.

\bullet \ bullet
No se observó lisis cuando los ratones recibieron la proteína o el adyuvante solo. No lysis was observed when mice received the protein or the adjuvant alone. La mejor lisis específica se observó cuando los ratones recibieron el antígeno en DQ o SB62' (véase tabla 7). The best specific lysis was observed when mice received the antigen in DQ or SB62 '(see table 7).
TABLA 7 TABLE 7 Resumen de las respuestas de CTL después de estimulación de linfocitos esplénicos con TC1 EL4 + EL7 Summary of CTL responses after stimulation of splenic lymphocytes with TC1 EL4 + EL7

Grupo Group Anti-E7 CTL (relación de E:T 100:1) Anti-E7 CTL (E ratio: T 100: 1)
a to - -
b b - -
c c +++ +++
d d - -
e and ++ ++
f F - -
g g ++++ ++++
h h - -
i i + +
k k ++ ++
l l + +

Resultados de inmunohistoquímica Immunohistochemical results

Se retiraron los tumores de los ratones (2 ratones por grupo) y se congelaron las secciones. tumors of mice (2 mice per group) were removed and frozen sections. Las secciones criogénicas de los tumores se tiñeron con anticuerpos anti-CD4 y anti-CD8. Cryogenic tumor sections were stained with anti-CD4 and anti-CD8 antibodies. Los resultados de la infiltración tumoral observada por células CD4 y CD8+ve se proporcionan en la tabla 8. The results observed tumor infiltration by CD4 and CD8 + ve cells are given in Table 8.

TABLA 8 TABLE 8 Resultados de infiltración de tumores linfocíticos después de la vacunación con Results lymphocytic infiltration of tumors after immunization with

Grupo (Nº de ratón) Group (No. of mice) Control negativo negative control Infiltración de infiltration Infiltración de infiltration
linfocitos CD4+ve CD4 + sees linfocitos CD8+ve CD8 + sees
a (1) a (1) - - - - +/- +/-
a (2) a (2) - - - - +/- +/-
b (1) b (1) - - +/- +/- + +
b (2) b (2) - - - - + +
c (1) c (1) - - + + +++ +++
c (2) c (2) - - + + +++ +++
d (1) d (1) - - - - +/- +/-
d (2) d (2) - - +/- +/- + +

TABLA 8 (continuación) TABLE 8 (continued)

Grupo (Nº de ratón) Group (No. of mice) Control negativo negative control Infiltración de infiltration Infiltración de infiltration
linfocitos CD4+ve CD4 + sees linfocitos CD8+ve CD8 + sees
e (1) and (1) - - +/- +/- +++ +++
e (2) and (2) - - +/- +/- +++ +++
f (1) f (1) - - - - +/- +/-
f (2) f (2) - - - - +/- +/-

Conclusiones conclusions

\bullet \ bullet
Los tumores de regresión, en los grupos de ratones que recibieron la ProtD-1/3 E7 en DQ o SB62, mostraron una infiltración masiva con células CD8+ y poca de células CD4+. Regression tumors in the groups of mice that received the ProtD-1/3 E7 in DQ or SB62, showed a massive infiltration with CD8 + and CD4 + cell little.

\bullet \ bullet
Los tumores extraídos de los animales que recibieron el PBS, antígeno, o adyuvantes solos, no contenían ninguna infiltración linfocítica de CD8+ve. Tumors removed from the animals that received the PBS, antigen, or adjuvants alone, did not contain any CD8 + lymphocyte infiltration seen.

\bullet \ bullet
Dos vacunaciones (los días 7 y 14) con 5 \mug de ProtD 1/3 en formulaciones diferentes a base de SB62 indujeron el rechazo de tumores preestablecidos que expresan E7 implantados en un sitio distante. Two vaccinations (on days 7 and 14) with 5 \ ProtD 1/3 mug of different SB62 based formulations induced the rejection of pre-established E7 expressing tumors implanted to a distant site.

\bullet \ bullet
El rechazo de tumores se asocia con una respuesta CTL específica de anti E7. The tumor rejection is associated with a specific anti E7 CTL response. Existe una tendencia para que haya una respuesta ligeramente mejor de CTL en los individuos que rechazaron sus tumores. There is a tendency for there to be a slightly better CTL response in individuals who rejected their tumors.

\bullet \ bullet
La inmunoquímica mostró una infiltración masiva de células T de CD8+ en tumores que vuelven tras la vacunación con ProtD1/3 E7 + DQ y SB62. Immunochemistry showed a massive infiltration of CD8 + T cells in tumors returning after vaccination with ProtD1 / 3 E7 + DQ and SB62.

\bullet \ bullet
Dos vacunaciones (los días 14 y 21 después de la provocación de tumores) con 5 \mug de ProtD 1/3 E7 VPH 16 en SB62 redujo el desarrollo de estos tumores más grandes pero no indujeron regresión completa. Two vaccinations (days 14 and 21 after challenge of tumors) with 5 \ ProtD 1/3 E7 mug of HPV16 in SB62 reduced the development of these larger tumors but did not induce complete regression.

\bullet \ bullet
Cuatro vacunaciones (los días 7, 14, 21 y 28 después de la provocación de tumores) con 5 \mug de ProtD 1/3 E7 VPH 16 en SB62 indujo el rechazo completo de tumores establecidos en 60% de los animales. Four vaccinations (days 7, 14, 21 and 28 after challenge of tumors) with 5 \ ProtD 1/3 E7 mug of HPV16 in SB62 induced the complete rejection of established tumors in 60% of animals. Se observó el 40% de rechazo total después de 2 vacunaciones con el mismo adyuvante. 40% total rejection after 2 vaccinations with the same adjuvant was observed.

\bullet \ bullet
El uso la dosis baja de adyuvante de SB62' no tenía ningún efecto en la magnitud de los títulos de anticuerpos anti E7, todavía indujo el nivel más alto de proliferación de linfocitos esplénicos y respuestas de CTL anti-E7. The use of the low dose SB62 adjuvant 'had no effect on the magnitude of the titres of anti E7 antibody, yet induced the highest level of splenic lymphocyte proliferation and CTL responses anti-E7.
Conclusiones globales de la invención Overall conclusions of the invention

De los ejemplos anteriores está claro que la presente invención comprende una emulsión de aceite en agua que induce preferentemente una fuerte respuesta inmune de tipo Th1, especialmente la producción de IFN-\gamma. From the above examples it is clear that the present invention comprises an oil in water preferentially induces a strong immune response of Th1 type, especially production of IFN- \ gamma. Se ha demostrado que estas formulaciones estimulan respuestas inmunes a una amplia diversidad de antígenos y, por lo tanto, se prevé que esta invención presente encontrará utilidad en una amplia diversidad de patógenos sin limitarse a los encontrados en esta memoria descriptiva. It has been shown that these formulations stimulate immune to a wide variety of antigens responses and, therefore, are expected to find utility present invention in a wide variety of pathogens not limited to those found herein.

Ejemplo 5 example 5 Estabilización de QS21 mediante adición de colesterol Stabilization of QS21 by addition of Cholesterol

Se ha descrito previamente que QS21-H es producto de hidrólisis de QS21, que ya no es activo como adyuvante. Previously it described that QS21-H is hydrolysis product of QS21, that is no longer active as adjuvant. Se forma mediante escisión de la molécula de QS21 mediante OH^{-} de la solución acuosa. It is formed by cleavage of the QS21 molecule by OH- {-} of the aqueous solution. Esta reacción se produce cuando el pH del medio acuoso es superior a un valor de 6,5 y se acelera por temperatura más alta. This reaction occurs when the aqueous pH exceeds a value of 6.5 and is accelerated by higher temperature. Las emulsiones de aceite en agua descritas en esta solicitud de patente (por ejemplo SB62) se sabe que muestran un efecto estabilizante de tal forma que se inhibe la hidrólisis de QS21 en QS21-H. Oil emulsions in water described in this patent application (for example SB62) are known to exhibit a stabilizing effect such that the hydrolysis of QS21 QS21-H is inhibited. Tras la dilución de la emulsión de aceite en presencia de QS21 constante, pierden su propiedad estabilizante y el QS21 degenera en la forma inactiva QS21-H. Upon dilution of the oil emulsion in the presence of constant QS21, they lose their stabilizing property and the QS21 degenerates into the inactive QS21-H form. Sorprendentemente, las emulsiones que contienen colesterol adicional, que a una relación 1/1 no muestran una estabilidad de QS21 mejorada, mantienen el efecto estabilizante incluso a una dilución 1/5. emulsions containing additional Cholesterol, who at 1/1 ratio do not show an improved QS21 stability surprisingly maintain the stabilizing effect even at a 1/5 dilution.

QS21 y QS21-H se ensayan directamente en la emulsión. QS21 and QS21-H are assayed directly into the emulsion. Esto se logra mediante derivatización química de la formulación completa y realizando una etapa de extracción selectiva que disuelve la QS21, pero deja detrás la mayoría de los compuestos de matriz que interfieren. This is achieved by chemical derivatization of the entire formulation, and by performing a selective extraction step that dissolves the QS21, but leaves behind most interfering matrix compounds. El ensayo se basa en HPLC y los compuestos están dansilados. The assay is based on HPLC and the compounds are dansylated. La dansilación se realiza secando una muestra de la emulsión y añadiendo 100 \mul de 3,5 mg de hidracina de dansilo/ml C/M 2/1 y 100 \mul de 1:4 de ácido acético : C/M 2/1 en ese orden. The dansylation is performed by drying a sample of the emulsion and adding 100 \ l of 3.5 mg Dansyl hydrazine / ml C / M 2/1 and 100 \ l of 1: 4 Acetic acid: C / M 2/1 in that order. La mezcla se agita bien con vórtice y se incuba a 60ºC durante 2 horas. The mixture is well vortexed and incubated at 60 for 2 hours. Se seca la mezcla de reacción en el Speedvac. The reaction mixture in the Speedvac dried. Se reconstituye en 500 \mul de 30% de ACN en H_{2}O y se centrifuga dos veces a 14000 rpm durante dos minutos. It is reconstituted in 500 \ mul 30% ACN in H {2} O and centrifugated twice at 14000 rpm for two minutes. Después se recogen los sobrenadantes en un tubo automuestreador. Supernatants were then collected in an autosampler tube. Se obtiene una curva estándar mediante la preparación de QS21 y QS21-H en una mezcla que contiene los mismos compuestos que la emulsión en estudio. A standard curve is obtained by preparing QS21 and QS21-H in a mixture containing the same compounds as the emulsion under study.

El ensayo de HPLC se desarrolló en una columna C18 RP de tamaño de partícula 5 \mu Vydac 218TP54, 250* 4,6 mm. The HPLC assay was developed on a C18 RP column particle size 5 \ Vydac 218TP54 mu, 250 * 4.6mm. Los disolventes son A: H_{2}O + 0,05% de TFA (ácido trifluoroacético) y B: acetonitrilo + 0,05% de TFA. Solvents are A: H {2} O + 0.05% TFA (trifluoroacetic acid) and B: acetonitrile + 0.05% TFA. La tabla de gradientes es: The gradient table is:

Tiempo (min) Time (min) % de A % A % de B % B
0 0 70 70 30 30
2 two 70 70 30 30
15 fifteen 50 fifty 50 fifty
17 17 50 fifty 50 fifty
17,1 17.1 10 10 90 90
19 19 10 10 90 90
21 twenty-one 70 70 30 30
25 25 70 70 30 30

El caudal es 1 ml/min. The flow rate is 1 ml / min. La detección es en fluorescencia, con excitación a 345 nm y emisión a 515 nm. Detection is fluorescence, with excitation at 345 nm and emission at 515 nm. Se inyectan 50 \mul tanto de la muestra como de los patrones. They Inject 50 \ mul both sample as patterns. La columna más caliente se coloca a 37ºC para esta separación Se distinguen en el cromatograma los picos para QS21, QS21-iso y QS21-H. The warmer column 37 is placed for this separation peaks for QS21, QS21-iso and QS21-H are distinguished on the chromatogram.

Se analizó una serie de muestras con la siguiente composición: A series of samples were analyzed with the following composition:

Composición Composition SB62 SB62 SB62c SB62c MPL MPL QS21 QS21
SB62 SB62 250 \mul 250 \ mul - - 50 \mug 50 \ mug 50 \mug 50 \ mug
SB62' SB62 ' 50 \mul 50 \ mul - - 50 \mug 50 \ mug 50 \mug 50 \ mug
SB62c SB62c - - 250 \mul 250 \ mul 50 \mug 50 \ mug 50 \mug 50 \ mug
SB62'c SB62'c - - 50 \mul 50 \ mul 50 \mug 50 \ mug 50 \mug 50 \ mug

Se realizó el ensayo de QS21/QS21-H después de la incubación de las muestras en diversos intervalos de tiempo y temperaturas (4ºC y 37ºC). assay QS21 / QS21-H after incubation of the samples at various time intervals and temperatures (4 and 37) was performed. Los datos durante 1 mes a 37ºC en este modelo se correlacionan bien con la estabilidad de QS21 después de almacenamiento prolongado a 4ºC (por ejemplo 2 años). The data for 1 month at 37 in this model correlate well with stability of QS21 after prolonged at 4 (eg 2 years) storage.

TABLA 9 TABLE 9 Ensayo de QS21 por HPLC: % de QS21-H generada con el tiempo HPLC QS21 assay:% of QS21-H generated over time

Composición Composition 3 meses (4ºC) 3 months (4 ° C) 6 meses (4ºC) 6 months (4 ° C) 3 meses (4ºC) 3 months (4 ° C) 1 mes (37ºC) 1 month (37)
+ 7 días (37ºC) + 7 days (37 ° C)
SB62 SB62 1% one% 2% two% 3% 3% 15% fifteen%
SB62' SB62 ' 1% one% 1% one% 9% 9% 31% 31%
SB62c SB62c 2% two% 2% two% 3% 3% 17% 17%
SB62'c SB62'c 2% two% 2% two% 3% 3% 21% twenty-one%

Este resultado presentado en la tabla anterior muestra claramente (tanto durante 7 días como 1 m) el efecto de la adición de esterol, en este caso colesterol, a SB62' en el mantenimiento de la estabilidad de QS21. This result shown in the above table shows clearly (both for 7 days or 1 m) the effect of addition of sterol, in this case cholesterol, to SB62 'in maintaining the stability of QS21.

Claims (26)

1. Una composición que comprende una emulsión de aceite en agua y una saponina, en la que dicho aceite es un aceite metabolizable, caracterizado porque la relación del aceite metabolizable:saponina (p/p) está en el intervalo entre 1:1 y 200:1. 1. A composition comprising an oil in water and a saponin, wherein said oil is a metabolizable oil, wherein the ratio of the metabolisable oil: saponin (w / w) is in the range between 1: 1 and 200 :one.
2. Una composición según la reivindicación 1, caracterizada porque la relación del aceite metabolizable:saponina (p/p) está en el intervalo entre 1:1 y 100:1. 2. A composition according to claim 1, wherein the ratio of the metabolisable oil: saponin (w / w) is in the range between 1: 1 and 100: 1.
3. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en la que la saponina se deriva de QuilA, tal como QS21. 3. A composition according to any of claims 1 or 2, wherein the saponin is derived from QuilA, such as QS21.
4. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el aceite metabolizable es escualeno. 4. A composition according to any of claims 1 to 3, wherein the metabolizable oil is squalene.
5. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende además un esterol. 5. A composition according to any of claims 1 to 4, further comprising a sterol.
6. Una composición según la reivindicación 5, en la que el esterol es colesterol. 6. A composition according to claim 5, wherein the sterol is cholesterol.
7. Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende además uno o más inmunomoduladores. 7. A composition according to any one of claims 1 to 6, further comprising one or more immunomodulators.
8. Una composición según la reivindicación 7, en la que dicho inmunomodulador se selecciona del grupo constituido por: 3D-MPL y \alpha-tocoferol. 8. A composition according to claim 7, wherein said immunomodulator is selected from the group consisting of: 3D-MPL and \ -tocopherol.
9. Una composición según la reivindicación 3, y que comprende además 3D-MPL, caracterizada por que la relación de QS21:3D-MPL (p/p) está entre 1:10 y 10:1. 9. A composition according to claim 3, and further comprising 3D-MPL, characterized in that the ratio of QS21: 3D-MPL (w / w) is between 1:10 and 10: 1.
10. Una composición según la reivindicación 9, en la que la relación de QS21:3D-MPL (p/p) está entre 1:1 y 1:2,5. 10. A composition according to claim 9, wherein the ratio of QS21: 3D-MPL (w / w) is between 1: 1 and 1: 2.5.
11. Una composición según la reivindicación 1, y que comprende además colesterol, y en la que la saponina es QS21, caracterizada porque la relación de QS21:colesterol (p/p) está en el intervalo entre 1:1 y 1:20. 11. A composition according to claim 1, and further comprising cholesterol, and wherein the saponin is QS21, characterized in that the ratio of QS21: cholesterol (w / w) is in the range between 1: 1 and 1:20.
12. Una composición de vacunas que comprende una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende además un antígeno o una preparación antigénica. 12. A vaccine composition comprising a composition according to any one of claims 1 to 11, further comprising an antigen or antigenic preparation.
13. Una composición de vacunas según la reivindicación 12, en la que el antígeno o preparación antigénica se prepara a partir del grupo constituido por: virus de inmunodeficiencia humana; 13. A vaccine composition according to claim 12, wherein the antigen or antigenic preparation is prepared from the group consisting of: human immunodeficiency virus; virus Herpes simple tipo 1; Herpes simplex virus type 1; virus Herpes simple tipo 2; Herpes simplex virus type 2; citomagalovirus humano; human citomagalovirus; Hepatitis A, B, C, o E; Hepatitis A, B, C, or E; virus sincitial respiratorio; respiratory syncytial virus; virus de papiloma humano; human papillomavirus; virus de influenza; influenza virus; Salmonella; Salmonella; Neisseria; Neisseria; Borrelia; Borrelia; Chlamydia; Chlamydia; Bordetella; Bordetella; TB; TB; VBE; VBE; Plasmodium y Toxoplasma. Plasmodium and Toxoplasma.
14. Una composición de vacunas según la reivindicación 12, en la que el antígeno o preparación antigénica es una combinación de los antígenos de malaria RTS,S y TRAP. 14. A vaccine composition according to claim 12, wherein the antigen or antigenic preparation is a combination of the Malaria antigens RTS, S and TRAP.
15. Una composición de vacunas según la reivindicación 12, en la que el antígeno o preparación antigénica es, o se deriva de, un antígeno derivado de tumor u hospedador. 15. A vaccine composition according to claim 12, wherein the antigen or antigenic preparation is, or is derived from, a tumor or host derived antigen.
16. Una composición según la reivindicación 1, en la que la emulsión de aceite en agua comprende gotas de aceite que tienen un diámetro que es inferior a 1 micra. 16. A composition according to claim 1, wherein the oil in water emulsion comprises oil droplets having a diameter which is less than 1 micron.
17. Una composición según la reivindicación 1, en la que la emulsión de aceite en agua comprende gotas de aceite que están en el intervalo entre 120 y 750 nm de diámetro. 17. A composition according to claim 1, wherein the oil in water emulsion comprises oil droplets which are in the range between 120 and 750 nm in diameter.
18. Una composición según la reivindicación 1, en la que la emulsión de aceite en agua comprende gotas de aceite que están en el intervalo entre 120 y 600 nm de diámetro. 18. A composition according to claim 1, wherein the oil in water emulsion comprises oil droplets which are in the range between 120 and 600 nm in diameter.
19. Una composición de vacunas según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15 que es capaz de invocar una respuesta de células T de tipo citolítico en un mamífero al antígeno o composición antigénica. 19. A vaccine composition according to any one of claims 12 to 15 which is able to invoke a response from cytolytic T cell type in a mammal to the antigen or antigenic composition.
20. Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15 que es capaz de estimular la producción de interferón-\gamma en un mamífero al antígeno o composición antigénica. 20. A composition according to any one of claims 12 to 15 which is able to stimulate the production of interferon- \ gamma in a mammal to the antigen or antigenic composition.
21. Una composición de adyuvantes de vacunas según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15 para uso en medicina. 21. A composition according vaccine adjuvants any one of claims 12 to 15 for use in medicine.
  \newpage \ newpage 
22. Un procedimiento para fabricar una vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, que comprende la mezcla de una emulsión de aceite en agua; 22. A method of making a vaccine according to any one of claims 12 to 15, comprising admixing an oil in water; QS21; QS21; colesterol; cholesterol; 3D-MPL; 3D-MPL; \alpha-tocoferol; \ -Tocopherol; y un antígeno o preparación antigénica. and an antigen or antigenic preparation.
23. El uso de una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la fabricación de una vacuna adecuada para el tratamiento de un ser humano susceptible o que padece una enfermedad. 23. Use of a composition according to any one of claims 1 to 11 in the manufacture of a vaccine suitable for the treatment of a human susceptible to or suffering from a disease.
24. Un procedimiento para estabilizar una saponina presente en una composición de la reivindicación 1, que comprende la adición de un esterol en la fase oleosa de dicha emulsión de aceite en agua. 24. A method of stabilizing a saponin present in a composition of claim 1 comprising the addition of a sterol into the oil phase of said oil in water emulsion.
25. Un procedimiento según la reivindicación 24 en la que la saponina es QS21. 25. A method according to claim 24 wherein the saponin is QS21.
26. Un procedimiento según la reivindicación 24 ó 25 en la que el esterol es colesterol. 26. A method according to claim 24 or 25 wherein the sterol is cholesterol.
ES98954264T 1997-09-05 1998-09-02 Oil in water emulsions containing saponins. Expired - Lifetime ES2201551T3 (en)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB9718902.1A GB9718902D0 (en) 1997-09-05 1997-09-05 Vaccine
GB9718902 1997-09-05
GBGB9720982.9A GB9720982D0 (en) 1997-10-02 1997-10-02 Vaccine
GB9720982 1997-10-02

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2201551T3 true ES2201551T3 (en) 2004-03-16

Family

ID=26312192

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES98954264T Expired - Lifetime ES2201551T3 (en) 1997-09-05 1998-09-02 Oil in water emulsions containing saponins.
ES02018002T Expired - Lifetime ES2298316T3 (en) 1997-09-05 1998-09-02 Oil in water emulsions containing saponins.

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES02018002T Expired - Lifetime ES2298316T3 (en) 1997-09-05 1998-09-02 Oil in water emulsions containing saponins.

Country Status (8)

Country Link
US (2) US7323182B2 (en)
EP (2) EP1279401B1 (en)
JP (1) JP4426091B2 (en)
AU (1) AU1145699A (en)
CA (1) CA2302554C (en)
DE (2) DE69838992T2 (en)
ES (2) ES2201551T3 (en)
WO (1) WO1999011241A1 (en)

Families Citing this family (227)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9326253D0 (en) 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
AU1463097A (en) 1996-01-04 1997-08-01 Rican Limited Helicobacter pylori bacterioferritin
US6913749B2 (en) 1998-11-02 2005-07-05 Resistentia Pharmaceuticals Ab Immunogenic polypeptides for inducing anti-self IgE responses
US8206749B1 (en) 1999-02-26 2012-06-26 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Microemulsions with adsorbed macromolecules and microparticles
DK2266603T3 (en) 2000-10-18 2012-11-05 Glaxosmithkline Biolog Sa tumor Vaccines
AU5885700A (en) * 1999-06-22 2001-01-09 Chiron Corporation Method for treating chronic hbv infection
GB9915204D0 (en) * 1999-06-29 1999-09-01 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
GB9923176D0 (en) * 1999-09-30 1999-12-01 Smithkline Beecham Biolog Novel composition
AT402715T (en) * 1999-11-19 2008-08-15 Csl Ltd HCV vaccine compositions
IT1307281B1 (en) * 1999-11-25 2001-10-30 Simonelli Giuseppe Use of ubiquinone Q10 for the local treatment and prevention dipatalogie secondary ophthalmologic the photorefractive therapy,
MX357775B (en) 2000-10-27 2018-07-20 J Craig Venter Inst Inc Nucleic acids and proteins from streptococcus groups a b.
AU2736502A (en) 2000-12-07 2002-06-18 Chiron Corp Endogenous retroviruses up-regulated in prostate cancer
TWI228420B (en) * 2001-05-30 2005-03-01 Smithkline Beecham Pharma Gmbh Novel vaccine composition
GB0115176D0 (en) 2001-06-20 2001-08-15 Chiron Spa Capular polysaccharide solubilisation and combination vaccines
US8481043B2 (en) 2001-06-22 2013-07-09 Cpex Pharmaceuticals, Inc. Nasal immunization
PL367526A1 (en) 2001-06-29 2005-02-21 Chiron Corporation Hcv e1e2 vaccine compositions
GB0118249D0 (en) 2001-07-26 2001-09-19 Chiron Spa Histidine vaccines
US20030138434A1 (en) * 2001-08-13 2003-07-24 Campbell Robert L. Agents for enhancing the immune response
GB0121591D0 (en) 2001-09-06 2001-10-24 Chiron Spa Hybrid and tandem expression of neisserial proteins
US20030119774A1 (en) * 2001-09-25 2003-06-26 Marianna Foldvari Compositions and methods for stimulating an immune response
WO2003070909A2 (en) 2002-02-20 2003-08-28 Chiron Corporation Microparticles with adsorbed polypeptide-containing molecules
GB0210682D0 (en) * 2002-05-09 2002-06-19 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel use
AU2008200068B2 (en) * 2002-06-10 2009-10-29 Novartis Ag Combinations comprising epothilones and pharmaceutical uses thereof
EP1532161B1 (en) 2002-06-13 2012-02-15 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Vectors for expression of hml-2 polypeptides
US20050250175A1 (en) * 2002-08-02 2005-11-10 Takehiko Nomura Bacterial cell wall skeleton component preparaion
JP2006501237A (en) * 2002-08-26 2006-01-12 ファイザー・プロダクツ・インク A vaccine against respiratory and reproductive system infections of livestock
GB0220194D0 (en) 2002-08-30 2002-10-09 Chiron Spa Improved vesicles
CA2501812C (en) 2002-10-11 2012-07-10 Mariagrazia Pizza Polypeptide-vaccines for broad protection against hypervirulent meningococcal lineages
ES2594758T3 (en) 2002-10-23 2016-12-22 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vaccination procedures against malaria
EP1562982B1 (en) 2002-11-15 2010-05-05 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Unexpected surface proteins in neisseria meningitidis
GB0227346D0 (en) 2002-11-22 2002-12-31 Chiron Spa 741
CA2511512C (en) 2002-12-27 2013-10-29 Chiron Corporation Immunogenic compositions containing phospholipid
WO2004067030A2 (en) 2003-01-30 2004-08-12 Chiron Srl Injectable vaccines against multiple meningococcal serogroups
EP1608369B1 (en) 2003-03-28 2013-06-26 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Use of organic compounds for immunopotentiation
RU2005130646A (en) 2003-04-04 2006-01-27 Пфайзер Продактс Инк. (Us) Microfluidized emulsion oil in water compositions and vaccines
GB0308198D0 (en) 2003-04-09 2003-05-14 Chiron Srl ADP-ribosylating bacterial toxin
AT437633T (en) 2003-06-02 2009-08-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Immunogenic compositions based on biodegradable microparticles containing a diphtheria and tetanus toxoid
US20060035242A1 (en) 2004-08-13 2006-02-16 Michelitsch Melissa D Prion-specific peptide reagents
GB0323103D0 (en) 2003-10-02 2003-11-05 Chiron Srl De-acetylated saccharides
WO2005032583A2 (en) 2003-10-02 2005-04-14 Chiron Srl Liquid vaccines for multiple meningococcal serogroups
US20080254065A1 (en) 2004-03-09 2008-10-16 Chiron Corporation Influenza Virus Vaccines
DK1742659T3 (en) * 2004-04-05 2013-06-03 Zoetis P Llc Microfluidized oil-in-water emulsions and vaccine compositions
EP1741438A4 (en) * 2004-04-22 2009-08-26 Dainippon Sumitomo Pharma Co Pharmaceutical preparation containing bacterial cell wall skeleton component
GB0409745D0 (en) 2004-04-30 2004-06-09 Chiron Srl Compositions including unconjugated carrier proteins
WO2005105140A2 (en) 2004-04-30 2005-11-10 Chiron Srl Meningococcal conjugate vaccination
GB0410866D0 (en) 2004-05-14 2004-06-16 Chiron Srl Haemophilius influenzae
CA2567446C (en) 2004-05-21 2018-01-02 Chiron Corporation Alphavirus vectors for respiratory pathogen vaccines
WO2006115509A2 (en) 2004-06-24 2006-11-02 Novartis Vaccines And Diagnostics Inc. Small molecule immunopotentiators and assays for their detection
JP2008504292A (en) 2004-06-24 2008-02-14 ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス, インコーポレイテッド Compounds for immune enhancement
US20090317420A1 (en) 2004-07-29 2009-12-24 Chiron Corporation Immunogenic compositions for gram positive bacteria such as streptococcus agalactiae
GB0417494D0 (en) 2004-08-05 2004-09-08 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
GB0424092D0 (en) 2004-10-29 2004-12-01 Chiron Srl Immunogenic bacterial vesicles with outer membrane proteins
GB0500787D0 (en) 2005-01-14 2005-02-23 Chiron Srl Integration of meningococcal conjugate vaccination
BRPI0607374A2 (en) 2005-01-27 2009-09-01 Childrens Hosp & Res Ct Oakland vesicle-based vaccines gna1870 for broad-spectrum protection against disease caused by Neisseria meningitidis
GB0502095D0 (en) 2005-02-01 2005-03-09 Chiron Srl Conjugation of streptococcal capsular saccharides
GB0503337D0 (en) 2005-02-17 2005-03-23 Glaxosmithkline Biolog Sa Compositions
HUE027400T2 (en) 2005-02-18 2016-10-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa Proteins and nucleic acids from meningitis/sepsis-associated escherichia coli
NZ560929A (en) 2005-02-18 2009-12-24 Novartis Vaccines & Diagnostic Immunogens from uropathogenic escherichia coli
GB0504436D0 (en) 2005-03-03 2005-04-06 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
WO2006100111A1 (en) * 2005-03-23 2006-09-28 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Composition
GB0513421D0 (en) 2005-06-30 2005-08-03 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccines
CN101309701A (en) * 2005-10-07 2008-11-19 辉瑞产品公司 Vaccines and methods to treat canine influenza
CN101355960A (en) 2005-10-18 2009-01-28 诺华疫苗和诊断公司 Mucosal and systemic immunizations with alphavirus replicon particles
GB0522765D0 (en) 2005-11-08 2005-12-14 Chiron Srl Combination vaccine manufacture
JP5215865B2 (en) 2005-11-22 2013-06-19 ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス インコーポレイテッド Norovirus antigen and support viral antigens
GB0524066D0 (en) 2005-11-25 2006-01-04 Chiron Srl 741 ii
TWI457133B (en) 2005-12-13 2014-10-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel composition
KR101367237B1 (en) 2005-12-22 2014-03-14 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. Vaccine comprising streptococcus pneumoniae capsular polysaccharide conjugates
BRPI0717219A2 (en) 2006-10-12 2015-05-26 Glaxosmithkline Biolog Sa "Immunogenic composition, a method for treating or preventing disease, and use of an immunogenic composition."
SI2086582T1 (en) 2006-10-12 2013-02-28 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vaccine comprising an oil in water emulsion adjuvant
EP2357184B1 (en) 2006-03-23 2015-02-25 Novartis AG Imidazoquinoxaline compounds as immunomodulators
US20100021503A1 (en) 2006-03-30 2010-01-28 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Immunogenic composition
GB0607088D0 (en) 2006-04-07 2006-05-17 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
US9839685B2 (en) 2006-04-13 2017-12-12 The Regents Of The University Of Michigan Methods of inducing human immunodeficiency virus-specific immune responses in a host comprising nasally administering compositions comprising a naonemulsion and recombinant GP120 immunogen
US10138279B2 (en) 2006-04-13 2018-11-27 Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for Bacillus anthracis vaccination
WO2009030978A2 (en) 2006-06-09 2009-03-12 Novartis Ag Conformers of bacterial adhesins
WO2008009309A1 (en) 2006-07-17 2008-01-24 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Influenza vaccine
US20100166788A1 (en) 2006-08-16 2010-07-01 Novartis Vaccines And Diagnostics Immunogens from uropathogenic escherichia coli
AT555808T (en) 2006-09-26 2012-05-15 Infectious Disease Res Inst Vaccine composition with a synthetic adjuvant
US20090181078A1 (en) 2006-09-26 2009-07-16 Infectious Disease Research Institute Vaccine composition containing synthetic adjuvant
PE01462009A1 (en) 2007-04-20 2009-03-23 Glaxosmithkline Biolog Sa immunogenic composition against influenza virus
US20100055166A1 (en) 2007-03-02 2010-03-04 Gerald Hermann Voss Novel method and compositions
CN101784282B (en) 2007-06-26 2015-07-08 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 Vaccine comprising streptococcus pneumoniae capsular polysaccharide conjugates
GB0713880D0 (en) 2007-07-17 2007-08-29 Novartis Ag Conjugate purification
GB0714963D0 (en) 2007-08-01 2007-09-12 Novartis Ag Compositions comprising antigens
KR101580660B1 (en) * 2007-08-02 2015-12-28 바이오앤드백스 파마슈티칼즈, 리미티드. Multimeric multiepitope influenza vaccines
WO2009021931A1 (en) 2007-08-13 2009-02-19 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vaccines
KR101621837B1 (en) 2007-09-12 2016-05-17 노파르티스 아게 Gas57 mutant antigens and gas57 antibodies
EP2244695A1 (en) 2007-12-07 2010-11-03 Novartis AG Compositions for inducing immune responses
KR20100109556A (en) * 2007-12-21 2010-10-08 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. Vaccines for malaria
NZ586430A (en) 2007-12-21 2012-09-28 Novartis Ag Mutant forms of streptolysin o (slo)
RU2475496C2 (en) 2008-02-21 2013-02-20 Новартис Аг MENINGOCOCCAL fHBP POLYPEPTIDES
AU2009223613B2 (en) 2008-03-10 2014-09-25 Children's Hospital & Research Center At Oakland Chimeric factor H binding proteins (fHBP) containing a heterologous B domain and methods of use
WO2009127676A1 (en) 2008-04-16 2009-10-22 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Vaccine
EP2293813A4 (en) 2008-05-23 2012-07-11 Univ Michigan Nanoemulsion vaccines
GB0815872D0 (en) 2008-09-01 2008-10-08 Pasteur Institut Novel method and compositions
JP5722782B2 (en) 2008-09-26 2015-05-27 ナノバイオ コーポレーション Nanoemulsion therapeutic compositions and methods of use thereof
GB0818453D0 (en) 2008-10-08 2008-11-12 Novartis Ag Fermentation processes for cultivating streptococci and purification processes for obtaining cps therefrom
KR20110091560A (en) 2008-12-03 2011-08-11 프로테아 벡신 테크놀로지스 엘티디. Glutamyl trna synthetase (gts) fragments
WO2010067286A2 (en) 2008-12-09 2010-06-17 Pfizer Vaccines Llc IgE CH3 PEPTIDE VACCINE
MX2011007456A (en) 2009-01-12 2011-08-03 Novartis Ag Cna_b domain antigens in vaccines against gram positive bacteria.
EP2396032B1 (en) 2009-02-10 2016-09-28 Seqirus UK Limited Influenza vaccines with reduced amounts of squalene
PE15882015A1 (en) * 2009-02-17 2015-11-18 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine against dengue virus
EP2403526B1 (en) 2009-03-06 2019-05-15 GlaxoSmithKline Biologicals SA Chlamydia antigens
JP5830009B2 (en) 2009-04-14 2015-12-09 ノバルティス アーゲー Composition for immunizing against Staphylococcusaureus
AU2010243285B2 (en) 2009-04-30 2013-06-06 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Pneumococcal vaccine and uses thereof
US8668911B2 (en) 2009-05-14 2014-03-11 The Regents Of The University Of Michigan Streptococcus vaccine compositions and methods of using the same
MX360448B (en) 2009-06-05 2018-11-01 Infectious Disease Res Institute Synthetic glucopyranosyl lipid adjuvants.
DK2442826T3 (en) 2009-06-15 2015-09-21 Univ Singapore Influenza vaccine, composition and methods of using
WO2010148111A1 (en) 2009-06-16 2010-12-23 The Regents Of The University Of Michigan Nanoemulsion vaccines
JP2012532600A (en) 2009-07-07 2012-12-20 ノバルティス アーゲー Stored E. coli immunogen
EP2464658B1 (en) 2009-07-16 2014-10-01 Novartis AG Detoxified escherichia coli immunogens
WO2011013034A1 (en) 2009-07-30 2011-02-03 Pfizer Vaccines Llc Antigenic tau peptides and uses thereof
GB0913681D0 (en) 2009-08-05 2009-09-16 Glaxosmithkline Biolog Sa Immunogenic composition
GB0913680D0 (en) 2009-08-05 2009-09-16 Glaxosmithkline Biolog Sa Immunogenic composition
BR112012002963A2 (en) * 2009-08-12 2017-10-24 Sigmoid Pharma Ltd immunomodulatory compositions comprising a polymer matrix and an oily phase
NZ622048A (en) 2009-08-27 2015-10-30 Novartis Ag Hybrid polypeptides including meningococcal fhbp sequences
CA2846746A1 (en) 2009-09-03 2011-03-10 Pfizer Vaccines Llc Pcsk9 vaccine
WO2011031139A1 (en) 2009-09-09 2011-03-17 Universiteit Utrecht Holding B.V. An ataq protein or a part thereof as a vaccine
AU2010292233B2 (en) * 2009-09-10 2014-03-06 Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc. New vaccine formulations comprising saponin-containing adjuvants
CA2773637A1 (en) 2009-09-10 2011-03-17 Novartis Ag Combination vaccines against respiratory tract diseases
GB0917003D0 (en) 2009-09-28 2009-11-11 Novartis Vaccines Inst For Global Health Srl Purification of bacterial vesicles
GB0917002D0 (en) 2009-09-28 2009-11-11 Novartis Vaccines Inst For Global Health Srl Improved shigella blebs
AU2010302344A1 (en) 2009-09-30 2012-04-26 Novartis Ag Expression of meningococcal fhbp polypeptides
CA2779798C (en) 2009-09-30 2019-03-19 Novartis Ag Conjugation of staphylococcus aureus type 5 and type 8 capsular polysaccharides
GB0918392D0 (en) 2009-10-20 2009-12-02 Novartis Ag Diagnostic and therapeutic methods
JP5960055B2 (en) 2009-10-27 2016-08-02 ノバルティス アーゲー Modified meningococcal fHBP polypeptide
GB0919117D0 (en) 2009-10-30 2009-12-16 Glaxosmithkline Biolog Sa Process
GB0919690D0 (en) 2009-11-10 2009-12-23 Guy S And St Thomas S Nhs Foun compositions for immunising against staphylococcus aureus
MX341066B (en) 2009-11-13 2016-08-05 Laboratorios Leti S L * The use of an l3 and/or l5 source as a vaccine or as a diagnostic for a parasitic disease.
WO2011067758A2 (en) 2009-12-02 2011-06-09 Protea Vaccine Technologies Ltd. Immunogenic fragments and multimers from streptococcus pneumoniae proteins
EP2515934B1 (en) 2009-12-22 2017-05-17 Celldex Therapeutics, Inc. Vaccine compositions
ES2707778T3 (en) 2009-12-30 2019-04-05 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogens polysaccharides conjugated with carrier proteins of E. coli
EP2353609A1 (en) 2010-02-04 2011-08-10 Sanofi Pasteur Immunization compositions and methods
GB201003333D0 (en) 2010-02-26 2010-04-14 Novartis Ag Immunogenic proteins and compositions
GB201003920D0 (en) 2010-03-09 2010-04-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Method of treatment
WO2011126863A1 (en) 2010-03-30 2011-10-13 Children's Hospital & Research Center Oakland Factor h binding proteins (fhbp) with altered properties and methods of use thereof
GB201005625D0 (en) 2010-04-01 2010-05-19 Novartis Ag Immunogenic proteins and compositions
EP2556151A1 (en) 2010-04-07 2013-02-13 Novartis AG Method for generating a parvovirus b19 virus-like particle
ES2595207T3 (en) * 2010-05-07 2016-12-28 Virbac Vaccine composition for preventing or treating leishmaniosis
KR20130121699A (en) 2010-05-28 2013-11-06 테트리스 온라인, 인코포레이티드 Interactive hybrid asynchronous computer game infrastructure
CA2798837A1 (en) 2010-06-07 2011-12-15 Pfizer Inc. Her-2 peptides and vaccines
WO2011154878A1 (en) 2010-06-07 2011-12-15 Pfizer Vaccines Llc Ige ch3 peptide vaccine
GB201009671D0 (en) * 2010-06-10 2010-07-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel process
GB201009861D0 (en) 2010-06-11 2010-07-21 Novartis Ag OMV vaccines
US8658603B2 (en) 2010-06-16 2014-02-25 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for inducing an immune response
US9192661B2 (en) 2010-07-06 2015-11-24 Novartis Ag Delivery of self-replicating RNA using biodegradable polymer particles
MX2013000163A (en) 2010-07-06 2013-03-05 Novartis Ag Norovirus derived immunogenic compositions and methods.
BR112013004582A2 (en) 2010-09-27 2016-09-06 Crucell Holland Bv method for inducing an immune response in a subject against an antigen of a parasite that causes malaria
GB201017519D0 (en) 2010-10-15 2010-12-01 Novartis Vaccines Inst For Global Health S R L Vaccines
MX345739B (en) 2010-11-10 2017-02-14 Laboratorios Leti S L * New adjuvant.
WO2012072769A1 (en) 2010-12-01 2012-06-07 Novartis Ag Pneumococcal rrgb epitopes and clade combinations
EP2655389A2 (en) 2010-12-24 2013-10-30 Novartis AG Compounds
GB201101665D0 (en) 2011-01-31 2011-03-16 Novartis Ag Immunogenic compositions
CA2828068C (en) 2011-02-22 2019-03-19 Biondvax Pharmaceuticals Ltd. Multimeric multiepitope polypeptides in improved seasonal and pandemic influenza vaccines
WO2012131504A1 (en) 2011-03-02 2012-10-04 Pfizer Inc. Pcsk9 vaccine
EA027236B1 (en) 2011-04-08 2017-07-31 Иммьюн Дизайн Корп. Immunogenic compositions and methods of using the compositions for inducing humoral and cellular immune responses
ES2687129T3 (en) 2011-07-25 2018-10-23 Glaxosmithkline Biologicals Sa Compositions and methods for assessing functional immunogenicity of vaccines against parvovirus
EP2747779A4 (en) 2011-08-22 2015-04-08 Nanobio Corp Herpes simplex virus nanoemulsion vaccine
GB201114923D0 (en) 2011-08-30 2011-10-12 Novartis Ag Immunogenic proteins and compositions
EP2753354A4 (en) 2011-09-09 2015-04-15 Nanobio Corp Nanoemulsion respiratory syncytial virus (rsv) subunit vaccine
EP2755683B1 (en) 2011-09-14 2019-04-03 GlaxoSmithKline Biologicals SA Methods for making saccharide-protein glycoconjugates
US9511130B2 (en) 2011-09-14 2016-12-06 Glaxosmithkline Biologicals Sa Escherichia coli vaccine combination
CA2848611A1 (en) 2011-09-16 2013-03-21 Ucb Pharma S.A. Neutralising antibodies to the major exotoxins tcda and tcdb of clostridium difficile
WO2013074501A1 (en) 2011-11-14 2013-05-23 Crucell Holland B.V. Heterologous prime-boost immunization using measles virus-based vaccines
EP2788477A2 (en) 2011-12-07 2014-10-15 Institut Pasteur Identification of a swine parecho-like virus and applications
KR20140101835A (en) 2011-12-08 2014-08-20 노파르티스 아게 Clostridium difficile toxin-based vaccine
WO2013108272A2 (en) 2012-01-20 2013-07-25 International Centre For Genetic Engineering And Biotechnology Blood stage malaria vaccine
CN104363892A (en) 2012-02-07 2015-02-18 传染性疾病研究院 Improved adjuvant formulations comprising tlr4 agonists and methods of using the same
MX2014010011A (en) 2012-02-24 2014-09-08 Novartis Ag Pilus proteins and compositions.
US10279026B2 (en) 2012-04-26 2019-05-07 Glaxosmithkline Biologicals Sa Antigens and antigen combinations
RU2014147491A (en) 2012-04-26 2016-06-20 Новартис Аг Antigens and antigen composition
EP2659908A1 (en) 2012-05-01 2013-11-06 Affiris AG Compositions
EP2659906A1 (en) 2012-05-01 2013-11-06 Affiris AG Compositions
EP2659907A1 (en) 2012-05-01 2013-11-06 Affiris AG Compositions
CN104284674A (en) 2012-05-04 2015-01-14 辉瑞公司 Prostate-associated antigens and vaccine-based immunotherapy regimens
MX350274B (en) 2012-05-16 2017-08-31 Immune Design Corp Vaccines for hsv-2.
MX2014014067A (en) 2012-05-22 2015-02-04 Novartis Ag Meningococcus serogroup x conjugate.
PE03562015A1 (en) 2012-07-24 2015-03-20 Sanofi Pasteur Vaccine compositions for the prevention against infection by dengue virus
EP2877208A1 (en) 2012-07-24 2015-06-03 Sanofi Pasteur Vaccine compositions
AU2013320313B2 (en) 2012-09-18 2018-07-12 Glaxosmithkline Biologicals Sa Outer membrane vesicles
TR201808684T4 (en) 2012-10-02 2018-07-23 Glaxosmithkline Biologicals Sa Non-linear saccharide conjugates.
KR20150073943A (en) 2012-10-03 2015-07-01 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. Immunogenic composition
WO2014066663A1 (en) 2012-10-24 2014-05-01 Platelet Targeted Therapeutics, Llc Platelet targeted treatment
RS56886B1 (en) 2012-11-30 2018-04-30 Glaxosmithkline Biologicals Sa Pseudomonas antigens and antigen combinations
WO2014083194A1 (en) 2012-11-30 2014-06-05 Sanofi Pasteur Methods for inducing antibodies
CN105209047A (en) 2013-04-18 2015-12-30 免疫设计股份有限公司 GLA monotherapy for use in cancer treatment
US9463198B2 (en) 2013-06-04 2016-10-11 Infectious Disease Research Institute Compositions and methods for reducing or preventing metastasis
US10208102B2 (en) 2013-11-01 2019-02-19 University Of Oslo Albumin variants and uses thereof
SI3062815T1 (en) 2013-11-01 2019-05-31 Pfizer Inc. Vectors for expression of prostate-associated antigens
WO2015071769A2 (en) 2013-11-13 2015-05-21 University Of Oslo Outer membrane vesicles and uses thereof
DK3069138T3 (en) 2013-11-15 2019-04-08 Oslo Univ Hf CTL peptide epitopes and the antigen-specific T cells, methods for the realization thereof and uses thereof
WO2015077442A2 (en) 2013-11-20 2015-05-28 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Grass pollen immunogens and methods and uses for immune response modulation
US20160287696A1 (en) 2013-11-20 2016-10-06 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Pan pollen immunogens and methods and uses for immune response modulation
WO2015092710A1 (en) 2013-12-19 2015-06-25 Glaxosmithkline Biologicals, S.A. Contralateral co-administration of vaccines
EP3096785A2 (en) 2014-01-21 2016-11-30 Pfizer Inc Immunogenic compositions comprising conjugated capsular saccharide antigens and uses thereof
CA2935722A1 (en) 2014-01-21 2015-07-30 Immune Design Corp. Compositions for use in the treatment of allergic conditions
WO2015123291A1 (en) 2014-02-11 2015-08-20 The Usa, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services Pcsk9 vaccine and methods of using the same
WO2015131053A1 (en) 2014-02-28 2015-09-03 Alk-Abelló A/S Polypeptides derived from phl p and methods and uses thereof for immune response modulation
AR102548A1 (en) 2014-11-07 2017-03-08 Takeda Vaccines Inc Disease vaccines hands, feet and mouth and methods of manufacture and use
MX2017009308A (en) 2015-01-15 2017-11-08 Pfizer Immunogenic compositions for use in pneumococcal vaccines.
JP2018521016A (en) 2015-06-03 2018-08-02 アフィリス・アクチェンゲゼルシャフトAffiris Ag IL-23-p19 vaccine
US20180186896A1 (en) 2015-07-07 2018-07-05 Affiris Ag Vaccines for the treatment and prevention of ige mediated diseases
PE6572018A1 (en) 2015-07-21 2018-04-17 Pfizer immunogenic compositions comprising capsular saccharide antigens conjugated kits comprising them and their uses
US20180256633A1 (en) 2015-09-18 2018-09-13 Rijksuniversiteit Groningen Long chain inulin for stimulating an immune response
GB201518684D0 (en) 2015-10-21 2015-12-02 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
GB201518668D0 (en) 2015-10-21 2015-12-02 Glaxosmithkline Biolog Sa Immunogenic Comosition
CA3005524A1 (en) 2015-11-20 2017-05-26 Pfizer Inc. Immunogenic compositions for use in pneumococcal vaccines
BR112018013967A2 (en) 2016-01-19 2019-02-05 Pfizer cancer vaccines
WO2017158421A1 (en) 2016-03-14 2017-09-21 University Of Oslo Anti-viral engineered immunoglobulins
CA3011887A1 (en) 2016-03-14 2017-09-21 Stian FOSS Engineered immunoglobulins with altered fcrn binding
GB201610599D0 (en) 2016-06-17 2016-08-03 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic Composition
WO2017221072A2 (en) 2016-06-21 2017-12-28 University Of Oslo Hla binding vaccine moieties and uses thereof
EP3504230A1 (en) 2016-08-23 2019-07-03 GlaxoSmithKline Biologicals SA Fusion peptides with antigens linked to short fragments of invariant chain (cd74)
GB201614799D0 (en) 2016-09-01 2016-10-19 Glaxosmithkline Biologicals Sa Compositions
WO2018060288A1 (en) 2016-09-29 2018-04-05 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Compositions and methods of treatment of persistent hpv infection
WO2018096396A1 (en) 2016-11-22 2018-05-31 University Of Oslo Albumin variants and uses thereof
GB201620968D0 (en) 2016-12-09 2017-01-25 Glaxosmithkline Biologicals Sa Adenovirus polynucleotides and polypeptides
AU2018208844A1 (en) 2017-01-20 2019-07-11 Pfizer Inc. Immunogenic compositions for use in pneumococcal vaccines
WO2018232257A1 (en) 2017-06-15 2018-12-20 Infectious Disease Research Institute Nanostructured lipid carriers and stable emulsions and uses thereof
WO2019048936A1 (en) 2017-09-07 2019-03-14 University Of Oslo Vaccine molecules
WO2019048928A1 (en) 2017-09-07 2019-03-14 University Of Oslo Vaccine molecules
WO2019090238A1 (en) 2017-11-03 2019-05-09 Takeda Vaccines, Inc. Zika vaccines and immunogenic compositions, and methods of using the same
GB201721068D0 (en) 2017-12-15 2018-01-31 Glaxosmithkline Biologicals Sa Hepatitis B immunisation regimen and compositions
GB201721069D0 (en) 2017-12-15 2018-01-31 Glaxosmithkline Biologicals Sa Hepatitis B Immunisation regimen and compositions
GB201721582D0 (en) 2017-12-21 2018-02-07 Glaxosmithkline Biologicals Sa S aureus antigens and immunogenic compositions
GB201721576D0 (en) 2017-12-21 2018-02-07 Glaxosmithkline Biologicals Sa Hla antigens and glycoconjugates thereof

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0230733B2 (en) * 1982-06-28 1990-07-09 Shiseido Co Ltd
US5057540A (en) * 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
GB8819209D0 (en) * 1988-08-12 1988-09-14 Research Corp Ltd Polypeptide & dna encoding same
EP0454735B1 (en) * 1989-01-23 1996-05-22 Auspharm International Limited Vaccine composition
US5178862A (en) * 1989-12-01 1993-01-12 Parhelion Corporation Canine distemper virus vaccine and method of preparation
HU220295B (en) 1991-07-25 2001-11-28 Idec Pharmaceuticals Corp. Antigen formulations and their use to induce cytotoxic T-lymphocyte responses in
FR2713906B1 (en) 1993-12-20 1996-08-30 Moulinex Sa Automatic ground grain dispenser.
GB9326253D0 (en) * 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
JPH08605A (en) 1994-06-16 1996-01-09 Hitachi Medical Corp X-ray tomographic equipment
JP3308397B2 (en) 1994-07-07 2002-07-29 住友ベークライト株式会社 The epoxy resin composition for semiconductor encapsulation
ES2140076T5 (en) * 1995-04-25 2007-04-16 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Vaccines containing a saponin and a sterol.
NZ331164A (en) * 1996-02-09 2000-02-28 Univ Liege Vaccines against varicella zoster virus gene 63 product
GB9718901D0 (en) * 1997-09-05 1997-11-12 Smithkline Beecham Biolog Vaccine

Also Published As

Publication number Publication date
US20080160047A1 (en) 2008-07-03
EP1279401A1 (en) 2003-01-29
CA2302554A1 (en) 1999-03-11
US20030095974A1 (en) 2003-05-22
EP1009382B1 (en) 2003-06-18
ES2298316T3 (en) 2008-05-16
CA2302554C (en) 2007-04-10
WO1999011241A1 (en) 1999-03-11
US7323182B2 (en) 2008-01-29
JP4426091B2 (en) 2010-03-03
EP1009382A1 (en) 2000-06-21
DE69838992T2 (en) 2008-12-24
DE69838992D1 (en) 2008-02-21
DE69815692T2 (en) 2004-04-29
AU1145699A (en) 1999-03-22
DE69815692D1 (en) 2003-07-24
JP2001514208A (en) 2001-09-11
EP1279401B1 (en) 2008-01-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Barr et al. ISCOMs and other saponin based adjuvants
AU714930B2 (en) Vaccines
KR100876263B1 (en) The use of imidazo quinoline amine as an adjuvant in vaccination Dna
AU661404B2 (en) Vaccine composition containing adjuvants
EP0822831B2 (en) Vaccines containing a saponin and a sterol
CA2662921C (en) Vaccine and pharmaceutical compositions and kits and uses thereof in stimulating an immune response with a synthetic glucopyranosyl lipid adjuvant
EP2664332B1 (en) Vaccine composition containing synthetic adjuvant
AU2004254152B2 (en) Quil a fraction with low toxicity and use thereof
CA2347099C (en) Adjuvant systems comprising an immunostimulant adsorbed to a metallic salt particle and vaccines thereof
AP515A (en) &#34;&#34;&#34;Vaccine compositions&#34;&#34;.&#34;
JP5230632B2 (en) Vaccines containing oil-in-water emulsion adjuvant
KR100350965B1 (en) Be a vaccine composition, and its production method comprising the oil-in-water emulsion, and this also applies to the pharmaceutical
ES2378471T3 (en) immunogenic composition comprising an adjuvant
AU765824B2 (en) Vaccines
CA2679410C (en) Novel method and compositions
Garçon et al. Development of RTS, S/AS02: a purified subunit-based malaria vaccine candidate formulated with a novel adjuvant
JP4636877B2 (en) Preparation and use of immunostimulating complexes
US20040013695A1 (en) Oral solid dose vaccine
DE60132474T2 (en) An immunostimulating nucleotide and a tocol containing composition
US6375945B1 (en) Adjuvant compositions for vaccines
JP5108521B2 (en) Malaria prime / boost vaccine
US6544518B1 (en) Vaccines
Cohen et al. Vaccines
Kensil et al. Structural and immunological characterization of the vaccine adjuvant QS-21
AU766635B2 (en) Adjuvant comprising a polyxyethylene alkyl ether or ester and at least one nonionic surfactant