EP4743218A1 - Dispositif microfluidique d'étude et/ou de manipulation d'un milieu d'étude et/ou d'au moins un micro-objet - Google Patents

Dispositif microfluidique d'étude et/ou de manipulation d'un milieu d'étude et/ou d'au moins un micro-objet

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EP4743218A1
EP4743218A1 EP24742928.5A EP24742928A EP4743218A1 EP 4743218 A1 EP4743218 A1 EP 4743218A1 EP 24742928 A EP24742928 A EP 24742928A EP 4743218 A1 EP4743218 A1 EP 4743218A1
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EP
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study
chamber
deformation
micro
medium
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Pending
Application number
EP24742928.5A
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English (en)
Inventor
Charles Baroud
Shreyansh Jain
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Centre National de la Recherche Scientifique
École Polytechnique
Institut Pasteur
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique
École Polytechnique
Institut Pasteur
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Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique, École Polytechnique, Institut Pasteur filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique
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Abstract

L'invention concerne un dispositif microfluidique (10) comportant: - un support (20) comportant un substrat (25) en un matériau élastiquement déformable, - une chambre d'étude (30, 30a, 30b) s'étendant dans le support (20) présentant au moins une paroi supérieure (32) formée au moins partiellement par le substrat (25), au moins une paroi inférieure (34) et au moins deux parois latérales (33), - au moins une chambre de déformation (40, 40a, 40b) du substrat formée au moins partiellement par le substrat (25), indépendante fluidiquement de la chambre d'étude (30, 30a, 30b) et s'étendant au moins partiellement dans le support (20) au moins partiellement le long d'une des parois latérales (33) de la chambre d'étude (30), le dispositif étant configuré pour que la déformation de la chambre de déformation (40, 40a, 40b) génère l'application d'une contrainte mécanique d'au moins une partie de la paroi supérieure (32) dans la chambre d'étude (30).

Description

Description
Titre : Dispositif microfluidique d’étude et/ou de manipulation d’un milieu d’étude et/ou d’au moins un micro-objet.
La présente invention concerne un dispositif microfluidique d’étude et/ou de manipulation d’un milieu d’étude et/ou d’un micro-objet dans une chambre d’étude présentant au moins une paroi supérieure élastiquement déformable. L’invention se rapporte également à un procédé d’étude et/ou de manipulation d’au moins un micro-objet à l’aide du dispositif microfluidique.
Domaine technique
Il existe aujourd’hui différentes méthodes pour manipuler mécaniquement et caractériser des micro-objets, en particulier des cellules individuelles ou des agrégats cellulaires. Ces méthodes trouvent notamment leur utilisation dans le domaine de la mécano- biologie. Ces méthodes sont par exemple utilisées pour caractériser des propriétés mécaniques ou pour analyser les réactions à des stimulus mécaniques des objets.
Technique antérieure
Les méthodes connues dans ce domaine sont par exemple l’aspiration par micropipette, la microscopie à force atomique ou la compression par plaques parallèles déplacées entre elles mécaniquement. De nombreux dispositifs ont été utilisés pour des études en deux dimensions. De tels dispositifs ne permettent de caractériser qu’un unique objet à la fois et sont compliqués à mettre en œuvre. De plus, l’analyse optique, notamment dans le cas des deux plaques parallèles peut être complexe.
Par ailleurs, il existe aujourd’hui de nombreux types de dispositifs microfluidiques permettant de réaliser différentes opérations, notamment de contrôle ou manipulation de fluides en petit volume, typiquement à l’échelle du microlitres ou moins, et/ou d’objets de petites tailles, typiquement à l’échelle millimétrique ou moins, dans un fluide.
Il est notamment connu de l’article Y.-J. Liu et al., “Confinement and Low Adhesion Induce Fast Amoeboid Migration of Slow Mesenchymal Cells f Cell, vol. 160, no. 4, pp. 659-672, Feb. 2015, doi: 10.1016/j.cell.2015.01.007 un dispositif microfluidique comportant une chambre présentant une zone centrale de compression de hauteur réduite avec une paroi supérieure rigide et une zone périphérique pouvant être mise en pression ou dépression de sorte à contrôler la montée ou descente de la paroi rigide dans la zone centrale. Cela permet notamment de confiner les cellules dans des compartiments qui se forment lorsque la paroi rigide est en position basse. Un tel dispositif n’est décrit que pour l’étude de cellules uniques et nécessite une bonne dispersion des cellules dans la zone centrale. De plus, la continuité fluidique entre la zone centrale et la zone périphérique ne permet pas l’utilisation d’un tel dispositif avec un flux de fluide dans la chambre ni de multiplexer plusieurs chambres.
Il est connu de la demande internationale W02020084148 un dispositif microfluidique comportant une chambre de réception d’un matériel à stimuler mécaniquement et une rangée de chambres de compression séparées de la chambre de réception par une membrane élastique. Les chambres de compression sont pressurisées indépendamment les unes des autres et sont liées entre elles par un séparateur de chambre. Dans ce dispositif, la chambre de réception est déformée par la déformation directe de la membrane par les chambres de compression. Une pression positive dans une chambre de compression entraîne une réduction du volume de la chambre de compression par déformation de la membrane vers la chambre de réception et inversement. Un tel dispositif, de par la présence d’une membrane élastique fine entre la chambre de réception et les chambres de compression est compliqué à fabriquer et fragile. De plus, la plage de compression atteignable est limitée. De plus la déformation est localisée dans les régions proches de la membrane élastique et ne sont pas transmises à des objets plus loin dans le microcanal.
Il existe donc un besoin d’un dispositif microfluidique de fabrication simple, peu coûteux, facile d’utilisation et présentant une grande versatilité d’application permettant l’application d’une action mécanique sur un objet afin notamment d’en déterminer des propriétés mécaniques ou de réponse à un stimulus mécanique.
Tout particulièrement, il existe un besoin de dispositifs susceptibles d’être adaptés à l’étude de matériels biologiques complexes et hétérogènes, tels que des tissus cancéreux dont il est notoire qu’ils présentent des propriétés mécaniques distinctes, et peuvent notamment être formés de plusieurs types cellulaires ou des échantillons de biopsies issues de tissu fibreux, qui présente une anisotropie sans réponse mécanique.
A cet égard, il existe un besoin particulier, notamment dans le domaine pharmaceutique ou diagnostique, de dispositifs susceptibles de caractériser une structure hétérogène, telle qu’une biopsie. Il existe également un besoin particulier de dispositifs aptes à une pratique en haut-débit et/ou multiplexe.
L’invention a pour objet de satisfaire ces besoins.
Exposé de l’invention
L’invention répond à ce besoin par un dispositif microfhiidique comportant:
- un support comportant un substrat en un matériau élastiquement déformable,
- une chambre d’étude s’étendant dans le support présentant au moins une paroi supérieure formée au moins partiellement, de préférence totalement, par le substrat, au moins une paroi inférieure et au moins deux parois latérales,
- au moins une chambre de déformation du support formée au moins partiellement parle substrat, indépendante fluidiquement de la chambre d’étude et s’étendant au moins partiellement dans le support au moins partiellement le long d’une des parois latérales de la chambre d’étude, le dispositif étant configuré pour que la déformation de la chambre de déformation génère l’application d’une contrainte mécanique d’au moins une partie de la paroi supérieure de la chambre d’étude dans la chambre d’étude, notamment par déformation de la paroi supérieure.
Les notions spatiales telles que « supérieure » ou « latérale » sont à comprendre en relation les unes par rapport aux autres. H est bien entendu compris que le dispositif peut s’orienter dans toutes les directions et qu’il existe une orientation du dispositif ayant les caractéristiques d’orientation ci-dessus.
Par « en un matériau élastiquement déformable », on comprend que le substrat présente une capacité de déformation réversible par application d’une force. De préférence, le module de Young du substrat est inférieur ou égal à 1 GPa, mieux inférieur ou égal à 0,1 GPa.
Le fait que la chambre d’étude et la chambre de déformation soit agencées au moins partiellement latéralement l’une par rapport à l’autre permet de faciliter la fabrication et de limiter le coût. L’utilisation d’un simple moule est possible. Il n’y a pas besoin d’une membrane fine qui pourrait fragiliser la structure ou compliquer sa fabrication.
Dans l’invention, la déformation de la chambre de déformation est possible car elle est formée au moins partiellement par le substrat élastiquement déformable. Une telle déformation de la chambre de déformation génère dans le substrat des contraintes de déformation locale dans le volume du substrat, notamment au niveau de la paroi supérieure de la chambre d’étude formée par le substrat et entraîne l’application d’une contrainte locale de la paroi supérieure dans la chambre d’étude. La contrainte de la paroi supérieure dans la chambre d’étude est donc obtenue indirectement par la déformation de la chambre de déformation et dépend des contraintes de déformation locales dans le substrat générées par la déformation de la chambre de déformation.
Un tel dispositif permet l’étude et/ou la manipulation d’un fluide, gel et/ou micro-objet dans la chambre d’étude par action mécanique de la paroi supérieure dans la chambre d’étude qui est simple à mettre en œuvre et à moindre coût par une simple déformation de la chambre de déformation. De plus, les dimensions de la chambre d’étude accessibles permettent d’avoir grande quantité d’objets d’un échantillon simultanément dans la chambre d’étude, ce qui permet une étude ou manipulation de plusieurs micro-objets simultanément que ce soit des micro-objets en deux dimensions du type cellules uniques ou en trois dimensions du type agrégat.
Le positionnement latéral permet également une observation facile de la chambre d’étude par le dessus ou le dessous perpendiculairement à la paroi supérieure et l’observation de l’effet de la contrainte sur un fluide, gel et/ou micro-objet dans cet axe, notamment par microscopie et la taille du dispositif est également particulièrement adaptée à une telle utilisation.
La structure simple de ce dispositif permet d’avoir une grande adaptabilité du dispositif pour un grand nombre d’application, notamment par simple choix des formes, structures et dimensions des chambre d’étude et de déformation, par la précision de contrôle de la contrainte générée par la paroi supérieure, notamment par le contrôle de la pression appliquée dans la chambre de déformation, par l’adaptabilité d’un milieu d’étude pour une stimulation directe ou indirecte des fluides, gels et/ou micro-objets et par la simplicité d’utilisation du dispositif.
Le terme « pression » désigne ici en particulier une pression manométrique, c’est-à-dire une pression par rapport à la pression de l’air ambiant. Ainsi, une pression de - 600 mbar indique que la pression de la chambre de pression est de 600 mbar en dessous de la pression de l’air ambiant, par exemple 600 mbar en dessous de la pression atmosphérique (1,01321 bar). En général, la pression d’air ambiant peut être la pression d’air atmosphérique. Cependant, le dispositif peut fonctionner dans un environnement sous pression, tel qu’une salle à haute pression, dans laquelle la pression ambiante est, par exemple, environ le double de la pression atmosphérique (2,02642 bar). Le terme « pression » peut désigner ici à la fois des pressions positives et négatives. Le terme « pression positive » se rapporte à une pression supérieure à la pression ambiante. De même, le terme « pression négative » désigne une pression inférieure à la pression ambiante. Il est clair pour l’homme du métier que la valeur absolue de la dépression ne peut pas dépasser la pression ambiante. Il est également clair pour l’homme du métier que différentes pressions seront sélectionnées pour différents matériaux, c’est-à-dire que plus le matériau est rigide, plus la pression peut être nécessaire pour atteindre une déformation de matériau souhaitée (et vice versa). Par exemple, pour un matériau ayant une rigidité comparable au PDMS, la pression peut être choisie dans la plage de +1000 à -1000 mbar (par rapport à la pression ambiante), mieux dans la plage de -100 à -800 mbar.
Un tel dispositif permet l’application de stimulus mécanique(s) sur un milieu d’étude et/ou un ou plusieurs micro-objets. Un tel dispositif peut permettre de générer des stimulus mécaniques, par exemple une ou plusieurs séquences de stimulus mécaniques.
Contrainte mécanique
Dans certains modes de réalisation, le dispositif est configuré pour que la déformation de la chambre de déformation génère une déformation de la paroi supérieure de la chambre d’étude dans le sens d’une augmentation de volume ou d’une diminution de volume de la chambre d’étude, la contrainte mécanique exercée par la paroi supérieure étant une contrainte de compression dans la sens d’une diminution de volume de la chambre d’étude, ou une contrainte de détente dans le sens d’une augmentation du volume de la chambre d’étude, ladite déformation de la paroi supérieure générant l’application d’une contrainte mécanique dans la chambre d’étude.
De préférence, le dispositif est configuré pour qu’une réduction de volume de la chambre de déformation, notamment par l’application d’une pression négative dans la chambre de déformation, génère une déformation de la paroi supérieure de la chambre d’étude dans le sens d’une réduction du volume, notamment une réduction de la hauteur, de la chambre d’étude et pour qu’une augmentation de volume de la chambre de déformation, notamment par l’application d’une pression positive dans la chambre de déformation, génère une déformation de la paroi supérieure de la chambre d’étude vers une augmentation du volume, notamment une augmentation de la hauteur de la chambre d’étude. La paroi supérieure peut prendre une forme courbe selon au moins une section transversale, mieux selon au moins deux sections transversales orthogonales, lorsque la chambre de déformation est déformée. La forme courbe peut être de forme convexe vers la chambre d’étude à réduction de volume de la chambre de déformation et de forme concave vers la chambre d’étude à augmentation de volume de la chambre de déformation. Une telle déformation facilite la mise en œuvre car la réduction de volume de la chambre d’étude se fait par application d’une pression négative qui est plus facile à maintenir dans un dispositif microfluidique, l’application d’une pression positive pouvant plus facilement générer une rupture du support notamment à la jonction entre plusieurs couches, notamment une plaque rigide et le substrat. Une déformation directe par une chambre de déformation tel que mentionnée dans les arts antérieurs précités irait dans le sens opposé car, dans ce cas, une augmentation de volume de la chambre de déformation génère une déformation de la chambre d’étude dans le sens d’une réduction de volume de la chambre d’étude.
De préférence, le dispositif est configuré pour que les parois latérales de la chambre d’étude ne se déforment pas d’une déformation supérieure à 5%, mieux supérieure à 3%, mieux ne se déforment substantiellement pas. Cela permet d’avoir une déformation uniquement sur la hauteur plus facilement contrôlable et plus efficace car comme expliqué précédemment une déformation latérale serait dans le sens inverse de la déformation de la paroi supérieure.
De préférence, le dispositif est configuré pour que la déformation de la paroi supérieure de la chambre d’étude vers l’intérieur de la chambre d’étude, à une pression dans la chambre de déformation comprise entre -100 et -800 mbar, soit supérieure ou égale à 10%, mieux supérieure ou égale à 20%, encore mieux supérieure ou égale à 40%, encore mieux supérieure ou égale à 60% de la hauteur de la chambre d’étude.
Dans certains modes de réalisation, le dispositif est configuré pour exercer une force, de préférence une force de compression, sur le contenu de la chambre d’étude, notamment sur le milieu d’étude et/ou un ou plusieurs micro-objets. Une telle force peut générer un stimulus sur le milieu d’étude et/ou le ou les micro-objets.
Unité de contrôle
De préférence, le dispositif comporte une unité de contrôle de la déformation de la chambre de déformation, notamment par application d’une pression positive ou négative dans la chambre de déformation, reliée fluidiquement à la chambre de déformation, notamment par un canal. L’unité de contrôle de la déformation peut être configurée pour appliquer une pression négative dans la chambre de déformation du substrat. L’unité de contrôle peut être une source de pression programmable.
Le canal reliant l’unité de contrôle à la chambre de déformation peut s’étendre au moins partiellement dans le substrat.
La chambre de déformation peut être remplie d’un fluide, l’unité de contrôle étant un contrôleur de la quantité de fluide dans la chambre de déformation dans le cas d’une chambre de déformation à une seule entrée ou un contrôleur de flux en entrée et/ou en sortie pour une chambre de déformation comportant une entrée et une sortie de fluide.
De préférence, la chambre de déformation est remplie d’un gaz et la pression du gaz dans la chambre de déformation est contrôlée par l’unité de contrôle, l’unité de contrôle étant un contrôleur de pression du gaz dans la chambre de déformation. En variante, la chambre de déformation est remplie d’un liquide et la quantité de liquide dans la chambre de déformation est contrôlée par l’unité de contrôle, la pression dans la chambre de déformation dépend de la quantité de liquide présente dans la chambre de déformation ou des flux en entrée et sortie de la chambre de déformation.
Chambre d’étude
Le dispositif peut comporter un canal d’alimentation de la chambre d’étude, notamment donnant vers l’extérieur, pour alimenter la chambre d’étude un milieu d’étude et/ou un canal de sortie de la chambre d’étude pour extraire de la chambre d’étude le milieu d’étude.
La chambre d’étude peut comporter un ou plusieurs pièges capillaires sous formes de reliefs en saillies ou retraits s’étendant sur une des parois internes, notamment sur la paroi supérieure ou une paroi inférieure.
Le dispositif peut comporter une chambre additionnelle en amont et/ou en aval de la chambre d’étude, reliée fluidiquement à la chambre d’étude. La chambre additionnelle peut être d’une hauteur plus grande que la chambre d’étude.
Hors pression dans la chambre de déformation, la chambre d’étude peut être de section sensiblement polygonale, notamment rectangulaire. De préférence, la chambre d’étude présente un rapport de sa plus grande largeur à la base sur sa hauteur supérieur ou égal à 5, mieux supérieur ou égal à 8, encore mieux supérieur ou égal à 10.
La chambre d’étude peut présenter en section une hauteur constante.
La hauteur de la chambre d’étude peut être constante sur sa longueur. En variante, elle peut varier. Une telle variation sur la longueur peut permettre de classer des micro-objets selon leur taille ou de guider et faciliter le mouvement des micro-objets d’une extrémité à l’autre de la chambre d’étude.
De préférence, la hauteur de la chambre d’ étude est inférieure ou égale à 5 mm, mieux inférieure ou égale à 1 mm, encore mieux inférieure ou égale à 500 g m, encore mieux inférieure ou égale à 200 pm.
De préférence, la largeur de la chambre d’étude est inférieure ou égale à 5 cm, mieux inférieure ou égale à 3 cm, encore mieux inférieure ou égale à 1 cm, encore mieux inférieure ou égale à 3 mm.
La largeur de la chambre d’étude peut être constante sur toute la longueur de la chambre d’étude ou varier. Une variation de la largeur peut permettre de guider les microobjets dans la chambre d’étude ou de les classer selon leurs tailles.
Chambre de déformation
De préférence, la chambre de déformation s’étend dans le support en regard d’un plan défini par une des parois latérales de la chambre d’étude sur au moins une partie de la hauteur de la chambre d’étude. La chambre de déformation peut s’étendre en regard d’une des parois latérales sur une hauteur supérieure ou égale à 30%, mieux 50%, encore mieux 70%, encore mieux 80%, de la hauteur maximale de la chambre de déformation. La chambre de déformation peut s’étendre en regard d’une des parois latérales de la chambre d’étude sur toute sa hauteur. Le fait que la plus grande partie de la chambre de déformation s’étende en regard d’une des parois latérales permet de faciliter la fabrication et d’améliorer la déformation dans le sens décrit précédemment. En effet, une trop grande extension au-dessus de la chambre d’étude nuirait à la déformation recherchée décrite précédemment.
De préférence, la chambre de déformation s’étend sur une hauteur supérieure ou égale à celle de la chambre d’étude dans le substrat, le rapport de hauteur étant de préférence supérieur ou égal à 5, mieux supérieur ou égal à 10. Un tel rapport de hauteur permet d’avoir une bonne capacité de déformation de la paroi supérieure de la chambre d’étude. De préférence, la chambre de déformation présente une extension le long de la paroi supérieure de la chambre d’étude au-dessus de cette dernière une largeur inférieure ou égale à 50%, mieux à 40%, encore mieux à 30%, encore mieux à 20% de la largeur de la chambre d’étude ou ne présente pas de telle extension.
De préférence, la plus petite épaisseur de substrat entre la chambre d’étude et la chambre de déformation est supérieure ou égale à la hauteur de la chambre d’étude. De préférence, la plus petite épaisseur de substrat entre la chambre d’étude et la chambre de déformation est inférieure ou égale à 100 fois la hauteur de la chambre d’étude, mieux inférieure ou égale à 50 fois la hauteur de la chambre d’étude, mieux inférieure ou égale à 40 fois la hauteur de la chambre d’étude, encore mieux inférieure ou égale à 20 fois la hauteur de la chambre d’étude. Une telle épaisseur permet de limiter la déformation directe de la chambre d’étude par la chambre de déformation, ce qui irait dans le sens contraire de celui recherché, comme expliqué précédemment.
La largeur de la chambre déformation peut être inférieure ou égale à 5 cm, mieux inférieure ou égale à 3 cm, encore mieux inférieure ou égale à 1 cm.
La hauteur de la chambre de déformation peut être inférieure ou égale à 1 cm, mieux inférieure ou égale à 5 mm.
La chambre de déformation peut être sensiblement en forme de trapézoïde inversé, la base de la chambre de déformation étant formée par le petit côté du trapèze.
De préférence, la chambre de déformation contient de l’air. En variante, elle peut contenir un liquide et la déformation de la chambre de déformation peut dépendre de la pression de liquide dans la chambre de déformation comme expliqué précédemment.
Support
De préférence, le substrat est au moins partiellement transparent, mieux totalement transparent.
Le support peut comporter une base rigide en contact avec le substrat. De préférence, la base rigide est au moins partiellement transparente, mieux totalement transparente.
La base peut être en verre ou en un matériau plastique transparent. La base rigide peut être plane. En variante, la base est formée d’un puit d’une plaque multi -puit.
Selon un mode de réalisation, la base rigide forme au moins une paroi de la chambre de déformation. Selon un mode de réalisation non mutuellement exclusif, la base rigide forme au moins une paroi de la chambre d’étude. Selon un mode de réalisation non mutuellement exclusif, la base rigide forme au moins une paroi de la chambre de déformation et de la chambre d’étude.
La chambre de déformation et la chambre d’étude peuvent être délimitées totalement par le substrat et la base rigide. De préférence, elles sont formées dans le substrat et fermées à leur base par la base rigide plane. Une telle structure permet d’avoir une fabrication du dispositif fluidique facile par fabrication du substrat et des chambres dans le substrat, notamment par moulage, impression 3D ou tout autre technique, puis fixation du substrat sur la base rigide pour fermer les chambres.
En variante, elles sont formées partiellement par le substrat et par des surfaces en creux dans la base rigide. En variante encore, elles sont formées totalement dans le substrat.
Le substrat comporte un élastomère, notamment choisi parmi le PD MS, le Flexdym™, le latex, le caoutchouc, et tout autre élastomère et leurs mélanges. Le substrat peut comporter un agent de réticulation.
Le substrat peut être homogène dans son volume. En variante, le substrat peut comporter des zones de densité différentes ou des creux dans sa masse, notamment au niveau de la paroi supérieure. Cela peut permettre de contrôler la déformation du substrat et donc de la paroi supérieure selon une déformation prédéterminée.
Système d’analyse
Le dispositif microfluidique peut comporter ou être fonctionnellement couplé à un système d'analyse configuré pour analyser le dispositif microfluidique, en particulier la chambre d’étude, notamment le milieu d’étude ou le ou les micro-objets dans la chambre d’étude. Le système d'analyse peut être fonctionnellement couplé à l’unité de contrôle de la déformation de la chambre de déformation, en particulier le système d'analyse peut fournir un signal d'analyse à l’unité de contrôle. L’unité de contrôle peut commander la déformation de la ou des chambres de déformation en fonction du signal d'analyse.
Le système d’analyse dans la chambre d’étude peut comporter un système d’imagerie optique, notamment un microscope optique ou électronique, ou un système d’imagerie confocal, ou un système de mesure des propriétés électriques, notamment l’impédance, la conductivité du milieu d’étude ou une action électrique d’une unité cellulaire durant la stimulation mécanique. De préférence, le système d’analyse est agencé sur ou sous la chambre d’étude et est configuré pour prendre des images du fluide, gel et/ou d’un ou plusieurs micro-objets dans la chambre d’étude. Le système d’analyse peut être configuré pour détecter des informations statiques ou dynamiques du fluide, gel et/ou d’un ou plusieurs micro-objets dans la chambre d’étude.
Pluralité de chambres de déformation
Dans certains modes de réalisation, le dispositif comporte au moins deux chambres de déformation du substrat formées au moins partiellement par le substrat, indépendante de la chambre d’étude et s’étendant au moins partiellement chacune le long d’une paroi latérale de la chambre d’étude.
Dans certains modes de réalisation, deux chambres de déformation s’étendent de part et d’autre de la chambre d’étude.
Les deux chambres de déformation du support peuvent être configurées pour s’étendre au-dessus de la paroi supérieure de la chambre d’étude sur moins de 90%, mieux à moins de 80%, encore mieux à moins de 70%, encore mieux à moins de 50%, de la paroi supérieure de la chambre d’étude et encore mieux ne pas avoir de superposition avec la chambre d’étude
Dans certains modes de réalisation, deux chambres de déformation s’étendent le long de la chambre d’étude.
Dans certains modes de réalisation, deux chambres de déformation s’étendent le long de la chambre d’étude et sont espacées d’une distance telle que leur champ d’application de contrainte dans le substrat sont disjoints au niveau d’une zone de la paroi supérieure de la chambre d’étude. Cela peut permettre d’avoir une contrainte dans la chambre d’étude par la paroi supérieure qui ne soit pas uniforme le long de la chambre d’étude et qui soit contrôlable.
Dans certains modes de réalisation, deux chambres de déformation s’étendent le long de la chambre d’étude et sont espacées entre elles d’une distance telle que leur champ d’application de contrainte dans le substrat se recoupent au moins partiellement au niveau de la paroi supérieure de la chambre d’étude.
Les chambres de déformation peuvent être de forme et volume identiques ou différents.
Dans certains modes de réalisation, deux chambres de déformation sont contrôlées à la même pression par la même unité de contrôle de la déformation les contrôlant simultanément. De préférence, les deux chambres de déformation sont identiques et agencées de façon symétrique par rapport à la chambre d’étude. Ainsi, la déformation.
Dans certains modes de réalisation, deux chambres de déformation sont contrôlées en déformation indépendamment les unes des autres, notamment en étant liées à deux unités de contrôle de la déformation différentes ou en étant contrôlées différemment par une unique unité de contrôle de la déformation. De tels chambres peuvent être le long d’une même chambre d’étude. De tels chambres de déformation peuvent permettre de contrôler la pression et/ou la déformation de la paroi supérieure selon un déplacement complexe.
Le dispositif peut comporter une pluralité de chambre d’étude indépendante ou de préférence reliées fluidiquement en série ou en parallèle entre elles, la contrainte par la paroi supérieure dans chaque chambre d’étude, notamment la déformation de la paroi supérieure, étant générée par la ou les mêmes chambres de déformation ou par des chambres de déformation distinctes liées fluidiquement entre elles ou non. Dans le cas de chambres de déformation distinctes, elles peuvent être identiques. En variante, elles sont de formes différentes de sorte à générer des déformations de la paroi supérieure différentes à pression identique.
L’homme du métier comprend de ce qui précède que les possibilités de combinaison et d’agencement de chambres de déformation et chambre d’étude sont multiples et l’homme du métier saura adapter la structure du dispositif microfluidique à l’application qu’il souhaite mettre en œuvre.
Le dispositif microfluidique peut être symétrique par rapport à un plan médian transversal au support.
Milieu d’étude
La chambre d’étude peut comporter un milieu d’étude fluide, notamment liquide, ou gélifié. Dans le cas d’un gel, il présente de préférence un module de Young plus faible que le substrat. Un tel gel permet le transfert de la déformation de la paroi supérieure à un ou plusieurs micro-objets s’étendant dans le gel.
Le gel peut être un hydrogel, notamment choisi dans le groupe comprenant l'agarose, le collagène, la gomme d'agar, le Matrigel™, la gélatine, les gels dits « crosslinked » tels le Polyéthylène Glycol (PEG), ou d’autres types d’hydrogels. Selon certains modes de réalisation, la chambre d’étude comprend un milieu d’étude distinct d’un gel, notamment distinct d’un hydrogel.
Le gel peut être homogène dans la chambre d’étude. En variante, le gel est de densité variable dans le volume de la chambre d’étude, notamment peut présenter un gradient de densité du centre de la chambre d’étude vers les parois latérales.
Le gel peut remplir entièrement la chambre d’étude, ou bien en variante peut aussi être constitué d’îlots séparés entre eux qui sont positionnés de façon aléatoire ou bien de façon bien contrôlée dans le plan de la chambre d’étude.
Le dispositif peut être configuré pour que la déformation de la paroi supérieure de la chambre d’étude génère un flux du milieu d’étude d’une entrée à une sortie dans la chambre d’étude, agissant ainsi à la manière d’une pompe à membrane. Dans ce cas, la chambre d’étude peut sensiblement présenter une portion de forme sensiblement tronconique, la chambre de déformation s’étendant le long d’une paroi latérale du côté de la grande base de la forme tronconique, la plus grande déformation de la paroi supérieure généré par la déformation de la chambre de déformation étant plus proche de la grande base que de la petite base. Ainsi, le milieu d’étude est pompé de la grande base vers la petite base.
Micro-objet
Le dispositif peut comporter au moins un micro-objet, mieux une pluralité de micro-objets dans la chambre d’étude, notamment dans le milieu d’étude.
De préférence, le ou les micro-objets sont déformables.
Dans certains modes de réalisation, la hauteur du au moins un micro-objet est inférieure à 100 pm. Dans certains modes de réalisation, la hauteur du au moins un microobjet est supérieure à 100 pm.
Dans certains modes de réalisation, la hauteur du au moins un micro-objet est comprise entre 100 pm et 1000 pm ; par exemple comprise entre 100 pm et 900 pm, par exemple comprise entre 100 pm et 800 pm, par exemple comprise entre 100 pm et 700 pm, par exemple comprise entre 100 pm et 600 pm, par exemple comprise entre 100 pm et 500 pm, par exemple comprise entre 100 pm et 400 pm, par exemple comprise entre 100 pm et 300 pm, par exemple comprise entre 100 pm et 200 pm de hauteur.
Dans certains modes de réalisation, la hauteur du ou des micro-objets est supérieure ou égale à la hauteur de la chambre d’étude. Dans certains modes de réalisation, la hauteur du ou des micro-objets est inférieure à la hauteur de la chambre d’étude. De préférence, dans ce cas, le milieu d’étude comporte un agent gélifiant.
Le ou les micro-objets peuvent être choisis parmi les microgouttes, les microunités gélifiées, notamment comportant un hydrogel et pouvant se présenter sous forme de microgouttes gélifiées, et/ou tout matériel biologique, tel que des unités cellulaires, notamment les cellules ou les agrégats cellulaires, tels que les sphéroïdes ou les organoïdes, ou de cellules ou agrégats de cellules issus d’une biopsie d’un tissu de patient, ou encore tout type de milieu de culture.
Les microgouttes ou les micro-unités gélifiées peuvent comporter en leur sein un matériel biologique, tel qu’une unité cellulaire, notamment une cellule, un agrégat cellulaire, tels qu’un sphéroïde ou un organoïde, ou des de biopsie d’un patient. Dans le cas de plusieurs micro-unités gélifiées dans la chambre d’étude, les micro-unités gélifiées peuvent être de rigidités différentes.
Selon un mode de réalisation particulier, le ou les micro-objets comprennent ou consistent en un matériel biologique, et/ou un milieu apte à la culture d’un matériel biologique tel que tout milieu de culture susceptible de comprendre un ou plusieurs nutriments (par exemple, des protéines, peptides, acides aminés, et/ou toute source de carbone).
Le terme « matériel biologique » est susceptible de désigner tout type cellulaire, y compris embryonnaire, ou non-embryonnaire, ainsi que tout type d’extrait, lysat, fraction d’une ou plusieurs cellules, et notamment d’origine humaine, animale ou végétale.
Le terme « milieu de culture » est susceptible de désigner tout milieu physiologiquement acceptable, apte à la mise en culture d’un ou plusieurs types cellulaires, en particulier tout milieu comprenant au moins une source de carbone et d’énergie ; en particulier des nutriments (par exemple des peptides, polypeptides et/ou acides aminés, des carbohydrates, des métaux et minéraux essentiels, et des agents tampons).
Selon certains modes de réalisation, le dit matériel biologique comprend ou consiste en des cellules vivantes, quiescentes et/ou en culture.
De manière non-exhaustive, le dit matériel biologique peut comprendre ou consister en un ou plusieurs types de cellules, choisies parmi des cellules de type eucaryote, procaryotes, ou encore de virus ou particules virales. Selon certains modes de réalisation particuliers, le dit matériel biologique peut comprendre ou consister en des cellules eucaryotes, telles que des cellules de mammifères, notamment humaines ou non humaines ; par exemple issues d’humains, de souris, de rat, de chien, chat, vache, cochon, poulet, chèvre, cheval, levures ou autres.
Selon certains modes de réalisation particuliers, le dit matériel biologique peut comprendre ou consister en des cellules non-eucaryotes, telles que des cellules procaryotes ; par exemple des bactéries ou archaebactéries.
Selon certains modes de réalisation particuliers, le dit matériel biologique peut comprendre ou consister en des virus ou particules virales, telles que des virus enveloppés ou non-enveloppés, des virus à ARN, à ADN, ou tout autre virus de la classification de Baltimore ; tel que des virus appartenant à l’un quelconque des groupes I, II, III, IV, V, VI, ou VII de la dite classification.
Selon certains modes de réalisation particuliers, le dit matériel biologique peut comprendre ou consister en une ou plusieurs cellules génétiquement modifiées, transfectées, et/ou dont l’expression d’un ou plusieurs acides nucléiques est modulée.
Selon certains modes de réalisation particuliers, le dit matériel biologique peut comprendre ou consister en une ou plusieurs cellules somatiques, ou encore de cellules progénitrices, par exemple d’une ou plusieurs cellules pluripotentes ou multipotentes, telles que des cellules embryonnaires, ou encore issues d’embryons.
Selon certains modes de réalisation particuliers, les dites cellules peuvent être sous forme différentiée, ou en voie de différentiation, ou encore non différenciées.
Selon certains modes de réalisation, les dites cellules peuvent être des cellules cancéreuses, ou précancéreuses, ou encore issues de tissus cancéreux, d’origine diverse.
Selon certains modes de réalisation, les dites cellules (par exemple des cellules cancéreuses) peuvent être issues d’un ou plusieurs tissus ou organes choisis dans une liste consistant en : glandes adrénale, vessie, sang, os, moelle osseuse, cerveau, cartilage, utérus, cervix, endomètre, cornée, œsophage, tractus gastrointestinal, nerveux, foie, poumon, tissu lymphatique, muscle, cœur, pancréas, glande pituitaire, prostate, testicule, rein, glande salivaire, peau, thyroïde, système immunitaire, épithéliales, endothéliales, mésothéliales.
Selon certains modes de réalisation particuliers, les dites cellules peuvent être choisies parmi des cellules sanguines et/ou du système immunitaire, en particulier choisis dans une liste consistant en : érythrocytes, plaquettes, lymphocytes T, lymphocytes B, leucocytes, cellules dendritiques, macrophages.
Selon certains modes de réalisation, les dites cellules peuvent être issues de patients ou individus souffrant d’une ou plusieurs pathologies.
Selon certains modes de réalisation, le dit matériel biologique comprend ou consiste en une culture tridimensionnelle de cellules.
Selon certains modes de réalisation, le dit matériel biologique et/ou milieu de culture est susceptible de comprendre un ou plusieurs composés d’intérêt, par exemple un ou plusieurs actifs pharmaceutiques, tels qu’un ou plusieurs anticorps, ou fragment d’anticorps.
Selon certains modes de réalisation, le dit matériel biologique comprend ou consiste en un ou plusieurs sphéroïdes.
Selon certains modes de réalisation, le dit matériel biologique comprend ou consiste en un ou plusieurs organoïdes.
Le terme « sphéroïde » est susceptible de désigner tout agrégat, de tout type de cellules, tel qu’un agrégat constitué d’un seul type cellulaire ou d’une pluralité de type cellulaire, apte à croître de manière tridimensionnelle, en suspension, et apte à développer des interactions avec un ou plusieurs types cellulaires et/ou une matrice tridimensionnelle, telle qu’un Matrigel™, ou tout type de milieu de culture adapté.
Le terme « organoïde » est susceptible de désigner toute structure cellulaire obtenue par expansion d’un ou plusieurs types cellulaires spécifiques d’un tissu donné, et apte, en totalité ou partiellement, à s’ autoorganiser et/ou à se différencier.
Procédé d’étude ou de manipulation
L’invention a également pour objet un procédé d’étude ou de manipulation d’au moins un milieu d’étude ou un micro-objet, à l’aide du dispositif microfluidique tel que décrit précédemment, comportant l’introduction du milieu d’étude et/ou du micro-objet dans la ou une des chambre d’étude, l’application d’une pression, notamment négative, dans la ou les chambres de déformation générant une contrainte par la paroi supérieure de la chambre d’étude dans la chambre d’étude, de préférence une déformation de la paroi supérieure, notamment dans le sens d’une réduction de la hauteur de la chambre d’étude, la contrainte par la paroi supérieure dans la chambre d’étude appliquant un stimulus mécanique sur le milieu d’étude ou le micro-objet ou générant un déplacement du milieu d’étude ou du microobjet dans la chambre d’étude.
Le stimulus mécanique peut être une compression, dépression et/ou force mécanique.
Dans certains modes de réalisation, le procédé comporte l’étude ou le déplacement d’un ou plusieurs micro-objets contenu dans un milieu d’étude dans la chambre d’étude.
Dans certains modes de réalisation, le procédé comporte le déplacement d’un milieu d’étude, notamment fluide, dans la chambre d’étude. La déformation de la paroi supérieure peut générer une contrainte sur le milieu d’étude fluide dans la chambre d’étude qui entraine un champ de déplacement dans le milieu d’étude contenu dans la chambre d’étude. Ce champ de déplacement peut être unidirectionnel, ce qui génère un flux de fluide général dans une direction ou être plus diffus, selon les applications recherchées.
De préférence, la pression appliquée dans la chambre de déformation est comprise entre +1000 et -1000 mbar, mieux entre 0 et -800 mbar.
Durant l’application de la pression dans la chambre de déformation, la paroi supérieure peut prendre une forme courbe selon au moins une section transversale, mieux selon au moins deux sections transversales orthogonales. La forme courbe peut être de forme convexe, notamment de forme parabolique, vers la chambre d’étude.
De préférence, durant l’application de la pression dans la chambre de déformation, les parois latérales de la chambre d’étude ne se déforment pas d’une déformation supérieure à 10%, mieux supérieure à 5%, mieux ne se déforment substantiellement pas.
Le procédé peut comporter l’introduction d’un ou plusieurs micro-objets dans la chambre d’étude, notamment dans un milieu fluide contenu dans la chambre d’étude. L’introduction du micro-objet dans la chambre d’étude peut se faire par pipetage du microobjet dans la chambre d’étude avec un fluide, notamment un liquide.
Le milieu d’étude peut être un fluide circulant au moins au moment de l’introduction du ou des micro-objet dans le dispositif et/ou au moment de l’application de la pression dans la ou les chambres de déformation. Le ou les micro-objets peuvent être introduits dans la chambre d’étude avec le milieu d’étude. Le procédé peut comporter l’introduction d’un ou plusieurs éléments chimiques ou physiologique dans le milieu d’étude, notamment l’introduction d’un agent durcissant, notamment un agent gélifiant, après l’introduction du ou des micro-objets.
Le procédé peut comporter une étape d’introduction d’un agent durcissant dans la chambre d’étude, et de durcissement de l’agent durcissant. Le durcissement de l’agent durcissant peut comporter un ou plusieurs des éléments suivants : polymérisation, chauffage, dénaturation, irradiation, telle qu'avec un rayonnement et/ou une lumière, en particulier une lumière UV, une gélification, une réticulation physique, telle qu'un durcissement (réversible) par des interactions ioniques et des réticulations enzymatiques. Il apparaîtra clairement à l'homme du métier quelles méthodes de durcissement conviennent à un agent durcissant particulier.
Le milieu d’étude peut comporter un agent de gélification, notamment un hydrogel, introduit avec le ou les micro-objets dans la chambre d’étude ou après dans le milieu d’étude contenu dans la chambre d’étude. Le procédé peut comporter la gélification du milieu d’étude avant la déformation de la paroi supérieure. De préférence, le milieu d’étude après gélification présente un module de Young plus faible que le substrat Cela permet notamment d’immobiliser le ou les micro-objets. Le fait que le milieu d’étude soit gélifié permet notamment le transfert de la déformation de la paroi supérieure par compression du gel à un ou plusieurs micro-objets s’étendant dans le gel. Le procédé peut comporter dans ce cas l’observation pendant ou après la déformation de la paroi supérieure du déplacement du ou des micro-objets dans le gel.
Le ou les micro-objets peuvent être choisis parmi les microgouttes, les microunités gélifiées d’hydrogel, tout matériel biologique comme précédemment mentionné. L’échantillon peut être un échantillon cellulaire. L’échantillon cellulaire peut être un échantillon d’une biopsie d’un patient.
Dans le cas de plusieurs micro-unités gélifiées dans la chambre d’étude, les micro-unités gélifiées peuvent être de rigidités différentes.
Le dispositif peut comporter une chambre d’étude présentant une hauteur variant continûment, notamment diminuant continûment, ou bien variant par paliers discrets sur sa longueur ou sa largeur et le procédé peut comporter l’introduction dans la chambre d’étude d’une pluralité de micro-objets déformables de différentes hauteurs toutes supérieures ou égales à la plus petite hauteur de la chambre d’étude, le procédé comportant le classement automatique des micro-objets dans la chambre d’étude selon leur hauteur, la déformation de la paroi supérieure de la chambre d’ étude appliquant une force différente sur les micro-objets selon leur position dans la chambre d’étude.
Le procédé peut être un procédé de déformation mécanique du ou des micro - objets. La déformation du ou des micro-objets dans la chambre d’étude peut être directe par compression de la paroi supérieure sur le ou les micro-objets durant sa déformation. Dans ce cas, il est préférentiel que la hauteur du ou des objets soit supérieure ou égale à la hauteur de la chambre d’étude. En variante, la déformation du ou des micro-objets dans la chambre d’étude est indirecte, notamment par l’intermédiaire du milieu d’étude, de préférence d’un gel, notamment d’un hydrogel comme décrit précédemment.
Le procédé peut comporter l’immobilisation du ou des objets avant déformation de la paroi supérieure, notamment par compression entre les parois supérieure et inférieure de la chambre d’étude avant déformation, par l’utilisation d’un ou plusieurs pièges capillaires dans la chambre d’étude ou par gélification du milieu d’étude.
Le procédé peut comporter l’application d’un cycle de déformation de la ou de chaque chambre de déformation pour générer un cycle de déformation de la paroi supérieure, notamment dans le sens d’une réduction de la hauteur de la chambre d’étude, et ainsi appliquer une série de stimulus sur le ou les objets. Par « cycle de déformation de la ou de chaque chambre de déformation », on comprend l’application d’une suite de plusieurs déformation et/ou relaxes successives de la ou de chaque chambre de compression selon un diagramme de pression prédéterminée pour chacune des chambres de déformation. Selon certains modes de réalisation, le cycle de pression peut comporter une suite répétitive à l’identique d’une pression, notamment négative, et une relaxe pendant un temps prédéterminé. Selon certains modes de réalisation, le cycle de pression peut comporter une suite prédéterminée de pressions différentes, notamment négatives, et/ou relaxes pendant un temps prédéterminé. De tel cycle de déformation permettent de stimuler le milieu d’étude et/ou le ou les objets selon une suite de stimulus identiques ou différents.
Le procédé peut comporter la détection du comportement du ou des micro-objets dans le milieu d’étude pendant ou suite à la déformation ou au cycle de déformation de la paroi supérieur, notamment la détection du déplacement global du ou des objets, le déplacement local d’une partie du ou des micro-objets, notamment d’un ou plusieurs noyaux de cellules d’une ou de plusieurs unités cellulaires, la déformation globale du ou des micro- objets, notamment la déformation radiale instantanée, et/ou la déformation locale d’une partie du ou des micro-objets, notamment d’un ou plusieurs noyaux de cellules d’une ou de plusieurs unités cellulaires durant et/ou après la déformation de la paroi supérieure de la chambre d’étude et/ou après un ou plusieurs cycles de déformation de la paroi supérieure de la chambre d’étude.
Le procédé peut comporter la gélification du milieu avant ou après déformation de la paroi supérieure ou après un ou plusieurs cycles de déformation de la paroi supérieure. Le procédé peut comporter la déformation cyclique du ou des objets, la gélification du liquide dans la chambre d’étude et la détection du déplacement du ou des micro-objets dans la chambre d’étude.
Le procédé peut comporter la détection, notamment optique de la déformation latérale, notamment la déformation radiale instantanée, et/ou de la déformation locale du ou des micro-objets, notamment du noyau d’une cellule d’un agrégat cellulaire ou d’une cellule unique, en réponse à la déformation de la paroi supérieure de la chambre d’étude.
Le procédé peut comporter la comparaison du déplacement global ou local détecté et/ou de la déformation locale ou globale détectée du ou des micro-objets avec le déplacement global ou local et/ou la déformation globale ou locale d’un échantillon de référence réel ou par simulation à la même position dans la chambre d’étude.
Le procédé peut comporter la détermination des propriétés rhéologiques et/ou biologiques du ou des micro-objets ou d’une partie du ou des micro-objets par détermination de la déformation du ou des micro-objets ou de la partie du ou des micro-objets et comparaison avec la déformation d’un objet de référence dont les propriétés rhéologiques et/ou biologiques sont connues, notamment celle du milieu d’étude contenant les microobjets ou d’une partie du ou des micro-objets dont les propriétés rhéologiques sont connues. Par exemple, le procédé peut comporter l’introduction de micro-unités gélifiées de rigidité différentes connues contenant chacun une unité cellulaire à étudier et la détermination des propriétés rhéologique de l’unité cellulaire par détermination de la déformation de l’unité cellulaire dans les micro-unités gélifiées et comparaison avec la déformation de l’hydrogel des micro-unités gélifiées à la même position dont les propriétés rhéologiques sont connues.
Le procédé peut comporter la déformation du milieu d’étude et/ou le pompage du milieu d’étude dans la chambre d’étude. La déformation de la paroi supérieure de la chambre d’étude peut générer un flux du milieu d’étude d’une entrée à une sortie dans la chambre d’étude, agissant ainsi à la manière d’une pompe à membrane. Cette déformation et/ou pompage du milieu d’étude peut se faire avec ou sans micro-objet dans le milieu d’étude.
Selon certains objets particuliers dudit procédé, l’invention concerne également un procédé d’étude ou de manipulation, en particulier, de matériel biologique ; comprenant les étapes de : a) provision d’un dispositif microfluidique tel que décrit précédemment comprenant au moins un matériel biologique dans la chambre d’étude ; b) application d’une pression, notamment négative, dans la chambre de déformation générant une déformation de la paroi supérieure de la chambre d’étude ; c) détection du dit matériel biologique dans la chambre d’étude ; de préférence caractérisé en ce que le dit matériel biologique est mis en contact avec un ou plusieurs ligands ou composés d’intérêt, avant, pendant, ou après la dite étape de détection.
Brève description des dessins
[Fig 1] représente schématiquement un exemple de dispositif microfluidique selon l’invention,
[Fig 2] représente schématiquement une section transversale du dispositif microfluidique de la figure 1 ,
[Fig 3] représente schématiquement une section du dispositif microfluidique de la figure 1 pendant l’application d’une pression négative dans la chambre de déformation,
[Fig 4A] est en section transversale une variante de dispositif microfluidique,
[Fig 4B] est en section transversale une variante de dispositif microfluidique,
[Fig 4C] est en section transversale une variante de dispositif microfluidique,
[Fig 5A] est en section transversale une variante de dispositif microfluidique pendant l’application d’une pression négative dans la chambre de déformation,
[Fig 5B] est en section transversale une variante de dispositif microfluidique pendant l’application d’une pression négative dans la chambre de déformation,
[Fig 6] est en section transversale une variante de dispositif microfluidique,
[Fig 7A] est une section longitudinale de la chambre d’étude du dispositif microfluidique de la figure 1, la chambre d’étude contenant un milieu d’étude et des microobjets, [Fig 7B] est une section longitudinale de la chambre d’étude d’une variante de dispositif microfluidique, la chambre d’étude contenant un milieu d’étude et des microobjets,
[Fig 7C] est une section longitudinale de la chambre d’étude d’une variante de dispositif microfluidique,
[Fig 8] est en section transversale une variante de dispositif microfluidique,
[Fig 9] représente en section transversale le dispositif de la figure 8, une pression négative étant appliquée dans les chambres de déformation,
[Fig 10A] représente en section le champ de contrainte s’appliquant dans le substrat lorsqu’une pression négative est appliqué dans une variante de dispositif microfluidique,
[Fig 10B] représente la déformation au centre de la chambre d’étude en fonction de la pression négative appliquée dans les chambres de déformation,
[Fig 11 A] représente en section le champ de contrainte s’appliquant dans le substrat lorsqu’une pression positive est appliqué dans une variante de dispositif microfluidique,
[Fig 1 IB] est un graphique représentant la déformation de la paroi supérieure au centre de la chambre d’étude en fonction de la pression positive appliquée dans les chambres de déformation,
[Fig 12] représente une variante de dispositif microfluidique selon l’invention,
[Fig 13] est un graphique représentant le changement d’aire de micro-objets en vue du dessus au centre de la chambre d’étude et latéralement dans la chambre d’étude en fonction de la pression négative appliquée dans les chambres de déformation,
[Fig 14] représente une variante de dispositif microfluidique selon l’invention,
[Fig 15] est une image par microscopie de la chambre d’étude contenant un milieu d’étude et des micro-objets,
[Fig 16] est un graphique représentant le changement d’aire d’un micro-objet en vue du dessus en fonction du temps pendant un cycle sinusoïdal de pression,
[Fig 17A] représente la déformation radiale des cellules dans un sphéroïde d’un premier échantillon lorsqu’une pression est appliquée dans les chambres de déformation,
[Fig 17B] représente la déformation radiale des cellules dans un sphéroïde d’un deuxième échantillon lorsqu’une pression est appliquée dans les chambres de déformation, [Fig 18] représente une variante de dispositif microfluidique selon l’invention, [Fig 19] représente une variante de dispositif microfluidique selon l’invention, [Fig 20] représente en section une portion de chambre d’étude contenant un milieu d’étude en hydrogel et des micro-objets dans le milieu d’étude,
[Fig 21] représente en section une portion de chambre d’étude contenant un milieu d’étude contenant des unités d’hydrogels de rigidités différentes contenant des microobjets,
[Fig 22] représente une variante de dispositif microfluidique selon l’invention,
[Fig 23] représente une section selon XXIII-XXIII du dispositif de la figure 22, la chambre d’étude contenant un milieu d’étude en hydrogel et des micro-objets dans le milieu d’étude, et
[Fig 24] représente une variante de dispositif microfluidique selon l’invention.
Description détaillée
On a illustré sur les figures 1 et 2 un dispositif microfluidique 10 selon l’invention comportant un support 20 incluant, en son sein, une chambre d’étude 30 et une chambre de déformation 40 indépendantes fluidiquement l’une de l’autre.
Le support 20 comporte un substrat 25 en un matériau élastiquement déformable, par exemple en PDMS. Le PDMS est avantageux en raison de ses caractéristiques non toxiques, d’élasticité et de transparence, et de son faible coût. Cependant l’invention n’est pas limitée au PDMS et d’autres matériaux élastiquement déformables peuvent être utilisés. Les canaux ou chambres présentes sur la puce peuvent être obtenus par un procédé comprenant une lithographie douce et/ou un collage De préférence, le substrat 25 présente un module de Young inférieur ou égal à 1 GPa, mieux inférieur ou égal à 0,1 GPa. Dans l’exemple illustré, le support 20 comporte également une base rigide 28, notamment une plaque en verre, portant le substrat 25. La chambre d’étude 30 et la chambre de déformation 40 s’étendent dans des cavités du substrat 25 fermées à leurs bases par la base rigide 28.
Cependant, il pourrait en être autrement comme illustré par exemple sur les figures 4A à 4C. Par exemple, la base rigide pourrait comporter une ou plusieurs rainures formant partiellement une ou les chambres d’étude et de déformation, comme illustré sur les figures 4A et 4B. En variante, le substrat 25 pourrait comporter des cavités totalement incluses dans le substrat 25, la base rigide venant limiter la déformation du substrat par la base des chambres d’étude 30 et de déformation 40 et ne délimitant pas les chambres d’études ou de déformation, comme illustré sur la figure 4C. En variante encore, la base rigide est autre qu’une plaque en verre. La base rigide peut être tout support rigide pouvant porter le substrat 25, notamment une plaque multi-puit ou une plaque en un autre matériau rigide.
Dans tous les cas, la chambre d’étude 40 comporte au moins une paroi supérieure 32 formée par le substrat 25, deux parois latérales 33 et une paroi inférieure 34, comme illustré sur les figures.
Les chambres d’étude 30 et de déformation 40 sont agencées dans le support de sorte à s’étendre latéralement l’une par rapport à l’autre au moins partiellement. Dans les exemples illustrés sur les figures 1 à 4, la chambre de déformation 40 est de section transversale rectangulaire et s’étend latéralement sur toute sa hauteur H par rapport à la chambre d’étude 30. Cependant, la forme de la chambre de déformation 40 n’est pas limitée à une forme rectangulaire en section transversale. Comme illustré sur les figures 5A et 5B, elle peut prendre une autre forme en section transversale, notamment une forme sensiblement polygonale, notamment sensiblement de quadrilatère convexe, par exemple sensiblement trapézoïdale, à petit côté formant l’extrémité haute, comme illustré sur la figure 5 A, ou à petit côté formant la base, comme illustré sur la figure 5B. Une ou plusieurs des arêtes peuvent être arrondies, notamment lorsqu’ elles forment un angle aigu dans le substrat, comme cela est illustré sur la figure 5B. De plus, la chambre de déformation 40 peut s’étendre partiellement au-dessus de la chambre d’étude 30, notamment de la paroi supérieure 32, comme cela est illustré sur la figure 5B .
La chambre d’étude 30 peut présenter en section transversale une forme sensiblement polygonale, notamment de quadrilatère convexe, en particulier rectangulaire.
La plus grande largeur w à la base de la chambre d’étude 30 peut être comprise entre 200 pm et 5 cm, mieux entre 300 pm et 1 cm, par exemple sensiblement égale à 4 mm et la plus grande hauteur h de la section de la chambre d’étude 30 peut être plus petite que sa plus grande largeur w à la base et est de préférence inférieure ou égale à 10 mm, mieux inférieure ou égale à 500pm. La plus grande hauteur h peut être définie notamment en fonction du ou des objets à étudier dans la chambre d’étude 30 entre les parois supérieure 32 et inférieure 34. De préférence, le rapport de la plus grande largeur w sur la plus grande hauteur h de la chambre d’étude est supérieur ou égal à 5, mieux à 10. Les dimensions de la section de la chambre d’étude 30 sont notamment choisies en fonction du ou des objets à étudier dans la chambre d’étude et du procédé d’étude envisagé comme cela apparaitra clairement à la lecture des exemples ci-dessous.
La plus grande largeur W à la base de la chambre de déformation 40 peut être comprise entre 200 pm et 5 cm, mieux entre 300 pm et 1 cm, par exemple sensiblement égale à 5 mm et la plus grande hauteur H de la section de la chambre d’étude 30 est de préférence plus petite que sa plus grande largeur W à la base et est de préférence inférieure ou égale à 10 mm, mieux inférieure ou égale à 7 mm, par exemple sensiblement égale à 3 mm. La plus grande hauteur H est définie notamment en fonction du ou des objets à étudier dans la chambre d’étude 30. De préférence, le rapport de la plus grande largeur w sur la plus grande hauteur h de la chambre d’étude est supérieur ou égal à 5, mieux à 10.
La hauteur H de la chambre de déformation 40 est supérieure ou égale à la hauteur h de la chambre d’étude 30. Le rapport de hauteur est de préférence supérieur ou égal à 5, mieux supérieur ou égal à 10.
La chambre de déformation 40 et la chambre d’étude 30 sont espacées entre elles par une épaisseur e de substrat 25. La plus petite épaisseur e de substrat entre la chambre d’étude et la chambre de déformation est supérieure ou égale à la hauteur h de la chambre d’étude 30. De préférence, la plus petite épaisseur e de substrat entre la chambre d’étude et la chambre de déformation est inférieure ou égale à 40 fois la hauteur de la chambre d’étude, encore mieux inférieure ou égale à 20 fois la hauteur h de la chambre d’étude 30. Elle est par exemple sensiblement égale à 2 mm.
Il est bien entendu que les dimensions et formes sont à adapter en fonction du ou des objets à étudier dans la chambre d’étude et du procédé d’étude envisagé comme cela apparaitra clairement à la lecture des exemples ci-dessous.
Dans l’exemple de la figure 1, la chambre d’étude 30 est reliée à ses deux extrémités longitudinales à une entrée et une sortie de fluide et par des canaux de circulation fluidiques 34. De tels canaux 34 peuvent s’étendre dans le substrat 25 et/ou à l’interface entre le substrat 25 et la base rigide 28. Ils peuvent relier fluidiquement la chambre d’étude 30 à l’extérieur et/ou à d’autres dispositifs fluidiques en série avec la chambre d’étude 30. Les autres dispositifs peuvent être externe au support 20 du présent dispositif microfluidique ou être inclus dans le support 20, notamment en amont ou aval de la chambre d’étude 30. L’invention n’est pas limitée à de tels liaisons. Il est parfaitement envisageable d’avoir une chambre d’étude 30 comportant uniquement une entrée de fluide ou n’en comportant pas, notamment dans le cas d’une étude dans un milieu d’étude stationnaire d’un ou plusieurs micro-objets enfermés dans la chambre d’étude.
La chambre de déformation 40 est de préférence reliée fluidiquement à une unité de contrôle de la déformation 45, notamment à une unité de contrôle de la pression dans la chambre de déformation, par un canal 42 s’étendant dans le substrat 25 et/ou à l’interface entre le substrat 25 et la base rigide 28, comme cela est illustré sur les figures 1 et 15. Une telle unité de contrôle 45 permet d’appliquer une pression positive ou négative dans la chambre de déformation 40, ce qui la déforme, comme cela est illustré sur la figure 3 notamment. Une telle déformation de la chambre de déformation génère des contraintes dans le substrat 25, ce qui déforme la paroi supérieure 32 de la chambre d’étude 30 par transmission de contrainte au sein du substrat 25 élastiquement déformable. Comme cela est illustré sur les figures 3, 5A, 5B et 9 et 10A, dans le cas d’une pression négative dans la chambre de déformation 40, le volume de la chambre d’étude 30 diminue par l’abaissement du centre de la paroi supérieure 32. La paroi supérieure 32 prend, dans ce cas, une forme courbe vers l’intérieur de la chambre d’étude 30 selon au moins deux directions orthogonales. A l’inverse, comme cela est illustré sur la figure 11A, dans le cas d’une pression positive, le volume de la chambre d’étude 30 augmente par l’élévation du centre de la paroi supérieure 32. La paroi supérieure 32 prend, dans ce cas, une forme courbe vers l’extérieur de la chambre d’étude 30. La plus grande déformation d de la paroi supérieure 32, notamment en son centre, dépend notamment de la pression absolue dans la chambre de déformation, comme cela est illustré sur les graphiques des figures 10B et 11B, et des paramètres du dispositif, notamment de tailles, forme et flexibilité et sont facilement déterminable par des essais comparatifs à la portée de l’homme du métier. Par exemple, la déformation maximale d3 de la paroi supérieure 32 dans le cas d’une chambre de déformation en forme de trapèze inversé, selon la figure 5B par exemple, est plus grande que dans le cas d.2 d’une chambre de déformation de forme rectangulaire, selon la figure 2 par exemple, elle-même plus grande que celle dans le cas dl d’une chambre de déformation de forme trapézoïde non inversée, selon la figure 5A par exemple.
De préférence, la pression dans la chambre de déformation est comprise entre - 100 et 1000 mbar, mieux entre -100 et -500 mbar.
Durant l’application de la pression dans la chambre de déformation 40, pour une pression dans la chambre de déformation 40 inférieure à -500 mbar, les parois latérales 33 de la chambre d’étude 30 ne se déforment pas d’une déformation supérieure à 5%, mieux supérieure à 3%. Il peuvent flamber légèrement su fait de la déformation de la paroi supérieure 32. La plus grande largeur de la chambre d’étude 30 est sensiblement constante durant l’application de la pression dans la chambre de déformation 40, notamment ne change pas de plus de 2%, mieux ne change pas de plus de 1%. Cela est notamment dû à la distance entre la chambre de déformation et la chambre d’étude qui est telle que la déformation directe par l’intermédiaire sur substrat 20 est négligeable et à la grande dimension de la largeur par rapport à la hauteur de la chambre d’étude.
Par exemple, pour une pression dans la chambre de déformation 40 comprise entre -100 et -500, la déformation de la paroi supérieure 32 de la chambre d’étude 30 vers l’intérieur de la chambre d’étude 30 est supérieure ou égale à 10%, mieux supérieure ou égale à 40% de la hauteur de la chambre d’étude, comme cela est visible sur la figure 10B représentant la hauteur de déformation de la paroi supérieure en micromètre par rapport à la pression appliquée dans la chambre de déformation.
La chambre d’étude peut présenter une hauteur h constante en section transversale, comme cela est illustré sur les figures 1 à 4.
La chambre d’étude peut présenter une hauteur h constante sur toute la longueur de la chambre d’étude 30, comme cela est illustré sur la figure 1.
En variante, comme cela est illustré sur la figure 7B, la hauteur h de la chambre d’étude 30 peut varier sur la longueur de la chambre d’étude 30 de façon monotone. Cela peut permettre de classer ou guider les objets à étudier dans la chambre d’étude 30.
En variante, une des parois de la chambre d’étude, notamment la paroi supérieure 30 ou la paroi inférieure 33, peuvent comporter des reliefs de surfaces 38 en creux ou saillies sur la longueur, comme illustré sur la figure 7C, ou la largeur, comme illustré sur la figure 6. De tels reliefs peuvent être des pièges capillaires à forces de piégeage variables selon la hauteur de la chambre d’étude, contrôlable par la pression dans la chambre de déformation 40. De tels reliefs peuvent piéger, à une pression négative minimale appliquée dans la chambre de déformation, ou libérer, à une pression positive minimale appliquée dans la chambre de déformation, le ou les micro-objets. En variante, les reliefs 38 peuvent être des guides pour le ou les micro-objets dans la chambre d’étude 30, notamment lorsqu’ils sont sous la forme de nervures ou rainures s’étendant sur la longueur de la chambre d’étude 30. Dans ce cas, le guidage peut être permanent en étant plus ou moins fort selon la hauteur de la chambre d’étude 30 ou avoir lieu uniquement lorsque la hauteur de la chambre d’étude est en deçà d’une hauteur seuil. Le guidage peut se faire de façon directe sur le ou les microobjets, ou de façon indirecte, notamment par l’intermédiaire d’un milieu d’étude liquide ou par l’intermédiaire d’un hydrogel.
La chambre d’étude 30 peut être de forme sensiblement cylindrique. Dans l’exemple de la figure 1, la chambre d’étude 30 a une forme sensiblement de pavé droit. Cependant, il pourrait en être autrement et la chambre d’étude 30 pourrait avoir d’autres formes, notamment cylindrique à base circulaire ou à autre base, comme cela est visible notamment sur les figures 14, 15, et 18 ou d’autre forme non cylindrique.
Par ailleurs, l’invention n’est pas limitée à une unique chambre de déformation 40 pour déformer la paroi supérieure 32 d’une chambre d’étude 30. Comme cela est illustré sur les figures 8 à 10 notamment. Le dispositif peut comporter une pluralité de chambres de déformation 40a et 40b, notamment deux chambres de déformation sensiblement identiques s’étendant de part et d’autre de la chambre d’étude 30. De préférence, les deux chambres de déformation 40a et 40b sont reliées à un même organe de contrôle de la pression 45 et la pression est identique dans les deux chambres 40a et 40b, comme cela est illustré sur la figure 14. La présence de deux chambres de déformation 40a et 40b permet notamment d’avoir une déformation de la paroi supérieure 32 plus grande, comme cela est visible sur la figure 9. En variante, les deux chambres de déformation 40a et 40b ne sont pas identiques et/ou ne sont pas à une même pression durant l’application de la pression.
En variante ou de façon complémentaire, non illustré, le dispositif peut comporter des chambres de déformation permettant de déformer la paroi supérieure selon un profil de déformation plus complexe qu’une simple courbe, notamment des chambres de déformation réparties sur la longueur en étant espacée ou non et en ayant une pression appliquée identique ou non.
Dans certains modes de réalisation, notamment illustrés sur les figures 12 et 14, le dispositif peut comporter une pluralité de chambres d’étude 30a et 30b reliées fluidiquement entre elles en séries, la sortie d’une chambre d’étude 30a étant reliées fluidiquement à l’entrée de la chambre d’étude 30b. Chaque chambre d’étude peut être bordée latéralement par une ou plusieurs chambres de déformation contrôlées indépendamment ou simultanément par une ou plusieurs unités de contrôle 45 de la pression.
Milieu d’étude et micro-objets Durant le procédé d’étude ou de manipulation, un milieu d’étude 50 contenant un ou plusieurs micro-objets 55 peut être introduit dans la chambre d’étude 30 avant ou pendant l’application de la pression dans la ou les chambres de déformation 40. Ce milieu d’étude 50 peut être introduit par tout moyen usuellement utilisé dans le domaine de la microfluidique, notamment par pipetage à partir d’un réservoir contenant le milieu d’étude. Ce milieu d’étude et/ou le ou les micro-objets peuvent être immobiles dans la chambre d’étude ou en mouvement d’une entrée de fluide à une sortie de fluide durant l’application de la pression.
Le milieu d’étude peut être liquide. Il peut comporter un agent de durcissement, notamment un gélifiant, par exemple un hydrogel. Il peut être durci avant, pendant ou après l’application de la pression dans la ou les chambres de déformation 40. Dans le cas d’un milieu d’étude durci, notamment gélifié, il présente de préférence un module de Young plus faible que le substrat. Un tel milieu d’étude durci permet le transfert de la déformation de la paroi supérieure à un ou plusieurs micro-objets s’étendant dans le milieu d’étude. Ce dernier peut être homogène dans la chambre d’étude 30. En variante, il est de densité variable dans le volume de la chambre d’étude 30, notamment peut présenter un gradient de densité du centre de la chambre d’étude vers les parois latérales.
Le ou les micro-objets sont préférentiellement déformables.
Le ou les micro-objets peuvent être choisis parmi les microgouttes, les microunités gélifiées, notamment comportant un hydrogel et pouvant se présenter sous forme de microgouttes gélifiées, et/ou tout matériel biologique, tel que les unités cellulaires, notamment les cellules ou les agrégats cellulaires, tels que les sphéroïdes ou les organoïdes. Dans le cas de plusieurs micro-unités gélifiées dans la chambre d’étude, les micro-unités gélifiées peuvent être de rigidités différentes. Les microgouttes ou les micro-unités gélifiées peuvent comporter en leur sein un matériel biologique, notamment une unité cellulaire, telle qu’une cellule ou un agrégat cellulaire, l’agrégat cellulaire pouvant être notamment un sphéroïde ou un organoïde ou issu d’une biopsie d’un patient.
Selon un mode de réalisation particulier, le ou les micro-objets comprennent ou consistent en un matériel biologique, et/ou un milieu apte à la culture d’un matériel biologique tel que tout milieu de culture susceptible de comprendre un ou plusieurs nutriments (par exemple, des protéines, peptides, acides aminés, et/ou toute source de carbone). Le terme « matériel biologique » est susceptible de désigner tout type cellulaire, y compris embryonnaire, ou non-embryonnaire, ainsi que tout type d’extrait, lysat, fraction d’une ou plusieurs cellules, et notamment d’origine humaine, animale ou végétale.
Le terme « milieu de culture » est susceptible de désigner tout milieu physiologiquement acceptable, apte à la mise en culture d’un ou plusieurs types cellulaires, en particulier tout milieu comprenant au moins une source de carbone et d’énergie ; en particulier des nutriments, par exemple des peptides, polypeptides et/ou acides aminés, des carbohydrates, des métaux et minéraux essentiels, et des agents tampons.
Selon certains modes de réalisation, le dit matériel biologique comprend ou consiste en des cellules vivantes, quiescentes et/ou en culture.
Selon certains modes de réalisation, le matériel biologique comprend ou consiste en des acide nucléique ou des fractions d’acides nucléiques, notamment des ADN et/ou ARN.
De manière non-exhaustive, le dit matériel biologique peut comprendre ou consister en un ou plusieurs types de cellules, choisies parmi des cellules de type eucaryote, procaryotes, ou encore de virus ou particules virales.
Selon certains modes de réalisation particuliers, le dit matériel biologique peut comprendre ou consister en des cellules eucaryotes, telles que des cellules de mammifères, notamment humaines ou non humaines ; par exemple issues d’humains, de souris, de rat, de chien, chat, vache, cochon, poulet, chèvre, cheval, levures ou autres.
Selon certains modes de réalisation particuliers, le dit matériel biologique peut comprendre ou consister en des cellules non-eucaryotes, telles que des cellules procaryotes ; par exemple des bactéries ou archaebactéries.
Selon certains modes de réalisation particuliers, le dit matériel biologique peut comprendre ou consister en des virus ou particules virales, telles que des virus enveloppés ou non-enveloppés, des virus à ARN, à ADN, ou tout autre virus de la classification de Baltimore ; tel que des virus appartenant à l’un quelconque des groupes I, II, III, IV, V, VI, ou VII de la dite classification.
Selon certains modes de réalisation particuliers, le dit matériel biologique peut comprendre ou consister en une ou plusieurs cellules génétiquement modifiées, transfectées, et/ou dont l’expression d’un ou plusieurs acides nucléiques est modulée. Selon certains modes de réalisation particuliers, le dit matériel biologique peut comprendre ou consister en une ou plusieurs cellules somatiques, ou encore de cellules progénitrices, par exemple d’une ou plusieurs cellules pluripotentes ou multipotentes, telles que des cellules embryonnaires, ou encore issues d’embryons.
Selon certains modes de réalisation particuliers, les dites cellules peuvent être sous forme différentiée, ou en voie de différentiation, ou encore non différenciées.
Selon certains modes de réalisation, les dites cellules peuvent être des cellules cancéreuses, ou précancéreuses, ou encore issues de tissus cancéreux, d’origine diverse.
Selon certains modes de réalisation, les dites cellules (par exemple des cellules cancéreuses) peuvent être issues d’un ou plusieurs tissus ou organes choisis dans une liste consistant en : glandes adrénale, vessie, sang, os, moelle osseuse, cerveau, cartilage, utérus, cervix, endomètre, cornée, œsophage, tractus gastrointestinal, nerveux, foie, poumon, tissu lymphatique, muscle, cœur, pancréas, glande pituitaire, prostate, testicule, rein, glande salivaire, peau, thyroïde, système immunitaire, épithéliales, endothéliales, mésothéliales.
Selon certains modes de réalisation particuliers, les dites cellules peuvent être choisies parmi des cellules sanguines et/ou du système immunitaire, en particulier choisis dans une liste consistant en : érythrocytes, plaquettes, lymphocytes T, lymphocytes B, leucocytes, cellules dendritiques, macrophages.
Selon certains modes de réalisation, les dites cellules peuvent être issues de patients ou individus souffrant d’une ou plusieurs pathologies. Ces pathologies peuvent inclure des pathologies qui modifient les propriétés mécaniques des tissus, telle la fibrose, le cancer, ou toute autre condition qui mène à la cicatrisation du tissu.
Selon certains modes de réalisation, le dit matériel biologique comprend ou consiste en une culture tridimensionnelle de cellules.
Selon certains modes de réalisation, le dit matériel biologique et/ou milieu de culture est susceptible de comprendre un ou plusieurs composés d’intérêt, par exemple un ou plusieurs actifs pharmaceutiques, tels qu’un ou plusieurs anticorps, ou fragment d’anticorps.
Selon certains modes de réalisation, ledit matériel biologique comprend ou consiste en un ou plusieurs sphéroïdes.
Selon certains modes de réalisation, ledit matériel biologique comprend ou consiste en un ou plusieurs organoïdes. Le terme « sphéroïde » est susceptible de désigner tout agrégat, de tout type de cellules, tel qu’un agrégat constitué d’un seul type cellulaire ou d’une pluralité de type cellulaire, apte à croître de manière tridimensionnelle, en suspension, et apte à développer des interactions avec un ou plusieurs types cellulaires et/ou une matrice tridimensionnelle (telle qu’un Matrigel™) ou tout type de milieu de culture adapté.
Le terme « organoïde » est susceptible de désigner toute structure cellulaire obtenue par expansion d’un ou plusieurs types cellulaires spécifiques d’un tissu donné, et apte, en totalité ou partiellement, à s’ autoorganiser et/ou à se différencier.
La hauteur du ou des micro-objets peut être supérieure ou égale à la hauteur de la chambre d’étude, comme cela est illustré sur les figures 7 A et 7B. En variante, La hauteur du ou des micro-objets est inférieure à la hauteur de la chambre d’étude 30. Dans ce cas, le milieu d’étude comporte préférentiellement un agent gélifiant, notamment un hydrogel de sorte à pouvoir gélifier le milieu d’étude avant, pendant ou après l’application de la pression dans la ou les chambres de déformation.
Système d’analyse
Comme illustré sur la figure 14, Le dispositif microfluidique peut comporter ou être fonctionnellement couplé à un système d'analyse 60 configuré pour analyser la chambre d’étude 30, notamment le milieu d’étude 50 ou le ou les micro-objets 55 dans la chambre d’étude 30. Le système d'analyse peut être fonctionnellement couplé à l’unité de contrôle de la déformation de la chambre de déformation ou non, en particulier le système d'analyse peut fournir un signal d'analyse à l’unité de contrôle. L’unité de contrôle peut commander la déformation de la ou des chambres de déformation en fonction du signal d'analyse.
Le système d’analyse 60 dans la chambre d’étude 30 peut être un système d’imagerie optique, notamment un microscope optique ou électronique, ou un système d’imagerie confocal comme illustré sur la figure 14, ou tout autre système d’analyse, notamment un système de mesure des propriétés électriques, notamment l’impédance, la conductivité du milieu d’étude ou une action électrique d’une unité cellulaire durant la stimulation mécanique. De préférence, le système d’analyse 60 est agencé sur ou sous la chambre d’étude et est configuré pour prendre des images du fluide, gel et/ou d’un ou plusieurs micro-objets dans la chambre d’étude. Le système d’analyse 60 peut être configuré pour détecter des informations statiques ou dynamiques du fluide, gel et/ou d’un ou plusieurs micro-objets dans la chambre d’étude. Procédé
Dans certains modes de réalisation, la déformation de la paroi supérieure 32 de la chambre d’étude applique une force sur les micro-objets 55 dans la chambre d’étude 30 générant leur déformation. Il est alors possible de déterminer, notamment par des méthodes de microscopie et d’analyse d’image, la déformation du ou des micro-objets 55. La déformation déterminée peut être la déformation globale du ou des micro-objets ou la déformation locale d’une partie seulement du ou des micro-objet, notamment d’une ou quelques cellules d’un agrégat cellulaire ou du noyau d’une cellule. Une telle mesure de la déformation peut permettre de déterminer les propriétés mécaniques du ou des micro-objets ou de la partie du ou des micro-objets, notamment leur rigidité.
Cette déformation déterminée peut être directe lorsque le ou les micro-objets sont de tailles plus petites que la hauteur h de la chambre d’étude 30 ou de façon indirecte par l’intermédiaire du milieu d’étude, la déformation de la paroi supérieure 32 générant une déformation en volume du milieu d’étude, notamment gélifié, dans la chambre d’étude 30 et par la même la déformation du ou des micro-objets.
Le procédé peut comporter la comparaison de la déformation du ou des microobjets ou de la partie du ou des micro-objets avec la déformation d’un échantillon de référence réelle ou calculée dans la même chambre d’étude à la même position ou une position équivalente pour en déduire une caractéristique du ou des micro-objets, notamment une caractéristique de déformabilité et/ou une caractéristique biologique.
Dans certains modes de réalisation, la déformation de la paroi supérieure de la chambre d’étude entraine un déplacement du ou des micro-objets dans la chambre d’étude 30 ou d’une partie du ou des micro-objets dans le ou les micro-objets, notamment d’une ou quelques cellules dans un agrégat cellulaire ou du noyau de cellules. Ce déplacement peut avoir lieu pendant la déformation du fait de l’action de la paroi supérieure 32 sur le milieu d’étude, notamment gélifiée contenant le ou les micro-objets ou sur le ou les micro-objets.
Le procédé peut comporter la comparaison du déplacement du ou des microobjets ou de la partie du ou des micro-objets avec le déplacement d’un échantillon de référence dans la même chambre d’étude pour en déduire une caractéristique du ou des micro-objets, notamment une caractéristique biologique.
Dans certains modes de réalisation, le procédé peut comporter l’étude de la déformation du ou des micro-objets et de leur déplacement tels que décrit précédemment. Dans certains modes de réalisation, le procédé comporte l’application d’un cycle de pression dans la ou les chambres de déformation 40 correspondant à la répétition périodique pendant un temps prédéterminée d’une succession de pression/relaxe dans la ou les chambres de déformation 40. Les différentes pressions du cycle peuvent être identiques ou non et espacées entre elles d’un temps identique ou non. Un tel cycle de pression permet d’appliquer une déformation cyclique de la paroi supérieure 32 pendant un temps déterminé, ce qui génère une stimulation périodique sur le ou les micro-objets 55. Il est alors possible d’étudier, notamment par imagerie et analyse d’image, les réactions du ou des micro-objets, notamment du matériel biologique à une telle stimulation cyclique. Le procédé peut comporter l’étude de la déformation du ou des micro-objets dans le temps en corrélation avec le cycle de pression appliqué ou l’étude du déplacement du ou des micro-objets dans le temps d’application du cycle de pression, en corrélation avec le cycle de pression appliqué. Il est également possible d’étudier le déplacement du ou des micro-objets dans le temps en corrélation avec le cycle de pression appliqué ou l’étude du déplacement du ou des microobjets dans le temps d’application du cycle de pression, en corrélation avec le cycle de pression appliqué ou après l’application du cycle de pression en réaction au stimulus appliquée par le cycle de déformation, notamment dans le cas de micro-objet(s) comportant un matériel biologique.
Nous allons détailler maintenant plusieurs exemples d’utilisation du dispositif microfluidique décrit ci-dessus.
Exemple
Culture cellulaire et formation de sphéroïdes
Des cellules cancéreuses de type H4-II-EC3 et NIH-3T3 et MDA-MB-231 GFP sont mises en culture dans un milieu DMEM, supplémenté de 10% FBS, et de 1% d’antibiotique de type Pénicilline et/ou Streptomycine.
Les sphéroïdes sont produits à partir de plaques 96 puits non-adhérentes en U (Corning catalog 7007).
Afin d’obtenir des cocultures de sphéroïdes, les deux types cellulaires sont mélangés selon différents ratios en fonction de la taille souhaitée du sphéroïde et de l’application recherchée. Par exemple, un mélange de cent cellules H4-II-EC3 et quatre- cents cellules NIH-3T3 résulte en des sphéroïdes de taille plus importantes, et cent cellules de chaque type donnent des sphéroïdes de petite taille. Les cellules sont co-cultivées pendant 72 heures pour former les sphéroïdes.
Les images sont capturées avec un microscope à épifluorescence de type Nikon spinning disk Ti2 motorisé équipé avec une lentille 20x. L’illumination est produite à partir d’une source lumière LED Lumencor pour l’ épifluorescence, ou d’un set de lasers Oxius pour l’imagerie confocale, et les images sont capturées par une caméra Hamamatsu C13440- 20CU SCMOS. Les données brutes sont collectées avec le logiciel d’imagerie Nikon Elements (version 5.11.01, Build 1367). fluorescent
Les cellules peuvent être marquées soit par immunofluorescence soit par des kits standards de détection. Tous les réactifs sont introduits avec une pipette dans le dispositif, sans application de pression. Le marquage de l’actine est réalisé avec un Alexa Fluor™ 488 Phalloidin (Thermofisher- Catalog number: A12379) à une dilution de 1:200. Les noyaux sont marqués avec un réactif de type NucBlue™ Live ReadyProbes™ Reagent (Hoechst 33342, Invitrogen Catalog number: R37605) selon le protocole commercial. La membrane est marquée avec le réactif CellBrite® Steady 650, selon le protocole commercial (Biotium catalog number: 30108).
Mesure de la taille des sphéroïdes
Les tailles des sphéroïdes sont analysées à partir des images de microscopie à l’aide d’une macro du logiciel ImageJ (FIKI). Pour chaque valeur de pression, le périmètre, Faire totale, et les axes majeurs et mineurs des sphéroïdes peuvent être mesurés et enregistrés.
Exemple 1 : Analyse de la compression globale de sphéroïdes en fonction de la position dans la chambre d’étude dans le cadre d’une chambre d’étude en forme de pavé droit
Un dispositif selon la figure 12 est fabriqué. Un substrat 25 en polydiméthylsiloxane (PDMS) monolithique est fabriqué à partir d’un moule fabriqué par impression 3D, le moule présentant des reliefs correspondant à la trace inversée des chambres d’étude 30 et de déformation 40, ainsi que des conduits 34 et 42. Le substrat 25 fabriqué ainsi est disposé sur une plaque de microscope 28, le côté du substrat comportant les empreintes des chambres étant en contact avec la plaque de microscope. Le dispositif comporte deux chambres d’étude 30a et 30b identiques, de forme allongée et de sections transversale et longitudinale sensiblement rectangulaires, reliées entre elles en série. Les deux chambres d’étude 30a et 30b sont chacune bordée de part et d’autre de leur axe longitudinal par deux chambres de déformation 40a et 40b connectées à une même source de pression par un conduit 42 donnant dans les deux chambres de déformation. Les deux paires de chambres de déformation correspondant chacune à une chambre d’étude ne sont pas reliées entre elles. Elles sont dans le cas présent soumise à la même pression. Les chambres d’étude présentent une hauteur sensiblement égale à lOOpm.
Un échantillon de sphéroïdes formés comme décrit précédemment de diamètre sensiblement égal à 130 ± 20 iim est introduit dans les chambres d’étude 30a et 30b à l’aide d’une pipette en position fixe dans les chambres d’études. Des mesures de l’aire visible, par microscopie et analyse d’image selon la méthode décrite précédemment, de sphéroïdes dans la chambre d’étude en position centrale de la chambre d’étude et en position latérale de la chambre d’étude sont faite par microscopie avant et après application de différentes pression négative dans les chambres de déformation. Les résultats avant et après application de la pression dans les chambres de déformation sont comparés pour déterminer le pourcentage de changement d’aire des sphéroïdes représentant la déformation des sphéroïdes par la déformation de la paroi supérieure. La figure 13 illustre le changement d’aire moyen en fonction de la pression dans les chambres de déformation de sphéroïdes en position latérale dans les chambres d’étude (courbe du bas) et en position centrale dans les chambres d’étude (courbe du haut). On constate que la déformation des sphéroïdes est fonction à la fois de la pression appliquée dans les chambres de déformation et de la position des sphéroïdes dans la chambre d’étude, la déformation de la paroi supérieure 32 étant plus prononcé au centre de la chambre d’étude qu’en position latérale de cette dernière.
Exemple 2 : Analyse du comportement global de sphéroïdes lors de 1’ d’un cycle de dans le cadre d’une chambre d’étude en forme de cylindre à base circulaire.
Un dispositif selon la figure 14 est fabriqué. Un substrat 25 en polydiméthylsiloxane (PDMS) monolithique est fabriqué à partir d’un moule fabriqué par impression 3D, le moule présentant des reliefs correspondant à la trace inversée des chambres d’étude 30 et de déformation 40, ainsi que des conduits 34 et 42. Le substrat 25 fabriqué ainsi est disposé sur une plaque de microscope 28, le côté du substrat comportant les empreintes des chambres étant en contact avec la plaque de microscope. Le dispositif comporte deux chambres d’étude 30a et 30b identiques, de forme circulaire en vue du dessus, reliées entre elles en série par un conduit. Les conduit de liaison, d’entrée et sortie du dispositif sont de hauteur plus grande que la hauteur des chambres d’études. Les deux chambres d’étude 30a et 30b sont chacune bordée de part et d’autre par deux chambres de déformation 40a et 40b connectées à une même source de pression par un conduit 42 donnant dans les deux chambres de déformation. Les deux paires de chambres de déformation correspondant chacune à une chambre d’étude ne sont pas reliées entre elles. Elles sont dans le cas présent soumise à des pressions différentes de sorte à étudier simultanément la déformation de sphéroïdes à deux pressions différentes. Les chambres d’étude présentent une hauteur sensiblement égale à 100pm.
Un échantillon de sphéroïdes formés comme décrit précédemment de diamètre sensiblement égal à 130 ± 20 pm sont introduits dans les chambres d’étude 30a et 30b à l’aide d’une pipette en position fixe dans les chambres d’études. Des mesures de l’aire visible, par microscopie et analyse d’image selon la méthode décrite précédemment, de sphéroïdes dans la chambre d’étude en position sensiblement centrale de la chambre d’étude sont faites par microscopie, comme cela est visible sur la figure 15, avant l’application d’un cycle sinusoïdal de pression à une pression négative de -300 mbar et avec une fréquence de 0,5 Hz. La figure 16 illustre le changement moyen d’aire des sphéroïdes dans le temps durant l’application du cycle de pression. Il apparait de la figure 16 que la déformation des sphéroïdes suit bien le cycle de pression dans le temps et donc que la paroi supérieure se déforme bien de façon périodique selon le cycle de pression.
Exemple 3 : Analyse de la déformation des cellules individuelles dans des sphéroïdes lors de l’ application dans le cadre d’une chambre d’étude en forme de cylindre à base circulaire.
Dans le dispositif de l’exemple 2, des échantillons de sphéroïdes formés comme décrit précédemment de diamètre sensiblement égal à 130 + 20 pm sont introduits dans les chambres d’étude 30a et 30b à l’aide d’une pipette en position fixe dans les chambres d’études. Il a été démontré que la déformation locale des cellules individuelles et de leurs noyaux dans les sphéroïdes, marquées par fluorescence comme décrit précédemment, peuvent être observées. Il est alors possible d’étudier la déformation des noyaux dans les cellules, la déformations des cellules et/ou les comportements/réarrangements de cellules dans les sphéroïdes durant la déformation des sphéroïdes.
Exemple 4 : Analyse de la déformation des cellules individuelles dans des sphéroïdes lors de l’application dans le cadre d’une chambre d’étude en forme de cylindre à base circulaire. Dans le dispositif de l’exemple 2, deux échantilles de sphéroïdes de combinaison de cellules différentes et de diamètre sensiblement égal à 130 ± 20 pm sont introduits dans les chambres d’étude 30a et 30b à l’aide d’une pipette en position fixe dans les chambres d’études. Le premier échantillon est composé de sphéroïdes formés uniquement de cellules H4-II-EC3 et le deuxième échantillon est composé de sphéroïdes formés d’une coculture de cellules H4-II-EC3 et NIH-3T3. Avant déformation de la paroi supérieure, les cellules NIH- 3T3 sont réparties dans le centre des sphéroïdes, alors que les H4-II-EC3 forment une coque autour des premières. Le champ de déformation des sphéroïdes, dans le plan de l’image en champ clair, est mesurée par l’utilisation d’un logiciel de vélocimétrie par images de particules (PIV), et la déformation radiale vers l’extérieur est calculée. Les graphiques des figures 17A à 17C sont obtenus. Le graphique 17A représente la déformation radiale d’un sphéroïde du premier échantillon. Le graphique 17B représente la déformation radiale d’un sphéroïde du deuxième échantillon. Pour le premier échantillon comportant uniquement des cellules H4-II-EC3, la déformation se fait du centre vers le bord en augmentant graduellement. Pour le deuxième échantillon comportant uniquement la coculture de cellules H4-II-EC3 et NIH-3T3, le sphéroïde comporte un noyau statique se déformant peu et une région latérale se déformant plus.
L'hypothèse selon laquelle une telle différence de comportement était liée spécifiquement à l’auto-organisation de ces différentes cellules en une structure noyau- enveloppe, et donc que soit les cellules cancéreuses H4-Ü-EC3 soit les cellules NIH-3T3 puissent présenter des caractéristiques mécaniques différentes, l'une étant plus rigide que l'autre a été testé.
Les cellules NIH-3T3 ont été marquées par GFP avant de les mélanger avec les cellules de type H4-II-EC3. En observant les cellules dans les sphéroïdes, il est noté que les cellules NIH-3T3 se déplacent vers l'intérieur du sphéroïde formant un noyau, tandis que les cellules cancéreuses sont disposées en périphérie.
Ces résultats suggèrent donc que les cellules NIH-3T3 s'assemblent dans un noyau formant une structure plus rigide par rapport à la partie latérale constituée de cellules H4-II-EC3.
En particulier, les données quantitatives indiquent que le noyau de cellules NIH- 3T3 est environ 30 à 50 fois plus rigide que la couche externe formée par les cellules H4-II- EC3. Il est donc possible de déterminer les propriétés mécaniques d’arrangements cellulaires en trois dimensions différents et de structure hétérogène et d’en déterminer, par comparaison avec les propriétés mécaniques d’arrangements cellulaires connus des propriétés biologiques d’un échantillon cellulaire à étudier. Cet exemple démontre donc que le dispositif est particulièrement adapté à la caractérisation de structures hétérogènes, ainsi qu’à l’identification d’une démarcation entre cellule saine et cellule cancéreuse.
Des dispositifs selon les figures 18 et 19 est fabriqué avec pour base une plaque multipuit. La structure rectangulaire n’étant pas adaptée pour le dispositif microfluidique, des structures plus adaptées ont été développés. Un substrat 25 en polydiméthylsiloxane (PDMS) monolithique est fabriqué à partir d’un moule fabriqué par impression 3D, le moule présentant des nervures correspondant à la trace inversée des chambres d’étude 30 et de déformation 40, ainsi que des conduits 34 et 42. Le substrat 25 fabriqué ainsi est de taille adaptée aux puits d’une plaque multipuit, le côté du substrat comportant les empreintes des chambres étant en contact avec le fond du puit.
Le dispositif selon la figure 18 comporte une unique chambre d’étude sensiblement circulaire en vue du dessus reliées à deux canaux 34 d’entrée et de sortie de l’échantillon, les canaux formant entre eux un angle aigu et une chambre de déformation en forme de lune en vue de dessous entourant partiellement la chambre d’étude. La pression dans la chambre de déformation est contrôlée à l’aide d’un canal de contrôle 42. A -600 mbar dans la chambre de déformation 40, la paroi supérieure de la chambre d’étude se déforme en son centre vers l’intérieur de la chambre d’étude d’environ 43 pm.
Le dispositif selon la figure 19 comporte quant à lui une unique chambre d’étude sensiblement circulaire en vue du dessus reliées à deux canaux 34 d’entrée et de sortie de l’échantillon, les canaux étant en opposition, et deux chambres de déformation identiques de part et d’autre de la chambre d’étude en formes de rein en vue du dessus. La pression dans les chambres de déformation est contrôlée à l’aide d’un canal de contrôle 42 commun. Elles sont donc soumises à la même pression. A -600 mbar dans les chambres de déformation 40a et 40b, la paroi supérieure 32 de la chambre d’étude se déforme en son centre vers l’intérieur de la chambre d’étude d’environ 49 pm. d’un agrégat cellulaire dans un milieu gélifié. Dans le dispositif de l’exemple 1, un échantillon de sphéroïdes de cellules de cancer du sein métastatique de type MDA-MB-231 dans un milieu liquide sont introduit dans la chambre d’étude 30 en étant de diamètre supérieur à la hauteur de la chambre d’étude. Les sphéroïdes sont stimulés dans le milieu liquide par un cycle sensiblement sinusoïdal de pression à -350 mbar avec une fréquence de 0,5Hz pendant 12h dans les chambres de déformation 40. Après la stimulation, le milieu liquide est remplacé par une matrice de membrane basale, dite Matrigel™, et la migration cellulaire dans la matrice en réponse à la stimulation cyclique est étudié dans le temps pendant 16. Les cellules cancéreuses de MDA- MB-231 migrent dans la matrice vers l’extérieur, ce qui permet d’étudier la capacité métastatique des cellules cancéreuses en réponse à un stimulus externe.
Exemple 7 : Stimulation de sphéroïdes dans un hydrogel.
Dans le dispositif de l’exemple 1, un échantillon de sphéroïdes dans un milieu gélifié d’ garose est étudié. Les sphéroïdes sont de dimension plus petite que la hauteur de la chambre d’étude. Une telle configuration permet de stimuler et d’appliquer un stress mécanique aux sphéroïdes au lieu d’imposer une déformation. La paroi supérieure va déformer par sa déformation l’ hydrogel contenant les sphéroïdes, ce qui va déplacer latéralement les sphéroïdes avec l’hydrogel dans la chambre d’étude comme cela est illustré sur la figure 20. Cela permet d’appliquer une contrainte de cisaillement et/ou d’extensions sur les sphéroïdes.
Une telle dynamique de déformation des sphéroïdes dans l'hydrogel pourrait être utilisée pour déterminer analytiquement les propriétés rhéologiques des tissus ou des agrégats cellulaires intégrés à l'intérieur d’une chambre. En effet, la quantité de déformation du sphéroïde peut être extraite en la comparant à la déformation de l’hydrogel l’entourant ayant des propriétés rhéologiques connues : Un micro-tissu très mou va se déformer fortement alors qu’un micro-tissu très rigide restera quasiment non déformé par rapport au gel qui l'entoure. C'est donc possible de tester des tissus ayant différentes rigidités en ajustant la rigidité de l'hydrogel qui les entoure. Dans les cas extrêmes on peut remplacer l'hydrogel par un hydrogel purement visqueux liquide, comme le glycérol, l'huile de paraffine ou d'autres liquides.
Exemple 8 : Stimulation de dans des unités d’hydrogel.
En utilisant la méthodologie décrite ci-dessus à propos des sphéroïdes incorporés dans des hydrogels, il est également possible d’avoir des unités d'hydrogels 65a à 65c dans un milieu fluide dans la chambre d’étude comportant chacune des sphéroïdes. Cela permet de multiplexer la capacité à appliquer différentes gammes de contraintes dans une étude. Comme mentionné à l’ exemple 7, l'hydrogel de rigidité connue peut être utilisé pour analyser la rigidité des sphéroïdes par rapport aux propriétés rhéologiques de l’hydrogel. Avec des unités d’hydrogel, il est possible d’avoir dans une même chambre d’étude des unités d’hydrogels de propriétés rhéologiques différentes. Ces différentes unités d'hydrogel avec des rigidités différentes lorsqu’elles sont comprimés peuvent produire différents flux en eux, produisant ainsi différentes forces et contraintes mécaniques dans les sphéroïdes intégrés à l'intérieur comme cela est illustré sur la figure 21.
Exemple 9 : Dispositifs microfluidiques générant un déplacement du milieu d’étude et de
Un dispositif selon la figure 22 est fabriqué selon la même méthode que dans l’exemple 1. Le dispositif comporte une chambre d’étude 30 en forme d’entonnoir en vue du dessus et une chambre de déformation 40 s’étendant le long du grand côté de la forme en entonnoir. La chambre de déformation 40 présente en section sensiblement la même forme que la chambre de déformation de la figure 5B. La déformation de la chambre de déformation par l’application d’une pression dans la chambre de déformation génère une déformation de la paroi supérieure 32 de la chambre d’étude dans la partie élargie de l’entonnoir uniquement, comme cela est illustré sur la figure 23. Un hydro gel comportant de sphéroïdes est introduit dans la chambre d’étude.
Dans cette conception, la chambre d’étude est pressée uniquement à partir d'une extrémité (adjacente à la chambre de déformation), ce qui entraîne une poussée vers l'avant de l'hydrogel et des sphéroïdes intégrés dans l’hydrogel, comme cela est illustré sur la figure 23. Une telle déformation produit une déformation spatialement hétérogène dans l’hydrogel. Différentes configurations de dispositif peuvent être conçues pour obtenir différentes déformations d'hydrogel. Par exemple, l'introduction de reliefs 65 sur les bords dans la chambre d’étude comme illustré sur la figure 24 génère davantage de déformations du type flexion dans les hydrogels entre reliefs dans la chambre d’étude.
L’invention n’est pas limitée aux exemples et modes de réalisation décrit ci- dessus. Les caractéristiques des différents modes de réalisation décrits ci-dessus peuvent être combinées au sein de variantes additionnelles.

Claims

Revendications
1. Dispositif microfluidique (10) comportant:
- un support (20) comportant un substrat (25) en un matériau élastiquement déformable,
- une chambre d’étude (30, 30a, 30b) s’étendant dans le support (20) présentant au moins une paroi supérieure (32) formée au moins partiellement, de préférence totalement, par le substrat (25), au moins une paroi inférieure (34) et au moins deux parois latérales (33),
- au moins une chambre de déformation (40, 40a, 40b) du substrat formée au moins partiellement par le substrat (25), indépendante fluidiquement de la chambre d’étude (30, 30a, 30b) et s’étendant au moins partiellement dans le support (20) au moins partiellement le long d’une des parois latérales (33) de la chambre d’étude (30), le dispositif étant configuré pour que la déformation de la chambre de déformation (40, 40a, 40b) génère l’application d’une contrainte mécanique d’au moins une partie de la paroi supérieure (32) de la chambre d’étude dans la chambre d’étude (30), notamment par déformation de la paroi supérieure (32).
2. Dispositif selon la revendication 1, dans lequel le module de Young du substrat (25) est inférieur ou égal à 1 GPa, mieux inférieur ou égal à 0,1 GPa.
3. Dispositif selon l’une quelconque des revendications précédentes, configuré pour qu’une réduction de volume de la chambre de déformation (40, 40a, 40b), notamment par une pression négative dans la chambre de déformation (40, 40a, 40b), génère une déformation de la paroi supérieure (32) de la chambre d’étude dans le sens d’une réduction du volume, notamment une réduction de la hauteur h, de la chambre d’étude (30) et pour qu’une augmentation de volume de la chambre de déformation (40, 40a, 40b), notamment par une pression positive dans la chambre de déformation (40, 40a, 40b), génère une déformation de la paroi supérieure (32) de la chambre d’étude vers une augmentation du volume, notamment une augmentation de la hauteur h, de la chambre d’étude, ladite déformation de la paroi supérieure (32) générant l’application d’une contrainte mécanique dans la chambre d’étude (30, 30a, 30b).
4. Dispositif selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la chambre de déformation (40, 40a, 40b) s’étend sur une hauteur H supérieure ou égale à celle h de la chambre d’étude (30, 30a, 30b) dans le substrat (25), le rapport de hauteur H/h étant de préférence supérieur ou égal à 5, mieux supérieur ou égal à 10.
5. Dispositif selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la plus petite épaisseur e de substrat entre la chambre d’étude (30, 30a, 30b) et la chambre de déformation (40, 40a, 40b) est supérieure ou égale à la hauteur h de la chambre d’étude (30, 30a, 30b) et/ou inférieure ou égale à 100 fois la hauteur h de la chambre d’étude (30, 30a, 30b), mieux inférieure ou égale à 50 fois la hauteur h de la chambre d’étude (30, 30a, 30b), mieux inférieure ou égale à 40 fois la hauteur h de la chambre d’étude (30, 30a, 30b), encore mieux inférieure ou égale à 20 fois la hauteur h de la chambre d’étude (30, 30a, 30b).
6. Dispositif selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la chambre de déformation (40, 40a, 40b) s’étend dans le support (20) en regard d’un plan défini par une des parois latérales (33) de la chambre d’étude (30, 30a, 30b) sur une hauteur supérieure ou égale à 50% de sa hauteur maximale H, mieux, sur une hauteur supérieure ou égale à 70% de sa hauteur maximale H, encore mieux sur une hauteur supérieure ou égale à 80% de sa hauteur maximale H.
7. Dispositif selon l’une quelconque des revendications précédentes, comportant au moins deux chambres de déformation (40a, 40b) du substrat formées au moins partiellement par le substrat (25), indépendante de la chambre d’étude (30, 30a, 30b) et s’étendant au moins partiellement le long chacune à une paroi latérale (33) de la chambre d’étude, notamment s’étendant de part et d’autre de la chambre d’étude (30, 30a, 30b).
8. Dispositif selon l’une quelconque des revendications précédentes, comportant une pluralité de chambre d’étude (30a, 30b) reliées fluidiquement en série entre elles, la contrainte par la paroi supérieure (32) dans chaque chambre d’étude, notamment la déformation de la paroi supérieure, étant générée par la ou les mêmes chambres de déformation (40, 40a, 40b) ou par des chambres de déformation distinctes liées ou non fluidiquement entre elles.
9. Dispositif selon l’une quelconque des revendications précédentes, comportant une unité de contrôle (45) de la déformation de la chambre de déformation (40, 40a, 40b), notamment de la pression dans la chambre de déformation, reliée fluidiquement à la chambre de déformation (40, 40a, 40b), notamment par un canal (42).
10. Dispositif selon l’une quelconque des revendications précédentes, comportant ou étant fonctionnellement couplé à un système d'analyse (60) configuré pour analyser le dispositif microfluidique, en particulier la chambre d’étude, notamment le milieu d’étude ou le ou les micro-objets dans la chambre d’étude (30, 30a, 30b).
11. Dispositif selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la chambre d’étude (30, 30a, 30b) comporte un milieu d’étude (50) et/ou au moins un micro-objet (55), mieux une pluralité de micro-objets dans la chambre d’étude, notamment dans le milieu d’étude (50).
12. Dispositif selon la revendication 11, dans lequel le ou les micro-objets (55) peuvent être choisis parmi les microgouttes, les micro-unités gélifiées, notamment comportant un hydrogel et pouvant se présenter sous forme de microgouttes gélifiées, et/ou tout matériel biologique, tel que des unités cellulaires, notamment les cellules ou les agrégats cellulaires, tels que les sphéroïdes ou les organoïdes, ou encore tout type de milieu de culture.
13. Procédé d’étude ou de manipulation d’au moins un milieu d’étude (50) ou un micro-objet (55), à l’aide du dispositif microfluidique (10) selon l’une quelconque des revendications précédentes, comportant l’introduction du milieu d’étude (50) et/ou du micro-objet (55) dans la ou une des chambres d’étude (30, 30a, 30b), l’application d’une pression, notamment négative, dans la ou les chambres de déformation (40, 40a, 40b) générant une contrainte par la paroi supérieure (32) de la chambre d’étude dans la chambre d’étude (30, 30a, 30b), de préférence une déformation de la paroi supérieure, notamment dans le sens d’une réduction de la hauteur de la chambre d’étude, la contrainte par la paroi supérieure dans la chambre d’étude appliquant un stimulus mécanique sur le milieu d’étude (50) ou le micro-objet (55) ou générant un déplacement du milieu d’étude (50) ou du microobjet (55) dans la chambre d’étude (30, 30a, 30b).
14. Procédé selon la revendication 13, dans lequel le milieu d’étude (50) comporte un agent de gélification, notamment un hydrogel, introduit avec le ou les microobjets dans la chambre d’étude ou après dans le milieu d’étude contenu dans la chambre d’étude, le milieu d’étude (50) présentant après gélification un module de Young plus faible que le substrat (25).
15. Procédé selon une des revendications 13 et 14, comportant la déformation du milieu d’étude et/ou le pompage du milieu d’étude dans la chambre d’étude (30, 30a, 30b), la déformation de la paroi supérieure (32) de la chambre d’étude (30, 30a, 30b) générant notamment un flux du milieu d’étude (50) d’une entrée à une sortie dans la chambre d’étude (30, 30a, 30b), agissant ainsi à la manière d’une pompe à membrane.
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