EP4689114A1 - Procede pour inhiber le processus de nitrification dans un sol - Google Patents

Procede pour inhiber le processus de nitrification dans un sol

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EP4689114A1
EP4689114A1 EP24723193.9A EP24723193A EP4689114A1 EP 4689114 A1 EP4689114 A1 EP 4689114A1 EP 24723193 A EP24723193 A EP 24723193A EP 4689114 A1 EP4689114 A1 EP 4689114A1
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EP
European Patent Office
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sequence
seq
soil
nucleotide
sbi
Prior art date
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Pending
Application number
EP24723193.9A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Davoud FARAJZADEH
Mustapha ARKOUN
Sylvain PLUCHON
Cécile MONARD
Abdelhak El Amrani
Emmanuel CLOSTRES
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Rennes 1
Agro Innovation International SAS
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Rennes 1
Agro Innovation International SAS
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Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Universite de Rennes 1, Agro Innovation International SAS filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP4689114A1 publication Critical patent/EP4689114A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C05—FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
    • C05G—MIXTURES OF FERTILISERS COVERED INDIVIDUALLY BY DIFFERENT SUBCLASSES OF CLASS C05; MIXTURES OF ONE OR MORE FERTILISERS WITH MATERIALS NOT HAVING A SPECIFIC FERTILISING ACTIVITY, e.g. PESTICIDES, SOIL-CONDITIONERS, WETTING AGENTS; FERTILISERS CHARACTERISED BY THEIR FORM
    • C05G3/00—Mixtures of one or more fertilisers with additives not having a specially fertilising activity
    • C05G3/90—Mixtures of one or more fertilisers with additives not having a specially fertilising activity for affecting the nitrification of ammonium compounds or urea in the soil
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0044—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on other nitrogen compounds as donors (1.7)
    • C12N9/0046—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on other nitrogen compounds as donors (1.7) with oxygen as acceptor (1.7.3)
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    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C12N9/0083—Miscellaneous (1.14.99)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y107/00—Oxidoreductases acting on other nitrogenous compounds as donors (1.7)
    • C12Y107/03—Oxidoreductases acting on other nitrogenous compounds as donors (1.7) with oxygen as acceptor (1.7.3)
    • C12Y107/03004—Hydroxylamine oxidase (1.7.3.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/99—Miscellaneous (1.14.99)
    • C12Y114/99039—Ammonia monooxygenase (1.14.99.39)

Definitions

  • the invention relates to a method for inhibiting the nitrification process in a soil, in which one or more miRNAs are applied to the soil in order to inhibit the expression of one or more genes which participate in the nitrification process in said soil, such as the genes encoding the enzyme AMO (Ammonia MonoOxygenase) and/or the enzyme HAO (HydroxylAmine Oxidoreductase).
  • AMO Ammonia MonoOxygenase
  • HAO Hydrophilic Acid Oxidoreductase
  • the invention also relates to a fertilizing composition comprising a fertilizer or an amendment, and one or more miRNAs.
  • N nitrogen
  • the oxidation state of nitrogen (N) varies considerably, ranging from -3 to +5, resulting in the formation of many nitrogen species, including N 2 O 5 , HNO 3 , HNO 3 , NO 2 , N 2 O 4 , HNO 2 , HNO 2 , NO, N 2 O, N 2 , NH 3 , NH 4 +, NH 4 Cl, and CH 3 NH 2 [1].
  • the inventors have thus developed a new strategy for inhibiting nitrification genes by showing that certain miRNAs have the property of inhibiting the nitrification process in soil.
  • the invention which finds application in the field of agriculture, relates to the discovery of microRNAs (miRNAs) having the capacity to inhibit mRNAs of different bacterial genera responsible for regulating the nitrification process in soils (hereinafter the invention).
  • miRNAs have been identified having the capacity to inhibit the mRNAs coding for the AMO and/or HAO enzymes, which would make it possible to inhibit the nitrification process in soils.
  • a first subject of the present invention relates to a method for inhibiting the nitrification process in a soil, in which one or more miRNAs of formula (I) are applied to the soil in order to inhibit the expression of one or more genes which participate in the nitrification process in said soil: [Nucleotide]-[Core sequence]-[3' sequence] (I), in which:
  • Nucleotide corresponds to a nucleotide chosen from A, U, G or C,
  • [3' sequence] corresponds to a sequence of 10 to 13 nucleotides
  • Core sequence corresponds to a nucleotide sequence chosen from the sequences SEQ ID NO: 1-8.
  • a second subject of the present invention relates to the use of a miRNA of formula (I) to inhibit the expression of one or more genes which participate in the nitrification process:
  • [3' sequence] corresponds to a sequence of 10 to 13 nucleotides
  • Core sequence corresponds to a nucleotide sequence chosen from the sequences SEQ ID NO: 1-8.
  • a third subject of the present invention relates to a composition comprising one or more isolated miRNA(s) of formula (I):
  • Nucleotide corresponds to a nucleotide chosen from A, U, G or C,
  • [3' sequence] corresponds to a sequence of 10 to 13 nucleotides
  • Core sequence corresponds to a nucleotide sequence chosen from the sequences SEQ ID NO: 1-8.
  • a fourth subject of the present invention relates to a culture support or a culture solution comprising one or more isolated miRNA(s) of formula (I) or a composition according to the invention.
  • the present invention relates to a method for inhibiting the nitrification process in a soil, wherein one or more miRNAs of formula (I) are applied to the soil in order to inhibit the expression of one or more genes which participate in the nitrification process in said soil: [Nucleotide]-[Core sequence]-[3' sequence] (I), in which:
  • Nucleotide corresponds to a nucleotide chosen from A, U, G or C,
  • [3' sequence] corresponds to a sequence of 10 to 13 nucleotides
  • Core sequence corresponds to a nucleotide sequence chosen from the sequences SEQ ID NO: 1-8.
  • the present invention also relates to the use of a miRNA of formula (I) to inhibit the expression of one or more genes which participate in the nitrification process:
  • Nucleotide corresponds to a nucleotide chosen from A, U, G or C,
  • [3' sequence] corresponds to a sequence of 10 to 13 nucleotides
  • the term "inhibiting the nitrification process” or “inhibition of the nitrification process” means at least 2%, at least 3%, at least 4%, at least 5%, at least 10%, at least 15%, at least 20%, at least 25%, at least 30%, at least 35%, at least 40%, at least 45%, or at least 50% reduction in the nitrification process compared to a reference condition.
  • the inhibition of the nitrification process is calculated by measuring the nitrification process in a soil to which one or more miRNAs of formula (I) are applied, and by comparing it with a soil to which one or more miRNAs of formula (I) have not been applied. A method for measuring the inhibition is detailed in the examples.
  • the term "inhibiting the expression of one or more genes” or “inhibition of the expression of one or more genes” refers to the property of miRNAs to inhibit the mRNAs of said one or more genes, thereby inhibiting the synthesis of proteins encoded by said inhibited genes.
  • the inhibition is at least 2%, at least 3%, at least at least 4%, at least 5%, at least 10%, at least 15%, at least 20%, at least 25%, at least 30%, at least 35%, at least 40%, at least 45%, or at least 50%, of reduction in the expression of said one or more genes compared to a reference condition.
  • the inhibition of the expression of one or more genes can be calculated by quantifying the proteins encoded by said inhibited genes and/or the corresponding mRNAs by implementing conventional techniques for those skilled in the art such as the ELISA method for quantifying the proteins or RT-qPCR for quantifying the mRNAs.
  • the percentage of inhibition is calculated by measuring the inhibition of the expression of one or more genes in a soil to which one or more miRNAs of formula (I) are applied, and by comparing it with a soil to which one or more miRNAs of formula (I) have not been applied.
  • miRNA refers to a short ribonucleic acid (RNA) molecule that acts as a post-transcriptional regulator by regulating target mRNAs.
  • a miRNA may be 20 to 24 nucleotides (nt) in length, preferably 20 to 22 nt, for example 20, 21 or 22 nt.
  • the preparation of a miRNA does not present any particular difficulty, for example by conventional chemical synthesis.
  • the miRNA of formula (I) is a synthetic miRNA, i.e. it has been synthesized in vitro, for example by chemical synthesis. Examples include synthesis on a solid support by the phosphoramidite method. In vitro synthesis makes it possible to easily obtain the desired quantities of miRNA of formula (I).
  • the miRNA of formula (I) comprises from 19 to 21 nucleotides, i.e. 19 nucleotides, 20 nucleotides or 21 nucleotides.
  • [Sequence 3'] corresponds to the 3' part of the sequence of the miRNA of formula (I). This sequence may comprise 10, 11, 12 or 13 nucleotides.
  • [Sequence S'] comprises at least 80% homology with a nucleotide sequence chosen from the sequences SEQ ID NO: 9-16, preferably at least 85% homology, for example at least 90% homology, at least 95% homology, at least 99% homology or even 100% homology.
  • [Core sequence] is SEQ ID NO: 1
  • [Sequence S'] preferably comprises at least 80% homology with the nucleotide sequence SEQ ID NO: 9.
  • [Sequence S'] preferably comprises at least 80% homology with the nucleotide sequence SEQ ID NO: 10.
  • [Sequence S'] preferably comprises at least 80% homology with the nucleotide sequence SEQ ID NO: 11.
  • [Sequence 3'] preferably comprises at least 80% homology with the nucleotide sequence SEQ ID NO: 12.
  • [Sequence S'] preferably comprises at least 80% homology with the nucleotide sequence SEQ ID NO: 13.
  • [Sequence 3'] preferably comprises at least 80% homology with the nucleotide sequence SEQ ID NO: 14.
  • [Sequence 3'] preferably comprises at least 80% homology with the nucleotide sequence SEQ ID NO: 15.
  • [Sequence S'] preferably comprises at least 80% homology with the nucleotide sequence SEQ ID NO: 16.
  • the miRNA of formula (I) may be selected from sbi-miR162 (SEQ ID NO: 17), sbi-miR394a (SEQ ID NO: 18), sbi-miR397-5p (SEQ ID NO: 19), sbi-miR5386 (SEQ ID NO: 20), sbi-miR5388 (SEQ ID NO: 21), sbi-miR5568d-3p (SEQ ID NO: 22), sbi-miR5568d-5p (SEQ ID NO: 23) and sbi-miR6232a-5p (SEQ ID NO: 24).
  • a mixture of several miRNAs of formula (I) each having a distinct [Core Sequence] may be applied to the soil.
  • from two to eight miRNAs of formula (I) each having a distinct [Core Sequence] are applied to the soil, for example a mixture of two, three, four, five, six, seven or eight miRNAs of formula (I) each having a distinct [Core Sequence] is applied to the soil.
  • it may be a mixture comprising sbi-miR162 (SEQ ID NO: 17), sbi-miR394a (SEQ ID NO: 18), sbi-miR397-5p (SEQ ID NO: 19), sbi-miR5386 (SEQ ID NO: 20), sbi-miR5388 (SEQ ID NO: 21), sbi-miR5568d-3p (SEQ EQ ID NO: 22), sbi-miR5568d-5p (SEQ ID NO: 23) and sbi-miR6232a-5p (SEQ ID NO: 24).
  • the miRNA of formula (I) inhibits the expression of a gene encoding the enzyme Ammonia MonoOxygenase (AMO) and/or inhibits the expression of a gene encoding the enzyme HydroxylAmine Oxydoreductase (HAO).
  • AMO Ammonia MonoOxygenase
  • HAO HydroxylAmine Oxydoreductase
  • the miRNA of formula (I) is capable of targeting one or more mRNAs encoding AMO and/or one or more mRNAs encoding AHO, which has the effect of inhibiting the translation of the target mRNAs into proteins.
  • said one or more genes which participate in the nitrification process in said soil encode the enzyme Ammonia MonoOxygenase (AMO) and/or the enzyme HydroxylAmine Oxydoreductase (HAO).
  • AMO Ammonia MonoOxygenase
  • HAO HydroxylAmine Oxydoreductase
  • said one or more genes which participate in the nitrification process in said soil is expressed by one or more bacteria present in the soil, in particular ammonia-oxidizing bacteria (AOB) and/or nitrite-oxidizing bacteria (NOB), preferably one or more bacteria present in the soil selected from Nitrosomonas spp., Nitrosospira spp. and Nitrosococcus spp., for example selected from Nitrosomonas europaea, Nitrosomonas eutropha C-91, Nitrosomonas communis Nm2, Nitrosospira multiformis and Nitrosospira iacus APG3.
  • AOB ammonia-oxidizing bacteria
  • NOB nitrite-oxidizing bacteria
  • the miRNA of formula (I) therefore has the property of inhibiting the nitrification activity of microorganisms involved in the nitrification process in the soil, in particular ammonia-oxidizing bacteria (AOB) and/or nitrite-oxidizing bacteria (NOB).
  • AOB ammonia-oxidizing bacteria
  • NOB nitrite-oxidizing bacteria
  • the miRNA of formula (I) can be applied to the soil in an amount ranging from 1 g/ha to 1000 g/ha.
  • the miRNA of formula (I) can be applied to the soil with a fertilizer, for example a solid or liquid fertilizer, an amendment, and/or a biostimulant. It can be, for example, a nitrogen fertilizer.
  • the miRNA of formula (I) can inhibit the nitrification of a nitrogen fertilizer applied to the soil, for example a nitrogen fertilizer that is applied to said soil before, concomitantly or after said miRNA.
  • the miRNA of formula (I) and the nitrogen fertilizer can be applied to the soil simultaneously or sequentially.
  • the miRNA of formula (I) can be applied to the soil during a first treatment, and the nitrogen fertilizer can be applied to the soil during a second treatment. Several successive treatments of the soil can thus be carried out.
  • the person skilled in the art will adapt the number of treatments and the nature of the treatment, for example depending on the nature of the soil and/or the plant grown in the soil.
  • peas - protein crops
  • oilseeds sunflower, sunflower
  • the plant may belong to the order of monocotyledons, preferably to the family of poaceae.
  • Poaceae commonly called grasses, contain including most species commonly called “grasses” and “cereals”. Cereals are widely cultivated, primarily for their grains, and are used in human and animal food.
  • the plant is a poaceae, preferably selected from wheat, rice, barley, oats, rye, sugarcane, meadow or corn, preferably wheat.
  • the miRNA is an isolated miRNA.
  • the invention relates to a method for inhibiting the nitrification process in a soil, in which one or more isolated miRNAs of formula (I) are applied to the soil in order to inhibit the expression of one or more genes which participate in the nitrification process in said soil: [Nucleotide]-[Core sequence]-[3’ sequence] (I), in which:
  • Nucleotide corresponds to a nucleotide selected from A, U, G or C
  • [3’ sequence] corresponds to a sequence of 10 to 13 nucleotides
  • [Core sequence] corresponds to a nucleotide sequence selected from the sequences SEQ ID NO: 1-8.
  • the present invention relates to the use of an isolated miRNA of formula (I) for inhibiting the expression of one or more genes which participate in the nitrification process: [Nucleotide]-[Core sequence]-[3' sequence] (I), in which:
  • Nucleotide corresponds to a nucleotide chosen from A, U, G or C,
  • [3' sequence] corresponds to a sequence of 10 to 13 nucleotides
  • Core sequence corresponds to a nucleotide sequence chosen from the sequences SEQ ID NO: 1-8.
  • the miRNA (or isolated miRNA) may be in the form of a composition, for example a composition comprising said miRNA and an excipient.
  • the excipient may be chosen for its ability to stabilize the miRNA in the soil, thereby reducing the degradation of the miRNA in the soil.
  • the composition may comprise from 0.01% to 99% by weight of said miRNA.
  • the composition may be in the form of a plant extract or an algae extract.
  • the invention also relates to a composition comprising one or more isolated miRNA(s) of formula (I):
  • Nucleotide corresponds to a nucleotide chosen from A, U, G or C,
  • [3' sequence] corresponds to a sequence of 10 to 13 nucleotides
  • Core sequence corresponds to a nucleotide sequence chosen from the sequences SEQ ID NO: 1-8.
  • the composition according to the invention further comprises a fertilizer.
  • the fertilizer may be a fertilizer, an amendment and/or a biostimulant.
  • [Sequence 3'] comprises at least 80% homology with a nucleotide sequence selected from the sequences SEQ ID NO: 9-16, preferably at least 85% homology, for example at least 90% homology, at least 95% homology, at least 99% homology or even 100% homology.
  • the composition according to the invention may be in solid form, for example in the form of granules or powder, or in liquid form, for example in the form of an aqueous solution.
  • the composition according to the invention may be in the form of granules impregnated or coated with miRNA of formula (I).
  • the miRNA may be a miRNA extracted from a living organism known to contain said miRNA or a synthetic miRNA, as described above.
  • the composition may comprise an excipient that stabilizes the miRNA in the soil, thereby reducing degradation of the miRNA in the soil.
  • the composition may comprise from 0.01% to 99% by weight of said miRNA.
  • the fertilizer may be of natural or synthetic origin.
  • the fertilizer is a nitrogenous fertilizer.
  • a nitrogenous fertilizer must provide at least nitrogen (N) as a nutrient.
  • the nitrogen fertilizer contains ammonium, ammonia, and/or urea.
  • ammonium-containing fertilizers are calcium ammonium nitrate, calcium ammonium nitrate, ammonium sulfate nitrate, ammonium sulfate, and ammonium phosphate.
  • An example of an ammonia-containing fertilizer is ammonium nitrate.
  • the nitrogen fertilizer may also provide other nutrients, for example, potassium (K) and/or phosphorus (P). It may be an inorganic fertilizer and/or an organic fertilizer.
  • K potassium
  • P phosphorus
  • the amendment may be an organic amendment or a mineral amendment, such as calcium carbonate.
  • composition according to the invention may also comprise micronutrients such as molybdenum, zinc, boron and copper. These elements are typically provided in the form of water-soluble salts.
  • composition according to the invention may also comprise a solvent, a solid support, a dispersant or an emulsifier, an organic or inorganic thickener, a pesticidal agent, an antifreeze agent, an anti-foaming agent, where appropriate a colorant, a sticking agent or a binder.
  • the composition according to the invention comprises a mixture of two to eight miRNAs of formula (I) each having a distinct [Core sequence], for example a mixture of two, three, four, five, six, seven or eight miRNAs of formula (I) each having a distinct [Core sequence].
  • the composition according to the invention is intended for culture supports and/or culture solutions.
  • Another subject of the present invention relates to a culture support or a culture solution comprising one or more isolated miRNA(s) of formula (I) or a composition according to the invention.
  • culture solution means any solution which allows the cultivation of a plant such as, for example, irrigation water, liquid solution intended for fertigation by sprinkling or drip irrigation, hydroponic bath or aeroponic solution.
  • culture medium is defined above.
  • Example 1 miRNA to inhibit the biological nitrification process of Nitrosomonas europaea 25978
  • the 8 miRNAs used in this example were prepared by chemical synthesis and correspond to the miRNAs presented in Table 1.
  • SW Skinner and Walker
  • a nitrite test [13] was performed on all samples at different intervals: Oh (just after the addition of miRNAs or deionized water) and 46h. For this, the collected cells were centrifuged at 8000 rpm for 10 min at 4°C and the supernatants were used for nitrite assay. Nitrite concentrations were measured colorimetrically at 540 nm using a microtiter plate reader through Griess reagent [13]. 100 ⁇ L of 30 mM sulfanilamide was added to each sample and mixed by pipetting up and down, then 100 ⁇ L of 12 mM N-(l-naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride was added to the mixture. In parallel, nitrite standard samples between 0 and 100 pM using 1 mM NaNO 2 were prepared. The absorbance of all samples and standards was measured by a microplate reader (BMG labtech, Germany) at 540 nm.
  • Neem seed oil a potent nitrification inhibitor to control nitrate leaching after incorporation of crop residues.

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Abstract

Procédé pour inhiber le processus de nitrification dans un sol L'invention concerne un procédé pour inhiber le processus de nitrification dans un sol, dans lequel un ou plusieurs miARN est appliqué au sol afin d'inhiber l'expression d'un ou de plusieurs gènes qui participent au processus de nitrification dans ledit sol, tels que les gènes codant l'enzyme AMO (Ammonia MonoOxygenase) et/ou l'enzyme HAO (HydroxylAmine Oxydoréductase).

Description

Titre de l'invention : procédé pour inhiber le processus de nitrification dans un sol
DESCRIPTION
Domaine Technique
[0001] L'invention concerne un procédé pour inhiber le processus de nitrification dans un sol, dans lequel un ou plusieurs miARN est appliqué au sol afin d'inhiber l'expression d'un ou de plusieurs gènes qui participent au processus de nitrification dans ledit sol, tels que les gènes codant l'enzyme AMO (Ammonia MonoOxygenase) et/ou l'enzyme HAO (HydroxylAmine Oxydoréductase). L'invention concerne également une composition fertilisante comprenant un engrais ou un amendement, et un ou plusieurs miARN.
Technique antérieure
[0002] Dans la nature, en raison des processus biogéochimiques, l'état d'oxydation de l'azote (N) varie considérablement, allant de -3 à +5, entraînant la formation de nombreuses espèces d'azote, notamment N2O5, HNO3, HNO3, NO2, N2O4, HNO2, HNO2, NO, N2O, N2, NH3, NH4+, NH4CI, et CH3NH2 [1].
[0003] La nitrification est un processus biologique par lequel les nitrates sont produits dans l'environnement. Celle-ci se fait en plusieurs étapes distinctes, chacune sous l'action de micro-organismes différents :
[0004] Etape 1) Les bactéries oxydant l'ammoniaque (i.e. les AOB, telles que Nitrosomonas spp. et Nitrosococcus spp.) initient le processus de nitrification en oxydant l'ammoniac (NH3) en hydroxylamine (NH2OH). Cette étape est catalysée par l'enzyme AMO (Ammonia MonoOxygenase).
[0005] Etape 2) Les AOB oxydent NH2OH en nitrite (NO2“) via l'enzyme HAO (HydroxylAmine Oxydoréductase).
[0006] Etape 3) Les bactéries oxydant les nitrites (i.e. les NOB, telles que Nitrobacter spp.) complètent le processus de nitrification en produisant du nitrate (NO3‘) via l'enzyme HAO (Hydroxyl Amine Oxydoréductase).
[0007] La nitrification entraîne la perte d'environ un cinquième de l'azote appliqué au sol via le lessivage de NO3 et l'émission d'oxyde nitreux (N2O) [2]. La nitrification entraîne une augmentation du coût de la production agricole, une pollution de l'environnement [3], des maladies humaines et animales [4], une dégradation de l'ozone et des émissions de gaz à effet de serre qui participent au changement climatique [5]. Environ 97% des émissions de N2O dans les systèmes de culture sont attribués au processus de nitrification [6].
[0008] Par conséquent, le contrôle du processus de nitrification est devenu un enjeu majeur en agriculture au cours des dernières décennies.
[0009] Actuellement, le contrôle de la nitrification dans le sol par l'agriculteur est principalement réalisé en utilisant des inhibiteurs synthétiques de nitrification. Ces derniers comprennent une large gamme de composés tels que le dicyandiamide (DCD), le 2-chloro-6- (trichlorométhyl)-pyridine (Nitrapyrine), le phosphate de 3,4-diméthylpyrazole (DMPP) [7], l'allylthiourée [8], 2-amino-4-chloro-6-méthylpyrimidine [9], etc.
[0010] Cependant, l'utilisation de ces inhibiteurs synthétiques a été limitée en raison du coût élevé qui limite leur utilisation à grande échelle, de leur disponibilité limitée [10], de leur effet non ciblé causant des effets néfastes sur les micro-organismes bénéfiques présents dans le sol [11] et en raison de la pollution de l'environnement qu'ils engendrent, en particulier sur les écosystèmes aquatiques [2][10].
[0011] Dans un contexte où la protection de l'environnement est un enjeu de société majeur, il est important de mettre au point des méthodes naturelles et respectueuses de l'environnement qui permettent d'inhiber la nitrification dans le sol.
[0012] Les inventeurs ont ainsi mis au point une nouvelle stratégie d'inhibition des gènes de la nitrification en montrant que certains miARN avaient la propriété d'inhiber le processus de nitrification dans un sol.
[0013] L'invention, qui trouve application dans le domaine de l'agriculture, porte sur la découverte de microARNs (miARNs) ayant la capacité d'inhiber des ARNm de différents genres bactériens responsables de la régulation du processus de nitrification dans les sols (ci-après l'invention). En particulier, il a été mis en évidence des miARNs ayant la capacité d'inhiber les ARNm codant pour les enzymes AMO et/ou HAO, ce qui permettrait d'inhiber le processus de nitrification dans les sols.
Résumé de l'invention
[0014] Un premier objet de la présente invention concerne un procédé pour inhiber le processus de nitrification dans un sol, dans lequel un ou plusieurs miARN de formule (I) est appliqué au sol afin d'inhiber l'expression d'un ou de plusieurs gènes qui participent au processus de nitrification dans ledit sol : [Nucléotide]-[Séquence cœur]-[Séquence 3'] (I), dans laquelle :
[Nucléotide] correspond à un nucléotide choisi parmi A, U, G ou C,
[Séquence 3'] correspond à une séquence de 10 à 13 nucléotides, et
[Séquence cœur] correspond à une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID NO: 1-8.
[0015] Un deuxième objet de la présente invention concerne l'utilisation d'un miARN de formule (I) pour inhiber l'expression d'un ou de plusieurs gènes qui participent au processus de nitrification :
[Nucléotide]-[Séquence cœur]-[Séquence 3'] (I), dans laquelle : [Nucléotide] correspond à un nucléotide choisi parmi A, U, G ou C,
[Séquence 3'] correspond à une séquence de 10 à 13 nucléotides, et
[Séquence cœur] correspond à une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID NO: 1-8.
[0016] Un troisième objet de la présente invention concerne une composition comprenant un ou plusieurs miARN isolé(s) de formule (I) :
[Nucléotide]-[Séquence cœur]-[Séquence 3'] (I), dans laquelle :
[Nucléotide] correspond à un nucléotide choisi parmi A, U, G ou C,
[Séquence 3'] correspond à une séquence de 10 à 13 nucléotides, et
[Séquence cœur] correspond à une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID NO: 1-8.
[0017] Un quatrième objet de la présente invention concerne support de culture ou une solution de culture comprenant un ou plusieurs miARN isolé(s) de formule (I) ou une composition selon l'invention
Description détaillée
[0018] Procédé ou utilisation pour inhiber l'expression d'un ou de plusieurs gènes qui participent au processus de nitrification
[0019] La présente invention concerne un procédé pour inhiber le processus de nitrification dans un sol, dans lequel un ou plusieurs miARN de formule (I) est appliqué au sol afin d'inhiber l'expression d'un ou de plusieurs gènes qui participent au processus de nitrification dans ledit sol : [Nucléotide]-[Séquence cœur]-[Séquence 3'] (I), dans laquelle :
[Nucléotide] correspond à un nucléotide choisi parmi A, U, G ou C,
[Séquence 3'] correspond à une séquence de 10 à 13 nucléotides, et
[Séquence cœur] correspond à une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID NO: 1-8.
[0020] La présente invention concerne également l'utilisation d'un miARN de formule (I) pour inhiber l'expression d'un ou de plusieurs gènes qui participent au processus de nitrification :
[Nucléotide]-[Séquence cœur]-[Séquence 3'] (I), dans laquelle :
[Nucléotide] correspond à un nucléotide choisi parmi A, U, G ou C,
[Séquence 3'] correspond à une séquence de 10 à 13 nucléotides, et
[Séquence cœur] correspond à une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID NO: 1-8.
[0021] Le terme « sol » désigne le substrat exploré par les racines des plantes cultivées. Le terme sol comprend tout type de substrat sur lequel une plante peut se développer, tel que par exemple un sol artificiel, un sol agricole cultivé, un sol agricole non cultivé, de la tourbe, du terreau, de la laine de roche ou de la fibre de coco. Le terme sol couvre donc également les supports de cultures qui peuvent notamment être utilisés pour de la culture dite « hors sol », par exemple dans des pots.
[0022] Le terme « inhiber le processus de nitrification » ou « inhibition du processus de nitrification » désigne au moins 2 %, au moins 3 %, au moins 4 %, au moins 5 %, au moins 10 %, au moins 15 %, au moins 20 %, au moins 25 %, au moins 30 %, au moins 35 %, au moins 40 %, au moins 45 %, ou au moins 50 %, de diminution du processus de nitrification par rapport à une condition de référence. Dans le cadre de l'invention, l'inhibition du processus de nitrification se calcule en mesurant le processus de nitrification dans un sol auquel on applique un ou plusieurs miARN de formule (I), et en le comparant avec un sol auquel on n'a pas appliqué un ou plusieurs miARN de formule (I). Une méthode permettant de mesurer l'inhibition est détaillée dans les exemples.
[0023] Le terme « inhiber l'expression d'un ou de plusieurs gènes » ou « inhibition de l'expression d'un ou de plusieurs gènes » désigne la propriété des miARNs à inhiber les ARNm dudit un ou plusieurs gènes, inhibant ainsi la synthèse des protéines codées par lesdits gènes inhibés. Avantageusement, l'inhibition est d'au moins 2 %, au moins 3 %, au moins 4 %, au moins 5 %, au moins 10 %, au moins 15 %, au moins 20 %, au moins 25 %, au moins 30 %, au moins 35 %, au moins 40 %, au moins 45 %, ou au moins 50 %, de diminution de l'expression dudit un ou plusieurs gènes par rapport à une condition de référence. Dans le cadre de l'invention, l'inhibition de l'expression d'un ou de plusieurs gènes peut se calculer en quantifiant les protéines codées par lesdits gènes inhibés et/ou les ARNm correspondants en mettant en œuvre des techniques classiques pour la personne du métier tel que la méthode ELISA pour quantifier les protéines ou la RT-qPCR pour quantifier les ARNm. Le pourcentage d'inhibition se calcule en mesurant l'inhibition de l'expression d'un ou de plusieurs gènes dans un sol auquel on applique un ou plusieurs miARN de formule (I), et en le comparant avec un sol auquel on n'a pas appliqué un ou plusieurs miARN de formule (I).
[0024] Le terme « microARN » ou « miARN » (ou miRNA en anglais) désigne une courte molécule d'acide ribonucléique (ARN) qui agit comme un régulateur post-transcriptionnel en régulant des ARNm cibles. Un miARN peut avoir une longueur allant de 20 à 24 nucléotides (nt), de préférence de 20 à 22 nt, par exemple 20, 21 ou 22 nt. La préparation d'un miARN ne présente aucune difficulté particulière, par exemple par synthèse chimique classique.
[0025] Dans des modes de réalisation particuliers, le miRNA de formule (I) est un miARN synthétique, c'est-à-dire qu'il a été synthétisé in vitro, par exemple par synthèse chimique. On peut citer par exemple la synthèse sur support solide par la méthode phosphoramidite. La synthèse in vitro permet d'obtenir facilement les quantités souhaitées de miARN de formule (I).
[0026] Dans des modes de réalisation particuliers, le miARN de formule (I) comprend de 19 à 21 nucléotides, c'est à dire 19 nucléotides, 20 nucléotides ou 21 nucléotides.
[0027] [Séquence 3'] correspond à la partie 3' de la séquence du miARN de formule (I). Cette séquence peut comprendre 10, 11, 12 ou 13 nucléotides. Dans des modes de réalisation particuliers, [Séquence S'] comprend au moins 80% d'homologie avec une séquence nucléotidique choisie parmi les séquence SEQ ID NO : 9-16, de préférence au moins 85% d'homologie, par exemple au moins 90% d'homologie, au moins 95% d'homologie, au moins 99% d'homologie ou même 100% d'homologie.
[0028] Lorsque [Séquence cœur] est SEQ ID NO : 1, [Séquence S'] comprend de préférence au moins 80% d'homologie avec la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 9. Lorsque [Séquence cœur] est SEQ ID NO : 2, [Séquence S'] comprend de préférence au moins 80% d'homologie avec la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 10. Lorsque [Séquence cœur] est SEQ ID NO : 3, [Séquence S'] comprend de préférence au moins 80% d'homologie avec la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 11. Lorsque [Séquence cœur] est SEQ ID NO : 4, [Séquence 3'] comprend de préférence au moins 80% d'homologie avec la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 12. Lorsque [Séquence cœur] est SEQ ID NO : 5, [Séquence S'] comprend de préférence au moins 80% d'homologie avec la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 13. Lorsque [Séquence cœur] est SEQ ID NO : 6, [Séquence 3'] comprend de préférence au moins 80% d'homologie avec la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 14. Lorsque [Séquence cœur] est SEQ ID NO : 7, [Séquence 3'] comprend de préférence au moins 80% d'homologie avec la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 15. Lorsque [Séquence cœur] est SEQ ID NO : 8, [Séquence S'] comprend de préférence au moins 80% d'homologie avec la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 16.
[0029] Dans des modes de réalisation particuliers, le miARN de formule (I) peut être choisi parmi sbi-miR162 (SEQ ID NO : 17), sbi-miR394a (SEQ ID NO : 18), sbi-miR397-5p (SEQ ID NO : 19), sbi-miR5386 (SEQ ID NO : 20), sbi-miR5388 (SEQ ID NO : 21), sbi-miR5568d-3p (SEQ ID NO : 22), sbi-miR5568d-5p (SEQ ID NO : 23) et sbi-miR6232a-5p (SEQ ID NO : 24).
[0030] Un mélange de plusieurs miARNs de formule (I) ayant chacun une [Séquence cœur] distincte peut être appliqué au sol. Dans des modes de réalisation particuliers, de deux à huit miARNs de formule (I) ayant chacun une [Séquence cœur] distincte est appliqué au sol, par exemple un mélange de deux, trois, quatre, cinq, six sept ou huit miARNs de formule (I) ayant chacun une [Séquence cœur] distincte est appliqué au sol. Par exemple, il peut s'agir d'un mélange comprenant sbi-miR162 (SEQ ID NO : 17), sbi-miR394a (SEQ ID NO : 18), sbi- miR397-5p (SEQ ID NO : 19), sbi-miR5386 (SEQ ID NO : 20), sbi-miR5388 (SEQ ID NO : 21), sbi-miR5568d-3p (SEQ ID NO : 22), sbi-miR5568d-5p (SEQ ID NO : 23) et sbi- miR6232a-5p (SEQ ID NO : 24).
[0031] Le miARN de formule (I) inhibe l'expression d'un gène codant pour l'enzyme Ammonia MonoOxygenase (AMO) et/ou inhibe l'expression d'un gène codant pour l'enzyme HydroxylAmine Oxydoréductase (HAO). En particulier, le miARN de formule (I) est capable de cibler un ou plusieurs ARNm codant pour AMO et/ou un ou plusieurs ARNm codant pour AHO, ce qui a pour effet d'inhiber la traduction des ARNm cibles en protéines. Ainsi, dans un mode de réalisation préféré, ledit un ou plusieurs gènes qui participent au processus de nitrification dans ledit sol code pour l’enzyme Ammonia MonoOxygenase (AMO) et/ou pour l’enzyme HydroxylAmine Oxydoréductase (HAO).
[0032] Dans le cadre de la présente invention, ledit un ou plusieurs gènes qui participent au processus de nitrification dans ledit sol est exprimé par une ou plusieurs bactéries présentes dans le sol, notamment les bactéries oxydant l'ammoniac (AOB) et/ou les bactéries oxydant les nitrites (NOB), de préférence une ou plusieurs bactéries présentes dans le sol choisie parmi Nitrosomonas spp., Nitrosospira spp. et Nitrosococcus spp., par exemple choisie parmi Nitrosomonas europaea, Nitrosomonas eutropha C-91, Nitrosomonas communis Nm2, Nitrosospira multiformis et Nitrosospira iacus APG3.. Le miARN de formule (I) a donc la propriété d'inhiber l'activité de nitrification des micro-organismes impliqués dans le processus de nitrification dans le sol, notamment les bactéries oxydant l'ammoniac (AOB) et/ou les bactéries oxydant les nitrites (NOB).
[0033] Le miARN de formule (I) peut être appliqué au sol dans une quantité allant de 1 g/ha à 1000 g/ha.
[0034] Dans un mode de réalisation particulier, le miARN de formule (I) peut être appliqué au sol avec un fertilisant, par exemple un engrais, solide ou liquide, un amendement, et/ou un biostimulant. Il peut s'agir, par exemple, d'un engrais azoté. Le miARN de formule (I) peut inhiber la nitrification d'un engrais azoté appliqué au sol, par exemple un engrais azoté qui est appliqué audit sol avant, concomitamment ou après ledit miARN. Ainsi, le miARN de formule (I) et l'engrais azoté peuvent être appliqués au sol simultanément ou séquentiellement. Par exemple, le miARN de formule (I) peut être appliqué au sol lors d'un premier traitement, et l'engrais azoté peut être appliqué au sol lors d'un second traitement. Plusieurs traitements successifs du sol peuvent ainsi être réalisés. Généralement, la personne du métier adapte le nombre de traitements et la nature du traitement, par exemple en fonction de la nature du sol et/ou de la plante cultivée dans le sol.
[0035] Le procédé ou l'utilisation selon l'invention trouve application dans le traitement d'un sol dans lequel peut être planté une très grande variété de plantes. Parmi celles-ci, on citera en particulier :
- les plantes de grande culture telles que les céréales (blé, maïs, orge),
- les protéagineux (pois),
- les oléagineux (soja, tournesol),
- les cultures de Solanacées (pomme de terre),
- les cultures d'Amaranthaceae (betterave),
- les cultures spécialisées telles qu'en particulier le maraîchage (laitue, épinard, oignon, échalote, tomate, melon), la vigne, l'arboriculture (poire, pomme, nectarine), ou l'horticulture.
[0036] En particulier, la plante peut appartenir à l'ordre des monocotylédones, de préférence à la famille des poacées. Les poacées, communément appelés les graminées, renferment notamment la plupart des espèces appelées communément « herbes » et « céréales ». Les céréales sont largement cultivées, principalement pour leurs grains, et sont utilisées dans l'alimentation humaine et animale. Avantageusement, la plante est une poacée, de préférence choisie parmi le blé, le riz, l'orge, l'avoine, le seigle, la canne à sucre, la prairie ou le maïs, de préférence le blé.
[0037] Dans des modes de réalisations particuliers, le miARN est un miARN isolé.
[0038] Ainsi, dans des modes de réalisation particuliers, l'invention concerne un procédé pour inhiber le processus de nitrification dans un sol, dans lequel un ou plusieurs miARN isolé de formule (I) est appliqué au sol afin d'inhiber l'expression d'un ou de plusieurs gènes qui participent au processus de nitrification dans ledit sol : [Nucléotide]-[Séquence cœur]-[Séquence 3’] (I), dans laquelle :
[Nucléotide] correspond à un nucléotide choisi parmi A, U, G ou C, [Séquence 3’] correspond à une séquence de 10 à 13 nucléotides, et [Séquence cœur] correspond à une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 1-8.
[0039] Ainsi également, dans des modes de réalisation particuliers, la présente invention concerne l'utilisation d'un miARN isolé de formule (I) pour inhiber l'expression d'un ou de plusieurs gènes qui participent au processus de nitrification : [Nucléotide]-[Séquence cœur]-[Séquence 3'] (I), dans laquelle :
[Nucléotide] correspond à un nucléotide choisi parmi A, U, G ou C,
[Séquence 3'] correspond à une séquence de 10 à 13 nucléotides, et
[Séquence cœur] correspond à une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 1-8.
[0040] Un miARN isolé correspond à un miARN isolé de son environnement naturel. Par exemple, le miARN peut être isolé à partir d'un organisme vivant contenant ledit miARN, tel qu'une plante ou une algue, par exemple en mettant en œuvre un procédé d'extraction. Des procédés d'extraction de microARN sont décrits dans la littérature et leur mise en œuvre ne présente aucune difficulté particulière pour la personne du métier. On peut citer par exemple l'extraction avec par solvant, tel que l'eau, un solvant hydrophile ou une combinaison de ceux-ci.
[0041] Le miARN isolé peut aussi être synthétisé chimiquement. On pourra alors parler de miARN synthétique. Des méthodes de synthèse chimique d'acides nucléiques sont largement décrites dans la littérature et leur mise en œuvre ne présente aucune difficulté particulière pour la personne du métier.
[0042] Le miARN (ou miARN isolé) peut se présenter sous la forme d'une composition, par exemple une composition comprenant ledit miARN et un excipient. L'excipient peut être choisi pour ses capacités à stabiliser le miARN dans le sol, ce qui permet de diminuer la dégradation du miARN dans le sol. La composition peut comprendre de 0,01% à 99% en poids dudit miARN. Lorsque le miARN est isolé à partir d'une plante ou d'une algue, la composition peut se présenter sous la forme d'un extrait de plante ou d'un extrait d'algue.
[0043] Composition et support de culture
[0044] L'invention concerne également une composition comprenant un ou plusieurs miARN isolé(s) de formule (I) :
[Nucléotide]-[Séquence cœur]-[Séquence 3'] (I), dans laquelle :
[Nucléotide] correspond à un nucléotide choisi parmi A, U, G ou C,
[Séquence 3'] correspond à une séquence de 10 à 13 nucléotides, et
[Séquence cœur] correspond à une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID NO: 1-8.
[0045] Dans des modes de réalisations particuliers, la composition selon l'invention comprend en outre un fertilisant. Le fertilisant peut être un engrais, un amendement et/ou un biostimulant.
[0046] Dans des modes de réalisation particuliers, [Séquence 3'] comprend au moins 80% d'homologie avec une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 9- 16, de préférence au moins 85% d'homologie, par exemple au moins 90% d'homologie, au moins 95% d'homologie, au moins 99% d'homologie ou même 100% d'homologie.
[0047] Dans des modes de réalisation particuliers, le miARN est choisi parmi sbi-miR162 (SEQ ID NO : 17), sbi-miR394a (SEQ ID NO : 18), sbi-miR397-5p (SEQ ID NO : 19), sbi- miR5386 (SEQ ID NO : 20), sbi-miR5388 (SEQ ID NO : 21), sbi-miR5568d-3p (SEQ ID NO : 22), sbi-miR5568d-5p (SEQ ID NO : 23) et sbi-miR6232a-5p (SEQ ID NO : 24).
[0048] La composition selon l'invention peut se présenter sous forme solide, par exemple sous forme de granules ou de poudre, ou sous forme liquide, par exemple sous forme de solution aqueuse. Par exemple, la composition selon l'invention peut se présenter sous forme de granules imprégnés ou recouverts de miARN de formule (I). [0049] Le miARN peut être un miARN extrait à partir d'un organisme vivant connu pour contenir ledit miARN ou un miARN synthétique, tels que décrits plus haut.
[0050] La composition peut comprendre un excipient qui stabilise le miARN dans le sol, ce qui permet de diminuer la dégradation du miARN dans le sol. La composition peut comprendre de 0,01% à 99% en poids dudit miARN.
[0051] L'engrais peut être d'origine naturelle ou synthétique. Dans un mode de réalisation, l'engrais est un azoté. Un engrais azoté doit fournir au moins de l'azote (N) comme nutriment.
[0052] Dans des modes de réalisation particuliers, l'engrais azoté contient de l'ammonium, de l'ammoniac et/ou de l'urée. Des exemples d'engrais contenant de l'ammonium sont le nitrate d'ammonium calcique, le nitrate de calcium et d'ammonium, le nitrate de sulfate d'ammonium, le sulfate d'ammonium et le phosphate d'ammonium. Un exemple d'engrais contenant de d'ammoniac est le nitrate d'ammoniac.
[0053] L'engrais azoté peut également fournir d'autres nutriments, par exemple, du potassium (K) et/ou du phosphore (P). Il peut s'agir d'un engrais inorganique et/ou d'un engrais organique. Dans les engrais azotés fournissant N, ainsi que P ou K, on peut citer les engrais dits « NP » ou « NK », tels que le phosphate monoammonique ou le phosphate diammonique. Dans les engrais azotés fournissant N, P et K, on peut citer les engrais dits « NPK ».
[0054] L'amendement peut être un amendement organique ou un amendement minéral, tel que le carbonate de calcium.
[0055] La composition selon l'invention peut également comprendre des micronutriments tels que le molybdène, le zinc, le bore et le cuivre. Ces éléments sont typiquement fournis sous forme de sels solubles dans l'eau.
[0056] La composition selon l'invention peut également comprendre un solvant, un support solide, un dispersant ou un émulsifiant, un épaississant organique ou inorganique, un agent pesticide, un agent antigel, un agent anti-mousse, le cas échéant un colorant, un agent collant ou un liant.
[0057] Dans des modes de réalisation particuliers, la composition selon l'invention comprend un mélange de deux à huit miARNs de formule (I) ayant chacun une [Séquence cœur] distincte, par exemple un mélange de deux, trois, quatre, cinq, six, sept ou huit miARNs de formule (I) ayant chacun une [Séquence cœur] distincte. [0058] Dans des modes de réalisations particuliers, la composition selon l'invention est destinée aux supports de culture et/ou aux solutions de culture.
[0059] Ainsi, un autre objet de la présente invention concerne un support de culture ou une solution de culture comprenant un ou plusieurs miARN isolé(s) de formule (I) ou une composition selon l'invention.
[0060] Au sens de la présente invention, on entend par « solution de culture » toute solution qui permet la culture d'une plante telle que par exemple eau d'irrigation, solution liquide destinée à la fertigation par aspersion ou goutte à goutte, bain d'hydroponie ou solution d'aéroponie. Le terme « support de culture » est défini ci-dessus.
EXEMPLES
[0061] Exemple 1 : miARN pour inhiber le processus de nitrification biologique de Nitrosomonas europaea 25978
[0062] Matériels et méthodes
[0063] Les 8 miARNs utilisés dans cet exemple ont été préparés par synthèse chimique et correspondent aux miARN présentés dans le tableau 1.
[0064] [Table 1]
[0065] Une culture liquide dans un flacon de 500 mL contenant 150 mL de milieu de Skinner et Walker (SW) [12] a été inoculée avec Nitrosomonas europaea 25978 dans un rapport de 1: 100 (V/V) et cultivée à 28°C sous agitation à 70 rpm jusqu'à ce que la DO 600nm de la culture atteigne 0,3. La suspension cellulaire a ensuite été distribuée en volumes de 20 ml dans des tubes Falcon de 50 ml.
[0066] Par la suite, 1 pg de chacun des 8 miARNs dans un volume de 15 pL d'eau a été ajouté aux cultures bactériennes en trois répétitions et mélangé doucement. Toutes les suspensions cellulaires, y compris les cellules témoins (traitées avec le même volume d'eau déionisée ne contenant pas de miARN) et les cellules traitées avec les miARNs, ont été cultivées pendant 5 jours avec une agitation constante à 28°C.
[0067] Un test de nitrite [13] a été effectué sur tous les échantillons à différents intervalles : Oh (juste après l'ajout des miARN ou de l'eau déionisée) et 46h. Pour cela, les cellules collectées ont été centrifugées à 8 000 tr/min pendant 10 minutes à 4°C et les surnageants ont été utilisés pour le dosage des nitrites. Les concentrations de nitrite ont été mesurées par colorimétrie à 540 nm à l'aide d'un lecteur de plaque de microtitration à travers le réactif de Griess [13]. 100 pL de sulfanilamide à 30 mM ont été ajoutés à chaque échantillon et mélangés par pipetage de haut en bas, puis 100 pL de dichlorhydrate de N-(l-naphtyl) éthylènediamine à 12 mM ont été ajoutés au mélange. En parallèle, des échantillons étalons de nitrite entre 0 et 100 pM utilisant du NaNO2 à 1 mM ont été préparés. L'absorbance de tous les échantillons et étalons a été mesurée par un lecteur de microplaques (BMG labtech, Allemagne) à 540 nm.
[0068] Résultats:
[0069] Les résultats sont présentés au tableau 2.
[0070] [Table 2]
[0071] Les résultats montrent que les miARNs ont été capables d'inhiber la nitrification biologique de Nitrosomonas europaea 25978 d'environ 11%. [0072] Références
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[0081] [9] Kumar, R., Parmar, B. S., Walia, S., & Saha, S. (2015). Nitrification Inhibitors: Classes and Its Use in Nitrification Management. In Nutrient Use Efficiency: From Basics to Advance (pp. 103-122). Springer, New Delhi, https://doi.org/10.1007/978-81-322- 2169-2_8. [0082] [10] Sun, L, Lu, Y., Yu, F., Kronzucker, H. J., & Shi, W. (2016a). Biological nitrification inhibition by rice root exudates and its relationship with nitrogen-use efficiency. New Phytologist, 212(3), 646-656. https://doi.org/10.llll/NPH.14057.
[0083] [11] Opoku, A., Chaves, B., & de Neve, S. (2014). Neem seed oil: a potent nitrification inhibitor to control nitrate leaching after incorporation of crop residues.
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[0084] [12] Skinner, F. A., & Walker, N. (1961). Growth of Nitrosomonas europaea in batch and continuous culture. Archiv Für Mikrobiologie 1961 38:4, 38(4), 339-349. [0085] [13] Keeney, D. R., & Nelson, D. W. (1982). Nitrogen— Inorganic Forms. In: Methods of Soil Analysis Part 2: Chemical and Microbiological Properties, 2ndedn, Page AL, Miller R. H, Keeney D.R.(Eds) Agronomy 9/2, American Society of Agronomy, Madison, WI, 643-698.
[0086] Listage de séquences
[0087] [Table 3]

Claims

REVENDICATIONS
[Revendication 1] Procédé pour inhiber le processus de nitrification dans un sol, dans lequel un ou plusieurs miARN de formule (I) est appliqué au sol afin d'inhiber l'expression d'un ou de plusieurs gènes qui participent au processus de nitrification dans ledit sol : [Nucléotide]-[Séquence cœur]-[Séquence 3'] (I), dans laquelle :
[Nucléotide] correspond à un nucléotide choisi parmi A, U, G ou C, [Séquence 3'] correspond à une séquence de 10 à 13 nucléotides, et [Séquence cœur] correspond à une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID NO: 1-8, dans lequel ledit un ou plusieurs gènes qui participent au processus de nitrification dans ledit sol est exprimé par une ou plusieurs bactéries présentes dans ledit sol.
[Revendication 2] Utilisation d'un miARN de formule (I) pour inhiber l'expression d'un ou de plusieurs gènes qui participent au processus de nitrification dans un sol: [Nucléotide]-[Séquence cœur]-[Séquence 3'] (I), dans laquelle :
[Nucléotide] correspond à un nucléotide choisi parmi A, U, G ou C, [Séquence 3'] correspond à une séquence de 10 à 13 nucléotides, et [Séquence cœur] correspond à une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID NO: 1-8, dans lequel ledit un ou plusieurs gènes qui participent au processus de nitrification dans ledit sol est exprimé par une ou plusieurs bactéries présentes dans ledit sol.
[Revendication 3] Procédé ou utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ledit un ou plusieurs gènes qui participent au processus de nitrification dans ledit sol code pour l'enzyme Ammonia MonoOxygenase (AMO) et/ou pour l'enzyme HydroxylAmine Oxydoréductase (HAO).
[Revendication 4] Procédé ou utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ledit un ou plusieurs gènes qui participent au processus de nitrification dans ledit sol est exprimé par une ou plusieurs bactéries présentes dans ledit sol choisie parmi Nitrosomonas spp., Nitrosospira spp. et Nitrosococcus spp., par exemple choisie parmi Nitrosomonas europaea, Nitrosomonas eutropha C-91, Nitrosomonas communis Nm2, Nitrosospira multiformis et Nitrosospira iacus APG3.
[Revendication 5] Procédé ou utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le miARN comprend de 19 à 21 nucléotides.
[Revendication 6] Procédé ou utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le miARN inhibe la nitrification d'un engrais azoté appliqué au sol, par exemple un engrais azoté qui est appliqué audit sol avant, concomitamment ou après ledit un ou plusieurs miARN.
[Revendication 7] Procédé ou utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel [Séquence S'] comprend au moins 80% d'homologie avec une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 9-16, de préférence au moins 85% d'homologie, par exemple au moins 90% d'homologie, au moins 95% d'homologie, au moins 99% d'homologie ou même 100% d'homologie.
[Revendication 8] Procédé ou utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le miARN est choisi parmi sbi-miR162 (SEQ ID NO : 17), sbi- miR394a (SEQ ID NO : 18), sbi-miR397-5p (SEQ ID NO : 19), sbi-miR5386 (SEQ ID NO : 20), sbi-miR5388 (SEQ ID NO : 21), sbi-miR5568d-3p (SEQ ID NO : 22), sbi-miR5568d-5p (SEQ ID NO : 23) et sbi-miR6232a-5p (SEQ ID NO : 24).
[Revendication 9] Procédé ou utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel un mélange de deux à huit miARNs de formule (I) ayant chacun une [Séquence cœur] distincte est appliqué au sol, par exemple un mélange de deux, de trois, de quatre, de cinq, de six, de sept ou de huit miARNs de formule (I) ayant chacun une [Séquence cœur] distincte.
[Revendication 10] Composition comprenant un ou plusieurs miARN isolé(s) de formule (I) :
[Nucléotide]-[Séquence cœur]-[Séquence 3'] (I), dans laquelle :
[Nucléotide] correspond à un nucléotide choisi parmi A, U, G ou C, [Séquence 3'] correspond à une séquence de 10 à 13 nucléotides, et [Séquence cœur] correspond à une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID NO: 1-8.
[Revendication 11] Composition selon la revendication 10, dans laquelle [Séquence 3'] comprend au moins 80% d'homologie avec une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 9-16, de préférence au moins 85% d'homologie, par exemple au moins 90% d'homologie, au moins 95% d'homologie, au moins 99% d'homologie ou même 100% d'homologie.
[Revendication 12] Composition selon la revendication 10 ou 11, dans laquelle le miARN est choisi parmi sbi-miR162 (SEQ ID NO : 17), sbi-miR394a (SEQ ID NO : 18), sbi-miR397- 5p (SEQ ID NO : 19), sbi-miR5386 (SEQ ID NO : 20), sbi-miR5388 (SEQ ID NO : 21), sbi- miR5568d-3p (SEQ ID NO : 22), sbi-miR5568d-5p (SEQ ID NO : 23) et sbi-miR6232a-5p (SEQ ID NO : 24).
[Revendication 13] Composition selon l'une quelconque des revendications 10 à 12, comprenant un mélange de deux à huit miARNs de formule (I) ayant chacun une [Séquence cœur] distincte, par exemple un mélange de huit miARNs de formule (I) ayant chacun une [Séquence cœur] distincte.
[Revendication 14] Composition selon l'une quelconque des revendications 10 à 13, comprenant en outre un fertilisant, par exemple un engrais, un amendement et/ou un biostimulant.
[Revendication 15] Support de culture ou solution de culture comprenant un ou plusieurs miARN isolé(s) de formule (I) ou une composition selon l'une quelconque des revendications 10 à 14,
[Nucléotide]-[Séquence cœur]-[Séquence 3'] (I), dans laquelle :
[Nucléotide] correspond à un nucléotide choisi parmi A, U, G ou C, [Séquence 3'] correspond à une séquence de 10 à 13 nucléotides, et [Séquence cœur] correspond à une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID NO: 1-8.
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