EP4754293A1 - Verbessertes verfahren zur quantifizierung der zellulären zusammensetzung einer biologischen probe - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung zumindest eines Teils der zellulären Zusammensetzung mindestens einer biologischen Probe, die Leukozyten umfasst, wobei der Anteil mindestens eines Leukozytentyps basierend auf den identifizierten Methylierungsgraden bestimmt wird, um die relative Verteilung dieses Leukozytentyps in der Probe vorherzusagen. Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung mindestens eines künstlichen Nukleinsäuremoleküls zur Bestimmung zumindest eines Teils der zellulären Zusammensetzung einer biologischen Probe, die Leukozyten umfasst, nach dem oben genannten Verfahren. Im Rahmen der erfindung konnten die folgenden erfindungsgemäßen CpG-Stellen mit zelltypspezifischer Methylierung identifiziert werden: cg22381196 (DHODH), cg12483340 (TMEM87A), cg06270401 (DYRK4), cg23054181 (FAM169BP), cg26076724 (RP11-146I2.2), cg12249234 (KSR1), cg04468741 (MICAL2), cg05074138 (CTLA4), cg05705140 (LINC01237), cg15564619 (SKI), cg11531557 (HMBOX1), cg02212339 (TRPV1), cg22488278 (ZFYVE28), cg02240030 (MAD1L1) und cg24408769 (JARID2).

Description

Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule (RWTH) Aachen 23521WO Verbessertes Verfahren zur Quantifizierung der zellulären Zusammensetzung einer biologischen Probe Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung zumindest eines Teils der zellulären Zusammensetzung mindestens einer biologischen Probe, die Leukozyten umfasst, wobei der Anteil mindestens eines Leukozytentyps basierend auf den identifizierten Methylierungsgraden bestimmt wird, um die relative Verteilung dieses Leukozytentyps in der Probe vorherzusagen. Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung mindestens eines künstlichen Nukleinsäuremoleküls zur Bestimmung zumindest eines Teils der zellulären Zusammensetzung einer biologischen Probe, die Leukozyten umfasst, nach dem oben genannten Verfahren. Die Analyse der zellulären Zusammensetzung biologischer Proben, insbesondere von Blut, ist ein grundlegendes diagnostisches Verfahren, das Rückschlüsse auf viele Erkrankungen zulässt. Bisher werden beispielsweise Differentialblutbilder insbesondere durchflusszytometrisch, mittels immunphänotypischer Analysen und anhand morphologischer Eigenschaften der Zellen erstellt. Die Untersuchung der weißen Blutkörperchen ist dabei ein wichtiger Baustein der hämatologischen Diagnostik. Dennoch gibt es auch heutzutage noch viele Herausforderungen. Erstens ist die Analyse schwer zu standardisieren, was dazu führt, dass dieselben Blutproben in verschiedenen Labors völlig unterschiedliche Ergebnisse liefern. Zweitens darf das Blut nicht zu lange aufbewahrt werden (maximal einige Stunden). Für die venöse Blutentnahme müssen Patienten in der Regel zu Fachpersonal kommen. Die Corona-Krise hat deutlich gezeigt, dass dies nicht immer möglich ist und dass eine Selbstentnahmemöglichkeit ggf. sinnvoll wäre. Je nachdem welche Zelltypen analysiert werden sollen, stehen derzeit mehrere Methoden zur Verfügung. Ein gefärbter Blutausstrich kann unter dem Mikroskop beurteilt werden. Es gibt auch automatische Zellzähler, die Informationen über die Anzahl der Granulozyten, Lymphozyten und Monozyten anzeigen. Falls die Bestimmung des zellulären Immunstatus erforderlich ist, bei dem auch die verschiedenen Subtypen der Lymphozyten unterschieden werden, kann dies insbesondere mittels Antikörperfärbung und anschließender durchflusszytometrischer Messung erfolgen. Durchflusszytometrische Messungen sind relativ arbeits- und kostenintensiv und können nur auf frische Blutproben angewendet werden. Es wird frisches Blut benötigt, das weniger als 24 Stunden alt sein darf. Zudem ist das erforderliche Blutvolumen in der Regel größer als bei einer kleinen Kappilarblutprobe aus der Fingerbeere. Um die Anzahl der Leukozyten-Untergruppen im Blut zu bestimmen, können auch epigenetische Verfahren wie die zelltypspezifische DNA-Methylierung (DNAm) verwendet werden. Jedoch beruhen die meisten bekannten Verfahren auf größeren Methylierungsprofilen (>100 CpG-Dinukleotiden) und nicht auf einzelnen CpGs. Insbesondere die Auswahl von wenigen oder einzelnen CpGs ist jedoch für eine klinische Anwendung vorteilhaft. Im Gegensatz zu herkömmlichen Methoden, die auf der Zellmorphologie oder der Expression von Oberflächenmarkern beruhen, eignet sich die zelluläre Dekonvolution auf der Grundlage von DNAm-Werten auch für gefrorenes oder getrocknetes Blut. Aus der EP 3561074 A1 ist beispielsweise ein Verfahren zur epigenetische Blutzellzählung bekannt, bei dem ein quantitatives Bild der Zellzusammensetzung in einer Blutprobe identifiziert wird, wobei ein Normalisierungsstandard verwendet wird. Der Normalisierungsstandard ist ein Nukleinsäuremolekül, das mindestens eine Markerregion umfasst, die für jede der nachzuweisenden Blutzellen spezifisch ist, und mindestens eine Kontrollregion, die zellunspezifisch ist, wobei diese Regionen in der gleichen Anzahl an Kopien vorliegen auf diesem Molekül und/oder einer natürlichen Blutzellenprobe bekannter Zusammensetzung. Aus der EP 3382033 A1 ist ein alternatives epigenetisches Verfahren zur Bestimmung der zellulären Zusammensetzung des peripheren Blutes bekannt, bei dem die DNA-Methylierung (DNAm) an bestimmten genomischen Regionen mittels Pyrosequenzierung gemessen und für die relative Quantifizierung von Granulozyten, Lymphozyten, Monozyten, CD4⁺-T-Zellen, CD8⁺-T-Zellen, B- Zellen und NK-Zellen genutzt wird. Es ist Aufgabe der Erfindung, die Genauigkeit der Bestimmung der zellulären Zusammensetzung von biologischen Proben durch eine Erweiterung der Auswahl an zelltypspezifischen CpGs-Dinukleotiden zu verbessern. Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren zur Bestimmung zumindest eines Teils der zellulären Zusammensetzung mindestens einer biologischen Probe, die Leukozyten umfasst, gelöst, welches die folgenden Schritte umfasst: - Identifizieren von DNA-Methylierungsgraden von mindestens einer Region der genomischen DNA in der Probe, wobei die spezifische Region mindestens ein CpG-Dinukleotid umfasst, und wobei die spezifische Region mindestens eine Nukleotidsequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus cg22381196 (DHODH), cg12483340 (TMEM87A), cg06270401 (DYRK4), cg23054181 (FAM169BP), cg26076724 (RP11-146I2.2), cg12249234 (KSR1), cg04468741 (MICAL2), cg05074138 (CTLA4), cg05705140 (LINC01237), cg15564619 (SKI), cg11531557 (HMBOX1), cg02212339 (TRPV1), cg22488278 (ZFYVE28), cg02240030 (MAD1L1) und cg24408769 (JARID2) ausgewählt ist; und - Bestimmen des Anteils mindestens eines Leukozytentyps basierend auf den identifizierten Methylierungsgraden, um die relative Verteilung dieses Leukozytentyps in der Probe vorherzusagen, wobei - der Methylierungsgrad mindestens eines CpG-Dinukleotids, das aus der Gruppe bestehend aus den CpG-Dinukleotiden cg22381196 (DHODH), cg12483340 (TMEM87A), cg06270401 (DYRK4) und mindestens einem CpG-Dinukleotid, das sich innerhalb einer Region von 1.000 Nukleotiden stromaufwärts und/oder stromabwärts von jeweils einem der genannten CpG-Dinukleotide befindet, ausgewählt ist, den Anteil an Granulozyten anzeigt, - der Methylierungsgrad des CpG-Dinukleotids cg04468741 (MICAL2) oder mindestens eines CpG-Dinukleotids, das sich innerhalb einer Region von 1.000 Nukleotiden stromaufwärts und/oder stromabwärts von dem genannten CpG-Dinukleotid befindet, den Anteil an Monozyten anzeigt, - der Methylierungsgrad mindestens eines CpG-Dinukleotids, das aus der Gruppe bestehend aus den CpG-Dinukleotiden cg23054181 (FAM169BP), cg26076724 (RP11-146I2.2), cg12249234 (KSR1) und mindestens einem CpG-Dinukleotid, das sich innerhalb einer Region von 1.000 Nukleotiden stromaufwärts und/oder stromabwärts von jeweils einem der genannten CpG-Dinukleotide befindet, ausgewählt ist, den Anteil an Lymphozyten anzeigt, - der Methylierungsgrad des CpG-Dinukleotids cg02212339 (TRPV1) oder mindestens eines CpG-Dinukleotids, das sich innerhalb einer Region von 1.000 Nukleotiden stromaufwärts und/oder stromabwärts von dem genannten CpG-Dinukleotid befindet, den Anteil an B-Zellen anzeigt, - der Methylierungsgrad mindestens eines CpG-Dinukleotids, das aus der Gruppe bestehend aus den Dinukleotiden cg05074138 (CTLA4), cg15564619 (SKI), cg05705140 (LINC01237) und mindestens einem CpG- Dinukleotid, das sich innerhalb einer Region von 1.000 Nukleotiden stromaufwärts und/oder stromabwärts von jeweils einem der genannten CpG-Dinukleotide befindet, ausgewählt ist, den Anteil an CD4⁺ - T-Zellen anzeigt, - und der Methylierungsgrad des CpG-Dinukleotids cg11531557 (HMBOX1) oder mindestens eines CpG-Dinukleotids, das sich innerhalb einer Region von 1.000 Nukleotiden stromaufwärts und/oder stromabwärts von dem genannten CpG-Dinukleotid befindet, den Anteil an CD8⁺ - T-Zellen anzeigt, und - der Methylierungsgrad mindestens eines CpG-Dinukleotids, das aus der Gruppe bestehend aus den Dinukleotiden cg22488278 (ZFYVE28), cg02240030 (MAD1L1), cg24408769 (JARID2) und mindestens einem CpG-Dinukleotid, das sich innerhalb einer Region von 1.000 Nukleotiden stromaufwärts und/oder stromabwärts von jeweils einem der genannten CpG-Dinukleotide befindet, ausgewählt ist, den Anteil an NK-Zellen anzeigt. Die Probennummer “cg…” im Sinne der Erfindung bezieht sich auf die Position des jeweiligen CpG-Dinukleotids auf dem „450k Illumina Bead Chip“ (Illumina, San Diego, Kalifornien, USA). Auf der Grundlage von DNAm-Profilen aus über 1.300 sortierten Zellproben aus 40 verschiedenen Studien konnten die folgenden erfindungsgemäßen CpG- Stellen mit zelltypspezifischer Methylierung identifiziert werden: cg22381196 (DHODH), cg12483340 (TMEM87A), cg06270401 (DYRK4), cg23054181 (FAM169BP), cg26076724 (RP11-146I2.2), cg12249234 (KSR1), cg04468741 (MICAL2), cg05074138 (CTLA4), cg05705140 (LINC01237), cg15564619 (SKI), cg11531557 (HMBOX1), cg02212339 (TRPV1), cg22488278 (ZFYVE28), cg02240030 (MAD1L1) und cg24408769 (JARID2). Bei der Verwendung dieser CpG-Stellen korrelierten in venösem Blut die durchflusszytometrischen und epigenetischen Schätzungen der relativen Leukozytenzahl für Granulozyten (r=0,95), Lymphozyten (r=0,96), Monozyten (r=0,82), CD4-T-Zellen (r=0,84), CD8-T-Zellen (r=0,94), B-Zellen (r=0,96) und NK-Zellen (r=0,72). Bei getrockneten Blutproben wurden ähnliche Korrelationen erzielt. „Spike-in“ mit einem Referenzplasmid ermöglichte eine genaue epigenetische Schätzung der absoluten Leukozytenzahlen aus getrockneten Blutproben, die mit konventionellen venösen (r = 0,85) und kapillaren (r = 0,80) Blutmessungen korrelierten. Die neuen erfindungsgemäßen genomischen Bereiche sind für die epigenetischen Blutbilder nochmal besser geeignet als die CpG-Stellen, die bereits aus der EP 3382033 A1 bekannt sind. Das Verfahren wurde in einer großen Kohorte von gesunden Spendern und Patienten mit hämatopoetischen Erkrankungen validiert. Die Messungen wurden hierbei mittels digitaler Tröpfchen-PCR (ddPCR) durchgeführt. Insgesamt konnte die Präzision bzw. Sensitivität des Messverfahrens anhand der neuen genomischen Bereiche und der ddPCR-Messung weiter verbessert werden. Die Vorteile der Erfindung gegenüber konventiellen Blutbildern liegen insbesondere auch darin, dass das erfindungsgemäße Verfahren auf DNA basiert, die lange Zeit stabil ist, so dass die zu testenden Proben für einen längeren Zeitraum (im gefrorenen Zustand über Jahrzehnte) gelagert werden können. Es konnte zudem belegt werden, dass das erfindungsgemäße Verfahren auch mit getrocknetem Blut durchgeführt werden kann. Die Patienten könnten somit Zuhause durch einen Fingerstich die Blutprobe entnehmen. Darüber hinaus ist das erfindungsgemäße Verfahren quantitativ sowie leicht zu standardisieren und korreliert mit konventionellen Messverfahren. Die Erfindung eröffnet somit die Möglichkeit, das Blutbild von Patienten unabhängig davon zu analysieren, wie lange die Proben schon gelagert wurden. Sogar retrospektive Analysen Jahre später (z.B. für wissenschaftliche Studien) sind dabei möglich. Des Weiteren kann die DNA auch aus getrockneten Blutproben isoliert und analysiert werden. Um das Analyseverfahren so gut wie möglich zu optimieren, wurden auf „Gene Expression Omnibus“ allen möglichen öffentlichen Datensätzen mit Methylierungsdaten gesucht. Insgesamt konnten dabei Datensätze aus 40 Studien ermittelt werden, die 1303 Proben umfassten. Mit Hilfe einer eigenen, neu entwickelten Datenanalyse-Pipeline namens „CimpleG“ haben die Erfinder für jeden Zelltyp (Granulozyten, Lymphozyten, Monozyten, CD4⁺-T-Zellen, CD8⁺-T-Zellen, B-Zellen und NK-Zellen) jeweils die 3 wichtigsten CpGs identifiziert, d.h. diejenigen mit den größten Unterschieden in der DNA- Methylierung zwischen einem Zelltyp im Vergleich zu allen anderen Zelltypen für die die Standardabweichung am geringsten ist. Für alle diese 21 CpGs wurden ddPCR-Assays entwickelt und diese in Patientenproben mit bekannten Zellzahlen getestet. Folgende CpGs erwiesen sich in der ddPCR-Validierung als geeignet und sind bisher noch nicht im Zusammenhang mit einer Blutbildbestimmung beschrieben worden (siehe Tabelle 1): Tabelle 1: Liste der erfindungsgemäßen CpG-Stellen Blutzelltyp CpG-Stelle Gen, Position im Genom Korrelation DHODH (“Dihydroorotate Granulozyten cg22381196 dehydrogenase”), 0.83 chr16:72041376 TMEM87A (“Transmembrane protein ” Granulozyten cg06270401 phosphorylation regulated kinase 4), 0.81 chr12:4699085 FAM169BP (“Family with sequence ” Lymphozyten cg26076724 RNA), 0.83 chr6:15090163 KSR1 (“Kinase suppressor of ras 1”), Lymphozyten cg12249234 0.83 Monozyten cg04468741 monooxygenase, calponin and LIM 0.5 domain containing 2”), chr11:12181467 CD4⁺-T- CTLA4 (“Cytotoxic T-lymphocyte cg05074138 0.92 ” cg05705140 Protein Coding RNA 1237), 0.86 Zellen chr2:242945114 CD4⁺-T- SKI (“SKI proto-oncogene”), cg15564619 0.71 Zellen chr8:28919234 TRPV1 (“Transient receptor potential ” containing 28), chr4:2321957 MAD1L1 (“Mitotic Arrest Deficient 1 Like NK-Zellen cg02240030 - ” NK-Zellen cg24408769 Interaction Domain Containing 2), - chr6:15506085 Bemerkenswert ist, dass bis heute einige Zelltypen nicht genau vorhergesagt werden können, wobei die Auswahl der genomischen Region eine sehr wichtige Rolle spielt. Da die erfindungsgemäßen CpG-Stellen auf vielen verschiedenen öffentlichen Daten beruhen und statt mit quantitativer PCR (qPCR) oder Pyrosequenzierung mit ddPCR gemessen werden, einer relativ neuen und sehr präzisen Methode, können die verschiedenen Zelltypen viel besser als zuvor und mit noch weniger Volume (<30µl Blut) vorhersagt werden. Die erfindungsgemäße epigenetische Leukozytenbestimmung stellt ferner eine alternative Messmethode für die Fälle dar, in denen konventionelle Verfahren kein eindeutiges Ergebnis liefern (z.B. aufgrund von Koagulation). Vorzugsweise befindet sich mindestens ein CpG-Dinukleotid innerhalb einer Region von 500, 400, 300, 200 oder 100 Nukleotiden stromaufwärts und/oder stromabwärts von jeweils einem der genannten CpG-Dinukleotide cg22381196, cg12483340, cg06270401, cg23054181, cg26076724, cg12249234, cg04468741, cg05074138, cg05705140, cg15564619, cg11531557, cg02212339, cg22488278, cg02240030 und cg24408769. In vorteilhafter Ausgestaltung der Erfindung ist ferner vorgesehen, dass die Probe mit einem Volumen von höchstens oder weniger als 50 µl, höchstens oder weniger als 40 µl, höchstens oder weniger als 30 µl, höchstens oder weniger als 20 µl, höchstens oder weniger als 10 µl, 10 – 40 µl, 10 – 30 µl, 10 – 20 µl, 20 – 40 µl, 30 – 40 µl, 20 – 30 µl, 10 – 20 µl, 25 – 35 µl oder vorzugsweise 30 µl bereitgestellt wird. Das erfindungsgemäße Verfahren kommt also mit sehr geringen Probenvolumina aus, so dass für eine erfolgreiche und genaue Bestimmung der zellulären Zusammensetzung keine großen Probenmengen zur Verfügung stehen müssen. Die biologische Probe kann beispielsweise eine Blutprobe sein, die mobilisiertes peripheres Blut eines menschlichen Individuums umfasst. Dabei kann es sich in vorteilhafter Weise auch um gefrorenes Blut oder getrocknete Blutspots handeln. Die biologische Probe kann aber auch Knochenmark, Liquor und/oder ein anderes, Leukozyten-haltiges Gewebe umfassen. Die Bestimmung des Methylierungsgrads bzw. Messung der DNA-Methylierung (DNAm) kann vorzugsweise mittels digitaler PCR (dPCR), beispielsweise digitaler Tröpfchen-PCR (ddPCR), durchgeführt werden. Die Aufgabe wird erfindungsgemäß ferner durch die Verwendung mindestens eines künstlichen Nukleinsäuremoleküls zur Bestimmung zumindest eines Teils der zellulären Zusammensetzung einer biologischen Probe, die Leukozyten umfasst, nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gelöst, bei der das Nukleinsäuremolekül mindestens eine Nukleotidsequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: a) Einer Nukleotidsequenz, die aus der Gruppe bestehend aus der SEQ ID NR: 1, SEQ ID NR: 2, SEQ ID NR: 3 und SEQ ID NR: 4 ausgewählt ist, zur Bestimmung des Anteils an Granulozyten; b) einer Nukleotidsequenz, die aus der Gruppe bestehend aus der SEQ ID NR: 5, SEQ ID NR: 6, SEQ ID NR: 7 und SEQ ID NR: 8 ausgewählt ist, zur Bestimmung des Anteils an Granulozyten; c) einer Nukleotidsequenz, die aus der Gruppe bestehend aus der SEQ ID NR: 9, SEQ ID NR: 10, SEQ ID NR: 11 und SEQ ID NR: 12 ausgewählt ist, zur Bestimmung des Anteils an Granulozyten; d) einer Nukleotidsequenz, die aus der Gruppe bestehend aus der SEQ ID NR: 13, SEQ ID NR: 14, SEQ ID NR: 15 und SEQ ID NR: 16 ausgewählt ist, zur Bestimmung des Anteils an Monozyten; e) einer Nukleotidsequenz, die aus der Gruppe bestehend aus der SEQ ID NR: 17, SEQ ID NR: 18, SEQ ID NR: 19 und SEQ ID NR: 20 ausgewählt ist, zur Bestimmung des Anteils an Lymphozyten; f) einer Nukleotidsequenz, die aus der Gruppe bestehend aus der SEQ ID NR: 21, SEQ ID NR: 22, SEQ ID NR: 23 und SEQ ID NR: 24 ausgewählt ist, zur Bestimmung des Anteils an Lymphozyten; g) einer Nukleotidsequenz, die aus der Gruppe bestehend aus der SEQ ID NR: 25, SEQ ID NR: 26, SEQ ID NR: 27 und SEQ ID NR: 28 ausgewählt ist, zur Bestimmung des Anteils an Lymphozyten; h) einer Nukleotidsequenz, die aus der Gruppe bestehend aus der SEQ ID NR: 29, SEQ ID NR: 30, SEQ ID NR: 31 und SEQ ID NR: 32 ausgewählt ist, zur Bestimmung des Anteils an B-Zellen; i) einer Nukleotidsequenz, die aus der Gruppe bestehend aus der SEQ ID NR: 33, SEQ ID NR: 34, SEQ ID NR: 35 und SEQ ID NR: 36 ausgewählt ist, zur Bestimmung des Anteils an CD4⁺ - T-Zellen; j) einer Nukleotidsequenz, die aus der Gruppe bestehend aus der SEQ ID NR: 37, SEQ ID NR: 38, SEQ ID NR: 39 und SEQ ID NR: 40 ausgewählt ist, zur Bestimmung des Anteils an CD4⁺ - T-Zellen; k) einer Nukleotidsequenz, die aus der Gruppe bestehend aus der SEQ ID NR: 41, SEQ ID NR: 42, SEQ ID NR: 43 und SEQ ID NR: 44 ausgewählt ist, zur Bestimmung des Anteils an CD4⁺ - T-Zellen; l) einer Nukleotidsequenz, die aus der Gruppe bestehend aus der SEQ ID NR: 45, SEQ ID NR: 46, SEQ ID NR: 47 und SEQ ID NR: 48 ausgewählt ist, zur Bestimmung des Anteils an CD8⁺ - T-Zellen; m) einer Nukleotidsequenz, die aus der Gruppe bestehend aus der SEQ ID NR: 49, SEQ ID NR: 50, SEQ ID NR: 51 und SEQ ID NR: 52 ausgewählt ist, zur Bestimmung des Anteils an NK-Zellen; n) einer Nukleotidsequenz, die aus der Gruppe bestehend aus der SEQ ID NR: 53, SEQ ID NR: 54, SEQ ID NR: 55 und SEQ ID NR: 56 ausgewählt ist, zur Bestimmung des Anteils an NK-Zellen; o) einer Nukleotidsequenz, die aus der Gruppe bestehend aus der SEQ ID NR: 57, SEQ ID NR: 58, SEQ ID NR: 59 und SEQ ID NR: 60 ausgewählt ist, zur Bestimmung des Anteils an NK-Zellen; p) einer Nukleotidsequenz, die sich von einer der Nukleotidsequenzen gemäß a) bis o) durch den Austausch von höchstens 10 % der Nukleotide, vorzugsweise höchstens 5 % der Nukleotide, unterscheidet; und q) einer Nukleotidsequenz, die dem komplementären Strang einer der Nukleotidsequenzen gemäß a) bis p) entspricht. Die Erfindung umfasst dabei beispielsweise ein Kit mit einer Zusammenstellung geeigneter Referenz-DNAs, Primer-Sets, sowie optional Anleitungen und Auswertesoftware. Die Erfindung umfasst folglich auch ein Kit, insbesondere ein Kit zur Bestimmung zumindest eines Teils der zellulären Zusammensetzung von Blut, vorzugsweise zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, das mindestens einen Oligonukleotid-Primer (beispielsweise Oligonukleotid-Primer- Set“, siehe z. B. Tabelle 2) zur Amplifizierung und/oder Sequenzierung zumindest von mindestens einem CpG-Dinukleotid mindestens einer Nukleotid- Sequenz umfasst, die mindestens ein CpG-Dinukleotid aus der Gruppe bestehend aus den CpG-Dinukleotiden cg22381196, cg12483340, cg06270401, cg23054181, cg26076724, cg12249234, cg04468741, cg05074138, cg05705140, cg15564619, cg11531557, cg02212339, cg22488278, cg02240030, cg24408769 und mindestens einem CpG-Dinukleotid, das sich innerhalb einer Region von 1.000 Nukleotiden stromaufwärts und/oder stromabwärts von jeweils einem der genannten CpG-Dinukleotide befindet, umfasst. Das erfindungsgemäße Kit kann beispielsweise mindestens ein erfindungsgemäßes Primer-Set und optional mindestens eine Pufferlösung und/oder mindestens ein Reagenz zur Durchführung mindestens eines Verfahrens, das aus der Gruppe bestehend aus DNA-Amplifikation, Bisulfit- Behandlung von DNA, DNA-Sequenzierung, vorzugsweise Pyrosequenzierung von DNA, MassArray-Analyse, „Deep Sequencing“ von Bisulfit-convertierter DNA, semiquantitative PCR, digitale PCR, digitale Tröpfchen-PCR, Epityper, Amplikon-Sequenzierung, Nanopore-Sequenzierung und SMART-Sequencing ausgewählt ist, umfassen. Tabelle 2: Liste der Primer und Sonden für die ddPCR CpG-Stelle Primer Sequenz SEQ ID NR: cg22381196 Vor GGTTTTATTGTGTTAGTTAGGAT 1 cg23054181 Vor TTTGGTTTTAAAGAAGTTTTTTGAG 17 „ c = cw rs- rmer „Sm-“ = Sonde für unmethylierten Strang, 5' 6-FAM - [Seqenz] - 3' BHQ-1 „Sm+“ = Sonde für methylierten Strang, 5' HEX - [Seqenz] - 3' BHQ-1 Die Erfindung wird im Weiteren anhand der Figuren und Tabellen beispielhaft näher erläutert. Kurze Beschreibung der Figuren Figur 1: Identifizierung von CpGs mit zelltypspezifischer DNAm in Leukozytenuntergruppen. (A) Flussdiagramm, wie Illumina BeadChip-Messungen von Proben gereinigter Leukozyten-Untergruppen (n) in verschiedenen Studien (N) zusammengestellt wurden. Die Daten aus 40 Studien kamen für eine Neuanalyse durch CimpleG in Frage, die Methylierungsdaten von 1303 sortierten Zellproben von 726 Patienten umfasste. (B) Auf der Grundlage dieser Datensammlung wurden die Kandidaten-CpGs für jeden Zelltyp anhand der mittleren Differenz und der Gesamtvarianz nach CimpleG eingestuft. Die Top 3 CpG mit dem höchsten CimpleG-Score für jeden Zelltyp sind hervorgehoben. (C) Die Heatmap zeigt die DNAm (Beta-Werte) für die 27 zelltypspezifischen CpG-Stellen. HSPC: hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen; nRBC: kernhaltige rote Blutkörperchen. Figur 2: Epigenetische Schätzungen von Granulozyten, Lymphozyten und Monozyten. (A) Einfache lineare Regressionsmodelle für Monozyten, Lymphozyten und Granulozyten wurden für 50 gesunde Spender auf der Grundlage von DNAm- Messungen (ddPCR) im Vergleich zu herkömmlichen Zellzahlen (gemessen mit Cell Dyn Emerald) trainiert. Es wird eine inverse Korrelation für Monozyten und Granulozyten (hypomethylierte CpGs) und eine positive Korrelation für Lymphozyten (hypermethylierte CpGs) gezeigt. (B,C) Diese Modelle wurden an 110 unabhängigen Blutproben von gesunden Spendern (B; ebenfalls gemessen mit Cell Dyn Emerald) und 150 Patienten (C; gemessen mit Sysmex XS800i) getestet. Aufgrund des systemischen Offsets, der bei epigenetischen Schätzungen von Proben beobachtet wurde, die mit dem Sysmex XS800i gemessen wurden, wurden einzelne lineare Regressionsmodelle für dieses Gerät an 50 zufällig ausgewählten Proben neu trainiert. (D,E) ddPCR- Messungen wurden an 36 Ringversuchsproben verglichen, die von etwa 400 Labors mit verschiedenen herkömmlichen Zellzählern unterschiedlicher Hersteller gemessen wurden. Die auf dem Sysmex XS800i trainierten epigenetischen Vorhersagen wurden mit den durchschnittlichen Zellzahlen aus dem Ringversuch verglichen (D). Außerdem wurden alternative Modelle für epigenetische Vorhersagen verglichen, die entweder auf Cell Dyn Emerald (grün) oder auf Sysmex XS800i (rot) für jede einzelne Probe trainiert wurden (E). Die Pearson-Korrelation r und der mittlere absolute Fehler (MAE) sind für jeden Zelltyp angegeben. Figur 3: Epigenetische Blutwerte korrelieren mit durchflusszytometrischen Messungen. (A) Die mittels ddPCR bestimmten DNAm-Werte wurden mit dem konventionellen Blutbild in Blutproben von 50 zufällig ausgewählten Patienten korreliert, die auf Granulozyten, Monozyten, Pan-Lymphozyten (Sysmex XS800i) und CD4⁺-T-Zellen, CD8⁺-T-Zellen, B-Zellen und NK-Zellen (Durchflusszytometrie) untersucht wurden. Eine positive Korrelation wird für Lymphozyten (hypermethylierte CpG) und eine negative Korrelation für die anderen Zelltypen (hypomethylierte CpGs) beobachtet. (B) Lineare Regressionsmodelle für jeden Zelltyp, die auf diesen Daten trainiert wurden, wurden dann auf einen unabhängigen Validierungssatz (n = 100) angewendet, um die Zellzahlen zu schätzen. Die Pearson-Korrelation r und der mittlere absolute Fehler (MAE) sind für jede Leukozytenuntergruppe angegeben. Figur 4: Relative Leukozytenzahlen für getrocknete Blutproben. (A-C) Korrelation von konventionellen Zellzahlen (Sysmex XS800i und Durchflusszytometrie) mit relativen Blutzahlen, die mittels ddPCR geschätzt wurden, für kryokonserviertes venöses Blut von 75 Patienten, das entweder aufgetaut und direkt verwendet (A) oder über Nacht entweder auf Mitra 30µl- Mikrosamplern (Neoterxy) (B) oder Whatman-Protein-Saver-Karten (C) getrocknet wurde. (D) Frisches Kapillarblut wurde von 31 Spendern entnommen und sofort mit einem Zellzähler (Cell Dyn Emerald) gemessen oder vor der ddPCR-Analyse 3-5 Tage lang auf Whatman-Proteinpapier-Saverkarten getrocknet. Die Pearson-Korrelation r und der mittlere absolute Fehler (MAE) sind für jeden Zelltyp angegeben. Figur 5: Gesamtleukozytenzahlen mittels ddPCR mit einem Referenzplasmid. (A) Schema des Arbeitsablaufs für die absolute Quantifizierung von Leukozyten. Venöses Blut, Stanzen von Whatman-Protein-Saver-Karten mit getrocknetem Blut oder Spitzen der Mitro-Mikroprobenentnahmegeräte mit getrocknetem Blut wurden vor der DNA-Isolierung und ddPCR mit einem Referenzplasmid gemischt. (B) Die Zellzahlen wurden auf der Grundlage des Verhältnisses von genomischer zu Plasmid-DNA geschätzt. (C) Kombination der Schätzungen für die relative Leukozytenzahl mit der absoluten Zellzahl. Die Pearson-Korrelation zwischen epigenetischen Schätzungen und konventionellen Messungen ist angegeben. Figur 6: Hauptkomponentenanalyse auf der Grundlage der 27 zelltypspezifischen CpGs. Für jeden der 9 Zelltypen wurden 3 unterschiedlich methylierte CpGs identifiziert. Die Hauptkomponentenanalyse der DNAm-Daten dieser 27 CpGs zeigte, dass die Zelltypen in einem Cluster zusammengefasst sind, obwohl die Daten aus vielen verschiedenen Studien stammen. Man beachte, dass in PC1/PC2 die nRBCs sehr eng mit den HSPCs geclustert sind, was zu erwarten ist, da nRBCs auch eher unreifen Blutzellen ähneln. HSPC: hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen; RBC: rote Blutzellen. Figur 7: Auswertung der zelltypspezifischen CpGs. Das Verhalten der granulozyten-, lymphozyten- und monozytenspezifischen CpG-Stellen wurde bei 92 gesunden Spendern bewertet. Das Verhalten der CpG-Stellen von Lymphozyten-Untergruppen wurde bei 21 Patienten bewertet. Die Pearson-Korrelation r wird für die DNAm-Werte im Vergleich zu den mit automatischen Zellzählern bzw. mittels Durchflusszytometrie ermittelten Zellzahlen angegeben. Figur 8: Trennung von methylierten und unmethylierten Signalen in der ddPCR-Analyse. Beispielhafte Ergebnisse für ddPCR-Messungen. Die einzelnen Tröpfchen wurden entweder als methyliertes CpG (blau), unmethyliertes CpG (grün) oder beides (orange) bewertet. Auf dieser Grundlage wird der DNAm-Gehalt durch die Fischer-Verteilung bestimmt. Für die absolute Quantifizierung enthalten die Tröpfchen genomische DNA (blau), Plasmid-DNA (grün) oder beides (orange). Figur 9: DNA-Methylierung von Genen mit den Top-Kandidaten-CpGs. Die Kandidaten-CpG-Stellen wurden in DHODH, FAM169BP, MICAL2, TRPV1, CTLA4, CD8B und MVD identifiziert. Diese Abbildung zeigt die mit einem „450k Illumina Beadchip“ gemessenen DNAm-Werte (β-Werte) für die sortierten Leukozyten aus dem öffentlich zugänglichen Datensatz GSE35069. Die Gene sind schematisch in Übereinstimmung mit den Annotationen von Illumina dargestellt und zeigen 1500bp und 200bp stromaufwärts der Transkriptionsstartstelle (TSS1500 und TSS200), die 5' und 3' untranslatierten Regionen (UTR), 1. Exon und den Genkörper. Jeder Punkt steht für eine CpG- Stelle, wobei die rote Linie das ausgewählte CpG anzeigt. Figur 10: Die zelltypspezifische DNAm spiegelt sich kaum auf der Ebene der Genexpression wider. Die im humanen Proteinatlas (proteinatlas.org) verfügbaren Einzelzelltranskriptomdaten zeigen, dass die meisten Gene, die eine zelltypspezifische CpG-Stelle aufweisen, in verschiedenen Zelltypen exprimiert werden. Nur für CD8B (CpG für CD8⁺-T-Zellen) und CTLA4 (CpG für CD4⁺-T- Zellen) wurde eine spezifische Hochregulierung in den entsprechenden Zelltypen beobachtet. DHODH (CpG-Granulozyten) wurde besonders in Hepatozyten exprimiert. Figur 11: Genauigkeit der epigenetischen Schätzungen in Abhängigkeit von Alter und Geschlecht. (A) Der Vergleich zwischen jungen (Alter ≤ 30 Jahre, n = 24) und älteren Patienten (Alter ≥ 60 Jahre, n = 58) zeigte, dass das Alter keinen signifikanten Einfluss auf die Genauigkeit der epigenetischen Zelltypvorhersage hatte. (B) Es wurden keine signifikanten Unterschiede in der Vorhersagegenauigkeit zwischen weiblichen (n = 74) und männlichen Spendern (n = 76) festgestellt. Die Daten werden als Whisker-Box-Plot der Abweichung zwischen epigenetischen Schätzungen und konventionellen Zellzahlen dargestellt. Die Boxen geben das erste und dritte Quartil an, die horizontalen Linien in den Boxen den Median, die Whisker den 1,5-fachen Interquartilsbereich. Figur 12: Summenauswertung der epigenetischen Schätzungen für einzelne Zelltypen. Zur weiteren Einschätzung der Konsistenz der epigenetischen Zelltypvorhersagen wurde geschätzt, ob die Anteile der einzelnen Zelltypen von den erwarteten 100 % abweichen. (A, B) Zu diesem Zweck wurden die Vorhersagen für Granulozyten, Monozyten und Pan-Lymphozyten (3 CpG- Score) für gesunde Spender (Cell Dyn Emerald-Modell, A) und Patienten (Sysmex XN9000; B) summiert. Die geringfügig höhere Abweichung bei Patientenproben könnte auf hämatologische Erkrankungen zurückzuführen sein. (C) Alternativ dazu wurden die Vorhersagen für Granulozyten, Monozyten, CD4+-T-Zellen, CD8-T-Zellen, B-Zellen und NK-Zellen (6 CpG-Score) summiert und mit den Patientenproben verglichen Figur 13: Absolute Quantifizierung auf der Grundlage genomischer DNA- Kopien. Die digitale Tröpfchen-PCR ist eine absolute Quantifizierungsmethode, die eine absolute Anzahl von DNA-Kopien pro Reaktion liefert. Im Rahmen der Erfindung wurde eine einzigartige genomische Region (R5), die alternativ auch für den Referenzplasmid-basierten Ansatz verwendet wurde, analysiert. Während bei venösem Blut eine klare Korrelation zwischen den mittels ddPCR nachgewiesenen genomischen Kopien von R5 und der konventionellen Leukozytenzahl besteht, gibt es bei der Analyse von getrocknetem Blut mehrere Ausreißer. Die Pearson-Korrelation r ist angegeben. Beschreibung beispielhafter und bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung DNAm-Profile aus 40 verschiedenen Studien wurden zusammengestellt, um mit Hilfe von CimpleG CG-Dinukleotide (CpGs) mit zelltypspezifischem DNAm zu identifizieren. Die DNAm-Konzentrationen an diesen CpGs wurden dann mit digitaler Tröpfchen-PCR (ddPCR) in venösem Blut von 160 gesunden Spendern und 150 Patienten mit verschiedenen hämatologischen Erkrankungen gemessen. Die Dekonvolution wurde ferner mit venösem Blut (n=75) und Kapillarblut (n=31) validiert, das entweder über Nacht (16 Stunden) oder bis zu 5 Tage auf Whatman-Papier oder auf Mitra-Mikroprobenentnahmegeräten getrocknet wurde. Differenzialblutbilder werden häufig zur Unterstützung der Diagnose einer Vielzahl von Erkrankungen oder zur Überwachung der Behandlung verwendet. Sie werden in der Regel entweder mit automatischen Zellzählern oder mit der Durchflusszytometrie durchgeführt (1, 2). Zu diesem Zweck muss frisches Blut entnommen werden, da die Zellzahlen innerhalb von 24 Stunden durch den Verlust der zellulären Integrität, die Gerinnung, eine gestörte elektrische Impedanz oder eine schlechte Antikörperbindung beeinträchtigt werden (3-5). Im Gegensatz dazu würde die Leukozytenzählung auf der Grundlage von getrockneten Blutflecken die Selbstentnahme durch Einstich in den Finger erleichtern, ohne dass qualifiziertes Personal erforderlich wäre, die langfristige Lagerung und den Versand von Blutproben erleichtern und im Vergleich zur Venenpunktion ein deutlich geringeres Blutungsrisiko bergen (6). Die Entfaltung von Leukozyten-Untergruppen ist auch mit epigenetischen Mitteln möglich. DNA-Methylierungsmuster (DNAm) werden während der Differenzierung durchweg zelltypspezifisch moduliert (7). Epigenetische Signaturen, die DNAm-Werte an vielen CG-Dinukleotiden (CpGs) integrieren, können daher zur Bestimmung der Zusammensetzung von Zelltypen im Gewebe verwendet werden (8, 9)oder von Leukozyten im Blut (10-12). Epigenetische Signaturen für die Dekonvolution von hämatopoetischen Untergruppen wurden zunächst für Illumina BeadChip-Daten (10-12). Da die genomweite DNAm- Profilierung jedoch kaum für die Routinediagnostik geeignet ist, ist es wichtig, eine gezielte DNAm-Analyse einzelner CpGs für die klinische Anwendung zu definieren (13). Zu diesem Zweck können viele verschiedene Methoden eingesetzt werden, z. B. die quantitative PCR (qPCR) (14), Pyrosequenzierung (15), Barcodierte Amplikon-Sequenzierung (16)oder methylierungsspezifische digitale Tröpfchen-PCR (ddPCR)(17). Insbesondere die ddPCR kann zuverlässigere DNAm-Messungen ermöglichen, da es keine PCR-Verzerrung zwischen methylierten und nicht-methylierten Sequenzen gibt (18). Neben der Auswahl einer empfindlichen Methode ist die Auswahl von zelltypspezifischen Kandidaten-CpGs entscheidend für die Entwicklung zuverlässiger gezielter Biomarker. In einer früheren Arbeit haben die Erfinder solche genomischen Stellen auf der Grundlage eines Datensatzes von sortierten Leukozytenuntergruppen ausgewählt (15, 19). Diese Signaturen wurden zwar an Patientenmaterial validiert, zeigten aber nicht für alle Leukozyten-Untergruppen eine sehr starke Korrelation mit herkömmlichen Blutbildern (17). Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurden daher die verfügbaren Illumina BeadChip DNAm-Profile von sortierten Leukozyten im Gene Expression Omnibus (GEO) des NCBI zusammengestellt. Auf dieser Grundlage wurden neue zelltypspezifische CpGs mithilfe eines computergestützten Systems namens "CimpleG" identifiziert (20). Epigenetische Vorhersagen auf der Grundlage von ddPCR-Messungen an diesen CpGs verbesserten deutlich die Genauigkeit der Leukozytenzählung in Blutproben von gesunden Spendern und Patienten mit hämatologischen Erkrankungen. Darüber hinaus konnte die Anwendbarkeit für getrocknete Blutproben nachgewiesen werden. Auswahl der unterschiedlich methylierten Stellen Die GEO-Datenbank wurde nach öffentlich verfügbaren DNAm-Profilen (450k oder EPIC Illumina BeadChip Arrays) von sortierten menschlichen hämatopoetischen Zellen durchsucht (ergänzende Tabelle S1). Diese Profile wurden anschließend mit CimpleG (20) analysiert. Blutproben Alle Blutproben (kryokonserviertes venöses Blut von 160 gesunden Spendern und 150 Patienten mit hämatologischen Erkrankungen sowie frisches Kapillarblut von 31 gesunden Spendern) wurden am Universitätsklinikum der RWTH Aachen nach informierter und schriftlicher Zustimmung in Übereinstimmung mit der örtlichen Ethikkommission (EK041/15, EK206/09) entnommen. Für eine Teilmenge der Proben wurden getrocknete Blutspots mit zwei verschiedenen Mikrosamplern entnommen: Mitra®- Mikroprobenentnahmegeräte (Neoteryx) und Whatman®-Protein-Saver-Karten (Cytiva). Zusätzlich wurden 36 kryokonservierte Blutproben vom Referenzinstitut für Bioanalytik (RfB, Bonn, Deutschland) erworben. Digitale Tröpfchen-PCR Die Primer wurden mit dem Bisulfit-Primersucher-Tool (Zymo Research) entworfen, und die fluoreszierenden Sonden wurden manuell mit Schmelztemperaturen entworfen, die mehrere Grad höher als die der Primer lagen. (Tabellen 2 und 3). Mit einem QX200-Tropfengenerator (Bio-Rad) wurden Tröpfchen für 20 µl Reaktionsmischung erzeugt, die 2x Supermix für Sonden (keine dUTPs, Bio-Rad), 1 µM Primer und 0,25 µM TaqMan-Sonden (beide Metabion) sowie 10-30ng Bisulfit-konvertierte DNA enthielten. Anschließend wurde die DNA auf einem C1000 Touch Thermal Cycler (Bio-Rad) mit folgendem Programm amplifiziert: 1 x 95°C für 10 min, 40 x 94°C für 30 s und 54°C für 30 s, 1 x 98°C für 10 min. Die Tröpfchen wurden mit einem QX200 Droplet Digital Reader quantifiziert und mit der QuantaSoft analysis Pro Software (beide Bio- Rad) ausgewertet. Epigenetische Leukozytenzahlen Zur Schätzung der relativen Leukozytenzahlen wurden 50 gesunde Spender oder 50 Patientenproben nach dem Zufallsprinzip ausgewählt, um einzelne lineare Regressionen auf der Grundlage der DNAm-Werte im Vergleich zu konventionellen manuellen differenziellen Zellzählungen für den jeweiligen Zelltyp zu erhalten. Die übrigen Proben wurden als unabhängige Validierungssets verwendet. Die absoluten Leukozytenzahlen wurden für eine Untergruppe von Proben in Bezug auf das Referenzplasmid geschätzt (17). Auf der Grundlage der detektierten Plasmidkopien und der genomischen Kopien wurde die absolute Anzahl der Zellen wie unten beschrieben berechnet. CpG-Auswahl Um Leukozyten-Untergruppen-spezifische CpG-Stellen zu identifizieren, wurde der Gene Expression Omnibus (GEO) nach öffentlich verfügbaren Datensätzen durchsucht. Der folgende Suchbegriff wurde verwendet: "Lymphozyten OR NK- Zellen OR CD4⁺ OR CD8⁺ OR B-Zellen OR Monozyten OR Granulozyten OR kernhaltige rote Blutkörperchen OR CD34⁺ OR Vorläuferzellen OR Stammzellen)". Die Suche wurde auf "Homo sapiens" als Organismus beschränkt. Die Datensätze wurden nach den Studientypen "Methylation Profiling by Array" oder "Methylation Profiling by Genome Tiling Array" gefiltert, wobei entweder der Illumina HumanMethylation450 BeadChip (GPL16304 OR GPL13534) oder die Infinium MethylationEPIC (GPL21145) Plattform verwendet wurde. Um eine bessere Re-Analyse zu ermöglichen, wurden nur Studien berücksichtigt, die ihre Rohdaten im IDAT-Format veröffentlicht haben. Diese Suche wurde zuletzt am 14-10-2021 durchgeführt und ergab 150 Datensätze. Datensätze mit Proben von erkrankten Patienten, insbesondere solchen mit hämatopoetischen Malignomen, wurden anschließend von der weiteren Analyse ausgeschlossen, da sie das epigenetische Profil beeinflussen könnten (21, 22). Außerdem wurde ein Datensatz, der eine Mischung aus 450K- und EPIC- BeadChip-Daten enthielt, bei der ersten Qualitätsbewertung ausgeschlossen, da er als Ausreißer betrachtet wurde. Daraus ergaben sich 40 in Frage kommende Datensätze, die 1303 DNAm-Profile enthielten. Diese 1303 DNAm-Profile wurden mit der CimpleG-Pipeline analysiert (20). Zunächst wurden die Daten mit dem R-Paket minfi v1.30.0 (minfi, RRID:SCR_012830) verarbeitet und mit ssNoob, einem Verfahren zur Normalisierung innerhalb einer Probe, normalisiert. Anschließend wurden Sonden mit schlechter Mapping-Qualität oder solche, die auf sexuelle Chromosomen gemappt wurden, ausgeschlossen. Schließlich wurden nur CpGs beibehalten, die sowohl in der 450k- als auch in der EPIC-Plattform vorhanden waren. Diese verbleibenden CpGs wurden auf der Grundlage einer 10-fachen geschichteten Kreuzvalidierung auf ihre Zelltypspezifität hin untersucht. Innerhalb jeder Falte oder Schleife wird jedes CpG mit einer t-ähnlichen Statistik bewertet, und seine Leistung bei der Klassifizierungsaufgabe wird mit der Fläche unter der Präzisions-Rückrufkurve (AUPR) gemessen. Eine endgültige Punktzahl für jede Sonde mit der besten Leistung wurde durch die Kombination der durchschnittlichen t-like-Statistik der Sonde mit der durchschnittlichen Trainings-AUPR multipliziert mit dem Anteil der Faltungen, in denen ein CpG als Spitzenkandidat ausgewählt wurde, ermittelt. Diese Ranking-Analyse für die CpG-Auswahl wurde zweimal durchgeführt. Die erste Analyse diente der Identifizierung von CpGs mit Methylierung, die spezifisch für Monozyten, Granulozyten und Pan-Lymphozyten sind. Die zweite Analyse diente der Identifizierung von CpG-Stellen für spezifischere Untergruppen von Blutzellen, darunter B-Zellen, CD4⁺ T-Zellen, CD8⁺ T-Zellen, natürliche Killerzellen (NK), kernhaltige rote Blutkörperchen (nRBC) und CD34⁺ hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen (HSPC). Blutprobenentnahme Die Erfinder analysierten kryokonservierte venöse Blutproben (160 gesunde Spender und 150 Patienten mit hämatologischen Erkrankungen), die vor der DNA-Isolierung bis zu fünf Jahre bei -80°C gelagert wurden. Diese wurden am Universitätsklinikum der RWTH Aachen nach informierter und schriftlicher Zustimmung in Übereinstimmung mit der lokalen Ethikkommission der RWTH Aachen (EK041/15, EK206/09) entnommen. Für die Analyse der getrockneten Blutspots wurde kryokonserviertes Venenblut von 75 Patienten aufgetaut und anschließend 30µl auf Mitra®-Mikroprobenentnahmegeräten (Neoteryx, Torrance, USA) und Whatman®-Protein-Saver-Karten (Cytiva, Freiburg im Breisgau, Deutschland) getrocknet. Darüber hinaus wurde 31 Patienten frisches Kapillarblut mit einer Microvette® (Sartstedt, Nümbrecht, Deutschland) entnommen, das sofort auf Whatman®-Protein-Saver-Karten getrocknet und bis zu 5 Tage später analysiert wurde. Zum Zeitpunkt der Blutentnahme wurden sofort konventionelle Leukozytenzählungen entweder mit einem Cell Dyn Emerald (Abbott, Wiesbaden, Deutschland) oder mit einem Sysmex XS800i (Sysmex, Norderstedt, Deutschland) in Kombination mit Durchflusszytometrie durchgeführt, wie angegeben. DNA-Isolierung und Bisulfit-Behandlung Aus kryokonserviertem Venenblut wurde DNA entweder direkt aus 150 µl mit dem QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) in 200 µl Elutionspuffer isoliert oder alternativ wurden 30 µl für mindestens 16 Stunden (über Nacht) entweder auf Mitra®-Mikrosamplinggeräten oder Whatman®- Protein-Saver-Karten getrocknet. Die DNA aus diesen getrockneten Proben wurde mit dem QIAamp DNA micro kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) isoliert. Dazu wurde die 30 µl Mitra®-Spitze fragmentiert, und aus den Whatman®- Protein-Saver-Karten wurden mit Stanzmessern drei Bereiche (mit einem Durchmesser von jeweils 3 mm) entnommen. Bei Kapillarblut variierte das auf das Whatman-Papier aufgetragene Volumen, doch wurde die DNA immer aus drei Bereichen (mit einem Durchmesser von je 3 mm) mit dem QIAamp DNA micro kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) isoliert. Das endgültige Elutionsvolumen für DNA aus getrocknetem Blut betrug 30 µl. Für die Methylierungsanalyse wurde die isolierte DNA (50-500ng) mit dem EZ DNA Methylation Kit (Zymo research) gemäß den Anweisungen des Herstellers bisulfitiert und in einem Gesamtvolumen von 20µl eluiert. Zusätzliche Informationen für die digitale Tröpfchen-PCR Für die relative Leukozytenzahl wurden zunächst drei Primerpaare für jedes CpG entwickelt und diese auf einem Temperaturgradienten von 50°C bis 60°C mit einer Mischung aus DNA von 10 Patienten getestet. Die besten Primerpaare funktionierten bei 54°C gleich gut, so dass sie in einem Assay kombiniert werden können. Die absolute Quantifizierung der Leukozytenzahl wurde mit einem Referenzplasmid durchgeführt, das eine im menschlichen Genom einzigartige und konservierte genomische Region enthält, die an drei Positionen verändert wurde (Tabelle 5), wie zuvor beschrieben ((17). Die Probe (150µl Blut, 3x3mm Whatman-Papier oder die fragmentierte Mitra-Spitze) wird mit 15µl Plasmid (entsprechend 0,00389 ng oder 580.908 Kopien) gemischt, gefolgt von Proteinase K und Lysepuffer, und 15 Sekunden lang kräftig vortexen. Anschließend wird das Isolierungsprotokoll gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Bei der ddPCR wird die Anzahl der Kopien der genomischen DNA und der Referenz-DNA gemessen, und die absoluten Zellzahlen können dann anhand der folgenden Formel berechnet werden: Cg × 580908 ^^^^^/µl = × ^^ 2 × Cr × v wobei Cg für die gemessene Kopienzahl der genomischen DNA (Kopien/µl), Cr für die gemessene Kopienzahl des Referenzplasmids (Kopien/µl) und v für das Ausgangsvolumen (150µl für venöses Blut und 30µl für Trockenblut) steht. Die "2" dient zur Korrektur der Tatsache, dass jede Zelle 2 Kopien der interessierenden genomischen DNA-Region enthält. Um Verunreinigungen der Plasmid-DNA (bakterielles Genom und andere Plasmide), technische Abweichungen beim Pipettieren, die DNA-Quantifizierung während der Referenzplasmidpräparation, die Effizienz der DNA-Isolierung und Änderungen des Ausgangsvolumens bei getrocknetem Blut zu berücksichtigen, wurde ein empirisch ermittelter Korrekturfaktor cf einbezogen (für venöses Blut cf = 0,07; venöses Blut getrocknet auf Whatman cf = 5; venöses Blut getrocknet auf Mitra cf = 8; und Kapillarblut getrocknet auf Whatman cf = 10). Datenanalyse und Statistik Streudiagramme und die Hauptkomponentenanalyse wurden in R erstellt. Die Heatmap wurde mit heatmapper (23). Der Pearson-Korrelationskoeffizient r und der mittlere absolute Fehler (MAE) der DNAm wurden in Windows Office 2016 Excel (Microsoft) und GraphPad Prism Version 9 (Graph Pad Software Inc.) analysiert und aufgezeichnet. Identifizierung von zelltypspezifischen Methylierungsstellen Zur Auswahl der besten Kandidaten-CpGs für zelltypspezifische DNAm wurde ein Datensatz mit 1303 DNAm-Profilen aus 40 verschiedenen Studien zusammengestellt (Figur 1A; ergänzende Tabelle S1). Mithilfe von CimpleG wurden die drei besten CpGs für Granulozyten, Monozyten, Lymphozyten, CD4- T-Zellen, CD8-T-Zellen, B-Zellen, NK-Zellen, hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) und kernhaltige rote Blutkörperchen (nRBCs; Figur 1B) ausgewählt. Die ausgewählten CpGs zeigten eine zelltypspezifische Hypomethylierung, mit Ausnahme der Pan-Lymphozyten und HSPCs, die hypermethyliert waren. Die Heatmap-Analyse bestätigte ebenfalls die Konsistenz der zelltypspezifischen DNAm-Unterschiede (Figur 1C). Darüber hinaus zeigte die Hauptkomponentenanalyse mit diesen CpG-Stellen deutliche Cluster für jeden Zelltyp (Figur 6). Somit schienen die ausgewählten Kandidaten- CpGs geeignet zu sein, um die jeweiligen Zelltypen über viele verschiedene DNAm-Datensätze hinweg klar zu unterscheiden. Gezielte DNA-Methylierungsanalyse mit digitaler Tröpfchen-PCR Anschließend wurden ddPCR-Assays für die gezielte DNAm-Analyse an den ausgewählten CpGs entwickelt. Die CpGs für HSPCs und nRBCs wurden für diese Analyse nicht berücksichtigt, da diese Zelltypen in der Regel kaum im venösen Blut vorhanden sind. Andererseits wurden zusätzlich ddPCR-Assays für zelltypspezifische CpGs, die zuvor auf der Grundlage von DNAm-Profilen aus einer einzigen Studie ausgewählt wurden, entworfen (15, 17). Da sich bei CD8- T-Zellen das CD8A-assoziierte cg25939861 in beiden Auswahlen überschnitt, analysierten die Erfinder 27 CpGs. Ein erstes Screening wurde an 92 venösen Blutproben von gesunden Spendern durchgeführt, um die besten CpGs für Granulozyten, Monozyten und Pan-Lymphozyten auszuwählen. Für CD4-T- Zellen, CD8-T-Zellen, B-Zellen und NK-Zellen wurden die Lymphozyten von 21 Patienten durchflusszytometrisch weiter stratifiziert (Figur 7). Insgesamt war die Korrelation der DNAm-Werte mit dem konventionellen Blutbild sehr hoch (r > 0,8 oder r < -0,8). Die leistungsfähigsten CpG-Kandidaten (Tabelle 1) wurden auf der Grundlage dieser Korrelationen und, bei ähnlicher Leistung, auf der Grundlage ihres Ranges in der CimpleG-Analyse oder danach ausgewählt, wie gut die positiven ddPCR-Tropfen unterschieden werden konnten (Figur 8). Die ausgewählten CpGs befanden sich entweder in der 1500bp-Region vor der Transkriptionsstartstelle (DHODH), in der 5'UTR-Region (FAM169BP und MICAL2), im ersten Exon (CTLA4) oder im Genkörper (CD8B, TRPV1 und MVD; Figur 9). Die Analyse der Genexpression im menschlichen Proteinatlas zeigte, dass mit Ausnahme von CTLA4 und CD8B die entsprechenden Gene keine charakteristische Hochregulierung in den jeweiligen Zelltypen aufweisen (Figur 10) (24). Daher spiegelt sich eine unterschiedliche DNAm bei diesen epigenetischen Biomarkern nicht unbedingt auf der Ebene der Genexpression wider. Epigenetische Schätzung von Granulozyten, Monozyten und Lymphozyten Für die epigenetische Schätzung der Granulozyten-, Monozyten- und Pan- Lymphozytenfraktion wurden nach dem Zufallsprinzip 50 Proben von gesunden Spendern ausgewählt, um die einzelnen linearen Regressionsmodelle für jeden Zelltyp zu trainieren (Figur 2A, Tabelle 4). Diese Modelle konnten die Anzahl der Granulozyten (r = 0,81; mittlerer absoluter Fehler [MAE] = 3,7) und der Pan- Lymphozyten (r = 0,82; MAE = 3,4) genau vorhersagen und die Anzahl der Monozyten (r = 0,40; MAE = 2,1) bei 110 unabhängigen Spendern, die mit demselben Cell Dyn Emerald Zellzähler gemessen wurden, mäßig vorhersagen (Figur 2B). Als diese Prädiktoren jedoch an 150 Patientenproben getestet wurden, die in einer anderen Abteilung mit einem Sysmex XS800i analysiert wurden, zeigte sich eine systematische Unterschätzung der Granulozyten (MAE = 9,5) und eine systematische Überschätzung der Lymphozyten (MAE = 8,0) und Monozyten (MAE = 3,7) (Figur 2C). Die sehr hohen Korrelationen mit konventionellen Zählungen (r = 0,95, r = 0,96 bzw. r = 0,86) deuten jedoch darauf hin, dass diese Abweichung auf die Referenzmessungen mit verschiedenen Zellzählern zurückzuführen ist. Insbesondere das CpG für Monozyten zeigte eine bessere Korrelation mit den automatischen Zellzählungen in den Patientenproben, was darauf hindeutet, dass diese Messungen präziser sein könnten. Daher wurden die Modelle an einem zufällig ausgewählten Satz von 50 Patientenproben, die mit einem Sysmex XS800i gemessen wurden, erneut trainiert (Tabelle 4). Um diese Assays weiter zu vergleichen, nahmen die Erfinder an einem Ringversuch mit mehr als 400 anderen Instituten teil, bei dem verschiedene konventionelle automatische Zellzähler verwendet wurden. Die ddPCR- Messungen korrelierten eindeutig mit der durchschnittlichen Gesamtzellzahl (Figur 2D). Die Ergebnisse des Ringversuchs zeigten jedoch eine große Abweichung zwischen den verschiedenen Geräten (Figur 2E). Dies zeigt, wie wichtig präzise Referenzmessungen für die Feinabstimmung der linearen Regressionsmodelle für ddPCR sind. Während ddPCR-Messungen robust sind, überschätzten die auf Cell Dyn-Messungen (grün) trainierten Vorhersagen Lymphozyten und Monozyten, während die auf Sysmex XS800i-Messungen (rot) trainierten Vorhersagen Granulozyten eher überschätzten. Epigenetisches Blutbild korreliert mit Durchflusszytometrie in Patientenproben Um die Leistung von CpGs, die für CD4-T-Zellen, CD8-T-Zellen, B-Zellen und NK-Zellen spezifisch sind, zu vergleichen, wurden Blutproben von 150 Patienten mit verschiedenen hämatologischen Erkrankungen analysiert. Diese Blutproben wurden mit einem Sysmex XS800i auf Granulozyten, Monozyten und Pan- Lymphozyten untersucht, und die Lymphozyten wurden durchflusszytometrisch weiter stratifiziert. Wie oben erwähnt, wurde eine Untergruppe von 50 Patienten zufällig für einzelne lineare Regressionsmodelle für jeden dieser Zelltypen ausgewählt (Figur 3A; Tabelle 4). Mit diesen Modellen für den unabhängigen Satz von 100 Patientenproben konnte der Anteil der Granulozyten (r = 0,95, MAE = 3,2), der Pan-Lymphozyten (r = 0,97; MAE = 2.5), Monozyten (r = 0,82; MAE = 1,9), CD4 T-Zellen (r = 0,84; MAE = 2,5), CD8 T-Zellen (r = 0,94; MAE = 1,7), B-Zellen (r = 0,96; MAE = 1,2) und NK-Zellen (r = 0,72; MAE = 1,4) (Figur 3B) vorhergesagt werden. Die Genauigkeit der Vorhersagen wurde durch Alter oder Geschlecht nicht signifikant beeinflusst (Figur 11). Um die Konsistenz der Schätzungen unabhängig von den konventionellen Zellzählern weiter zu bewerten, wurde ermittelt, ob die Vorhersagen für die einzelnen Zelltypen in der Summe 100 % ergeben (Figur 12). Die geschätzten Anteile von Granulozyten, Monozyten und Pan-Lymphozyten summierten sich bei den Patienten auf 99,3 ± 5,2 %, was der Summe bei den gesunden Spendern (100,1 ± 2,6 %) entsprach, und für beide Gruppen unterschied sich die Summe nicht signifikant von den erwarteten 100 % (p = 0,12 bzw. p = 0,78). Die Summe unterschied sich auch nicht signifikant von 100 % (99,2 ± 6,8 %; p = 0,18), als die Pan-Lymphozyten weiter in B-Zellen, CD4-T-Zellen, CD8-T-Zellen und NK- Zellen stratifiziert wurden. Die epigenetischen Schätzungen sind also robust und können auch für Patientenproben konsistente Ergebnisse liefern. Auswertung von Leukozytenfraktionen aus Trockenblut Als Nächstes wurde die Durchführbarkeit der epigenetischen Blutzählung bei getrockneten Blutproben untersucht. Zu diesem Zweck wurden 30 µl venöses Blut von 75 Patienten pipettiert und über Nacht auf zwei alternativen Probenahmegeräten getrocknet: Whatman-Protein-Saver-Karten und Mitra 30µl-Mikroprobenentnahmegeräte. Bemerkenswert ist, dass die Vorhersagen der einzelnen Zellfraktionen eine ähnliche Präzision aufwiesen, wie sie für 150 µl venöses Blut beobachtet wurde, insbesondere wenn das Blut auf Whatman- Protein-Saver-Karten getrocknet wurde, die die Mitra- Mikroprobenentnahmegeräte leicht übertrafen (Figur 4A-C). Als Nächstes wurde die Anwendbarkeit für Kapillarblut, das 31 gesunden Spendern durch Fingerstiche entnommen wurde, getestet. Eine frische Probe wurde mit einem Cell Dyn Emerald-Gerät gemessen, und parallel dazu wurden Blutspots vor der epigenetischen Blutzählung bis zu fünf Tage lang auf Whatman-Protein-Saver-Karten getrocknet. Insbesondere für Granulozyten (r = 0,79, MAE = 5,1) und Pan-Lymphozyten (r = 0,80, MAE = 4,6) ergaben sich gute Korrelationen (Figur 4D). Eine geringere Korrelation wurde für Monozyten (r = 0,16, MAE = 2,0) beobachtet, was auf die Inkonsistenz der Referenzzählungen auf dem Cell Dyn Emerald-Gerät zurückzuführen sein könnte, wie ebenfalls oben erwähnt. Insgesamt zeigen die Ergebnisse, dass das erfindungsgemäße Verfahren für getrocknetes Kapillarblut, das mit einem Fingerstich abgenommen wurde, geeignet ist. Absolute Quantifizierung der Leukozytenzahl Da jeder Leukozyt zwei DNA-Kopien besitzt, wird erwartet, dass die absolute Zellzahl mit der DNA-Konzentration korreliert. Dies lässt sich anhand der Anzahl der in der ddPCR nachgewiesenen Kopien einer bestimmten genomischen Region in nicht mit Biosulfit umgewandelter DNA abschätzen. Tatsächlich korrelierte bei DNA, die aus 150 µl Venenblut isoliert wurde, die Anzahl der positiven Tropfen in der ddPCR für die genomische Region "R5" mit der Leukozytenzahl (r = 0,95; Figur 13). Bei getrocknetem Blut wurden jedoch mehrere Ausreißer beobachtet, insbesondere bei Blut, das auf Mitra- Mikroprobenentnahmegeräten getrocknet wurde (r = 0,58). Ein direkter Vergleich der positiven ddPCR-Ereignisse in 30 µl frischem Blut im Vergleich zu 30 µl derselben Probe, die über Nacht getrocknet wurde, ergab, dass sowohl bei Whatman-Protein-Saver-Karten (67,7 ± 21,4 %) als auch bei Mitra- Mikroprobenentnahmegeräten (33,5 ± 27,6 %) deutlich weniger Kopien nachgewiesen wurden, so dass die DNA-Isolationseffizienz bei getrockneten Blutflecken geringer und variabler war. Daher wurden die Proben vor der DNA-Isolierung mit einem Referenzplasmid in bekannter Menge versetzt, wie zuvor beschrieben (Figur 5A)(17). Die Zellzahl kann dann anhand des Verhältnisses von genomischen zu Plasmid-DNA-Kopien geschätzt werden. Dieser Ansatz bietet eine höhere Korrelation mit konventionellen Leukozytenzählungen von venösem Blut, das entweder auf Whatman-Protein-Saver-Karten (r = 0,86) oder Mitra-Mikrosamplern (r = 0,84) getrocknet wurde (Figur 5B). Außerdem galt dies auch für Kapillarblut, das auf Whatman-Papier getrocknet wurde (r = 0,80). Durch die Kombination von Schätzungen der Leukozytenzahlen mit relativen Zählungen auf der Grundlage zelltypspezifischer DNAm konnten die absoluten Zahlen für jede der Leukozytenuntergruppen berechnet werden. Für jeden Zelltyp konnte eine klare Korrelation zwischen den herkömmlichen absoluten Zellzahlen und den epigenetischen Schätzungen festgestellt werden (Figur 5C). Zusammenfassung Mit Hilfe des neuen erfindungsgemäßen Verfahrens können epigenetische Leukozytenzählungen durch eine umfassende Auswahl zelltypspezifischer Kandidaten-CpGs und optimierte ddPCR-Assays weiter verbessert werden. Die Ergebnisse übertrafen die Präzision früherer Modelle, die auf verschiedenen CpGs und Messungen mit Pyrosequenzierung basieren (17). Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass getrocknete Blutflecken, die durch einen Stich in den Finger gewonnen wurden, für erfindungsgemäße epigenetische Leukozytenzählungen verwendet werden können. Für die Auswahl der Kandidaten-CpGs wurde ein sehr großer Datensatz von DNAm-Profilen zusammengestellt (1303 zelltypspezifische DNAm-Profile von 726 Spendern, die aus 40 verschiedenen Studien stammen). Im Gegensatz dazu basierte die frühere Auswahl von zelltypspezifischen CpGs auf DNAm-Profilen von nur 6 Spendern (19). In einer anderen Studie konzentrierten sich Baron und Mitarbeiter zunächst auf funktionell relevante Gene, um CpG-Kandidaten auszuwählen, insbesondere für CD4-T-Zellen (CD4-Gen) und CD8-T-Zellen (CD8B-Gen) (14). Bemerkenswert ist, dass trotz der sehr unterschiedlichen Selektionsansätze eine Kandidaten-CpG für CD8-T-Zellen (cg04329870) ebenfalls in dieser CD8B-Region gefunden wurde. Außerdem analysierten sie sortierte Zellen von 2 Spendern, um zelltypspezifische CpGs für B-Zellen, NK- Zellen und Granulozyten zu identifizieren (14). Bemerkenswerterweise wurde auch eine CpG-Kandidat für NK-Zellen (cg05355684) in ihrer Arbeit ausgewählt. In jüngerer Zeit haben die Erfinder zelltypspezifische CpGs für HSPCs, die auf der Grundlage von DNAm-Profilen von CD34⁺ Zellen von fünf Spendern identifiziert wurden (25), im Vergleich zu DNAm-Profilen anderer sortierter Leukozyten-Untergruppen von 6 Spendern getestet (19). Auf dieser Grundlage wurden die wichtigsten Kandidaten-CpGs für HSPCs identifiziert (26). Obwohl die HPSCs in der aktuellen Studie nicht validiert haben, da CD34⁺ Zellen im normalen peripheren Blut kaum nachgewiesen werden können, gab es eine auffällige Überschneidung von zwei der drei Top-CpGs in den verschiedenen Auswahlen: SP140 (cg17607231) und CD48 (cg13311440) wurden auch in dieser unabhängigen Auswahl identifiziert und korrelierten mit CD34⁺ Zellen in mobilisiertem peripherem Blut und Blastenzahlen bei Leukämie (26). Die Feststellung, dass verschiedene Studien dieselbe genomische Region oder sogar genau dieselben CpGs auswählen, deutet darauf hin, dass genomische Regionen mit gut geeigneten Kandidaten-CpGs für zelltypspezifische DNAm begrenzt sein könnten. Für eine systematischere Auswahl der Top-Kandidaten-CpGs wurde die neue CimpleG-Pipeline verwendet (20). Die DNA von Nicht-Leukozyten-Zelltypen wurde nicht berücksichtigt, da sich die erfindungsgemäße Anwendung speziell auf die Analyse von Blut konzentriert. Es ist zwar theoretisch möglich, dass Hautzellen, Endothelzellen oder sogar zellfreie DNA die Vorhersagen beeinflussen (8, 9, 27), jedoch stammt die überwiegende Mehrheit der DNA im Blut eindeutig aus Leukozyten. Bemerkenswert ist, dass einige der ausgewählten CpGs bei den ddPCR-Messungen keine klare Korrelation mit der Zellzahl aufwiesen (PPM1F und TOP1MT für Monozyten, LCN8 für B-Zellen und PLXND1 für NK-Zellen). Somit lieferten entweder die Sondensätze des Illumina BeadChip-Arrays oder die entsprechenden ddPCR-Assays keine spezifischen oder genauen DNAm-Messungen. Über derartige Diskrepanzen zwischen Arrays und gezielten Assays wurde bereits berichtet (28, 29) und unterstreicht die Notwendigkeit, solche Biomarker zu validieren. Für gezielte DNAm-Messungen gibt es mehrere Methoden (18). In früheren Arbeiten basierten epigenetische Blutbilder hauptsächlich auf der Pyrosequenzierung (17, 19), während Baron et al. ihre Tests auf der Grundlage von methylierungsspezifischer qPCR durchgeführt haben (14). Es hat sich gezeigt, dass die DNAm-Konzentrationen bei Messungen mit Pyrosequenzierung und qPCR erheblich variieren können (30). Es ist davon auszugehen, dass die verbesserte Präzision der epigenetischen Blutwerte in der aktuellen Studie teilweise auf die Verwendung der ddPCR zurückzuführen ist. Im Gegensatz zur qPCR gibt es bei der ddPCR weniger PCR-Verzerrungen für methylierte oder nicht-methylierte Sequenzen, da einzelne Tröpfchen nur als positiv oder negativ klassifiziert werden (31). Tatsächlich wurde für epigenetische Schätzungen von CD3-T-Lymphozyten gezeigt, dass ddPCR eine höhere Präzision und größere Genauigkeit bietet, insbesondere bei Proben mit niedrigen Kopienzahlen der Zielgene (32, 33). Ein großer Vorteil des epigenetischen Blutbildes besteht darin, dass die Blutproben mit einem einfachen Fingerstich entnommen und als getrocknete Blutpunkte versandt werden können. Dies erleichtert Selbsttests ohne geschultes medizinisches Personal - z. B. für ältere Patienten, die nur schwer einen Arzt aufsuchen können. Außerdem ist die Methode für das Neugeborenen- Screening auf schwere kombinierte Immundefekte geeignet (14, 34). Andere klinisch relevante Beispiele sind die Zählung von CD4-T-Zellen während einer HIV-Infektion (14) oder die Überwachung einer Neutropenie nach einer Chemotherapie. Hier wurden zwei alternative Probenahmegeräte für getrocknetes Blut getestet. Filterpapier, wie z. B. Whatman-Protein-Saver- Karten, werden häufig verwendet und sind kostengünstiger, während Mikroprobennehmer, wie z. B. Mitra-Mikrosampler, ein definierteres Blutvolumen entnehmen können. Überraschenderweise waren in den durchgeführten Experimenten die epigenetischen Zellzahlen mit Whatman-Protein-Saver-Karten präziser, was auf eine weniger effiziente DNA-Isolierung aus den Mitra-Spitzen zurückzuführen sein könnte. Obwohl die Schätzungen aus getrocknetem Blut vielversprechend sind, gibt es noch Einschränkungen und Herausforderungen, die angegangen werden müssen, bevor die Methode in der klinischen Anwendung eingesetzt werden kann. 1) Eine Einschränkung besteht darin, dass Erythrozyten und Thrombozyten nicht berücksichtigt werden können, da sie keine genomische DNA enthalten.2) Eine besondere Herausforderung für epigenetische Blutbilder ist der Nachweis seltener Zelltypen (<5 %) oder eng verwandter Zelltypen, da ihre unterschiedliche DNA-Methylierung nur einen geringen Einfluss auf die mittleren Methylierungswerte in der Massen-DNA hat.3) Die Methode ist relativ zeitaufwendig. Mit dem derzeitigen Protokoll beträgt die Durchlaufzeit etwa 2 Tage, da die Bisulfit-Konvertierung über Nacht (12-16 Stunden) erfolgt. Mit alternativen Bisulfit-Konversionsverfahren, die direkt auf Blut anwendbar sind, kann der gesamte Arbeitsablauf jedoch auf etwa 8 Stunden reduziert werden.4) Für eine absolute Quantifizierung, insbesondere bei getrocknetem Blut, muss die Effizienz der DNA-Extraktion verbessert werden. Hier wurde die Variabilität der DNA-Isolationseffizienz mit einem Referenzplasmid angegangen, aber seine Stabilität bei definierter Konzentration muss noch in unabhängigen Kohorten weiter validiert werden.5) Obwohl in gesunden Kohorten und bei Patienten kein signifikanter Einfluss auf die epigenetischen Blutwerte beobachtet werden konnte, kann die epigenetische Zusammensetzung durch spezifische Krankheiten - insbesondere Leukämie - beeinflusst werden. (16). Außerdem kann es zu Abweichungen zwischen Proben von Kindern und Erwachsenen kommen. Daher muss die Methode speziell für bestimmte klinische Anwendungen validiert werden.6) Nicht zuletzt sind auch regulatorische Hürden zu überwinden. Die Biomarker müssen gemäß den lokalen behördlichen Anforderungen validiert und akkreditiert werden - in Europa gemäß der neuen Richtlinie für In-vitro-Diagnostika (35). Im Allgemeinen sollte es machbar sein, diese anspruchsvollen Anforderungen zu erfüllen, da ähnliche Verfahren klinisch zugelassen sind, die Instrumente für die DNA-Isolierung und die ddPCR bereits CE-zertifiziert sind und die erforderliche Analysesoftware, die in diesem Fall auf relativ einfachen linearen Regressionsmodellen beruht, ebenfalls entsprechend zertifiziert werden konnte. Trotz dieser Einschränkungen und Herausforderungen hat diese Studie gezeigt, dass die epigenetische Leukozytenzählung mittels ddPCR eine genaue Alternative für kryokonserviertes Blut oder getrocknetes Blut aus der Fingerbeere darstellt. In einer kürzlich durchgeführten Studie konnte bezüglich möglicher Abweichungen zwischen Proben von Kindern und Erwachsenen ferner gezeigt werden, dass das erfindungsgemäße Verfahren auch bei Blutproben von Kindern zuverlässig angewendet werden kann und somit auch für pediatrische Anwendungen geeignet ist (36).

Tabelle 3: Weitere für die ddPCR verwendete Primer und Sonden (siehe auch Tabelle 2). Gen, cg… Primer/Sonde Sequenz, SEQ ID NR:[…] PPM1F Vorwärts-Primer GTTTAGTTTAGATTTTGTTTAGGAAAGG [61] ] Q1 AT cg17117981 Rückwärts-Primer AAACAAAAATTAATCAAACACC [66] 6-FAM- Sonde nicht TGTGAGGTTTTTTTTTGATTGTTTTTTTTT - methyliert BHQ1 [67] HEX - TGTGAGGTTCGTTTTTGATTGTTTG - Sonde methyliert BHQ1 [68] LRP5 Vorwärts-Primer GTTTTTTAGGTTGTAGGTGTTTATTG [69] ] cg14482811 Rückwärts-Primer CACCCCACATAACACTTATTTT [74] Sonde nicht 6-FAM- AGTGTTGGAGGTTTTGGTTTGTTG - methyliert BHQ1 [75] HEX - TGTTGGAGGTTTTGGTTCGTTGT - Sonde methyliert BHQ1 [76] CD8A Vorwärts-Primer TGATGATGGTTAGATTTGGGG [77] GTT T - cg04329870 Rückwärts-Primer AACTCCTTCAAACCCTAAACC [82] Sonde nicht 6-FAM- TTTAGTTATGGAGGTTTTTGAGTGT - methyliert BHQ1 [83] HEX - TAGTTATGGAGGTTTTCGAGTGT -BHQ1 Sonde methyliert [84] cg21333217 Rückwärts-Primer ACTAACCTTACCCAACTACAA [90] 6-FAM- Sonde nicht TGTTTTTTAGTTATTGTGTAGGTTTTTAT - methyliert BHQ1 [91] HEX - TTTTTAGTTATCGCGTAGGTTTT -BHQ1 Sonde methyliert [92] AG R5-Referenz Vorwärts-Primer 5'-GTTTCCACACACAGAGGAAGTAG-3' [97] Rückwärts-Primer 5'-ACGGGATGAGGAGATTTTAAGCC-3' [98] Sonde 5' 6-FAM- TGGCTGGCAGAGACCCAGGA - 3' genomische DNA BHQ-1 [99] Sonde Plasmid- 5' HEX - TGGCTGCGAGAGACCGAGGA - 3' DNA BHQ-1 [100]

Tabelle 4: Einfache lineare Regressionsmodelle für epigenetische Schätzungen der relativen Leukozytenzahl Cell Dyn Emerald - Sysmex XS800i-Messungen bei Messungen von gesunden Patienten mit hämatologischen Zelltyp Spendern Erkrankungen Granulozyten 82,0817 - 0,9072*DNAm 98,7825 - 1,2030*DNAm Lymphozyten 10,6012 + 1,0541*DNAm 1,0172 + 1,1007*DNAm CD4-T- K.A. 58,2602 - 0,6056*DNAm Zellen B-Zellen K.A. 45,4241 - 0,4825*DNAm DNAm: DNA-Methylierung, ausgedrückt in Prozent (0 - 100) Tabelle 5: Sequenz im Referenzplasmid für die absolute Leukozytenquantifizierung mittels ddPCR Geklonte Sequenz AGTACCGAATTCGCTGAGTTTCCACACAGGAAGTAGGTGGAAAATTTGACAA AACTCTGGAGATGGCTGCGAGACCGAGGAAAAATTAAATTATCTCCAGATTTG AGTTTTTCTGGTAGAGGCTTAAAATCTCCTCATCCCGTTGCATGGATCCCCAT GA [SEQ ID NR: 101] Literatur: 1. Pitoiset F, Cassard L, El Soufi K, Boselli L, Grivel J, Roux A, et al. Deep phenotyping of immune cell populations by optimized and standardized flow cytometry analyses. Cytometry A 2018;93:793-802. 2. 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Claims

RWTH Aachen 23521WO Patentansprüche 1. Verfahren zur Bestimmung zumindest eines Teils der zellulären Zusammensetzung mindestens einer biologischen Probe, die Leukozyten umfasst, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst: - Identifizieren von DNA-Methylierungsgraden von mindestens einer Region der genomischen DNA in der Probe, wobei die spezifische Region mindestens ein CpG-Dinukleotid umfasst, und wobei die spezifische Region mindestens eine Nukleotidsequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus cg22381196 (DHODH), cg12483340 (TMEM87A), cg06270401 (DYRK4), cg23054181 (FAM169BP), cg26076724 (RP11- 146I2.2), cg12249234 (KSR1), cg04468741 (MICAL2), cg05074138 (CTLA4), cg05705140 (LINC01237), cg15564619 (SKI), cg11531557 (HMBOX1), cg02212339 (TRPV1), cg22488278 (ZFYVE28), cg02240030 (MAD1L1) und cg24408769 (JARID2) ausgewählt ist; und - Bestimmen des Anteils mindestens eines Leukozytentyps basierend auf den identifizierten Methylierungsgraden, um die relative Verteilung dieses Leukozytentyps in der Probe vorherzusagen, wobei - der Methylierungsgrad mindestens eines CpG-Dinukleotids, das aus der Gruppe bestehend aus den CpG-Dinukleotiden cg22381196 (DHODH), cg12483340 (TMEM87A), cg06270401 (DYRK4) und mindestens einem CpG-Dinukleotid, das sich innerhalb einer Region von 1.000 Nukleotiden stromaufwärts und/oder stromabwärts von jeweils einem der genannten CpG-Dinukleotide befindet, ausgewählt ist, den Anteil an Granulozyten anzeigt, - der Methylierungsgrad des CpG-Dinukleotids cg04468741 (MICAL2) oder mindestens eines CpG-Dinukleotids, das sich innerhalb einer Region von 1.000 Nukleotiden stromaufwärts und/oder stromabwärts von dem genannten CpG-Dinukleotid befindet, den Anteil an Monozyten anzeigt, - der Methylierungsgrad mindestens eines CpG-Dinukleotids, das aus der Gruppe bestehend aus den CpG-Dinukleotiden cg23054181 (FAM169BP), cg26076724 (RP11-146I2.2), cg12249234 (KSR1) und 2 mindestens einem CpG-Dinukleotid, das sich innerhalb einer Region von 1.000 Nukleotiden stromaufwärts und/oder stromabwärts von jeweils einem der genannten CpG-Dinukleotide befindet, ausgewählt ist, den Anteil an Lymphozyten anzeigt, - der Methylierungsgrad des CpG-Dinukleotids cg02212339 (TRPV1) oder mindestens eines CpG-Dinukleotids, das sich innerhalb einer Region von 1.000 Nukleotiden stromaufwärts und/oder stromabwärts von dem genannten CpG-Dinukleotid befindet, den Anteil an B-Zellen anzeigt, - der Methylierungsgrad mindestens eines CpG-Dinukleotids, das aus der Gruppe bestehend aus den Dinukleotiden cg05074138 (CTLA4), cg15564619 (SKI), cg05705140 (LINC01237) und mindestens einem CpG-Dinukleotid, das sich innerhalb einer Region von 1.000 Nukleotiden stromaufwärts und/oder stromabwärts von jeweils einem der genannten CpG-Dinukleotide befindet, ausgewählt ist, den Anteil an CD4⁺ - T-Zellen anzeigt, - und der Methylierungsgrad des CpG-Dinukleotids cg11531557 (HMBOX1) oder mindestens eines CpG-Dinukleotids, das sich innerhalb einer Region von 1.000 Nukleotiden stromaufwärts und/oder stromabwärts von dem genannten CpG-Dinukleotid befindet, den Anteil an CD8⁺ - T-Zellen anzeigt, und - der Methylierungsgrad mindestens eines CpG-Dinukleotids, das aus der Gruppe bestehend aus den Dinukleotiden cg22488278 (ZFYVE28), cg02240030 (MAD1L1), cg24408769 (JARID2) und mindestens einem CpG-Dinukleotid, das sich innerhalb einer Region von 1.000 Nukleotiden stromaufwärts und/oder stromabwärts von jeweils einem der genannten CpG-Dinukleotide befindet, ausgewählt ist, den Anteil an NK-Zellen anzeigt. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sich mindestens ein CpG-Dinukleotid innerhalb einer Region von 500, 400, 300, 200 oder 100 Nukleotiden stromaufwärts und/oder stromabwärts von jeweils einem der genannten CpG-Dinukleotide cg22381196, cg12483340, cg06270401, cg23054181, cg26076724, cg12249234, cg04468741, cg05074138, 3 cg05705140, cg15564619, cg11531557, cg02212339, cg22488278, cg02240030 und cg24408769 befindet. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe mit einem Volumen von höchstens oder weniger als 50 µl, höchstens oder weniger als 40 µl, höchstens oder weniger als 30 µl, höchstens oder weniger als 20 µl, höchstens oder weniger als 10 µl, 10 – 40 µl, 10 – 30 µl, 10 – 20 µl, 20 – 40 µl, 30 – 40 µl, 20 – 30 µl, 10 – 20 µl, 25 – 35 µl oder vorzugsweise 30 µl bereitgestellt wird. 4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die biologische Probe Blut, Knochenmark, Liquor und/oder ein anderes, Leukozyten-haltiges Gewebe umfasst. 5. Verwendung mindestens eines künstlichen Nukleinsäuremoleküls zur Bestimmung zumindest eines Teils der zellulären Zusammensetzung einer biologischen Probe, die Leukozyten umfasst, nach dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, bei der das Nukleinsäuremolekül mindestens eine Nukleotidsequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: a) Einer Nukleotidsequenz, die aus der Gruppe bestehend aus der SEQ ID NR: 1, SEQ ID NR: 2, SEQ ID NR: 3 und SEQ ID NR: 4 ausgewählt ist, zur Bestimmung des Anteils an Granulozyten; b) einer Nukleotidsequenz, die aus der Gruppe bestehend aus der SEQ ID NR: 5, SEQ ID NR: 6, SEQ ID NR: 7 und SEQ ID NR: 8 ausgewählt ist, zur Bestimmung des Anteils an Granulozyten; c) einer Nukleotidsequenz, die aus der Gruppe bestehend aus der SEQ ID NR: 9, SEQ ID NR: 10, SEQ ID NR: 11 und SEQ ID NR: 12 ausgewählt ist, zur Bestimmung des Anteils an Granulozyten; d) einer Nukleotidsequenz, die aus der Gruppe bestehend aus der SEQ ID NR: 13, SEQ ID NR: 14, SEQ ID NR: 15 und SEQ ID NR: 16 ausgewählt ist, zur Bestimmung des Anteils an Monozyten; e) einer Nukleotidsequenz, die aus der Gruppe bestehend aus der SEQ ID NR: 17, SEQ ID NR: 18, SEQ ID NR: 19 und SEQ ID NR: 20 ausgewählt 4 ist, zur Bestimmung des Anteils an Lymphozyten; f) einer Nukleotidsequenz, die aus der Gruppe bestehend aus der SEQ ID NR: 21, SEQ ID NR: 22, SEQ ID NR: 23 und SEQ ID NR: 24 ausgewählt ist, zur Bestimmung des Anteils an Lymphozyten; g) einer Nukleotidsequenz, die aus der Gruppe bestehend aus der SEQ ID NR: 25, SEQ ID NR: 26, SEQ ID NR: 27 und SEQ ID NR: 28 ausgewählt ist, zur Bestimmung des Anteils an Lymphozyten; h) einer Nukleotidsequenz, die aus der Gruppe bestehend aus der SEQ ID NR: 29, SEQ ID NR: 30, SEQ ID NR: 31 und SEQ ID NR: 32 ausgewählt ist, zur Bestimmung des Anteils an B-Zellen; i) einer Nukleotidsequenz, die aus der Gruppe bestehend aus der SEQ ID NR: 33, SEQ ID NR: 34, SEQ ID NR: 35 und SEQ ID NR: 36 ausgewählt ist, zur Bestimmung des Anteils an CD4⁺ - T-Zellen; j) einer Nukleotidsequenz, die aus der Gruppe bestehend aus der SEQ ID NR: 37, SEQ ID NR: 38, SEQ ID NR: 39 und SEQ ID NR: 40 ausgewählt ist, zur Bestimmung des Anteils an CD4⁺ - T-Zellen; k) einer Nukleotidsequenz, die aus der Gruppe bestehend aus der SEQ ID NR: 41, SEQ ID NR: 42, SEQ ID NR: 43 und SEQ ID NR: 44 ausgewählt ist, zur Bestimmung des Anteils an CD4⁺ - T-Zellen; l) einer Nukleotidsequenz, die aus der Gruppe bestehend aus der SEQ ID NR: 45, SEQ ID NR: 46, SEQ ID NR: 47 und SEQ ID NR: 48 ausgewählt ist, zur Bestimmung des Anteils an CD8⁺ - T-Zellen; m)einer Nukleotidsequenz, die aus der Gruppe bestehend aus der SEQ ID NR: 49, SEQ ID NR: 50, SEQ ID NR: 51 und SEQ ID NR: 52 ausgewählt ist, zur Bestimmung des Anteils an NK-Zellen; n) einer Nukleotidsequenz, die aus der Gruppe bestehend aus der SEQ ID NR: 53, SEQ ID NR: 54, SEQ ID NR: 55 und SEQ ID NR: 56 ausgewählt ist, zur Bestimmung des Anteils an NK-Zellen; o) einer Nukleotidsequenz, die aus der Gruppe bestehend aus der SEQ ID NR: 57, SEQ ID NR: 58, SEQ ID NR: 59 und SEQ ID NR: 60 ausgewählt ist, zur Bestimmung des Anteils an NK-Zellen; p) einer Nukleotidsequenz, die sich von einer der Nukleotidsequenzen gemäß a) bis o) durch den Austausch von höchstens 10 % der Nukleotide, vorzugsweise höchstens 5 % der Nukleotide, unterscheidet; und 5 q) einer Nukleotidsequenz, die dem komplementären Strang einer der Nukleotidsequenzen gemäß a) bis p) entspricht.