EP4735594A1 - Utilisation d'un mimique du mir-27-5p pour traiter les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (mici) - Google Patents

Abstract

Les présents inventeurs ont découvert qu'une molécule mimique du miR-27a-5p est capable de fortement moduler la réponse inflammatoire dans un modèle animal reconnu de maladie inflammatoire chronique de l'intestin (MICI). Ils proposent donc d'incorporer ce mimique dans une composition pharmaceutique pour traiter des patients souffrant de cette maladie. De manière avantageuse, ce mimique peut être associé à une matrice, incorporé dans des particules, ou véhiculé par un vecteur.

Description

Utilisation d'un mimique du miR-27-5p pour traiter les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI)

Description de l'art antérieur

Les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (ou MICI) regroupent la maladie de Crohn (MC) et la rectocolite hémorragique (RCH). Toutes deux se caractérisent par une inflammation de la paroi d'une partie du tube digestif. Dans la MC, cette inflammation peut être localisée à tous les niveaux du système digestif, de la bouche à l'anus, même si c'est au niveau de l'intestin grêle qu'on la retrouve le plus souvent. Dans la RCH, elle est localisée au niveau du rectum et du côlon. Les MICI sont le plus souvent diagnostiquées chez des sujets jeunes, âgés de 20 à 30 ans. Toutefois, elles peuvent survenir à tout âge et 15 % des cas concernent des enfants.

Ces maladies évoluent par poussées inflammatoires de durée et de fréquence extrêmement variables selon les patients. Ces poussées alternent avec des phases de rémission. Chez environ 20 % des patients, les crises sont sévères : leur intensité peut imposer l'hospitalisation, l'arrêt de l'alimentation et un traitement par perfusion pendant quelques jours. En outre, l'évolution de la maladie peut entraîner des complications nécessitant une intervention chirurgicale.

Il n'existe pas de traitement curatif des MICI. Les médicaments anti-inflammatoires actuellement disponibles permettent un contrôle partiel, le but étant de prévenir l'apparition des poussées et de prolonger les phases de rémission en favorisant la cicatrisation des lésions du tube digestif. Les biothérapies actuellement utilisées pour le traitement des MICI ont permis d'améliorer la qualité de vie des patients et de réduire leur hospitalisation ainsi que les effets secondaires par rapport aux corticostéroïdes. Cependant, cet usage n'est pas sans risques. En effet, de nombreux problèmes de toxicité inattendus se sont produits et ont été reconnus comme étant liés aux biothérapies, comme par exemple avec des anti-TNF qui provoquent l'aggravation de l'insuffisance cardiaque ainsi que la réactivation des infections mycobactériennes ; ou des anticorps anti-intégrine dont le natalizumab, avec des cas rares d'encéphalite virale létale ou même un syndrome de libération excessive de cytokines, observé chez des volontaires sains traités avec un anticorps monoclonal dirigé contre CD28. En outre, l'usage de certaines biothérapies pourrait être également associé à une toxicité à long terme, dont le développement des lymphomes chez des patients traités par infliximab (anti-TNF).

D'autre part, la plupart des agents biologiques sont immunogènes et pourraient donc perdre leur effet avec le temps. Par ailleurs, la plupart des patients traités par des agents biologiques ont besoin d'un traitement d'induction et d'entretien et le coût de ces agents est susceptible de rester élevé. Ainsi, un équilibre entre l'efficacité et l'innocuité doit être soigneusement pris en compte pour chaque patient [1],

Malgré les nombreuses approches thérapeutiques développées à ce jour pour la prise en charge de l'inflammation intestinal dans le cadre des MICI, des besoins médicaux restent non satisfaits :

1) perte d'activité des molécules au fil du temps, nécessitant le changement de molécule,

2) des effets secondaires à moyen et à long terme, notamment des perturbations immunitaires, des développements de cancers, notamment de cancers du côlon, 3) absence de réponse dans les formes réfractaires.

Il existe donc un besoin urgent d'identifier des traitements plus efficaces pour traiter les patients souffrant d'une MICI, avec la meilleure tolérance possible ou avec le moins d'effets indésirables possibles.

Plusieurs équipes ont rapporté le rôle bénéfique que pouvait avoir un miARN dans la régulation de l'inflammation associée aux MICI [2], Les micro-ARNs (miARN ou miR) sont des séquences d'ARN non codant de 21 à 24 nucléotides, responsables de la régulation post-transcriptionnelle de gènes par leur action spécifique sur les ARNm. Ils peuvent moduler la réponse innée en régulant différentes voies de signalisation [3], La régulation fine exercée par les miARNs par leur action sur plusieurs molécules effectrices et/ou régulatrices d'une même voie de signalisation, représente un avantage majeur de cette approche thérapeutique puisqu'elle permet une diminution moins drastique du niveau d'expression d'un ou plusieurs gènes cible sans les inhiber complètement, contrairement aux approches moléculaires directes (ex. petites molécules, biothérapies par anticorps monoclonaux ou autres) qui agissent sur leur cible directe et universelle en bloquant fortement leur activité. Cet aspect est très important dans le cas de médicaments destinés aux traitements de l'inflammation des MICIs, puisque, chez les patients souffrant de ces maladies, la réponse inflammatoire est une réponse physiologique universelle dont les acteurs, que ce soient des effecteurs des voies de signalisation, des régulateurs ou des produits finaux dont les cytokines, sont ubiquitaires et présents dans les différents tissus. Ainsi, une régulation fine et ciblée de l'expression de ces gènes par un miARN donné permet une réduction moins importante des protéines effectrices correspondantes sans les anéantir complètement, ce qui limite par conséquent les effets indésirables importants observés lors de l'utilisation des traitements anti-inflammatoires classiques.

Malheureusement, il reste encore de nombreuses zones d'ombre dans la compréhension des réseaux de modulation liés à chaque miARN. Leur non-spécificité (chaque miARN ciblant une multitude de gènes) pourrait également induire des effets secondaires chez l'individu auquel il est administré. L'identification d'un miARN d'intérêt permettant de traiter une maladie aussi complexe que la maladie de Crohn est encore peu aisée, tant la validation des candidats est lourde. De plus, il est impossible de prédire l'effet d'un miARN sur ce type de maladie sans procéder à des expérimentations précliniques ou animales rigoureuses, avantageusement sur différents modèles [2],

Dans ce contexte, les présents inventeurs ont obtenu des résultats très satisfaisants en administrant à des animaux modèles un mimique du miARN 27a-5p (miR-27a-5p). Il est intéressant qu'une telle molécule ait un effet chez des animaux modèles de MICI, car ce miARN particulier n'a jamais été impliqué dans ces maladies (contrairement à d'autres miARNs, voir par exemple ceux listés dans le tableau 2 de Suri et al (2021) [2],

Cette molécule mimique de miR-27a-5p a certes été proposée par le passé pour traiter un modèle murin d'infection à Clostridioides difficile (ICD) (W02020/094865). Cependant, l'effet thérapeutique de ce miARN était intrinsèquement lié à l'effet des flagellines permettant à la bactérie C. difficile d'induire une forte réponse inflammatoire intestinale. En effet, les résultats présentés dans cette demande de brevet montraient que la flagelline FliC de C. difficile induit une réponse pro-inflammatoire dans les cellules épithéliales intestinales et dans le caecum de souris (modèle murin d'infection à C. difficile ou ICD), et que la voie de signalisation NF-kB jouait un rôle prédominant via l'activation du récepteur de la réponse inné TRL5, qui est spécifique de la flagelline [4,5], Dans ce contexte très particulier, le mimique de miR-27a-5p inhiberait principalement la voie de signalisation pro-inflammatoire NF-kB induite spécifiquement par la flagelline de C. difficile, induisant une forte inhibition de l'expression des gènes des cytokines TNFa et de l'interleukine IL-8.

Or, il est aujourd'hui bien connu qu'un même miRNA peut avoir un rôle donné dans des conditions et dans un type cellulaire donné et un rôle complètement opposé dans un autre type de cellule. Ainsi par exemple, il est connu que le miR-146a a des effets opposés selon les cellules étudiées : un effet pro-inflammatoire dans les cellules endothéliales stimulées par des surnageants de monocytes activés au LPS [6] ou un effet anti-inflammatoire dans les cellules endothéliales vasculaires stimulées au LPS [7], Par ailleurs, le miR-27a lui-même peut avoir un rôle oncogénique dans le cancer du sein, mais, à l'inverse, un rôle suppresseur de tumeur dans les cancers de la prostate [8,9], Ainsi, les résultats existants sur des modèles autres que M ICI, et notamment sur des cellules infectées par C. difficile, ne pouvaient pas être transposés dans les modèles murins d'inflammation intestinale (M ICI).

En 2005, Fichtner-Feigl et al [10] avaient proposé que des oligonucléotides leurres (ADN double- brin) ciblant NF-kB dans un modèle murin de colite induite par le TNBS, puissent réduire une telle inflammation intestinale. Cependant, ces résultats n'ont jamais été confirmés depuis. Au contraire, en 2020, l'étude de phase 2 de Danes et al [11] n'a constaté aucun effet d'une inhibition indirecte de NF-kB dans l'inflammation intestinale. De plus, de nombreuses publications ont montré depuis que des voies de signalisation autres que celle de NF-kB jouent un rôle bien plus important dans le développement des MICI. En effet, les mécanismes physiopathologiques des MICI sont complexes et multifactoriels (immunitaires, génétiques, environnementaux...). Il est à présent bien établi que la réponse immunitaire, tant la réponse innée que la réponse adaptative, joue un rôle important dans le développement et l'entretien des MICI. En effet, la différentiation des populations de lymphocytes T CD4 vers des cellules Thl7 occupe une place centrale dans la pathogenèse des MICI avec l'activation de différentes voies complexes de signalisation menant à la synthèse de différentes cytokines proinflammatoires [12], Cette différenciation des cellules TCD4 en Thl7 induite par le TGFP et l'IL- 6 (non montrée dans le cas de l'inflammation lors de l'infection par C. difficile) conduit à l'activation des voies de signalisation de STAT3, JAK1 et des facteurs de transcription STAT3, BATF, SMAD2 et IRF4, aboutissant à la production des cytokines IL-17, IL-21 et TNFa. Or le facteur de transcription central NF-kB ne joue aucun rôle direct dans ces voies. Ainsi, il est aujourd'hui bien établi que la réponse immunitaire adaptative par le biais de l'activation des Thl7 promeut l'inflammation au niveau des intestins, sans lien direct avec la voie NF-kB.

Par ailleurs, les molécules thérapeutiques utilisées et en cours de développement dans le cadre des MICI ciblent des voies de signalisation autres que celle de NF-kB. A titre d'exemple, nous pouvons citer : des anticorps monoclonaux anti-TNFa comme l'adalizumab (sur le marché), des anticorps monoclonaux anti-intégrines tels que le vedolizumab (sur le marché), l'etrolizumab (en phase II), l'abrilumab (phase llb) ; des anti-molécules d'adhésion MAdCAM-1 comme l'entavalimab (phase III), des anticorps anti-IL23 tel que l'ustekinumab (sur le marché), le mirikizumab (en phase II), le rizankizumab (en phase II), et le brazikumab (en phase III), ainsi que les molécules inhibitrices de kinases (inhibiteurs de JAK1) comme le filgotinib (en phase III), l'upadacitinib (en phase III) [13], D'autres cibles sont également en phase clinique d'études (des agonistes du TLR9, des modulateurs des récepteurs des sphingosine -1-phosphate). Ces molécules ciblent des facteurs pro-inflammatoires mais aucune n'affecte directement la voie de NF-kB.

Dans ce contexte, il ne pouvait pas être envisagé que l'inhibition de la voie NF-kB (de manière directe ou indirecte) puisse réduire la forte réponse inflammatoire retrouvée dans les modèles murins d'inflammation intestinale (M ICI) non infectés par C. difficile.

Par ailleurs, récemment, plusieurs études ont évalué l'implication des miARN dans la pathogenèse des M ICI et des cancers associés à la colite. En particulier, de nombreux miARN ont été impliqués dans les voies de l'inflammation et dans la fibrogenèse des M ICI ; par conséquent, leur utilisation en tant que biomarqueurs diagnostiques de l'inflammation et/ou de fibrose a été proposée. À la lumière de ces résultats dans le domaine diagnostique, il n'était cependant pas évident d'envisager qu'un de ces miARN puisse agir efficacement comme agent thérapeutique.

En outre, il est bien connu dans l'art qu'un même miARN peut avoir un rôle donné dans des conditions et dans un certain type cellulaire et un rôle complètement opposé dans un autre type de cellule. Par exemple le miR-146a a des effets opposés selon les cellules considérées (effet pro-inflammatoire dans les cellules endothéliales stimulées par des surnageants de monocytes activés au LPS [6] ou effet anti-inflammatoire dans les cellules endothéliales vasculaires stimulées au LPS [7]).

D'ailleurs, à l'inverse des présents inventeurs, l'équipe de Xie et al a montré que le miR-27a augmentait la réponse inflammatoire médiée par l'IL-10, dans des macrophages activés [14], Dans ce contexte technique complexe et contradictoire, il ne pouvait être envisagé que l'administration d'un mimique du miR-27a miARN puisse réduire la forte réponse inflammatoire retrouvée dans les modèles murins d'inflammation intestinale ( M ICI ) non infectés par C. difficile.

Le problème technique posé par les inventeurs était d'identifier un nouveau traitement des Maladies Inflammatoires Chroniques de l'intestin (MICI). Les inventeurs ont identifié un effet anti-inflammatoire inattendu du miR-27a chez des animaux modèles de cette maladie, effet dont les mécanismes moléculaires restent à élucider.

Comme indiqué ci-dessus, il s'agit de la première étude révélant le rôle du miR-27a-5p dans le processus inflammatoire intestinal des MICI, ce miARN n'ayant jamais été proposé dans le cadre du diagnostic ou du traitement de cette maladie.

Description détaillée de l'invention

Comme expliqué dans les exemples ci-dessous, les présents inventeurs ont étudié l'effet du mimique de miR-27a- 5p dans un modèle murin de colite couramment utilisé pour l'étude des MICI. Dans ce modèle, le dextran sulfate sodium (DSS), un polysaccharide sulfaté qui est directement toxique pour l'épithélium colique, induit une inflammation aiguë très reproductible limitée au côlon et caractérisée par des érosions / ulcères, une perte de cryptes et une infiltration de granulocytes, indiquant que les cytokines effectrices produites par des effecteurs de la réponse innée sont suffisantes pour provoquer l'inflammation. Sur cette base, la colite au DSS est devenue un modèle utile pour l'étude des mécanismes immunitaires impliqués dans le développement de l'inflammation intestinale [2], Les inventeurs ont pu démontrer que l'injection intraveineuse d'une formulation lipidique d'un mimique de miR-27a-5p chez des souris C57BL/6 traitées au DSS dans l'eau de boisson et atteintes de colite sévère, permet d'améliorer les signes cliniques avec une forte diminution de la diarrhée et du saignement rectal dès 24h après le début du traitement, ainsi que l'arrêt du rétrécissement du colon.

Dans un premier aspect, la présente invention vise donc une composition pharmaceutique contenant un mimique du miR-27a-5p, pour son utilisation pour traiter un sujet souffrant d'une maladie inflammatoire chronique de l'intestin.

Dans le cadre de la présente demande, le terme « miARN » est utilisé pour désigner indifféremment un micro-ARN (ou miARN). Il s'agit de courts ARN non-codants possédant entre 20 et 25 nucléotides, se liant à des ARNm cibles et inhibant ainsi leur traduction. Les micro-ARNs se lient à l'ARNm cible par 5 à 8 nucléotides consécutifs au niveau de la région 3'UTR de l'ARNm cible, cette séquence de reconnaissance étant appelée « seed » portée par le brin appelé « guide » de la molécule [3], Chaque micro-ARN est donc capable de reconnaître et de moduler un grand nombre d'ARNm (en pratique, tous les ARNm contenant ces 5 à 8 nucléotides de la région 3'UTR de l'ARNm cible, qui codent potentiellement différents gènes). Ces miARNs peuvent être sous forme double-brin (précurseur ou duplex) ou simple-brin (forme mature, prête à se lier à l'ARNm cible).

Le miARN connu sous la dénomination « miR-27a-5p » est un ARN simple-brin (sous sa forme mature) ayant chez la souris et l'homme la même séquence SEQ. ID NO : 1 (AGGGCUUAGCUGCUUGUGAGCA). Il a été identifié en 2001 [15] et a été impliqué dans la voie NF-KB dans des cellules aortiques [16], et dans le cancer [17], Il a également été identifié dans les cellules interstitielles de la valve mitrale [18],

Par « mimique du miR-27a-5p », on entend ici toute molécule synthétique d'ARN double-brin qui a la même séquence ou une séquence similaire à celle du micro-ARN (miARN) miR-27a-5p naturel, et qui permet de moduler la ou les même(s) cible(s) génétique(s) (ces gènes sont décrits dans : Romay et al [16],

Cette molécule « mimique » est synthétisée de manière artificielle. Elle contient idéalement les 5 à 8 nucléotidiques consécutifs « seed » dans le brin « guide » du micro-ARN naturel connus pour se fixer à l'ARNm cible, mais pourrait par exemple présenter avantageusement des différences nucléotidiques à ses extrémités, afin de cibler plus spécifiquement des gènes cibles parmi ceux connus pour être modulés par le micro-ARN naturel. La littérature explique précisément comment choisir la séquence des mimiques de micro-ARN, de manière à optimiser ses effets biologiques [19], Les « mimiques de micro-ARN » peuvent donc être plus spécifiques que les micro-ARN naturels dont ils dérivent (seuls les ARNm contenant précisément la séquence complémentaire de cette succession précise de nucléotides seront donc affectés par le mimique, ce qui restreint le nombre de gènes modulés).

Dans le cadre de la présente invention, on désigne donc, par l'expression « mimique du miR- 27a-5p », une molécule synthétique d'ARN double-brin qui contient au moins 5, 6, 7 ou 8 des 8 nucléotides consécutifs AGGGCUUA qui constituent la partie « seed » dans le brin « guide » du miR-27a-5p [partie 5' qui se lie au mARN cible]. Il s'agit donc d'une molécule qui contient au moins 5 nucléotides consécutifs de la séquence AGGGCUUA, c'est-à-dire qui contient AGGGC ou GGGCU ou GGCUU ou GCUUA, ou au moins 6 nucléotides consécutifs de cette séquence, c'est- à-dire qui contient AGGGCU ou GGGCUU ou GGCUUA, ou encore au moins 7 nucléotides consécutifs de cette séquence, c'est-à-dire qui contient AGGGCUU ou GGGCUUA. Le reste de la séquence oligonucléotidique du mimique de l'invention peut ensuite être similaire au reste de la molécule naturelle du miR-27a-5p de SEQ ID NO : 1, Le., être similaire avec la SEQ ID NO : 4 (représentant la partie 3' de la séquence SEQ ID NO :1, sans les 8 nucléotides AGGGCUUA constituant la partie « seed »). Par conséquent, la présente invention vise donc une composition pharmaceutique contenant un mimique du miR-27a-5p, pour son utilisation pour traiter un sujet souffrant d'une maladie inflammatoire chronique de l'intestin et dans laquelle ledit ARN mimique du miR-27a-5p contient au moins 5, 6, 7 ou 8 des 8 nucléotides consécutifs AGGGCUUA. De préférence, ledit ARN mimique du miR-27a-5p contient la séquence AGGGCUUA.

Par « séquence similaire », on entend ici une séquence d'acide nucléique ayant un pourcentage d'identité supérieur ou égal à 70 %, de préférence supérieure ou égale à 80 %, de manière encore plus préférée supérieure ou égale à 90 %, avec la partie 3' de la séquence du miR-27a- 5p naturelle connue (SEQ ID NO : 4). Par « pourcentage d'identité » entre deux séquences d'acide nucléique, on entend désigner un pourcentage de nucléotides identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement (alignement optimal), ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur.

Ce pourcentage d'identité peut être calculé par toute méthode d'analyse de séquences bien connue de l'homme du métier. Le pourcentage d'identité peut être déterminé après alignement global des séquences à comparer prises dans leur intégralité. Outre manuellement, il est possible de le déterminer au moyen de l'algorithme de Needleman et Wunsch (1970). Pour les séquences nucléotidiques, la comparaison des séquences peut être effectuée à l'aide de tout logiciel bien connu de l'homme du métier, comme par exemple le logiciel Needle. Les paramètres utilisés peuvent notamment être les suivants : « Gap Open » égal à 10,0, « Gap Extend » égal à 0,5 et la matrice EDNAFULL (Version EMBOSS du NCBI NUC4.4). Ce pourcentage peut également être déterminé après alignement local des séquences à comparer. Outre manuellement, il est possible d'utiliser l'algorithme de Smith et Waterman (1981) pour déterminer ce pourcentage. De préférence, le pourcentage d'identité défini dans le cadre de la présente invention est déterminé au moyen d'un alignement global des séquences à comparer sur toute leur longueur.

Par exemple, le « mimique du miR-27a-5p » utilisé dans le cadre de l'invention peut être l'ARN double-brin ayant pour séquence (brin « guide ») SEQ ID NO : 2 (5'- AGGGCUUAGCUGCUUGUGACCCCC-3') et ayant pour séquence accompagnante (brin « passager ») SEQ ID NO : 3 (5'-GGGGGUCACAAGCAGCUAAGCCCU-3') (ou son complémentaire). Il peut notamment être fourni par des sociétés telles que RIBOXX ou Axolabs.

En outre, cette molécule synthétique diffère également avantageusement des miARNs naturels en ce qu'elle a subi des modifications chimiques tant sur le brin guide que sur le brin « passager » visant à augmenter sa stabilité vis-à-vis notamment des RNases et des protéines du complexe RISC (« RNA-induced silencing complex »). Lesdites modifications chimiques sont par exemple la méthylation, l'addition de groupes thioates (remplacement de l'oxygène non-liant du groupe phosphate par un atome de soufre), l'ajout de groupements méthyles (par exemple 2'-O-methyl ou 2'-O-methoxyethyl) sur différentes bases de la séquence [20,21], En outre, il est possible de modifier les bases des ARN des mimiques de l'invention en ajoutant des groupements 2'Fluoro (2'F) sur différentes bases de la séquence des deux brins [22], Des liaisons internucléotidiques s-thioate peuvent également être ajoutées entre les bases U en 3' du brin « guide » [23], Ces modifications chimiques permettent d'améliorer la stabilité de ce brin « guide ».

Dans le cadre de la présente invention, des molécules mimiques modifiées chimiquement de préférence choisies pour présenter une activité anti-inflammatoire in vivo similaire ou supérieure à celle du mimique de miARN-27a-5p pourront être testées.

Il est également possible de modifier le mimique du miR-27a-5p de l'invention par tout moyen connu permettant de le stabiliser ou de le rendre plus efficace, notamment ceux décrits dans Bernardo et al. [3],

Dans la composition pharmaceutique de l'invention, le miARN mimique (double brin) peut être nu. Il peut également être complexé avec des molécules chimiques ou des nanoparticules (i.e., des particules ayant un diamètre inférieur à 1 pm) chargées positivement, ou encore être enveloppé dans des matériaux protecteurs, par exemple des capsules, des liposomes, etc., de sorte à favoriser sa stabilité et sa transfectabilité (entrée dans les cellules cibles).

Tout moyen de stabilisation connu pour favoriser le transport et le ciblage des siARNs pourra être utilisé pour faciliter l'administration du mimique de l'invention, car ces molécules ont la même structure. Ces moyens sont connus dans l'art [23,24],

Dans un mode de réalisation préféré, ledit mimique du miR-27a-5p est donc associé à (ou inclus dans) un vecteur, une matrice ou des particules favorisant sa stabilité et sa transfectabilité.

S'il est véhiculé par un vecteur, ledit vecteur est de préférence un virus recombinant choisi parmi : les adénovirus, les rétrovirus, les lentivirus, les virus adéno-associé (AAV), les virus de l'herpès, les cytomégalovirus (CMV), les virus de la vaccine, etc.

De manière avantageuse, ledit virus recombinant est un virus défectif, par exemple un AAV défectif. Le terme « virus défectif » désigne ici un virus incapable de se répliquer dans une cellule cible. Généralement, le génome des virus défectifs est dénué d'au moins une des séquences nécessaires pour la réplication dudit virus dans la cellule infectée. Ces régions peuvent être soit éliminées, soit rendues non fonctionnelles ou encore substituées par d'autres séquences et en particulier par l'acide nucléique qui code le peptide d'intérêt. Néanmoins, de préférence, le virus défectif conserve malgré tout les séquences de son génome qui sont nécessaires pour l'encapsulation des particules virales.

Ce vecteur peut également être un bactériophage, ceux-ci ayant été déjà utilisés avec succès pour véhiculer des siARN. Les bactériophages tels que MS2, Ph i 29, etc. peuvent être utilisés dans le cadre de la présente invention.

Si ledit mimique du miR-27a-5p est associé à des particules, celles-ci peuvent être celles déjà proposées pour le transport des siARNs [23], Il peut s'agir par exemple de liposomes (DOPC), de nanoparticules lipidiques, de nanocellules (type EnGenelC EDV), de nanoparticules de silice, d'exosomes, etc. Plus précisément, ces particules peuvent être des nanoparticules de poly(alkylcyanoacrylate), de préférence recouvertes de chitosan. Le miARN mimique de l'invention pourra y être aisément adsorbé par formation d'une paire d'ion, comme démontré précédemment pour les siARN [25],

Si ledit mimique du miR-27a-5p est inclus dans une matrice, ladite matrice peut être une émulsion lipidique neutre (NLE), du polyethylenimine (PEI), du poly(lactide-co-glycolide) (PLGA), etc.

De manière particulièrement préférée, ledit mimique du miR-27a-5p peut être complexé dans un polymère cationique tel que le « in vivo-jet PEI® », bien connu pour transporter efficacement tout type d'acides nucléiques in vivo dans différents organes, sans susciter de réponse inflammatoire [26],

Il est également possible d'administrer le mimique de l'invention conjugué avec une protéine ou une molécule chimique d'intérêt, par exemple choisie parmi : les lipides, le cholesterol, le PEG, la cyclodextrine, le chitosan, les dendrimères (de poly(amidoamine) ou de poly(propylenimine), le N-acetyl-D-galactosamine (GalNAc), etc.

La présente invention vise également des méthodes pour traiter des sujets souffrant d'une maladie inflammatoire chronique de l'intestin. Ces méthodes contiennent une étape d'administration de la composition pharmaceutique de l'invention à des patients souffrant d'une maladie inflammatoire chronique de l'intestin.

La présente invention concerne enfin l'utilisation du mimique de l'invention, tel que défini ci- dessus, pour fabriquer un médicament destiné à traiter des patients souffrant d'une maladie inflammatoire chronique de l'intestin.

Ces sujets / patients peuvent être des animaux (domestiques ou non, par exemple le chat, le chien, les équidés) ou des êtres humains. De préférence, ces sujets ne sont pas des enfants en bas âge.

Les sujets / patients à traiter dans le cadre de la présente invention souffrent d'une maladie inflammatoire chronique de l'intestin (« MICI »), notamment de la maladie de Crohn (MC) ou d'une rectocolite hémorragique (RCH). Ces maladies se caractérisent par l'inflammation de la paroi d'une partie du tube digestif, due à une dérégulation du système immunitaire intestinal. Cette inflammation incontrôlée est responsable de lésions tissulaires et de la chronicité de la maladie. Son origine semble résulter de la combinaison complexe de facteurs environnementaux, associés à une susceptibilité génétique du patient et à la réactivité particulière de son système immunitaire. Les MICI évoluent par poussées inflammatoires, de durée et de fréquence extrêmement variables selon les patients, qui alternent avec des phases de rémission. Elles se distinguent par la localisation et la nature de l'inflammation dans le tube digestif, les complications, les facteurs de risque, les symptômes, ou encore les réponses aux traitements.

Dans la maladie de Crohn, l'inflammation peut toucher tous les segments du tube digestif (de la bouche à l'anus), mais se localise le plus souvent au niveau de l'intestin et touche fréquemment l'iléon terminal, avec ou sans atteinte colique. Dans la rectocolite hémorragique, l'inflammation affecte toujours la partie basse du rectum et remonte plus ou moins dans le côlon. L'intestin n'est jamais touché. Le diagnostic des MICI repose sur plusieurs critères cliniques, biologiques et d'imagerie médicale. Lorsque des symptômes cliniques évoquent une M ICI, un bilan biologique est réalisé en premier lieu. Il permet de détecter un syndrome inflammatoire grâce au dosage sanguin de la protéine CRP et de rechercher la présence de calprotectine dans les selles. En effet, cette dernière se retrouve dans les selles uniquement en cas d'inflammation sévère de l'intestin (celle- ci entraînant une destruction de l'épithélium intestinal qui permet le passage de la molécule à travers la paroi intestinale). Si l'augmentation du taux de calprotectine n'est pas spécifique aux MICI, elle permet de discriminer une MICI d'un trouble fonctionnel intestinal. Cet indicateur sert également au suivi de la maladie et à l'évaluation de l'efficacité du traitement mis en place. L'examen de référence pour le diagnostic est néanmoins l'endoscopie digestive. Elle permet de rechercher la présence et la localisation de lésions du tube digestif, ainsi que de réaliser des prélèvements. Cet examen consiste à introduire une sonde équipée d'une caméra dans le système digestif du patient. Si nécessaire, une entéro-IRM (ou IRM abdominale) peut compléter l'examen pour étudier plus finement l'intestin grêle. L'utilisation de vidéocapsule, une gélule à avaler munie d'une mini-caméra, permet également d'observer l'intestin grêle inaccessible à l'endoscope. Dans la rectocolite hémorragique, l'inflammation touche exclusivement le rectum et le côlon. On observe une atteinte continue avec une muqueuse rouge, fragile, saignant facilement, avec des micro-ulcérations et du pus. Dans la maladie de Crohn, l'atteinte est discontinue : des segments de muqueuse touchée alternent la muqueuse saine. L'examen peut également révéler des rétrécissements de la lumière intestinale (sténose) ou une fistule, notamment de la région ano-périnéale. L'ensemble du tube digestif peut être concerné.

Les M ICI sont le plus souvent diagnostiquées entre 20 et 30 ans. Toutefois, elles peuvent survenir à tout âge et 15 % des cas concernent des enfants.

Il existe une susceptibilité génétique aux MICI et le risque d'en développer une augmente de 6 à 10 % en cas d'antécédents familiaux. L'analyse du génome de patients atteints a permis l'identification de plus de 170 gènes de prédisposition à ces maladies. Certains sont communs aux deux pathologies et d'autres spécifiques à l'une d'elles. A des rares exceptions près, leur impact sur la survenue d'une MICI est toutefois modéré. Néanmoins, la présence d'un polymorphisme particulier affectant le gène NOD2/CARD15 multiplierait par 40 le risque de développer la maladie de Crohn, certainement en présence d'autres facteurs déclenchants qui restent à découvrir. Ce gène code un récepteur cellulaire à un agent bactérien.

De manière préférentielle, les sujets / patients à traiter dans le cadre de la présente invention ne sont pas infectés par la bactérie Clostridioides difficile. En d'autres termes, ils ne souffrent pas d'ICD.

Dans le cadre de l'invention, il est possible d'utiliser le traitement de l'invention également pour prévenir ou traiter les cancers du côlon qui sont engendrés par une MICI, et donc associés à la colite. Plus précisément, ledit ARN mimique du miR-27a-5p peut être avantageusement administré à un sujet souffrant d'une MICI, en prévention du développement d'un cancer du côlon, ou à un sujet souffrant d'un cancer du côlon induit par une MICI.

Par « traitement », on entend ici un traitement à titre curatif (visant à au moins espacer voire empêcher les poussées inflammatoires symptomatiques de la MICI ou à ralentir voire stopper le développement des lésions intestinales ou gastriques des patients souffrant de MICI) ou prophylactique (visant à réduire le risque d'apparition de ces lésions en cas de susceptibilité génétique par exemple).

Le médicament de l'invention est en particulier utilisé pour atténuer les douleurs abdominales, diminuer la fréquence et la quantité des diarrhées, empêcher la rectorragie, et limiter la perte de poids chez les patients atteints de M ICI.

La composition pharmaceutique utilisée dans l'invention contient, en tant que principe actif, l'acide nucléique décrit ci-dessus (éventuellement associé ou protégé par des particules, vecteurs, lipides, etc.). Elle contient également, de préférence, un excipient pharmaceutiquement acceptable.

Dans la présente description, on entend désigner par « excipient pharmaceutiquement acceptable », un composé (ou une combinaison de composés) entrant dans une composition pharmaceutique, mais ne provoquant pas de réactions secondaires et qui permet par exemple la facilitation de l'administration du ou des composés actifs, l'augmentation de sa durée de vie et/ou de son efficacité dans l'organisme, l'augmentation de sa solubilité en solution ou encore l'amélioration de sa conservation. Ces excipients pharmaceutiquement acceptables sont bien connus et seront adaptés par l'homme de l'art en fonction de la nature et du mode d'administration du ou des composés actifs choisis.

De préférence, le mimique de l'invention sera administré par voie systémique, en particulier par voie intraveineuse, par voie intramusculaire, intradermique, intrapéritonéale ou sous-cutanée, ou par voie orale. De manière plus préférée, il sera administré par voie parentérale, à l'hôpital ou à domicile. Son administration par voie sous-cutanée est envisagée et préférable.

Le mimique de l'invention peut être administré à plusieurs reprises, de manière étalée dans le temps.

Son mode d'administration, posologies et formes galéniques optimaux peuvent être déterminés selon les critères généralement pris en compte dans l'établissement d'un traitement adapté à un patient comme par exemple l'âge ou le poids corporel du patient, la gravité de son état général, la tolérance au traitement et les effets secondaires constatés.

Le mimique de l'invention peut être formulé également sous forme de microcapsules, éventuellement avec un ou plusieurs supports additifs. Pour la préparation de ces microcapsules, le mimique de l'invention est en général combiné à des diluants appropriés, des stabilisants appropriés, des agents favorisant la libération prolongée des substances actives ou tout autre type d'additif pour la formation d'un noyau central qui est ensuite revêtu d'un polymère approprié (par exemple une résine hydrosoluble ou une résine insoluble dans l'eau). Les techniques connues de l'homme du métier seront utilisées à cet effet. Les microcapsules ainsi obtenues sont ensuite éventuellement formulées dans des unités de dosage appropriées.

Le mimique de l'invention peut également être formulé dans des liposomes. Les liposomes sont formés à partir de phospholipides qui sont dispersés dans un milieu aqueux et forment spontanément des vésicules bicouches concentriques multilamellaires. Ces vésicules ont généralement un diamètre de 25 nm à 4 pm et peuvent être soniquées, conduisant à la formation de vésicules plus petites unilamellaires, de diamètre de 200 à 500 Â, contenant une solution aqueuse en leur cœur. Les liposomes seront particulièrement avantageux pour administrer le médicament à une cible cellulaire ou tissulaire précise. Pour cela, les lipides pourront être couplés chimiquement à des molécules de ciblage, tels que des peptides de ciblage (par exemple hormones), ou des anticorps.

La posologie dépend naturellement du vecteur / complexe considéré, du mode d'administration, du stade de la maladie, de l'âge du patient et de son état. Certains auteurs ont utilisé des doses de miARNs de 10 mg/kg par voie intraveineuse. Des doses moins importantes peuvent également être utilisées (par exemple, entre 3 et 5 mg/kg par jour).

Lorsque le mimique de l'invention est associé à un polymère cationique ou à un autre vecteur, il est possible d'utiliser des doses plus fortes (25 mg/kg), en une prise, ou en plusieurs fois, en répétant les injections.

Légende des figures

La figure 1 démontre l'effet anti-inflammatoire du miARN de l'invention dans un modèle murin DSS de M ICI. Evaluation de la longueur du gros intestin, du caecum au rectum, chez les souris sans traitement (DSS, à gauche) et chez les souris traitées avec le miR-27a-5p-mimic (à droite).

La figure 2 démontre l'effet du miARN de l'invention sur la réduction de l'apparition de tumeurs recto-coliques dans un modèle murin DSS de M ICI chronique/cancer (induit par l'azoxyméthane : AOM). A. Evaluation du nombre des tumeurs du colon et du rectum chez les souris qui ont reçu une molécule anodine de miR (miR-nc, sans effet clinique) (DSS/AOM, carrés) et chez les souris traitées avec le miR-27a-5p-mimic (triangles). B. Evaluation histologique de la présence des tumeurs (flèches) chez une souris sans traitement (DSS/AOM, gauche) et une souris traitée avec le miR-27a-5p-mimic (droite).

Exemples

Le mimique de miR-27a-5p utilisé dans le cadre de ces exemples est un ARN double-brin ayant pour séquence (brin « guide ») SEQ ID NO : 2 (5'-AGGGCUUAGCUGCUUGUGACCCCC-3') et ayant pour séquence accompagnante (brin « passager ») SEQ ID NO : 3 (5'-

GGGGGUCACAAGCAGCUAAGCCCU-3') (ou son complémentaire) fourni par la société Axolabs. Il sera appelé « miR-27a-5p-mimic » dans le cadre de ces exemples.

La molécule anodine utilisée en tant que contrôle négatif dans le cadre de ces exemples, a pour séquence (brin « guide ») SEQ ID NO : 5 (5'-AAGGCAAGCUGACCCUGAAGUU-3') et pour séquence accompagnante (brin « passager ») SEQ ID NO : 6 (5'-AACUUCAGGGUCAGCUUGCCUU-3').

Exemple 1 : Evaluation de l'effet anti-inflammatoire de miR-27a-5p-mimic sur un modèle de souris traitées avec du dextran sulfate de sodium (DSS)

Des souris C57BL/6 ont été traitées par du DSS dans l'eau de boisson durant 7 jours. Dès l'apparition de symptômes de colite (diarrhée, rectorragie, perte de poids), à J5 du début du traitement par le DSS, un groupe de souris (n = 6) a été traité par une suspension intraveineuse (IV) du miR-27a-5p-mimic associé au véhicule in vivo-jetPEl® (société Polyplus), avec une seconde injection à 24 h d'intervalle (J6 post-traitement DSS). A J7 (24 h après la deuxième dose de miR- 27a-5p-mimic) les intestins (caecum et côlon) ont été analysés quant à leur aspect macroscopique et histologique ainsi que sur l'expression de gènes de cytokines proinflammatoires. Comme attendu, toutes les souris traitées par le DSS (n = 12) ont développé des manifestations de colite (diarrhée, rectorragie, perte de poids) à partir de J5 du traitement par le DSS. Les animaux atteints de colite ayant été traités par le miR-27a-5p-mimic par voie IV (n = 6) ont présenté une amélioration des signes cliniques avec une forte diminution de la diarrhée et du saignement rectal dès 24 h après la première dose et après 48 h du traitement par le miR-27a- mimic.

[Table 1]

L'analyse macroscopique des intestins (caecum et côlon) des souris non traitées par le miR-27a- 5p-mimic comparée à celle des animaux traités par ce miARN (48h après traitement) a montré la présence d'un contenu intestinal hémorragique et une diminution de la longueur du gros intestin (caecum, côlon et rectum) (Figure 1).

Ces résultats ont été confirmés en analysant la réponse inflammatoire intestinale (analyse histologique, détection des ARNm des cytokines pro-inflammatoires par qRT-PCR) dans les deux groupes d'animaux testés (données non montrées).

Exemple 2 : Evaluation de l'effet anti-inflammatoire de miR-27a-5p-mimic sur un modèle de cellules épithéliales intestinales humaines

Des cellules de la lignée Caco-2 sont transfectées par le miR-27a-5p-mimic pendant 24h puis traitées par du DSS 1 % durant 24h. L'activation des voies de signalisation pro-inflammatoires sera analysée par l'activation des effecteurs par Western blot, l'expression de gènes de cytokines pro-inflammatoire par qRT-PCR et leur synthèse dans le surnageant par ELISA.

Exemple 3 : Evaluation de l'effet du miR-27a-5p-mimic sur la réduction de l'apparition de tumeurs coliques dans un modèle de souris de MICI chronique DSS /cancer (induit par l'azoxyméthane : AOM)

Des souris C57BL/6 ont été traitées par une injection intrapéritonéale d'AOM (100 pl d'une solution à 2 pg/pl) pour l'induction de tumeurs coliques. Sept jours plus tard deux cycles de 20 jours ont été réalisés comprenant pour chaque cycle 6 jours de DSS dans l'eau de boisson suivis par deux semaines d'eau sans DSS. Lors de l'injection de l'AOM, un groupe de souris (n = 8) a reçu une injection par voie intraveineuse de 0,1 ml d'une solution de miR-27a-5p-mimic (100 pg) associé au véhicule in vivo-jetPEl® (société Polyplus). Cette injection a été réitérée pour ce groupe d'animaux tous les sept jours. Un groupe contrôle de souris (n = 8) a reçu une molécule anodine de miR (miR-nc, sans effet clinique ; fourni par la société Axolabs) également associé au véhicule in vivo-jetPEl®. A la fin des deux cycles, les côlons de chaque souris ont été prélevés, puis analysés au plan macroscopique pour quantifier les tumeurs (notamment au niveau du rectum), et histologique afin de confirmer la présence de tumeurs. Comme attendu, toutes les souris ont développé des manifestations de colite durant les cycles de DSS (diarrhée, rectorragie, perte de poids) avec des périodes de rémission durant les périodes sans DSS. Les animaux atteints de colite ayant été traités par le miR-27a-5p-mimic par voie IV (n = 8) ont présenté une amélioration des signes cliniques avec une forte diminution de la diarrhée et du saignement rectal dès 24 h après la première dose et après tout le long du traitement par le miR-27a-mimic.

L'analyse macroscopique des intestins (côlon et rectum) des souris traitées par le miR-27a-5p- mimic comparée à celle des animaux non traités par ce miARN a montré une nette diminution du nombre tumeurs du gros intestin (notamment du rectum) (Figure 2A ; une souris du groupe contrôle est décédée au cours de l'expérience).

Ces résultats ont été confirmés en analysant la présence des tumeurs intestinales sur des coupes histologiques (Figure 2B).

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Claims

REVENDICATIONS

1. Composition pharmaceutique contenant un ARN double-brin mimique du miR-27a-5p pour son utilisation pour traiter un sujet souffrant d'une maladie inflammatoire chronique de l'intestin ( M ICI ), et dans laquelle ledit ARN mimique du miR-27a-5p contient au moins 5, 6, 7 ou 8 des 8 nucléotides consécutifs AGGGCUUA.

2. Composition pharmaceutique pour son utilisation selon la revendication 1, dans laquelle ledit ARN mimique du miR-27a-5p contient la séquence AGGGCUUA.

3. Composition pharmaceutique pour son utilisation selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle ledit ARN mimique du miR-27a-5p contient deux brins d'ARN de séquences respectives SEQ ID NO : 2 et SEQ ID NO : 3.

4. Composition pharmaceutique pour son utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, comprenant en outre un excipient pharmaceutiquement acceptable.

5. Composition pharmaceutique pour son utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, dans laquelle ledit ARN mimique du miR-27a-5p est associé à ou inclus dans un vecteur, une matrice ou des particules favorisant sa stabilité et/ou sa transfection.

6. Composition pharmaceutique pour son utilisation selon la revendication 5, dans laquelle ledit vecteur est choisi parmi : les adénovirus, les rétrovirus, les lentivirus, les virus adéno-associé (AAV), les virus de l'herpès, les cytomégalovirus (CMV), et les virus de la vaccine.

7. Composition pharmaceutique pour son utilisation selon la revendication 5, dans laquelle lesdites particules sont choisies parmi : les liposomes (DOPC), les nanoparticules lipidiques, les nanocellules, les nanoparticules de silice, les exosomes.

8. Composition pharmaceutique pour son utilisation selon la revendication 5, dans laquelle ladite matrice est choisie parmi l'émulsion lipidique neutre (NLE), le polyethylenimine (PEI), le poly(lactide-co-glycolide) (PLGA).

9. Composition pharmaceutique pour son utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, pour prévenir ou traiter un cancer du côlon induit par une M ICI.

10. Composition pharmaceutique pour son utilisation selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisée en ce que la composition pharmaceutique est sous une forme adaptée pour l'administration par voie intraveineuse.