EP4705774A1 - Procédé pour le diagnostic in vitro d'une maladie neurodégénerative - Google Patents

Procédé pour le diagnostic in vitro d'une maladie neurodégénerative

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EP4705774A1
EP4705774A1 EP24729891.2A EP24729891A EP4705774A1 EP 4705774 A1 EP4705774 A1 EP 4705774A1 EP 24729891 A EP24729891 A EP 24729891A EP 4705774 A1 EP4705774 A1 EP 4705774A1
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Muriel-Réjane JACQUIER-SARLIN
Alain Buisson
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Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Universite Grenoble Alpes
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Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Universite Grenoble Alpes
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Abstract

L'invention concerne un procédé pour le diagnostic in vitro d'une maladie neurodégénérative, chez un individu humain ou animal, à un stade précoce, comprenant l'étape qui consiste à détecter la présence d'au moins un marqueur choisi parmi les formes dérivées des peptides béta-amyloïdes (Aβ) sélectionnées parmi les oligomères desdits peptides et les formes agrégées préfibrillaires et fibrillaires desdits peptides, et les formes dérivées des protéines tau phosphorylées sélectionnées parmi les formes hyperphosphorylées desdites protéines, les formes agrégées desdites protéines et les protéines tau phosphorylées modifiées résultant d'une ou de modifications post-traductionnelles, la présence du ou des marqueurs étant détectée dans un échantillon de selles dudit individu.

Description

DESCRIPTION
TITRE : PROCEDE POUR LE DIAGNOSTIC IN VITRO D’UNE MALADIE NEURODEGENERATIVE
La présente invention concerne la détection de maladies neurodégénératives (MND), et plus précisément la détection de ces maladies à un stade précoce.
Par maladie neurodégénérative, on entend une maladie chronique progressive qui affecte le système nerveux et entraine des troubles irréversibles d’ordre cognitif, comportemental, sensoriel et moteur. La maladie d’Alzheimer est la forme la plus fréquente de démence chez l’individu humain, elle représente de 60 à 70% des cas de démence, viennent ensuite la maladie de Parkinson au second rang, puis des maladies comme la maladie de Charcot, la maladie de Huntington. Elles sont toutes caractérisées par une perte progressive de la fonction des neurones et par un facteur de risque majeur, le vieillissement.
Plusieurs maladies neurodégénératives et en particulier les maladies précitées, sont classées dans les protéinopathies, en ce qu’elles sont associées à la présence de protéines sous une forme anormalement agrégée et/ou mal repliée dont l’accumulation dans le cerveau entraîne une toxicité. Appartiennent à ce groupe de pathologies, les tauopathies qui ont en commun une accumulation anormale de protéines tau sous forme d’amas et qui partagent des similitudes cliniques et pathologiques. L’invention se rapporte au diagnostic de telles maladies et particulièrement celles associées à au moins l’une des protéines beta amyloïde et tau.
La présente invention est décrite en référence aux tauopathies, en particulier à la maladie d’Alzheimer, mais elle n’y est pas limitée et s’étend à toutes les MND répondant à la définition ci-dessus.
La maladie d'Alzheimer (MA) est une maladie neurodégénérative incurable qui débute par une longue phase asymptomatique et qui est caractérisée par un déclin progressif des capacités cognitives accompagné d'une perte neuronale et synaptique.
Il n’existe actuellement aucun traitement curatif de la maladie d’Alzheimer et l'échec des dernières stratégies thérapeutiques résulte en grande partie d’un diagnostic trop tardif de la maladie alors que les premiers signes caractéristiques sont déjà visibles.
Le diagnostic de la MA a pourtant considérablement évolué ces dernières années avec la mise en évidence de la présence concomitante de deux types de lésions cérébrales, caractéristiques de la maladie : des dépôts extracellulaires de peptides amyloïdes (Ap), en particulier d’Ap42, désignés par plaques amyloïdes ou plaques séniles, et des dépôts intraneuronaux de protéines tau hyperphosphorylées (P-tau), associés à une dégénérescence neurofibrillaire (DNF). Ainsi, à ce jour, la détection de la MA repose sur des tests neuropsychologiques, le dosage des peptides amyloïdes et des protéines tau hyperphosphorylées dans le liquide céphalorachidien (LCR), les imageries morphologiques (IRM) et la technologie de tomographie par émission de positons (TEP) pour détecter les traceurs fonctionnels (TEP au fluorodésoxyglucose radioactif ou 18FDG) ou moléculaires (TEP-amyloïde et TEP-tau).
La détection des marqueurs de la MA, Ap et tau, est effectuée dans le LCR car il contient des protéines provenant du cerveau, mais la collecte du LCR peut être difficile en fonction de l'âge et de l'état de santé du patient car elle nécessite une ponction lombaire, une procédure invasive.
L’intérêt de ces marqueurs réside dans leur utilisation synergique pour affiner le diagnostic positif et commencer à apporter des informations de pronostic au patient. Cependant, même s’ils sont très sensibles et spécifiques pour le diagnostic positif et pour détecter les lésions physiopathologiques dès le stade de la plainte de mémoire ou de troubles cognitifs mineurs, bien avant le déclin cognitif et la perte d’autonomie, le diagnostic intervient à la phase clinique de la MA, alors qu’elle est précédée d’une phase préclinique de l’ordre de 20 ans, voire plus, au cours de laquelle aucun ou seulement des symptômes subtils de la maladie sont observés. L’identification de marqueurs dans cette phase de la maladie permettrait :
1 ) de retarder l'apparition de la maladie ou même de prévenir la démence de la MA ; en effet, les traitements actuels peuvent seulement contribuer à améliorer les symptômes cliniques, mais ne peuvent pas retarder ou inverser la progression de la MA ;
2) une intervention plus en amont de stratégies thérapeutiques qui pourraient avoir une meilleure efficacité ; et
3) un suivi systématique des patients et de l’efficacité des traitements.
Des études ont été menées sur la détection d’une signature moléculaire de la MA dans un fluide corporel comme le sang ou la salive, qui peut être collecté de manière peu invasive.
S’agissant du marqueur Ap, celui-ci est produit dans le cerveau et se retrouve effectivement présent dans le plasma sanguin. Toutefois, il est aussi produit dans les plaquettes et les tissus périphériques, complexifiant sa distinction, dans le plasma, entre l’Ap provenant du cerveau et celui produit. De plus, les concentrations plasmatiques d’Ap42 sont au moins 100 fois plus faibles que dans le LCR (typiquement, de l'ordre de quelques pg/ml) et sont diluées par la concentration élevée des autres composants protéiques non spécifiques. Enfin, les peptides Ap plasmatiques, en raison de leur nature hydrophobe, ont tendance à se lier aux érythrocytes et à d'autres protéines plasmatiques ce qui est susceptible d’entraîner un masquage des épitopes et alors empêcher la détection des peptides.
Quant au marqueur P-tau, sécrété dans le LCR, il est aussi présent dans le plasma sanguin. Un test semi-sensible pour ce marqueur phosphorylé sur la thréonine 181 (similaire au test LCR le plus utilisé) avec détection par électrochimioluminescence a été a été mis au point. Ce test a permis de mettre en évidence que la concentration plasmatique de P-tau était plus élevée chez les patients atteints de démence Alzheimer que chez les témoins (2 à 4 fois). Cette augmentation apparaît dans la phase préclinique de la maladie, mais peut aussi surgir dans d’autres circonstances de façon épisodique comme les lésions cérébrales hypoxiques aiguës dans le cas d'une commotion cérébrale et pendant une anesthésie, ce qui a conduit à écarter ce test.
D’autres protéines candidates dans le sang ont été trouvées par l'approche protéomique (Kitamura Y. et al., Plasma protein profiling for potential biomarkers in the early diagnosis of Alzheimer’s disease, Neurological Research. Taylor & Francis, 39(3), pp231-238, (2017) mais elles n’ont pas permis d’obtenir des résultats satisfaisants.
Le document WO2019/192969A1 décrit un procédé de diagnostic ou de pronostic, à un stade dit précoce, d’une maladie associée à un peptide ou une protéine amyloïde dans un échantillon biologique consistant à y détecter spécifiquement des agrégats de ce peptide ou de cette protéine, ou à en déterminer le nombre, la concentration ou la taille. Un échantillon biologique peut être un échantillon de sang, d’urine, de fluide synovial, de selles, de salive. Ce procédé peut être complété par une étape consistant à détecter dans ledit échantillon la protéine tau, éventuellement phosphorylée, ou à en déterminer le nombre, la concentration ou la taille.
Le document W02021/239700A2 divulgue un procédé pour détecter des oligomères et des formes agrégées du peptide Ap en tant que marqueurs pathologiques d’une maladie neurodégénérative, notamment la maladie d’Alzheimer, dans un échantillon de selles, le procédé permettant de déterminer le nombre, la concentration et la taille des agrégats. Le choix des selles (ou fèces) considérées comme un reflet de la présence de ces marqueurs dans le cerveau, le liquide céphalo-rachidien et le sang, évite à l’individu des prélèvements invasifs et le recours à des professionnels de la santé pour effectuer le prélèvement. Ce procédé est applicable au diagnostic, notamment précoce, de la maladie d’Alzheimer.
L’accumulation des formes oligomères et agrégées des peptides amyloïdes et des formes phosphorylées des protéines tau sont effectivement des marqueurs d’une maladie neurodégénérative et plus leur détection est spécifique par rapport aux formes monomériques et plus elle est sensible, plus tôt le diagnostic est posé. Mais, comme indiqué précédemment, la phase préclinique est très longue et ce diagnostic intervient tardivement, ces formes agrégées étant déjà en présence ubiquitaire et la phase clinique de la maladie amorcée.
A ce jour, il existe toujours un crucial besoin d’identifier des marqueurs viables pour la MA, qui suivent la progression de la maladie dans le temps et dont les concentrations peuvent changer en réponse à un traitement de la maladie.
Il a été découvert, de manière surprenante, qu’une signature moléculaire viable et fiable de la MA est présente dans les selles (ou fèces) d’un humain ou d’un animal, à un stade précoce. Ces marqueurs sont les peptides béta-amyloïdes (Ap) et les protéines tau phosphorylées (P-tau) et leurs formes dérivées respectives, dont les variations permettent de caractériser un stade précoce de maladie neurodégénérative de type protéinopathie telle qu’une tauopathie, et notamment la maladie d’Alzheimer.
Ainsi l’invention concerne un procédé pour le diagnostic in vitro d’une maladie neurodégénérative, chez un individu humain ou animal, comprenant l’étape qui consiste à détecter la présence d’au moins un marqueur choisi parmi les formes dérivées des peptides béta-amyloïdes (Ap) sélectionnées parmi les oligomères desdits peptides et les formes agrégées préfibrillaires et fibrillaires desdits peptides ; et les formes dérivées des protéines tau phosphorylées (P-tau) sélectionnées parmi les formes hyperphosphorylées desdites protéines, les formes agrégées desdites protéines et les protéines tau phosphorylées modifiées résultant d’une ou de modifications post-traductionnelles, la présence du ou des marqueurs étant détectée dans un échantillon de selles (ou fèces) dudit individu.
Selon une mise en œuvre du procédé de l’invention, la maladie neurodégénérative est une tauopathie, et on détecte la présence d’au moins un marqueur choisi parmi lesdites formes dérivées des protéines tau phosphorylées, dans un échantillon de selles dudit individu. Selon une autre mise en œuvre du procédé de l’invention, la présence d’au moins un marqueur choisi parmi lesdites formes dérivées des peptides béta-amyloïdes et d’au moins un marqueur choisi parmi lesdites formes dérivées des protéines tau phosphorylées, est déterminée.
Dans tous les objets de l’invention décrits dans le présent texte, l’expression « au moins un marqueur choisi parmi les formes dérivées des peptides béta-amyloïdes (Ap) et les formes dérivées des protéines tau phosphorylées (P-tau) », il convient de comprendre que ledit objet implique un ou plusieurs marqueurs choisis indifféremment parmi les formes dérivées des peptides béta-amyloïdes (Ap) et les formes dérivées des protéines tau phosphorylées (P-tau). Lorsqu’il implique plusieurs marqueurs, toute combinaison de ceux-ci peut être envisagée.
La détection dans les selles de ces marqueurs qui présente l’avantage d’être moins invasive et moins coûteuse que leur détection dans le LCR, est en outre reproductible et sensible. De manière inattendue, elle se révèle spécifique pour le diagnostic précoce d’une MA, voire en mesure de révéler des sujets à risque de développer une MA. De plus, les biomarqueurs analysés à l’issue du prélèvement se sont montrés stables dans le temps, et leur concentration ne varie pas jusqu’à 7 jours post-prélèvement indiquant qu’il y a peu, voire aucune dégradation du prélèvement durant cette période. C’est en particulier le cas de la protéine tau et de ces formes dérivées qui se dégradent rapidement dans un échantillon biologique liquide, notamment aqueux, comme le sang ou le sérum (Schôll et al., Biomarkers for tau pathology, Molecular and Cellular Neuroscience, 97, pp18-33, 2019) et (Randall et al., Tau proteins in serum predict neurological outcome after hypoxic brain injury from cardie arrest : results of a pilot study. Resuscitation 84, pp351-356, 2013). Les auteurs ont en effet observé que, dans les selles, ces marqueurs peuvent être détectés plusieurs jours après le prélèvement, même une semaine, sans aucune évolution dans le temps, ni dans leur structure, ni dans leur concentration. Vu la praticité d’un prélèvement de selles qui peut être réalisé par l’individu lui-même et ensuite déposé ou envoyé dans un laboratoire pour une analyse, cette découverte est un réel progrès dans le diagnostic des tauopathies.
La présente invention apporte une réelle contribution au diagnostic des maladies neurodégénératives, telles que la maladie d’Alzheimer.
Comme évoqué précédemment, les peptides béta-amyloïdes (Ap) et les protéines tau phosphorylées ainsi que leurs formes dérivées respectives sont un groupe de molécules connues et bien identifiées. Leurs définitions sont rappelées ci-dessous.
On entend par peptide béta-amyloïde (Ap), une structure de 38 à 42 acides aminés issue du clivage enzymatique de la protéine précurseur de l’amyloïde (PPA) impliquant des enzymes de type beta- ou gamma-sécrétase. Le gène codant pour cette protéine est situé sur le chromosome 21. Le peptide béta-amyloïde qui est soluble a la capacité de s’oligomériser pour donner des oligomères solubles de différentes tailles et de s’agréger pour former des structures préfibrillaires et des plaques amyloïdes fibrillaires qui sont insolubles. Ainsi, par forme dérivée du peptide béta-amyloïde, on entend les oligomères du peptide béta-amyloïde quelle que soit leur taille, et les formes agrégées préfibrillaires et fibrillaires (Chen, Gf., et al. Amyloid beta: structure, biology and structure-based therapeutic development. Acta Pharmacol Sin 38, 1205- 1235 (2017). Il doit être observé que, selon une mise en œuvre particulière de l’invention, à savoir une détection par DotBIot, ces différentes conformations peuvent être distinguées. C’est un atout supplémentaire pour l’invention, car les formes oligomériques, qui ne sont pas encore agrégées, sont les plus toxiques. Dans la définition de forme dérivée du peptide Ap, entre aussi les peptides modifiés résultant d’une ou de modifications post-traductionnelles tels qu’un peptide Ap tronqué.
La protéine tau est une protéine codée par le gène de la protéine tau associée aux microtubules (MAPT) sur le chromosome 17 humain et est décrite dans Xia et al. Molecular Neurodegeneration 16, 37 (2021 ). C’est une protéine hydrosoluble, elle présente environ 80 sites potentiels de phosphorylation, sur les acides aminés sérine et thréonine. Chez un individu sain, certains de ces sites sont phosphorylés dans les conditions physiologiques, mais dans certaines conditions pathologiques, et en particulier dans les MND, la protéine est fortement phosphorylée (désignée par P-tau, protéine tau phosphorylée ou protéine tau hyperphosphorylée). Selon l’invention, on entend par protéine tau phosphorylée, une phosphorylation anormale de certains sites clés préalablement identifiés de la protéine tau. Par forme dérivée de la protéine tau phosphorylée, on comprend les formes hyperphosphorylées que l’on retrouve sur les sites pathologiques, des protéines tau agrégées et des protéines modifiées résultant d’une ou de modifications post-traductionnelles telles qu’une protéine tau tronquée.
Les formes dérivées du peptide Ap ou de la protéine tau résultant de modification(s) post-traductionnelle(s) sont une notion connue de l’homme du métier. A titre d’exemples, il peut se référer aux articles suivants :
Carroll T, Guha S, Nehrke K and Johnson GVW; Tau Post-Translational Modifications: Potentiators of Selective Vulnerability in Sporadic Alzheimer’s Disease. Biology 2021 , 10, 1047;
Alquezar C, Arya S and Kao AW; Tau Post-translational Modifications: Dynamic Transformers of Tau Function, Degradation, and Aggregation. Front. Neurol. 2021 , 11 :595532; et
Barykin EP, Mitkevich VA, Kozin SA and Makarov AA; Amyloid p Modification: A Key to the Sporadic Alzheimer’s Disease? Front. Genet. 2017, 8:58.
Le peptide Ap et la protéine tau sont des entités hydrosolubles ; comme indiqué précédemment, elles tendent à former des oligomères qui, en augmentant de taille, deviennent de moins en moins hydrosolubles pour évoluer vers des agrégats qui sont insolubles en milieu aqueux.
En tant que marqueur choisi parmi les peptides béta-amyloïdes (Ap) et les protéines tau phosphorylées (P-tau), ainsi que leurs formes dérivées respectives, on entend qu’ils sont à l’état libre, ou dans un état combiné à une ou d’autres entités telles que d’autres protéines/peptides, n’empêchant pas leur détection.
Dans une variante de l’invention, les peptides béta-amyloïdes (Ap) et les protéines tau phosphorylées (P-tau), en tant que monomères non spécifiques d’un diagnostic précoce d’une maladie neurodégénérative, peuvent être utilisés comme marqueur(s) dans le calcul d’un ratio formes dérivées / toutes formes dudit peptide ou de ladite protéine ; toutes formes incluant les peptides (Ap) et formes dérivées de ceux-ci telles que décrites précédemment ou les protéines tau phosphorylées (P-tau) et formes dérivées de celles-ci telles que décrites précédemment, respectivement.
Selon une mise en œuvre préférentielle de chacun des procédés, kit et utilisations de l’invention, on détecte au moins un marqueur choisi parmi lesdites formes dérivées des peptides béta-amyloïdes, et au moins un marqueur choisi parmi lesdites formes dérivées des protéines tau phosphorylées.
Par stade précoce selon l’invention, on entend un stade auquel les symptômes légers de démence ne sont pas encore apparus ou apparaissent, sans qu’un lien direct n’ait été établi avec une maladie neurodégénérative. A titre d’exemples, il peut correspondre au stade auquel les premiers troubles mnésiques sont détectés ou auquel d’autres troubles sont observés notamment lors de campagnes de dépistage telles qu’elles sont mises en place à partir de 50 ans pour des cancers. Les auteurs ont aussi découvert qu’à ce stade précoce, lesdites formes dérivées des peptides béta-amyloïdes et lesdites formes dérivées des protéines tau phosphorylées ne sont pas accumulées dans le cerveau. Ceci signifie qu’à ce stade précoce, le cerveau est encore capable d’éliminer ces formes dérivées ; ces dernières peuvent donc y être présentes mais non de manière pathologique puisqu’elles ne s’y accumulent pas. Il ressort qu’à ce stade précoce selon l’invention, les tissus et liquides biologiques ne contiennent pas les mêmes formes de molécules, monomériques et solubles, ou agrégées et insolubles. Par rapport à l’état de la technique et en particulier par rapport aux documents précités, WO2019/192969A1 et W02021/239700A2, l’invention repose sur la mise en évidence d’un processus d’élimination des formes dérivées des peptides Ap et des protéines tau produites dans le cerveau, dans les selles où elles peuvent être détectées avant leur accumulation toxique dans le cerveau.
La présence de ces formes dérivées dans le cerveau peut être déterminée par imagerie médicale comme la tomographie par émission de positrons (PET) ; l’homme du métier peut se référer aux documents suivants :
Brain imaging using PET and radiotracers will reflect reliably on fibrillar deposits of amyloid in the brain that are > 1 mm in size (20-22) 20. Saint-Aubert, L., Lemoine, L., Chiotis, K., Leuzy, A., Rodriguez-Vieitez, E., and Nordberg, A. (2017) Molecular neurodegeneration 12, 19 Garibotto, V., Herholz, K., Boccardi, M., Picco, A., Varrone, A., Nordberg, A., Nobili, F., Ratib, O., and Geneva Task Force for the Roadmap of Alzheimer's, B. (2017) Neurobiology of aging 52, 183-195
Chiotis, K., Saint-Aubert, L., Boccardi, M., Gietl, A., Picco, A., Varrone, A., Garibotto, V., Herholz, K., Nobili, F., Nordberg, A., and Geneva Task Force for the Roadmap of Alzheimer's, B. (2017) Neurobiology of aging 52, 214-227.
Il a en outre été constaté que lesdites formes dérivées des peptides Ap et des protéines tau phosphorylées détectées dans les selles sont différentes de celles présentes dans l’intestin, suggérant qu’elles parviennent dans les selles par une autre voie que la voie digestive. Ceci est corroboré par l’étude décrite dans A. Lionnet et al, Acta Neuropathologica Communications (2018) 6 :65.
Dans une variante, le procédé de l’invention comprend les étapes suivantes : on met en contact ledit échantillon de selles dudit individu en présence d’au moins un anticorps ou partie d’anticorps reconnaissant spécifiquement au moins l’un desdits marqueurs, dans des conditions permettant la formation d’un complexe entre ledit anticorps ou partie d’anticorps et ledit marqueur, et on détecte la présence d’un dit complexe, le cas échéant, la présence d’un dit complexe déterminant l’atteinte de l’individu par une maladie neurodégénérative. Selon une variante de l’invention, ce procédé permet le diagnostic in vitro de la maladie d’Alzheimer, chez un individu.
Comme dit précédemment, un des intérêts de l’invention est d’obtenir un diagnostic précoce. En cela, l’individu testé peut être asymptomatique ou présenter quelques troubles cognitifs mineurs qui peuvent ne pas être directement associés à une MND.
L’invention concerne aussi un procédé de suivi de l’état d’un individu humain ou animal suspecté d’être atteint d’une maladie neurodégénérative, comprenant les étapes suivantes : on met en contact un premier échantillon de selles dudit individu en présence d’au moins un anticorps ou partie d’anticorps reconnaissant spécifiquement au moins un marqueur choisi parmi les peptides béta-amyloïdes, les formes dérivées desdits peptides, les protéines tau phosphorylées et les formes dérivées desdites protéines, dans des conditions permettant la formation d’un complexe entre ledit anticorps ou partie d’anticorps et ledit marqueur, on mesure la teneur d’un dit complexe dans le premier échantillon, puis on met en contact un second échantillon de selles dudit individu, ledit second échantillon étant prélevé après le premier échantillon, en présence dudit anticorps ou partie d’anticorps, dans des conditions permettant la formation d’un complexe entre ledit anticorps ou partie d’anticorps et ledit marqueur, on mesure la teneur d’un dit complexe dans le second échantillon, une variation entre les teneurs dudit complexe dans le premier échantillon et dans le second échantillon, indiquant une progression de la maladie ou une régression de la maladie.
Dans une variante de ce procédé, l’anticorps ou partie d’anticorps reconnaît spécifiquement au moins un peptide béta- amyloïde ou une forme dérivée d’un peptide béta-amyloïde et forme avec celui-ci un complexe, et une teneur dudit complexe dans le second échantillon supérieure à la teneur de ce même complexe dans le premier échantillon indique une progression de la maladie, à un stade précoce, ou une teneur dudit complexe dans le second échantillon inférieure à la teneur de ce même complexe dans le premier échantillon indique une régression de la maladie.
Selon une autre variante d’un procédé de suivi de l’état d’un individu, qui peut être combinée à la ou une précédente, l’anticorps ou partie d’anticorps reconnaît spécifiquement au moins une protéine tau phosphorylée soluble ou une forme dérivée d’une protéine tau phosphorylée et forme avec celle- ci un complexe, et une teneur dudit complexe dans le second échantillon supérieure à la teneur de ce même complexe dans le premier échantillon indique une progression de la maladie, à un stade précoce, ou une teneur dudit complexe dans le second échantillon inférieure à la teneur de ce même complexe dans le premier échantillon indique une régression de la maladie.
Le procédé de suivi de l’état d’un individu humain ou animal suspecté d’être atteint d’une maladie neurodégénérative tel que présenté ci-dessus s’inscrit préférentiellement à un stade précoce de la maladie jusqu’à un stade où l’individu présente des troubles qui viennent d’être associés à une MND, par opposition à un stade tardif de la maladie. Il a effectivement été observé qu’à un stade tardif de la maladie, un individu peut subir des altérations de l’élimination des plaques, ce qui se traduit par une diminution de la teneur en marqueurs de l’invention dans les selles, ce qui, à ce stade, ne doit pas être interprétée comme une régression de la maladie.
L’une quelconque des variantes d’un procédé de suivi ci-dessus peut être mise en œuvre sur un échantillon de selles d’un individu traité pour ladite maladie, permettant notamment d’évaluer l’efficacité du traitement.
Ainsi, l’invention a aussi pour objet un procédé de criblage d’un médicament pour traiter une maladie neurodégénérative, chez un individu suspecté d’être atteint d’une telle maladie, comprenant les étapes suivantes : on met en contact un premier échantillon de selles dudit individu en présence d’au moins un anticorps ou partie d’anticorps reconnaissant spécifiquement au moins un marqueur choisi parmi les peptides béta-amyloïdes, les formes dérivées desdits peptides, les protéines tau phosphorylées et les formes dérivées desdites protéines, dans des conditions permettant la formation d’un complexe entre ledit anticorps ou partie d’anticorps et ledit marqueur, on mesure la teneur d’un dit complexe dans le premier échantillon, puis on met en contact un second échantillon de selles dudit individu, ledit second échantillon étant prélevé après le premier échantillon, en présence dudit anticorps ou partie d’anticorps, dans des conditions permettant la formation d’un complexe entre ledit anticorps ou partie d’anticorps et ledit marqueur, on mesure la teneur d’un dit complexe dans le second échantillon, une variation entre les teneurs dudit complexe dans le premier échantillon et dudit complexe dans le second échantillon, indiquant l’efficacité ou l’inefficacité dudit médicament.
Dans une variante de ce procédé, l’anticorps ou partie d’anticorps reconnaît spécifiquement au moins un peptide béta- amyloïde ou une forme dérivée d’un peptide béta-amyloïde et forme un complexe avec celui-ci, et la teneur dudit complexe dans le second échantillon inférieure à la teneur de ce complexe dans le premier échantillon indique une efficacité du médicament.
Dans une autre variante du procédé, qui peut être combinée à la ou une variante ci- dessus, l’anticorps ou partie d’anticorps reconnaît spécifiquement au moins une protéine tau phosphorylée ou une forme dérivée d’une protéine tau phosphorylée et forme un complexe avec celle-ci, et une teneur dudit complexe dans le second échantillon inférieure à la teneur de ce complexe dans le premier échantillon indique une efficacité du médicament.
La durée séparant le prélèvement du premier et du second échantillon sera variable selon le procédé mis en œuvre. Ainsi dans un procédé de suivi de l’état d’un individu ayant un traitement thérapeutique, cette durée pourra être courte et le procédé répété plus fréquemment que dans un procédé pour le diagnostic. Néanmoins, le procédé étant non invasif, il est envisageable de multiplier les prélèvements pour un suivi individualisé et rapproché.
Selon l’une quelconque des variantes ci-dessus, les formes monomères non spécifiques des peptides Ap et/ou des protéines P-tau, en tant que monomères non spécifiques d’un diagnostic précoce d’une maladie neurodégénérative, pourront être utilisées comme marqueur(s) dans le calcul du ratio formes dérivées desdits peptides AP ou desdites protéines P-tau / toutes formes desdits peptides Ap ou desdites protéines P-tau.
L’invention se rapporte en outre à un kit pour la détection in vitro d’une maladie neurodégénérative, au stade précoce, d’un individu humain ou animal, comprenant au moins un anticorps ou partie d’anticorps reconnaissant spécifiquement au moins un marqueur choisi parmi les formes dérivées des peptides béta-amyloïdes (Ap) sélectionnées parmi les oligomères desdits peptides et les formes agrégées préfibrillaires et fibrillaires desdits peptides ; et parmi les formes dérivées des protéines tau phosphorylées sélectionnées parmi les formes hyperphosphorylées desdites protéines, les formes agrégées desdites protéines et les protéines tau phosphorylées modifiées résultant d’une ou de modifications post-traductionnelles, et les moyens permettant l’extraction, à partir d’un échantillon de selles dudit individu, d’au moins un marqueur choisi parmi les peptides béta-amyloïdes (Ap), les formes dérivées, les protéines tau phosphorylées et les formes dérivées desdites protéines, et la formation d’un complexe entre ledit anticorps ou partie d’anticorps et ledit marqueur,
Le kit de l’invention peut aussi comprendre des anticorps reconnaissant les formes monomères des peptides Ap et/ou des protéines P-tau, non spécifiques d’un diagnostic précoce d’une maladie neurodégénérative, celles-ci pouvant être utilisées en tant que marqueur(s) dans le calcul du ratio formes dérivées desdits peptides Ap / quantités totales desdits peptides Ap et de leurs formes dérivées, ou du ratio formes dérivées desdites protéines P-tau / quantités totales desdits protéines P-tau et de leurs formes dérivées.
L’invention a également pour objet l’utilisation d’un marqueur choisi parmi les formes dérivées des peptides béta-amyloïdes (Ap) sélectionnées parmi les oligomères desdits peptides et les formes agrégées préfibrillaires et fibrillaires desdits peptides ; et parmi les formes dérivées des protéines tau phosphorylées sélectionnées parmi les formes hyperphosphorylées desdites protéines, les formes agrégées desdites protéines et les protéines tau phosphorylées modifiées résultant d’une ou de modifications post-traductionnelles, pour le diagnostic in vitro d’une maladie neurodégénérative, chez un individu, ledit marqueur étant détecté dans les selles dudit individu. Selon une utilisation de l’invention le diagnostic est effectué à un stade précoce de la maladie. En particulier, elle est destinée pour le diagnostic in vitro de la maladie d’Alzheimer.
La détection des formes dérivées des peptides Ap et des protéines tau phosphorylées peut être conduite par des techniques à la portée de l’homme du métier. Ainsi, l’anticorps AT8 permettant de détecter spécifiquement la protéine tau hyperphosphorylée. Il existe des anticorps anti-peptide amyloïde oligomérique toxique (tels que Apo, E22P), anti-peptide amyloïde fibrillaire (tels que Ap-F, OC) ; l’utilisation de ces anticorps est illustrée dans les exemples qui suivent.
La présente invention est illustrée dans l’exemple qui suit et à l’appui des figures selon lesquelles :
[Fig. 1] et [Fig. 2] représentent la quantité, déterminée par analyse densitométrique et exprimée en intensité relative, des peptides amyloïdes oligomériques toxiques (E22P), des peptides amyloïdes préfibrillaires (OC) et des protéines P-tau (Tau-PThr181, Tau-PThr205) d’une fraction de peptides et protéines solubles [Fig. 1] et d’une fraction de peptides et protéines insolubles [Fig. 2], extraites de fèces de souris sauvages (WT) et de souris transgéniques de la MA (APP/PS1-21 ), en fonction du temps exprimé en mois : à 1 mois, Fig. 1A et Fig. 2A ; à 4 mois, Fig. 1 B et Fig. 2B ; à 6 mois, Fig. 1C et Fig. 2C ; à 9 mois, Fig. 1 D et Fig. 2D.
Exemple
Dans un modèle de souris transgénique (TG) de la maladie d’Alzheimer (MA) (souris APP/PS1-21 ), la progression temporelle (de 1 à 9 mois) de la MA a été suivie respectivement dans les selles, dans le cerveau et dans les intestins.
1) Suivi dans les selles
Des fèces de souris de type sauvage (WT) et de souris APP/PS1 ont été collectées et les protéines de ces échantillons ont été extraites.
Mode opératoire 1.1 ) Récupération des selles
Les souris sont installées dans une cage propre pendant deux heures au bout desquelles les crottes sont ramassées et comptées avant d’être congelées à -80°C. Puis les échantillons sont décongelés, 5-6 crottes (100 mg) sont transférées dans un tube et placées toute la nuit dans un incubateur à 56°C pour y être déshydratées. Le matériel sec est pesé à nouveau afin de déterminer le % en eau qui reflète en partie le fonctionnement intestinal.
1 .2) Extraction protéique
Les selles desséchées sont reprises dans 1 ml de tampon RIPA (50 mM Tris-HCI pH8, 150 mM NaCI, 1 % NP-40, 0,5% sodium désoxycholate et 0,1 % SDS) contenant un cocktail d’inhibiteurs de protéases et de phosphatases. L’homogénat est incubé 10 minutes sur glace avant d’être soumis à 5 cycles de sonication dans les conditions suivantes : 10 secondes de sonication (Amplitude 45) + 10 secondes dans la glace. L’homogénat est ensuite centrifugé 10 minutes à 4°C à 14 000 tours/minutes. Le surnageant est récupéré dans un tube propre. Il contient les protéines solubles.
Le culot est re-suspendu dans 1 mL de tampon 5M guanidine HCl / 50 mM Tris-HCI pH 8 contenant un cocktail d’inhibiteurs de protéases et phosphatases. L’homogénat est à nouveau soumis à 5 cycles de sonication dans les conditions suivantes : 10 secondes de sonication (Amplitude 45) + 10 secondes dans la glace. L’homogénat est ensuite centrifugé 10 minutes à 4°C à 14 000 tours/minute. Le surnageant est récupéré dans un tube propre. Il contient les protéines insolubles.
Le contenu en protéines de chacune des fractions est déterminé en utilisant le kit de dosage protéique BCA (Pierce™).
1 .3) Analyse des fractions par DotBIot
Dix pg de protéines sont absorbés par capillarité sur une membrane de nitrocellulose (appareil Biorad) et traités pour une analyse DotBIot avec des anticorps anti-peptide amyloïde oligomérique toxique (Apo, E22P), anti-peptide amyloïde fibrillaire (Ap-F, OC) et anti-Tau phosphorylé sur Thréonine 181 (pTauThr181) ou Thréonine 205 (pTauThr205). La normalisation des résultats est réalisée à l’aide d’un anticorps anti-GAPDH ou une coloration à l’amido-black pour la fraction soluble ou après coloration au Rouge Ponceau pour la fraction insoluble.
2) Suivi dans le cerveau et dans les intestins
Les protéines et les peptides sont récupérés des différents tissus et organes
Mode opératoire
2.1 ) Dissection
Aux différents âges étudiés, les souris sont sacrifiées par dislocation cervicale. Les cerveaux et les intestins de souris de type sauvage (WT) et de souris APP/PS1 sont collectés. Le cerveau est extrait de la boîte crânienne et disséqué afin de séparer le cortex et l’hippocampe. Les intestins sont récupérés et compartimentés comme suit : duodénum, jéjunum, iléum et colon. Ces échantillons sont séparés en 2 lots avant d’être congelés (dans l’azote liquide puis conservés à -80°C, dans l’OCT) :
- un des lots va servir à une analyse microscopique après préparation de coupe de 30 pm)
- l’autre lot va être utilisé pour des expériences biochimiques (Western Blot) ou de biologie moléculaire (QPCR).
2.2) Extraction protéique
Les échantillons d’intestins et de cerveaux sont repris dans 1 ml de tampon RIPA (50 mM Tris-HCI pH 8, 150 mM NaCI, 1 % NP-40, 0,5% sodium désoxycholate et 0,1 % SDS) contenant un cocktail d’inhibiteurs de protéases et phosphatases. Les tissus sont broyés grâce à un programme automatisé sur broyeur Milteny. L’homogénat est ensuite centrifugé 10 minutes à 4°C à 2 500 tours/minute. Le surnageant est récupéré dans un tube propre. Il contient les protéines. Le contenu en protéines de chacune des fractions est déterminé en utilisant le kit de dosage protéique BCA (Pierce™).
2.3) Analyse des lysats par Western Blot
Quinze pg de protéines sont mises à migrer sur gel de polyacrylamide SDS-PAGE (BioRad) à 100 volts pendant une heure et 30 minutes. Le gel est ensuite électrotransféré sur une membrane de polyfluorure de vinylidène (BioRad) et traité pour analyse avec des anticorps anti-peptide amyloïde oligomérique (Apo, A11 ), anti-peptide amyloïde fibrillaire (Ap-F, OC) et anti-Tau phosphorylé sur Thréonine 205 (pTauThr205) ou Thréonine 181 (pTauThr181).
2.4 Microscopie confocale
Les tissus fixés au paraformaldéhyde (PFA) des souris WT et APP/PS1 ont été immergés dans du saccharose à 20% en PBS pendant une nuit, puis congelés dans du PFA refroidi et conservés à -30°C. Des sections (20-30 pm d'épaisseur) ont été coupées avec un microtome cryostat (HM 500M, Microm). Les sections sont bloquées par incubation avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 0,1 % (v/v) de Triton X100 et 3% de BSA pendant 30 min à température ambiante. Les coupes de tissus ont ensuite été incubées pendant une nuit à 4°C avec des anticorps primaires dirigés contre les différentes protéines d’intérêt, lavées 3 fois avec du PBS contenant 0,2% de Tween20 (PBS-T) et incubées pendant 2h à température ambiante avec les anticorps secondaires conjugués à différents fluorochromes. Après trois lavages dans du PBS-T, les noyaux ont été colorés par incubation dans une solution de Hoescht (1 :200) pendant 5 minutes et les lames ont été montées dans un milieu de montage fluorescent (Dako).
2.5) Suivi dans le cerveau L’étude morphologique des épines et de la densité synaptique est réalisée par microscopie confocale en utilisant le modèle murin Thy1-eYFP APP/PS1-21 . La distribution des protéines Ap et P-tau est également analysée par microscopie confocale avec des anticorps spécifiques des différentes protéines. La présence des plaques amyloïdes est détectée par microscopie confocale en utilisant la thioflavine-T. Les niveaux d’expression de ces différentes protéines sont déterminés par Western Blot, DotBIot et/ou Elisa.
2.6) Suivi dans les intestins
Comme pour le cerveau, la distribution des protéines Ap et P-tau est analysée par microscopie confocale avec des anticorps spécifiques des différentes protéines. Cette technique permet également d’appréhender la structure et la morphologie des villosités et des cryptes intestinales. Les niveaux d’expression de ces différentes protéines sont déterminés par Western Blot, DotBIot. Le contexte inflammatoire sera validé par dosage en QPCR et en Elisa de différentes cytokines.
3) Résultats
L'analyse des peptides Ap fécaux (formes oligomériques toxiques E22P et pré-fibrillaires OC par des anticorps conformationnels spécifiques) et des protéines Tau-PThr181 et Tau-PThr205 a révélé une différence significative dans les fractions solubles extraites des fèces entre les animaux WT et TG, dès 1 mois, avant toute accumulation détectable dans le cerveau [Fig. 1A]. En effet les souris transgéniques éliminent significativement plus d’Apo toxiques (E22P), de pTauThr181 et de pTauThr205 que les animaux WT, à 1 mois. Ces différences se maintiennent à 2 mois (résultats non montrés). A partir de 4 mois [Fig. 1 B] et [Fig. 1C], les différences entre les animaux WT et TG sont moins importantes. A 9 mois [Fig. 1 D], la différence d’élimination des formes Apo toxiques (E22P) et de pTauThr181 entre les animaux WT et TG persistent et augmentent. De même à cet âge on observe une élimination significative des formes pré- fibrillaires d’Ap (OC) chez les animaux TG.
Dans les fractions insolubles, on observe une augmentation de la détection des protéines Tau-PThr181, Tau-PThr205 et Ap-F (OC) chez les animaux TG par rapport aux animaux WT à l'âge de 4 mois [Fig. 2B]. A partir de 6 mois [Fig. 2C] et [Fig. 2D], les animaux WT éliminent de façon identique pTauThr181 , voire plus de pTauThr205 ou Ap-F (OC) que les animaux transgéniques.
Au niveau du cerveau, des plaques amyloïdes sont détectées dans le cortex et l’hippocampe chez des souris à partir de 3 mois. Ces observations s’accompagnent de changements morphologiques et d’une diminution de la densité des synapses.
Au niveau intestinal, dès 6 semaines, on observe une accumulation de la forme oligomérique toxique d’Ap (Apo) et de la forme pré-fibrillaire (A p-F). Cependant il n’y a pas de plaques amyloïdes au niveau intestinal. Cette accumulation est associée à une désorganisation de la barrière épithéliale. Ces observations suggèrent une modification des propriétés de la barrière entraînant une altération des capacités d'absorption des nutriments et/ou de la motilité de transit des souris TG et le développement d’un contexte inflammatoire.
Ces résultats démontrent que, de manière inattendue, le tractus gastro-intestinal reflète ce qui se passe dans le cerveau au niveau d’Ap et de tau. Selon l’invention, des modifications moléculaires et histologiques solides sont observées, annonciateurs de la MA dans l’intestin, avant même l’apparition des premiers symptômes, i.e. avant toute atteinte du cerveau et spécifiquement à cette maladie.
L’utilisation des fèces par rapport aux marqueurs sanguins ou salivaires présente l’avantage d’être beaucoup plus précoce et plus sensible (les peptides Ap et les protéines tau éliminés sont stables et en quantités importantes).
Le dosage de ces marqueurs dans les selles constitue donc un outil performant pour le diagnostic précoce de la MA et le suivi de la progression de la maladie.
L'ensemble de ces observations indique que les changements intestinaux suivent la progression du cerveau de la MA. L'intestin révèle également une accumulation des peptides Ap et des protéines tau-phosphorylées dans les fèces qui a été détectée avant toute accumulation dans le cerveau. En effet, une accumulation puis une élimination des protéines solubles associées aux changements morphologiques intestinaux, suivie d'une clairance des protéines insolubles dans les fèces ont été observées.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé pour le diagnostic in vitro d’une maladie neurodégénérative, chez un individu humain ou animal, à un stade précoce, comprenant l’étape qui consiste à détecter la présence d’au moins un marqueur choisi parmi les formes dérivées des peptides béta-amyloïdes (Ap) sélectionnées parmi les oligomères desdits peptides et les formes agrégées préfibrillaires et fibrillaires desdits peptides, et les formes dérivées des protéines tau phosphorylées sélectionnées parmi les formes hyperphosphorylées desdites protéines, les formes agrégées desdites protéines et les protéines tau phosphorylées modifiées résultant d’une ou de modifications post-traduction nelles, ledit procédé étant caractérisé en ce que la présence du ou des marqueurs est détectée dans un échantillon de selles dudit individu.
2. Procédé selon la revendication 1 pour le diagnostic in vitro d’une tauopathie, chez un individu humain ou animal, à un stade précoce, comprenant l’étape qui consiste à détecter la présence d’au moins un marqueur choisi parmi les formes dérivées des protéines tau phosphorylées sélectionnées parmi les formes hyperphosphorylées desdites protéines, les formes agrégées desdites protéines et les protéines tau phosphorylées modifiées résultant d’une ou de modifications post-traduction nelles, dans un échantillon de selles dudit individu.
3. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce qu’il comprend l’étape qui consiste à détecter la présence d’au moins un marqueur choisi parmi lesdites formes dérivées des peptides béta-amyloïdes (Ap) et un marqueur choisi parmi lesdites formes dérivées des protéines tau phosphorylées.
4. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu’il comprend les étapes suivantes : on met en contact ledit échantillon de selles dudit individu en présence d’au moins un anticorps ou partie d’anticorps reconnaissant spécifiquement au moins l’un desdits marqueurs, dans des conditions permettant la formation d’un complexe entre ledit anticorps ou partie d’anticorps et ledit marqueur, on détecte la présence d’un dit complexe, le cas échéant, la présence d’un dit complexe déterminant l’atteinte de l’individu par une maladie neurodégénérative.
5. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, pour le diagnostic in vitro de la maladie d’Alzheimer, chez un individu.
6. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l’individu est asymptomatique.
7. Procédé de suivi de l’état d’un individu humain ou animal suspecté d’être atteint d’une maladie neurodégénérative, comprenant les étapes suivantes : on met en contact un premier échantillon de selles dudit individu en présence d’au moins un anticorps ou partie d’anticorps reconnaissant spécifiquement au moins un marqueur choisi parmi les peptides béta-amyloïdes (Ap), les formes dérivées desdits peptides, les protéines tau phosphorylées et les formes dérivées desdites protéines, dans des conditions permettant la formation d’un complexe entre ledit anticorps ou partie d’anticorps et ledit marqueur, on mesure la teneur d’un dit complexe dans le premier échantillon, puis on met en contact un second échantillon de selles dudit individu, ledit second échantillon étant prélevé après le premier échantillon, en présence dudit anticorps ou partie d’anticorps, dans des conditions permettant la formation d’un complexe entre ledit anticorps ou partie d’anticorps et ledit marqueur, on mesure la teneur d’un dit complexe dans le second échantillon, une variation entre les teneurs dudit complexe dans le premier échantillon et dudit complexe dans le second échantillon, indiquant une progression de la maladie ou une régression de la maladie.
8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l’anticorps ou partie d’anticorps reconnaît spécifiquement au moins un peptide béta- amyloïde ou une forme dérivée d’un peptide béta-amyloïde soluble et forme avec celui-ci un complexe, et une teneur dudit complexe dans le second échantillon supérieure à la teneur de ce même complexe dans le premier échantillon indique une progression de la maladie, à un stade précoce, ou une teneur dudit complexe dans le second échantillon inférieure à la teneur de ce même complexe dans le premier échantillon indique une régression de la maladie.
9. Procédé selon la revendication 7 ou 8, caractérisé en ce que l’anticorps ou partie d’anticorps reconnaît spécifiquement au moins une protéine tau phosphorylée soluble ou une forme dérivée d’une protéine tau phosphorylée et forme avec celle-ci un complexe, et une teneur dudit complexe dans le second échantillon supérieure à la teneur de ce même complexe dans le premier échantillon indique une progression de la maladie, à un stade précoce, ou une teneur dudit complexe dans le second échantillon inférieure à la teneur de ce même complexe dans le premier échantillon indique une régression de la maladie.
10. Procédé selon l’une quelconque des revendications 7 à 9, caractérisé en ce que ledit individu est traité pour ladite maladie.
11. Procédé de criblage d’un médicament pour traiter une maladie neurodégénérative, chez un individu suspecté d’être atteint d’une telle maladie, comprenant les étapes suivantes : on met en contact un premier échantillon de selles dudit individu en présence d’au moins un anticorps ou partie d’anticorps reconnaissant spécifiquement au moins un marqueur choisi parmi les peptides béta-amyloïdes (Ap), les formes dérivées desdits peptides, les protéines tau phosphorylées et les formes dérivées desdites protéines, dans des conditions permettant la formation d’un complexe entre ledit anticorps ou partie d’anticorps et ledit marqueur, on mesure la teneur d’un dit complexe dans le premier échantillon, puis on met en contact un second échantillon de selles dudit individu, ledit second échantillon étant prélevé après le premier échantillon, en présence dudit anticorps ou partie d’anticorps, dans des conditions permettant la formation d’un complexe entre ledit anticorps ou partie d’anticorps et ledit marqueur, on mesure la teneur d’un dit complexe dans le second échantillon, une variation entre les teneurs dudit complexe dans le premier échantillon et dudit complexe dans le second échantillon, indiquant l’efficacité ou l’inefficacité dudit médicament.
12. Procédé selon la revendication 11 , caractérisé en ce que l’anticorps ou partie d’anticorps reconnaît spécifiquement au moins un peptide béta- amyloïde ou une forme dérivée d’un peptide béta-amyloïde soluble et forme un complexe avec celui-ci, et la teneur dudit complexe dans le second échantillon inférieure à la teneur de ce complexe dans le premier échantillon indique une efficacité du médicament.
13. Procédé selon la revendication 11 ou 12, caractérisé en ce que l’anticorps ou partie d’anticorps reconnaît spécifiquement au moins une protéine tau phosphorylée ou une forme dérivée d’une protéine tau phosphorylée soluble et forme un complexe avec celle-ci, et une teneur dudit complexe dans le second échantillon inférieure à la teneur de ce complexe dans le premier échantillon indique une efficacité du médicament.
14. Kit pour la détection in vitro d’une maladie neurodégénérative, au stade précoce, d’un individu humain ou animal, comprenant au moins un anticorps ou partie d’anticorps reconnaissant spécifiquement au moins un marqueur choisi parmi les formes dérivées des peptides béta-amyloïdes (Ap) sélectionnées parmi les oligomères desdits peptides et les formes agrégées préfibrillaires et fibrillaires desdits peptides ; et parmi les formes dérivées des protéines tau phosphorylées sélectionnées parmi les formes hyperphosphorylées desdites protéines, les formes agrégées desdites protéines et les protéines tau phosphorylées modifiées résultant d’une ou de modifications post-traductionnelles, et les moyens permettant l’extraction, à partir d’un échantillon de selles dudit individu, d’au moins un marqueur tel que défini précédemment, et la formation d’un complexe entre ledit anticorps ou partie d’anticorps et ledit marqueur,
15. Utilisation d’un marqueur choisi parmi les formes dérivées des peptides béta- amyloïdes (Ap) sélectionnées parmi les oligomères desdits peptides et les formes agrégées préfibrillaires et fibrillaires desdits peptides ; et parmi les formes dérivées des protéines tau phosphorylées sélectionnées parmi les formes hyperphosphorylées desdites protéines, les formes agrégées desdites protéines et les protéines tau phosphorylées modifiées résultant d’une ou de modifications post-traductionnelles, pour le diagnostic in vitro d’une maladie neurodégénérative, chez un individu, ledit marqueur étant détecté dans les selles dudit individu.
16. Utilisation selon la revendication 15, caractérisée en ce que le diagnostic est effectué à un stade précoce de la maladie.
17. Utilisation selon la revendication 15 ou 16, caractérisée en ce que la maladie neurodégénérative est la maladie d’Alzheimer.
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