ES2197923T3

ES2197923T3 - Composiciones de muramilpeptidos que inhiben la replicacion de vih.

Info

Publication number: ES2197923T3
Application number: ES95932794T
Authority: ES
Inventors: Georges Bahr
Original assignee: Vacsyn SA
Current assignee: Vacsyn SA
Priority date: 1994-09-26
Filing date: 1995-09-26
Publication date: 2004-01-16
Anticipated expiration: 2015-09-26
Also published as: EP0783319A1; DK0783319T3; DE69530779D1; EP0783319B1; AU3569995A; JPH10506120A; PT783319E; CA2200993A1; ATE240114T1; DE69530779T2; FR2724845B1; WO1996009837A1; FR2724845A1

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A LA UTILIZACION DE MULRAMILPEPTIDOS NO TOXICOS, PARTICULARMENTE EL MURABUTIDO Y EL MURAMETIDO, PARA LA CONSTITUCION DE MEDICAMENTOS QUE INHIBEN LA REPLICACION DE VIH EN EL HOMBRE. ESTOS MURAMILPEPTIDOS SON APTOS PARA INHIBIR HASTA 100% LA REPLICACION DE RETROVIRUS EN CULTIVOS PRIMARIOS DE MONOCITOS DEL HUESPED.

Description

Composiciones de muramilpéptidos que inhiben la replicación de VIH.

El síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) es una enfermedad devastadora causada por una infección por el retrovirus VIH. Se han consagrado muchos esfuerzos para encontrar medicamentos capaces de inhibir la replicación del virus. Pero hasta hoy se han obtenido pocos éxitos significativos. Aunque el VIH pueda infectar muchas células diferentes, la enfermedad es causada mayoritariamente por la destrucción y/o la disfunción de una subpoblación de linfocitos llamados células T auxiliares. Desde hace poco se atribuye la persistencia de la infección por el virus a su capacidad de infectar otra población importante de células, la descendencia monocito/macrófago, que serviría de depósito para relargar el virus en continuo. Ya se ha explicado el importante papel jugado por esta descendencia por VIH en la persistencia y la progresión de la enfermedad por:

1): el aislamiento de variantes monocitótropas del VIH de los leucocitos de la sangre circulante y de los macrófagos tisulares de los sujetos infectados a todos los niveles de la infección (J. Virology,; Vol. 65, páginas 356-363, 1991) y

2): la correlación directa entre una ausencia de disfunción de la inmunidad sistémica en el huésped infectado y una ausencia de replicación viral en la descendencia monocito/macrófago (J. Infectious diseases, Vol. 168, páginas 1140- 1147, 1993). Además, la inhibición de una infección que produce virus en los monocitos parece estar unida en gran medida a la inhibición de la proliferación monocitaria, sugiriendo que la replicación del virus depende de una etapa previa obligatoria de proliferación de la célula monocitaria alta. De esta forma podría ser que la proliferación de esta población fuese un paso obligado para la manifestación del carácter infeccioso del VIH. Así ha sido formulada la hipótesis de que unas sustancias capaces de inhibir la replicación monocitaria podrían también inhibir la replicación del VIH (J. Clinical Investigation, Vol. 89, páginas 1154-1160, 1992).

Los muramilpéptidos son unas copias sintéticas de la pared bacteriana y se han revelado capaces de numerosísimas actividades inmunofarmacológicas sobre la descendencia monocito/macrófago (Federation proceedings, Vol. 45, páginas 2541- 2544, 1986). Además, la molécula inicial, la N-acetil-muramil-L-alanil-D- Isoglutamina (Nac-Mur-L-Ala-DisoGln) también llamada Muramil dipéptido o MDP, ha sido descrita como capaz de inhibir la proliferación de los macrófagos de los cobayas (Cellular Immunology, Vol. 89, páginas 427-438, 1984). En otro estudio que utiliza unas descendencias celulares establecidas de linfocitos o de células de tipo monocitario, se ha encontrado que el MDP está dotado de la capacidad de inhibir parcialmente la replicación del HIV, cuando es utilizado in vitro a unas dosis muy elevadas 1000 \mug/ml (AIDS Research and Human Retroviruses, Vol. 6, páginas 393/394, 1990). De todas formas, aparte que el uso del MDP en clínica humana es difícilmente previsible debido a los efectos secundarios que induce, los efectos observados, incluso a estas dosis elevadas en el sistema experimental utilizado, no prejuzgarían ninguna eficacia terapéutica con respecto a la infección por el VIH. Lazdins et al. (Aids Research and Human Retroviruses, Vol. 6, páginas 1157-1161, 1990), han mostrado in vitro unas propiedades similares de inhibición de la replicación del VIH por un muramilpéptido que tiene un mejor índice terapéutico que el MDP: el MTP-PE. Esta molécula, en su forma libre, ha sido añadida de forma repetitiva antes y después de la infección por VIH a unos cultivos de macrófagos fruto de monocitos humanos puestos en cultivo. Pero solo ha podido, en estas condiciones, inducir una reducción parcial de la replicación viral. Debe subrayarse que el MTP-PE no ha sido capaz, ni en estado libre, ni incorporado en unos liposomas, de provocar una supresión total de la replicación viral. Por otra parte su actividad sólo puede ejercerse si el compuesto está presente el día de la infección del cultivo celular por el virus. Si el compuesto es añadido un día antes o 4 días después al cultivo, su actividad es mínima.

Shcreck et al., Clin. Exp. Inmunol. 90 pp. 188-193 (1992) describe la selección de un muramil péptido como adyuvante potencial para unas vacunas contra el SIDA, estando basada la selección en la ausencia de activación del factor -kB nuclear. Solo el MDP (thr)-GDP ha sido extraído.

Estos resultados sólo hacen que sean más sorprendentes los obtenidos con otra categoría de muramilpéptidos, que han revelado que permiten una inhibición completa de la proliferación del VIH, en particular en unos cultivos primarios de monocitos, y ello a unas dosis mucho más bajas. Añadiéndose su menor toxicidad a estos efectos favorables, los hace por lo tanto aptos para la composición de medicamentos aptos para prevenir o tratar unos SIDA y/o unos síndromes relacionados con estos.

\newpage

Más particularmente la invención se refiere a la utilización, para la elaboración de medicamentos que inhiben la replicación del retrovirus de la inmunodeficiencia adquirida en el hombre o aquellos mamíferos que es susceptible de infectar, de un muramilpéptido de fórmula:

1

en la cual el grupo R es un grupo metilo; X es un residuo L-alanilo y R1 es un grupo amino o un grupo O(CH_{2})_{x} H con x= 1, 2, 3 ó 4, R2 es, independientemente de R1, un grupo hidroxilo, amino O(CH_{2})_{x}H con x = 1, 2, 3 ó 4 en la cual el muramilpéptido es apto para inhibir hasta el 100% la replicación del retrovirus en unos cultivos primarios de monocitos del huésped.

Una subcategoría de muramilpéptidos preferidos para la producción de los medicamentos arriba indicados está constituida por unos muramilpéptidos hidrófilos que responden a la fórmula general indicada más arriba en la cual el grupo R es un hidrógeno o un grupo metilo; X es un residuo L-alanilo ó L- treonilo, y R1 y R2 son independientemente el uno del otro, unos grupos hidroxilo, amino, O(CH_{2})_{x}H con x= 1, 2, 3 ó 4, entendiéndose que, cuando X es un residuo L-alanilo, uno al menos de estos dos grupos R1 y R2 es siempre un grupo O(CH_{2})_{x} H tal como el definido anteriormente.

Unos compuestos preferidos para la utilización según la invención son el Murabutide (Nac-Mur-L-Ala-DGln O_{n}C_{4}H_{9}) y el Murametide (Nac-Mur- L-Ala-DGln OMe). Estas moléculas presentan un excelente perfil de actividades en el hombre; están desprovistas de efectos secundarios y han demostrado su excelente tolerancia, durante los ensayos clínicos realizados en voluntarios sanos y sujetos cancerosos.

Es de destacar a este respecto que los muramilpéptidos arriba mencionados son capaces, en concentraciones relativamente bajas, de ejercer una inhibición completa, de hasta el 100%, de la proliferación del VIH, en unos cultivos primarios de monocitos, y ello de manera muy particular en los protocolos experimentales a los cuales se hará referencia seguidamente.

Es particularmente interesante destacar que la manifestación del efecto inhibidor de estos muramilpéptidos con respecto a la replicación retroviral, no está relacionada con la simultaneidad de infección de los monocitos y el tratamiento de estos últimos con estos muramilpéptidos.

Aparecerán también unas características suplementarias de la invención a lo largo de la descripción que sigue, unos efectos biológicos ejercidos por dos muramilpéptidos preferidos contra la replicación del VIH en unos cultivos primarios de monocitos humanos extraídos de unos voluntarios sanos.

En el ejemplo 1, el Murabutide y el Murametide han demostrado su capacidad de inhibir la proliferación de macrófagos en cultivo. Para ello, unos monocitos extraídos de un donante son puestos en cultivo durante 5 días, o bien a) sin estimulación (con el fin de evaluar su nivel de proliferación espontánea), o bien b) en presencia de la interleucina 3 recombinante humana (rh IL-3), o bien c) en presencia de rh IL-3 y de rh GM-CSF ``granulocyte- macróphage colony stimulating factor'' recombinante humano.

Estos dos tratamientos permiten obtener un alto nivel de proliferación. Los compuestos de la invención son añadidos al medio de cultivo un día antes de añadir timidina tritiada (^{3}H-timidina). Las células en vía de división incorporan esta timidina. Las células (que se han diferenciado en macrófagos durante la duración del cultivo) son recogidas y lavadas, y se evalúa el nivel de proliferación midiendo, en un contador beta, la cantidad de ^{3}H incorporada siguiendo unos métodos clásicos tales como los descritos en Blood, Vol. 76, páginas 1490- 1493, 1990. Los resultados son presentados en la tabla 1 y muestran que los dos derivados son capaces, incluso a la dosis de 1 \mug/ml, de inhibir la proliferación de macrófagos estimulados por el IL-_{3} o la combinación IL-_{3}/GM-CSF. El efecto de inhibición de la proliferación espontánea ha sido observado con 10 \mug/ml de Murabutide y 10 ó 50 \mug/ml de Murametide.

El ejemplo 2 demuestra el efecto del Murabutide y del Murametide sobre el nivel de replicación del VIH en unos cultivos primarios de monocitos humanos extraídos de unos voluntarios sanos. Algunos cultivos monocitarios han sido infectados a día 0 por una fuente VIH (HTLV III Ba-L) que presenta un tropismo para los monocitos. Ciertos cultivos fueron tratados por diferentes concentraciones de unos compuestos o bien 1 día antes, o bien el mismo día, o bien 1 día después de la inoculación por el VIH. La replicación del virus ha sido evaluada el día 7 midiendo la cantidad de proteína viral P24 en los sobrenadantes como se ha descrito en Blood, vol.76, página 1490-1493, 1990. Los resultados presentados en la tabla 2 muestran claramente que el tratamiento con Murabutide a una concentración de 10 a 50 \mug/ml inhibe completamente la replicación viral aunque el tratamiento haya sido practicado el día -1, el día 0 o el día +1 con respecto a la infección. De forma similar, el tratamiento con Murametide ha permitido observar una supresión altamente significativa de la replicación viral y este efecto es del 100% a la dosis de 50 \mug/ml sea cual sea aquí también el montante del tratamiento.

Esos resultados son los primeros descritos que han permitido, mediante un muralmilpéptido, obtener una inhibición completa de la replicación del VIH en unos monocitos humanos. Debe destacarse que la inhibición se obtiene cuando el compuesto es añadido al cultivo una sola vez e incluso después de la infección por el VIH.

Los datos anteriores muestran que los muralpéptidos de la invención pueden ser aplicados en la composición de medicamentos aplicables a la prevención o el tratamiento del SIDA, o de los síndromes que le están asociados, como por ejemplo el sarcoma de Kaposi.

La invención es también aplicable a la composición de medicamentos en los cuales los muralpéptidos son utilizados asociados con otros agentes terapéuticos utilizados para prevenir o inhibir la proliferación y la difusión del VIH en el hombre. Entre estos agentes se pueden citar los interferones \alpha, \beta, \gamma y el GM-CSF.

Las moléculas de la invención pueden ser utilizadas en clínica humana o bien a título preventivo en los sujetos de riesgo, o bien a título curativo en unos individuos seropositivos antes de la aparición de los síntomas clínicos o pacientes que hayan desarrollado síntomas del SIDA. Las dosis terapéuticas del muramilpéptido (por ejemplo Murabutide o Murametide) a administrar o bien sólo, o bien en asociación con unos tratamientos antivíricos, en particular unas citoquinas, se sitúan entre 1 \mug y 500 \mug/Kg/día. Se puede realizar la administración por vía sistémica, por inyección subcutánea o intravenosa o por perfusión. El tratamiento puede consistir en administraciones diarias o con algunos días de intervalo y prolongarse de una semana a varios meses dependiendo del efecto observado.

En el caso de individuos seropositivos o enfermos, el tratamiento debe prolongarse hasta la ausencia de detección de antígeno o la ausencia de genes virales respectivamente en el suero o en las células del individuo infectado. En el caso de individuos de riesgo, el tratamiento preventivo debe ser aplicado durante el periodo en que existe un riesgo de infección.

Las moléculas de la invención así como los otras moléculas de la familia de muramilpéptidos pueden también ser utilizadas como reactivos de laboratorio con el fin de permitir la evaluación como agentes anti-VIH de otras drogas presumiblemente dotadas de actividad antiviral. Así unas dosis por debajo de las óptimas de muramilpéptidos podrían ser utilizadas en asociación con un otro agente para detectar una actividad potencial de este último.

Este tipo de reactivo podría ser utilizado en unos sistemas de experimentación in vitro que utilicen unos cultivos de monocitos/macrófagos tales como los descritos en esta patente o unos procedimientos de evaluación in vivo que incluyan la utilización de ratones SCID.

TABLA 1 Inhibición de la proliferación de cultivos primarios de macrófagos por el Murabutide o el Murametide

\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|l|l|l|l|l|l|l|}\hline
 Moléculas  \+\multicolumn{6}{|l|}{Proliferación de los macrófagos
después de la estimulación}\\\dddcline{2}{7}  Ensayadas 
\+\multicolumn{2}{|l|}{Medio }\+\multicolumn{2}{|l|}{rh
IL-3 }\+\multicolumn{2}{|l|}{rh IL-3
+ rh GM-CSF}\\\dddcline{2}{7}  ( \mu g/ml)  \+ Cpm* 
\+ % inhibición  \+ Cpm  \+ % inhibición  \+ Cpm  \+ % inhibición
\\\hline  \+ \+ \+ \+ \+ \+ \\\hline  -  \+ 1500  \+ 0  \+ 3400  \+
0  \+ 5000  \+ 0 \\\hline  \+ \+ \+ \+ \+ \+ \\\hline  Murabutide \+
\+ \+ \+ \+ \+ \\\hline  (1)  \+ 1400  \+ 7  \+ 2600  \+ 23  \+ 2100
 \+ 58 \\\hline  (10)  \+ 100  \+ 93  \+ 600  \+ 82  \+ 1000  \+ 80
\\\hline  (50)  \+ 900  \+ 40  \+ 1700  \+ 50  \+ 1200  \+ 76
\\\hline  (100)  \+ 1500  \+ 0  \+ 2100  \+ 38  \+ 2000  \+ 60
\\\hline  \+ \+ \+ \+ \+ \+ \\\hline  Murametide \+ \+ \+ \+ \+ \+
\\\hline  (1)  \+ 300  \+ 80  \+ 1000  \+ 70  \+ 1100  \+ 78
\\\hline  (10)  \+ 1200  \+ 20  \+ 1700  \+ 50  \+ 1300  \+ 74
\\\hline  (50)  \+ 150  \+ 90  \+ 500  \+ 85  \+ 1000  \+ 80
\\\hline  (100)  \+ 1000  \+ 33  \+ 1600  \+ 53  \+ 1350  \+ 73
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

* Golpes por minuto de ^{3}H-timidina/cultivo

TABLA 2 Inhibición de la replicación del VIH en unos monocitos humanos por el Murabutide o el Murametide

\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|l|l|l|l|l|l|l|}\hline
 Moléculas  \+\multicolumn{6}{|l|}{Replicación del HIV en unos
cultivos de 7 días de monocitos  humanos tratados
a}\\\dddcline{2}{7}  Ensayadas  \+\multicolumn{2}{|l|}{DIA -1*
}\+\multicolumn{2}{|l|}{DIA 0 }\+\multicolumn{2}{|l|}{DIA
+1}\\\dddcline{2}{7}  ( \mu g/ml)  \+ P24  \+ % inhibición  \+ P24 
\+ % inhibición  \+ P24  \+ % inhibición \\   \+ ( \mu g/ml)  \+  \+
( \mu g/ml)  \+  \+ ( \mu g/ml) \+ \\\hline  \+ \+ \+ \+ \+ \+
\\\hline  Murabutide \+ \+ \+ \+ \+ \+ \\\hline  (0)  \+ 755  \+ 0 
\+ 755  \+ 0  \+ 755  \+ 0 \\\hline  (1)  \+ 355  \+ 53  \+ 480  \+
36  \+ 105  \+ 86 \\\hline  (10)  \+ 0  \+ 100  \+ 0  \+ 100  \+ 0 
\+ 100 \\\hline  (50)  \+ 0  \+ 100  \+ 0  \+ 100  \+ 0  \+ 100
\\\hline  (100)  \+ 70  \+ 91  \+ 0  \+ 100  \+ 0  \+ 100 \\\hline 
\+ \+ \+ \+ \+ \+ \\\hline  Murametide \+ \+ \+ \+ \+ \+ \\\hline 
(0)  \+ 874  \+ 0  \+ 874  \+ 0  \+ 874  \+ 0 \\\hline  (1)  \+ 473 
\+ 46  \+ 255  \+ 71  \+ 182  \+ 79 \\\hline  (10)  \+ 136  \+ 84 
\+ 182  \+ 79  \+ 27  \+ 97 \\\hline  (50)  \+ 0  \+ 100  \+ 0  \+
100  \+ 0  \+ 100 \\\hline  (100)  \+ 36  \+ 96  \+ 55  \+ 94  \+ 0 
\+ 100
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip

*: el día del tratamiento indica el día en que las moléculas han sido añadidas al medio de cultivo con respecto al día de la infección por el VIH que es considerado como día 0.

Claims

1. Utilización para la preparación de un medicamento que inhibe la replicación de los retrovirus de la inmunodeficiencia adquirida en el hombre o en los mamíferos que son susceptibles de infectar, de un muramilpéptido de fórmula:

2

en la cual el grupo R es un grupo metilo; X es un residuo de L-alanilo, y R1 es un grupo O(CH_{2})_{x}H con x= 1, 2, 3 ó 4, R2 es, independientemente de R1, un grupo hidroxilo, amino o un grupo O(CH_{2})_{x}H con x= 1, 2, 3 ó 4, y en la cual el muramilpéptido es apto para inhibir hasta el 100% la replicación de retrovirus en unos cultivos primarios de monocitos del huésped.

2. Utilización según la reivindicación 1, caracterizada porque el grupo R es un grupo metilo, y el grupo R2 es un grupo NH_{2}.

3. Utilización según la reivindicación 1, caracterizada porque el muramilpéptido es el Murametide.

4. Utilización según la reivindicación 1, caracterizada porque el muramilpéptido es el Murabutide.

5. Utilización según la reivindicación 1, caracterizada porque el muramilpéptido es el Muradimetide.

6. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para la preparación de medicamentos destinados a la prevención o al tratamiento del SIDA o de unos síntomas que le están asociados, en particular el sarcoma de Kaposi.

7. Utilización según la reivindicación 6, para la preparación de medicamentos que contengan además del mencionado muramilpéptido, otra molécula que participe en la acción antirretroviral.

8. Utilización según la reivindicación 7, caracterizada porque la otra molécula es una citoquina, tal como un interferón \alpha, \beta ó \gamma.

9. Utilización según la reivindicación 7, caracterizada porque la otra molécula es el GM-CSF.

10. Utilización según la reivindicación 7, caracterizada porque la otra molécula es un inhibidor de la proteasa.