EP4757942A1 - Mikrofluidische kartusche - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft eine mikrofluidische Kartusche (20) zum Nachweis eines Analyten in einer Analysenprobe, mit einem Kartuschenkörper (22), der eine Fluidschnittstelle (30) zum Anschluss eines Probenbehälters (10) aufweist. Dabei sind in dem Kartuschenkörper ausgebildet: - ein Fluidreservoir (32) für eine Probenaufnahmeflüssigkeit (52), ein Fluidhauptkanal (34), der das Fluidreservoir mit der Fluidschnittstelle verbindet und eine Pumpeinrichtung (36) zum bidirektionalen Pumpen von Fluid zwischen dem Fluidreservoir (32) und der Fluidschnittstelle (30) durch den Fluidhauptkanal (34), - einen zwischen dem Fluidreservoir (32) und der Fluidschnittstelle (30) angeordneten aktivierbaren Verschluss (38) für den Fluidhauptkanal (34), - ein Fluidnebenkanal (40), der an einer zwischen dem aktivierbaren Verschluss (38) und dem Fluidreservoir (32) angeordneten Abzweigung (42) von dem Fluidhauptkanal (34) abzweigt, - eine Nachweiskammer (44) zum Nachweis des Analyten mittels eines Biochips (54), mit einem Fluideinlass und einem Fluidauslass, wobei der Fluidnebenkanal (40) die Abzweigung (42) von dem Fluidhauptkanal mit dem Fluideinlass der Nachweiskammer (44) verbindet, - eine Reaktionskammer (46) zur Vervielfältigung des nachzuweisenden Analyten in der Analysenprobe, mit einem Fluideinlass und einem Fluidauslass, wobei der Fluidauslass der Nachweiskammer (44) mit dem Fluideinlass der Reaktionskammer (46) verbunden ist, und - eine Sackgassen-Druckkammer (48) mit nur einem Fluideinlass, der mit dem Fluidauslass der Reaktionskammer (46) verbunden ist.

Description

Mikrofluidische Kartusche

Die Erfindung betrifft eine mikrofluidische Kartusche für den Nachweis von Biomolekülen in einer Probenlösung sowie ein zugehöriges Nachweis verfah- ren.

Viele Fragestellungen der molekularbiologischen Forschung und der Mole- kulardiagnostik erfordern die Bestimmung der Menge bzw. Konzentration bestimmter Biomoleküle, beispielsweise bestimmter Nukleinsäuren in einer Probe. Der Begriff Nukleinsäure umfasst dabei im Rahmen dieser Beschrei- bung auch Nukleinsäuresequenzen.

Leistungsfähige und schnelle Detektionsverfahren setzen dabei eine Array- Technologie unter Verwendung sogenannter DNA-Chips oder Biochips ein, die eine oberflächensensitive Detektion von Nukleinsäureoligomer- Hybridisierungsereignissen ermöglichen. Oft wird der eigentlichen, ohnehin hochempfindlichen Detektion noch ein Amplifizierungsschritt vorgeschaltet, in dem die nachzuweisenden Nukleinsäuren vervielfältigt werden, damit sie letztlich in einer über der Nachweisgrenze der gewählten Detektionsmetho- de liegenden Konzentration vorhanden sind.

Für eine solche spezifische Amplifikation von Nukleinsäuren sind im Stand der Technik verschiedene Verfahren bekannt, beispielsweise die Polymerase- Kettenreaktion (PCR). Für Details und Hintergründe zur PCR wird auf die Druckschrift DE 102011 056606 B3 der Anmelderin verwiesen, deren Offen- barungsgehalt insoweit in die vorliegende Anmeldung aufgenommen wird.

Aus der Druckschrift DE 102015 001 998 B3 ist eine mikrofluidische Kartu- sche für den Nachweis von Biopartikeln bekannt. Da die beschriebene Kar- tusche ein Durchflusssystem darstellt, bei dem die Prozessflüssigkeit durch das gesamte Mikrokanalsystem geführt werden muss, besteht allerdings die Gefahr, ungeschützt im Kanalsystem liegende Substanzen anzulösen. Dar- über hinaus ist die für die Zuführung der Prozessflüssigkeit eingesetzte Doppelspritze als Mehrfachwerkzeug technisch sehr aufwendig.

Ausgehend davon liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, eine mikroflu- idische Kartusche mit einer einfachen und robusten Konstruktion anzuge- ben, die einen zuverlässigen Nachweise eines Analyten in einer vorgegebe- nen Analyseprobe erlaubt.

Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der unabhängigen Ansprüche ge- löst. Weiterbildungen der Erfindung sind Gegenstand der abhängigen An- sprüche.

Die Erfindung stellt eine mikrofluidische Kartusche zum Nachweis eines Analyten in einer Analysenprobe bereit, mit einem Kartuschenkörper, der eine Fluidschnittstelle zum Anschluss eines Probenbehälters aufweist, wobei in dem Kartuschenkörper ausgebildet sind: ein Fluidreservoir für eine Probenaufnahmeflüssigkeit, ein Fluid- hauptkanal, der das Fluidreservoir mit der Fluidschnittstelle verbin- det und eine Pumpeinrichtung zum bidirektionalen Pumpen von Flu- id zwischen dem Fluidreservoir und der Fluidschnittstelle durch den Fluidhauptkanal, einen zwischen dem Fluidreservoir und der Fluidschnittstelle ange- ordneten aktivierbaren Verschluss für den Fluidhauptkanal, ein Fluidnebenkanal, der an einer zwischen dem aktivierbaren Ver- schluss und dem Fluidreservoir angeordneten Abzweigung von dem Fluidhauptkanal abzweigt, eine Nachweiskammer zum Nachweis des Analyten mittels eines Bio- chips, mit einem Fluideinlass und einem Fluidauslass, wobei der Flu- idnebenkanal die Abzweigung von dem Fluidhauptkanal mit dem Fluideinlass der Nachweiskammer verbindet, eine Reaktionskammer zur Vervielfältigung des nachzu weisenden Analyten in der Analysenprobe, mit einem Fluideinlass und einem Fluidauslass, wobei der Fluidauslass der Nachweiskammer mit dem Fluideinlass der Reaktionskammer verbunden ist, und eine Sackgassen-Druckkammer mit nur einem Fluideinlass, der mit dem Fluidauslass der Reaktionskammer verbunden ist.

Die Sackgassen-Druckkammer ist dabei bevorzugt in Mäanderform ausge- bildet.

Der Fluidnebenkanal weist mit Vorteil einen kleineren Querschnitt auf als der Fluidhauptkanal, wobei die Querschnittsfläche des Fluidnebenkanals vorteilhaft zwischen 10% und 90%, insbesondere zwischen 30% und 60% der Querschnittsfläche des Fluidhauptkanals liegt. Die beim Vorwärts- Pumpschritt in den Nebenast gelangende Menge an Probenaufnahmeflüs- sigkeit wird dadurch weiter reduziert.

In einer vorteilhaften Ausgestaltung ist vorgesehen, dass der Fluidnebenka- nal der Kartusche von dem Fluidhauptkanal in einem Abzweigungswinkel θ abzweigt, der bezogen auf die Vorwär ts-Fließrichtung im Fluidhauptkanal 90° oder weniger, insbesondere 70° oder weniger beträgt. Vorteilhaft ist der Abzweigungswinkel 0 so klein wie möglich. Auch durch diese Maßnahme kann die beim Vorwärts-Pumpschritt in den Nebenast gelangende Menge an Probenaufnahmeflüssigkeit weiter reduziert werden.

Die Fluidschnittstelle ist zweckmäßig mit einem standardisierten Anschluss, insbesondere einem Luer-Slip oder einem Luer-Lock, ausgestattet.

Mit Vorteil enthält die Kartusche einen Biochip, dessen mit einem Array von funktionalisierten Teststellen ausgestatteter Sensorbereich in der Nachweis- kammer angeordnet ist.

Die Pumpeinrichtung der Kartusche umfasst vorteilhaft einen im Fluidreser- voir verschiebbar angeordneten Spritzenkolben, der vorzugsweise eine Öff- nung für die Aufnahme eines Passstifts eines Schrittmotors aufweist. Die verschiedenen Pumpschritte können dadurch exakt gesteuert werden. Das Fluidreservoir und der Spritzenkolben sind zweckmäßig zylinderförmig ausgebildet.

Bei einer vorteilhaften Ausgestaltung ist der aktivierbare Verschluss durch einen Ventilbereich und ein Gummikügelchen gebildet, das in einem sich senkrecht vom Fluidhauptkanal weg erstreckenden Kugelgang vorgesteckt ist. Zum Schießen (i.e. Aktivieren) des Verschlusses kann das Gummikügel- chen in den Ventilbereich gedrückt werden.

Der Kartuschenkörper ist mit Vorteil aus einem Spritzgusskörper, beispiels- weise aus Polycarbonat oder Polypropylen gebildet, der auf seiner Ober- oder Unterseite mit einer Deckfolie verschlossenen ist.

Die Reaktionskammer ist vorteilhaft zur Durchführung einer PCR und/oder einer RT-PCR (Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion) eingerich- tet. Die abkürzende Schreibweise (RT-)PCR steht in dieser Beschreibung für beide Verfahrensvarianten.

Das Verhältnis des Volumens der Druckkammer zum Volumen des Rests des außerhalb des Fluidreservoirs liegenden Fluidiksystems liegt bevorzugt zwischen 2:1 und 1:2, besonders bevorzugt bei etwa 1:1 liegt. Durch die Fül- lung des Fluidiksystems mit Ausnahme der Druckkammer mit der Analyse- probe wird das luftgefüllte Ausgangsvolumen auf 2/3 bis 1/3, insbesondere auf etwa die Hälfte reduziert, der Druck in der Druckkammer also um einen Faktor 1,5 bis 3, insbesondere einen Faktor von etwa 2 erhöht. Durch wird ein Gegendruck zur Unterdrückung unerwünschter Gasblasen bei der nach- folgenden Prozessierung, insbesondere der Durchführung einer (RT-)PCR erwiesen.

Die Erfindung enthält auch ein Verfahren zum Nachweis eines Analyten in einer Analysenprobe mittels einer mikrofluidischen Kartusche der beschrie- benen Art, bei dem die Kartusche mit einem Probenbehälter mit einem zu untersuchen- den Analyten verbunden wird, in einem Vorwär ts-Pumpschritt die Probenaufnahmeflüssigkeit mit der Pumpeinrichtung aus dem Fluidreservoir in den Probenbehälter gepumpt wird, in einem Rückwärts-Pumpschritt zumindest ein Teil der Probenauf- nahmeflüssigkeit zusammen mit dem Analyten als Analysenprobe in das Fluidreservoir zurückgepumpt wird, der aktivierbare Verschluss aktiviert und der Fluidhauptkanal dadurch von der Fluidschnittstelle abgekoppelt wird, in einem internen Vorwärts-Pumpschritt ein Teil der Analysenprobe aus dem Fluidreservoir in die Nachweiskammer und die Reaktions- kammer gepumpt wird, der Analyt in der Reaktionskammer bearbeitet, insbesondere amplifi- ziert wird, in einem internen Rückwärts-Pumpschritt ein Teil der Analysenprobe mit dem bearbeiteten Analyten in der Nachweiskammer gepumpt wird, und der Analyt in der Nachweiskammer mit einem Biochip nachgewiesen wird.

Vorteile der Erfindung sowie weitere Ausführungsbeispiele werden nach- folgend anhand der Figuren erläutert, bei deren Darstellung auf eine maß- stabs- und proportionsgetreue Wiedergabe verzichtet wurde, um die An- schaulichkeit zu erhöhen.

Es zeigen:

Fig. 1 schematisch eine mikrofluidische Kartusche nach einem Aus- führungsbeispiel der Erfindung und einen Probenbehälter mit einer zu untersuchenden Abstrichprobe,

Fig. 2 bis 6 Zwischenschritte im Prozessablauf beim Nachweis von Biomo- lekülen in der Abstrichprobe mit der mikrofluidischen Kartu- sche der Fig. 1, und

Fig. 7 schematisch eine mikrofluidische Kartusche nach einem ande- ren Ausführungsbeispiel der Erfindung. Die Erfindung wird nun anhand von mikrofluidischen Kartuschen für den Nachweis bestimmter Nukleinsäuren in einer Analyseprobe erläutert.

Figur 1 zeigt dazu schematisch eine mikrofluidische Kartusche 20, die über eine Fluidschnittstelle 30 mit einem Probenbehälter 10 verbunden werden kann. Bei dem Probenbehälter handelt es sich im Ausführungsbeispiel um ein Tupferröhrchen 10 mit einem hohlen Tupferstab 12, an dessen distalem Ende ein Wattebausch 14 eine Abstrichprobe 50 eines Patienten trägt, die mikrobiologisch beispielsweise auf MRS A-Stämme (Methicillin resistenter Staphylococcus aureus) untersucht werden soll.

Es versteht sich, dass mit der Kartusche 20 auch andere mikrobiologische oder sonstige molekulardiagnostische Untersuchungen durchgeführt wer- den können. Auch können andere Arten von Probenbehältern, etwa ein Sputumbecher an die Kartusche 20 angeschossen werden. Die Fluidschnitt- stelle 30 kann zu diesem Zweck mit einem standardisierten Anschluss, bei- spielsweise einem Luer-Slip oder einem Luer-Lock ausgestattet sein, der mit einem entsprechenden Gegenstück auf Seiten des Probenbehälters verbun- den werden kann.

Die mikrofluidische Kartusche 20 weist einen Kartuschenkörper 22 auf, der beispielsweise aus einem mit einer Deckfolie verschlossenen Spritzgusskör- per aus Polycarbonat oder Polypropylen besteht und in dem die Fluid- schnittstelle 30 und die weiteren, nachfolgend genauer beschriebenen Ele- mente des Fluidiksy stems 24 der Kartusche 20 ausgebildet sind.

Als eine Besonderheit besteht das Fluidiksystem 24 aus einem Hauptast 26 und einem als Sackgasse ausgebildeten Nebenast 28. Der Hauptast 26 um- fasst dabei ein Fluidreservoir 32 zur Aufnahme einer Probenaufnahmeflüs- sigkeit 52, einen Fluidhauptkanal 34, der das Fluidreservoir 32 mit der Fluid- schnittstelle 30 verbindet und eine Pumpeinrichtung 36 zum bidirektionalen Pumpen von Fluid zwischen dem Fluidreservoir 32 und der Fluidschnittstel- le 30 durch den Fluidhauptkanal 34.

Zwischen dem Fluidreservoir 32 und der Fluidschnittstelle 30 ist ein akti- vierbarer Verschluss 38 angeordnet, mit dem Fluidhauptkanal 34 verschlos- sen werden kann. In dem in Fig. 1 gezeigten Auslieferungszustand der Kar- tusche 20 befindet sich der Verschluss 38 in seinem geöffneten Zustand.

Der Nebenast 26 des Fluidiksy stems 24 enthält einen Fluidnebenkanal 40, der an einer zwischen dem aktivierbaren Verschluss 38 und dem Fluidreser- voir 32 angeordneten Abzweigung 42 von dem Fluidhauptkanal 34 ab- zweigt, eine Nachweiskammer 44, eine Reaktionskammer 46 und eine Sack- gassen-Druckkammer 48.

Die Nachweiskammer 44 dient dabei dem Nachweis eines in einer Analyse- probe enthaltenen Analyten mittels eines in die Kartusche 20 eingeschobe- nen Biochips 54. Die Nachweiskammer 44 weist einen Fluideinlass 44-1 und einem Fluidauslass 44-0 auf, wobei der Fluidnebenkanal 40 die Abzweigung 42 von dem Fluidhauptkanal 34 mit dem Fluideinlass 44-1 der Nachweis- kammer 44 verbindet.

Die Reaktionskammer 46 dient der Vervielfältigung des nachzuweisenden Analyten, beispielsweise mittels (RT-)PCR, und weist einen Fluideinlass 46-1 und einem Fluidauslass 46-0 auf, wobei der Fluidauslass 44-0 der Nach- weiskammer mit dem Fluideinlass 46-1 der Reaktionskammer 46 verbunden ist. Die Druckkammer 48 ist als Sackgassenkammer ausgeführt und enthält nur einen Fluideinlass 48-1, aber keinen Fluidauslass. Der Fluideinlass 48-1 der Sackgassen-Druckkammer 48 ist mit dem Fluidauslass 46-0 der Reaktions- kammer 46 verbunden. Die die Nachweiskammer 44 und die Reaktions- kammer 46 bzw. die Reaktionskammer 46 und die Druckkammer 48 verbin- denden Kanalstücke werden ebenfalls als Teil des Fluidnebenkanals 40 an- gesehen.

Der Fluidnebenkanals 40 weist insbesondere einen kleineren Querschnitt auf als der Fluidhauptkanal 34. Darüber hinaus beträgt der Abzweigungswinkel 0 des Fluidnebenkanals 40 zur Vorwärts-Fließrichtung 70 (Fig. 2) des Fluid- hauptkanals 90° oder weniger.

Der grundsätzliche Prozessablauf beim Nachweis von Biomolekülen mit der mikrofluidischen Kartusche 20 gestaltet sich mit Bezug auf die Figuren 2 bis 6 beispielsweise wie folgt:

Zunächst wird die Kartusche 20 auf den Probenbehälter 10 mit der zu unter- suchenden Abstrichprobe 50 aufgesteckt und eine Fluidverbindung zwi- schen Fluidreservoir 32 und dem Probenbehälter 10 her stellt. Die Fluid- schnittstelle 30 kann im Auslieferungszustand der Kartusche beispielsweise durch eine Luer Cap geschützt sein, die vor dem Aufstecken der Kartusche abgenommen wird. Auch kann das Fluidreservoir 32 beispielsweise mit ei- nem Wachssiegel verschlossen sein, welches vor Beginn der Analyse durch Erwärmung aufgeschmolzen und dadurch die Fluidverbindung zwischen Fluidreservoir 32 und Probenbehälter 10 geöffnet wird. Darüber hinaus können zwischen dem Fluidreservoir 32 und der Fluid- schnitstelle 30 wachsgeschützte Lysechemikalien (nicht dargestellt) vorge- legt sein, die durch Aufschmelzen des Wachsschutzes freigelegt werden.

Mit Bezug nunmehr auf Fig. 2 wird nach diesen Vorbereitungsschritten in einem Vorwärts-Pumpschritt 70 die im Fluidreservoir 32 vorgelegte Proben- aufnahmeflüssigkeit 52 zusammen mit der freigelegten Lysechemie durch den Fluidhauptkanal 34 über die Fluidschnittstelle 30 in den Probenbehälter 10 gepumpt. In einem konkreten Ausführungsbeispiel können beispielsweise 400μl an Probenaufnahmeflüssigkeit 52 vorgelegt sein und im Vorwärts- Pumpschritt in das Tupferröhrchen gepumpt werden. Um einen definierten Endzustand herzustellen, kann der Pumpvorgang fortgesetzt werden, bis das Austreten von Luft die vollständige Entleerung des Fluidreservoirs 32 anzeigt.

In dem Vorwärts-Pumpschritt 70 gelangt zwar auch eine kleine Menge an Probenaufnahmeflüssigkeit 52 über die Abzweigung 42 in den Nebenast 28, diese Menge ist allerdings aufgrund der Geometrie der Abzweigung 42 und der Fluidkanäle 34, 40, und aufgrund der Ausbildung des Nebenasts 28 als Sackgasse vernachlässigbar gering. Die Probenaufnahmeflüssigkeit 52 wird bei dem Vorwärts-Pumpschritt 70 daher praktisch ausschließlich in den Pro- benbehälter 10 gepumpt, wie in Fig. 2 dar gestellt.

Der Tupferbereich mit der Abstrichprobe 50 kann zusätzlich beheizt, mit Ultraschall beaufschlagt und/ oder mechanischen Scherkräften oder anderen mechanischen Maßnahmen ausgesetzt werden, um die Solubilisierung, die Lyse und/ oder die Inaktivierung der Abstrichprobe zu fördern. Nach der Lyse 60 der Abstrichprobe 50 enthält die Probenaufnahmeflüssig- keit den in der Abstrichprobe 50 enthaltenen, nachzuweisenden Analyten 58, wie in Fig. 2 links unten dargestellt, und bildet so die Analyseprobe 62.

Nach erfolgter Lyse 60 wird die Analyseprobe 62 in einem Rückwärts- Pumpschritt 72 in das Fluidreservoir 32 zurückgepumpt, wie in Fig. 3 ge- zeigt. Im Ausführungsbeispiel können beispielsweise etwa 300μl an Analy- seprobe 62 in das Fluidreservoir 32 zurückgepumpt werden, der Rest der Analyseprobe (« 100 pl) verbleibt im Wattebausch 14 des Tupferstäbchens.

Nach dem Rückwärts-Pumpschritt 72 wird der aktivierbare Verschluss 38 aktiviert um die Fluidverbindung zwischen dem Fluidiksystem 24 der Kar- tusche 20 und der Fluidschnittstelle 30 zu schließen. Nach dem Schließen des Verschlusses 38 befinden sich im Ausführungsbeispiel im Fluidreservoir 32 etwa 300μl an Analyseprobe 62 und etwa 700 μl Luft.

Mit Bezug nunmehr auf Fig. 4 wird nach dem Verschließen des Fluidhaupt- kanals 34 die Analyseprobe 62 in einem internen Vorwärts-Pumpschritt 74 in den Nebenast 28 des Fluidiksystems 24 gepumpt, bis die Nachweiskammer 44 und die Reaktionskammer 46 mit der Analyseprobe 62 gefüllt sind.

Da der Nebenast 28 als Sackgasse mit einer distalen Sackgassen- Druckkammer 48 ausgebildet ist, baut sich während des internen Vorwärts- Pumpschritts 74 durch die Verringerung des Luftvolumens in der Druck- kammer 48 ein Gegendruck von etwa 2 bar auf, der bei der nachfolgenden Erhitzung der Analyseprobe 62 in der Reaktionskammer 46 zur Unterdrü- ckung unerwünschten Gasblasen führt. Im Ausführungsbeispiel hat die Reaktionskammer 46 beispielsweise ein Auf nähme volumen von etwa 25 pl, die Nachweiskammer ein Aufnahmevo- lumen von nur etwa 1 -2 μl und die Druckausgleichskammer ein Aufnahme- volumen von etwa 35 pl. Die verschiedenen Teilstücke des Fluidhauptkanals 34 und des Fluidnebenkanals 40 haben zusammen ein Aufnahmevolumen von etwa 10 pl.

Durch eine vollständige Füllung der Reaktionskammer 46 und der verschie- denen Teilstücke des Fluidhauptkanals und des Fluidnebenkanals mit der Analyseprobe 62 gemäß Fig. 4 wird das anfänglich mit Luft gefüllte Aus- gangsvolumen von etwa 70μl auf etwa die Hälfte, nämlich das Volumen der Druckkammer (etwa 35 pl) reduziert. Der Druck in der Druckkammer wird dadurch auf etwa 2 bar verdoppelt. Ein solcher Gegendruck von etwa 2 bar hat sich als sehr effektiv für die Unterdrückung unerwünschter Gasblasen bei der nachfolgenden Durchführung einer (RT-)PCR erwiesen. Es ist bei entsprechender Wahl der Volumina allerdings ohne weiteres auch möglich, einen anderen Gegendruck, beispielsweise 1,5 bar, 2,5 bar oder 3 bar in der Druckkammer zu erzeugen.

Nach der Füllung der Reaktionskammer 46 wird dort zur Amplifikation der nachzuweisenden Nukleinsäuren des Analyten 58 eine (RT-)Polymerase- Kettenreaktion (PCR) durchgeführt. Die dafür benötigten Chemikalien lie- gen in der Reaktionskammer 46, beispielsweise unter einer Wachsschicht geschützt, vorkonfektioniert vor. Zum Start der Amplifikation wird die Wachsschicht durch eine Temperaturerhöhung geschmolzen und die PCR- Chemikalien dadurch der Analyseprobe 62 in der Reaktionskammer 46 bei- gegeben oder freigesetzt. Während der PCR bleibt das geschmolzene Wachs flüssig bzw. wird von einem oder mehreren Wachsreservoiren im Randbereich der Reaktions- kammer 46 aufgenommen, um sicherzustellen, dass kein verfestigtes Wachs angrenzende Fluidkanäle verstopft. Dazu kann ausgenutzt werden, dass flüssiges Wachs leichter ist als die umgebende Flüssigkeit und daher nach oben steigt. In der Reaktionskammer 46 können daher an vorbestimmten Stellen im Randbereich Ausbuchtungen vorgesehen sein, in denen sich bei entsprechender schräger Stellung der Kartusche 20 während der Durchfüh- rung der (RT-)PCR das aufsteigende flüssige Wachs sammelt.

Der für die PCR erforderliche zyklische Temperaturverlauf in der Reakti- onskammer 46 wird beispielsweise mit Hilfe einer Heiz-/ Kühleinrichtung des Analysegeräts erzeugt, wobei ein kontrollierter Ablauf der (RT-)PCR durch den von der Sackgassen-Druckkammer 48 erzeugten Gegendruck si- chergestellt wird.

Nach der Vervielfältigung des Analyten 58 in der Reaktionskammer 46 liegt in der Reaktionskammer 46 eine amplifizierte Analyseprobe 64 vor, in der der nachzuweisende Analyt 58 in einer vielfach höheren Konzentration als vor dem (RT-)PCR-Schritt vorliegt, wie in Fig. 5 schematisch dargestellt.

Für den Nachweisschritt wird nun in einem internen Rückwärts- Pumpschritt 76 ein kleiner Teil der amplifizierten Analyseprobe 64 in die Nachweiskammer 44 überführt, wie in Fig. 6 illustriert.

In der Nachweiskammer 44 ist der Sensorbereich des eingeschobenen Bio- chips 54 mit einem Array von funktionalisierten Teststellen 56 zur elektro- chemischen Detektion von Nukleinsäuren in der amplifizierten Analysepro- be 64 angeordnet. Bei der elektrochemischen Detektion erzeugen die Test- stellen 56 jeweils ein elektrisches Signal, dessen Größe ein Maß für die Kon- zentration an Nukleinsäure in dem überführten Nachweisvolumen darstellt. Diese elektrischen Signale werden dann an Kontaktpads 58 des Biochips ab- genommen und in dem Analysegerät ausgewertet.

Bei einer reinen Endpunktsbestimmung liefert die (RT-)PCR als Ergebnis eine qualitative Ja/ Nein- Antwort, also eine Aussage, ob der nachzuweisende Analyt in der Analyseprobe vorliegt oder nicht.

Die erfindungsgemäße mikrofluidische Kartusche 20 erlaubt allerdings auch die Durchführung einer quantitativen oder semi-quantitativen (RT-)PCR. Dazu wird die Menge an in der Probenlösung vorliegenden Nukleinsäure bestimmt, während die Reaktion abläuft, um eine genauere Bestimmung der Konzentration der Nukleinsäure in der Analyseprobe als mit einer reinen Endpunktsbestimmung am Ende einer (RT-)PCR zu ermöglichen.

Die in Fig. 5 und 6 illustrierten Schritte der Amplifikation in der Reaktions- kammer 46 und der Überführung eines Nachweisvolumens in die Nach- weiskammer 44 werden dabei mehrfach wiederholt. Beispielsweise wird, wie im Zusammenhang mit Fig. 5 beschrieben, zunächst eine erste vorbe- stimmte Anzahl von Zyklen der Amplifikationsreaktion, beispielsweise 10 Zyklen, durchgeführt, um die Konzentration an Nukleinsäure in der Analy- seprobe in den Messbereich anzuheben.

Anschließend wird mit Hilfe der Pumpeinrichtung 36 ein definiertes Volu- men an Analyseprobe mit amplifizierten Nukleinsäuren aus der Reaktions- kammer 46 in die Nachweiskammer 44 überführt und durch elektrochemi- sche Detektion die Konzentration der Nukleinsäuren bestimmt. Anschlie- ßend wird wiederholt jeweils ein weiterer PCR-Zyklus durchgeführt, um die Konzentration an Nukleinsäuren in der Reaktionskammer 46 weiter zu er- höhen und beispielsweise nach jeweils 5 Zyklen erneut ein definiertes Volu- men an Probenlösung mit amplifizierten Nukleinsäuren aus der Reaktions- kammer 46 in die Nachweiskammer 44 überführt und die Konzentration an Nukleinsäuren elektrochemisch bestimmt. Auf diese Weise können bei- spielsweise insgesamt 30 bis 40 PCR-Zyklen durchgeführt werden und Kon- zentrationswerte nach 10, 15, 20, 25, 30 und ggf. 35 und 40 Zyklen bestimmt. Bei einer solchen Vorgehensweise kann (semi-)quantitativ ein Ct-Wert ange- geben werden, der anzeigt, nach welcher Anzahl von Zyklen ein vorbe- stimmter Schwell wert der Konzentration überschritten wird.

Bei der Durchführung der (semi-)quantitativen (RT-)PCR kommen zwei Va- rianten in Betracht: bei einer ersten Variante wird das der Reaktionskammer entnommene Volumen nach einem Nachweisschritt jeweils wieder zurück- gepumpt, während bei einer zweiten Variante kein Rückpumpschritt erfolgt und daher die Menge an Analysefluid in der Reaktionskammer mit jedem Nachweisschritt abnimmt.

Figur 7 zeigt ein weiteres Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen mikrofluidischen Kartusche 120 mit einem Spritzguss-Kartuschenkörper 122 und einer in dem Kartuschenkörper ausgebildeten Fluidschnittstelle 130 zur Verbindung mit einem Probenbehälter, wie etwa dem Tupferröhrchen 10 der Fig. 1.

In dem Kartuschenkörper 122 ist ein Fluidiksystem 124 mit einem Hauptast 126 und einem als Sackgasse ausgebildeten Nebenast 128 ausgebildet. Der Hauptast 126 umfasst ein zylinderförmiges Fluidreservoir 132 zur Aufnahme einer Probenaufnahmeflüssigkeit 52, einen Fluidhauptkanal 134, der das Flu- idreservoir 132 mit der Fluidschnittstelle 130 verbindet und eine Pumpein- richtung 136 zum bidirektionalen Pumpen von Fluid zwischen dem Fluidre- servoir 132 und der Fluidschnittstelle 130 durch den Fluidhauptkanal 134.

Zum Pumpen kontrollierter Fluidvolumina kann die Pumpeinrichtung 136 durch einen in den Figuren nicht dargestellten Schrittmotor eines Analysege- räts gesteuert werden. Die Pumpeinrichtung 136 umfasst dazu einen im Flu- idreservoir-Zylinder 132 verschiebbar angeordneten Spritzenkolben 150 mit einer kreisförmigen Öffnung 152 am Kolbenende, in die ein Passstift des Schrittmotors eingreifen kann, um die verschiedenen Vorwärts- und Rück- wärts-Pumpschritte 70, 72, 74, 76 exakt kontrolliert ausführen zu können.

Zwischen dem Fluidreservoir 132 und der Fluidschnittstelle 130 ist ein aktivierbarer Verschluss 138 angeordnet, der im Ausführungsbeispiel der Fig. 7 durch einen Ventilbereich 160 und ein Gummikügelchen 162 gebildet ist, das in einem sich senkrecht vom Fluidhauptkanal 34 weg erstreckenden Kugelgang vorgesteckt ist.

Im geöffneten Zustand des Verschlusses 138 klemmt das Gummikügelchen 162 im Kugelgang außerhalb des Fluidhauptkanals 134, zum Schließen des Verschlusses 138 kann das Gummikügelchen 162 mit einem' Stößel in den in den Ventilbereich 160 gedrückt werden, wo es den Fluidhauptkanal 134 voll- ständig verschließt.

Der Nebenast 126 des Fluidiksystems 124 enthält einen Fluidnebenkanal 140, der an einer zwischen dem aktivierbaren Verschluss 138 und dem Fluidre- servoir 132 angeordneten Abzweigung 142 von dem Fluidhauptkanal 134 abzweigt, eine Nachweiskammer 144, eine Reaktionskammer 146 und eine Sackgassen-Druckkammer 148. Die genannten Kammern sind wie bei Fig. 2 beschrieben, über den Fluidnebenkanal 140 fluidisch miteinander verbunden und können insbesondere die im Zusammenhang mit Fig. 2 bis 6 beschrie- benen Aufnahmevolumina haben.

Wie in Fig. 7 dargestellt, weist der Fluidnebenkanals 40 einen deutlich klei- neren Querschnitt als der Fluidhauptkanal 34 auf. Darüber hinaus beträgt der Abzweigungs winkel 0 des Fluidnebenkanals 40 zur Vorwärts- Fließrichtung des Fluidhauptkanals nur etwa 75°. Beide Maßnahmen tragen dazu bei, dass beim Vorwärts-Pumpschritt 70 kaum Probenaufnahmeflüs- sigkeit in den Nebenast 128 gelangt.

Die Kartusche 120 ist in Fig. 7 zusammen mit dem eingeschobenen Biochip 54 für den Nachweis eines Analyten in der Nachweiskammer 144 gezeigt.

In der Reaktionskammer 146 sind an drei Stellen 170 durch eine schmelzbare Wachsabdeckung geschützte PCR-Chemikalien vorgelegt. Zudem weist die Reaktionskammer 146 ein Wachsaufnahmereservoir 172 auf, in dem sich das geschmolzene Wachs der Wachsabdeckung bei der Analyse sammeln kann, ohne den schmalen Fluidnebenkanal 40 zu verstopfen.

Die Sackgassen-Druckkammer 148 ist in Mäanderform ausgebildet, was sich in der Praxis zum Aufbau eines Gegendrucks zur Blasenunterdrückung be- sonders bewährt hat.

Der Prozessablauf beim Einsatz der Kartusche 120 mit den Vorwärts- und Rückwärts-Pumpschritten 70, 72, 74, 76 entspricht im Wesentlichem dem oben beschriebenen Prozessablauf.

Claims

Patentansprüche

1. Mikrofluidische Kartusche zum Nachweis eines Analyten in einer Analysenprobe, mit einem Kartuschenkörper, der eine Fluidschnittstelle zum Anschluss eines Probenbehälters aufweist, wobei in dem Kartuschenkörper ausgebildet sind: ein Fluidreservoir für eine Probenaufnahmeflüssigkeit, ein Fluid- hauptkanal, der das Fluidreservoir mit der Fluidschnittstelle verbin- det und eine Pumpeinrichtung zum bidirektionalen Pumpen von Flu- id zwischen dem Fluidreservoir und der Fluidschnittstelle durch den Fluidhauptkanal, einen zwischen dem Fluidreservoir und der Fluidschnittstelle ange- ordneten aktivierbaren Verschluss für den Fluidhauptkanal, ein Fluidnebenkanal, der an einer zwischen dem aktivierbaren Ver- schluss und dem Fluidreservoir angeordneten Abzweigung von dem Fluidhauptkanal abzweigt, eine Nachweiskammer zum Nachweis des Analyten mittels eines Bio- chips, mit einem Fluideinlass und einem Fluidauslass, wobei der Flu- idnebenkanal die Abzweigung von dem Fluidhauptkanal mit dem Fluideinlass der Nachweiskammer verbindet, eine Reaktionskammer zur Vervielfältigung des nachzu weisenden Analyten in der Analysenprobe, mit einem Fluideinlass und einem Fluidauslass, wobei der Fluidauslass der Nachweiskammer mit dem Fluideinlass der Reaktionskammer verbunden ist, und eine Sackgassen-Druckkammer mit nur einem Fluideinlass, der mit dem Fluidauslass der Reaktionskammer verbunden ist.

2. Mikrofluidische Kartusche nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich- net, dass die Sackgassen-Druckkammer in Mäanderform ausgebildet ist.

3. Mikrofluidische Kartusche nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekenn- zeichnet, dass der Fluidnebenkanal einen kleineren Querschnitt aufweist als der Fluidhauptkanal, wobei die Querschnittsfläche des Fluidnebenkanals vorteilhaft zwischen 10% und 90%, insbesondere zwischen 30% und 60% der Querschnittsfläche des Fluidhauptkanals liegt.

4. Mikrofluidische Kartusche nach wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Fluidnebenkanal von dem Fluid- hauptkanal in einem Abzweigungswinkel abzweigt, der bezogen auf die Vorwärts-Fließrichtung im Fluidhauptkanal 90° oder weniger, insbesondere 70° oder weniger beträgt.

5. Mikrofluidische Kartusche nach wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Fluidschnittstelle mit einem stan- dardisierten Anschluss, insbesondere einem Luer-Slip oder einem Luer- Lock, ausgestattet ist.

6. Mikrofluidische Kartusche nach wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Kartusche einen Biochip enthält, dessen mit einem Array von funktionalisierten Teststellen ausgestatteter Sensorbereich in der Nachweiskammer angeordnet ist.

7. Mikrofluidische Kartusche nach wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Pumpeinrichtung einen im Fluidre- servoir verschiebbar angeordneten Spritzenkolben umfasst, der vorzugswei- se eine Öffnung für die Aufnahme eines Passstifts eines Schrittmotors auf- weist.

8. Mikrofluidische Kartusche nach Anspruch 7, dadurch gekennzeich- net, dass das Fluidreservoir und der Spritzenkolben zylinderförmig ausge- bildet sind.

9. Mikrofluidische Kartusche nach wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der aktivierbare Verschluss durch ei- nen Ventilbereich und ein Gummikügelchen gebildet ist, das in einem sich senkrecht vom Fluidhauptkanal weg erstreckenden Kugelgang vorgesteckt ist.

10. Mikrofluidische Kartusche nach wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Kartuschenkörper aus einem mit einer Deckfolie verschlossenen Spritzgusskörper gebildet ist.

11. Mikrofluidische Kartusche nach wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionskammer zur Durchfüh- rung einer (RT-)PCR eingerichtet ist.

12. Mikrofluidische Kartusche nach wenigstens einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis des Volumens der Druckkammer zum Volumen des Rests des außerhalb des Fluidreservoirs liegenden Fluidiksystems zwischen 2:1 und 1:2, vorteilhaft bei etwa 1:1 liegt.

13. Verfahren zum Nachweis eines Analyten in einer Analysenprobe mit- tels einer mikrofluidischen Kartusche nach einem der Ansprüche 1 bis 12, bei dem die Kartusche mit einem Probenbehälter mit einem zu untersuchenden Analyten verbunden wird, in einem Vorwärts-Pumpschritt die Probenaufnahmeflüssigkeit mit der Pumpeinrichtung aus dem Fluidreservoir in den Probenbehälter gepumpt wird, in einem Rückwärts-Pumpschritt zumindest ein Teil der Probenaufnahmeflüssigkeit zusammen mit dem Analyten als Analysenprobe in das Fluidreservoir zurückgepumpt wird, der aktivierbare Verschluss aktiviert und der Fluidhauptkanal dadurch von der Fluidschnittstelle abgekoppelt wird, in einem internen Vorwärts-Pumpschritt ein Teil der Analysenprobe aus dem Fluidreservoir in die Nachweiskammer und die Reaktions- kamrner gepumpt wird, der Analyt in der Reaktionskammer bearbeitet, insbesondere amplifi- ziert wird, in einem internen Rückwärts-Pumpschritt ein Teil der Analysenprobe mit dem bearbeiteten Analyten in der Nachweiskammer gepumpt wird, und der Analyt in der Nachweiskammer mit einem Biochip nachgewiesen wird.